CZ172497A3 - Fragments of monoclonal substance exhibiting immunosuppressor activity - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká fragmentů monoklonální ? protilátky, majících imunosupresorickou aktivitu.

Ol-l3AO'iS λΙΛί QHd avyci

Z 6 (ΙΑ ε 1

Dosavadní stav techniky . 0T§00 !

o 2. $ f e θ

Třída II molekul hlavního histokomapatibilního komplexů^Λ (MHC) váže antigenní peptidové fragmenty a presentuje je pomocným (CD4+) T buňkám (Th buňkám) (1). U monoklonSInTcjT^™™^ protilátek (MAb) specifických pro třídu II MHC molekul se ukázalo, že jsou extremně silnými selektivními inhibitory odpovědi Th buněk in vitro (2). Vzhledem k tomuto zjištění byly tyto považovány za potenciální léčiva pro selektivní imunosupresivní terapii autoimunitních chorob, jako je revmatoidní artritida. Počáteční in vivo studie ukázaly prospěšný vliv těchto mAb na Th buňkami zprostředkované hetero a autoimunitní odpovědi (3 - 6). Nicméně, v některých případech byla experimentální in vivo aplikace specifických mAb proti třídě II MHC asociována s neočekávanými komplikacemi spojenými s úmrtím laboratorních primátů (7,

8). Pozdější pozorování snížila zájem o další studie imunomodulace MHC specifickými mAb. Nedávná publikace popsala, že 10ti násobná redukce exprese třídy II MHC u transgenních myší způsobuje neodpovídavost Th buněk díky neúčinné antigenní presentaci (19). Toto ukazuje, že redukce exprese třídy II MHC koreluje s imunosupresí v in vivo modelu.

Podstata vynálezu

Podle vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že monovalentní mAb fragmenty (Fab) mAb, které mají schopnost snižovat expresi HLA-DR, mohou samy o sobě snižovat takovou expresi HLA-DR bez cytotoxicity mAb bud samostatně, nebo jako bivalentní fragmenty (F)ab)'2) mAb. Fab fragmenty podle vynálezu jsou proto silnými pro třídu II MHC specifickými imunosupresivními sloučeninami bez cytotoxických vedlejších účinku. Protože je dále vynález popsán podrobněji, je dále podán stručný popis obrázků.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1: Účinky DR vázajícícího se kompetitorního peptidu a DR specifické mAb na EBV transformovanou B buněčnou linii Priess.

Obrázek 2: Časový průběh modulačních a cytotoxických účinků mAb L243 na LG2 .

Obrázek 3: Trvání modulačních a cytotoxických účinků L243 na LG2 po odstranění mAb.

Obrázek 4: Snížení HLA-DR exprese v různých APC populacích po kokultivaci s DR specifickou mAb L243 a jejími fragmenty.

Obrázek 5: účinky zvýšené koncentrace DR specifického Fab fragmentu na EBV transformovanou B buněčnou linii LG2.

Obrázek 6: účinky prolongované kokultivace L243 a jejích fragmentů na LG2 buňky.

Obrázek 7: Závislost EBV-LCL cytotoxicity na DR-zkříženou vazbu.

Obrázek 8: Selektivita DR downregulation na klidové B buňky a monocyty/makrofágy.

Obrázek 9: Selektivita DR downregulation na B buněčné blasty.

Obrázek 10: Selektivita DR downregulation na LG2 buňky.

Obrázek 11: Alotypová ne-selektivita DR downregulation způsobené mAb.

Obrázek 12: Downregulation celé třídy II na TS-1O buňkách způsobená 1-1C4 Fab.

Obrázek 13: Nedostatek sekrece TNFa zvýšený při kokultivaci LG2 a Priess buněk s L243 a jejími fragmenty.

Obrázek 14: Požadovaná koncentrace protilátek pro inhibici Th buněk a DR downregulation.

Obrázek 15: účinek anti-DR mAb a Fab fragmentů na presentaci antigenu fixovanými APC.

Obrázek 16: účinek antigenu zavedeného na silné mAb, Fab a peptidové antagonisty.

Obrázek 17: Relativní účinky Fab a peptidu na křivky odpovědi v závislosti na dávce antigenu.

Obrázek 18: účinek třídy II antagonistu na nástup odpovědi Th buněk.

Jisté monoklonální protilátky (mAb), které jsou specifické pro HLA-DR (lidský leukocytární antigen typu DR; třída II hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) molekul) mohou snižovat expresi HLA-DR molekul na povrchu leukocytů, které jsou antigen presentujícími buňkami (APC) o asi 90%. Stejné mAb také inhibují aktivaci klonů lidských Th buněk, které vyžadují presentaci antigenu HLA-DR molekulami pro aktivaci. Inhibiční potenciál takových mAB je několikasetkrát až nekolikatisíckrát vyšší než potenciál nyní dostupných peptidových antegonistů (viz. tabulka 1, níže). Toto snížení exprese HLA-DR a inhibice aktivace Th buněk je farmakologickou aktivitou, jejímž výsledkem je imunosuprese. Tato imunosuprese může být využitelná v léčbě autoimunitních chorob, zejmena revmatoidní artritidy.

Podle vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že monovalentní, antigen vázající mAb fragmenty (Fab) mAb, mající schopnost snižovat expresi HLA-DR mohou sami snižovat takovou HLA-DR expresi bez cytotoxicity mAb, bud samy, nebo jako bivalentní fragmenty (F(ab)'2) mAb. Fab fragmenty podle vynálezu jsou proto silné, pro třídu II MHC specifické imunosupresivní sloučeniny bez cytotoxických vedlejších účinků. Tak předkládaný vynález obsahuje Fab fragment anti-HLA-DR mAb, kde uvedená intaktní mAb je cytotoxická pro antigen presentující buňky a snižuje HLA-DR expresi na zbývajících antigen presentujících buňkách. Taková mAb inhibuje aktivaci Th buněk. mAb, ze kterých jsou Fab fragmenty podle předkládaného vynálezu odvozeny, se všechny vážou na první doménu HLA-DR.

Příklady tří downregulujících mAb použitelných podle vynálezu jsou:

LB3.1 (myší IgG2b, pan-DRal-specifická; odkazy 9-10);

L243 (myší IgG2a, pan-DRal-specifická; odkazy 10-11; ATCC přírůstkové číslo HB55); a

SFR3-DR5 (krysí IgG2b. DRB1* 1lOX-specifická; odk. 13;

ATCC přírůstkové číslo HB-151).

Kromě toho, HLA-DR downregulující mAb, 1-1C4 (myší IgG2a, β-řetězec specifická; odk. 14), která navíc downreguluje HLA-DQ a -DP, byla generována konvenčními prostředky jak je popsáno v příkladu 22. Tak jsou Fab fragmenty výše uvedené mAb zahrnuty v předkládaném vynálezu.

V souladu se schopností downregulujících mAb inhibovat aktivaci Th buněk, pět non-downregulujících mAb, CCCL20 (myší IgG2b,, specifická pro tři DRB1 (β-řetězec) alelické formy (DRBl*0101, DRBl*0401, DRBl*0404; odk. 12) a 8D1, 9F1, 9F2, 10F12 (všechny čtyři myší IgGl), inhibují aktivitu Th buněk pouze velmi slabě nebo vůbec.

Aktivní mAb jsou cytotoxické pro B lymfoblastoidní buňky a pro malou část normálně aktivovaných B buněk. Stejně jako mAb, bivalentní (F(ab)'2) fragmenty těchto mAb zprostředkují downregulaci, ale jsou také cytotoxické. Nicméně, podle vynálezu, monovalentní Fab fragmenty těchto mAb ztratily cytotoxicitu, ale překvapivě si zachovaly downregulující vlastnosti původní mAb.

Anti-HLA-DR mAb použité pro získání Fab fragmentů podle vynálezu mohou být produkovány jakýmikoliv konvenčními prostředky, např. obecně postupy prvně popsanými Kohlerem a Milsteinem. Injekcí antigenu do myši nebo krysy, králíka, ovce a podobně (preferovaně myši) mohou být připraveny monoklonální protilátky odebráním protilátky produkujících buněk z takového imunizovaného zvířete a imortalizací uvedených buněk konvenčním způsobem fúzí s myelomovými buňkami, např. PAI myšími myelomovými buňkami, SP2/0- nebo SP2/0-Agl4-buňkami (ATCC č. CRL 1581; ATCC č. CRL 8287) (pro obecný návod pro produkci protilátek viz. např. Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow and Lee, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Supernatanty kultur takových hybridomů potom mohou být vyšetřovány na monoklonální protilátky (mAb) běžnými postupy jako je rádioimuno- nebo enzymimuno- nebo tečková imunovazba nebo imunofluorescenčními testy. mAb mohou být purifikovány ze supernatantu hybridomů běžnými chromatografickými postupy jako je například iontová výměnná chromatografie, afinitní chromatografie na proteinu A, anti-imunoglobulinovými protilátkami nebo navázáním antigenu nebo jeho části na pevný nosič, HPCL a podobně. Produkce mAb použitelných podle vynálezu je ukázána v příkladu 22.

