CZ171197A3 - Nová transfekční činidla a jejich farmaceutické aplikace - Google Patents

Nová transfekční činidla a jejich farmaceutické aplikace Download PDF

Info

Publication number
CZ171197A3
CZ171197A3 CZ971711A CZ171197A CZ171197A3 CZ 171197 A3 CZ171197 A3 CZ 171197A3 CZ 971711 A CZ971711 A CZ 971711A CZ 171197 A CZ171197 A CZ 171197A CZ 171197 A3 CZ171197 A3 CZ 171197A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pharmaceutical composition
group
lipopolyamine
nucleic acid
composition according
Prior art date
Application number
CZ971711A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ289513B6 (cs
Inventor
Gerardo Byk
Catherine Dubertret
Daniel Scherman
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ171197A3 publication Critical patent/CZ171197A3/cs
Publication of CZ289513B6 publication Critical patent/CZ289513B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/04—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C233/05—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových sloučenin náležejících do skupiny lipopolyaminů, farmaceutických kompozic, které tyto sloučeniny obsahují, a jejich aplikace pro transfekci in vivo nebo/a in vitro nukleových kyselin.
Dosavadní stav techniky
Četná genetická onemocnění jsou spojena s chybnou nebo/a abnormální expresí (tj. deficitní nebo nadměrnou expresí) jedné nebo několika nukleových kyselin. Základním cílem genové terapie je korigovat tento typ genetických anomálií nepřímo buněčnou expresí in vivo nebo in vitro klonovaných genů.
V sočasné době existuje několik způsobů navržených pro intracelulární poskytnutí tohoto typu genetické informace.
Jeden z těchto způsobů spočívá v použití chemických nebo biochemických vektorů. Syntetické vektory mají dvě základní funkce, a sice vázat DNA určenou k transfekci a podpořit její celulární fixaci, jakož i její průchod plasmovou membránou a případně oběma jádrovými membránami.
Významného pokroku v rámci tohoto transfekčního způsobu bylo dosaženo vývojem technologie založené na použití kationtového lipidu. Takto bylo prokázáno, že pozitivně nabitý kat iontový lipid, kterým je N-/1 -(2,3-dioleyloxy)propy1/Ν,Ν,Ν-trimethylamoniumchlorid (DOTMA), spontánně interferuje ve formě liposomů nebo ve formě malých váčků s DNA, která je nabita záporně, za vzniku komplexů lipidy-DNA, které jsou schopné sloučení s buněčnými membránami, a umožňuje tak intracelulární uvolnění DNA. Jakkoliv je však tato molekula účinná v úrovni transfekce, má nevýhodu spočívající v tom, že není biologicky odbouratelná a má vůči buňkám toxický charakter.
Po lipidu DOTMA byly vyvinuty další kationtové lipidy na bázi tohoto strukturního modelů: lipofilní skupina spojená s amino-skupinou prostřednictvím ramene, které bývá označováno jako distanční člen. Z těchto kationtových lipidů lze obzvláště citovat lipidy obsahující jako lipofilní skupinu dvě mastné kyseliny nebo derivát cholesterolu a zahrnující kromě toho případně jako amino-skupinu kvartérní amoniovou skupinu. Jako reprezentativní zástupci této kategorie kationtových lipidů mohou být zejména citovány DOTAP,
DOBT'.nebo ChOTB. Další sloučeniny, jako například DOSC a ChOSC, jsou charakterizovány přítomnosti cholinové skupiny namísto kvartérní amoniové skupiny. Obecně však zůstává transfekční účinnost těchto sloučenin dosti nízká.
Rovněž byla popsána další kategorie kationtových lipidů, kterými jsou lipopolyaminy. V tomto typu sloučenin je kationtová skupina reprezentována L-5-karboxysperminovým radikálem, který obsahuje čtyři amoniové skupiny, z nichž dvě jsou primárními skupinami a dvě sekundárními skupinami. Součástí této skupiny sloučenin jsou zejména DOGS a DPPES. Tyto lipopolyaminy jsou zejména účinné pro transfekci primárních endokrinních buněk.
Ve skutečnosti by ideální syntetické transfekční činidlo mělo vykazovat vysokou míru transfekce a současně by mělo mít pro široké spektrum buněk nulovou toxicitu nebo alespoň velmi minimalizovanou toxicitu při aplikačních dávkách, přičemž takové ideální transfekční činidlo by mělo být biologicky- odbouratelné za -účelem eliminace všech sekundárních účinků v úrovni ošetřených buněk.
Cílem vynálezu je navrhnout nové sloučeniny, které by byly schopné účinného použití při transfekci in vitro nebo in vivo buněk a zejména pro vektorizaci nukleových kyselin.
Podstata vynálezu
Prvním předmětem vynálezu jsou lipopolyaminy ve formě
D, L nebo DL a jejich soli, reprezentované obecným vzorcem I
H2N-((CH)m-NH)n-H z i m ve kterém
m znamená celé číslo od 2 do 6,
n znamená celé číslo od 1 do 9 a výhodněji od 1 do 5,
přičemž v případě, že n znamená celé číslo od 2 do 9,
potom v obecném vzorci je přítomna jediná skupina R odlišná od vodíku, a m má proměnné nebo identické hodnoty ve skupinách -(CH ) - nebo -(CH_) -,
-1 c m 2 m
R znamená atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce II
(II) ve kterém
X a X' znamenají nezávisle jeden na druhém atom kyslíku, methylenovou skupinu -(CH_) -, kde q znamená 0, 1, 2 z q nebo 3, nebo amino-skupinu -NH- nebo NR'-, kde R' zna. „ mená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,
Y a Y' znamenají nezávisle jeden na druhém methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S,
R^, R4 a R^ znamenají nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, p znamená číslo od 0 do 5 a
Rg znamená cholesterolový derivát nebo alkylamino-skupinu
-NR^R2# ve které R^ a R£ znamenají nezávisle jeden na druhém nasycenou nebo nenasycenou, lineární nebo rozvětvenou alifatickou skupinu obsahující 12 až 22 uhlíkových atomů.
Obzvláště zajímavé jsou sloučeniny, ve kterých R znamená skupinu obecného vzorce II' <pH)p R5
(II' ve kterém R^, R^, R^, Rg a p mají výše uvedené významy a X znamená atom kyslíku nebo skupinu -(CH_) -,ve které q znamená nulu.
Tato skupina sloučenin je zejména charakterizovaná přítomnosti vnitřní esterové vazby, která je zajímavá s ohledem na biologickou odbouratelnost uvedených sloučenin.
Jako výhodné lipopolyaminy podle vynálezu lze zejména uvést následující sloučeniny:
V
N-H
H i
N-H
N-H o
N- H
1Oalfa-cholesteryl
H^ ve formě D, L nebo DL nebo ve formě některé z jejich solí.
Předmětem vynálezu je rovněž terapeutické použití lipopolyaminů podle vynálezu a to buá přímo nebo v rámci farmaceutických kompozic.
Jak již bylo vysvětleno výše, ukázalo se, že sloučeniny obecného vzorce I jsou obzvláště zajímavé pro transfekci in vitro a in vivo nukleových kyselin. Tyto sloučeniny pevně váží DNA a výhodně vykazují velmi nízkou, ba i nulovou toxicitu vůči ošetřeným buňkám. Kromě toho jsou uvedené slou6 ceniny biologicky odbouratelné a to zejména hydrolýzou jejich esterové vazby.
Pro dosažení maximálního účinku kompozic podle vynálezu se příslušná množství sloučeniny obecného vzorce I a nukleové kyseliny výhodně určí tak, aby bylo dosaženo optimálního poměru R, vyjádřeného pozitivními náboji uvažovaného lipopolyaminu na negativní náboje uvedené nukleové kyseliny. Tento optimální poměr, který se mění zejména podle způsobu použití (in vivo nebo in vitro) a podle transfekovaného buněčného typu, se optimalizuje případ od případu. Tato optimalizace je zcela v kompetenci příslušného odborného pracovníka .
