CZ193898A3 - Tricyklické amidy , které se používají pro inhibici G-proteinové funkce a k léčení proliferativních onemocnění - Google Patents

Description

Tricyklické amidy, které se používají pro inhibici

G-proteinové funkce a k léčení proliterativních onemocnění • · · · · · ' • ········· · ··· ♦ amidů, které jsou užitečné pro a k léčení proliferativních

Ob1ast techn i ky

Vynález se týká tricyk1 ických inhibici G-proteinové funkce onemocnění. Zároveň se týká způsobů jejich přípravy a přípravy farmaceutických prostředků

Dosavadní stav techn i ky

Biologický význam Ras onkogenu a úloha jak Ras, tak enzymu, který je známý jako farnesyl protein transferása, v konverzí normálních buněk na rakovinné buňky, je popsána v PCT mezinárodní přihlášce č. W095/00497 a H095/10516. Každá z těchto publikací také popisuje rozdílnou třídu sloučenin, které inhibuji aktivitu enzymu farnesyl protein transferásy a tím také inhibují farnesylaci Ras proteinu.

PCT mezinárodní přihláška č. WO95/1O516 se týká tricyklických sloučenin amidu a močoviny obecného vzorce (1.0),

( 1.0) a jejich využiti v metodě a abnormálního růstu buněk sub-generických tříd sloučenin sloučeniny vzorců (V.Oc), (V.Ic) pro inhibici Ras Je popsáno vzorce ( I. O) . Pop i s funkce množství zahrnuj e a (V. Ha) ♦··· · ····'

a také 11-R-ísomer a 11 -S-isomer sloučenin (V.Oc) a (5.1c). Je popsáno množství specifických sloučenin, které spadají do takových sub-generických sloučenin. Je zde také popsána biologická aktivita těchto sloučenin.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje nové tricyklické amidové sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z‘-

racemát

··

o o

Br

(+) - enantiomer

(xxm.o)

(+) - enantiomer 'tyty ·· ·· . · · ·

SiBiiú

Λ<·Α>ό'-^:ύ'.;^;.·. ty·, ;ty-tyž ty;.. jjí.' /ýýjýj.í .;··./.

Br

(+) - enantiomer

Br

(-) - enantiomer

(XXYV.O)

• 4 ^:4 ,-.·...

' 4' ' 4' ·

4444 • .·

4 4 <

• 4 4 4

4 44

4 4 4 4

4 4 4

44

44 • 4 4 · • 4 44

444 4 ·

4 4 «4 4 4

O

o

ΙΟ

Br

, -5

(LXO)

Ν Ό ο

(LXI ·ο) • 9 ·« · ·-.♦· · Μ ··

Ο ο

:.:, . : j .**. » *·♦.. ·

^Br Ctxxuvo)

(LKkUl.ti) o

o ·» • · > · ·· ··* · * • · » • · ·.»· • · ··· • · · I · ·« >. · · · I » · . « ·· . ♦»

nebo z jejich farmaceuticky přijatelných solí.

Optické otáčivosti sloučenin ((+) nebo (-)) jsou měřeny v methanolu nebo v ethanolu pří 25°C.

Tento vynález zahrnuje výše uvedené sloučeniny v amorfním stavu nebo v krystalickém stavu.

Sloučeniny z tohoto vynálezu zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá ·ζ- sloučenin 1.0, II. O, III.0, V.O, VI.O, VII.O, VII.OA, VIII.O, VIII.OA, IX.O, X.0,

XI.O, XII.O, XIII.O, XIV.O, XV.O, XVI.O a XVII.O nebo z jejich v

farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou def i nované výše.

Sloučeniny z tohoto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z: sloučenin XVIII.O, XIX.O, XX.O, XXI.O, XXII.O, XXIII.O, XXIV.O, XXV.O, XXVI.O, XXVII.O, XXVIII.O, XXIX.O, XXX.O, XXXI.O, XXXII.O, XXXIII.o, XXXIV.O, XXXV.O, XXXVI.O, XXXVII.O, XXXVIII.O, XXXIX.O. XL.O, a XLI.O nebo z jejich farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definované výše.

Sloučeniny z tohoto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z= <+)-enantiomeru sloučenin LXX.O, LXXI.O, LXXII.O, LXXIII.O, LXXIV.O, LXXV.O, LXXVI.O, LXXVII.O, LXXVIII.O, LXXIX.O, a LXXX.O nebo z jejích

99... 99 '**;,'„*** • ·· · ; s ·· • * · · ··!ϊ !

• ···· · 9

9--9- 9

999 9 farmaceuticky přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definované výše.

Sloučeniny z tohoto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z= sloučenin XLII.O, XLVI.O, XLVII.O, XLVIII.O, XLIX.O, LIV.O, LV.O, LVI.O, LVII.O, LVIII.O,

LXII.O, LXIII.O, LXIV.O, LXV.O, LXVI.O, a LXIX.O, nebo z jejich farmaceuticky

XLIII.O, XLIV.O, XLV.O, L.O, LI.O, Lil.O, Lili.O, LIX.O, LX.O, LXI.O,

LXVII.O, LXVIII.O, přijatelných solí, kde tyto sloučeniny jsou definované výše. Preferované sloučeniny zahrnují 3,7, 8-trihalogensloučeniny, které mají optickou otáčivost (->. Například sloučeniny

XXII.O, XXIII.O, XXV.O a XXVII

Pre f erované s1oučen i ny které

3.8.10- tri halogenslouěeniny, (+). Například sloučeniny XXIX.O, XXXVI.O, XXXVII.O, XXXIX.O a XLI.O.

Preferované sloučeniny

3.10- dihalogensloučeniny, které mají například sloučeninu XX.O.

Preferované sloučeniny

3.10- dibrom-8-chlor-sloučeniny, které také zahrnuj í mají optickou otáčivost XXXI.O, XXXII.O, XXXIV.O, také zahrnuj í optickou otáčivost (+), zahrnuj í maj f S také konfiguraci v poloze C-ll. Například sloučeniny L.O, Lili.O, LV.O, LVU.O.

Preferované sloučeniny také

3,lO-dibrom-8-chlorsloučeniny, které mají zahrnuj í konf iguraci v poloze C-ll. Například sloučeniny LXII.O, LXIV.O, LXVI.O a LXVIII.O.

Preferované sloučeniny také zahrnují sloučeniny XVI.O, XVII.O, XXXIX.O, XL.O, XLI.O, LXVIII.O a LXIX.O.

Více se dává přednost sloučeninám XVI,O, XXXIX.O, XL.O, Ještě více se dává přednost sloučeninám

LXVIII.O a LXIX. XVI.O, XXXIX.O, a LXVIII.O a nejvíce se dává přednost sloučeninám XXXIX.O nebo LXVIII.O. Odborníkovi v oboru je zřejmé, očíslován^: že tricyklický systém je

Odborn í kov i v oboru je také zřejmé, že S a R konfigurace • · · · · ··.·.· · · ·· ·········· ·· · · · · ·- · · 9 9 9 9 ·· vazby v poloze C-11 je =

Inhibice farnesyl protein transferásy tricyklickými sloučeninami z tohoto vynálezu nebyla dříve popsána.

Proto tento vynález poskytuje způsob pro inhibici farnesyl protein transferásy za použití tricyk1 ickýeh sloučenin z tohoto vynálezu které (i) silně inhibují farnesyl protein transferásu, ale ne geranylgeranyl protein transferásu I, in vitro (i i) blokují fenotypovou změnu indukovanou formou transformujícího se Ras, který je akceptor farnesylu, ale ne změnu indukovanou formou transformujícího se Ras, který je akceptor geranylgeranyl zbytku (iii) blokují intrabuněčný vývoj Ras, který je akceptorem farnesylu, ale ne Ras, který je konstruován jako geranylgeranyl akceptor ( iv) blokují abnormální růst buněk v kultuře, který je indukovaný transformujícím se Ras.

Ukazuje se, že sloučeniny z tohoto vynálezu vykazují protinádorovou aktivitu na zvířecích modelech.

Tento vynález poskytuje způsob pro inhibici abnormálního růstu buněk, který zahrnuje transformované buňky, podáváním v

účinného množství sloučeniny z tohoto vynálezu. Abnormální růst buněk se týká růstu buněk, který je závislý na normálních regulačních mechanismech (např. ztrátě kontaktní inhibice). Toto zahrnuje abnormální růst= (1) nádorových buněk (nádorů), které se vyznačují aktivovaným Ras onkogenem (2) nádorových buněk, ve kterých je Ras protein aktivován jako výsledek onkogenni mutace jiného genu (3) benigní a maligní buňky jiných proliterativních onemocnění, ve kterých se nenormální aktivace Ras vyskytuje.

Tento vynález se také týká způsobu inhibice růstu nádoru podáváním účinného Množství tricyklické sloučeniny, která je zde popsána, savcům (např.1 idera), kteří takovou léčbu • · potřebují. Zejména tento vynález poskytuje způsob inhibice růstu nádorů, které se vyznačují aktivovaným Ras onkogenem, • ··· · · · · · .· podáváním účinného množství nádorů, které lze inhíbovat plic např. adenokarcinoa karcinom pankreatu jako výše popsaných s1oučeni n. Př í klady zahrnuj í , ale nevymezuj í ’ rakovinu plic), rakovinu pankreatu (např. je exokrínní karcinom pankreatu), rakovinu tračníku (kolorektální karcinomy jako je např. adenokarcinom tračníku a adenom tračníku), myeloidní leukemie (například akutní myelogenni leukemi i (AML)), thyro i dn í kare i nom foli ku1 a, mye1odysp1ast i cký syndrom (MDS), kare i nom močového měchýře, a prostaty.

Tento vynález epidermální kare i nom, rakov i nu prsu také poskytuj e způsob proliferativních onemocnění, jak benigních, tak maligních, kde jsou Ras proteiny nenormálně aktivovány jako výsledek onkogenní mutace jiných genů- t.j. Ras protein sám není aktivován mutací na onkogenní formu. Tato inhibice je prováděna podáváním účinného množství tricyklických sloučenin, které jsou zde popsány, savcům (např. lidem), kteří takovou léčbu potřebují. Například benigní proliferativní onemocnění neurofibromatosa, nebo nádor, ve kterém je Ras aktivován kvůli mutaci nebo přeznačení onkogeny tyrasin kínasy (např. neu, src, abl, lek, a fyn) lze inhibovat tricyk1 ickými sloučeninami, které jsou zde popsány.

Sloučeniny z tohoto vynálezu inhibují farnesyl protein transferásu a farnesylaci onkogenního proteinu Ras. Tento vynález dále poskytuje způsob ínhibování Ras farnesyl protein transferásy u savců, zvláště u lidí, množství tricyklických sloučenin, které Podávání sloučenin z tohoto vynálezu inhibovala farnesyl protein transferása, nádorů, které jsou popsané výše.

Tricyklícké sloučeniny z tohoto vynálezu se používají ve způsobech z tohoto vynálezu, které inhibují abnormální růst buněk. Bez podložení teorií se uvažuje, že tyto sloučeniny mohou fungovat přes inhibici G-proteinové funkce, jako je ras tím že blokují isoprenylaci G-proteinu pro inhibici podáván í m úč i nného j sou popsány výše. pacientům, aby se je užitečné v léčbě p21 užitečné při léčbě nádoru nebo rakov i na.

pro1 i ferat i vn í ch onemocněn í

Proto j ako j e sou růst

Bez podložení teorií se uvažuje, že tyto sloučeniny inhibují ras farnesyl protein transferásu a právě • · proto vykazují antiproliferativní aktivitu proti buňkám transformovaným ras.

Příklady provedeni vynálezu

Následující termíny, které jsou zde použity, jsou definovány níže, jestliže není jinak uvedeno.