Pro produkci velkých množství mAb, podle metod dobře v oboru známých, mohou být hybridomy secernující požadovanou protilátku injikovány intraperitoneálně myším, které byly předem ošetřeny, například, přistáném před injikováním. Více než 100 mg mAb může být produkováno výsledným nádorovým ascitem u jedné myši. mAb mohou být purifikovány z ascitu produkovanému takovými nádory metodami popsanými výše.

mAb mohou být charakterizovány na jejich podtřídy známými metodami, jako je Ouchterlony imunodifuse. V oboru je také známé, že mAb mohou být modifikovány pro různé použití, nebo mohou být generovány jejich fragmenty, které jsou stále ještě schopné vazby antigenu. Takové fragmenty mohou být generovány například, enzymovým trávením mAb papainem, pepsinem a podobně.

Imunogenem pro produkci mAb, který může být použit podle vynálezu je preferovaně HLA-DR β-řetězec (viz. například W092/10589; J. Biol. Chemistry 262: 8748 - 8758 (1987); informace o sekvenci může být také získána z databáze sekvencí, napříkad jako je Genbank (Intel 1igenetics, California, USA), European Bioinformatics Institute (Hinxton Halí, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) a Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Medision, Wisconsin, USA); takové sekvence mohou být použity podle metod v oboru známých k produkci antigenu pro přípravu monoklonálních protilátek pro použití v předkládaném vynálezu), který byl purifikován běžnými prostředky, jako je SDS-PAGE.

Identifikace výše popsaných anti-HLA-DR mAb, které jsou cytotoxické pro APC a také snižují HLA-DR expresi může být provedena jakýmikoliv běžnými prostředky. Preferovaně je tato identifikace provedena v souladu s příkladem 3, kde je použito virem Epstein-Barrové transformované lidské B-lymfoblastické buněčné linie (EBV-LCL) jako modelu APC (zejména aktivovaných B buněk). Kultury alespoň 1 ml obsahující okolo 10⁵ EBV-LCL buněk na ml jsou preferovaně použity. Kultura je inkubována s 20 nM anti-HLA-DR mAb po 16 hodin, a počet mrtvých buněk a HLA-DR exprese u zbývajících přeživších buněk je určen běžnými prostředky. Pro účely tohoto vynálezu jsou cytotoxicita a snížení exprese definovány takto: 1) mAb je cytotoxická pro antigen presentující buňku, jestliže, za výše uvedených podmínek, je usmrceno alespoň 25 %, lépe 40 % EBV-LCL antigen presentujících buněk intaktní mAb; a 2) mAb snižuje HLA-DR expresi na antigen presentujících buňkách jestliže, za výše uvedených podmínek, redukuje množství HLA-DR molekul na povrchu EBV-LCL antigen presentujících buněk, které zůstávají naživu, alespoň v průměru o 50 %.

EBV-LCL antigen presentující buňky jsou označeny pro detekování mrtvých buněk a pro měření HLA-DR exprese přežívajících buněk běžnou imunofluorescencí. Buňky jsou analyzovány za použití průtokového cytometru (např. FACScan,

Becton - Dickinson, San Jose, California) a procento mrtvých buněk a redukce HLA-DR exprese na zbývajících buňkách je počítána běžnými prostředky, preferovaně za použití softwaru normálně používaného ve spojení s průtokovým cytometrem (např. LYSIS II software s FACScan cytometrem).

EBV-LCL použité pro vyšetřování na monoklonální protilátky nejsou zásadní. Jakékoliv běžné EBV-LCL mohou být použity podle vynálezu. Příklady EBV-LCL použitelných podle vynálezu jsou Priess (ECACC (Salisbury, UK) přírůstkové č. 86052111), LG2 (Instituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro (Genová, Italy) přírůstkové č. G201 12301), a TS-10 (ECACC (Salisbury, UK) přírůstkové č.85102911).

Fab fragmenty výše popsaných mAb mohou být produkovány jakýmikoliv běžnými prostředky. Fab fragmenty mohou být produklovány trávením původní mAb pepsinem a izolováním Fab fragmentů prostředky v oboru známými (např. Andrew and i Titus, Fragmentation of immunoglobulin G, Current

Protocols in Immunology, Coligan et al., eds. (Greene and * Wiley 1994)). V souladu s tím jsou tyto procesy a Fab fragmenty připravené takovými procesy také předmětem předkládaného vynálezu. Preferovaně jsou Fab fragmenty podle vynálezu produkovány rekombinantní buněčnou linií, která exprivuje gen, který kóduje požadovaný Fab fragment. Takové rekombinantní buněčné linie mohou být produkovány jakýmikoliv běžnými prostředky. Například, část genu kódující Fab fragment může být klonována běžnými prostředky z hybridomu, který secernuje původní mAb Fab fragmentu. cDNA Fab fragmentu může potom být inkorporována běžnými prostředky do expresního vektoru, který je potom použit pro transfekci vhodné buněčné linie.

Preferované Fab fragmenty podle vynálezu jsou humanizované, takže jsou méně antigenní při podání lidem než Fab fragmenty, které jsou produkovány přímo ze zvířecí, preferovaně myší, mAb. Způsob, kterým jsou humanizované Fab fragmenty podle vynálezu produkovány není zásadní.

Jakékoliv běžné prostředky v oboru známé mohou být použity. Takové metody využívají skutečnosti, že imunoglobulin (Ig) , jako je monoklonální protilátka, se skládá z konstantní domény a variabilní domény, na které se vyskytuje místo vazby antigenu. Variabilní doména se skládá ze šesti komplementaritu určujících regionů (CDR) uložených v regionu pracovního rámečku (tři CDR na lehké a těžkém řetězci Ig). (42). Jsou to CDR, které jsou zodpovědné za specifitu mAb. Protože mAb jsou myšího nebo jiného zvířecího původu je provedena humanizace mAb v podstatě nahrazením alespoň jednoho, nebo lépe všech šesti, CDR lidského * imunoglobulinů korespondujícími CDR zvířecí mAb mající požadovanou specifitu. Tak slouží lidský Ig jako pracovní • rámeček pro zvířecí CDR. V takových postupech je zvířecí mAb, obvykle myší, popisována jako donor a lidský Ig je označován jako akceptor.

Další doladění aminokyselinové sekvence humanizovaných mAb jak je popsáno v oboru může také být provedeno pro optimalizaci specificity humanizované mAb pro antigen. Například, publikovaná mezinárodní patentová přihláška č. WO 90/7861 objasňuje, že by měl být vyšetřován panel 10 - 20 lidských Ig a ten lidský Ig, jehož variabilní region má ’ nejvyšší stupeň homologie s variabilním regionem myšího dárce mAb, typicky 65% - 70% nebo vyšší homologii, by měl být použit jako akceptor. Další substituce donor aminokyselin za akceptor aminokyseliny (typicky okolo tří substitucí) mohou být provedeny mimo CDR na základě čtyř kriterií popsaných v WO 90/7861 na str. 12 - 15.

V jiném příkladu humanizace známém v oboru objasňuje EP 0 620 276 hierarchii jednotlivých substitucí, které mohou být provedeny na Ig akceptoru mimo přenesené CDR dárce tak, aby se zvýšila specifita humanizované mAb. Takové substituce jsou popsány jako vyhýbající se nutnosti selektování Ig lidského akceptoru, jehož variabilní region má vysoký stupeň homologie s variabilním regionem mAb donoru. Specifický protokol pro humanizaci je poskytnut v EP 0 620 276 na str. 8-9.

Metody pro generování DNA sekvencí pro expresi humanizovaných intaktních mAb v hostitelských buňkách * využitelné pro získání Fab fragmentů podle vynálezu, nebo pro expresi humanizovaných Fab fragmentů podle vynálezu, jsou v oboru známé a nejsou zásadní. Takové metody zahrnují, například, místně řízenou mutagenesi, konstrukci celých variabilních regionů za použití přesahujících oligonukleotidů, které inkorporují zvířecí CDR na lidský rámeček, a použití PCR přenosu. (WO 90/7861, EP 0 620 276, odk. 43).

Tak může být vynález dále popsán jako Fab fragment obsahující imunoglobulinový Fab fragment a šest komplementaritu určujících regionů, které jsou obsaženy v uvedeném imunoglobulinovém Fab fragmentu, kde jeden až šest z uvedených komplementaritu určujících regionů jsou komplementaritu určující regiony monoklonální protilátky mající následující vlastnosti:

1) monoklonální protilátka se váže na první doménu HLA-DR,

2) monokolonální protilátka je cytotoxická pro antigen presentující buňky, které exprivují HLA-DR,

3) monoklonální protilátka snižuje HLA-DR expresi na antigen presentujících buňkách.