V kompozicích podle vynálezu může být polynukleotidem jak kyselina desoxyribonukleová, tak i kyselina ribonukleová. Může se jednat o sekvence přírodního nebo umělého původu a zejména o genomovou DNA, DNAc, RNAm, RNAt, RNAr, o hybridní sekvence nebo o syntetické nebo polosyntetické sekvence. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního nebo jiného původu.. Sekvence mohou být získány libovolnou známou technikou, zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také komplexními metodami zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank. Sekvence mohou být jinak zabudovány do vektorů, jakými jsou plasmidové vektory.
Pokud jde o desoxyribonukleové kyseliny, mohou mít tytokyseliny jednoduchý nebo dvojitý řetězec. Uvedené desoxyribonukleové kyseliny mohou nést terapeutické geny, regulační sekvence transkripce nebo replikace, modifikované nebo nemodifikované antimediátorové sekvence, vazebné oblasti k dalším buněčným složkám, atd..
Terapeutickým genem se v rámci vynálezu zejména rozumí každý gen kódující proteinový produkt mající terapeutický účinek. Takto kódovaným proteinovým produktem může být protein, peptid, atd.. Tento proteinový produkt může mít homologový charakter vůči cílové buňce (tj. produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce v případě, že tato buňka nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě, uvedená exprese proteinu například umožňuje léčit nedostatečnou expresi uvedeného proteinu v buňce nebo expresi neaktivního proteinu nebo málo aktivního proteinu nebo také exprimovat nadměrnou tvor bu uvedeného proteinu. Uvedený terapeutický gen může také kódovat mutant buněčného proteinu mající zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu, atd.. Proteinový produkt může mít také heterogenní charakter vůči cílové buňce. V tomto případě může exprimovaný protein například doplňovat nebo poskytovat deficitní aktivitu v buňce, v důsledku čehož je buňka schopna bojovat proti uvažované patologii nebo je tímto mechanismes stimulována její imunitní odezva.
Z uvedených terapeutických produktů lze zejména uvést. enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrophin, ats., dystrophin nebo minidystrophin (FR 9111947), protein CFTR sdružený s mukoviscidosou, geny suprimující nádory: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory uplatňující se při koagulaci: faktory VII, VIII, IX, geny intervenující .v reparaci DNA, sebevražedné geny (thymidin-kináza, cytosin-deamináza), geny hemoglobinu a další proteinové transportéry, geny odpovídající proteinům uplatňujícím„se_ při metabolismu lipidů agolipoproteinového typu zvolené z množiny zahrnující apoliproteiny A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J, metabolické enzymy, jako například lipoprotein-lipáza, hepatická lipáza, lecitin-cholesterol-acyltranferáza, 7alfa-cholesterol-hydroxyláza, kyselina fosfatidová-fosfatáza, nebo také transferové proteiny lipidů, jako transferový protein esterů cholesterolu a transferový protein fosfolipidů, vazebný protein HDL, nebo ještě receptor zvolený například z množiny zahrnující receptory LDL, receptory chylomikrons-remnantů a scavengero8 vé receptory, atd..
Terapeutickou nukleovou kyselinou může být rovněž gen nebo antimediátorová sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na komplementární RNA od buněčných RNAm a blokovat takto jejich translaci na protein technikou popsanou v evropském patentovém dokumentu EP 140 308. Uvedené terapeutické geny rovněž obsahují sekvence kódující ribozomy, které jsou schopné selektivně rozložit RNA cílových buněk (EP 321 201).
Jak již bylo uvedeno výše, může nukleová kyseliny rovněž zahrnovat jeden nebo několik genů kódujících antigenový peptid, který je schopný generovat u člověka nebo zvířete imunitní odezvu. V rámci tohoto specifického způsobu provedení vynálezu vynález tudíž umožňuje realizaci bud vakcín nebo imunoterapeutického ošetření u člověka nebo zvířete, zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovinám. Může se zejména jednat o specifické antigenové peptidy Epstein-Barrova viru, viru HIV, viru hapatitidy B (EP 185 573), viru pseudo-vztekliny, syncitia-tvorného viru a ostatních virů nebo také specifických nádorových virů (EP 259 212).
Nukleová kyselina rovněž výhodně obsahuje sekvence umožňující expresi terapeutického genu nebo/a genu kódujícího antigenový peptid v buňce nebo požadovaném orgánu. Může se jednat o sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi uvažovaného genu v případě, že jsou tyto sekvence schopné funkce v infikované buňce. Může se rovněž jednat o sekvence odlišného původu (sekvence zodpovědné za expresi dalších proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Zejména se může jednat o promoční sekvence eukaryotických nebo virálních genů. Může se například jednat o promoční sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována. Stejně tak se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu viru. V tomto ohledu lze například citovat promotory genů E1A, MLP, CMV,
RSv, atd.. Kromě toho mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí atd.. Může se také jednat o induktibilní nebo represibilní promotor.
Jinak může nukleová kyselina rovněž obsahovat,a to zejména před terapeutickým genem, signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečních cest cílové buňky. Touto signální sekvencí může být přirozená signální sekvence terapeutického produktu, i když se rovněž může jednat o libovolnou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální sekvenci. Nukleová kyselina může rovněž zahrnovat signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt do specifické oblasti buňky.
V rámci další formy provedení se vynález týká kompozic obsahujících nukleovou kyselinu, lipopolyamin, který je náro kován a přísadu schopnou spojit se s komplexem lipopolyaminnukleová kyselina a zlepšit tak transfekční potenci uvedeného komplexu. Přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že trans fekční potence lipopolyaminů může být neočekávaně zvýšena v přítomnosti některých přísad (například v přítomnosti lipi dů nebo proteinů), které jsou schopné přidružit se k uvedené mu komplexu tvořeného lipolyaminem a nukleovou kyselinou.
Výhodněji kompozice podle vynálezu obsahují jako přísa du jeden nebo několik neutrálních lipidů. Takové kompozice jsou obzvláště výhodné zejména v případě, kdy je poměr R níz kýL Přihlašovatel^ skutečně prokázal,_že přídave_k neutrálního lipidu umožňuje zlepšit tvorbu nukleolipidových částic a pře kvapivě příznivě ovlivnit proniknutí takové částice do buňky po destabilizaci její membrány.
Výhodněji jsou neutrálními lipidy použitými v rámci vynálezu lipidy se dvěma mastnými řetězci.
Obzvláště výhodně se používají přírodní nebo syntetické lipidy, mající zwiterionový charakter nebo jsoucí zbaveny za fyziologických podmínek iontového náboje. Takový lipid může být například zvolen z množiny zahrnující dioleylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl nebo -mirystoylfosfatidylethanolaminy, jakož i jejich 1 až 3 krát N-methylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (zejména sfingomyeliny) nebo také asialogangliosidy (zejména asialoGMI a GM2 ) .
Tyto jednotlivé lipidy mohou být získány bučí syntézou nebo extrakcí z orgánů (například z mozku) nebo z vajec klasickými a odborníkům dobře známými metodami. Extrakce lipidů může být zejména provedena za použití organických rozpouště•del (viz rovněž Lehninger, Biochemistry).
Kompozice podle vynálezu výhodně obsahují 0,1 až 20 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent sloučeniny obecného •vzorce I a výhodně 1 až 5 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent sloučeniny obecného vzorce I.
Kompozice podle vynálezu mohou být formulovány způsobem vhodným pro topickou, kutánní, perorální, rektální, vaginální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní,intraokulární, transdermální a jinou aplikaci. Výhodně farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují nosič, který je farmaceuticky přijatelný pro injikovatelnou formulaci, zejména pro přímou injekci v úrovni požadovaného orgánu nebo pro podání topickou cestou (na kůži nebo/a na sliznici. Může se jednat zejména o sterilní isotonické roztoky nebo o suché kompozice, zejména o lyofilizované kompozice, které po přidání buá sterilizované vody nebo fyziologického roztoku poskytují injikovatelné roztoky. Dávky nukleové kyseliny použité pro takovou injekci a počet podání mohou být zvoleny v závislosti na různých faktorech, zejména na použitém způsobu podání, na ošetřovaném patologickém stavu, na genu, který má být exprimován nebo také na požadované délce léčení. Pokud jde o způsob podání, může se jednat bu<3 o přímou injekci do tkáně nebo o ošetření buněk v kultuře a následnou reimplantaci těchto buněk in vivo, injekcí nebo roubem.