M⁺ odpovídá molekulárnímu iontu molekuly v hmotovém spektru.

MH⁺ představuje molekulární ion plus atom vodíku v hmotovém spektru.

Pyridyl N-oxidy jsou zde representovány skupinou zO

Následující rozpouštědla a činidla jsou zde uvedena pod dále uvedenými zkratkami: tetrahydrofuran (THF), ethanol (EtOH), methanol (MeOH), kyselina octová (HOAc nebo AcOH), ethylacetát (EtOAc), N,N-dimethylformamid (DMF), kyselina trifluoroctové (TFA), anhydrid kyseliny trifluoroctové (TFAA),

1-hydroxybenzotriazol (HOBT), kyselina m-chlorperbenzoová (MCPBA), triethylamin (Et3N), diethylether (Et₂O), chlormravenčan ethylnatý (ClCO₂Et), hydrochlorid

1-(3-dimethy1aminopropy1)-3-ethy1 karbodiimidu (DEC), diisobutylaluminium hydrid (DIBAL), isopropyl alkohol (íPrOH), dimethylsulfoxid (DMSO).

Určité sloučeniny z tohoto vynálezu existují v rozdílných isomerních formách (t.j. jako enantiomery nebo diastereomery), které zahrnují atropoisomery (t.j. sloučeniny, kde 7-členný kruh je ve fixní konformaci tak, že uhlíkový atom v poloze 11 je umístěn nad a nebo pod rovinu připojených benzenových kruhů kvůli přítomnosti brom substituentu v poloze 1O). Vynález uvažuje všechny takové isomery, jak v čisté formě , směsích, které zahrnují i racemické směsi.

Určité básické tricyklické sloučeniny tvoří farmaceuticky přijatelné soli Např i k1ad pyr i do-dus í kové atomy kyše 1 i nam i. Př i k1ady vhodných kyseliny chlorovodíková, sírová, šťavelová, malonová, salicylová, jablečná, fumarová, jantarová, askorbová, maleinová, methansu1fonová a další minerální např. so1 i mohou tvořit kyselin pro tak ve také s kyše 1 i nam i. sole se silnými tvorbu solí jsou fosforečná, octová, citrónová,

a karboxylové kyseliny, které jsou v tomto oboru známé. Soli se připravují běžným způsobem smísením sloučeniny ve formě volné báse s dostatečným množstvím požadované kyseliny, tak aby vznikla sůl. Volná báse může byt opět uvolněna ze soli působením vhodného zředěného vodného roztoku alkálie jako je zředěný vodný roztok hydroxidu sodného, uhličitanu draselného, hydroxidu amonného, hydrogenuhličitanu sodného. Formy volné báse se liší od odpovídajících solí v určitých fyzikálních vlastnostech jako je rozpustnost v polárních rozpouštědlech. Ale kyselé i zásadité solí jsou ekvivalentní s odpovídajícími formami volné báse pro účely tohoto vynálezu.

Všechny tyto sole jsou uvažovány, že jsou farmaceuticky přijatelné v rozsahu tohoto vynálezu a všechny jsou považovány za ekvivalentní k odpovídajícím formám volné báse sloučenin pro účely tohoto vynálezu.

Sloučeniny z tohoto vynálezu se připravují způsoby popsanými η í že.

Sloučenina z příkladu 10 je získána v krystalickém stavu. Odborník si uvědomí, že sloučeniny, které se získají v amorfním stavu se mohou převést do stavu krystalického dobře známými způsoby krystalizace amorfních materiálů z rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel jako je aceton, diethylether, ethylacetát, ethanol, 2-propanol, terč.butylether, voda a tak podobně.

Odborník si uvědomí, že racemická směs sloučeniny VII.0A se připraví podle způsobu popsaného níže. Například meziprodukt z preparátivního příkladu 6 se využije pro přípravu sloučeniny VII.OA.

Preparativní příklad 1

Ό—N

Ch

COaH (PI)

Krok A =

CO₂El

CPIA)

CO₂Et ethyl 4-pyridylacetátu (PI) se smísí se 120ml při -20°C, přidá se 10,45 g (60,5 mmo1) MCPBA

-20°C 1 hodinu a pak při 25°C 67 hodin. Pak se '4 »4 4 • 4' · •444 4 4

44

4 « »· 44

4 4 ·4 4 4 »44 4 <

4 4

Í4 44 lOg (60,5mmol) suchého CH2CI2 a míchá se při přidá dalších 3,48g (20,2 mmol) MCPBA a míchá se 24 hodin při

25°C. Reakční směs se zředí vodným roztokem NaHCO3 a vodou, ve vakuu do sucha a odparek

25K-5,5%, (10% NH4OH v Me0H/CH2Cl₂> PIA. Hmotové spektrum MH⁺ = 182, 15.

CH2CI2 a promyje se nasyceným Suší se MgSO-4, zkoncentruje se se chromátografuje (silikagel a získá se 8,12g produktu

Krok B=

Ό-Ν

/PIA)

CO₂Et

Ό—Nt

Smíchá se 3,5 g (19,3 mmol) produktu z kroku A (PIA), 17,5 ml EtOH a 96,6 ml 1O% NaOH (vodného) a směs se zahřívá při 67°C 2 hodiny. pH se upraví 2N HCI (vodnou) na 2,37 a reakční směs se zkoncentruje ve vakuu do sucha. Přidá se 2OOml suchého EtOH, zfiltruje se přes celit, filtrační koláč se promyje suchým EtOH (2x5Oml). Spojené filtráty se zkoncentrují ve vakuu a poskytnou 2,43 g požadované s1oučen i ny (PI).

Preparativní příklad 2
O /~~\	COoH	v-
/	y—/ (
(CH^C—O \ f	1
		(PII)
Požadovaná sloučenina PII	se připravuje	způsobem popsaným
v PCT mez i národn í př i h1ášce č.	WO95Z10516.

• - 0 0 ···.·. 00 ' -...0 0 .

'0 · 0· ·0 ,. · .0 .0 ·' • 0 « ' 0 ' 0 ·· 0· ·0 ' 0 0 0000' 0 0 0 0 '0. 0 000 0 ·

......· . 0.00.0'' 0,0-0, ' 0' ' · 0 0 0 · · 0·0

Preparativní příklad 3

Krok A

CO₂Et

14, 95g (39 mmol)

8-chlor-11-(1-ethoxykarbonyl-4-píperidinyl)- 1lH-benzo[5,63cykloheptaC1,2-b]pyridinu (III) se smísí se 150 ml CH2CI2, pak se přidá 13,O7g (42,9 mmol) (nBu)4NNO3 a směs se ochladí na O°C. Pomalu po kapkách se během 1,5 hodiny přidá roztok 6,09 ml (42,9 mmol) TFAA v 20 ml CH2CI2. Směs se udržuje při O°G přes noc, pak se opatrně promyje nasyceným vodným roztokem NaHCOa, vodou a solankou. Organická fáze se suší Na2S04, zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, EtOAc/hexan, gradient) poskytne dva produkty, 4,32g sloučeniny IIIA(í) a 1,90g sloučeniny IIIA(ii).

Hmotové spektrum pro sloučeninu IIIA(i) MH*= 428,2

IIIA(ii) MH⁺

ΦΦ Φ φ · ' φφ φ® φφ φ φ φ.φ φ φ φ φ . φ . φφ • · φ φ φ φ φ φφ

Krok Β ·’

CO₂El CO₂Et

m.B

22,0 g (51,4 mmol) produktu IIIA(i) z kroku A se smlsl se 150 ml 85% vodného EtOH, 25,85 g (0,463 mol) práškového železa a 2,42 g (21,8 mmol) CaCl2 a zahřívá se k refluxu přes noc. Přidá se 12,4 g (0,222 mol) práškového železa a 1,2 g (10,8 mmol) CaCl2 a reakčnf směs se zahřívá k refluxu ještě 2 hodiny. Horká reakční směs se zfiltruje přes Celit, celit se promyje 50 ml horkého EtOH a filtrát se zkoncentruje ve vakuu do sucha. Přidá se 1OO ml bezvodého EtOH, zkoncentruje se do sucha. Chromatografie odparku ( silikagel, MeOH/CH2Cl2, gradient) poskytne 16,47 g produktu (IIIB).

MH* = 398.

CO₂Et ·'. · - , :'· • 444 · ·

4.4:· 'a ' 4 4 • 4 ·

4' 44 • 4 « • 4 4 4 •4 4' ·· · 4 4 • .4 4 4

4 . »·

444 4 · · .

·' 4 4 4

16,47 g( 41,4 mmol) produktu z kroku Β (IIIB) se smísí se 150ml 48% HBr (vodného) a ochladí na -3°C. Pomalu se přidá (po kapkách) 18 ml bromu, pak se pomalu ( po kapkách) přidá roztok 8,55 g (O,124 mol) NaNOa v 85 ml vody. Reakční směs se míchá 45 min při teplotě od -3°€ do 0°C, pak se upraví pH na hodnotu 1O přídavkem 50% vodného roztoku NaOH. Extrahuje se EtOAc, extrakty se promyji solankou a suší se Na^SO^. Zkoncentrují se chromatografují (silikagel, EtOAc/hexan, gradient), dva produkty, 10,6g sloučeniny IIIC(í) a 3,28 g sloučeniny IIIC(ii).

Hmotová spektra pro sloučeninu IIIC(i)

IIICÍ i i) do sucha a Získaj i se

MH* = MH+ =

461,2 539.

Krok D:

T>uj

Produkt IIIC(i) z kroku C se hydrolyzuje rozpouštěním v koncentrované HCl a zahříváním na teplotu 1OO°C po dobu 16 hodin. Směs se ochladí, pak se zneutralizuje ÍM vodným roztokem NaOH. Směs se extrahuje CH2CI2, extrakty se suší MgSO^, zfiltrují se a zkoncentrují ve vakuu na požadovanou sloučeninu (PIU).

Hmotové spektrum: MH⁺ = 466,9.

Preparát ivni příklad 4

N

H (PIV) • · ····

0..· 0 0 » · · « • · 0 0 » · 4 « ► · · « ·♦ 00 • ·· .44

0 '0 I

0 0 4 • 00 0 <

' 0- ·' <

Krok Α ·

25, 86

(55, 9 mmol) ethylesteru

4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-1lHbenzo[5, 61cyk1ohepta[1,23pyridin-11-yliden)- 1-píperidin-1-karboxylové kyseliny (IV) se smísí s 250 ml koncentrované H2SO4 pří -5°C, pak se přidá 4,8 g (56,4 mmol) NaNO3 a míchá se 2 hodiny. Směs se nalije na 600 g ledu a zalkal izuje koncentrovaným vodným roztokem NH4OH. Směs se zfi truje, promyje 300 ml vody, pak se extrahuje 500 ml CH2CI3. Extrakt se promyje 200 ml vody, suší se MgSO4, pak se zfiltruje a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (sílí kage1, produktu (PIVA), t.t. = 165-167°C Hmotové spektrum MH⁺ Elementární analýza:

10% EtOAc/CH3CI2) poskytne 24,4 g (86 %)

506 (CI) vypočteno: nalezeno

C 52, 13, H 4, 17, N 8, 29 C 52,18, H 4,51, N 8,16

Krok B:

(40,5 mol) produktu z kroku A (PVIA)

200 koncentrované H2SO4 se smísí při 20°C. Pak se směs ochladí na il '99 ·· * , -* ·»Λ ' * *,* · * 9 Λ- - ί ·ι ♦«♦» 9 Λ '9 » 9 ;» ··· » ' » • · « · « ♦ ’ · · * «·« « -·»' *»-' »· *·· 0°C. Do směsi se přidá 7, 12 ,g

1,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoiňu a míchá sé 2O°,C. Reakční směs se ochladí na O°C a přidá (24,89 mmol) 3 hoiiiny při se další 1,O g (3,5 mmol) dibromhydantoinu a míchá se při 20°C 2 hodiny. Směs se nalije na 400 g ledu, zalkal izuje se koncentrovaným vodným roztokem NH4OH při 0°C. Výsledná pevná látka se spojí fitrací. Pevná látka se promyje 300 ml vody, rozmíchá se ve 200 ml acetonu na kaši a zfitruje se. Získá se 19,79 g (85,6%) produktu (PIVB).

t.t. = 236-237°C

Hmotové spektrum MH+ = 584 ( Cl)

Elementární analýza^-· vypočteno: C 45,11, H 3, 44, N 7, 17 nalezeno: C 44,95, H 3,57, N 7,16.

