JPH07242566A - 免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトヌクレオリンに反応性を有する抗体を有
効成分として含有ことを特徴とする免疫抑制剤。 【効果】 本発明の免疫抑制剤は、種々の免疫疾患に対
して有効性をもった薬剤であり、産業上きわめて有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗体を有効成分とする
免疫抑制剤に関する。更に詳しくは、ヒトヌクレオリン
に対して特異的に反応する抗体を有効成分として含む免
疫抑制剤に関する。

【０００２】

【従来技術】近年、臓器移植技術の進歩とともに移植時
に起こる免疫拒絶反応に対する様々な抑制剤が開発され
移植例数の増加にともないその需要を伸ばし、更に異種
動物間移植などその多様性が広がるなかで、完全な免疫
抑制剤が開発されていないのが現状である。具体的に
は、臓器移植時の免疫拒絶反応の抑制剤として著名なサ
イクロスポリンＡ、ステロイド剤などは液性免疫反応に
関して高い免疫抑制効果を示すことが知られているが、
細胞拒絶反応の一部を抑制することができないという弱
点を有している。そこで、この細胞性拒絶反応の抑制能
を有する各種抗体製剤が開発されてきた。免疫反応担当
細胞であるＴ細胞の表面抗原であるＣＤ３に対するマウ
スモノクローナル抗体（ＯＫＴ−３）も、その一つであ
る。^{(1) 、(2)、(3)}。同様の抗体製剤に、Ｔ細胞の受容体
を認識するマウスモノクローナル抗体ＢＭＡ０３１があ
る^(4)、(5)。また、ヒトリンパ球に対するポリクローナ
ル抗体製剤も開発されている。^(6)、(7)。

【０００３】生体内の防御機構である免疫機構は、主に
抗原の認識、免疫担当細胞の活性化、細胞傷害の３段階
に分類される。始めのステップである抗原の認識は主に
２種類のリンパ球によって担当されており、１つはＢ細
胞の担当するＢ細胞表面上に発現している膜結合型イム
ノグロブリンによる抗原のネイティブ形の認識である。
もう一方はＴ細胞が主に担当する細胞性免疫機構で抗原
提示細胞にどん食され断片化（ペプチド）されて細胞表
面上にあるＭＨＣ分子に提示された抗原に関するＴ細胞
上のＴ細胞受容体の認識である。この抗原の認識によっ
て次のステップである免疫担当細胞の活性化が起こるわ
けであるが、単に、抗原と膜結合型イムノグロブリンと
の結合或いは抗原提示細胞とＴ細胞間におけるＭＨＣ分
子＋抗原の複合体とＴ細胞受容体との結合のみによるシ
グナル伝達で担当細胞の活性化がおこるのではなく、そ
の際にＣＤ２,ＣＤ４,ＣＤ８,ＣＤ２８,ｇｐ３９,のＬ
ＦＡ−３,ＭＨＣ ＣｌａｓｓII,ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩ,
Ｂ７,ＣＤ４０との結合によるセカンダリーシグナルの
各細胞への伝達が必須であることが知られている。又、
細胞傷害機構についてはＭＨＣ ＣｌａｓｓＩ上に提示
された抗原を、細胞表面上にＣＤ８を発現しているＭＨ
Ｃ ＣｌａｓｓＩ拘束性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）が
認識し、パーフォリンを含む顆粒などを分泌し細胞傷害
性を引き起こす。これらの免疫反応に関して重要な役割
を果たしている単核球系細胞の表面抗原を認識する抗体
を探索し、その免疫抑制効果を調べていた中で、ヌクレ
オリン（それ自身の免疫機構への関与は知られていな
い）を認識する抗体が、免疫抑制効果を有することを発
見した。

【０００４】上記の様々な抗接着分子抗体の免疫抑制効
果が報告されているが、抗ヌクレオリン抗体については
自己免疫疾患ＳＬＥの自己抗体として知られているくら
いで、該抗体について免疫抑制効果の報告はまだない。
ここで、現在までに知られているヌクレオリン自体につ
いて簡単に述べると、別名Ｃ２３と呼ばれているこの蛋
白は真核細胞の増殖期に核内にメジャーに発現している
非ヒストン蛋白として知られており、細胞質と核間のシ
ャトル蛋白質⁽⁸⁾でｒＲＮＡと結合しｒＲＮＡの転写の
制御への関与が示唆されている。細胞内では細胞障害性
蛋白グランザイムＡ⁽⁹⁾や、ＦＫ５０６結合蛋白⁽¹⁰⁾と
結合することが発見されたが、又、その細胞分布は細胞
内のみでなく活性化Ｔ細胞やヒト肝実質細胞株ＨｅｐＧ
２細胞^{(1 1)}表面上でも発現しておりＬＤＬとの低い親和
性がある⁽¹¹⁾等の報告がなされているが、具体的にどの
ような機能を果たしているのかは定かでない。クローニ
ングされたヌクレオリンｃＤＮＡより予測されるアミノ
酸一次配列は、配列番号１のとおりである⁽¹²⁾。このア
ミノ酸一次配列から、ヌクレオリンは特徴的で全体的に
親水性に富んでおりＮ末付近に高いチャージを、中央付
近に核移行シグナルを、中央付近からＣ末にかけてＲＮ
Ａ結合ドメインとＣ末付近にグリシンにとんだ領域を持
っている⁽¹³⁾。このように多くの性格をもっているヌク
レオリンではあるが、その機能に関してはまだ解明され
ていない点が多く含まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗体
を有効成分とする新規な免疫抑制剤を開発し提供するこ
とにある。

【０００６】

【課題を解決する手段】本願発明者等は、上記課題を解
決すべく、種々の抗体を免疫抑制の観点からスクリーニ
ングし検討を重ねた結果、驚くべきことにヒトヌクレオ
リンに対する抗体が免疫抑制活性を有することを見い出
し、本発明を完成させた。本発明は新規な免疫抑制剤の
提供に係るものである。即ち、本発明はヒトヌクレオリ
ンに対し反応性を有する抗体を有効成分として含む免疫
抑制剤である。そして、このヒトヌクレオリンに対し反
応性を有する抗体としては、例えばモノクロナール抗
体、ポリクロナール抗体、Ｆ（ａｂ）₂ 断片などが挙げ
られる。また、前記モノクロナール抗体産生ハイブリド
ーマとしては、ハイブリドー細胞株Ｋ２８（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５７７）が用いられる。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
用いることのできる抗体については、ヒトヌクレオリン
に対する抗原特異性を保持しているあるいは損なわれな
い限り以下のすべてのものが使用できる。 Ａ：常法により、マウスを含む種々の動物由来のＢ細胞
を用いて作成した抗体産性ハイブリドーマによりり生産
されるモノクローナル抗体。