Vynález takto poskytuje obzvláště výhodný způsob léčení nemocí spočívající v podání in vivo nebo in vitro nukleové kyseliny schopné korigovat uvedenou nemoc a sdružené se sloučeninou obecného vzorce I za výše definovaných podmínek. Tento způsob je zejména použitelný v souvislosti s nemocemi, ke kterým dochází v důsledku nedostatku proteinového nebo nukleového produktu, přičemž podaná nukleová kyselina kóduje uvedený proteinový produkt nebo obsahuje uvedený nukleový produkt.
Vynález se vztahuje na jakékoliv použití lipopolyaminu podle vynálezu pro transfekci in vivo nebo in vitro buněk.
V následující části popisu bude vynález blíže popsán pomocí příkladů jeho konkrétních provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patentových nároků.
Příklady provedení vynálezu
Zkratky a symboly
AcOEt : ethylacetát
BOP : benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)fosfoniumDCC
DCU
DMAP
DMF
DMSO hexafluorfosfát dicyklohexylkarbodiimid dicyklohexylmočovina 4-dimethylaminopyridin dimethylformamid dimethylsulfoxid
DODÁ
EP
EtOH
NEt
Rf
TFA
THF
TMS dioktadecylamin petrolether ethanol triethylamin retenční koeficient kyselina trifluoroctová tetrahydrofuran tetramethylsilan
Látky a metody
A) Použité produkty
DODÁ, NEt^, TFA, ornitin, tetramethylamoniumhydroxid, Raneyův nikl a diglykolanhydrid pochází od firmy Fluka; BOP pochází od firmy Propeptide France; DMAP, isobutylchlorformiát a N-methylmorfolin pocházejí od firmy Aldrich, zatímco THF pochází od firmy Merck. Všechna ostatní použitá rozpouštědla jsou produkty firmy RP Prolabo. Roztoky chloridu sodného a hydrogenuhličitanu sodného jsou nasycenými roztoky, zatímco v případě roztoku hydrogensíranu draselného se jedná o 0,5M roztok.
B) Fyzikální měření
Protonová nukleární magnetickorezonanční spektra (^HNMR) byla získána za použití spektrometru Bruker. Chemické posuny jsou vyjádřeny v ppm vzhledem k TMS.
C) Chromatografie na silikagelu
a) Chromatografie na tenké vrstvě (CCM) se provádí na deskách silikagelu Merck o tlouštce 0,2 mm.
Vyvolání:
- v ultrafialovém světle při použití vlnové délky 254 nm,
- ninhydrinem: odpařuje se (lehký sprej) ethanolický roztok ninhydrinu (40 mg/100 ml EtOH) za účelem vyvolání aminů nebo amidů při zahřívání na teplotu 150 °C,
- fluorescaminem: odpařuje se acetonový roztok (40 mg/100 ml acetonu) za účelem vyvolání primárních aminů,
-jodem: deska se popráší práškovým jode..
b) Chromatografie v koloně se provádí na silikagelu 60 Merck majícím granulometrii 0,063-0,200 mm.
Příklad 1
Syntéza 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl-(dioktadecylkarba moylmethoxy)acetátu
V
N-H
H-
l.a Příprava tetramethylamonium-2,5-bis-(2-kyanoethylamino) pentanoátu
Monohydrochlorid kyseliny 2,5-diaminopentanové (L-ornitin) (6,74 g, 40 mmolů) a pentahydrát tetramethylamoniumhydroxidu (14,48 g, 80 mmolů) se uvedou do roztoku v methanolu (20 ml). Vytvořená voda a methanol se odpaří za sníženého tlaku (za použití olejového čerpadla) do té míry, že se získá suchý zbytek.
K získaným solím se přidá N,N-dimethylformamid (30 ml). Získaná směs se odplyní za použití dusíku, načež se intenzivně míchá po dobu deseti minut, což má za následek rozpuštění tetramethylamonium-2,5-diaminopentanoátu (zatímco tetramethylamoniumchlorid zůstane suspendován v DMF).
Potom se přidá akrylonitril (6 ml, 85,6 molu), přičemž tento přídavek se provede po kapkách. Baňka se mírně zahřeje. Reakční směs se potom ponechá po dobu jedné hodiny pod dusíkovou atmosférou při okolní teplotě. Směs se potom zfiltr je za účelem odstranění tetramethylamoniumchloridu. DMF se po tom odpaří za sníženého tlaku. Získaný zbytek je tvořen olejovitou tekutinou, která po odvedení z rotační odparky ztuhne. Přidá se acetonitril (100 ml) a baňka se mírně zahřívá až k získání průsvitného roztoku. Potom se přidá THF až k získání zakaleného roztoku. Baňka se potom přechovává po dobu dvou dnů v mrazničce, načež se tetramethylamoniová sůl kyseliny L-2,5-bis-(2-kyanoethylamino)pentanové izoluje filtrací ve formě bílého pevného produktu. Tento produkt se na fritš promyje THF a potom vysuší nas oxidem fosforečným. Získá se 6,06 g produktu, což představuje výtěžek surového produktu 49 %.
1.b Příprava tetramethylamoniové soli kyseliny 2,5-bis-(3aminopropylamino)pentanové (1.b)
Produkt získaný ve stupni 1.a se rozpustí ve směsi ethanolu (18 ml), vody (2 ml) a 2M hydroxidu draselného (5 ml) Získaný roztok se propláchne argonem. Potom se přidá Raneyův nikl (2 ml suspenze od firmy Fluka). Hydrogenace se provede v autoklávu vypláchnutém dusíkem při teplotě 26 °C. Po 3 hodinách klesne tlak z 5,06 na 4,47 MPa, načež se tlak stabilizuje po dobu delší než 1 hodina. Autokláv má obsah 250 ml a objem reakční směsi činí 30 ml. Získaná suspenze se zfiltruje, promyje vodou a zavede do rotační odparky. Získá se žlutý olej. Test na fluorescamin je pozitivní.
1.c Příprava kyseliny 2,5-bis-/terc.butoxykarbonyl-/3___ __ (terč .butoxyka rbonylamino)propy1/amino/pentanové ( 1 . c )
Produkt získaný ve stupni 1.b se rozpustí v dioxanu (30 ml). K získanému roztoku se přidá di-terc.butyldikarbonát (17,46 g, 80 mmolů). Získaná směs se míchá přes noc. Dioxan se potom odpaří. Přidá se hydrogensíran draselný. Produkt se potom extrahuje CHCl^ (3 x 100 ml). Organická fáze se potom postupně promyje roztokem hydrogenuhličitanu sodného (pH = 7,5) a roztokem chloridu sodného, načež se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Získá se g produktu (15,4 mmolu, což odpovídá výtěžku 39 %, vztaženo na ornitin.
Vysokotlaká sloupcová chromatografie: MeCN/í^O: 0,3 min 50% MeCN, 3-20 min 50-100% MeCN, 20-40 min 100% MeCN, K'=7,96 (kolona RP-18, průtok = 1 ml/min), chromatografie na tenké vrstvě; Rf (CHCl^:AcOEt = 95:5 objemově) = 0,28, 1H-NMR (ppm); 1,3(m, 8H, N+CH2-CH2-CH2-CHN+COO/2x N+CH2CH2ch2n+),
2,7-3,0(m.10 H 5x N+CH2),
3,8(t,1H,N+CHCOO), hmotové spektrum: MH = 647 (m.hm.=646).
