CZ17293A3 - Novel species of fungi and their use in production of antibiotics - Google Patents

Novel species of fungi and their use in production of antibiotics Download PDF

Info

Publication number
CZ17293A3
CZ17293A3 CZ93172A CZ17293A CZ17293A3 CZ 17293 A3 CZ17293 A3 CZ 17293A3 CZ 93172 A CZ93172 A CZ 93172A CZ 17293 A CZ17293 A CZ 17293A CZ 17293 A3 CZ17293 A3 CZ 17293A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lovastatin
strain
oryzae
fungal
aspergillus
Prior art date
Application number
CZ93172A
Other languages
English (en)
Inventor
Jagroop S Dahiya
Original Assignee
Novopharm Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CA002062023A external-priority patent/CA2062023A1/en
Application filed by Novopharm Ltd filed Critical Novopharm Ltd
Publication of CZ17293A3 publication Critical patent/CZ17293A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A20/00—Water conservation; Efficient water supply; Efficient water use
    • Y02A20/40—Protecting water resources
    • Y02A20/402—River restoration

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Předložený vynález se týká nových kmenů hub, zpracovaných genetickým inženýrstvím, a jejich použití při přípravě antibiotik . Specifičtěji se týká nových, genetickým inženýrstvím zpracovaných kmenů Agpergillus a jejich použití při přípravě léčiva lovastatinu a jeho analogů.
Dosavadní stav techniky
Lovastatin je chemicky 1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7dimethyl-8-/2- (tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl·)ethyl/-1-naftalenylester kyseliny /1S-/1 (Ss), 3ςς,7β,8/3> (2S*, 4S*), 8 //-2-me thyl butanové a má chemický vzorec
-2Je využitelný jako antihypercholesterolemické činidlo, protože je účinným inhibitorem HMG-CoA reduktázy, enzymu řídícího rychlost biosyntézy cholesterolu, úe houbovým metaboliten produkovaným fermentačním procesem za použití vybraných kmenů plísní.
Aitibiotika jako je lovastatin jsou metabolity, které pro svoji syntézu vyžadují soubor několika enzymů, -^ro umožnění jejich produkce molekulárním klonováním mikroorganismů, produkujících antibiotiku»je vyžadována izolace, analýza a snad modifikace odpovídajícího genu pro některé enzymy. Pokusy izolovat takové geny z příslušných kmenů plísní až dosud poskytly klony, nesoucí bud individuální geny souboru nebo pouze neúplný soubor genů- viz ^alpartida a Hopwood, Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic Pathway of a Střeptornyces Aitibiotics and its Expression in a neterologous Host”, Nátuře (1984), 309, str. 462-464.
kanadský patent Č. 1129794 Endo, popisuje přípravu lovastatinu fermentací za použití kmene plísnového druhu ^onascus ruber.
kanadský patent č. 1161380 Monaghan a spol., popisuje přípravu lovastatinu fenmentací za použití kmenů druhu plísně Agpergillus terreus.
V obou těchto známých postupech je lovastatin produkován samotný spolu s jinými, velmi chemicky podobnými sloučeninami, ve větších množstvích a musí být od nich oddělován* Za použití Monascus ruber je lovastatin produkován s monacolinem J. Za použití Aspergillue terreus je doprovázen dihydrolovastatinem a hydroxykyselinou. Zatímco hydroxyskupina může být snadno laktonizována na lovastatin, dihydrolovastatin od něj musí být oddělen.
-3Podstata vynálezu
Objektem předloženého vynálezu je poskytnout nové, pomocí genetického inženýrství připravené mutanty kmenů plísní., které jsou schopny využití ve fermentačních procesech pro přípravu lovastatinu.
Dalším objektem vynálezu je poskytnutí nových způsobů přípravy lovastatinu za použití těchto kmenů při fermentaci.
Podle jednoho aspektu předloženého vynálezu jsou poskytnuty nové mutanty kmenů plísní vhodného druhu rodu Aspergillus, které jsou schopny exprese a sekrece lovastatinu. Tyto kmeny obsahují geny souboru enzymů produkujících lovastatin, ve funkčním vzájemném vztahu, odvozené od DNA kmenů éspergillus terreus, produkujících lovastatin. Jsou připraveny způsobem transformace protoplastů DNA z kmene -áspergillus terreus, produkujícího lovastatin, obsahující^ také vhodný selektovatelný markér, s jinými druhy ^spergillus, které neprodukují lovastatin a jsou vybrány ze skupiny, zahrnující A.oryzae, A.fumígatus, A.niger, A.nidulans a A,flavus, výběrem transformantů takto vytvořených, podle selektovatelného markéru, identifikací a izolací transformantů, produkujících lovastatin a jejich subklonováním.