Krok C=

φίνο g (447 mmol) železných CaClž a suspenzí 20 g (34,19 v 700 ml 90:10 EtOH/voda při přes noc, zfiltruje se přes 2x 200 ml horkého EtOH.

pilin se smísí s ÍO g (90mol) mmol) produktu z kroku B (PIVB) 5O°C. Směs se zahřívá k refluxu celit, f i tračn í koláč se promyj e Filtráty a proplachy se spojí a koncentrují ve vakuu do sucha. Odparek se extrahuje 600 ml CH2CI2, promyje 300 ml vody a suší se MgS04- Zfiltruje se a zkoncentruie se ve vakuu do sucha. Pak se chromatografuje (silikagel, 30% EtOAc/CHzCl2) a získá se 11,4 g (60%) produktu (PIVC).

t. t. = 211-212°C

Hmot. spek.: MH* =554 (Cl)

Elementární analýza: vypočteno: C 47,55, H 3,99, N 7,56 nalezeno: C 47 , 45 H 4,31, N 7,49.

·*· • · · 9

9 99

999 9 · • · «· 'uš * ···< » · φ ·· • · 9

9 9

99' 99

Krok

01Vt>

Pomalu (po částech) se přidá při -1O°C 20 g (35,9 mmol) produktu z kroku C (PIVC) do roztoku 8 g (116 mmol) NaNOa ve 120 ml koncentrované vodné HCl. Výsledná směs se míchá pří 0°C po 2 hodiny. Pak se pomalu (po kapkách) při 0°C přidává 150 ml (1,44 mol) 50% H3PO2 po dobu 1 hodiny. Míchá se při 0°C 3 hodiny, pak se nalije na 600 g ledu a zalkalizuje se koncentrovaným vodným MH4OH. Extrahuje se 2x300 ml CH2CI2, extrakty se suší MgSO.4. Zfiltrují se a zkoncentrují ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 25% EtOAc/hexan) poskytne 13,67 g (70%) produktu PIVD).

t.t.= 163-165°C

Hmot. spek.' MH* = 539 (CI)

Elementární analýza: vypočteno na1ezeno

C 48,97, H 4,05, C 48,86, H 3,91,

N 5,22 N 5,18

Krok E:

?IV

Cl pi VP

6, 8 g (12,59 mmol) produktu z kroku D (PIVD) se smísí se ÍOO ml koncentrované vodné HCl a míchá při 85°C přes noc. Směs se > ' 44 ‘ 4 -4

9C· . 44 »44« 4 «

4 4

44- 44 • * ^k ·♦·.· «4 4 4 '* ί.

♦>♦· ·· * . χν*

4 »/|4 >·· «-44 4 4<-a- -MU ~B ochladí a nalije na 300 g ledu, zalkal izuje se koncentrovaným vodným roztokem NH4OH. Extrahuje se 2 x 300 ml CH2CI2, extrakty se pak suší MgSO^. Zfiltrují se, zkoncentrují ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku ísilikagel, 10%MeOH/EtOAc + 2% NH4 OH(vodný)) poskytne 5,4 g (92%) požadované sloučeniny (PIV), t.t.= 172-174°C

Hmot. spek. MH⁺ = 467

Elementární analýza·' vypočteno: C 48,69, H 3,65, N 5,97 nalezeno: C 48, 83, H 3, 80, N 5,97

Preparativní příklad 5

Cl ( PV )

Krok A:

2,42 g ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3~brom-5, 6-dihydro- 1lH-benzo[5,61cykloheptat1,2-blpyridin-11-yliden)-1-piperidinkarboxylové se hydrolyzuje stéjným způsobem, který je popsaný v preparátivním příkladu 3, krok D a poskytne 1,39 g (69%) produktu (PVA).

MH* = 389.

«Η», φ ¹ 3 > · Φ * · · $Λ$·Ι<Φ- ·/ ♦ * * ' ί φ φφ ί, ·····>« φφ φφ ·’ U · * φ φ ·

7««^ '·*’* ** ♦*· • φ φ φ φ ^γφ

9 Φ »· «Φ * φ φφφ

Krok Β:

Cl

Η lg (2,48 mmol) produktu z kroku A CPVA) se smíchá s 25 ml suchého toluenu, přidá se 2,5 ml IM DIBAL v toluenu a směs se zahřeje k refluxu. Po 0,5 hodině se přidá dalších 2,5 ml IM DIBAL v toluenu a zahřívá se k refluxu 1 hodinu. (Reakce je sledována TLC za použití 50% MeOH/CifaCl2 ♦ NH4OHÍvodný).) Reakční směs se ochladl na teplotu místnosti, přidá se 50 ml 1H HCl (vodný) a míchá se 5 minut. Přidá se ÍOO ml IN NaOH (vodný) a pak se extrahuje EtOAc (3 x 150 ml). Extrakty se suší MgS04, zfiltrují se a zkoncentrují ve vakuu do sucha. Získá se 1, lg požadované sloučeniny (PV).

MH* = 391.

Preparativní příklad 6

CPVl) • · · · _w ···· ···· • · _f · ♦ ·· · * ·* ···· · · · · · » ··· · · « «··♦ »·· t *.-,«· ·· ··

Krok ABr

Cl

16,6 g (0,03 mol) produktu z preparát ivního příkladu 4, krok D (PIVD) se smísí s 3:1 roztokem CH3CN a vody (212,65 ml CH3CN a 70,8 ml vody) a výsledná kaše se míchá přes noc při teplotě místnosti. Přidá se g (2,30 mmol) Ru02 ( př í dávek RuO2 i e (0,153 mol) míchá při

NaIO4 a pak O, 31 teplotě místnosti

32.833 g a pak se spojen s exotermní reakcí, teplota směsi vzroste z 2O°C na 3O°C). Směs se míchá 1,3 hodiny (teplota klesne zpět na 25°C během 30 minut). Reakční směs se zfiltruje, aby se odstranila pevná fáze. Pevná fáze se promyje CH3CI2, Filtrát se zkoncentruje ve vakuu do sucha a odparek se rozpustí v CH2CI2. Zfiltruje se, aby se odstranily nerozpuštěné částice, které se promyjí CH3CI2· Filtrát se promyje vodou, zkoncentruje a promyje bělidlem a pak vodou. Extrahuje se Vodný podíl se ochladí na O°C a pomalu se na objem 200 ml 6N HCI (vodnou).

přidává 50% vodný roztok NaOH, kterým se upraví pH = 4. Teplota pří přidávání se CH2CI2, extrakty sucha. Odparek udržuje pod 30°C. Pak se 2 x extrahuje se suší MgSOxt se rozm í chá na kaš i 0°C. Výsledná pevná látka, která se spojí na filtru, se suší ve vakuu. Získá se 7,95 g produktu (PVIA).

*H MNR (CDCI3, 200 MHz): 8,7(s, ÍH), 7,85(m,6H), 7,5(d, 2H) ,

3,45(m. 2H) , 3,15(16, 2H) .

a zkoncentrují va vakuu do v 2Ó ml EtOH a ochladí na

Krok B:

Br

PVl &

..··, í i,··.·.·!····.

• · · · • · ·· • ·· · · · ’ • · · ·· ©· • ·· , · ·, ·· ······» · · * • · · ♦ · · • Φ· · ·· ··

21,58 gr (53,75 mmol) produktu z kroku A (PVIA) se smíchá s 500 ml bězvodé 1:1 směsi EtOH a toluenu, přidá se 1,43 g (37,8 mmol) NaBILj a směs se zahřívá k ref luxu 10 min. Směs se ochladí na O°C, přidá se 1OO ml vody a pH se upraví na 4-5 ÍM HCl (vodnou), zatímco se teplota udržuje pod 1O°C. Přidá se 250 ml EtOAc a vrstvy se oddělí. Organická vrstva se promyje solankou (3 x 50ml), pak se suší NazSO-4 - Zkoncentruje se ve vakuu do sucha (24,Olg). Chromatografie odparku (si1 ikagel, 30% hexan/CH2CI2) poskytne produkt. Čisté frakce byly čištěny opakovanou chromatografií. Celkově bylo získáno 18,57 g produktu (PVIB).

‘H NMR (DMSO-de, 4OOMHz): 8,5 (s,ÍH). 7,9(s, ÍH). 7,5 Cdd,2H),

6, 2( s, ÍH) , 6, 1 ( s, ÍH) , 3, 5( m, ÍH) , 3, 4( m, ÍH) , 3, 2(m,2H) <

Krok C=

Pl/I

18,57 g (46,02 mmol) produktu z kroku B (PVIB) se smísí s 500 ml CHCI3, pak se přidá 6,70 ml (91,2 mmol) SOClz a směs se míchá při teplotě místnosti 4 hodiny. Během 5 minut se přidá roztok 35,6 g (0,413 mol) píperazinu v 800 ml THF a reakční směs se míchá 1 hodinu při teplotě místnost i. Směs se zahřívá k refluxu přes noc, pak se ochladí na teplotu místnosti a zředí se 1000 ml ClfeClz. Roztok se promyje vodou (5 x 2OOml), vodný podíl se extrahuje CHCI3 (3 x 1OO ml). Všechny organické podíly se spojí a promyjí solankou (3 x 200 ml) a suší se MgSOxj. Ve vakuu se zkoncentruji do sucha a chromatografie (silikagel. gradient 5%, 7,5% a 10% MeOH/CIfeCl2 ♦ NH4OH) poskytne 18,49 g požadované sloučeniny (PVI), což je racemická směs.

Krok J) - děleni enantiomerů ^:

Racemická saěs sloučeniny z kroku C (PVI) je dělena chirální chromatografií (Chíralpack AD, kolona 5 cm x 50 cm, průtok 100 ml/min, 20% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu). Bylo získáno

9,14 g (+) enantiomeru a 9,30 g C-)-enantiomeru.

Fyzikální data pro (+)-enantiomert.t.= 74,5-77,5°C hmot spek. MH+ = 471,9, loclp²⁵ = +97,4° (8,32 mg/2ml MeOH) .

Fyzikální data pro (-)-enant i omert.t.= 82,9-84,5°C hmot.spek. MH+ =471,8, trfln²⁵ = -97,4° (8,32 mg/2ml MeOH).

Preparativní příklad 7

* · ·» · · ·· « ··· · ·',·» · » · · . ·.·· · · ··,·» ··· · · * · »«·· ··· ··-· · »♦-·· - ·· ··

Krok A-

g (38,5 mmol) ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3-brom-5,6dihydro-1lH-benzo[5,61cyklohepta[1,2-b]pyridin-11-yliden)- 1 -pi peridiη-1-karboxylové (VII) se smísí se 150 ml koncentrované H3SO4 při -5°C, pak se přidá 3,89 g (38,5 mmol) KNO3 a míchá se 4 hodiny. Reakční směs se nalije na 3000 ml ledu a zalkalizuje 50% vodným roztokem NaOH. Extrahuje se CH2CI2 a suší MgSO^. Pak se zřiitruje a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Odparek se rekrystaluje z acetonu a získá se 6,69 g produktu (PVIIA).