1.d Příprava 2,5-bis-/terc.butoxykarbonyl-/3-(terc.butoxykarbonylamino)propyl/amino/pentan-1-olu (1.d)
L-5-Karboxytetra-terc.butoxykarbonylspermin (1,94 g, mmoly) se rozpustí ve 30 ml THF. Potom se do získaného roztoku zavede mikropipetou 370 ml (3,1 mmolu) N-methylmorfolinu. Reakční směs se pod dusíkovou atmosférou ochladí na teplotu 15 °C (v lázni suchého ledu a ethylenglykolu). Potom se přidá 390 ml (3,1 mmolu) isobutylchlorformiátu. Po třech minutách se reakční směs nalije do kádinky obsahující natriumborohydrid (2 g) rozpuštěný ve 20 ml vody teplé 4 °C. THF se potom odpaří. Přidá se roztok hydrogensíranu draselného (až do pH 7). Produkt se extrahuje AcOEt, promyje roztokem hydrgenuhličitanu sodného a potom roztokem chloridu sodného, načež se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří.
Získá se 1,15 g produktu, což odpovídá výtěžku 61 %.
Chromatografie na tenké vrstvě vede ke dvěma skvrnám. Provede se tedy separace na sloupci silikagelu za použití téhož elučního činidla, čímž se získá 0,97 g produktu (ve formě žlutého oleje). Výtěžek separace činí 84 %.
Výtěžek redukce je 51 %.
Chromatografie na tenké vrstvě: Rf (EP:AcOEt = 1:1 objemově)= 0,24, ^H-NMR (ppm): 1,42 (s, 4xBoc),
1,5-1,7(m, 8H N+CH2-CH2-CH2~CHN/ 2x N+CH2-CH2~ ch2n),
2,85-3,2 (m,10H 5x NCH2),
3,4(m,1H,NCHCH20H),
3.7 (d,2H,CH2OH),
6.8 (m,2H,NH), hmotové spektrum: MH+ = 633 (m.hm.=632).
1.e Příprava kyseliny 2,5-bis-/3-(terč.butoxykarbonylamino)propyl/-/terc.butoxykarbonylamino/pentyloxykarbonylmethoxyoctové (l.e)
0,51 g (0,806 mmolu) produktu získaného ve stupni
1.d se rozpustí v 10 ml CH2C12. K získanému roztoku se přidají dva ekvivalenty diglykolanhydridu (1,535 mmolu, 0,178 g), 2,2 ekvivalentu triethylaminu (1,687 mmolu, 235/Ul) a 5 mg DMAP. Po jedné hodině chromatografie na tenké vrstvě reakční směsi ukazuje, že alkohol zreagoval. Ke směsi se přidá CH2C12, načež se směs promyje 3 x 50 ml roztoku hydrogensíranu draselného, 3 x 50 ml roztoku chloridu sodného a vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří. Získá se 0,26 g pevného produktu, což odpovídá výtěžku 43 %.
Chromatografie na tenké vrstvě: Rf (CHCl^:MeOH:AcOH = 90:8:2 objemově) = 0,75, hmotové spektrum: MH+ = 749 (m.hm.=748).
1.f. Příprava 2,5-bis-/terčrbutoxykarbony1-/3-(terč.butoxy- karbonylamino) propyl/amino/pentyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetátu
0,123 g produktu získaného v předcházejícím reakčním stupni (0,164 mmolu), 1 ekvivalent (0,0856 g) dioktadecylaminu, 3 ekvivalenty triethylaminu (68,4 ml), 1,1 ekvivalent (0,0798 g) BOP se rozpustí v CHCl^. Reakční směs se potom míchá při okolní teplotě. Po dvou hodinách se k reakční smě17 si přidá 100 ml CH2Cl2 a směs se promyje 3 x 100 ml roztoku hydrogensíránu draselného, roztoku hydrogenuhličitanu sodného a roztoku chloridu sodného (až do pH 7), načež se vysuší a potom odpaří. Získá se 0,13 produktu, což odpovídá výtěžku 63 %.
Chromatografie na tenké vrstvě: Rf (EP:AcOEt = 1:1 objemově) 0,62; vyvolání jodem, ninhydrinem a fluorescaminem.
1H-NMR (ppm): 0,90 (t,J=7,5 Hz, 6H:CH3),
1,20-1,75 (m,108 H:CH./C(CH.).) ,
3,05-3,
4,15-4,
4,23-4,
4,5-5,5 hmotové spektrum: MH+ elementární analýza:
(m,14 H:CH2N), (m, 3H:NCHCH2OCO), (2s,2x 2H:OCH2CO), (m, rozpr.,2H:NH), = 1252 (m.hm. = 12 51), (C71H137N5°12>
vypočteno nalezeno
C(%) H(%)
68,06 11,02
67,14 11,93
N(%)
5,59
5,86.
1.g Příprava 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetátu ml TFA se přidá k 0,025 g produktu získaného ve stupni 1.f (0,02 mmolů) v tribici Eppendorf o obsahu 1,5 ml a směs se zde ponechá po dobu jedné hodiny při okolní teplotě. TFA se potom odpaří. Potom se přidá 500/Ul ethanolu ták,’ aby byl získán 40mM roztok potřebný pro biologické testy.
Hmotové spektrum: MH+ =852 (m.hm. = 851).
Příklad 2
Příprava 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetátu (2.f)
2.a Příprava 1,3-bis-(2-kyanoethylamino)-2-propanolu (2.a)
3,6 g (40 mmoiů) 1,3-diamino-2-propanolu se rozpustí v 75 ml methanolu. Potom se k získanému roztoku přidá v průběhu 15 minut 5,76 ml (80 mmoiů) akrylonitrilu. Zkouška na fluorescamin je pozitivní. Reakčni směs zůstane bezbarvá. Reakčni směs se potom míchá při okolní teplotě přes noc. Zkouška na fluorescamin je poto negativní- Methanol se odpaří. Izoluje se 7,9 g produktu (100% výtěžek surového produktu).
2.b Příprava 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propanolu (2.b)
Hydrogenace se provede v autoklávu propláchnutém dusíkem při teplotě 27 °C. Produkt získaný v reakčním stupni 2.a se rozpustí ve směsi 15 ml methanolu, 10 ml ethanolu a 5 ml 2M roztoku hydroxidu draselného. Roztok se propláchne argonem, načež se k němu v autoklávu přidají 4 ml suspenze Raneyova niklu. V průběhu 3 hodin klesne tlak v autoklávu z původní hodnoty 5,16 MPa na hodnotu 3,76 MPa, načež se stabilizuje po dobu delší než jedna hodina. Obsah autoklávu činí 250 ml, zatímco objem reakčni směsi činí 30 ml. Získaná suspenze se zfiltruje, promyje vodou a zavede do rotační odparky. Získá se žlutý olej. Zkouška na fluorescamin je pozitivní.
2.c Příprava 1 ,3-bis-/3-terc.butoxykarbonylamino-(terč.butoxykarbonylaminopropyl/-2-propan-2-olu (2.c)
Produkt získaný ve stupni 2.b se chrání stejným způsobem jako ve stupni 1.C. Přidá se 100 ml Cř^C^· 39,2 g (179 mmoiů) di-terc.butyldikarbonátu ve formě roztoko ve 100 ml dioxanu se potom po kapkách přidá k získané směsi. Roztok se míchá po dobu 72 hodin. Rozpouštědlo se odpaří a přidá se roztok hydrogensíranu draselného. Produkt se extrahuje za použití AcOEt (3 x 100 ml). Jednotlivé frakce se sloučí a promyjí roztokem hydrogensíranu draselného, hydrogenuhličitanu sodného a chloridu sodného, načež se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří. Získá se 20 g produktu, což odpovídá výtěžku 83 %, vztaženo na výchozí produkt.
Produkt se rekrystalizuje z EP.
Chromatografie na tenké vrstvě:
Rf (EP:AcOEt = 1:1 objemově) =0,23
Rf (EP:AcOEt = 1:2 objemově) = 0,63, ΊΗ-ΝΜΡ (ppm): 1,4 (2s,36H: 4 x (CH^),
1,65 (qt, 4H: 2 x NCH2CH2CH2NH),
2,95 (q,4H: 2 x NHCH2CH2),
3.1 (2d,4H: NCH2CHCH2N),
3.2 (t,4H: NCH2CH2),
3,85 (m,1H:0H),
5,9 (s,2H:NH), hmotové spektrum: MH+ = 605 (m.hm.=604).