Preferovaným provedením vynálezu je humanizovaný Fab fragment kde, v souladu s výše uvedeným, je imunoglobulinovým Fab fragmentem je lidský fragment a monoklonální protilátka mající vlastnosti 1 - 3 je zvířecí, preferovaně myší. Tento humanizovaný Fab fragment může být lidský imunoglobulinový Fab fragment, ve kterém bylo jeden až šest CDR v něm obsažených nahrazeno korespondujícími CDR zvířecí mAb. Tak je preferovaným Fab fragmentem podle vynálezu Fab fragment obsahující lidský imunoglobulinový Fab fragment a šest komplementaritu určujících regionů, které jsou obsaženy v uvedeném lidském imunoglobulinovém Fab fragmentu, kde jeden až šest z komplementaritu určujících regionů jsou komplementaritu určující regiony monoklonální protilátky mající vlastnosti 1-3, výše.

Je preferováno, aby tento humanizovaný Fab fragment podle vynálezu obsahoval všech šest zvířecích mAb CDR.

V případě, že imunoglobulinový Fab fragment je zvířecího původu je uvažováno, že Fab fragment podle vynálezu může být Fab fragment monoklonální protilátky, sám o sobě, který má vlastnosti 1-3, výše. Takový Fab fragment bude užitečný jako intermediát pro použití při získáni zvířecích CDR, které budou obsaženy v preferovaném humanizovaném Fab fragmentu podle vynálezu.

Preferované Fab fragmenty podle vynálezu mají podobné vlastnosti jako Fab fragmenty získané z monoklonálních protilátek LB3.1, L243, SFR3-DR5 a 1-1C4, jak jsou popsány výše. Protože Fab fragmenty podle vynálezu inhibují aktivaci Th buněk, mohou být použity v léčbě různých chorob, ve kterých jsou aktivované Th buňky zdrojem poškození chorobou nebo příznaků. Jednou z takových chorob je revmatoidní artritida. (33). Snížení exprese HLA-DR na APC u pacienta s revmatoidní artritidou, a tím inhibování aktivace Th buněk u takového pacienta, může zpomalit nebo zastavit progresi choroby. Inhibování aktivace Th buněk u pacienta s revmatoidní artritidou může také zmírnit příznaky, jako je bolest a zánět, snížením nebo zastavením uvolňování mediátorú, které jsou příčinou těchto příznaků.

Tak vynález také obsahuje Fab fragment jak je zde popsán a jeho použití jako terapeuticky aktivního agens a přesněji jako imunosuprivujíčího agens pro léčbu revmatoidní artritidy a metodu pro suprivování imunitní odpovědi u pacienta obsahující podání terapeuticky účinného množství Fab fragmentu podle vynálezu pacientovi, který potřebuje « takovou léčbu. Vynález dále obsahuje metodu pro léčbu revmatoidní artritidy u pacienta podáním terapeuticky účinného množství Fab fragmentu podle vynálezu pacientovi, který potřebuje takovou léčbu. Množství podaného Fab fragmentu může být určeno běžnými prostředky. Také podání Fab fragmentu podle vynálezu může být provedeno jakýmikoliv běžnými prostředky.

Podání Fab fragmentu podle vynálezu je preferovaně provedeno za použití farmaceutické kompozice podle vynálezu (popsané níže). Podání je preferovaně provedeno parenterálně (subkutánně, intramuskulárně nebo intravenosně), zejména intravenosně. Dávka požadovaná pro inhibici aktivace Th buněk u pacienta, a tak pro léčbu revmatoidní artritidy, může být určena jakýmikoliv běžnými prostředky, například klinickým zkoušením limitující dávky. Nicméně, dávka okolo 1 - 10 mg/den i.v., zejména okolo 3-7 mg/den, a ještě lépe okolo 5 mg/den je preferována (34, 35), a je preferovaně podána jako bolus. Léčba je preferovaně jedenkrát denně po i jeden týden nebo méně, nicméně denní léčba může pokračovat po více než tři týdny, pokud je to nezbytné.

Fab fragmenty podle vynálezu mohou být formulovány jako kapalné farmaceutické kompozice, např. pro parenterální podání obsahující Fab fragment podle vynálezu rozpuštěný v běžném farmaceuticky akceptovatelném kapalném materiálu nosiče. Kompozice může dále obsahovat jiné farmaceuticky akceptovatelné aktivní substance. Preferovaně obsahuje kompozice okolo 0,5 - 5 mg/ml Fab fragmentu podle vynálezu, zejména okolo 1-2 mg/ml. Preferovaný kapalný nosič je sterilní fyziologický salinický roztok.

Výsledky popsané níže v příkladech 1-7 ukazují, že inhibice aktivace Th buněk HLA-DR- specifickou raAb může být způsobena několikerým dějem: a) eliminací dostupných APC přímou cytotoxicitou, b) redukcí dostupných HLA-DR molekul na přežívajících APC snížením exprese na povrchu buněk, c) bráněním interakce třídy II MHC - TcR. Inhibice Th buněk se může také vyskytnout prostřednictvím mAb blokování peptidové vazebné drážky na Dr molekule, což jí činí nedostupnou pro antigen (30). Je proto nepochopitelné, proč jsou mAb vyšší inhibitory Th buněk než nynější antagonisté peptidů, jejichž účinek je výlučně založen na blokování vazebného místa pro antigen na HLA-DR molekulách.

Mechanismus průběhu cytotoxicity a snížení exprese třídy II zůstává předmětem výzkumu. Nicméně, je jasné, že cytotoxicita vyžaduje zkříženou vazbu, zatímco snížení exprese je dosaženo monovalentními Fab fragmenty podle vynálezu bez cytotoxicity původní mAb. Tento rozdíl umožňuje separaci těchto dvou vlastností fragmentací protilátky. Za předpokladu, že dříve pozorované vedlejší účinky Ab proti třídě II (7, 8) byly alespoň částečně asociovány s přímou cytotoxicitou mohou Fab fragmenty podle vynálezu sloužit pro terapeutické použití těchto protilátek jako imunosupresorú, bez vedlejších účinků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Isotypová specifita anti-DR mAb

Přesné specifity mAb byly určeny jejich schopností barvit myší buněčné linie transfektované geny třídy II lidských HLA.

Metody: Myší fibroblastové linie transfektované ukázanými lidskými geny třídy II (15), stejně jako netransfektované hostitelské buňky (Lmtk^-) byly barveny standardní nepřímou imunofluorescencí za použití DR- specifické mAb a FITC-konjugovaného kozí anti-myšího Ig (Southern,

Birmingham, Alabama) jako primárního a sekundárního reagens, v příslušném pořadí. Vzorky byly analyzovány na FACScan průtokovém cytometru (Becton-Dickinson, San Jose, California). Výsledky jsou ukázány v tabulce 1. a přítomnost a nepřítomnost testované protilátky, v příslušném pořadí; NT, netestováno.

Závěr: Protilátky 8D1, 9F1, 9F2 a Í0F12 jsou pan-DR specifické, zatímco 1-1C4 mohou rozpoznávat všechny tři izotypy lidské třídy II (DR, DP a DQ).

CM o

CM

u.

C\

Tabulka 1. Barveni vzorků pan-DR specifické mAb

Q oo

H

Vd t-t

Ή >tZ) tí fd > o >

•H S-i s- a w w vd >

O r>

M fd r—i €

Λ •r) ní b

Ή >H

4J

0)

H •H r-1

1	+	4.
1	•ř	+
1	4.	+
1	Z	+
»		-r
	Z o	z ®
	»w/ —·
	o ř	5?
1	* —	* MM
	< co	< a
	cí c:	CÍ Cí
	G G	G G
	ΓΊ	o
	CM	cn
	r-’	C
C	VD	CM
M-J	—	-3

+

CM

T

O *

a !Z — i :z iz

O 'ίΟ *

a r\X

V

Z O

ΤΓ

5?

íř mm < O <*✓ rZ ►** MM

G

Z c ~ G o ? # — < a ta cí !Z

C I ϋ.

i CM

J 1 J

O * * _ < CO cí e: G Q

5§

O * * MM < ea cí cí Q Q o

r->

i

CM		CM
—	Γ*	t~7
'T	·—	O
CM	O
·>

CM

G	CM
© ?	01 20
	— o
o *	o *
* _	* CD
< o	< a
Cí Cí	a cí
G Q	G G

vr.

# <

Cí

CM

CG Ό

Μ-J t mJ i —'

PRB3*OIOI

DRA*0I01/

DRB4*0101 náhradní list (prav.26)

Příklad 2

Specifita řetězců a domén anti-HLA-DR mAb

Metody: Za použití standardních metod klonování genů, rekombinace a transfekce (10) byly generovány dvě myší buněčné linie exprivující chimérické lidské/myší molekuly třídy II. Transfektant M12.C3.25 byl odvozen od myší třída II negativní hostitelské buněčné linie M12.C3 (15) a exprivuje MHC produkt složený z al a βΐ domén odvozených od lidského HLA-DRA*0101/DRBl*0401 molekuly, a a2 a β2 domény myšího I-E^d proteinu, na který se neváží DR-specifická reagens. Transfektant CH27.105 byl odvozen od myší třída II pozitivní hostitelské buněčné linie CH27 (16) a exprivuje původní myší Εβ^κ řetězec asociovaný s chimérickým 1idským/myším a řetězcem popsaným výše. Standardní nepřímé imunofluorescenční barvení bylo provedeno za použití značeného IgGž a IgGl protilátek, v konjunkci s proteinem A-FITC (Boehringer, Mannheim, Germany) a kozím anti-myším IgGi-FITC (Southern, Birmingham, Alabama), v příslušném pořadí. Vzorky byly analyzovány na FACScan průtokovém cytometru (Becton - Dickinson, San Jose, California). Výsledky jsou ukázány v tabulce 2 (presentace je jako v tabulce 1).