【０００８】Ｂ：Ａの抗体を以下に示す遺伝子組み換え
技術を用いてヒト型化、親和性向上、補対活性除去ある
いは強化等を目的として、改変或いは作製したもの。 ・Ａの抗体の可変領域⁽¹⁴⁾あるいは超可変領域⁽¹⁵⁾を様
々のイムノグロブリンの定常領域或いは定常領域＋フレ
ームワークへ挿入する。 ・Ａの抗体の可変領域或いは超可変領域をイムノグロブ
リン以外の分子と結合する⁽¹⁶⁾。

【０００９】・Ａの抗体の可変領域と、該抗体とは異な
る抗体の可変領域を有する２つの特異性を有する（bisp
esificな）抗体⁽¹⁷⁾を造成する。 ・ファージ表面上に抗体フラグメントを発現させたもの
より、抗原に親和性の高いものをスクリーニングする
⁽¹⁸⁾。 ・ＰＣＲ法などを用いてＤＮＡ変異を起こし親和性の高
いものに改変したもの。

【００１０】Ｃ：Ａの抗体に、補体活性を除去等の目的
で、酵素処理（例えばペプシン処理 ⁽¹⁹⁾やプラスミン処
理⁽²⁰⁾によりＦｃ部分を除去する）、或いは化学修飾
（例えばβ−プロピオラクトン処理⁽²¹⁾、ジスルフィド
結合の還元アルキル化⁽²²⁾によるＦｃ部分の不活化す
る）を行い改変したもの。 Ｄ：ヒト型イムノグロブリン産生トランスジェニック動
物⁽²³⁾を用いて作製したもの。

【００１１】Ｅ：免疫不全動物にヒト抗体産性細胞を導
入しこれより作製したもの。 Ｆ：常法により調製したポリクローナル抗体 本発明は、抗原提示反応のみを抑えるのみでなく細胞傷
害反応も抑制するので、同種間及び異種間における臓器
移植時あるいは骨髄細胞などの細胞移植時におこる拒絶
反応抑制薬として用いることができる。また、自己抗原
を認識しそれに対して細胞傷害性を起こす自己免疫疾患
一般の治療薬としても利用できるが、その際はヒト以外
の抗体では、長期投与によって該抗体に対する抗体がで
きると思われるので、ヒト型化するのが望ましい。

【００１２】本発明は注射剤好ましくは静脈投与の態様
で使用することができ、投与量、投与回数は対象の疾患
患者の病状を配慮して決めることができるが、成人一人
あたり１０μｇ〜１０００ｍｇ／日まで投与することが
できる。本発明は、液剤製剤あるいは凍結乾燥製剤とし
調剤することができ、必要に応じて薬剤的に許容される
賦形剤、希釈体、安定化剤、等張化剤、緩衝剤を添加物
として含む事ができる。好ましい添加物としてマルトー
ス等の糖類やポリソルベート等の界面活性剤、ヒト血清
アルブミン等の蛋白質、グリシン等のアミノ酸、塩化ナ
トリウム等の塩類を挙げることができる。 〔抗体調製例〕 １．抗体の調製 （１）抗体産生ハイブリドーマの取得 雌のBalb/cマウス８週令にＢ細胞株(CCRF-SB ATCC No.C
CL-120)で活性化したリンパ球2×10⁷を尾静注にて免疫
した。この免疫されたマウスの脾臓を摘出しこの脾臓よ
り調製したリンパ球とマウスミエローマ(p3X63 6.5.3 A
TCC No.CRL-1580)をポリエチレングリコール1500（ベリ
ンガー社）を用いて細胞融合を行った。この融合細胞を
限界希釈法を用いて抗体分泌陽性株のクローニングを行
った。尚、陽性株の判定はＥＬＩＳＡ法を用いた。具体
的には以下の方法を用いたヒト末梢血をリン酸緩衝液
（ＰＢＳ）にて洗浄し血球画分を0.1％ＦＣＳ（ウシ胎
児血清）/ＰＢＳ に懸濁してフィコールに重層した。1
500 rpmで30分間遠心後 buffy coatを単核球系細胞画分
として回収した。この単核細胞画分をＩｇＧカラムに通
してＢ細胞を取り除いた。このようにして得られたＴ細
胞とCCRF-SBを混合し、37℃にて6日間培養してＴ細胞を
活性化した。この細胞をFicolに重層して1500 rpmで遠
心後白血球濃縮画分（ buffy coat）をとりＰＢＳで3回
洗浄し免疫抗原を調製した。この免疫原をBalb/cマウス
の尾静脈に注入した。このマウスの脾臓を摘出しこの脾
臓より調製したリンパ球とp3X 63 6.5.3をポリエチレン
グリコール1500にて細胞融合した。この融合細胞を96穴
プレートにまきこみ、37℃,5％ CO₂ HAT（ヒポキサン
チン、アミノプテリン、チミジン シグマ社）+10％Ｆ
ＣＳ/ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地に
て10日間〜20日間培養した。

【００１３】常法により調製したヒトリンパ球を、懸濁
液Ａ（0.1％ NaN₃を含む 2％ＦＣＳ／ＰＢＳ）にて1×1
0⁶個／mlになるように調整し、これを100μl/ウエルず
つ96穴プレートに移した。このプレートに、先の融合細
胞培養上清を100μl/ウエル添加し、45分間 4℃にて静
置した。その後、懸濁液Ａで該リンパ球を洗浄し、アル
カリフォスファターゼで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ
（ＴＡＧＯ社）を該リンパ球と30分間 4℃で反応させ
た。反応後、再度懸濁液Ａにてリンパ球を洗浄し、発色
基質（KPL PHOSPHATASE SUBSTRATE SYSTEM FOR EIA; フ
ナコシ社）を加え発色させた。