2.d Příprava kyseliny 1,3-bis-/3-terc.butoxykarbonylamino(terč.butoxykarbonylaminopropyl/-2-propyl-2-ethoxy karbonylmethoxyoctové (2.d)
604 mg (1 mmol) produktu získaného ve stupni 2.c se rozpustí ve 20 ml CH2C12, načež se do získaného roztoku zavedou 2 ekvivalenty anhydridu (2 mmol, 0,232 g), 2,2 ekvivalentu NEt^ (307/Ul, potom 100/Ul), 6,5 g DMAP. Po 24 hodí novém míchání při okolní teplotě se ke směsi přidá CH2C12, a směs se promyje roztokem hydrogensíranu draselného a roztokem chloridu sodného, vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří. Získá se 0,156 g produktu (výtěžek 22 %). Chromatografie na tenké vrstvě: Rf (CHCl^:MeOH:AcOH=90:8:2 objemově )=0,71, 1H-NMR (ppm): 1,2-1,4 (2s,36H: 4 X (CH^),
1,5 (m,4H:2x NHCH2CH2CH2N) ,
2,85(q,4H:2 x NHCH2CH2) ,
3,1 (m,8H: 4 x NCH2),
3,9-4,2 (2s,4H:2 x OCH2COO),
5,25 (m,1H:CH2CHCH2),
6,7 (2H:NH), hmotové spektrum: MH+ = 721 (m.hm.=720).
2.e Příprava 1,3-bis-/3-terc.butoxykarbonylamino(terč . butoxykarbonylaminopropyl/-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetátu
0,216 mmolu kyseliny získané v předcházejícím stupni
2.d se rozpustí ve 3 ml CHCl^. K získanému roztoku se potom přidá 1 ekvivalent DODÁ (0,113 g), 3 ekvivalenty NEt3 (100 yul) a 1,1 ekvivalentu BOP (0,11 g). Reakční směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 24 hodin. CHCl^ se odpaří, načež se ke zbytku přidá 100 ml AcOEt. Organická fáze se pro myje 0,5M HC1, roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem chloridu sodného až k dosažení pH 7, načež se vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří. Získá se 0,185 g produktu (výtěžek 70 %). Provede se chromatografie na sloupci silikagelu. Izoluje se 110 mg produktu (42 %).
Chromatografie na tenké vrstvě: Rf (CHCl^:MeOH:AcOH=90:8:2 objemově)= 0,8+,
Rf (EP:AcOEt = 1:1 objemově) ΊΗ-ΝΜΡ (ppm): 0,85 (t,6H:2 x CH3),
1,20-1,55(m,100H:CH2/C(CH3)β ) ,
1,6 (m,4H:2 x NHCH2CH2CH2N),
3,05-3,4(m,16H:2 x NHCH2CH2CH2N/NCH2CHCH2N/2x ch2n),
4,1(s,2H:NCOCH2O),
4,15(s,2H:OCH2COO),
5,25(m,1H:CH2chCH2),
6,15(m,2H:NH), hmotové spektrum: MH+ = 1224 (m.hm.=1223.
2.f Příprava 1,3-bis-/3-terc.butoxykarbonylamino-(terč.bu toxykarbonylamino-(terč.butoxykarbonylamínopropyl/-2propyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetátu (2 . f) ml TFA se přidá k 0,0247 g produktu získaného ve stupni 2.e (0,021 mmolů) v trubici Eppendorf o obsahu 1,5 ml, kde se ponechá při okolní teplotě po dobu jedné hodiny. TFA se potom odpaří. Potom se přidá 505/Ul ethanolu tak, aby se získal 40mM roztok potřebný pro biologické testy.
Hmotové spektrum: MH+ = 824 (m.hm.=823).
Přiklaď 3
Příprava 2-(3-aminopropylamino)-1-(3-aminopropylaminomethyl) ethyl-(Ν,Ν-dioktadecyl)sukcinamátu
Tato sloučenina se připraví podle protokolu popsaného výše v přikladu 2, kdy se kýséliňa diglykolová ňáhřa3Í~kýšěTiňd’u’ jantarovou. Analýza provedená hmotovou spektrometrií takto získaného produktu indikuje fragment MH+: 808, což je v souladu s očekávanou hmotností.
Použití lipopolyaminů podle vynálezu pro transfekci in vitro genetického materiálu
A) Plasmidy použité pro přenos genů in vitro
Použije se plasmid pCMV-LUC. Jedná se o konstrukci zahrnující reportérovy gen luciferázu odvozenou buá od plasmidu pGL2-Basic Vector (Promega) nebo od plasmidu pGL2Control Vector (Promega) inzercí fragmentu Mlu I-Hind III obsahujícího promotor lidského cytomegaloviru (CMV) extrahovaný z plasmidového vektoru pcDNA3 (invitrogen).
B) Protokol přípravy roztoků použitých pro transfekci
Lipopolyaminy připravené podle předcházejících příkladů se rozpustí v ethanolu za vzniku 40mM roztoku, načež se potom zředí směsí ethanolu a vody, přičemž se udržuje koncentrace ethanolu nižší než 10 %. Roztoky kyseliny nukleové určené k transfekci se zředí fyziologickým roztokem (0,15M NaCl), načež se přidají k roztokům lipopolyaminů v poměru 1:1 objemově. Po homogenizaci vířivým míchadlem a 15 minutové inkubaci při okolní teplotě se roztoky DNA/lipopolyaminů distribuují (finální konc. 9 ébj.%) do jamek titrační plotny, kde jsou buňky promyté kultivačním prostředím bez proteinů (sérum).
Příklad 4
Vliv poměru nábojů (aminy/fosfáty) na účinnost transfekce
Vzorky obsahující 1.10^ buněk NIH 3T3 v exponenciální fázi růstu na 2 cm se zpracují roztoky lipopolyaminy/pCMV-LUC, majícími proměnné nábojové poměry, po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře obsahující 5 % C02, přičemž každý vzorek pojme 1/Ug nukleové kyseliny. Studium exprese reportérového genu se provádí po přidání fetálního telecího séra (finální koncentrace 8 %) a po následné 40 hodinové kultivaci v sušárně s atmosférou oxidu uhličitého. Aktivita luciferázy se stanoví světelnou emisí /RLU = relative light unit/ v přítomnosti luciferinu, koenzymu A a ATP po dobu 20 sekund a vyjádří v ^ug proteinu v supernatantu získaném po lyži buněk. Získané výsledky jsou uvedeny v dále uvedené tabulce I.
Tabulka I
Lipopolyamin z př.1 Lipopolyamin z př.2
Poměr nábojů luminescence ,koef . var . ( % ) luminescence koef.var.(%)
1 69 5 23 34
2 5091 3 252 6
4 3636 30 7890 3,
6 21334 3 61401 5
8 40846 3 73224 2
10 55321 1 77633 2
12 53239 5 48634 5
14 36 10 52417 2
ADN samot. 52 5
Každá hodnota odpovídá průměru ze tří nezávislých pokusů. Tento pokus jednoznačně ukazuje, že lipopolyaminy podle vynálezu umožňuje přenos genů za podmínek žádoucích pro jejich expresi.
Přiklad 5
Vliv koncentrace kyseliny nukleové ve směsích DNA/lipopolyaminy.
Za použití stejného protokolu, jaký byl popsán v předcházejícím příkladu se buňky NIH 3T3 ošetří směsmi DNA/lipopolyaminy za podmínek, v rámci kterých se použijí různé koncentrace DNA při stejném poměru nábojů. V tomto případě sě aktivita luciferázy měří po dobu 20 sekund a vztahuje na 2,5.103 ošetřených buněk. Získané výsledky jsou uvedeny následujících tabulkách II a III.