Závěr: Výsledky potvrzují dříve popsanou DRal specifitu LB3.1 a L243 (10). Protilátky 8D1 a 1 —1C4 jsou βίspecifické, zatímco epitop rozpoznávaný CCCL20 se zdá být β2 doména. Zbývající reagens (9F1, 9F2, 10F12) se pravděpodobně váží na determinanty exprivované druhou HLA-DR doménou. Korespondující epitop anti-DRB*110X mAb nemůže být mapován za použití těchto transfektantů, protože SFR3-DR5 nerozpoznává DRB*0401 alotyp.

ΟΙ

ΟΙ a

οι ΟΙ S =² U ~ li 11 ι < ι φ

•Η tí •Η γΗ

X!

Ο £

φ '>ι ν Λ! ο \φ Μ > β Ό Ό H) ·Η Ο XL) £5 2 Λ

U Ti 2 — I OC

Oí

04.* tX< Os Oý ~

CCCL20

H φ H ω

Φ Φ Ή Ρ Ό XZJ (¾ Ή

X >Ρ

W 4->

'Β •Η

Φ

4J

Ο

Ρ

Λ

Účinek anti-DR mAb a jejich fragmentů na HLA-DR expresi a přežívání buněk.

DR exprese a přežívání antigen presentujících buněk (APC) překultivovaných s bud DR-vážícím kompetitorním peptidem aXA (17), nebo DR-specifickou mAb byla vyšetřována v příslušných koncentracích, které v případě aXA a dvou mAb (LB3.1,

1-1C4), blokovaly presentaci antigenu Th buňkám. Jako APC byla použita virem Epsteina- Barrové transformovaná lidská B-lymfoblastická buněčná linie (EBV-LCL).

Příklad 3 účinky DR vážícího kompetitorního peptidu a DR-specifické mAb na EBV-LCL.

Metody: EBV-LCL (Priess, ECACC (Salisbury, UK) přírůstkové č. 86052111) (10⁵ buněk/ml) byly kultivovány za přítomnosti Dr- specifické mAb (LB3.1, 1-1C4, CCCL20) nebo peptidu aX-A (aXAAAKTAAAAa-NH2; odk. 17) v koncentracích ukázaných na obrázku 1 po 16 hodin. Buňky byly následně promyty a barveny standardní nepřímou fluorescencí za použití DR-specifické mAb (LB3.1 (a), CCCL20 (b), 1-1C4 (c)) a FITC-konjugované kozí anti-myší Ig (Southern Biotechnology Associates lne., Birmingham, Alabama), jako primárního a sekundárního reagens, v příslušném pořadí. Vzorky byly analyzovány na FACScan průtokovém cytometru (Becton - Dickinson, San Jose, California). Výsledky jsou ukázány na obrázku 1. Osa X representuje HLA-DR expresi a osa Y fluorescenci propidiumjodidem barvených mrtvých buněk, oboje v arbitrážních jednotkách fluorescence. Pozadí representuje kontrolní populaci buněk kultivovanou po 16 hodin v normálním mediu a následně značenou primárním reagens, v příslušném pořadí.

Závěr: Kokultivace s peptidem aXA (Obr. la) neovlivňuje signifikantně ani přežívání buněk, ani DR expresi, zatímco DR specifická mAb LB3.1 (obr. 1A) a 1-1C4 (obr. lc) indukují vysokou cytotoxicitu, stejně jako redukovanou expresi DR na přežívajících buňkách. Nicméně, tyto vlastnosti nebyly sdíleny všemi anti DR mAb, protože CCCL20 neovlivňuje ani přežívání, ani DR expresi, a to ani ve zvýšené koncentraci (obr. lb).

DR downmodulace a cytotoxicita na EBV-LCL může být indukována dvěma dalšími DR specifickými mAb, L243 a SFR-DR5. zatímco čtyři další anti-DR mAb (8D1, 9F1, 9F2 a 10F12) nebyly ani cytotoxické, ani neredukovaly DR expresi (data nejsou ukázána).

Příklad 4

Časový průběh modulačního a cytotoxického účinku mAb L243 na LG2.

Metody: EBV-LCL LG2 (Instituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro (Genová, Italy), přírůstkové č. G201 12301) (10⁵ buněk/ml) byly kultivovány za přítomnosti Dr-specifické mAb L243 (Becton-Dickinson) v koncentraci 10 nM po ukázanou časovou periodu. Buňky byly následně promyty a barveny standardní nepřímou fluorescencí za použití DR-specifické mAb L243 a FITC-konjugované kozí anti-myší Ig (Southern, Birmingham, Alabama), jako primárního a sekundárního reagens, v příslušném pořadí. Mrtvé buňky byly barveny propidiumjodidem a vzorky byly analyzovány na FACScan průtokovém cytometru. Výsledky jsou ukázány na obrázku 2. Histogramy representují relativní počet mrtvých buněk (světlé) a živých buněk exprivujících snížené množství HLA-DR (tmavé).

Závěr: In vitro studie kinetiky ukázaly detekovatelnou cytotoxicitu mAb po 2 hodinách, a plató toxicity po 8 hodinách. Snížená exprese Dr se stala detekovatelnou po 4 hodinách a dosáhla svého vrcholu po 8 hodinách.

Příklad 5

Trvání modulačních a cytotoxických účinků L243 na LG2 po odstranění mAb

Metody: EBV-LCL LG2 (10⁵ buněk/ml) byly kultivovány za přítomnosti Dr-specifické mAb L243 (Becton-Dickinson) v koncentraci 10 nM po ukázanou časovou periodu. Protilátka byla odstraněna 3x promytím a buněčná kultura pokračovala ve stejném objemu čerstvého media, jak je ukázáno. Buňky byly následně promyty a barveny standardní nepřímou fluorescencí za použití DR-specifické mAb L243 a FITC-konjugované kozí anti-myši Ig (Southern, Birmingham, Alabama), jako primárního a sekundárního reagens, v příslušném pořadí.

Mrtvé buňky byly barveny propidiumjodidem a vzorky byly analyzovány na FACScan průtokovém cytometru. Výsledky jsou ukázány na obrázku 3.

Histogramy representují relativní počet mrtvých buněk (světlé) a živých buněk exprivujících snížené množství HLA-DR (tmavé).

Závěr: Protilátkami indukovaná snížená exprese DR trvá po 16 hodin po odstranění mAb

Příklad 6

Snížená HLA-DR exprese v různých APC populacích po kokultivaci s DR-specifickou mAb L243 a jejími fragmenty.

Dále byl vyšetřován účinek anti DR mAb na různé netransformované MHC třída II pozitivní buněčné subpopulace: klidové a aktivované B buňky, monocyty/makrofágy a aktivované Th buňky.

Metody: Izolace B buněk a monocytú/makrofágů z čerstvé periferní krve byla provedena odebráním T buněk plus monocytů nebo B buněk (kde to bylo aplikovatelné) před kultivací, za použití magnetických korálků (Dynal) předem potažených mAb specifickou pro CD3 (SK7) a CD14 (ΜΦΡ9) nebo CD19 (4G7), v příslušném pořadí (Becton.Dickinson). Th a blasty B buněk byly generovány 3-5 denní in vitro stimulací mononukleárních buněk periferní krve s fytohemaglutininem (1 pg/ml; Sigma) a mitogenem líčidla amerického (2,5 |xg/ml; Sigma), v příslušném pořadí. L243 byla trávena pepsinem a papainem, aby se izolovali F(ab)^K2 a Fab fragmenty, v příslušném pořadí, jako v odk. 18. Netrávené protilátky a jejich Fc fragmenty byly odstraněny afinitní chromatografií na protein G kolonách. APC (10⁵ buněk/ml) byly kultivovány za přítomnosti ekvivalentních koncentrací kompletní L243 protilátky (10 nM) nebo jejího F(ab)'2 (10 nM) a Fab (20 nM) fragmentů po 16 hodin, jak je ukázáno na obrázku 4. Buňky byly potom promyty a barveny jako v příkladu 3. Výsledky jsou ukázány na obrázku 4. X osa representuje HLA-DR expresi a osa Y fluorescenci propidiumjodidem barvených mrtvých buněk, oboje v arbitrážních jednotkách fluorescence. Čísla ukazují procento buněk v korespondujících kvadrantech. DR-FITC barvení a pozadí FITC barvení representují kontrolní buněčné populace kultivované po 16 hodin v normálním mediu a následovně značené s a bez primárního reagens, v příslušném pořadí.