*H NMR (CDCI3, 200 MHz) : 8,5(s, 1H>, 7,75(s, IH), 7,6(s,lH),

7,35(s, IH), 4, 15(g,2H), 3,8(m,2H), 3, 5-3, 1 (m, 4H> ,

3,0-2,8(m,2H), 2,6-2,2(m,4H>, l,25(t,3H). MH*= 506.

Krok B:

S>Vllf) fiviiz

6,69 g (13,1 mmol) produktu z kroku A (PVIIA) se smísí s 1OO ml 85% EtOH/voda, pak se přidá 0,66 g (5,9 mmol) CaCl2 a 6,56 • · (117,9 mmol) železa a reakční směs se. zahřívá k refluxu přes noc.. Horká reakční směs se zflltruj.e .přes Celit a filtrační koláč se propláchne horkým EtOH. Filtrát se zkoncentruje ve vakuu a získá se 7,72 g produktu (PVIIB).

Hmot. spek. MH* = 476,0.

4* 44 • 4 4 4 * ·· ’4 4* ifr ’ » 4 ,

Krok C’

7,70 g produktu z kroku B (PVIIB) se smísí s 35 ml HOAc,pak se přidá 45 ml roztoku bromu v AcOH a reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Přidá se 300 ml IN vodného roztoku NaOH, Pak 75 ml 50% vodného roztoku NaOH a extrahuje se EtOAc. Extrakty se vysuší MgSO4 a zkoncentrují se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 20-30% EtOAc/hexan) poskytne 3,47 g produktu (PVIIC) (spolu s dalšími 1,28 g částečně vyčištěného produktu).

Hmot.spek. MH* - 554 <H NMR (CDCIa. 300 MHz)= 8,5(s,IH), 7,5(s,IH), 7,15(s,IH),

4, 5(s,2H), 4, 15(m,3H), 3,8(br s, 2H) , 3, 4-3, 1 (m, 4H) , 9-2,75 (m, IH), 2,7-2,5 (m, 2H), 2, 4-2, 2( m, 2H) , 1,25(m, 3H) .

Krok D^;

Směs 0,557 g (5,4 mmol) t -butyl ni tri tu a 3 ml DMF se zahřeje na 60-70°C. Pomalu po kapkách se přidá směs 2,00 g (3,6 mmol) produktu z kroku C (PVIIC) a 4 ml DMF. Pak se reakční směs ochladí na teplotu místnosti. Přidá se dalších 0,64 ml t-butylni tri tu při 40°C a reakční směs se znovu zahřeje na 6O-7O°C na 0,5 hodiny. Pak se směs ochladí na teplotu místnosti a nalije se do 150 ml vody. Extrahuje se CH3CI2, extrakt se suší MgSO4 a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 10-20% EtOAc/hexan) poskytne 0,74 g produktu (PVIID).

Hmot. spek. MH*= 539,0 *H NMR (CDCI3, 200 MHz): 8,52(s,lH), 7,5(d,2H), 7,2(s,IH), 4,15(g,2H), 3, 9-3, 7( m, 2H> , 3, 5-3, 1 ( m, 4H) , 3,0-2, 5(m, 2H) ,

2, 4-2, 2( m,2H) , 2, 1 l,9(m,2H), l,26(t,3H).

Krok E:

φ vni <pvii

Směs 0, 70 g (1,4mmol) produktu z kroku D (PVIID) a 8 ml koncentrované HCI (vodné) se zahřívá k refluxu přes noc. Přidá se 30 ml IN vodného NaOH, pak 5 ml 50% vodného NaOH a extrahuje se CH2CI3. Extrakt se suší MgSO₄ a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 0,59 g požadované sloučeniny (PVII).

Hmot.spek. MH⁺= 467, t.t.= 123,9 - 124,2°C.

'9 9 ♦ · • · 9 ♦ • ·«<« 9 · • · *

999 · ♦·

9 9 * • 9 99

999 9 9

9 9

Preparativní přiklad 8

Krok A:

PVIJ PI//J/

Připraví se roztok 8,1 g sloučeniny z preparát ivního přík1adu 7 (PVII) v toluenu a přidá se 17,3 ml 1M roztoku DIBAL v toluenu. Reakční směs se zahřeje k refluxu a pomalu (po kapkách) se přidá dalších 21 ml 1M DIBAL/toluen roztoku během 40 minut. Reakční směs se ochladí na 0°C a přidá se 700 ml 1M HCI(vodné). Organická fáze se oddělí a odstraní. Vodná fáze se promyje CH2CI3, extrakt se odstraní a vodná fáze se zalkal i zuje přídavkem 50% vodného roztoku NaOH. Vodná fáze se pak extrahuje CH3CI2, extrakt se vysuší MgSO4 a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 7,30 g požadované sloučeniny (PVIII), což je racemická směs enantiomerů.

MH* = 469.

0· > « • 0

0 0 · · ' 0 9 9 9.9 ·.

I 4 I ··♦ *

0« • 4 «

.00

Krok B: Dělení enantiomerů

Racemická sloučenina z kroku A (PVIII) je dělena chirální chromatografií (Chiralpack AD, kolona 5 ca x 50 cm za použití 20% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu). Získá se (+)-enantiomer a (-)-enantiomer požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer=

t.t. = 148,8°C, hmot. spek. MH* = 469 [cel»³⁵ = +65,6 (12,93 mg/2ml MeOH) .

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer=

t.t. = 112°C, hmot. spek. MH* = 469 [cf]»³⁵ = -65,2 (3,65 mg/2ml MeOH) .

Preparativní příklad 9

40,0 g (0,124 mo1) výchozího ketonu (IX) se smíchá s 200 al H2SO4 a ochladí na O°C. Pomalu během 1,5 hodiny se přidá 13,78 g (0,136 mol) KNO3 - Pák se reakční směs zahřeje na teplotu místnosti a míchá se přes noc. Reakční směs se zpracovává za použití v podstatě stejného způsobu, který je popsán pro preparativní příklad 4, krok A. Chromatografie (silikagel, 20%, 30%, 40%, 50% EtOAc/hexan, pak 100% EtOAc) poskytne 28 g 9-nitroproduktu (PIXA) spolu s malým množstvím 7-nitroproduktu a 19 g směsi 7-nítro a 9-nitro sloučenin.

MH* (9-nitro) = 367.

Krok B:

Reakce 28 g (Y6,2 mmol) 9-nitroproduktu z kroku A (PIXA), 400 ml 85% EtOH/voda, 3,8 g (34,3 mmol) CaCl₂ a 38,28 g (0,685 mol) železa probíhá stejným způsobem, který je popsán • · »· »· ·* ··.

·: :. : J ·<

♦ ··:· ·: :: : * ··:: ί • >· · 99 *9 ·* - ·· v preparát ivním příkladu 4, krok C. (PXkB).

MH* · 337.

Získá se 24 g produktu

Krok C^:

ÍMXC

13g (38,5 mmol) produktu z kroku Β (PIXB) se smísí se 140 ml AcOH a pak se pomalu během 20 minut přidá roztok 2,95 ml (57,8 mmol) bromu v 10 ml AcOH. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti, pak se zkoncentruje ve vakuu do sucha. Přidá se CH2CI3 a voda, pak se upraví pH na 8-9 50% vodným roztokem NaOH. Organická fáze se promyje vodou, pak solankou a suší se NazSO^- Zkoncentruje se ve vakuu a poskytne 11,3 g produktu (PIXC).

¹HNMR (CDCI3, 200 MHz)^: 8,73 (d.lH), 7, 74( d, ÍH) , 7, 14( s, ÍH) ,

4,63(s,2H), 3, 23-3, 15(m, 2H) a 3, 07-2, 98(m, 2H) .

Krok D^:

1OO ml koncentrované vodné HCI se ochladí na O°C, pak se přidá 5,61 g (81,4 mmol) NaNO₂ a míchá se 1O minut. Pomalu (po částech) se přidá 11,3 g (27,1 mmol) produktu z kroku C (PIXC) a reakční směs se míchá 2,25 hodiny při 0-3°C. Pomalu (po kapkách) se přidá 180 ml 50% H3PO2 (vodné) a reakční směs se ponechá stát při 0°C přes noc. Pak se pomalu během 30 min (po # v*. * .· t M' <

x| \* · ** * ' · · ·>

’* d * · * **« *« * * ’Λ *’ * · na 9. Pak se

L. _ · ♦ »· » ¹ ₄. v* ·>·'*<

• · ··*<

* - „ - · · ά . * ' „ , '♦ ‘,*,.

*«·kapkách) přidá 150 ml 50% NaOH, aby, se pH upravilo reakční směs extrahuje CH2CI2, Extrakt se promyje vodou, pak solankou a suší se NaaSO^ Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a chromatografie odparku (silikagel, 2% EtOAc/CH3CI2) poskytne

8,6 g produktu (PIXD).

MH* = 399,9.

*H NMR (CDCI3, 200 MHz): 8,75( d,lH), 7,77( d,lH), 7,56(d,IH), 7,21(d,lH> a 3,3-3,O(m,4H).

Krok E=

8,6 g (21,4 mmol) produktu z kroku D (PIXD) se smíchá s 300 ml MeOH a ochladí na O-2°C. Přidá se 1,21 g (32,1 mmol) NaBH4 a reakční směs se míchá při -O°C 1 hodinu. Přidá se další 0,121 g (3,21 mmol) NaBH4 a míchá se 2 hodiny při O°C. Pak se ještě ponechá stát při O°C přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a pak se odparek rozdělí mezi CHaCl3 a vodu. Organická fáze se oddělí a zkoncentruje ve vakuu (5O°C) a získá se 8,2 g produktu (PIXE).

*H NMR (CDCI3. 200MHz): 8,44(d,IH), 7,63(d,IH), 7,47(d,IH),

7, 17(d, IH), 6,56(d, IH) , 4, 17-4, O(m, IH) , 7,39(d, IH)

3,46-3, 3(m,lH), 3, 05-2, 74(m,2H).

Krok F=

fixe

PlX * λ ' z* ¢5 ' s-ís > ? φ ® ^φ 5- ΐ * ~ · * β 9 «'·&·* » ¢,4 é * 9 £ 9 ® 5 * * ® * > ⁵ i ' · 9 » ® » 9 4«

- · » » «e 4« 9 « «· ~

8,2 g (20,3 mmol) produktu z kroku E (PIXE) se smíchá s 160 ml CH2CI2 a ochladí se na O°C. Pak se pomalu (po kapkách) během 30 minut přidá 14,8 ml (203 mmol) SOCI2- Reakční směs se ohřeje na teplotu místnosti a míchá se při této teplotě 4,5 hodiny.

Pak se zkoncentruje ve vakuu do sucha, přidá se CH2CI2. Promyje se 1 N NaOH (vodným), pak solankou a suší se Na2S04. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha, pak se přidá suchý THF a 8,7 g (101 líitol) piperazinu a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu dosucha, přidá se CH3CI2. Promyje se s 0,25 N NaOH (vodným), vodou a pak solankou. Suší se NaaSO^ a zkoncentruje se ve vakuu. Získá se 9,46 g surového produktu. Jeho chromatografie (silikagel, 5% MeOH/CIfeClz + NH3) poskytne 3,59 g požadované sloučeniny (PIX) jako racemát.

ÁH NMR CCDCI3, 200 MHz): 8,43 ( d, IH) , 7, 55( d, IH) , 7,45(d, IH) ,

7, lKd.lH), 5,31(s,lH), 4,86-4,65(m,IH), 3, 57-3, 4OC ra, IH) ,

2, 98-2, 55( m, 6H) , 2, 45-2, 20(ra, 5H> .

MH* = 470.