【００１４】陽性反応がでた培養上清に対応する融合細
胞を限界希釈し1 cell／ウエルで96穴プレートにまきこ
み、前述の酵素免疫抗体法にて陽性株の再選択を行っ
た。以上一連の限界希釈操作を繰り返すことにより、複
数の陽性ハイブリドーマ株を取得した。このうちの１株
を、Ｋ２８と名付けた。本ハイブリドーマ細胞株Ｋ２８
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条
約に基づく国際寄託を行っており、その受託番号はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４５７７である。 （２）モノクローナル抗体Ｋ28Ｎの調製 抗体分泌ハイブリドーマＫ28を無血清培養した。この培
養上清をプロテインＡディスクカラムに通し、吸着した
ＩｇＧ画分を緩衝液にて溶出した。具体的には以下の方
法を用いた。

【００１５】ハイブリドーマＫ２８を１リットルのＥＲ
ＤＦ培地（極東製薬工業）（+インシュリン+トランスフ
ェリン等）にて37℃で6日間培養した。この培養液を遠
心し培養上清を回収した。この培養上清をプロテインＡ
カラム（富士フィルター工業）に通してイムノグロブリ
ン画分を吸着させた。このカラムを1.5Ｍ Glycine 3MNa
Cl pH 8.9にて洗浄し0.1Ｍ Glycine pH2.5にてイムノグ
ロブリン画分を溶出し、モノクローナル抗体 30 mg を
調製した。なお、Ｋ２８ハイブリドーマより得られたモ
ノクローナル抗体をＫ28Ｎと名付けた。 （３）Ｋ28ＮのＦ(ab)₂の調製 Ｆ(ab)₂の調製は、基本的にはImmuno Pure Ｆ(ab)₂ pre
paration kit(PIERCE)の操作法に準拠した。具体的には
以下の方法を用いた。

【００１６】Ｋ28Ｎ抗体を200mg/mlの濃度にした後透析
により20ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ3.5）に緩衝液を置
換し、次に、抗体濃度を10mg/mlになるように調整し
た。固定化ペプシンスラリー0.25 mlを消化緩衝液（dig
estion buffer）で3回洗浄し、0.5 mlの消化緩衝液に懸
濁した。抗体試料1.0mlを固定化ペプシン 0.5mlと混合
した。震盪器付き恒温水槽において37℃にて8時間イン
キュベートした後、固定化ペプシンを除去し、Ｆ(a
b)₂、Ｆｃフラグメント、未消化ＩｇＧを回収した。Pro
tein ＡアフィニティーカラムによりＦ(ab)₂画分を精製
し、透析を行ないＰＢＳに置換した。精製したＦ(ab)₂
画分を透析によりＰＢＳに置換した。 ２．抗体の解析 （１）自動蛍光解析装置による抗体Ｋ28Ｎの抗原分布の
解析 常法に従いヒト末梢血より単核球系細胞を調製した。抗
体Ｋ28Ｎおよび市販のＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１
４、ＣＤ５６、ＭＨＣＣｌａｓｓ II 抗体を用いて蛍光
二次染色した。この蛍光染色された単核球系細胞をフロ
ーサイトメトリーＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンデッキンソ
ン社）を使って解析し抗体の認識抗原分布を調べた。具
体的には以下の方法を用いた。

【００１７】末梢血からFicol（ファルマシア社）を用
いた密度勾配遠心法により単核球系細胞画分を調製し
た。このＴ細胞を0.1％ NaN₃ 2％ＦＣＳ/ＰＢＳに懸濁
しヒトイムノグロブリンを加え氷中30分放置した。次に
これを0.1％ NaN₃ 2％ＦＣＳ/ＰＢＳで３回洗浄後、抗
体Ｋ28Ｎを加え30分室温にて放置し、ＦＩＴＣ（フルオ
レッセンイソチオシアネート : TAGO社）あるいはＰＥ
（ピコエリスリン : TAGO社）標識された抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を添加し、これを0.1％ NaN₃ 2％ＦＣＳ/ＰＢＳ
で3回洗浄した。

【００１８】各市販のＰＥ或いはＦＩＴＣで標識された
抗ヒトＣＤ２抗体（anti-Leu 5b ベクトンデッキンソン
社），抗ヒトＣＤ４抗体（anti-Leu 3a ベクトンデッキ
ンソン社），抗ヒトＣＤ８抗体（anti-Leu 2a ベクトン
デッキンソン社），抗ヒトＣＤ１４抗体（anti-Leu-M
3 ベクトンデッキンソン社），抗ヒトＣＤ１９抗体（an
ti-Leu12ベクトン デッキンソン社），抗ヒトＣＤ５６
抗体（anti-Leu19ベクトンデッキンソン社），抗ヒトＭ
ＨＣＣｌａｓｓII抗体（抗HLA DR ベクトンデッキンソ
ン社）をそれぞれ加えて、30分室温にて放置した。これ
を0.1％ NaN₃ 2％ＦＣＳ/ＰＢＳで３回洗浄した。

【００１９】このようにして得られた蛍光標識された単
核球系細胞をＦＡＣＳｃａｎを用いたドットブロット解
析をすることにより、各市販のＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ
８，ＣＤ１４，ＣＤ１９，ＣＤ５６，ＭＨＣＣｌａｓｓ
II抗体と、取得抗体との、細胞認識群の差を検定した。
その結果、抗体Ｋ28Ｎが認識する抗原は、非活性状態で
はＢ細胞を含む抗原提示細胞に発現しており、活性状態
では先の抗原提示細胞及びＴ細胞に発現していることが
分かった。 （２）Ｋ28Ｎが認識する抗原の特定 Ａ．Ｋ28Ｎを用いた抗体カラムの調製 抗体カラムの調製は、Hi Trap ^TM Affinity columns
（ファルマシア）を使用した。具体的には以下の方法を
用いた。

【００２０】Ｋ２８Ｎ抗体を10mg/mlの濃度に調整後、
カップリング緩衝液（0.2Ｍ NaHCO3,0.5M NaCl pH 8.
3）に置換した。HiTrapカラムに1mM HClを30ml流して平
衡化後、抗体溶液 5mlを注入しパラフィルムで密封して
25℃で20分間静置した。カラムに洗浄用緩衝液Ａ（0.
5Mエタノールアミン, 0.5M NaCl, pH8.3）10mlを3回、
洗浄用緩衝液Ｂ（0.1M酢酸, 0.5M NaCl, pH 4.0）10ml
を3回注入し、更に洗浄用緩衝液Ａ 10mlを3回注入し、
そのまま1時間静置して未反応の活性基をブロックし
た。カラムに洗浄用緩衝液Ｂ 10mlを3回、洗浄用緩衝液
Ａ 10mlを3回,更に洗浄用緩衝液Ｂ 10mlを3回注入し,最
後にＰＢＳを10ml注入してpHを調整し固定化を終えた。 Ｂ．Ｋ28Ｎ抗体カラムを用いたＫ28Ｎ抗体に結合する抗
原の精製 5×10⁸のSKW6.4細胞を凍結融解後、9倍容の懸濁用緩衝
液（1mM CaCl₂, 1mM NaHCO₃, 0.8mg/ml EDTA, p-APMSF
26μｇ/ml, Leupeptin 10μg/ml）に懸濁した。この懸
濁液をマイクロホモジナイザー（OMEGAERECTRIC）でホ
モジナイズし、ホモジネートを2000×gで15分間遠心
し、ペレットを回収した。このペレットを4.5倍容の前
記緩衝液に懸濁した。更に、前述ホモジナイズから遠心
によるペレット回収までの操作を更に２回繰り返した。