Podle dalšího aspektu vynálezu je poskytnut způsob přípravy lovastatinu, který zahrnuje fermentaci živného media s transformantem mikroorganismu ^spergillus., obsahujícím geny odvozené od Aspergillus terreus a kódující sou bor enzymů, produkujících lovastatin a získání takto vytvořeného lovastatinu.
/.působ podle předloženého vynálezu produkuje lovastatin s výrazně menšími množstvími kontaminujícího dihydr olov astat inu a derivátů hydroxykyseliny ve srovnání s postupem, který využívá -Aspergillus terreus.
-4Y procesu přípravy transformantů podle předloženého vynálezu mohou být použity standardní techniky pro přípravu protoplastů z vybranghb lovastatin neprodukujícího kmene Aepergillusa standardní techniky extrakce LNA z lovastatin produkujícího kmene ^spergillus terreua. Tyto techniky jsou odborníkům dobře známé a není nutno se zde jimi podrobné zabývat. Podobně techniky a postupy transformace protoplastů, které jsou zde použity, jsou známé a standardní.
Výhodně je lovastatin neprodukujícím kmenem 4gpergillus kmen -Aspergillus oryzae, ale není podmínkou pro praktické úspěšné provedení vynálezu. Mohou být použity jiné druhy áspergillus, zejména 4.niger, A.nidulana, A. fumigatus a A.flavus. JLoryzae je zvolen jako výhodný vzhledem, k jeho inertnosti, která umožňuje snadnou a bezpečnou manipulaci s ním a fermentace v komerčním měřítku·
Za účelem oddělení transformantů mikroorganismů od. netransformovaných: po transformaci protoplastů, by DNA z A.terreus měla obsahovat selektovatelný markér· Existuji široký výběe selektovatelných markérů, dostupných a známých odborníkům a upřesnění volby není podstatné pro úspěšné provedení vynálezu. Mohou být použity markéry antibiotické rezistence jako je rezistence k ampicilinu, rezistence k rifampicinu, rezistence ke střeptornycínu atd a výsledná směs transformantů a netransformantů může být kultivována v mediu, obsahujícím vhodné antibiotikum tak, že pouze transformanty, které obsahují selektovatelný markér, budou přežívat izolaci.
Zvláště je jako selektovatelný markér, pr0 snadnost, vhodná rezistence k cykloheximidu. Cykloheximid je inhibi tor syntézy proteinu, takže přítomnost cykloheximid-rezia tentního kmene nebo transformantů v kultivační půda, je snadno detegovatelná.
-5Po selekci transformantů na bázi selektovatelného markéru, jsou tyto prohledány na ty, které budou exprimovat a sekretovat lovastatin. Pouze relativně malý počet celkových transformantů produkovaných procesem transformace protoplastů, má tuto schopnost. Jsou rozpoznány separátní kultivací ve standardní kultivační půdě a analýzou výsledného media, např. pomocí HPLC, na přítomnost lovastatinu· Ty, které byly testem shledány jako pozitivní na přítomnost lovastatinu se subkultivují a rostou a poskytnou kolonie nových, lovastatin produkujících transformantů fungál ního mmkroorganisrnu rodu Aspergillus a výhodně druhu -^pergillus species·
Vynález, je dále popsán pro účely ilustrace v následující experimentální části.
Připojené obrázky:
Obr.l je grafickým vyjádřením HPLC analýzy surového fungálního extraktu produkovaného pokusy podle příkladu 1 , který je uveden dále.
Obr.2 je ^H-NME spektrum lovastatinové sloučeniny získané a čištěné z hybridního kmene.
Obr.3 je hmotové spektrum téže sloučeniny.
Obr.4 je znázornění morfologických charakteristik nového transformantů AMt/NBJ-V.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Materiály a metody
-6Plísnové kultura - izoláty -“spergillus terreus a A. oryzae· použité v tomto pokuse, byly izolovány ze vzorků půdy orchideí z kolekce Agriculture Uanada, Research Station, Beaverlodge, Alberta, Canada.
Selekce mutantů rezistentních k cykloheximidu
Po kultivaci obou izolátu Aspergilli na Gzapekově dox mediu, obsahujícím cykloheximid (konc.0,1-5 mM) po b dnů při 28+ 2 °C, byly spory (10θ) každého izolátu A. terreus a A. oryzae rozděleny v 10 mM cykloheximid-Czapekově dox půdě (50 ml) a inkubovány 30 minut, odstřelovány při 10 000 g 10 minut a pak resuspendoványfce sterilní destilované vodě» Byly promyty třikrát mícháním a resedimentovány odstředěním» Spory byly pak suspendovány ve sterilním 1% (obj./obj.) roztoku Tritonu X-100 a jejich počet byl staaoven v podílu haeaocytoaetrem. Ve vhodném ředění byly rozděleny· na 10mM cykloheximidovém. selekčním mediu a po 10 dnech, inkubace při 28+ 2°G byly izolovány rezistentní mutanty· Izoláty byly zkoušeny na produkci lovastatinu. Pro další transformační studiii byl vybrán: k cykloheximidu rezistentní lovostatin produkující izolát A.terreus.