Krok G- Dělení enantiomerů

(PIX

Racemická sloučenina z kroku F (PIX) (5,7 g) je dělena chromatograficky jak je popsáno v preparativníra příkladu 6, krok D. Byl použit 30% iPrOH/hexan + 0,2% diethylenamin. Bylo získáno 2,88 g J?-(+)-enant iomeru a 2,77 S-( - ) -enant ioneru.

Fyzikálně-chemická data pro R-(♦)-enantioraer=

Hmot.spek. MH+ = 470, [ot]»²⁵ = +12,1° (10,9 mg/2ml MeOH)

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantioner: Hmot.spek.

MH⁺= 470, Ccřli>²⁵= -13,2° (11,51 mg/2ml MeOH).

v.

• φ φφφφ *Φ >Φ '* 99 **

Φ φ Φ Φ * ·· * φ · φφ « · ··

Φ té ΦΦ ·ΦΦΦ Φ ♦ ΦΦΦ φφ

ΦΦ

Preparát ivn1 příklad 10

Krok A:

g (33,3 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 4, krok D se smíchá s 300 ml toluenu při 20^0, pak se přidá 32,5 ml (32,5 mmol) 1M roztoku DIBAL v toluenu. Reakční směs se zahřívá k refluxu 1 hodinu. Ochladí se na 20°C a přidá se dalších 32,5 ml 1M roztoku DIBAL a směs se opět zahřívá 1 hodinu k refluxu. Směs se ochladl na 20°C a nalije do směsi 400g ledu, 500 ml EtOAc a 300 ml 10% NaOHívodného. Vodná vrstva se extrahuje CH3CI3 (3 x 2OOml), organické vrstvy se suší MgSO^, pak se zkoncentrují ve vakuu do sucha. Chromatografie (silikagel, 12% MeOH, CH2CI2 + 4% HH4OH) poskytne 10,4 g požadované sloučeniny jako racemát (PX).

Hmot.spek. MH+ = 469 (FAB) částečné *H NMR {CDCI3, 400 MHz): 8,38(s,lH), 7,57(s,lH>,

7,27(d, IH), 7,06(d, IH), 3,95(d, IH).

· »« , · r * ,

9999

9.

• 99 ·

99 »9 · * * 99

9 9 I

9 9 «

99

999 ·· ·

9 99 ' ··· 9 '· . 9 9 ' 9 ··

99

Krok B^; Dělení enantiomerů

Racemická sloučenina z kroku A (PX) je dělena preparativní chirální chromatografií ( Chiralpack AD, kolona 5 cm x 50 cm za použití 5% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu). Získá se (+)-enantiomer a (-)-enantiomer požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer^:

Hmot. spek. MH* = 469( FABS) , [ct3»^2S= +43,5° (c=O,402, EtOH) částečné *H NMR (CDCI3, 400 MHz): 8,38(s, IH), 7,57(s,lH), 7, 27(d,lH>, 7,05( d.íH), 3,95( d,lH>.

Fyz i ká1ně-chem i cká data pro (-)-enant i omer

Hmot. spek. MH* = 469(FABS), (<ζ3ι>²⁵= -41,8° (c=0, 328, EtOH) částečné ‘H NMR (CDCI3, 400 MHz) 8,38(s,IH), 7,57(s,IH), 7,27(d,lH), 7, 05(d, IH) , 3, 95(d, IH) .

4A

4 • 444

4 '<· · 4 4 > 4 · 4 4

4 4 4

4* 44 ‘44 44 , ♦ , · · 4 , 4>\ 4 , 44 ' ♦ 44 4 4

4 4

-44 .44

Preparativní příklad 11

PXI

Ethylester kyseliny

4- (8-chlor-3-bro«-5,6-di hydro-1lH-benzo[5,61cykloheptat1,2-blpyridin-11-yliden)- 1-piperidin-1 -karboxy1ové reaguje stejným způsobem jako je popsaný v preparativní příkladu 6, kroky A-D. Získá se produkt jako v kroku C PXI) , což je racemát a dále se získají jako produkty v kroku D R-(♦)-enantiomer a S-(-)-enantiomer požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enant iomer ·' ¹³C NMR (CDCls): 155, 8(0, 146, 4(CH), 140.5(CH), 140,2(0, 136,2(0, 135,3(0, 133,4(0, 132,O(CH), 129,9(CH), 125,6(CH), 119,3(0, 79,1(CH), 52, 3(CHa) , 52,3(CHa),

45,6(CH₂), 3O,O(CH2>, 29,8(CHa).

Ccfli>²⁵= +25,8° (8,46 mg/2ml MeOH) .

Fyzikálně-chemícká data pro R-(+)-enantiomer^{: 13}C NMR (CDC1₃)^; 155,9(0, 146,4(CH),

136,2(0, 135,3(0, 133,3(0, Í32,O(CH>,

119,2(0, 79, 1 ( CH) , 52, 5(CHa>, 52,5(CHa>, 45, 7( CHa) , 45, 7( CHa) , 3O,O(CH2> , 29,8(CH2> .

[otli>²⁵= -27,9° (8,90 mg/2ml MeOH).

45,6( CHa) ,

140.5(CH) , 140, 2(0 ,

129,9(CH), 125,5(CH),

Příklad 1

O'

0			• 0	00
-·>	> *	,0		0 0	0	0
* >'	1 ’♦ f '0		>*·*·	• 0 0		·'·.’
9000	« * 1 ·	0	•	0 00 0	'0	. 0
' 4	“ 0/T ·	0	- <	•	0	0
•			0*	00		00

Krok A=

1,160 g (2,98 mmol) sloučeniny z preparativního příkladu 3 (PIU) se rozpustí v 20 ml DMF, míchá se zá tějplótý místnost i . Pak se přidá 0,3914 g (3,87 mmol) 4-methylmorfolinu, 0,7418 g (3,87 mmol) DEC, O,5229 g (3.87 mmol) HOBT a 0,8795 g (3,87 mmol) 1-N-t-butoxykarbonyl-piperidinyl-4-octové kyseliny. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 2 dny. Pak se zkoncentruje ve vakuu do sucha a odparek se rozdělí mezi CHzCla a vodu. Organická fáze se opatrně promyje nasyceným vodným roztokem tfaHCÓ3, 1O% vodným NaHsPOa a solankou. Suší se MgS04, zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 2% MeOH/CIfeClz + NH3) poskytne 1,72 g produktu (IA).

t.t. = 94,0-94,5°C, hmot.spek. MH+= 614

Elementární analýza: vypočteno- C 60,54, H 6,06, N 6,83 nalezeno- C 59,93, H 6,62, N 7,45 \ Ή

Krok B:

1,67 g (2,7 mmol) produktu z kroku A (IA) se smíchá s 20 ml CH3ČI2 a míchá při 0°C. Přidá se TFA, směs še míchá 2 hodiny. Pak se reakční směs zalkalizuje IN NaOH (vodným). Extrahuje se CH2CI2. Organická fáze se suší MgSO.4, zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 1,16 g produktu ( IB) . t.t. = 140,2-140,S°C, hmot. spek. MH+= 514.

Krok C =

Br

(T O

Z

ZB

0,5 g produktu z kroku B ( IB) se smíchá s 20 ml CH2CI2 a 4, 5 ekvivalenty (CHa)3SiNC0 a míchá se při teplotě místnosti 3 hodiny. Reakční směs se extrahuje nasyceným vodnýn NaHCťh a organická fáze se suší MgSO.4. Zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 0,8 g surového produktu. Chromatografie surového produktu (silikagel, 5% MeOH/CHzClz + NH3) poskytne 0,26 g produktu (I).

t.t.= 170,2170,5°C, hmot. spek. MH⁺= 557.

Příklad 2

Br

Br

Br

Pl\f

II

O

0,5 g (ί,06 mmol) sloučeniny z preparátivního příkladu 4 (PIV) se smíchá při 0°C s 0,4 g (2,61 mmol) sloučeniny z preparát ivního příkladu 1 (PI), 5 ml suchého DMF a 0,5 ml (4,53 mmol) 4-methylmorfolinu. Pak se přidá O, 6 g (3,12 mmol) DEC a O,4 g (2,96 mmol) HOBT a reakční směs se míchá při 20°C přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a odparek se extrahuje CH2CI2 (2 x 50 ml). Extrakty se promyjí 25 ml vody, suší MgSO.4, pak se zkoncentruj í ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 10%Me0H/EtOAc + 2% NH4OH (vodný)) poskytne 0,6 g (93,7%) požadované sloučeniny (II). Hmot. spek. MH⁺ = 602 (FABS) částečné ‘H NMR CCDCI3, 300 MHz) 8,48Cs,lH), 8,16(d, 2H>,

7, 61(s, ÍH) , 7, 29(m, ÍH) , 7, 18(d, 2H) , 7,.04(d, ÍH) , 3, 71 (s, 2H> . Elementární analýza: vypočteno- C 48,81, H 4,10, N 6,57 nalezeno - C 49, 1.0, H 3,79, H 6,74

Příklad 3

Br Br

// ///

5,9 (9,78 mmol) sloučeniny 2 příkladu 2 (II) se rozpustí v 300 ml 1=5 CH2CI2/EtOAc při 0°C. Pomalu se přidá (po kapkách) 3 ml 4N HCI (vodné) a reakční směs se míchá při O°C 5 min. Přidá se 200 ml EtzO, výsledná pevná látka se spojí filtrací a pevná látka se promyje 50 ml Et2O. Pevná látka se pak suší při teplotě 20°C a tlaku 27 Pa (0,2 mm Hg) a získá se 5,9 g (96%) požadované sloučeniny (III).

Hmot. spek. MH⁺= 6O2ÍFAB) částečné »H NMR (DMSO-ck>, 300 MHz): 8,66(d,2H), 8,51(s,lH),

7,95(s,lH), 7,67( d, 2H) , 7,47(m,lH), 7,15(m,lH), 3,99(s,2H). Elementární analýza: vypočteno-C 48,77, H 3,62, N 6,56 nalezeno- C 48,34, H 3,95, N 6,84.

Příklad 4

Krok A·*

, 0,501 g (1,28 mmol) sloučeniny z preparát ivního příkladu 5 (PV) se smíchá s 20 ml suchého DMF, pak se přidá 0,405 g (1,664 mmol) 1 - ří-t-but oxy karbony! piper idinyl-4-octové kyseliny, 0,319 g (1,664 mmol) DEC, 0,225 g (1,664 mmol) HOBT a 0,168 g (1,664 mmol) 4-methylmorfolinu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Odparek se rozdělí mezi 150 ml Ch2Cl2 a 150 ml nasyceného roztoku NaHCO3 (vodného). Vodná fáze se extrahuje dalšími 150 ml CH2CI2. Organická fáze se suší MgSOxi a zkoncentruje se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 500 ml hexanu, 1000 ml 1% MeOH/CH2Cl₃ + 0,1% NH4OH (vodný)) poskytne 0,575 g produktu (IVA).

t.t.= 115-125°C, hmot.spek. MH⁺= 616.

Krok Β:

IVA

0,555 g (0,9 mol) produktu z kroku A (IVA) se smíchá s 15 ml CH2CI2 a směs se ochladí na O^C. Přidá se 15 ml TFA a míchá se při O°C 2 hodiny. Reakční směs se při 40-45°C zkoncentruje ve vakuu do sucha, pak se odparek rozdělí mezi 150 ml CH2CI2 a 1OO ml nasyceného vodného NaHCO3- Vodná fáze se extrahuje 1OO ml CH2CI2. Spojené extrakty se suší MgSO₄. Zkoncentrují se ve vakuu a získá se 0,47 g produktu (IVB).

t.t.= 140 150°C, hmot. spek. MH* =516.