【００２１】得られたペレットを緩衝液に懸濁し13mlに
し、この懸濁液を下から 41％ (W/W)ショ糖液 5ml, 37
％(W/W)ショ糖液7ml, 31％(W/W)ショ糖液12.5mlからな
る不連続勾配相の上に重層し、25000rpmで2時間遠心し
た。31％の界面画分を回収し、37mlの0.3Mショ糖液に懸
濁し更に25000 rpmで30分間遠心した。遠心後、ペレッ
トをＰＢＳ 10mlに懸濁し細胞膜画分を回収した。

【００２２】得られた細胞膜画分サンプルについて、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｋ28Ｎ抗体を用いたウエスタン
ブロッティングを行ったところ、Ｋ28Ｎ抗体に特異的に
染色される約50Ｋと約100Ｋのバンドが検出された。次
に、SKW6.4細胞の全細胞画分（cell lysate）を前記Ａ
に記載の抗体カラムに供した。抗体カラム吸着画分につ
いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＫ28Ｎ抗体を用いたウエス
タンブロッティングによって、同様のバンドが検出され
ることを確認した上で、該抗体カラム吸着画分について
再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、このゲルをポンソー
（シグマ）で染色した。上記のウエスタンブロッティン
グで確認した抗体との結合性を有するバンド部分をゲル
から切り出し、抽出した後、リジルエンドペプチダーゼ
（和光純薬）で消化した。この消化ペプチド断片を逆相
ＨＰＬＣにより単離し、プロテインシークエンサーPPSQ
-10（島津）を用いてアミノ酸配列の決定を行なった。
配列番号１に示すヒトヌクレオリンアミノ酸配列の363
残基目から370残基目の配列（ALELTGLK）,573残基目か
ら577 残基目の配列（TLFVK）,637残基目から643残基目
の配列（VTLDWAK）と合致した。

【００２３】以上、抗原の分子量及び部分アミノ酸配列
から、Ｋ28Ｎ抗体は、ヒトヌクレオリンに特異的に結合
する抗体であると判断した。 ３．Ｂ細胞株へのＫ28Ｎの影響 細胞表面にＫ28Ｎ抗体の認識抗原をもつＢ細胞株ＳＫＷ
6.4の自然増殖に対するＫ28Ｎの影響をみた。その方法
を以下に示すあらかじめK28Nの終濃度を各々0ng/ml、
3.85ng/ml、38.5ng/ml 、385ng/mlに調製した。10％Ｆ
ＣＳ／ＲＰＭＩ培地を用いてＳＫＷ6.4を1×10⁵個/ｍｌ
になるように懸濁し200μｌずつ96穴プレートに巻き込
み4日間 5％CO₂インキュベーターに静置した。その間24
時間後、48時間後、96時間後の細胞濃度を測定した。

【００２４】その結果を図１に示す。この図に示すとお
りＫ28ＮはＳＫＷ6.4の増殖に対してほとんど影響を及
ぼさなかった。 〔試験例〕 抗ヒトヌクレオリン抗体の免疫抑制効果 （１）ヒトの末梢血を用いたin vitroの免疫抑制能試験
における抗ヒトヌクレオリン抗体の免疫抑制効果 Ａ．リンパ球混合培養試験 本実験では、モノクローナル抗体Ｋ28Ｎ及びそのＦ(ab)
₂断片について、リンパ球混合培養試験を行った。

【００２５】免疫反応では、抗原提示細胞により抗原刺
激を受けたリンパ球は活性化され増殖が促進されるが、
これを in vitro の系で再現したのがリンパ球混合培養
試験であり、種々の免疫抑制物質の効果の判定に使用さ
れている⁽²⁴⁾。即ち、ハプロタイプの異なる（以下便宜
上ヒトＡ,ヒトＢという）リンパ球同士を混合して起こ
るリンパ球増殖が、被験サンプルの添加で抑制されるか
否かを見るのである。あらかじめヒトＡの末梢血より調
製したリンパ球をマイトマイシンＣ（協和発酵社製）を
用いて非増殖化しておく。この非増殖化されたリンパ球
(Stimulator)と抗体の添加されたヒトＢの末梢血より調
製したリンパ球(Responder)を混合し、4日後³Ｈラベル
されたサイミジンを添加しヒトＢのリンパ球の増殖を測
定する。具体的には以下の方法を用いた。

【００２６】ハプロタイプの異なるヒトＡ、ヒトＢの末
梢血それぞれからフィコールを用いた密度勾配遠心法に
よりリンパ球を分離調製した。次に、ヒトＡのリンパ球
1×10⁷個を、10％のヒトＢより調製した血清を含むＲＰ
ＭＩ（ギブコ）5mlに浮遊させ、このリンパ球浮遊液に
マイトマイシンＣ250μgを加えて37℃ 30分 5％ CO₂存
在下でインキュベートした。その後、1500 rpm 5分で遠
心後沈殿物を1％ＦＣＳ/ＰＢＳに懸濁し、更に遠心する
（洗浄操作）。この洗浄操作を4回繰り返した後、10％
ヒトＢの血清/ＲＰＭＩに5×10⁵/mlになるように懸濁
し、Stimulatorとした。また、ヒトＢのリンパ球を5×1
0⁵/mlになるように10％Ｂ氏血清/ＲＰＭＩに懸濁し、Re
sponderとした。