Příprava protoplastů a DNA
Izoláty Aeoergillus oryzae a k cykloheximidu rezistentní^lovastatin produkující A. terreus (označeného zde JAG-4703) byly kultivovány oddělena v 50 ml Czapekovy dox půdy. Kultury byly inkubovány 58 hodin při 28 + 2 °C na rotační třepačce (New Brunswick Scientific Ing.) při 200 ot.min“}, potom sklizeny a promyty sterilní destilovanou vodou s opakovaným odstředěním.
Protoplasty z kultur obou druhů byly získány za použití Novozymu 234 (Novo-Nordisk, Novo Alle, DK 2880, Bagsvaerd, Dánsko) pro odstranění buněčných stěn během 10 až 12hodinového štěpení, obecně podle metody popsané Dickinsonem
-7a Isenbergem, J.Gen.Microbiol. 128, str. 651-654 (1982). Podíly protoplastů z každého druhu regenerují životaschopné, jednotlivé buněčné spory se stěnami při 28 °C po 24 hodinách v regeraěním mediu (R), obsahujícím 0,1 g agara ÍDifco), 5 g sorbosy a 0,35 g EDTA v 50 ml destilované vody. Po geroinaci tyto spory mají všechny charakteristiky kultury rodičovské.
Celková DNA byla izolována z protoplastů Aspergillus terreus postupeh. podle práce Schliefa a Wensinka, Practical Methods in Molecular Biology, 33, 21-29 (1981). Protoplasty byly suspendovány v roztoku, obsahujícím 10 mg/ml SDS, Q,1M NaCl a 0,1M tris-HCl, pH 9,0. Byl přidán stejný objem fenolu nasyceného tris-HCl pufrem. Směs byla odstřelována při 12000 g 10 min v Eppendorfově odstředivkové zkumavce (Brinkmann Instruments, CanadaLtd., Rexdale, Ontario). Horní fáze, obsahující DNA byla odstraněna, smíšena s 95½ ethanolem, uchovávána při -20 °C 60 min, pak jako předtím odstřeďována 10 min. Peleta byla resuspendována v pufru pH 7,0 a inkubována a RNásou (Sigma, Stw Louis, MO, USA) zpracovanou s fenolem a DNA byla vysrážena z vodné vrstvy. Izolovaná DNA byla čištěna adsorpcí a promýváním na DEAE-celuloze (DE-52, Whatman),předem smočené v 1Q mM tris-HCl pufru, pH 7,5 a 0,3M NaCl a umístěné v Pasteurově pipetě. DNA byla eluována 10 mM trisHCl pufrem, pH 7,5, obsahujícím 1,5M NaCl. Tento roztok byl zředěn na Q,2M NaCl a DNA byla vysrážena dvěma objemy ethanolu. Čistota DNA byla hodnocena z 200-320 nm spektra stanovením poměru ^qq absorbance. Pouze DNA s poměry mezi 1,50 a 2,00 byly použity v transformaci. Šest vzorků, každý 0,1 mg izolované DNA,byl» inkubován» v regeneračním mediu pro zajištění nepřítomnosti životaschopných protoplastů a žádný z nich nevyvíjel jakékoliv kolonie.
-8—
Protopíast-DNA inkubace
Přibližně 5,2 χ 104 protoplastů A.oryzae, hodnoceno haemocytometrovým počítačem, bylo inkubováno s 10-100 ng A.terreus DNA v 5 ml regeneračního media, jehož složení je popsáno výše a regenerováno jak je popsáno výše. Za účelem studie možných chemických vlivů DNA na expresi lovastatinu bylo s podobným množství protoplastů A.oryzae inkubováno 10 až 100 /ug telecího thymu (Sigma Chemical Co., St.Louis,MO, USA), DNA (Bethesda Research Laboratories, Gaitheberg, MD,USA) a homologní DNA A.oryzae. Po zahrnutí DNA do inkubací, byla regenerace7 protoplastů snížena na méně než 10 % a srovnatelný počet takto zpracovaných protoplastů (104) postrádá jakoukoliv rezistenci k cykloheximidu.
Produkce lovastatinu a studie
Suspenze spor vyvinutých z protoplastů A.oryzae inkubovaných s DNA A.Terreus byla inokulována, 1 ml na ^etriho misku, na Czapekovo dox agarové medium, obsahující 10 mM cykloheximidu. Po 48hodinové inkubaci při 28+2 °C, dosáhly kultury průměru 6-8 mm. Každá se vyvinula odděleně z jednotlivé spory za těchto podmínek. Ty, které rostou na cykloheximidovém mediu byly každá separátně inokulovány na Czapekovu dox živnou půdu (50 ml v 500ml Erlenmeyerově bance), inkubovány na rotační třepačce (200 ot.rnin“1 ) při 28+2 °C po 12 dnů. Každé růstové medium bylo hodnoceno na produkci lovastatinu dále popsaným způsobem a analyzováno pomocí HPLC.