Krok C-

IV

0,449 g (0,87mmol) produktu z kroku B (IVB) se smíchá s 20 ml CH2CI2 a 0,501 g (0,59 mmol) (CH3)₃SiNCO a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Pak se přidá 50-75 ml nasyceného vodného NaHCO3 a míchá se 0,5 hodiny. Reakční směs se zředí CH2CI2, vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 2 x 100 ml CH2CI2. Spojené CH2CI2 extrakty se suší MgSO₄ a zkoncentrují se ve vakuu do sucha. Chromatografie odparku (silikagel, 500 ml CH2CI2, 1000 ml 1% MeOH/CH2Cl2 * 0,1% NK4OH (vodný), 1000 ml 2% MeOH/ClfeClz + O,2% NH4OH a nakonec 3% MeOH/CH2CI2 * 0,3% • · ♦· ·* ·· ·♦', ·· *·. · ·- · · ·- . · · · ·· ··*·.

'· -, .»··’'··’ '·. :'.· '· . ' Ο.*?!*·..·':/·*·· ·»· · Ο· ·· ·· ·*

ΝΗ4ΟΗ ) poskytne 0,33 g požadované sloučeniny (IV). t.t. = 145-155°C, hmot. spek; MH+= 559.

Příklad 5

(-)-enantiomer

3,0 g (6,36 mmol) (-) -enant i oaeru sloučeniny z preparát i vní ho příkladu 6, krok D se smíchá se 70 ml suchého DMF. Přidá se 3,84 ml (34,94 mmol) H-methylmorfolinu, 3,28 g (17, 11 mmol)

DEC, 2,23 g (16,52 mmol) 4-pyridyloctové kyseliny Reakční směs se lichá

HOBT a 2,09 g (13,55 mmo1) N-ox idu z preparát i vní ho příkladu 1 (PI). při teplotě místnosti přes noc.

Zkoncentruje se ve vakuu, aby se odstranil DMF, přidá se ÍOO ml nasyceného vodného NaHCO3 a 1O ml CH3CI2 a míchá se 15 minut. Reakční směs se extrahuje CH2CI2 (2 x 500 ml). Extrakty se suší MgSO.4 a zkoncentrují se ve vakuu do sucha. Odparek se chromatografuje (500 g reversní fáze C18 silica, gradient 75%, 80% a pak 85% MeOH/voda + O,1% AcOH). Požadované frakce se zkoncentrují ve vakuu, aby se odstranil MeOH a přidá se 50 ml IM HaOH (vodného). Míchá se 15 minut, pak se extrahuje CH2CI3 (2 x 500 ml) . Extrakt se suší MgSO.4 a zkoncentruje se ve vakuu. Získá se 3,5 g požadované sloučeniny (V).

t.t.= 148,9-150,5°C, hmot. spek. MH+= 605 ttf]D²⁵= -56,37° (9,4 mg/2ml MeOH).

Sloučeninu 2 příkladu 5 lze isolovat také jako hydrochlorid reakcí roztoku produktu (V) v HCl místnosti. Dále se reakční směs a poskytne hydrochlorid.

[<í]d^2S= -31,9° (4,80 mg/ 2 ml MeOH + 1 ml vody)

Při použití (+)-enantiomeru sloučeniny z preparátivního příkladu 6 se stejným způsobem, jako je popsaný výše pro příklad a CH2CI2 při teplotě zkoncentruje ve vakuu

5, připraví analogický (+)-enantíomer (příklad 5A) . t.j.

enantioner sloučeniny z příkladu 5.

t.t.= 149, O-150, 5°C, hmot. spek. MH* = 605

Ící Ir.²⁵- +67,1° (7,0 mg/2ml MeOH) .

Sloučeninu z příkladu 5A lze isolovat jako hydrochlorid stejným způsobem jako je popsaný pro příklad 5. t.t.=152,9°C ·««· « 9 « ».· A ·». 4.4.4·' 4.

(cf]»²⁵= *41,7° ( 2 Bl MeOH + 1 ml vody).

Při použití racemické sloučeniny z preparativního příkladu

6, krok C (PVIC) se stejnou procedurou jako je popsaná výše pro příklad 5 připraví racemát (Příklad 5B). t. t. = 84,3-85,6°C, hmot.spek. MH* « 607.

Příklad 6

Krok A^:

3,21 g (6,80 mol) (-)-enantiomeru sloučeniny z preparát ivního příkladu 6 se smíchá se 150 ml bezvodého DMF. Přidá se 2, 15 g (8,8 mmol) 1 -N-1-butoxykarbony1pí peridinyl-4-octové kyseliny,

l.p\* g (8,8 mmol) DEC, 1,19 g (8,8 mmol) HOBT a 0,97 ml (8,8 mmol) N-methylmorfolinu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Pak se zkoncentruje ve vakuu, aby se • · • «ν , ο ·♦· ·.♦· · · · · ’ ' f ’ , 1 ’ I ^W 9 9’· ,9 > 9 9“9 · 9 ··«···· 9 · ’ . · · ··· · • · · · · · 9 · , ·, '9 9 9 - < Ί · 9-· , 9· ·· odstranil DMF a přidá se 50 ml nasyceného vodného NaHCQ3. Extrahujé se CH2CI3 (2 x 250 ml), extrakty se promyjí 50 ml solanky a suší MgS04. Zkoncentrují se ve vakuu do sucha a chromatografie (silikagel, 2% Me0H/ClfeCl2 + 1O% NH4OH) poskytne 4,75 g produktu (VIA).

t.t.= 75,7-78,5°C, hmot. spek. MH⁺= 695

Ctfli>^3S= -5,5° (6,6 mg/2 ml MeOH) .

Krok B

Vlfi l/i&

4,70 g (6,74 mmol) produktu z kroku A (VIA) se smíchá s 50 ml MeOH, pak se přidá během 1 hodiny 50 ml 10% H3SO4/dioxan po 10 ml podílech. Reakční směs se nalije do 50 ml vody a přidá se 15 ml 50% NaOH (vodného), aby se pH upravilo 10-11. Směs se zfiltruje, aby se odstranila vzniklá pevná látka a filtrát se extrahuje CH2CI2 (2 x 250 ml). Vodná vrstva se zkoncentruje ve vakuu, aby se odstraní 1 MeOH a opět se extrahuje 250 ml CH3CI2. Spojené extrakty se suší MgS04 a zkoncentrují se vakuu do sucha. Získá se produkt (VIB).

t.t.= 128, 1 - 131,5°C, hmot. spek. MH+= 595.

Cof]D²⁵= -6,02° (9,3 mg/2 ml MeOH).

Krok C

I/I&

l/l β 9

3,64 g (5,58 mmol) produktu z kroku B (VIB> se smíchá s 30 ml CHaClz, pak se přidá 6,29 ml (44,64 mmol) (CH3)3SiMC0. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 2 dny. Přidá se 25 ml NaHCO3 (vodného), pak se extrahuje CHaCla (2 x 250 ml). Extrakty se promyjí 25 ml solanky a suší MgS04. Zkoncentrují se ve vakuu do sucha a chromátografují (silikagel, gradient 2,5%, 5,0% pak 7,5% MeOH/CIfaCla + 1O% NHUOH) . Získá se požadovaná sloučenina (VI).

t.t.= 150,5-153,O°C, hmot. spek. MH* = 638 -61,4° (8,18 rag/2 ml MeOH).

Příklad 7

Sloučenina sloučeninou z

z preparát i vn í ho př í k1adu preparátivního příkladu 1 jako je popsáno pro příklad 2. Získá

Ví) (PVII) reaguje se (PI) stejným způsobem se O,25 g požadovaně sloučeniny (VII), což je racemická směs atropoisomerů.

r

Hmot. spek. MH⁺= 602, t.t.= 167,2-167,8°C.

Hydrochlorid sloučeniny z příkladu 7 se připravuje mícháním s HCI/CH3CI3 po dobu 1 hodiny, vakuu a získá se sůl.

Pak se reakčni směs odpaří ve

Příklady 7A & 7B

• / 9 '· 9 9 ·· 9 .·' 9 · 9 · 9 9 9 99 99 999· 9 • 9 9 9 · · · ·' «-9 '9 9 9 9 9 9 je racemická směs dě1eny přeparat i vn í Chiralpack AD (5 cm

Sloučenina z přikladu 7 (VII) atropoisonerů. Tyto atropoísomery jsou chromatografií (HPLC) s použitím kolony x 50 cm) a 40% iPrOH/hexan + 0,2% diethylaminu jako mobilní fáze. Získají se (+)- a (-)-enantioměry, příklady 7A a 7B.

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer, příklad 7A t. t. = 114,2-114, 8°C, toclr>^2S= -154,6° (8,73 mg/2ml MeOH)

Fyzikálně-chemická data pro<+)-enantiomer, příklad 7B t.t. = 112, 6-113, 5°C, [oflD²⁵= +159,7° (10,33 mg/2ml MeOH).

Krok A=

6,0 g (12,8 mmol) sloučeniny z preparátivního příkladu 7 (PVII) se ponechá reagovat s 3,78 g (16,6 mmol) 1 -N-t-butoxykarbony1piperidinyl- 4-octové kyseliny stejným způsobem jako je popsán pro příklad 6, krok A. Získá se 8,52 g produktu (VIIIA).

Hmot. spek. MH*- 692(FAB) • · • ·

200 MHz) = 8,5(d, 1Η> . 7, 5( d, 2Η> , 7, 2( d. 1Η> ,

3, 8-3, 6(m, 1Η) , 3, 5-3, 15(m, 3Η> , 2,9(d,2H>,

2, 4-1,8( m, 6Η> , 1,8-1,6( £>r d, 2Η) , l,4ís,9H>,

*Η NMR (CDCI3 4,15-3, 9( m, 3Η> , 2, 8-2, 5( ra, 4Η) ,

1,25-1,Ο (m,2Η> .

Krok Β

1/Ν1β (//1/3

8,5 g produktu z kroku A (VIIIA) se smíchá s 60 ml CH3CI2 a ochladí se na O°C. Pak se přidá 55 ml TFA. Reakčni směs se míchá 3 hodiny při 0°C. Pak se přidá 500 ml IN NaOH (vodného) a dále 30 ml 50% NaOH (vodného). Extrahuje se CH2CI2. Extrakt se suší MgSO^i a zkoncentruje ve vakuu. Získá se 7, 86 9 produktu VIIIB).

Hmot. spek. MH⁺-NMR (CDCI3,

4, 1 -3, 95( ra, 2H) , 2, 45-1,6(m,6H) ,

592(FAB).

200 MHz): 8,51(d, 1H), 7,52(dd,2H) 3,8-3,65(a,2H), 3, 5-3,O5(ra,5H>, 3

1,4-1, Kra, 2H) .

7, 2O(d, 1H) , 0 2, 5(m, 6H) ,

Krok C:

VII/&

7,80 g (13,1 mmol·) produktu z kroku B (VIIIB) se ponechá reagovat s 12,1 g (105 mmol) (CH3>3SiNCO stejným způsobem jako je popsaný v příkladu 6, krok C. Získá se 5,50 g požadované • · ; '·· ' 99.--- '99 : ·· • · 9 :9 -. -.9-- 9. .9 9 . 9

9 --9 9 ' 99 . --9- 9 99. :

·0·0 · · · « 9-.9 99 9 9 ·

9 ·9.· '9 0· ·

--9--- 00' 00' ' 0 · 0 · sloučeniny (VIII), která je raceaickou směsí atropoisomerů.

t.t.= 163, 6-164, 0°C, hmot *H NMR (CDCla, 200 MHz)

7, 21 (d, 1H) ,

3, 0-2, 5(m, 5H)

4, 54( s, 2H> ,

2, 45-1,6(ra, 7H) spek. MH⁺ =635(FAB).

8, 5(d, 1H) . 7, 52( d, 1H) 4, 1 -3,6(m.411),

1,4-1,0(m, 2H) .