【００２７】StimolatorとResponderを各々100μl ずつ
U底96穴プレート上で混合した。この時あらかじめ混合
する1時間前に、Ｋ28Ｎ抗体或いはＫ28Ｎ抗体のＦ(ab)₂
断片を、Responder側に入れておく。この混合リンパ球
を37℃ 4日間 5％ CO₂存在下で培養した。その後、この
プレートに³Ｈサイミジンを0.25μCi/well添加し、37℃
16〜24時間 5％CO₂存在下で静置した。

【００２８】セルハーベスター（ワッラック製：培養プ
レート上の培養細胞を破砕しＤＮＡを回収する装置）を
用い、細胞から³Ｈサイミジンを取り込んだＤＮＡを回
収した。取り込まれた³Ｈサイミジンのβ線量を液体シ
ンチレーションカウンター（ワッラック）で測定した。
その結果を図２に示す。この図に示すとおりＫ28Ｎ抗体
及びそのＦ(ab)₂断片で抑制効果を示す事が分かった。 Ｂ．標的細胞障害性試験 本実験では、モノクローナル抗体Ｋ28Ｎについて、標的
細胞障害性試験を行った。

【００２９】前述の一連の免疫反応の最終段階において
起きるリンパ球による細胞障害は、移植の際におきる免
疫反応、ウイルス感染細胞に対する免疫反応、自己免疫
疾患等に深く関連している。この細胞障害作用をin viv
oでヒトにおいて試験することはできないので、これに
対するin vitroの試験法として広く用いられている以下
の細胞障害性試験⁽²⁵⁾によって、Ｋ２８Ｎ抗体の細胞障
害に対する効果を確認した。細胞障害性試験の概要を説
明すると、まず、ヒト末梢血より単核細胞を得る。次
に、マイトマイシンＣによって非増殖化したヒトＢ細胞
株（アロ刺激細胞）存在下でこの単核細胞を培養するこ
とにより、単核細胞より細胞障害性Ｔ細胞をつくる。別
に、先のマイトマイシンＣ処理に供したのと同じヒトＢ
細胞株に⁵¹Crを取り込ませた細胞（標的細胞）を作成す
る。そして、前記の標的細胞と細胞障害性Ｔ細胞を共に
培養し、細胞障害性Ｔ細胞によってもたらされるＢ細胞
株の損傷を、放出された放射性クロム量を指標に測定す
る。被験サンプルの免疫抑制作用を調べる場合には、細
胞障害性Ｔ細胞と標的細胞を混合する前に細胞障害性Ｔ
細胞側に被験サイプルを加えるという前処理を行い、こ
の前処理によって放射性クロムの放出がどの程度抑制さ
れるかをみる。具体的には以下の様に行った。

【００３０】ヒト末梢血を1500 rpm10分遠心して得た血
球画分をＰＢＳに懸濁し、これをフィコールに重層し
た。そして、1500 rpm 30 分間遠心しBuffy coatをリン
パ球画分として集めた。2 ％ＦＣＳ/ＰＢＳで2回洗浄
後、10％ＲＰＭＩに懸濁しヒト末梢血由来単核細胞を得
た。次に、ヒトＢ細胞株SKW6.4を10％ＦＣＳに懸濁し、
マイトマイシンＣを終濃度50μg/mlになるように加え、
37℃で30分間放置後ＰＢＳで4回洗浄し、アロ刺激細胞
の調製を行なった。

【００３１】前述の単核細胞及びアロ刺激細胞を混合し
37℃ 5％ CO₂ 6日間培養した。培養後、前述の単核細胞
取得操作と同様の操作を行い、得られた細胞画分を10％
ヒト血清ＲＰＭＩに懸濁し細胞障害性Ｔ細胞を得た。別
に、Ｂ細胞株 SKW 6.4を10％ＦＣＳ /ＲＰＭＩに懸濁
し、これに⁵¹Cr（NEN）を添加して37℃ 5％ CO₂ 1時間
培養後、1％ＦＣＳ/ＰＢＳで5回洗浄し⁵¹Crを取り込ん
だ標的細胞を調製した。

【００３２】細胞障害性Ｔ細胞と標的細胞とを混合し、
10％ヒト血清/ＲＰＭＩにて37℃ 5％ CO₂ 4時間培養し
た。尚、コントロールとしては、アロ刺激を行っていな
い（即ちアロ刺激細胞存在下での培養処理を行っていな
い）単核細胞を用いた。培養後の上清を上清採取システ
ム（大日本製薬）にて回収し、この回収された上清中の
標識体をガンマーカウンター（AUTO-GAMMA 5650 パッカ
ード）にて測定した。尚、免疫抑制反応を見るためのＫ
28Ｎ抗体の添加は、標的細胞と細胞障害性細胞を混合す
る1時間前に細胞障害性細胞に行なった。

【００３３】その結果を図３に示す。この図に示すとお
りＫ28Ｎ抗体は細胞障害を抑制効果を示すことが分かっ
た。 Ｃ．マイトジェン刺激によるリンパ球増殖に対する抑制
試験 本実験では、モノクローナル抗体Ｋ28Ｎについて、マイ
トジェン刺激によるリンパ球増殖に対する抑制試験を行
った。マイトジェンとしては、ＬＰＳ及びＰＨＡを用い
た。具体的には以下の通り。

【００３４】ヒト末梢血を1500 rpm 10分遠心して得た
血球画分をＰＢＳに懸濁し、これをフィコールに重層し
た。そして、1500 rpm 30分遠心しBuffy coatをリンパ
球画分として集めた。これを2%ＦＣＳ/ＰＢＳで2回洗浄
後10％ＲＰＭＩに懸濁し、ヒト末梢血由来単核細胞を得
た。これを、1×10⁵個/ウエル/200μlずつU底96穴プレ
ートにまいた。

【００３５】上記のプレートに、ＰＨＡを終濃度5μg/m
lあるいはＬＰＳを終濃度 5μg/mlになるよう添加し
た。同時にＫ28Ｎ抗体を終濃度 500 ng/mlから4 ng/ml
までの段階希釈になるように添加し、37℃ 3日 5％ CO₂
存在下で培養した。培養後のプレートに³Ｈサイミジン
を0.25μCi /well添加し、更に37℃ 16〜24時間 5％CO
₂ 存在下で静置した。