Tabulka II
Lipopolyamin z příkladu 1
Poměr n ábo jů
pg DNA x4 x 6 x8 xlO
0,25 27 (19) 25 (20) 32 (31) 36 (15)
0,5 23 (5) 37 (54) 4476 (4) 4811 (19)
' 1,0 4945 (12) 19194 (14) 30933 (21) 39357 (3)
2,0 93937 (2) 105533 (1) 111167 (14) 8315 (15)
3,0 4,0 106293 (11) 98553 (10) 100093 (8) 69863 (8) 53475 (12)
Tabulka III
Lipopolyamin z příkladu 2
Poměr nábojů
pg DNA x4 x 6 x8 x 10
0,25 40 (17) 52 (64) 122 (14) 51 (5)
0,5 28 (10) 204 (25) 36533 (7) 44473 (7)
1,0 3427 ((12) 48167 (13) 49363 (13) 50083 ( 9)
2,0 33377 (13) 44697 (18) 30670 (16) 9544 (4)
3,0 9686 (3) 31557 (2) 9157 (8)
4,0 4321 (9) 40105 (10)
Každá hodnota odpovídá průměru ze tři_ nezávislých pokusů. __ Hodnoty uvede v závorkách odpovídají koeficientu variace vyjádřenému v % .

Claims (22)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lipopolyamin ve formě D, L nebo DL nebo některá z jeho solí obecného vzorce I
    H2N-((CH)m-NH)„-H ά (I) ve kterém
    m znamená celé číslo od 2 do 6, n znamená celé číslo od 1 do 9 a výhodněji od 1 do 5, přičemž v případě, že n znamená celé číslo od 2 do 9,
    potom v obecném vzorci je přítomna jediná skupina R odlišná od vodíku, a m má proměnné nebo identické hodnoty ve skupinách -(CH ) - nebo -(CH_) -, c m 2 m
    R
    R znamená atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce II (II) ve kterém
    X a X' znamenají nezávisle jeden na druhém atom kyslíku, methylenovou skupinu -(CH?) -, kde q znamená 0, 1,2 z q nebo 3, nebo amino-skupinu -NH- nebo NR'-, kde R' znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,
    Y a Y' znamenají nezávisle jeden na druhém methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S,
    R^, R^ a R^ znamenají nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, p znamená číslo od 0 do 5 a
    Rg znamená cholesterolový derivát nebo alkylamino-skupinu
    -NR1R2z ve které R^ a R2 znamenají nezávisle jeden na druhém nasycenou nebo nenasycenou, lineární nebo rozvětvenou alifatickou skupinu obsahující 12 až 22 uhlíkových atomů.
  2. 2. Lipopolyamin podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kte rém R výhodně znamená skupinu obecného vzorce II'
    O
    R
  3. 3
    R4 (II') ve kterém R,, R., Rc, R, j 4 D b a X znamená atom kyslíku ná nulu.
    a p mají významy uvedené v nebo skupinu -(CH_) -, kde 2 q nároku 1 q zname3. Lipopolyamin podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I, kterým je sloučenina vzorce ve formě D, L nebo DL nebo některá z jejích solí.
  4. 4. Lipopolyamin podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I, kterým je sloučenina vzorce ve formě D, L nebo DL nebo některá z jejích solí.
  5. 5. Lipopolyamin podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I, kterým je sloučenina vzorce
    H
    I
    N-H ve formě D, L nebo DL nebo některá z jejích solí.
  6. 6. Lipopolyamin podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I, kterým je sloučenina vzorce / o o
    N- H
    10 alfa-cholesteryl ve formě D, L nebo DL nebo některá z jejích solí.
  7. 7. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden lipopolyamin podle některého z nároků 1 až 6 a alespoň jednu nukleovou kyselinu.
  8. 8. Farmaceutická čená tím, že xyribonukleová.
    kompozice podle nároku 7, v y z nukleovou kyselinou je kyselina n adeso
  9. 9. Farmaceutická kompozice podle nároku 7, vyznačená tím, že nukleovou kyselinou je kyselina ribonukleová .
  10. 10. Farmaceutická kompozice podle nároku 7, 8 nebo 9, vyznačená tím, že nukleová kyselina je chemicky modifikovaná.
  11. 11. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 7 až 10,vyznačená tím, že nukleovou kyselinou je antimediátorová sekvence.
  12. 12. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 7 až 10,vyznačená tím, že nukleová kyselina obsa huje terapeutický gen.
    Farmaceutická kompozice podle nároku 12, v y z n a č tím
  13. 13. n á že terapeutický gen kóduje protein uplatňují jho cí se při metabolismu lipidů, jako apoliprotein zvolený z množiny zahrnující apoliproteiny A-I, A-II, A-IV, B, C-I,
    C-II, C-IIIl_ D, _E, F, G, H, J a apo(a) , enzym, jako lipoprotein-lipáza, hepatická lipáza nebo další lipázy, lecitincholesterol-acyltransferáza, 7alfa-cholesterol-hydroxyláza a kyselina fosfatidová-fosfatáza, přenosový protein lipidů, jako přenosový protein esterů cholesterolu a přenosový protein fosfolipidů, vazebný protein HDL nebo také receptor zvolený například z množiny zahrnující receptory LDL, receptory chylomikrons-remnantů a scavengerové receptory.
  14. 14.
    Farmaceutická kompozice, vyznačená tím,
    29 že obsahuje nukleovou kyselinu, lipopolyamin podle některého z nároků 1 až 6 a přísadu schopnou spojit se s komplexem lipopolyamin/kyselina nukleová a zlepšit jeho transfekční potenci.
  15. 15. Farmaceutická kompozice podle nároku 14, v y z n a č e n á t i m, že přísadou je jeden nebo několik neutrálních lipidů.
  16. 16. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, v y z n ač e n á tím, že neutrální lipid nebo neutrální lipidy jsou zvoleny z množiny zahrnující syntetické nebo přírodní lipidy mající zwiterionový charakter nebo prosté iontového náboje za fyziologických podmínek.
  17. 17. Farmaceutická kompozice podle nároku 16, v y z n a čená tím, že neutrálním lipidem nebo neutrálními lipidy jsou lipidy se dvěma mastnými řetězci.
  18. 18. Farmaceutická kompozice podle nároku 17, v y z n a čená t i m , že neutrální lipid nebo neutrální lipidy jsou zvoleny z množiny zahrnující dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoylfosfatidylethanolamin, jakož i jejich 1 až 3 krát N-methylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy, zejména galaktocerebrosidy, sfingolipidy, zejména„sfingomyeliny, a asialogangliosidy, zejména asialoGM1 a GM2.
  19. 19. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků
    14 až 18, v y z načená tím, že obsahuje 0,1 až 20 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent lipopolyaminů, výhod ně 1 až 5 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent lipopolyaminu.
  20. 20.
    Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 7 až 19, vyznačená tím,že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič pro injikovatelnou formulaci.
  21. 21. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 7 až 19,vyznačená tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič pro použití na pokožku nebo/a na sliznici.
  22. 22. Použití lipopolyaminů podle některého z nároků 1 až 6 pro transfekci in vivo nebo in vitro buněk.