7, 48(d, 1H) , 3,45-3,15(ra,4H),

Příklady 8A & 8B

Cl

Sloučenina atropo i soraerů. chromatograf i í z příkladu 8 (Vlil) Tyto atropoisomery jsou (HPLC) za použití kolony je racemícká směs děleny preparativní Chiralpack AD (5 cm x 50 cm) a 20% iPrOH/hexan + 0,2% ethylaminu jako mobilní fáze.

v.

Průtok byl nízký 1OO ml/min. Získá se (+)- a (->-enantiomery, Příklady 8B a 8A.

Fyzikálně-chemická data pro (->-enantiomer, příklad 8A t.t. = 142, 9-143, 5°C, [<ζ1ι>²⁵= -151,7° (11,06 mg/2ml MeOH)

Fyzikálně-chemická data pro (+)-enantiomer, příklad 8B t.t. = 126, 5-127, O°C, [<υ1ι>²⁵⁵ = +145,6° (8,38 mg/2ml MeOH) .

• · 0 ···· · · ) Μ ' 0«

0 0 0 0 0 « . 0:0.'' ' '. .0. '. 0 0 0 ' 0 · 00 0000 «

Příklad 9

IX

3,32 g (+)-enantiomerů sloučeniny z preparativního příkladu 8, krok B (PVIIB) se smíchá s 2,38 g sloučeniny z preparativního příkladu 1 (PI), 1,92 g HOBT, 2,70 g DEC,

1,56 ml N-methyl morfoli nu a 50 ml suchého DMF. Míchá se pří 25°C 24 hodin. Zkoncentruje se ve vakuu, pak se odparek zředí CH2CI2. Promyje se ÍN NaOH (vodným), pak nasyceným roztokem NaHzPO.4 (vodným) a suší se ligSO.4. Zkoncentruje se ve vakuu do sucha a chromatografie odparku (silikagel, 2% MeOH/CHzCla + NH4OH) poskytne 3,82 g požadované sloučeniny (IX).

Hmot. spek. MH⁺ = 604 (FAB).

Sůl hydrochloridu byla připravena rozpuštěním sloučeniny z příkladu 9 v dichlormethanu, který byl nasycen chlorovodíkem. Po zkoncentrování ve vakuu bylo získáno sloučenina z příkladu 9 jako HCI sůl .

t.t.= 166,5°C.

[tfl»²²= +70,8° (9,9 mg/2ml MeOH).

Příklady 9A & 9B

• · ·· .' · · .. flfl · · • fl · fl · · · ' · · fl. .· • · · · · · · · · · · • fl··· · · flfl fl · ···· · fl · . · flfl · . flfl · fl»· · flfl flfl flfl flfl (-)-enantioner sloučeniny 2 preparativniho příkladu 8, krok B (3,38 g) je ponecháno reagovat s 2,20 g sloučeniny z preparát ivniho příkladu 1 (PI) stejným způsobe» jako je popsán v příkladě 9. Získá se 3,58 g sloučeniny z příkladu 9A.

HCI sůl sloučeniny 2 příkladu 9 A je připravena rozpuštěním této sloučeniny v CH2CI2. Pak se k roztoku přidá 6M HCI (g) v CH3CI2. Pak se roztok zkoncentruie ve vakuu a poskytne sůl. t.t.= 129°C, Ccďi>^as= -72,3° (3,32 mg/2ml MeOH).

Raceraát sloučeniny 2 preparát ivniho příkladu 8, krok A (PVIIIA), je ponechán reagovat se sloučeninou z preparát ivního příkladu 1 (PT) stejným způsobe» jako je popsán v příkladu 9. Získá se sloučenina 2 příkladu 9B.

t.t.= 145, 0°C.

Příklad 10

Krok A

1,33 g (+)-enantiomerů sloučeniny 2 preparát ivního příkladu 8, krok B se nechá reagovat s 1,37 g 1 -N“t butoxykarhony1piperid1nyl- 4-octové kyseliny způsobe», který je popsaný pro příklad 6, krok A. Získá se 2.78 · .. · • · .·

·. » · • ···· • '· ' ··· ' · ' ·· ··' .

' 9 9 ' ' 9. . · · · 9 9' • · · · · 9 • · · · ·· ··

9 9 · · ·· • ··· 9 · • 9 9

... _φ.₉ . - _{t e} g produktu (XA).

Hmot. spek. NH* = 694, 0( FAB) t«]p^2S= + 34,1° (5,45 mg/2ml MeOH)

Krok B

2,78 g produktu z kroku A (XA) se ponechá reagovat způsobe®, který je popsaný v příklad 8, krok B. Získá se 1,72 g produktu (XB) .

t.t.= 104,1°C. hmot.spek. MH⁺= 594

Ccclr>²⁵= +53,4° (11,42 mg/2ml MeOH).

Krok C:

^v cr

X& X

1,58 g produktu z kroku Β (XB) reaguje s 6 ml (CH3>3SiNC0 způsobem, který je popsaný pro příklad 6, krok C. Získá se 1,40 g požadované sloučeniny (X).

t.t.= 140°C

Hmot. spek. NH*= 637 [_(ř]_e25.. ,₄₉jo (4,24 mg/2ml MeOH).

Rekrystali žací z acetonu se získá požadovaná látka jako pevná látka. t.t.= 21 4, 5-215, 9°C .

0 00 00 00 00

00-0....-.0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0000 0 000

00000 000 00 0000 0

0 0 00 0 00 0

0 ' 0·· ' 0 0 0 0 0 0. 00' '

Příklady 10A & 1OB

(-)-enantiomer sloučeniny z preparát ivního příkladu 8, krok B, je převeden na požadovanou sloučeninu (příklad 1OA) v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 10, kroky A-C. Získá se sloučenina, přiklad 1OA.

t.t.= 152°C, hmot. spek. MH+ = 637

Ccf]D³⁵= -62,5° (1,12 mg/2ml MeOH).

Racemická sloučenina z preparát ivního příkladu 8, krok A, je převedena na požadovanou sloučeninu (příklad 9B) v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 1O, kroky A-C. Získá se sloučenina, příklad 1OB.

t.t.= 111,2°C.

Příklad 11

Požadovaná sloučeniny z

sloučenina (XI) je připravena preparát ivního příkladu 9, krok z racemické F v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 2.

*H NMR (CDC1₃, 400 MHz):

7,47<d, 1H>, 7,14(m,3H),

3,68(s,2H), 3,65-3,39(m,4H>

8,44(d,lH), 8,14(d,2H), 7,58(d,lH), 5,32(s, IH), 4,65-4,57(m,IH),

2,91-2,87(m,1H>, 2,69-2,63(m,IH), * 9 *' *

9 9 · « *

9 9 9 9 9 ·. · · ..99 • 9 9 9 . ·

9999 ''.99

9 1

2,45-2, 33(m, 4H) . MH* = 605.

Příklady 11A & 11B

Příklad 11A

Z R(+)- nebo S(-)- enantiomerů sloučeniny z preparát ivního příkladu 9, krok G, je připraven R(+)-enantioaer (příklad 11A) a S(-)-enantioaer (příklad 11B) v podstatě stejným způsobem, který je popsán pro příklad 2.

Fyzikálně chemická data pro R-(+)-enantiomer, příklad 11A: t.t.= 167,O-167,8°C, [tf]p^2S= +32,6° (c = 1, MeOH).

*H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8.44(d, 1H>, 8,14(d,2H), 7,58(d, IH),

7,47(d, IH), 7,14(m,3H), 5,32(s,lH), 4, 65-4, 57( m, IH) ,

3,68(s,2H), 3, 65-3, 39(ra, 4H> , 2, 91-2, 87( m, IH) , 2, 69-2, 63( m, IH) , 2, 45-2, 33(m,4H> .

MH* = 605.

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantiomer, příklad 11B= Coí1d²⁵= -38,2° (14,67mgV2 ml MeOH).

»H NMR (CDCI3, 400 MHz): 8,44(d,lH), 8,14(d,2H), 7,58(d, IH) , 7,47(d,lH), 7,14(m,3H), 5,32(s, IH) , 4, 64-4, 57( m, IH) ,

3,67(s,2H), 3,70-3,34(m,4H), 2,95-2, 87( m, IH) , 2,69-2,63(m,IH),

2, 45-2,31(m,4H).

MH* = 605.

• ·· ' '-to* ··: ·· • · ··· · · · · · 4 .4 4 to' 4 . 4 4 4

4444 4 4 4 4 4 4 444 4 4 · 4 4 · ·· · • .' ·· to· ·· ··'

Příklad 12

XJI

Požadovaná sloučenina z příkladu 12 (XII) je připravena z racemické sloučeniny z preparativního příkladu 9, krok F v podstatě stejným způsobem, který je popsaný pro příklad 8, kroky A-C. Sloučenina XII je racemát.

Příklady 12A & 12B.

Příklad 12A Příklad 12B

Sloučenina z příkladu 12 je racemická směs. Chromatografie

2,45 g sloučeniny z příkladu 12 za použití kolony Chiralpack AD, 20% íPrOH/hexan + 0,2% diethylamin jako mobilní fáze při nízké průtokové rychlosti lOOml/min, poskytne 0,970 g (+)-enantiomeru (přiklad 12B) a 0,982 g (-)-enantiomeru (příklad 12A).

Fyzikálně-chemická data pro (-)-enantiomer, příklad 12A = [rfli>²⁵= -31,2° (e = 0,453, MeOH).

>H NMR (CDCI3, 200 MHz): 8,43(d,íH), 7,58(d.lH), 7,48(d.lH>, 7,14(m,lH), 5,32(s,lH), 4, 5-4, 75( m, 1H) , 4,4(s,2H), 3,9(d,2H).

3,2-3,7(m,5H), 2,52 3,O5(ra,4H>, 1,85 2, 5( ra, 6H) ,

00*

1,5-1,85(m,4Η), 1 , Ο-1,4(m, 1Η) .

Fyzi kálně chemická data pro (+>-enantiomer, příklad 12B:

Ctílc^2S= +29,8° (c = O, 414, MeOH)

0' · • · 0 · • · · · • 0 0 0 « • 0 0 0 · 0

0 0 0 » .'0

0 0 0 0 <

' ' 00 ' λ 00' 0 0 *H NMR (CDCIa, 200 MHz): 8,43(d, IH), 7,58(d, IH), 7,48(d, IH), 7, 14(d, IH) , 5,32(s,lH), 4, 5-4, 75( m, IH) , 4,4(s,2H), 3,9(d,2H),

3,2 3,7(m,5H), 2,52-3,O5(m,4H), 1,85-2,5(ra,6H) ,

1,5- 1,85(ra, 4H> , 1,0-1,4(m, 1H> .

Příklad 13

XH1

Krok A^;

PXJS XIII o

1,35 g (-)-enantsoaeru sloučeniny z preparát ivnfho příkladu 10, krok Β (PXB), je ponecháno reagovat s 1,4 g 1 -N-1 butoxykarbonylpiperidinyl-4-octové kyseliny v podstatě stejným způsobem, který je popsaný pro příklad 6, krok A. Získá se 2,O g produktu (ΧΪΙΙΑ).

Hmot.spek. MH*= 694(FAB) částečné *H NMR (CDCI3, 300 MHz): 8,38(s,IH), 7,60(s,IH), · · ·· ·· ·' ·· ' ·« · · * ·«· · • · * · .· ·· ··· ·' · ·· • ···· · · · ·· · · ··· · • · « · · · · · »· · · · · · · · · · · • * ····

7,25(d, IH), 7,05(16, 1Η) , 1.45(s,9H)

Krok B:

1,95 g způsokem, produktu který je z kroku A popsaný pro (XIIIA) je ponecháno reagovat příklad 8, krok B. Získá se

1,63 g produktu (XIIIB).