Závěr: Exprese DR molekul na povrchu buněk se snížila ve všech populacích za přítomnosti kompletní mAb, stejně jako za přítomnosti jejích bi- a monovalentních fragmentů F(ab)'2 a Fab, v příslušném pořadí. Rozsah DR redukce byl vyšší u B buněk (80 - 90%), střední u monocytárních APC (50 - 65%) a nízký (méně než 50%) u Th buněčných blastů. Kokultivace EBV-LCL a preaktivovaných blastů B buněk s bivalentním anti-DR reagens (kompletní mAb a F(ab)'2 ) vedla k vysoké (60 - 70%) a marginální (5 - 15%) cytotoxicitě, v příslušném pořadí, zatímco monovalentní fragmenty indukovali pouze snížení exprese bez signifikantních smrtí buněk. Cytotoxický účinek byl kompletně nepřítomen u subpopulací klidových B buněk, aktivovaných Th lymfocytů a monocytů/makrofágú preinkubovaných s jakoukoliv formou DR-specifických mAb použitých v těchto pokusech.

Podobné profily (částečně ukázané v dalších sekcích) byly získány za použití kompletních mAb 1-1C4 a LB3.1 a jejich

Fab fragmentů. (F(ab)'2 fragment LB3.1 protilátky nemůže být generován, jelikož její izotyp nedovoluje trávení papainem).

Příklad 7

Účinky zvýšených koncentrací DR specifických Fab fragmentů na EBV transformovanou B buněčnou linii LG2.

Rozdíl ve smyslu cytotoxicity mezi mono- a bivalentními mAb reagens byly zkoumány pro určení toho, zda je to pouze rozdíl kvantitativní, nebo je-li způsoben kvalitativně odlišným mechanismem účinku.

Metody: Jako v příkladech 3 a 6. Výsledky jsou ukázány na obrázku 5. Presentace je jako na obrázku 1.

Závěr: Zvýšené koncentrace L243-Fab selhaly v indukci jakéhokoliv signifikantního snížení přežívání APC.

Příklad 8

Účinky prolongované kokultivace L243 a jejích fragmentů na LG2 buňky

Metody: APC (10⁵/ml) byly kultivovány za přítomnosti ekvivalentních koncentrací kompletní L243 protilátky (10 nM) nebo jejího Fab fragmentu (20 nM) po ukázanou dobu. Buňky byly poté promyty a barveny jako v příkladu 6. Výsledky jsou ukázány na obrázku 6. Presentace je jako na obrázku 2.

Závěr: Prolongovaná kokultivace selhala v indukci jakéhokoliv signifikantního snížení přežívání APC.

Příklad 9

Cytotoxicita EBV-LCL závisí na DR-překřížení

Metody: EBV-LCL (Priess) (10⁵ buněk/ml) byly kultivovány po 16 hodin za přítomnosti L243 Fab (20 nM) fragmentů a kozím anti-myším IgG předem potažených magnetických korálků (anti-Ig; Dynal), tak, aby došlo k překřížení na buněčnou membránu navázaných Fab fragmentů, jak je ukázáno. Buňky byly poté promyty a barveny jako v příkladu 6. Výsledky jsou ukázány na obrázku 7. Presentace je jako na obrázku 1.

Závěr: Překřížení HLA-DR vázaných Fab generuje cytotoxický účinek na EBV-LCL.

Z těchto výsledků dosud popsaných lze usoudit, že:

a) HLA-DR exprivované na jakýchkoliv mononuklerních krevních buňkách může být downregulován a ligací specifické mAb;

b) neočekávaně, DR ligace monovalentního reagens (Fab) může také vést k DR downregulaci;

c) protože je cytotoxicita zjevná pouze na EBV, modelu aktivovaných B buněk, mitogenem preaktivovaných B buněk, je pravděpodobně závislá na aktivačním stavu B buněk; a

d) cytotoxicita je následek DR-překřížení bivalentními ligandy (kompletní mAb a F(ab)'2 , překřížené Fab), a nevyžaduje Fc část protilátky.

Předchozí studie ukázaly, že ligace třídy II molekul s celou mAb nebo receptory T buněk signalizuje sérii změn v APC jako je sekrece cytokinů (19 - 20), modulace buněčného růstu a sekrece imunoglobulinů (21 - 28), upregulace kostimulačních (15) a buněčných adhesních molekul (20, 29) a downregulace CD23 (25). Bylo proto důležité stanovit, zda je snížení DR exprese za prekultivace s mAb omezeno na třídu II molekul ligovaných protilátkou, nebo jestli je to součást globálně indukované downregulace množství proteinů buněčného povrchu. Exprese HLA třída II izotypů DP a DQ, HLA třída I molekul a MHC nepříbuzného adhezního proteinu CD18 byla analyzována na různých subpopulacích APC po kokultivaci s F(ab)'2 nabo Fab fragmenty L243.

Příklad 10

Selektivita DR downregulace na klidové B buňky a monocyty/makrofágy

Metody: Jako v příkladu 6.standardní nepřímé imunofluorescenční barvení mAb specifickou pro HLA-DP (klon B7/21), -DQ (SK10), CD18 (L130) (vše IgGi podtřídy, Becton Dickinson) a anti-HLA třída I (W6-32 IgG2a, Accurate, Westbury, New York) reagens byla použita v konjunkci s kozím anti myším IgGi-FITC a FITC značeným proteinem A (Boehringer, v příslušném pořadí. Tento postup vylučuje další nepřímé FITC značení residuálnho na membránu vázaného DR specifického proti látkového fragmentu. Výsledky jsou ukázány na obrázku 8. Presentace je jako na obrázku 4. Kontrola representuje buněčnou populaci kultivovanou po 16 hodin v normálním mediu a následně značenou proteinem A a FITC konjugovaným kozím anti myším IgGi společně.

Závěr: Zatímco DR molekuly vykazovaly redukovanou expresi, DP, DQ, třída I a CD18 molekuly zůstávaly bez ovlivnění jak v klidových B buňkách, tak v monocytech/makrofágách prekultivovaných s F(ab)'2 fragmenty.

Příklad 11

Selektivita DR downregulace na B buněčné blasty

Metody: Jako v příkladu 10. Výsledky jsou ukázány na obrázku

9. Presentace je jako na obrázku 4.

Závěr: Zatímco DR molekuly byly downregulovány, DP, DQ, třída I a CD18 molekuly zůstávaly bez ovlivnění B buněčných blastech prekultivovaných s F(ab)*2 fragmenty.

Příklad 12

Selektivita DR downregulace na LG2 buňky

Metody: Jako v příkladu 10. Výsledky jsou ukázány na obrázku

10. Presentace je jako na obrázku 4.

Závěr: Zatímco exprese DR moleul se zdá být selektivně redukována ligací Fab, bivalentní F(ab)*2 fragenty indukují signifikantní downregulaci jiných izotypú třídy II, třídy I molekul a CD18. Protože úroveň neselektivní redukce je pouze dvojnásobná a DR redukce je desetinásobná je možné předpokládat, že snížení exprese jiných molekul buněčného povrchu je asociováno s obecnou škodlivostí bivalentních reagens na EBV-LCL.

Příklad 13

Alotypová neselektivita DR downregulace mAb

Modulační mAb LB3.1, L243 a 1-1C4 jsou pan-DR specifické, t.j. nerozlišují mezi různými alelickými formami HLA-DR. Proto nejsou vhodné pro testování alotypové specificity DR downregulace. Nicméně, tato otázka může být zodpovězena za použití downregulační mAb SFR3-DR5, která je exklusivně specifická pro DRB1*11OX (dříve DR 5; odk. 13).

Metody: B buňky (izolované z čerstvé periferní krve heterozygotního DRBl*0101/l101X dárce jako v příkladu 6) byly kultivovány za přítomnosti DRB1*11OX - specifické mAb SFR3-DR5 (20% tekutina supernatantu hybridomu; odk. 14). Buňky byly následně promyty a barveny standardní nepřímou imunofluorescencí s bud DRBl*110X - specifickou mAb SFR3-DR5 nebo s DRB1*Í1OX - specifickou mAb CCCL20 (12), v konjunkci s kozím anti myším a krysím Ig (Southern), jak je ukázáno. Výsledky jsou ukázány na obrázku 11. Presentace je jako na obrázku 4.

Závěr: DRBl*110X - specifické reagens SFR3-DR5 indukovalo downregulaci obou DR alomorfů exprivovaných heterozygotními klidovými B buňkami a také ovlivňovalo DR alotyp nerozpoznaný mAb. Tak se DR downregulace nezdá být alotyp specifickou.

Příklad 14

Pan-třída II downregulace na TS-10 buňkách účinkem 1-1C4 Fab.