CZ19971711A 1994-12-05 1995-12-04 Lipopolyamin, farmaceutická kompozice obsahující tento lipopolyamin a pouľití tohoto lipopolyaminu CZ289513B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9414596A FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1994-12-05 Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ171197A3 true CZ171197A3 (cs) 1998-03-18
CZ289513B6 CZ289513B6 (cs) 2002-02-13

Family

ID=9469480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19971711A CZ289513B6 (cs) 1994-12-05 1995-12-04 Lipopolyamin, farmaceutická kompozice obsahující tento lipopolyamin a pouľití tohoto lipopolyaminu

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6107286A (cs)
EP (1) EP0796240B1 (cs)
JP (1) JPH10509958A (cs)
KR (1) KR100447517B1 (cs)
AT (1) ATE200662T1 (cs)
AU (1) AU713662B2 (cs)
BR (1) BR9510080A (cs)
CA (1) CA2208184A1 (cs)
CZ (1) CZ289513B6 (cs)
DE (1) DE69520748T2 (cs)
DK (1) DK0796240T3 (cs)
ES (1) ES2157351T3 (cs)
FI (1) FI972366A0 (cs)
FR (1) FR2727679B1 (cs)
GR (1) GR3035759T3 (cs)
HU (1) HUT77171A (cs)
IL (1) IL116251A (cs)
NO (1) NO972566L (cs)
PT (1) PT796240E (cs)
SK (1) SK282601B6 (cs)
WO (1) WO1996017823A1 (cs)
ZA (1) ZA9510326B (cs)

Families Citing this family (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939401A (en) * 1994-12-09 1999-08-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5948767A (en) * 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US6331524B1 (en) 1994-12-09 2001-12-18 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy
US6383814B1 (en) 1994-12-09 2002-05-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
AUPN741696A0 (en) * 1996-01-05 1996-01-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of nucleic acids ii
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
DE19637043A1 (de) * 1996-09-12 1998-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue Aminoalkoholderivate, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Reagenzien
US7097854B2 (en) 1996-09-12 2006-08-29 Medigene Oncology Gmbh Amino alcohol derivatives, process for their production and pharmaceutical preparations and reagents containing these compounds
FR2754272B1 (fr) * 1996-10-08 1998-11-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de compositions pour le transfert d'acides nucleiques
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US6884430B1 (en) * 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
AU753781B2 (en) 1997-04-28 2002-10-31 Aventis Pharma S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
US6875606B1 (en) 1997-10-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Human α-7 nicotinic receptor promoter
BR9907269A (pt) 1998-01-30 2001-04-03 Aventis Pharma Sa Agente de transferência de ácidos nucleicos, composição, utilização de um agente de transferência, e, processos de transferência de ácidos nucleicos nas células, de preparação de uma composição e de tratamento de doenças.
KR20010042318A (ko) * 1998-04-02 2001-05-25 아방티 파르마 소시에테 아노님 신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
US6583301B1 (en) 1998-04-08 2003-06-24 Celltech R & D Limited Lipids
US6225456B1 (en) 1998-05-07 2001-05-01 University Technololy Corporation Ras suppressor SUR-5
US6506889B1 (en) 1998-05-19 2003-01-14 University Technology Corporation Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods
US6441156B1 (en) * 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
WO2000064858A1 (en) * 1999-04-26 2000-11-02 Celltech R&D Limited Bipolar lipids and their use for the delivery of bioactive substances
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
WO2001040254A1 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Tomohiko Ohwada Reagents for gene transfer
ATE511856T1 (de) 2000-03-13 2011-06-15 Cornell Res Foundation Inc Blockieren der leukozytenemigration und entzündung durch störung mit cd99/hec2
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
AU5345901A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Univ Rockefeller Enhancement of antibody-mediated immune responses
KR100373844B1 (ko) * 2000-09-21 2003-02-26 굿젠 주식회사 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법
KR100373845B1 (ko) * 2000-09-21 2003-02-26 굿젠 주식회사 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
BR0116756A (pt) 2000-12-28 2005-01-04 Wyeth Corp Proteìna protetora recombinante de streptococcus pneumoniae e uso da mesma
EP1534738B1 (en) 2001-02-20 2012-06-20 Intrexon Corporation Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
CA2438119C (en) 2001-02-20 2014-12-16 Rheogene Holdings, Inc. Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
ES2385598T3 (es) 2001-02-20 2012-07-27 Intrexon Corporation Sistema novedoso de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona/receptor X retinoide de invertebrado
AU2002306550B2 (en) 2001-02-20 2007-10-25 Intrexon Corporation Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP1499349B1 (en) 2001-03-02 2009-11-18 The Rockefeller University Recombinant hybrid allergen constructs with reduced allergenicity that retain immunogenicity of the natural allergen
JP2005532781A (ja) 2001-09-26 2005-11-04 レオジーン・ホールディングス，インコーポレーテッド ヨコバイエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
EP1490686A2 (en) 2001-09-26 2004-12-29 RheoGene Holdings Inc. Whitefly ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
EP1479985B1 (en) 2002-01-17 2017-06-14 Alfa Laval Corporate AB Submerged evaporator comprising a plate heat exchanger and a cylindric casing where the plate heat exchanger is arranged
MXPA04011624A (es) 2002-05-24 2005-03-07 Schering Corp Anticuerpo neutralizante humano anti-igfr.
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7304161B2 (en) * 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) * 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
DK1745295T3 (da) 2004-04-20 2011-01-31 Galapagos Nv Fremgangsmåder, sammensætninger og forbindelsesanalyser til hæmning af produktionen af amyloid beta-protein
CA2562833A1 (en) 2004-04-27 2005-11-03 Galapagos N.V. Methods, agents, and compound screening assays for inducing differentiation of undifferentiated mammalian cells into osteoblasts
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US7306923B2 (en) 2004-06-14 2007-12-11 Galapagos N.V. Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative & inflammatory diseases
US20070004658A1 (en) 2004-06-21 2007-01-04 Nick Vandeghinste Method and means for treatment of osteoarthritis
US7604798B2 (en) 2004-07-15 2009-10-20 Northwestern University Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei
EP2397490B1 (en) 2004-07-16 2013-09-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccine constructs and combinations of vaccines designed to improve the breadth of the immune response to diverse strains and clades of HIV
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
US20060211004A1 (en) 2005-02-15 2006-09-21 Ilsley Diane D Methods and compositions for determining non-specific cytotoxicity of a transfection agent
US8088382B2 (en) 2005-07-05 2012-01-03 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of inhibiting transendothelial migration of neutrophils and monocytes with anti-CD99L2 antibodies
WO2007028147A2 (en) 2005-09-01 2007-03-08 Philadelphia Health & Education Corporation D.B.A. Drexel University College Of Medicin Identification of a prostatic intraepithelial neoplasia (pin)-specific gene and protein (pin-1) useful as a diagnostic treatment for prostate cancer
MY151438A (en) 2006-07-28 2014-05-30 Sanofi Aventis Compositions and method for treatment of tumors
PL2068922T3 (pl) 2006-10-19 2012-11-30 Csl Ltd Przeciwciała anty-IL-13R alfa1 i ich zastosowania
ES2501947T3 (es) 2006-10-19 2014-10-02 Csl Limited Antagonistas de anticuerpos de alta afinidad del receptor alfa 1 de interleucina
CA2673622A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Imuthes Limited Lipid
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
MX363066B (es) 2007-05-29 2019-03-07 Intrexon Corp Ligandos quirales de diacilhidrazina para modular la expresion de genes exogenos por medio de un complejo receptor de ecdisona.
HRP20140405T1 (hr) 2007-06-20 2014-06-20 Galapagos N.V. Molekularni ciljevi i metode za identificiranje spojeva za lijeäśenje degenerativnih bolesti kostiju i zglobova
US20090069266A1 (en) 2007-06-27 2009-03-12 Northwestern University Methods and compositions for nucleic acid transfer into cells
US20090098055A1 (en) 2007-08-23 2009-04-16 Intrexon Corporation Methods and Compositions for Diagnosing Disease
MX2010002777A (es) * 2007-09-17 2010-05-21 Rohm & Haas Composiciones y metodos para modificacion de respuestas fisiologicas en plantas.