【００３６】セルハーベスター（ワッラック）を用い、
細胞から³Ｈサイミジンを取り込んだDNAを回収した。こ
の³Ｈサイミジンのβ線量を液体シンチレーションカウ
ンター（ワッラック）で測定した。その結果を図４に示
す。この図に示すとおりＫ28Ｎ抗体は、PHAによる増殖
刺激に対する抑制効果は示さなかったが、LPSによる増
殖刺激に対する抑制効果を示した。 （２）マウス或いはラットの脾臓細胞を用いた in vitr
o の免疫抑制試験 Ａ．マウス脾臓細胞を用いた混合リンパ球培養試験 本試験では、モノクローナル抗体Ｋ28Ｎを用い、基本的
には前記（１）Ａ．に記載したヒト混合リンパ球培養試
験方法に準じて、試験を行った。具体的には以下の通
り。

【００３７】ハプロタイプの異なる C3Hマウスおよび B
ALB/Cマウスの脾臓細胞より常法に従い、単核球系細胞
を調製した。次に、Balb/Cより調製した細胞1×10⁷個を
10％ＦＣＳ/ ＲＰＭＩ（ギブコ）5ml に浮遊させ、この
浮遊液にマイトマイシンＣ 250μｇを加えて37℃ 30分
5％CO₂存在下でインキュベートした。その後、1500 rpm
5分で遠心後沈殿物を 1% ＦＣＳ /ＰＢＳに懸濁し、更
に遠心する（洗浄操作）。この洗浄操作を4回繰り返し
た後、10％ＦＣＳ /ＲＰＭＩに5×10⁵/mlになるように
懸濁しStimulatorとした。また、C3H より調製した細胞
を10％ＦＣＳ/ＲＰＭＩに5×10⁵/mlになるように懸濁
し、Responderとした。

【００３８】StimulatorとResponder各々100μｌずつU
底96穴プレート上で混合した。この時あらかじめ混合す
る1時間前に、Ｋ28Ｎ抗体をResponder側に入れておく。
この混合リンパ球を37℃ 4日間 5％ CO₂存在下で培養
した。その後、このプレートに³Ｈサイミジンを0.25μ
Ｃi/well添加し37℃ 16〜24時間 5％CO₂存在下で静置し
た。

【００３９】セルハーベスター（ワッラック）を用い、
細胞から³Ｈサイミジンを取り込んだＤＮＡを回収し
た。取り込まれた³Ｈサイミジンのβ線量を液体シンチ
レーションカウンター（ワッラック）で測定した。その
結果を図５に示す。この図に示すとおり、ヒトヌクレオ
リンに対するモノクローナル抗体であるＫ28Ｎ抗体は、
マウスリンパ球においても交差性を持ち抑制効果があっ
た。 Ｂ．ラットの脾臓細胞を用いた混合リンパ球培養試験 本試験では、モノクローナル抗体Ｋ28Ｎ及びウサギ抗ラ
ットヌクレオリンポリクロナール抗体を用い、基本的に
は前記（１）Ａ．に記載したヒト混合リンパ球培養試験
方法に準じて、試験を行った。具体的には以下の通り。

【００４０】ハプロタイプの異なるLewisラット及びACI
ラットの脾臓細胞より常法に従い、単核球系細胞を調製
した。次に、ACIラットより調製した細胞1×10⁷個を10
％ＦＣＳ/ ＲＰＭＩ（ギブコ）1mlに浮遊させ、この浮
遊液にマイトマイシンＣ 50μｇを加えて37℃ 30分 5％
CO₂存在下でインキュベートした。その後、1500 rpm 5
分で遠心後沈殿物を 1% ＦＣＳ /ＰＢＳに懸濁し、更に
遠心する（洗浄操作）。この洗浄操作を4回繰り返した
後、10％ＦＣＳ /ＲＰＭＩに4×10⁶/mlになるように懸
濁しStimulatorとした。また、Lewisラットより調製し
た細胞を10％ＦＣＳ/ＲＰＭＩに4×10⁶/mlになるように
懸濁しResponderとした。StimulatorとResponder各々10
0μｌずつをU底96穴プレート上で混合した。この時あら
かじめ混合する1時間前に、Ｋ28Ｎ抗体（終濃度10μg/m
l）、ウサギ抗ラットヌクレオリンポリクローナル抗体
⁽²⁶⁾（終濃度10％）あるいはマウス抗ラットＣＤ３抗体
Ｇ4.18（生化学工業）（終濃度10μｇ／ml）をResponde
r側に入れておく。この混合リンパ球を37℃ 4日間 5％
CO₂存在下で培養した。その後、このプレートに³Ｈサ
イミジンを0.25μＣi/well添加し37℃ 21時間 5％CO₂存
在下で静置した。

【００４１】セルハーベスター（ワッラック）を用い、
細胞から³Ｈサイミジンを取り込んだＤＮＡを回収し
た。取り込まれた³Ｈサイミジンのβ線量を液体シンチ
レーションカウンター（ワッラック）で測定した。その
結果を図６に示す。この図に示すとおり、Ｋ28Ｎモノク
ローナル抗体のみならず、ウサギ抗ラットヌクレオリン
ポリクローナル抗体も顕著な免疫抑制効果が認められ
た。 （３）病態モデル動物におけるin vivo免疫抑制効果 Ａ．II型コラーゲン誘導関節炎モデルマウスによる実験 本実験では、Ｋ28Ｎ抗体を用いて、表記関節炎モデルで
の抑制作用を試験した。このモデルは、マウスに完全フ
ロインドアジュバント（以下ＣＦＡという）とII型コラ
ーゲンの混合物を免疫し、関節炎の誘導を行なう系で、
リューマチのモデルとして広く使用されている。このモ
デル動物に抗体を投与してその免疫抑制効果を調べた。
その方法を以下に示す。

【００４２】ＣＦＡ（DIFCO LABORATORY）とII型コラ
ーゲン（シグマ）を混合し氷中でエマルジョンを調製
し、100μｌをDBA1マウス（オス6週令：日本チャールズ
リバー）24匹の尾根部に皮下注し抗原感作を行なう。更
に初回感作後25日目及び40日目に追加免疫を行ない四肢
の浮腫を誘導する。予防的投与群、治療的投与群、非投
与群にそれぞれ8匹ずつ群分けを行ない、予防的効果を
みる投与群は、初回感作1日前から5〜6日間隔でＫ28Ｎ
を300μｇ／匹で静脈注投与を行なった。又、治療的効
果をみる投与群には初回感作から20日目から5〜6日間隔
でＫ28Ｎを300μｇ／匹で静脈注投与を行なった。