Extrakce
FerT.entovaná bůda (50 ml) byla okyselena na pH 4,0 17N HC1 a pak rozdělena ethylacetátem (100 ml, 3x). Spojené ethylacetátové frakce byly sušeny ve vakuu při 30 °C,zbytek
-9byl shromážděn v acetonitrilu (5 ml) a pak analyzován pomocí HPLC.
HPLC analýza
HPLC zařízení (Beckman i^odel 420) bylo dosáno firmou Beckman Instruments, Toronto, Kanada a obsahovalo ALtex čerpadlo (model 110 A) a injekční ventil. LC-UV detektor byl nastaven na 237 nm. Byla použita kolona hypersil C-18 ODS silica (25 x 0,46 cm, vnitřní průměr) a rozpouštědlový systém acetonitril a voda (55:45, obj./obj.) při průtokové rychlosti 1,0 ml.min*”1. Produkce lovastatinu byla srovnávána a kvantifikována ze standardní křivky pro Ιον astat in.
Příklad 1 - výsledky
Sedmdesát devět k cykloheximidu rezistentních izolátů, zahrnujících čtyři lovastatin produkující izoláty, c
bylo získáno z 5,2 x 10^ A.oryzae protoplastů inkubovaných s DNA z lovastatin produkujícího mutantu A.terreus rezistentního k cykloheximidu. Transformační pokusy byly provedeny šestkrátt
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 1.
-10<*ÍR-R-R· Μ· < Η- Η>
t
Ο
Ν' •
ο
IV vi VI -3 ►3 O
4» w w v ΓΙ-
ΟΛ ctí o IV IV -R Ο
K X X X X X Ό R»
© CO
o o o o o O rT
VI VI VI VI VI VI <<
--rouu^ — ví -υ ~q — —
X X X X X X
Ο Ο Ο Ο Ο Ο νι νι νι νι νι νι
*O Ό Ό
►3 •3 O
O O Cx
ΓΙ- ΓΙ- Φ
Ο Ο rt-
Ό Ό
H1 R« »3
© © Φ
CO CO OU
ř* (-Γ Φ
O P> ©
X· w Φ *3
Ό O
O
H> §
3 Cx
R· N O
R- ST
>3
-J σ\ -j -q σ\ νι φ ο νι ο γό ο Ολ ος
Φ
Ο φ
© ο
Φ — ΙΌ VI -q Ο Ο Ο VI Ο V, ο α
>► □
συ
Ο Ο Ο ΓΌ ΓΟ Ο
R* “O R· Ό
O T N O
< O O CH
© Cu I—* ro
CO c ©X rt-
ří- Ν' ΓΙ-
© r·- R- © c CJ. Rx O Rx O ©* Ο·
Tabulka 1 Protoplasty k cykloheaimidu rezistentního a lovastatin exprimujícího
Agpergillus oryzae inkubované s DNA z matantu Aspergillus terreus rezistentního k oykloheximidu a produkujícího lovaetatin
-11Jedna z transformovaných kultur AD-II si udržuje své originální transformované charakteristiky šest měsíců· Obr.l ilustruje HPLC analýzu extraktů získaných z recipientních a donorovýoh kultur A. Oryzae a těch, která byly zpracovány s DNA A.Terreus. Produkce lovastatinu transformovanými izoláty je uvedena dále v tabulce· 2.
Tabulka 2
Produkce lovastatinu transformovanými izoláty -Aspergillus oryzae v Czšpekově dox půdě (pH 6,8) izolát výtěžek lovastatinu (mg/1)
AD-I AD-II AD-III
15,36 + 1,78 26,89 + 3,76 13,46 + 4,56 9,67 + 0,75
Izolát č. AD-I byl subkultivován pětkrát pro poskytnutí transformantů AoAt - N3J/5, který byl deponován 25. února 1992, jako jeho životaschopná, permanentní kultura v? Jberioan Type Culture Collection pod označením ACCC 74135.
Lovastatin je produkován spolu se svým hydroxykyselinovým analogem, který je snadno převeditelný na lovastatin např. refluxováním v toluenu pro provedení laktoni— zace a tak se výtěžek lovastatinu zvyšuje'. Laktonizace v těchto pokusech nebyla provedena.
Lovastatin produkovaný rodičovskou kulturou A.terreus v Czapekově dox půdě byl v koncentraci 166,72 + 5,92 mg/1 a rodičovský Aiorazae neprodukoval žádný lovastatin.
-12Obr.2 připojených obrázků představuje ^H-NMR spektrum lovastatinové sloučeniny čištěné pomocí HPLC z hybridního kmene. Při srovnání se známým, standardním spektrem lovastatinu, potvrzuje toto spektrum identitu produktu.