Protože mAb 1-1C4 může rozpoznávat β řetězec všech tří izotypů HLA třída II (Dr, DP, DQ), bylo významné testovat, zda je schopná shodně redukovat jejich expresi.

Metody: EBV-LCL TS-10 (ECACC (Salisbury, UK) přírůstkové č. 85102911) byly kultivovány za přítomnosti 1-1C4 Fab (20 nM) , anti-DP mAb (10 nM) nebo anti-DQ mAb (10 nM) po 16 hodin, jak je ukázáno. Buňky byly následně promyty a barveny jako v příkladu 6 a 10. Výsledky jsou ukázány na obrázku 12. Histogram profilu barvení živých buněk jsou ukázány. Osa X representuje intenzitu fluorescence v arbitrážních jednotkách a osa Y relativní počet buněk. Otevřené histogramy representují kontrolní buněčné populace značené příslušným sekundárním činidlem.

Závěr: 1-1C4 downreguluje expresi všech tří izotypů třídy II (DR, DP, DQ) s redukcí intenzity srovnatelnou s redukcí dosaženou pro izotyp specifickou mAb (anti-DP, anti-DQ). Tato downmoduace pan-třídy II 1-1C4 byla selektivní, protože HLA třída I a CD 18 molekuly zůstávaly neovlivněny. Proto kromě využitelnosti pro léčbu HLA-DR-spoených indikací jako je revmatoidní artritida, mohou být Fab fragmenty podle vynálezu získané z pan-třídy II mAb jako je 1-1C4 užitečné pro léčbu chorob spojených s HLA-DP a -DQ expresí, jako je roztroušená sklerosa, diabetes mellitus typ I, myastenia gravis, lupus erythematosus, rejekce orgánového transplantátu a reakce štěpu proti hostiteli (odk. 36 - 41).

Příklad 15

Nedostatek TNFa sekrece se zvyšuje při kokultivaci LG2 a Priess buněk s L243 a jejími fragmenty

Předešlé studie ukázaly, že překřížení DR molekul L243 na EBV transformované B buněčné linii JY zvyšuje sekreci TNFa (20). Protože toto může být možný mechanismus pro cytotoxicitu, bylo měřeno uvolňování TNFa Priess a LG2 buňkami kokultivovanými se stejnou mAb L243 a jejími fragmenty.

Metody: APC (10⁵ buněk/ml) byly kultivovány za přítomnosti ekvivalentních koncentrací kompletní L243 protilátky (10 nM) nebo jejího F(ab)'₂ (10 nM) a Fab (20 nM) fragmentů po 16 hodin, jak je ukázáno. Koncentrace TNFa v supernatantech kultury byla měřena za použití vnitřně kontrolovaného standardního ELISA kitu (T cell Diagnostic, Cambridge, Massachusetts). Cytotoxické a DR modulační účinky monoklonálních reagens byly potvrzeny imunofluorescencí jako v příkladu 4 (data nejsou ukázána). Výsledky jsou ukázány na obrázku 13.

Závěr: Žádné signifikantní zvýšení TNFa nebylo detekováno v těchto kulturách. Proto zůstává mechanismus cytotoxicity stejně jako selektivní DR downregulace předmětem výzkumu.

Inhibice odpovědi T buněk působením anti DR mAb a jejich fragmentů

Příklad 16

Inhibice odpovědi T buněk anti-DR mAb, jejich fragmenty a DR vážícími peptidy

Metody: CD4 pozitivní klony Th buněk NBHAC25, KMHA25 a DSHABB10 připravené podle odkazu 32 odpovídají na hemaglutininový (HA) peptid viru chřipky HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT) presentovaný DRA/DRBl*0101, DRA/DRB1*0401 a DRA/DRB1*0401, v příslušném pořadí. Buňky byly inkubovány s mitomycinem C ošetřenými APC, antigenem (134 nM) a inhibitory. Antigen specifická proliferace Th buněk byla měřena standardním testem inkorporace ³H-thymidinu. Výsledky jsou ukázány v tabulce 3.

Závěr: mAb LB3.1, L243 a 1-1C4, t.j. ty, které indukovaly downregulaci DR molekul byly také silnými inhibitory aktivace Th buněk. Oproti tomu mAb, které neměly downregulační účinek na DR (CCCL20, 8D1, 9F1, 9F2, 10F12) selhaly také v ovlivnění odpovědi Th buněk, nebo indukovaly marginální inhibiční účinek (Tabulka 3). Tak schopnost DR downregulace koreluje s inhibiční aktivitou. Kromě toho tyto výsledky ukazují, že downregulační mAb mají tendenci k rozpoznávání epitopů umístěných na peptidových vazebných (al a βΐ) doménách molekul třídy II.

náhradní list

Ο ·

Í1 ^-.

5?Σ ” r“ Γ3 — ο -

O
rsí		o
	c	<*
Ó	Γ*ϊ	v>
ΓΜ

Ο

ΓΟ ο

ca

ΓΜ •H g

Ή •π

Φ •n ο

4J

-rl

Λ •Η •Η π5 •Ρ •Η >

rl ο ·—- ο _ υ ϊ?Σ ο c ~ >λ λ Ο U ca η

C

Γca ό

ca η

Ο C*' (ύ

	akt
	vtí
&	Λί
Q	O
1	•rl
•rl	Cn
4J	o
β	r—1
fO	O
	•rl
Λί	PQ

XD tí

Λ •rl

Ό xu š

© o

Ό •rl

4J

0) ft

O ω

•rl g Ή υ Φ Ή Ο >Ν •rl (tí

Λ •Η η

Φ

Λί ί>

ι

Ρ4

Q ní

4J η

φ

Λ ηί ιϋ Μ Η ΜΊ ο _J χ Ξ rt ~

Σ = •8-5 =£ £ο

Q ω

Ρί

Ο (ϋ u •Η <Η •rl ϋ \φ U Φ g Ο Λ ο —' ω Ό

Ζ)

ZD

CZ λ:

λ

Η

Οί ο, r-il rw ο

Ο ό

ΓΜ ί'Ί

Ο ο

U

<	<	<
	X.
2	2	2
íl <	<	< x.
2	2	2
o	ca	ca m
ΓΊ	e-M	1
ό 1	1 O 1	m t
Γ4		psi
«2	Ξ
	»-s
Ο rsí d <	<	<
υ = t '	5
s·/	ca	c>

<

r-’Τ

I

ΓΜ

ΤΓ

ΓΜ ιη

Γ^Ι xr

Χ5 <

Γ4 γμ ,τ δ

ZJ >

ΙΛ rsi rn <

O

ΓΜ ω

α . ο ο ο ” ο

ΓΜ ca rco <<

— y x *«* < Ol X Zi náhradní list

ΚΜΠΛ25 Priess: 1ΙΛ307-319 I.B3.1 mAb «1 + 100 1.8-3 6-20 co ρω rc <

ic. ~ tz> O O T '£ O <

r/j

Q o

CM co ρω

V

U

oo 'τΟ

PO

CM

I rH

				.	Φ				CO
		o?3		•2	>N			•	H
		to		U1	0			34
		G		G	G	•		>Φ	0
	\φ	34	'Φ	34	O	φ		G	Ό
o	34	O	34	O	G	!>		G
g	u	Ol	G	ft	ft	rl		Λ	S
Ol	•rl		•rl			G			Oi
g		G		·.	34	Cm	H
2	•rl		•rl		>1	Φ	X
á.	u	>N	υ	>N	G	Ol	fd	G	-
	φ	td	XU	<d	Φ	U1		G	co
o	Oi		ft		>	φ	fd	•rl	r-l
H	ω	ro	ω	co	O G	G		O rd	Ό
(tí	G	Φ	G	φ	id	-	r-	ft	O
	Φ	N	OJ	N	g	o\°	rH	(d
	Cn		tn		ω			34	O\
>Ί	H	>1	•rl	>1		CTl	•		H
Jj	G		G	G	G			'rl	CO
g	G	o	G	O	'>!	td	τ)	G	1
0)	(0	G	td	G	Λ		o	>O
E		qj		Ό		o\°		•rl	O
σ>	•rl	O	•rl	O	0	o	·**	33	CO

Ή ⁰³ S rd y_|

rd tti

o	Φ	'Φ	G	rd	G	rd
	>N	ř>	G	G	G	G
	rd	o	Φ	Φ	Φ	Φ
	(0	Ό	O	G	υ	G
	O	•rl	G	•H	G	•rl
	Q	G	0	rH	O	r-l
		&		o	W	0
		Φ		G		G
	Λ	Oi	υ	Oi	Ό	Or

>			1	rl
O	G	Ό	fÚ	G
34	rl	•rl		ω
•rl	Ό	G	řá	0
iH	rd	Ol		r-l
Or	r-l	Φ		ω
rd	Λ	o.	H	•rl
			fc4	rj
Ή	'Φ		S	\td
G	G		S	N
Φ	Φ		w
£	>G	tti		>
	>Φ		td
Φ		G		tn

«

I u¹

I

Příklad 17

Požadovaná koncentrace protilátek pro inhibici Th buněk a DR downregulaci

Pro další vyšetření korelace demonstrované v příkladu 16 byla určena požadovaná koncentrace protilátek pro inhibici downregulaci.