【００４３】それぞれのマウスの四肢のいずれかに浮腫
の発症が見られるマウスを発症個体とし、全く肉眼上浮
腫の見られない個体を未発症個体としそれぞれ数えた。
その結果を図７に示す。この図に示すとおり、抗体Ｋ28
ＮはII型コラーゲンにより誘導される関接炎にたいする
抑制効果を示した。 Ｂ．MRL lpr/lpr マウスによる実験 本実験では、Ｋ28Ｎ抗体を用いて、全身性自己免疫疾患
モデル（MRL lpr/lprマウス）での抑制作用を試験し
た。MRL lpr/lprマウスは、腎炎、血管炎、リンパ組織
肥大、シューグレン症候郡、関節病変、IgG1,IgG2aの上
昇などの症状を呈する全身性自己免疫疾患を自然発症
し、ＳＬＥ (systemic lupus erythematosus)や関接炎
などのモデル動物として広く使用されている。ＳＬＥの
病状であるルーパス腎炎にともなって血清中の尿素窒素
濃度の経時的上昇と、自己免疫疾患発症にともなう生存
率の低下が見られるので、この血清中の尿素窒素濃度と
生存率を指標に抗体投与による免疫抑制効果を調べた。
その方法を以下に示す。

【００４４】MRL lpr/lprマウスの血清中の尿素窒素濃
度を尿素窒素測定キット（尿素−窒素Ｂテストワコー
（和光純薬））を用いて測定し、抗体Ｋ28Ｎ投与群と非
投与群に均等に10匹ずつ群分けを行なった。投与群のマ
ウスにはリンパ節肥大の症状が現われる前（80日齡）か
ら1週間間隔で抗体200μｇ/匹の投与を開始した。投与
群と非投与群の血清中の尿素窒素濃度と生存率を測定し
経時的投与効果をみた。

【００４５】その結果を図８〜図９に示す。図に示すと
おり、抗体Ｋ28Ｎは血清中の尿素窒体濃度の経時的上昇
(図８) と、自己免疫疾患発症にともなう生存率の低下
(図９）に対して抑制効果を示した。 Ｃ．ＧＶＨＤモデルマウスによる実験 本実験では、Ｘ線照射したマウスにハプロタイプの異な
るマウス骨髄細胞を注入して発症させたＧＶＨＤモデル
マウスにＫ28Ｎ抗体を投与し、免疫抑制効果を調べた。
具体的には、その方法を以下に示す。

【００４６】C3Hマウス（チャールズリバー）にＸ線照
射装置 MBR1520R（日立）10 Gy のＸ線照射を施し骨髄
細胞を死滅させ、骨髄細胞細胞移入群８匹と骨髄細胞未
移入群3匹に群分けを行なった。更に骨髄細胞細胞移入
群８匹を抗体処理群4匹と未処理群4匹に郡分けを行なっ
た。骨髄細胞細胞移入群にはC57/Black（チャールズリ
バー）より調製した骨髄細胞 9.0×10⁶を静脈注した。
また、抗体処理郡4匹には、C57/Blackより調製した骨髄
細胞を移入する前にその骨髄細胞をあらかじめＫ28Ｎ抗
体（5μg/ml）で1.5時間処理を行ない、更にこの骨髄細
胞移入後移入したC3Hの尾静脈にＫ28Ｎ抗体300μg/匹/
日で7日間投与した。

【００４７】その結果を図10に示す。図に示すとおりＧ
ＶＨＤの発症による生存率の低下に対して、Ｋ28Ｎは抑
制効果を示した。

【００４８】

【実施例】

実施例１ 液剤−１ 抗ヒトヌクレオリンモノクローナル抗体（Ｋ28Ｎ）10m
g、日局ポリソルベート1.0mg、塩化ナトリウム16mg、2m
l PBS からなる溶液を無菌的に調製、アンプル充填し、
注射液とした。

【００４９】実施例２ 液剤−２ 抗ヒトヌクレオリンモノクローナル抗体（Ｋ28Ｎ）のＦ
（ａｂ）₂ 10mg、日局ポリソルベート1.0mg、塩化ナト
リウム16mg、2ml PBS からなる溶液を無菌的に調製、ア
ンプル充填し、注射液とした。 実施例３ 液剤−３ 抗ヒトヌクレオリンポリクローナル抗体 100mg、日局ポ
リソルベート 1.0mg、塩化ナトリウム 16mg、2ml PBS
からなる溶液を無菌的に調製、アンプル充填し、注射液
とした。

【００５０】実施例４ 凍結乾燥剤−１ 抗ヒトヌクレオリンモノクローナル抗体（Ｋ28Ｎ）10m
g、日局ポリソルベート1.0mg、塩化ナトリウム16mg、2m
l PBS からなる溶液を無菌的に調製した凍結乾燥剤。注
射用蒸留水にて溶解後、注射液として使用する。 実施例５ 凍結乾燥剤−２ 抗ヒトヌクレオリンモノクローナル抗体（Ｋ28Ｎ）のＦ
（ａｂ）₂ 10mg、日局ポリソルベート1.0mg、塩化ナト
リウム16mg、2ml PBS からなる溶液を無菌的に調製した
凍結乾燥剤。注射用蒸留水にて溶解後、注射液として使
用する。

【００５１】実施例６ 凍結乾燥剤−３ 抗ヒトヌクレオリンポリクローナル抗体 100mg、日局ポ
リソルベート 1.0mg、塩化ナトリウム 16mg、2ml PBS
からなる溶液を無菌的に調製した凍結乾燥剤。注射用蒸
留水にて溶解後、注射液として使用する。