Obr.3 připojených obrázků představuje hmotnvé spektrum téhož produktu a ukazuje, že lovastatin byl získán v čistotě 99 %»
Koncentrace DNA v rozmezí od 5 do 20 ng na ml media neovlivňují ani regenerační kapacitu protoplastů A.oryzae ani získání rezistence k cykloheximidu azlovastatin produkujících izolátů z inkubací s DNA A.terreus. Tyto hodnoty indikují, že tyto koncentrace1 nejsou limitním faktorem při produkci lovastatinu. Podobně, DNA z telecího thymu, DNA a homologní DNA A.or^zae v koncentracích od 5 ng; do 5 /Ug- na ml media neovlivňují regeneraci protoplastů A.oryzae- ve srovnání s neošetřenými kontrolami.
Avšak DNA v koncentracích 10 a 100 ^ug na ml media redukuje regeneraci maximálně na 26 a 1 í. Tato zpracování s DNA neeelicitují expresi lovastatinu.
Regenerační medium poskytuje počet protoplastů srovnatelný s počtem získaným podle Achá a spol., J.Gen. Microbiol., 45, 515-523 (1966), za použití komplexnějšího minerálního media. Konidie a čerstvě vzklíčené konidie produkují lepší výsledky životaschopných protoplastů a DNA než mycelia. Tvorba buněčných agregátů během regenerace protoplastů popsaná Asha-em a spol. (1966) nebyla v tomto systému pozorována. Zřejmý transfer faktorů zodpovědných za expresi rezistence k cykloheximidu a expresi lovastatinu z A.terreus do A.oryzae' indikuje mezidruhovou transformaci DNA. Ko-transformace rezistence k cykloheximidu a produkce lovastatinu je neočekávaně bezpečná a potvrzuje fyzickou příbuznost a možné shlukování genů zahrnutou ve vyjádření těchto charakteristik.
-13Morfologie nových transformantů AjAt-NSJ/5 je znázorněny na obr.4 a může být charakterizována následovně:
Morfologie AoAfc-NBJ/5
Konidiální hlavy sloupcovítá, světle hnědé. Konidiofory hladké, bezbarvé. Vesikula hemisférická, potažená až do jedné poloviny nebo dvou. třetin phialidy uspořádanými ve dvou vrstvách. Konidia kulovitá nebo elipsovitá, hladké kolonie na Czapekově agaru rostoucí velmi rychle, buď chomáčkovité nebo samětové skořicově hnědé během tvorby konidií. Oranžový exsudát, mění se ze žluté na hnědou.
Tyto pokusy demonstruji že, v zásadě, geneticky determinovaná produkce antibiotik, charakteristicky produkavaná jedním druhem plísni, může být exprimována v jiném druhu.
Příklad 2
Způsob výroby
Kultura plísně: Pro produkci lovastatinu byla použita transformovaná kultura Agpergillus oryzae (ATCC č. 74135)
Ao Afr/NBJ-V.
Perm ea táce:
Příprava očkovací kultury: Plísnová kultura (lyofilizo» váná lahvička) byla asepticky přenesena na brambor-dextrozový šikmý agar a ponechána růst pří 25 °C 4-5 dnů. Na konci inkubace byla konidiální suspenze připravena přídavkem 10 ml roztoku tritonu X-100 (0,01 %}, intenzivně míchána a konidiální suspenze byla přenesena na sterilní rýži (50 g) v Erlenmeyerově baňce (250 ml objem). Baňka byla doplněna dalšími 10 ml sterilní vody, intenzívně mí-14chána a inkubována při 28 °C 5 až 7 dnů. Na konci inkubační periody byla přidána sterilní voda (50 ml).
Konidiální suspenze?prošla sterilní mušelinovou látkou a filtrát, obsahující 1 r 108 konidií/ml, byl přenesen do očkovacího fermentoru (50 1 kapacita) se 30 1 očkovacího media. Složení očkovacího media bylo následující:
D-glukóza 20 g/l sladový extrakt 20 g/1 neo-pepton 3 g/1 vodovodní voda 1 1 pH 6,8 (upraveno 10% NaOH). (Medium bylo sterilováno při
121 °C po 30 min (15 psi). Očkovací kultura byla ponechána růst 17 až 20 hodih. při 28 °C (rychlost vzduchování 0,3 — 0,5 m) s 80 až 100 % rozpuštěného kyslíku (200 ot.ain~1)·
Produkce lovastatinu
Očkovací kultura (30 1) byla přenesena do nádoby pro-
dukčního fermentoru (1000 1 pracovní objem), obsahujícího
produkční medium. Složení produkčního media bylo nésledu-
jící:
laktoza 60 g/1
ard amine pH 10 g/1
sojový protein 2 g/1
KC1 2 g/1
0,8 g/1
MnS04.4H20 0,03 g/1
betain 0,6 g/1
P2000 2 ml
vodovodní voda 1 1
pH 6,8-(před sterilací , upraveno 105 NaOH/H^SO^), steri-
lizace při 121 °C po 1 hodinu při 15 až 20 psi.