Metody: Klony Th buněk KMHA25 a DSHABB10 (viz tabulka 3) byly inkubovány s mitomycinem C ošetřenými Priess buňkami jako APC, HA307-319 peptidem jako antigenem a ukázanými koncentracemi mAb LB3.1. Antigen specifická proliferace Th buněk (horní panel) byla měřena inkorporací ³H-thymidinu o tři dny později. Průtoková cytometrie Priess buněk s mAb LB3.1 (dolní panel) byla provedena jako v příkladu 3. Výsledky jsou ukázány na obrázku 14.

Závěr: Téměř kompletní inhibice Th odpovědí byla dosažena s koncentrací mAb, která indukovala 90% downregulaci DR v asi 2/3 APC (bez jejich usmrcení), což napovídá, že pro oba fenomény je zapotřebí asi stejná koncentrace.

Příklad 18 účinek anti DR mAb a Fab fragmentů na antigenní presentaci fixovanými APC

Bylo zkoumáno, zda DR downregulace je jediný mechanismus využitý v inhibici odpovědi Th buněk.

Metody: APC (LG-2) byly fixovány glutaraldehydem (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland). Odpověd klonu Th buněk NBHAC25 na mitomycinem ošetřené (My) nebo fixované (Fix) LG-2 plus HA307-319 (134 nM) v přítomnosti mAb nebo Fab byla měřena jako v příkladu 17. Výsledky jsou ukázány na obrázku 15.

Závěr: Anti-třída II mAb a jejich Fab fragmenty mohou také inhibovat odpověd Th buněk na peptidový antigen presentovaný fixovanými (t.j. usmrcenými) APC, kde downregulace třídy II molekul není možná. Tak alespoň jeden další mechanismus, nejpravděpodobněji sterická překážka interakce třída II - antigenní receptor Th buněk (TCR) hraje roli v inhibici Th buněk.

Příklad 19 účinek antigenu zavedeného na silné mAb, Fab a peptidové antagoni sty.

Relativní účinnost anti-třída II mAb, jejich fragmentu a antagonistú vazebného místa pro peptid v inhibici odpovědi Th buněk byla srovnávána.

Metody: Jako v příkladu 15. Th klon NBHAC25; APC LG-2. Horní panel HA 307-319 13,4 nM, dolní panel 330 nM. Peptidy jako v tabulce 3. Výsledky jsou ukázány na obrázku 16.

Závěr: Protilátky a Fab fragmenty mají srovnatelnou inhibiční kapacitu, s tím, že druhé jmenované jsou pouze o něco méně účinné než prvně. Oboje jsou, nicméně, několiksetkrát účinější než peptidy. Je významné zaznamenat, že zvýšení koncentrace antigenu (30 krát vyšší než v horním panelu obrázku 16) učinilo peptidové antagonisty méně účinnými, ale neovlivnilo potenciál mAb. Toto pozorování je vysvětlitelné odlišným mechanismem inhibice: zatímco peptidy přímo soutěží s antigenem o vazebná místa třídy II, protilátky downregulují expresi třídy II stejně jako brání MHC-TCR interakci.

Příklad 20

Relativní účinky Fab a peptidu na křivky dávka antigenu odpověd

Schopnost Fab fragmentů a peptidů inhibovat odpověd Th buněk byla srovnávána pro široký rozsah koncentrací antigenu.

Metody: Jako v příkladu 17. Th klon NBHAC25; APC LG-2.

HA 307-319 od 13,4 pM do 134 nM; Fab 100 nM; peptid aXA,,

100 μΜ. Výsledky jsou ukázány na obrázku 17.

Závěr: Z dat je jasné, že Fab fragmenty mají schopnost inhibovat odpověd Th buněk při asi 1000 krát vyšší koncentraci antigenu než peptidy, a tento rozdíl zůstává konstantní v celém rozsahu koncentrací antigenu.

Příklad 21

Účinek antagonistů třídy II na nástup odpovědi Th buněk

Bylo důležité stanovit, zda různé druhy antagonistů třídy II mohou interferovat s nástupem odpovědi Th buněk. Ačkoliv tato otázka nemůže být důkladně zkoumána uvnitř krátkého časového období in vitro odpovědi Th buněk, byl proveden pokus o srovnání mezi Fab fragmenty a peptidy přidanými v různou dobu k systému APC-antigen-Th buňka.

Metody: Jako v příkladu 17. Th klon NBHAC25; APC LG-2.

HA 307-319 4 nM . Inkubace APC s HA od -2 hodin. Klony přidány v hodinu 0. Byly použity Fab LB3.1. Výsledky jsou ukázány na obrázku 18.

Závěr: Oddálené přidání antagonisty peptidu vedlo ke graduálnímu, časové dependentnímu narušení inhibiční aktivity, která nemohla být obnovena zvýšením koncentrace kompetitoru. Oproti tomu, Fab fragmenty způsobily téměř kompletní inhibici, pokud byly přidány 2 hodiny po Th buňkách, a snížený inhibiční potenciál při oddáleném podání mohl být kompenzován zvýšenou oncentrací Fab. Tak se Fab fragmenty zdají být účinějšími v interferenci s nástupem odpovědi Th buněk, než momentálně dostupné peptidové kompet i tory.

Příklad 22

Produkce mAb 1-1C4

HLA-DR byl imunoprecipitován z EBV-LCL Priess za použití mAb L243 a HLA-DR a a β řetězce byly separovány SDS-PAGE. 28k elektroforetický proužek obsahující DR-β byl vystřižen z gelu a použit pro imunizaci BALB/c myší. Myší imunitní B buňky byly následně imortalizovány fúzí s myelomovou linií PAI-0 (Stocker, W et al., Research Disclosure, 217, 155 - 157 (1982)) tak, aby vznikly mAb secernující hybridomy. Supernatanty kultury takových hybridomů byly vyšetřovány na svou schopnost inhibovat aktivaci HA/DRB1*0401 Th buněk klonu KMHA25 (viz tabulka 3) v přítomnosti antigenu HA 307 - 319 a Priess jako APC. Hybridom 1-1C4 byl identifikován jako secernující mAb mající inhibiční kapacitu.

Odkazy;

1. Babbitt, B. et al. Nátuře, 317, 359-361 (1985).

2. Baxevanis, C.N. et al. Immunogenetics 11, 617-625 (1980).

3. Rosenbaum, J.T. et al. J. Exp. Med., 154, 1694-1702 (1981).

4. Waldor, M.K. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 2713-2717 (1983).

5. Jonker, M. et al. J. Autoimmun., 1, 399-4)4 (1988).

6. Stevens, H.P. et al. Transplant. Proč., 22, 1783-1784 (1990).

7. Billing, R. & Chatterjee, S. Transplant. Proč. 15, 649-650 (1983).

8. Jonker, M. et al. Transplant. Proč., 23, 264-265 (1991).

9. Gorga, J.C. et al. Cell. Immunol., 103, 160-173 (1986).

10. Woods, A. et al. J. Exp. Med., 180, 173-181 (1994).

11. Lampson, L.A. &. Levý, R. J. Immunol. 125, 293-299 (1980).

12. Dejelo, C.L. et al. Humman Immunol., 17, 135-136 (1986).

13. Radka, S.F. et al. J. Immunol., 130, 1863-1866 (1983).

14. Cammarota, G. et al. Nátuře ,356, 799- 801 (1992).

15. Nabavi, N. et al. Nátuře ,360, 266-268 (1992).

16. Pennell, C.A. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 3799-3803 (1985).

17. Ishioka, G. Y. et al. J. Immunol., 152, 4310-4319 (1993).

18. Andrew, S.M. & Titus, J.A. Current Protocols in Immunology (eds. Coligan, J.E. et al.) 1, 2.8.1-2.8.10 (Greene & Wilev, New

York, 1994)

19. Palacios, R. Proč. Natn. Acad. Sci. USA 82, 6652-6656 (1985).

20. Altomonte, M. et al. J. Immunol., 151, 5115-5122 (1993).

21. Palacios, R. et al. Proč. natn. Acad. Sci. USA, 80, 3456-3460 (1983).

22. Clement, L.T. et al. J. Immunol., 136, 2375-2381 (1986).

23. Howard, D.R. et al. Exp. Hematol. , 14, 887-895 (1986).

24. Vaickus, L. et al. Cell. Immunol., 119, 445-458 (1989).

25. Kabelitz, D. & Janssen. O. Cell. Immunol., 120, 21-30 (1989).

26. Holte, H. et al. Eur. J. Immunol. 19, 1221-1225 (1989).

27. Newell, M.K. et al. Proč. nati. Acad. Sci. USA, 90, 10459-10463 (1993).

28. Truman, J.-P. et al. Int. Immunol., 6, 887-896 (1994).

29. Mourad, W. et al. J. Exp. Med., 172, 1513-1516 (1990).

30. Naquet, P. et al. Immunogenetics., 18, 559- 574 (1983).

31. Gilfillan, S. et al. J. Immunol., 147, 4074-4081 (1991).

32. Panina-Bordignon, P. et al. Eur. J. Immunol., 19, 2237-2242 (1989).

33. Harris, E.D. Jr. X. Engl. J. Med.., 322(18):1277 (1990).

34. Cosimi, B. et al. X. Engl. J. Med., 305, 308-314 (1981).

35. Chatenoud, L. et al. Eur. J. Immunol., 12, 979-982 (1982).

36. Svejgaard, A. et al. Immunol. Rev. , 70, 193-218 (1983).

37. Todd, J.A. et al. Science, 240 1003-1009 (1988).

38. Nepom, G.T. et al. Immunol., 9, 493-525 (1991).

39. Sprent, J. et al. J. Exp. Med. 163, 998-1011 (1986).

40. Santos, G.W. Immunol. Rev. 88, 169-192 (1985).

41. Lehmann, P.V. et al. J. Exp. Med., 171, 1485-1496 (1990).

42. Co, M.S. and Queen, C. Nátuře, 351, 501-502 (1991).

43. Lewis, A.P. and Crowe, J.S. Gene, 101, 297-302 (1991).

Claims (2)

Patentové nároky

1 !