【００５２】

【発明の効果】本発明は、新規な免疫抑制剤を提供する
ことにある。そして、本発明のヒトヌクレオリンに対し
反応性を有する抗体を有効成分として含む免疫抑制剤
は、種々の免疫疾患に対して有効性をもった免疫抑制剤
であり、産業上きわめて有用である。 参考文献 （1）Von Wauwe J.P., Demey J.R., Goosens J.G. J Immunol 1980 ; 124: 2708 （2）Ellenhorn J.D.I., Woodle E.S., Ghobrial I., T
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【００５３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７０７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 トポロジー：直線状 配列の特徴：ヒトヌクレオリンのアミノ酸の一次構造 配列 Met Val Lys Leu Ala Lys Ala Gly Lys Asn Gln Gly Asp Pro Lys Lys 5 10 15 Met Ala Pro Pro Pro Lys Glu Val Glu Glu Asp Ser Glu Asp Glu Glu 20 25 30 Met Ser Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Ser Gly Glu Glu Val Val Ile 35 40 45 Pro Gln Lys Lys Gly Lys Lys Ala Ala Ala Thr Ser Ala Lys Lys Val 50 55 60 Val Val Ser Pro Thr Lys Lys Val Ala Val Ala Thr Pro Ala Lys Lys 65 70 75 80 Ala Ala Val Thr Pro Gly Lys Lys Ala Ala Ala Thr Pro Ala Lys Lys 85 90 95 Thr Val Thr Pro Ala Lys Ala Val Thr Thr Pro Gly Lys Lys Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Gly Lys Ala Leu Val Ala Thr Pro Gly Lys Lys Gly Ala Ala 115 120 125 Ile Pro Ala Lys Gly Ala Lys Asn Gly Lys Asn Ala Lys Lys Glu Asp 130 135 140 Ser Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp 145 150 155 160 Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Ile Glu Pro Ala Ala Met Lys 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ser Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp 180 185 190 Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Glu 195 200 205 Glu Ala Met Glu Thr Thr Pro Ala Lys Gly Lys Lys Ala Ala Lys Val 210 215 220 Val Pro Val Lys Ala Lys Asn Val Ala Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu 225 230 235 240 Asp Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro 260 265 270 Val Lys Glu Ala Pro Gly Lys Arg Lys Lys Glu Met Ala Lys Gln Lys 275 280 285 Ala Ala Pro Glu Ala Lys Lys Gln Lys Val Glu Gly Thr Glu Pro Thr 290 295 300 Thr Ala Phe Asn Leu Phe Val Gly Asn Leu Asn Phe Asn Lys Ser Ala 305 310 315 320 Pro Glu Leu Lys Thr Gly Ile Ser Asp Val Phe Ala Lys Asn Asp Leu 325 330 335 Ala Val Val Asp Val Arg Ile Gly Met Thr Arg Lys Phe Gly Tyr Val 340 345 350 Asp Phe Glu Ser Ala Glu Asp Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Thr Gly 355 360 365 Leu Lys Val Phe Gly Asn Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro Lys Gly Lys 370 375 380 Asp Ser Lys Lys Glu Arg Asp Ala Arg Thr Leu Leu Ala Lys Asn Leu 385 390 395 400 Pro Tyr Lys Val Thr Gln Asp Glu Leu Lys Glu Val Phe Glu Asp Ala 405 410 415 Ala Glu Ile Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Lys Ser Lys Gly Ile Ala 420 425 430 Tyr Ile Glu Phe Lys Thr Glu Ala Asp Ala Glu Lys Thr Phe Glu Glu 435 440 445 Lys Gln Gly Thr Glu Ile Asp Gly Arg Ser Ile Ser Leu Tyr Tyr Thr 450 455 460 Gly Glu Lys Gly Gln Asn Gln Asp Tyr Arg Gly Gly Lys Asn Ser Thr 465 470 475 480 Trp Ser Gly Glu Ser Lys Thr Leu Val Leu Ser Asn Leu Ser Tyr Ser 485 490 495 Ala Thr Glu Glu Thr Leu Gln Glu Val Phe Glu Lys Ala Thr Phe Ile 500 505 510 Lys Val Pro Gln Asn Gln Asn Gly Lys Ser Lys Gly Tyr Ala Phe Ile 515 520 525 Glu Phe Ala Ser Phe Glu Asp Ala Lys Glu Ala Leu Asn Ser Cys Asn 530 535 540 Lys Arg Glu Ile Glu Gly Arg Ala Ile Arg Leu Glu Leu Gln Gly Pro 545 550 555 560 Arg Gly Ser Pro Asn Ala Arg Ser Gln Pro Ser Lys Thr Leu Phe Val 565 570 575 Lys Gly Leu Ser Glu Asp Thr Thr Glu Glu Thr Leu Lys Glu Ser Phe 580 585 590 Asp Gly Ser Val Arg Ala Arg Ile Val Thr Asp Arg Glu Thr Gly Ser 595 600 605 Ser Lys Gly Phe Gly Phe Val Asp Phe Asn Ser Glu Glu Asp Ala Lys 610 615 620 Glu Ala Met Glu Asp Gly Glu Ile Asp Gly Asn Lys Val Thr Leu Asp 625 630 635 640 Trp Ala Lys Pro Lys Gly Glu Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly 645 650 655 Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly 660 665 670 Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg 675 680 685 Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Asp His Lys Pro Gln Gly Lys Lys Thr 690 695 700 Lys Phe Glu 705

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｂ細胞株への抗体の影響を示す図。

【図２】ヒトリンパ球混合培養試験における抗体の抑制
効果を示す図。

【図３】ヒト標的細胞障害性試験における抗体の抑制効
果を示す図。

【図４】マイトジェン刺激増殖における抗体の抑制効果
を示す図。

【図５】マウスリンパ球混合培養試験における抗体の抑
制効果を示す図。

【図６】ラットリンパ球混合培養試験における抗体の抑
制効果を示す図。

【図７】II型コラーゲン誘導関接炎モデルマウスにおけ
る抗体の抑制効果を示す図。

【図８】MRLlpr/lprにおける抗体の抑制効果（血中尿素
窒素濃度）を示す図。

【図９】MRLlpr/lprにおける抗体の抑制効果（生存率）
を示す図。

【図10】GVHDモデルマウスにおける抗体の抑制効果を示
す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトヌクレオリンに反応性を有する抗体
   を有効成分として含有することを特徴とする免疫抑制
   剤。
2. 【請求項２】 ヒトヌクレオリンに反応性を有する抗体
   がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１
   記載の免疫抑制剤。
3. 【請求項３】 ヒトヌクレオリンに反応性を有する抗体
   がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１
   記載の免疫抑制剤。
4. 【請求項４】 ヒトヌクレオリンに反応性を有する抗体
   がＦ（ａｂ）₂断片であることを特徴とする請求項１記
   載の免疫抑制剤。
5. 【請求項５】 ヒトヌクレオリンに反応性を有する抗体
   がハイブリドーマ細胞株Ｋ２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５
   ７７）により産生されるモノクローナル抗体であること
   を特徴とする請求項２記載の免疫抑制剤。
6. 【請求項６】 Ｆ（ａｂ）₂断片がハイブリドーマ細胞
   株Ｋ２８（ＦＥＲＭＢＰ−４５７７）により産生される
   モノクローナル抗体由来であることを特徴とする請求項
   ４記載の免疫抑制剤。