Po inokulaci byla kultura ponechána růst 7 až £ dnů při 28 °C se řízeným pH mezi 6,0 a 6,2 (10% HgSO^).
-15Rychlost pro vzdušilo vání byla udržována mezi. 0,7 - 1,0 vvm. (% rozpuštěného kyslíku 80 - 100 %).
Druhé produkční stadium.
dní stará fermentovaná půda (50 1) byla přenesena asepticky do očkovacího fermentoru (2000 1 pracovní objem), obsahujícího 1500 1 očkovacího media (složení uvedeno výše).
Očkovací kultura byla ponechána růst 24 hodin při 28 °C (200 it.min“') rozp.kyslík 80 až 100 Půda (200 1) byla asepticky převedena do produkčního fermentoru (30000 1) kapacity s pracovním objemem 20000 1), obsahujícího 18000 1 produkčního media. Kultura byla ponechána růst dalších
7-9 dnů při 28 ®C se řízeným pH 6,0 až 6,2. Po 60 hodinách fermentace nebylo pH kontrolováno. Fermentační půda byla doplňována živným mediem (rychlost 10 l/h) po 5 dnů.
Složení živného media bylo následující:
D-glukozs 285,7 g/1 ardamine pH 71,4 g/1 sojový protein 14,3 g/1 vodovodní voda 1 1 pff 6,8 (před sterilací) sterilováno při 121 °C po 30 až min. Na konci fermentace byla půda okyselena na pH 4,0 10N HC1 a odstředěna. Plísnový koláč byl sušen při 55 °C a extrahován.
Extrakce a čištění
Sušený plísnový koláč (20 kg) se homogenizuje- se studeným ethylacetátem (i0 - 15 min) a homogenizovaný materiál se refluxuje při 80 až 85 °C 4 až 6 hodin, ponechá vychladnout a filtruje. Filtrát se suší ve vakuu na černý dehtovitý materiál (2,5 kg až 3 kg). Černý dehtovitý materiál se smísí se silikagelem (2,5 kg) a CHgClg (5 litrů).
CHgClg se odpaří ve vakuu a se silikagelem smísený surový
-16dehtovitý materiál se nalije na silikagelovou skleněnou kolonu (100 cm délky x 22,5 cm průměr) vyvíjenou pomocí EtOAcihexanu (1:2 obj/dbj.). Vzorky (2000>1, 12x) se· odebírají. Po 24 hodinách se eluční směs rozpouštědel nahradí EtOJb:hexanem (1:1 obj./obj.)a ponechá se dalších 24 hodin. Vzorky, obsahující produkt se: spojí, suší (230 g) a krystalují s methanolem.
Krystalizace
Žlutý sušený produkt (280 g) se rozpustí ve 2,8 1 methanolu a vaří se: 40 až 60 minut při 60 až 65 °C. Horká methanolová směs se zfiltruje a filtrát se inkubuje 4 až 6 hodin při 4 °C. Bílé krystalické jehličky se oddělí od matečného louhu a propláchnou se studeným methanolem. Krystaly se suší ve vakuu, zváží (190 g) a uloží v exsikétoru při 4 °C.
Způsob podle předloženého vynálezu může poskytovat výtěžky lovastatinu, které jsou dosti vysoké, což je způsobeno rupturou buněčných stěn. nových transformantů Agpergillus oryzae, takže v tomto postupu může být eliminován, stupeň lýze buněk před získáním lovastatinu. Toto podstatně zjednodušuje: souproudé získávání a čištění. Jak je popsáno výše, lovastatin podle předloženého způsobu může být získáván extrakcí rozpouštědly, bez nutnosti tvorby esterů, solí atd* během získávání. Extrakce rozpouštědly je mnohem jednodušší a ekonomičtější způsob získávání a čištění než chromatografie.
Ve specifických příkladech byl vynález detailně popsán, není však jimi nikterak omezen. Jeho rozsah je definován v připojených patentových nárocích.
-17v., i ’Ξ i '-D
CO

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ N A*fi 0 Κ Ϊ
    1. 5^>ůsob přípravy lovastatinu, vyznačující se t i m, že se fermentuje živné medium s transformovaným fungálním mikroorganismem z kmene Agpergillus vybraným ze skupinyjdruhů A.fíryzae, A.niger, A.nidulans·, A.fumigatus a A.flsvus, kde tento kmen je neschopen exprese lovastatinu, ale byl transformován, tak, že obsahuje cizí DRA kódující soubor enzymů schopných syntézy lovastatinu, a selektovatelný markér, a lovastatin se získá ze živného media·
  2. 2· Způsob podle nároku 1, vyznaču jící se t í m, že transformovaný mikroorganismus obsahuje cizí DRA získanou z lovastatin produkujících druhů Aspergillus terreuss.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kmenem -áepergillas je kmen druhu A.oryzae.