US20090136465A1 (en) 2007-09-28 2009-05-28 Intrexon Corporation Therapeutic Gene-Switch Constructs and Bioreactors for the Expression of Biotherapeutic Molecules, and Uses Thereof
JP2010539993A (ja) 2007-10-08 2010-12-24 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用
EP2331071A1 (en) 2008-09-05 2011-06-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery
AU2009290848A1 (en) 2008-09-11 2010-03-18 Galapagos Nv Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of CF-associated mutant Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator
AU2009313615B2 (en) 2008-11-05 2012-11-29 Regents Of The University Of Minnesota Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (BHS) disease
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
EP2398480A1 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US20120004160A1 (en) 2009-02-19 2012-01-05 Glaxo Group Ltd. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP2398481A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US8993509B2 (en) 2009-03-31 2015-03-31 Robert Zimmerman Method for treatment of cachexia by administering inhibitors of adipose triglyceride lipase expression or activity
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
EP3043179B1 (en) 2009-04-01 2020-05-06 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
JP5822822B2 (ja) 2009-04-17 2015-11-24 ニューヨーク ユニバーシティ Ｔｎｆファミリー受容体を標的とし、ｔｎｆ作用を拮抗するペプチド、その組成物、方法および使用
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011116351A2 (en) 2010-03-19 2011-09-22 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
EP2550359B1 (en) 2010-03-23 2017-08-09 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
CA2808975C (en) 2010-08-23 2018-10-30 Wyeth Llc Stable formulations of neisseria meningitidis rlp2086 antigens
KR101584871B1 (ko) 2010-09-10 2016-01-22 와이어쓰 엘엘씨 네이세리아 메닝기티디스 orf2086 항원의 비-지질화된 변이체
CN103476928B (zh) 2010-12-09 2017-03-29 巴斯德研究所 用于获得高产量重组蛋白表达的基于mgmt的方法
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
EP2681327B1 (en) 2011-03-04 2018-11-21 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
US9458456B2 (en) 2011-04-01 2016-10-04 University Of South Alabama Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer
EP2546358A1 (en) 2011-07-15 2013-01-16 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and reagents for efficient control of HIV progression
BR112014006535A2 (pt) 2011-09-20 2017-03-28 Univ North Carolina Chapel Hill regulação dos canais de sódio através das proteínas plunc
WO2013053765A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma
DE21212055T1 (de) 2011-12-07 2022-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biologisch abbaubare lipide zur freisetzung von wirkstoffen
EP2788478B1 (en) 2011-12-09 2017-08-23 Institut Pasteur Multiplex immuno screening assay
WO2013103401A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
CZ201220A3 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
CA2865745C (en) 2012-03-09 2018-01-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
WO2014107739A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
US10981961B2 (en) 2013-03-11 2021-04-20 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of card protein as therapy for occular inflammation
JP6437467B2 (ja) 2013-03-14 2018-12-19 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップＧａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ． 線維化疾患治療において有用な分子標的及び化合物、並びにこれらの同定方法
US9952202B2 (en) 2013-03-14 2018-04-24 Galapagos Nv Methods of identifying compounds for the treatment of fibrosis by using S1PR5
JP2016522675A (ja) 2013-03-14 2016-08-04 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップＧａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ． 上皮間葉移行に関連した疾患の治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター
ES2683329T3 (es) 2013-03-15 2018-09-26 Intrexon Corporation Diacilhidrazinas que contienen boro
WO2014193800A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 The Johns Hopkins University Aptamers for the treatment of sickle cell disease
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
US11053291B2 (en) 2014-02-19 2021-07-06 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of Nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
CA2953341C (en) 2014-06-25 2023-01-24 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
EP3194359B1 (en) 2014-09-17 2020-04-08 Intrexon Corporation Boron-containing diacylhydrazine compounds
KR20190049940A (ko) 2015-02-19 2019-05-09 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
TW201710503A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途
HUE067372T2 (hu) 2015-06-29 2024-10-28 Acuitas Therapeutics Inc Lipidek és nanoszemcsés lipid formulázások nukleinsavak beadására
AU2016334401A1 (en) 2015-10-10 2018-04-26 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
CN108368028B (zh) 2015-10-28 2021-09-03 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
US12678515B2 (en) 2015-12-30 2026-07-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US10619159B2 (en) 2016-01-19 2020-04-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions using RNA interference for inhibition of KRAS
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
AU2017359342B2 (en) 2016-11-09 2022-02-17 Intrexon Corporation Frataxin expression constructs
SG11201906519RA (en) 2017-01-31 2019-08-27 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US12440578B2 (en) 2017-02-22 2025-10-14 Io Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs comprising gene editing multi-sites and uses thereof
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
US11820728B2 (en) 2017-04-28 2023-11-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
JP7355731B2 (ja) 2017-08-16 2023-10-03 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
US11524932B2 (en) 2017-08-17 2022-12-13 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
JP7461872B2 (ja) 2017-08-17 2024-04-04 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
EP3539975A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
JP7539161B2 (ja) 2018-08-10 2024-08-23 ユーティレックス カンパニー リミテッド Ｈｌａ－ｄｒに結合するキメラ抗原受容体およびｃａｒ－ｔ細胞
EP3852911B1 (en) 2018-09-21 2025-01-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
PL3908568T3 (pl) 2019-01-11 2024-12-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipidy do dostarczania środków czynnych w nanocząstkach lipidowych
BR112021017770A2 (pt) 2019-03-08 2021-11-16 Obsidian Therapeutics Inc Composições e métodos de cd40l para regulação ajustável
CA3155669A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CA3161098A1 (en) * 2020-01-03 2021-07-08 Ascendis Pharma A/S Conjugates undergoing intramolecular rearrangements
AU2021205416B2 (en) 2020-01-08 2026-08-06 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tunable regulation of transcription
EP3885440A1 (en) 2020-03-26 2021-09-29 Splicebio, S.L. Split inteins and their uses
KR20230051172A (ko) 2020-07-16 2023-04-17 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노 입자에 사용하기 위한 양이온성 지질
WO2023114943A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US12534540B2 (en) 2023-01-23 2026-01-27 Clemson University Research Foundation CYP1A1-targeted monoclonal antibody with reactivity across vertebrate taxa
WO2025109139A1 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Fundació Privada Institut D'investigació Oncològica De Vall Hebron Rodent models obtained by knock-in of the human her2 gene

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE757840A (fr) * 1969-10-23 1971-04-22 Basf Ag Procede de preparation d'amines a partir d'alcools
US4014933A (en) * 1969-10-23 1977-03-29 Basf Aktiengesellschaft Production of amines from alcohols
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production

Also Published As

Publication number Publication date
ATE200662T1 (de) 2001-05-15
HUT77171A (hu) 1998-03-02
GR3035759T3 (en) 2001-07-31
FI972366A7 (fi) 1997-06-04
FI972366L (fi) 1997-06-04
AU713662B2 (en) 1999-12-09
MX9703928A (es) 1998-05-31
ZA9510326B (en) 1996-06-11
NO972566D0 (no) 1997-06-05
FR2727679B1 (fr) 1997-01-03
KR100447517B1 (ko) 2004-11-20
NO972566L (no) 1997-06-05
BR9510080A (pt) 1997-12-30
CA2208184A1 (fr) 1996-06-13
FI972366A0 (fi) 1997-06-04
WO1996017823A1 (fr) 1996-06-13
FR2727679A1 (fr) 1996-06-07
JPH10509958A (ja) 1998-09-29
US6107286A (en) 2000-08-22
ES2157351T3 (es) 2001-08-16
SK282601B6 (sk) 2002-10-08
PT796240E (pt) 2001-09-28
EP0796240B1 (fr) 2001-04-18
AU4307296A (en) 1996-06-26
IL116251A (en) 2000-11-21
DK0796240T3 (da) 2001-05-07
IL116251A0 (en) 1996-03-31
CZ289513B6 (cs) 2002-02-13
EP0796240A1 (fr) 1997-09-24
DE69520748D1 (de) 2001-05-23
SK70197A3 (en) 1997-11-05
DE69520748T2 (de) 2001-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6107286A (en) Lipopolyamines as transfection agents and pharamaceutical uses thereof
CA2235721C (fr) Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
US6200956B1 (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
US6346516B1 (en) Cationic amphiphiles containing N-hydroxyalkyl group for intracellular delivery of biologically active molecules
AU3659097A (en) Cationic amphiphile/ DNA complexes
AU723998B2 (en) Compounds related to the amidinium family, pharmaceutical compositions containing same, and uses thereof
AU759197B2 (en) Transfecting compounds which are sensitive to reducing conditions, pharmaceutical compositions containing them and their applications
US6812218B2 (en) Lipid derivatives of polythiourea
MXPA97003928A (en) New transfection agents and their pharmaceutical applications
CZ20002713A3 (cs) Činidlo pro přenos nukleové kyseliny citlivé k redukujícím podmínkám, farmaceutické » přípravky obsahující toto činidlo a použití činidla

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20051204