-p ip iP ir -p ! I

~ 16* 162 iP 1Γ -_wp T IP ip ip ir do ; * x —i 1 - 1 n 1 DO · I J • _ 1 =1 \T =1 .J IP lP lP IP 1f T 16» ip ip ir třída I ! -i 1 - 1 třída I q ! 1 -1 ·« —< 1 i ři 1 J.<sa*S« íSS

P i·· ip ip ir ip ip je- -f.

i CD18 1 1 i * * · .“íCDlB n 1 -! =1 JCD18| j ·' - ! ÍS?^ •SSU>v .1 · ~ 2. .slip*

JCDIS! · . :

162 ip ir

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

7/v-v”7.·’ /4

Obrázek 9 ¹ 1 /2 2

16 kultivar

L243 F(ab)’₂ c':/ Pozadí AT FITC barvení .)

DR-F1TC i

barvení ^?

DP-FITC f

barvení dq-fitc barvení'

Class I-FÍTC

.........’.........i barvení;

CD18-FITC i

barvení <

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) r,'O 95/1737 4

12/22

Obrázek 10

EBV-LCL LG2 ·

N© Ab

ΫΖ4-?σΐ7£Ρ95.·04 43 —==

16h kultivace s L243 pozadí

FITC zabarvení

DR-FITC zabarvení

DP-FITC zabarvení

DQ-FITC zabarvení

Fab

I·» Ifcž 1·* »

CD18-FITC .1 zabarvení Třída I-FITC zabarvení

-ir· i·· ,

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

13/22

Obrázek 11

B buňky JJgBrinMU81'1101Xj Předkultivované s mAB

FITC zabarvení žádné

Anti-DRB1*110X pozadí

T

DRBV110X

DRB1O101

18*· 18=

SUBSTTTUTE SHEET (RULE 26)

14/22

FITC barvení

SK10 mAb (anlI-DQ)

SUBSTTTUTE SHEET (RULE 26)

Obrázek· 13

15/22 [|iu/fid] eqdie-jNi

L243/Kompl. L243/F(ab)’2 L243/Fab

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

4^^

16/22

Obrázek 14/1 nM LB3.1

9oiqrtiui χ

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

17/22

16 h kokultivace LB3.Í

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

WC .-'j' i ťal

18/22

co sr CM _1 SL- CM co co —- O“ m· _o -O CM CM e e _J _í LU LU + Ť- + — CM CM CM CM a a a o —1 >- X >% X LU 2 LU 1 □ i B 1 o ♦

i

LO rH 'Γΰ tn o

o o

o o

o uM mAb o o o co o o o co r- co o o lo *cr o o CO CM soxqxqux i %

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

19/22 n

co co < UX « E * *- CQ

-O DO «5 —J U_

Inhibice T buněčné odpovědi: Vliv antigenového zatížení uM blokát

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

2 0/22 r?

m

IX

X

Obrázek 16/2 r? _o m « _j u_

O

M->

»«3

Λ4

O r—( θοτητιμιτ

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

2 1/22

Srovnání peptidových antagonistú a Fab (L243) v inhibici odpovědi poměr inhibice/stimulace

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) ’ .·· :<·:>/17274

1) farmaceuticky přijatelný kapalný nosič; a

2) terapeuticky účinné množství Fab fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 2 až 4.

6. Kompozice podle nároku 5, kde množství Fab fragmentu je od 0,5 do 5 mg/ml kapalné kompozice.

7. Kompozice podle nároku 6, kde množství Fab fragmentu je od 1 do 2 mg/ml kapalné kompozice.

8. Způsob přípravy Fab fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že monoklonální protilátka jak je definována v nárocích 1 nebo 2 je štěpena pepsinem a Fab fragmenty jsou izolovány metodami v oboru známými.

9. Fab fragment připravený způsobem podle nároku 8.

10. Fab fragment podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 jako terapeuticky aktivní agens, zejména jako imunosupresivní agens.

11. Použití Fab fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 pro supresi imunitní odpovědi u pacienta.

12. Použití Fab fragmentu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 pro léčbu revmatoidní artritidy.

13. Vynález jak je zde popsán.

14. Způsob pro supresi imunitní odpovědi u pacienta vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství Fab fragmentu obsahujícího Fab fragment jak je definován v nárocích 3 nebo 4.

0 1/22 pozadí

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

0 2/22

200 nM CCCL20 20 πΜ CCCL20

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

0 3/22

W O »6.

‘.'S'74

16 hodin kokultivace s ... FITC barvení cr o

t s

X

• · · 'q * * >7 • ύ · ✓ * • Γ» Ji tíi Ji J

Ji b

Tr- pozadí su BSTITUTE SHEET (RULE 26)

0 4/22 v*t

Γ '“‘Ύ T'^f·

W??·

Obrázek 2 ^(gunq qejod τιίΑτ^εχθΗ

Kultivace s

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

0 5/22 :f-i3 ..

i οο -Η s/bez . L243

SUBSTITUTE SHEET(RULE 26)

Ή s

£ ctí

Ή Λ Ό πί Ο ν Η Ο Η ΡΜ (L έ· >« &

ϊ ί

I I

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

0 7/22

V 06/ S* l in

Obrázek ω

ω o

nm cx

SUBSTITUTE SHEET (RULE 15)

0 8/22 řtT,z»5«w«:

<D

N 'Φ

P

Λ

O

I 1.4 ) oooooooo ocoi^toLnxřrocv o o qej ρε z,(qB)d ρε

QBJ Pč

S.(qe)d Pl qBj Pt

OO-fl [%] ^unq 3^s3°ď τχίΛτ^ΒχθΗ

SUBSTITUTE SHEET(RULE 26)

Vv . '‘'νϊ'ΐ.Μδ i —

0 9/22

EBV-LCL PRIESS

Ίβ· lé* |β» lé’ lé·»

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Klidové B buňky

Ne Ab kontrola

u.

16DR ; l_··.

10/22

Obrázek 8

16H kultivace

Monocyry /macrophagy.

I

16h kultivace

L243 F(ab)’2 NaAb L243 F(ab)’₂ ' kontrola =i 57!

±i kontrola i - kontrola

-Al > ' ir -rr

162 ;p :r Tt* l·®·· i · rh^j^-*··

16· ip ip :r-:r

162 jp .: DR I ín g?&*=&S!3=* ' ^r,z *r> .

lP IP IP· -f 1(1 lP lP i»‘ iP iP ir -r i,* ip ;p ir ~p

1) monoklonální protilátka se váže na první doménu HLA-DR,

2) monoklonální protilátka je cytotoxická pro antigen presentující buňky, které exprivují HLA-DR,

3) monoklonální protilátka snižuje expresi HLA-DR na antigen presentujících buňkách.

2. Fab fragment podle nároku 1, kde monoklonální protilátka je myší monoklonální protilátka.

3. Fab fragment podle nároku 2, kde imunoglobulin je lidský imunoglobulin.

4. Fab fragment podle nároku 3, kde šest komplementaritu určujících regionů uvedeného Fab fragmentu je šest komplementaritu určujících regionů uvedené monoklonální protilátky.

5. Kapalná farmaceutická kompozice obsahující:

1. Fab fragment obsahující imunoglobulinový Fab fragment a šest komplementaritu určujících regionů, které jsou obsaženy v uvedeném Fab fragnmentu, kde jeden až šest z uvedených komplementaritu určujících regionů jsou komplementaritu určující regiony monoklonální protilátky mající následující vlastnosti:

2 2/22

CM 1 o CM CM 1 O CM + < < < -Q za za X X X <a ta ta a ta 0 Li_ LL. LL-

účinek třídy II antagonistů na nástup odpovědi T buněk