  4. 4· Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že cizí DRA zaváděná do transformantu obsahuje geny rezistence k cykloheximidu jako selektovatelný markér.
  5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se t í m, že transformantem je AoAt-NBJ/5 jak je popsán a definován.
  6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje další stupen laktonizace hydroxykyselinového analogu vzniklého při fermantační přípravě lovastatinu.
    -187· Způsob podle kteréhokoliv z předcházející nároků, vyznačující se tím, že získání lovastatinu. je provedeno extrakcí rozpouštědlem.
  7. 8. Nové fungélní transformanty schopné produkce enzymů schopných syntézy lovastatinu, kde uvedenými transfoi>manty jsou kmeny Aspergillus sp. vybrané z A.oryzae, A. nidulans, A.fumigatus a A.flsvus, které jsou přirozeně neschopné exprese lovastatinu, ale obsahující cizí DNA obsahující geny kódující produkci enzymů schopných syntetizovat lovastatin.
  8. 9. Fungální transformanty podle nároku 9, kde Aspergillus sp. je vybrán ze skupiny, zahrnující Á.oryzae, A. niger, A.nidulans a A.fumigalis.
  9. 10. Fungální transf ormanty podle nároku 10, kde Aspergillus sp. je A.oryzae.
  10. 11. Fungální transformanty podle nároku 11, kde cizí DNA je odvozena z lovastatin exprimujícího kmene druhu Aspergillus terreus.
  11. 12. Fungální transformanty podle nároku 12 a zahrnující produkt transformace protoplastů celkovou DNA z uvedeného kmene A. terreus do uvedeného kmene A.oryzae.
  12. 13. Fungální transformanty AoAt-N3J/5 jak jsou zde popsány a definovány.
CZ93172A 1992-02-10 1993-02-10 Novel species of fungi and their use in production of antibiotics CZ17293A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83349692A 1992-02-10 1992-02-10
CA002062023A CA2062023A1 (en) 1992-02-10 1992-02-27 Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ17293A3 true CZ17293A3 (en) 1993-12-15

Family

ID=25674996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ93172A CZ17293A3 (en) 1992-02-10 1993-02-10 Novel species of fungi and their use in production of antibiotics

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0556699A1 (cs)
JP (1) JPH0622780A (cs)
CN (1) CN1076965A (cs)
AU (1) AU667498B2 (cs)
BG (1) BG61180B1 (cs)
BR (1) BR9300467A (cs)
CZ (1) CZ17293A3 (cs)
EE (1) EE03048B1 (cs)
FI (1) FI930561A7 (cs)
HR (1) HRP930134A2 (cs)
HU (1) HUT67061A (cs)
IL (1) IL104481A0 (cs)
LV (1) LV10502B (cs)
NO (1) NO930446L (cs)
NZ (1) NZ245713A (cs)
PL (1) PL297691A1 (cs)
SI (1) SI9300068A (cs)
SK (1) SK5593A3 (cs)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5849881A (en) * 1989-05-05 1998-12-15 Baylor College Medicine Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using cDNA sequences in various organisms
IL94183A (en) 1989-05-05 2003-09-17 Baylor College Medicine cDNA SEQUENCE CODING FOR HUMAN LACTOFERRIN PROTEIN OR PORTION THEREOF AND LACTOFERRIN PROTEIN PRODUCED FROM SAID SEQUENCE
US5766939A (en) * 1989-05-05 1998-06-16 Baylor College Of Medicine Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms
US6100054A (en) * 1989-05-05 2000-08-08 Baylor College Of Medicine Production for recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using DNA sequences in various organisms
US5571691A (en) * 1989-05-05 1996-11-05 Baylor College Of Medicine Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms
SI9300303A (en) * 1993-06-08 1994-12-31 Krka Tovarna Zdravil Process for isolation of hypolipemic effective substance
US5849541A (en) 1993-11-02 1998-12-15 Merck & Co., Inc. DNA encoding triol polyketide synthase
US6221637B1 (en) 1996-03-05 2001-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Xanthene derivatives, their production and use
US6111081A (en) * 1996-05-31 2000-08-29 Baylor College Of Medicine Lactoferrin variants and uses thereof
CZ299290B6 (cs) * 1997-02-20 2008-06-11 Dsm Ip Assets B.V. Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia
NZ500870A (en) * 1998-03-20 2002-03-01 Biogal Gyogyszergyar Metabolic controlled fermentation process for preparing mevinolin (lovastatin)
US6391583B1 (en) 1998-12-18 2002-05-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of producing antihypercholesterolemic agents
EP1176208A1 (en) * 2000-07-28 2002-01-30 Société des Produits Nestlé S.A. Koji molds and use thereof for preparing cholesterol-lowering products
WO2002064809A2 (en) 2001-02-09 2002-08-22 Unilever N.V. Process for the preparation of one or more statins by fermentation
KR100423892B1 (ko) * 2001-12-03 2004-03-22 씨제이 주식회사 스타틴의 제조에 있어서 새로운 락톤화 방법
WO2006035295A1 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the purification of lovastatin
CN102533893A (zh) * 2010-12-09 2012-07-04 浙江海正药业股份有限公司 一种制备莫那可林j的方法
CN104277980B (zh) * 2013-07-09 2020-04-21 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 分离纯化米曲霉转化子的方法
CN105602856B (zh) * 2015-12-16 2019-04-16 浙江师范大学 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法
CN108118042B (zh) * 2016-11-30 2021-01-15 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林j的曲霉菌株及其构建方法与应用
CN111117894B (zh) * 2019-11-26 2023-11-10 漳州大北农农牧科技有限公司 一株米曲霉菌株及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL60219A (en) * 1979-06-15 1985-05-31 Merck & Co Inc Hypocholesteremic fermentation products of the hmg-coa reductase inhibitor type,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
EP0463707A1 (en) * 1985-12-17 1992-01-02 Lubrizol Genetics Inc. Production of polyketide antibiotics
FI104984B (fi) * 1988-08-11 2000-05-15 Dsm Nv Menetelmä biosynteettisten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi

Also Published As

Publication number Publication date
FI930561L (fi) 1993-08-11
AU3212193A (en) 1993-08-12
PL297691A1 (en) 1994-01-24
FI930561A0 (fi) 1993-02-09
NO930446L (no) 1993-08-11
HRP930134A2 (en) 1995-10-31
HU9300330D0 (en) 1993-04-28
LV10502B (en) 1995-08-20
JPH0622780A (ja) 1994-02-01
EP0556699A1 (en) 1993-08-25
AU667498B2 (en) 1996-03-28
NZ245713A (en) 1994-12-22
IL104481A0 (en) 1993-05-13
SK5593A3 (en) 1993-12-08
EE03048B1 (et) 1997-10-15
HUT67061A (en) 1995-01-30
BR9300467A (pt) 1993-08-17
CN1076965A (zh) 1993-10-06
BG97421A (bg) 1994-03-24
NO930446D0 (no) 1993-02-09
FI930561A7 (fi) 1993-08-11
SI9300068A (en) 1993-09-30
LV10502A (lv) 1995-02-20
BG61180B1 (bg) 1997-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ17293A3 (en) Novel species of fungi and their use in production of antibiotics
US5362638A (en) Fungal strains and use thereof in antibiotic production
NO300730B1 (no) Heksahydronaftalenesterderivater og farmasöytiske preparater inneholdende disse
CN105441371B (zh) 一种基因工程菌及其在生产辅酶q10中的应用
CN115197172A (zh) 二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法
CN101445784A (zh) 布雷正青霉变种zjb082702及其发酵制备布雷菲德菌素a的应用
CZ20012761A3 (cs) Mikrobiální způsob výroby pravastatinu
CN109182142B (zh) 皮落青霉及其应用
WO1999010499A1 (en) Statin production by fermentation
EP2115152A1 (en) Fermentation process for preparing pravastatin
CN116676353A (zh) 天蓝色链霉菌M145-chry及其在发酵生产金黄霉素中应用
CN109836433B (zh) 新型LL-D49194α1类似物，及其制备方法和应用
CN110872338B (zh) 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途
CN113337433B (zh) 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用
JP2002275194A (ja) 新規ｆｏ−６９７９−ｍ０物質、ｆｏ−６９７９−ｍ１物質、ｆｏ−６９７９−ｍ２物質、ｆｏ−６９７９−ｍ３物質及びｆｏ−６９７９−ｍ４物質並びにそれらの製造法
CN108864221B (zh) 阿克拉霉素类似物及其制法和用途
KR100313651B1 (ko) 미크로모노스포라카르보나세아로부터의신규한오르토소마이신
KR100725559B1 (ko) 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 ｄｓｍ 14455를 이용한프라바스타틴 나트륨염의 제조 방법
CN119193453A (zh) 一种筑波比星异源表达工程菌株及其构建方法与应用
KR101601089B1 (ko) 신규한 답토마이신 생산 균주 및 이를 이용한 답토마이신의 제조방법
EP0412464B1 (en) Butalactin, a process for its preparation and its use as pharmaceutical
JP2006314248A (ja) トリテルペン誘導体の製造方法
CN120390805A (zh) 生产(+)-龙涎缩醛的方法
JP2003093046A (ja) 有用変換微生物
JPH05239023A (ja) 生理活性物質ｍｂｐ０３９−０６およびその製造法