Hmot.spek. MH+ = 594(FAB) částečné *H NMR (CBCI3, 300 MHz) 8,38(s, IH), 7,60(s, IH),

7,25(d,lH), 7,O3(m,lH), 4,64(d,lH), 3,9O(m,2H>.

Krok C'

1,6 g produktu z kroku Β (XIIIB) je ponecháno reagovat s 1,3 ml (CH3)3SiNC0 stejným způsobem jako je popsaný pro příklad 6, krok C. Získá se 1,27 g produktu (XIII).

Hmot.spek. MH⁺ = 637(FABS) částečné ‘H NMR (CDCI3, 400 MHz) ^: 8,38(s,lH), 7,59(s,lH),

7,25(d,lH), 7,04(m,lH), 4,60(d,lH), 4,41(s,2H).

[tfb³⁵- -33,1° (c - 0,58, EtOH).

Příklad 13B

Příklad 13A (+)-enantiomer sloučeniny z preparativního příkladu 10, krok

B, (2,1 g), je převedeno na požadovanou sloučeninu stejným způsobem jako je popsaný pro příklad 1O, kroky A-C. Získá se sloučenina, příklad 13Á.

Hmot. spek. MH⁺ = 637(FABS), [λ]ι>³⁵= +32,4° (c= 0,57, EtOH) částečné *H NMR (CDCI3, 400 MHz): 8.39(s,1H), 7,59(s,1H), 7, 25( d, 1H) , 7, O4( m, 1H) , 4, 60( d, 1H) , 4, 41 ( s, 2H) , částečné *H NMR (DMSO-dfe, 400 MHz): 8,42(s,lH), 7,88(s,1H), 7, 41(d, 1H), 7, 29( m, 1H) , 5, 85( s, 2H) , 4, 20( d, 1H) .

Racemická sloučenina z preparativníhopříkladu 10, krok A, je převedena na racemickou sloučeninu, přiklad 13R, analogickým způsobem.

částečné 7,25(d, 1H) částečné 7, 41 (d, 1H) *H NMR (CDCI3, 400 MHz): , 7,O4(m,lH), 4,6O(d, 1H), 4, *H NMR (DMSOds, 400 MHz): , 7, 29( d, 1H) , 5, 85( s, 2H) , 4,

8, 38(s, 1H) 41(s.2H),

8, 42(s, 1H) , 20(d, 1H) .

7,.59( s, 1H) ,

7, 88 (s, 1H) ,

Příklad 14

XlV

O

4 ····

4-44 4 4 1 ,·· ··

4 4 « * ·4

4 4 «

2,6 g (+)-enantiomeru sloučeniny z preparátivni ho příkladu 1O‘, krok B, je ponecháno reagovat s 1,68 g sloučeniny z preparátivního příkladu 1 (PI), analogickým způsobem jako je popsaný pro příklad 9. Získá se 2,ÍO g požadované sloučeniny (XIV).

Hmot. spek. MH+ = 604ÍFAB), £ a]»²⁵= +34,1° ( ÍO,98mg/2ml EtOH) částečné *H NMR (CDCI3, 400 MHz): 8,38(s, IH) , 8,15(d,2H), 7, 58(s,IH), 7,26(d, IH) , 7,15(d,2H), 7,03(d,lH), 4,57(d, IH).

HCI sůl sloučeniny z příkladu 14 se připraví rozpuštěním 700 ag sloučeniny (XIV) ve 4 ml CH2CI2. Přidají se ochladí na O°C a pomalu (po kapkách se přidá v dioxanu. Přidají se 2 ml EtzO a reakční

0°C 7 minut. Pak se zředí 30 ml EtžO, pevný produkt se spoj í na filtru a promyje 30 ml EtsO. Pevný produkt se suší ve vakuu a získá se 0,836 g HCI sol i sloučeniny z příkladu 14.

[<x]d²⁵ = +64,8° (9,94mg/2ml EtOH).

al Et₂O, 1 al HCKg) směs se míchá při

Příklady 14A & 14B

Příklad 14A Příklad 14B

0,6 g (+)-enantiomeru sloučeniny z preparát ivního příkladu 10, krok B, je ponecháno reagovat s 0,39 g sloučeniny z preparát ivního příkladu 1 (PI), analogickým způsobem jako je popsaný pro příklad 9. Získá se 0,705 g požadované sloučeniny. Hmot. spek. MH*= 604(FABS), [cílu²⁵* -41,8° (EtOH) částečné *H NMR (CDCI3, 300 MHz): 8,38(s,lH), 8,15(d,2H), 7,58(s,lH), 7,26(d, IH) , 7,15(d.2H), 7, 03( d, IH) , 4, 57( d, 1H> .

HCI sůl sloučeniny z příkladu 14A se připraví stejným způsobem, který je popsaný pro příklad 14.

£clr>²S= 63,2° (EtOH).

/9 9 *H NMR (CDCla, 400 MHz): 8,3g (s,IH), 8,15(d,2H), , 7,26(d,lH), 7, 15(d,2H), 7,03(d,IH) , 4,57(d,lH).

*H NMR (DMSO-de, 400 MHz): 8,77(d,2H), 8,47(s,IH), , 7,74(d,2H>, 7,43(m. IH), 7.27(d.lH). 4.35(d • * · 9 9 9 9 9 • 999 9 999 • ·· ·9 ·· 9 · 9

9 9 · · 9 9 • · ·· 99 9 ·

Racemická sloučenina z preparátivního příkladu 10, Krok A, je převedena na racemickou sloučeninu z příkladu 14B stejným způsobem jako je popsán pro příklad 9.

částečné 7, 58(s, IH) částečné 7, 95(s, IH)

Příklad 15

XV

Sloučenina z preparát ivního příkladu 4 reaguje stejnými způsoby, které jsou popsány pro příklad 8, kroky A-C. Získá se požadovaná sloučenina (XV), která je racemát.

Hmot. spek. MH*= 635(FAB) částečné *H NMR (CDCI3): 8,45 (s,lH), 7,6O(s,IH), 7,35(d,IH),

7,05(d,lH), 4, 45(s, IH) .

Příklady 16A & 16B

preparát ivního příkladu 11 je převeden stejným způsobem, který ·:« ···· · * »4 4· 4 je popsán pro příklad 2. Získá se R-(+)-enantiomer, příklad 16A a S-(-)-enantiomer, příklad 16B, požadované sloučeniny.

Fyzikálně-chemícká data pro R-(+)-enantiomer= ^t3C NMR (CDC1₃>^: 166,5(0, 154,8(0, 146,6(CH), 14O,8(CH),

140,4(0, 138.5CCH), 138(CH), 136,3(O, 134, 6( O , 133, 8( O , 133,6(0, 132, O(CH), 130, O(CH), 126, 3(CH), 126, 3( CH) ,

125,8(CH), 119,6(0. 78,4(CH), 51,1(CHa), 50, 6(CHa>,

45,4(CHa), 41,5(CHa), 38,0(CHa). 30, 1 (CHa) , 30, 0( CHa) .

Ccc3d^2!5= +30,7° (10,35 mg/2ml MeOH).

Fyzikálně·chemická data pro S-(-)-enantiomer= ¹³C NMR (CDCI3) : 166,5(0, 154,8(0, 146,6(CH), 140,8(CH),

140,4(0, 138,5(CH), 138.5ÍCH), 136,3(0, 134,6(0, 133,8(0,

133,6(0, 132,O(CH), 13O,O(CH), 126.3ÍCH), 126,3(CH),

125.8ÍCH) , 119,6(0, 78, 4( CH) , 51,1 ( CHa) , 50,6(CHa>,

45,4( CHa)'/ 41,5( CHa),' 38,0(CHa), 30, 1 ( CHa) , 29.9( CHa ) .

[<řlD³⁵ = -30,'9° (9, 70 mg/2ml MeOH).

Příklady 17 & 17A

Příklad 17 (+)-enant i omer nebo

Příklad 17A (-)-enant i omer s1oučen i ny z preparát ivního příkladu 11 se zpracovává stejným způsobem, který je popsán pro příklad 1, kroky A-C. Získá se R-(+)-enantiomer, příklad 17 a S-(-)-enantiomer, příklad 17A, požadované s1oučen i ny.

Fyzikálně-chemická data pro R-(+)-enantiomer:

¹³C NMR (CDCI3): 169,3(0, 157,5(0, 155,0(0

14O,8(CH), 140,4(0, 136,3(0, 134,8(0

130, O(CH), 125, 8(CH), 119,6(0,

43,9( CHa).

50,9(CHa),

45, 2(CHa) ,

146, 6( CH), 133,7(0, 132,0(CH),

78,5(CH), 51,4( CHa),

38,8(CHa) ,

43, 9( CHa ) ,

32,5(CHa), 31,5(CHa>, 31.5( CHa)., 30,l(CHa>, 30,0(CHa).

4« *· » e « * to U*í * 9 • > * « « *· [tf]l>²⁴'⁸ = +28,7° (10,1 rag/2ml MeOH).

Fyzikálně-chemická data pro S-(-)-enantiomer:

¹³C NMR (CDCls): 169,3(0, 157,6(0, 155,0(0, 146,6(CH),

14O,8(CH), 140,4(0, 136,3(0, 134,8(0, 133,7(0, 132,O(CH),

119,6(0, 78,5(CH), 51,4tCHa>,

43,9(CH2), 43,9(CHz), 38,8(CH2 ),

5(C1Í2), 30, 1(CHž>,> . 3O,O(CH2> .

[tí]p²⁴'⁸^ -28,5° (10,1 mg/2ml MeOH).

13O,O(CH), 125,8(CH),

50,9( CH2), 45, 2(CHz ),

32, 5( CH2 ) , 31.5( CH3 > , 31

Příklad 18

xvm

Krok A =

0U//B

9,90 g (18,9 mmol) produktu z preparátívního příkladu 7, krok B (PVIIB), se rozpustí ve 150 ml CH2CI2 a 200 ml CH3CN a zahřeje se na 60°C. Přidá se 2,77 g (20,8 mmol)

N-chlorsuccinimidu a zahřívá se k refluxu po dobu 3 hodin. Reakce se monitoruje TLC (30% EtOAc/voda). Přidá se dalších 2,35 g (10,4 mmol) N-chlorsuccinimidu a zahřívá se k refluxu dalších 45 minut. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a extrahuje se IN NaOH a CH2CI3. CH2CI2 vrstva se suší MgSO.4, fl'fl · , ,9 · · fl ···· fl · • fl· ·

• , fl ‘.fl·· '9 9'9 fl'h ·?

• fl · flfl flfl flfl ‘ flfl

K fl , filtruje se a čistí flash chromatografií (1200 ml silikagelu s normální fází, eluce 30% EtOAc/voda). Získá se 6,24 g požadovaného produktu (XVIIIA).

t.t.= 193-195,4°C.

Krok B=

Ke 160 ml koncentrované HCI se při -10°C přidá 2,07 g (30,1 mmol) NaMO2 a míchá se 1O minut. Přidá se 5,18 g (10,1 mmol) produktu z kroku A (XVIIIA). Reakční směs se ohřeje z -10°C na 0° C během 2 hodin. Pak se reakční směs ochladí na -10°C a přidá se 100 ml H3PO2 a reakční směs se ponechá stát přes noc. Reakční směs se pak nalije na drcený led a zalkal izuje se 50% NaOH, extrahuje se CH2CI2. Organická vrstva se suší MgSO4, zfiltruje a zkoncentruje do sucha. Čisti se flash chromatografií (600 ml silikagelu s normální fází, eluce 20% EtOAc/hexan). Získá se 3,98 g produktu (XVIIIB).

Hmot. spek. MH⁺= 495.

Kl/uiG Λί////α_ φφ φφ «φ φφ

Φ Φ Φ Φ Φ Φ 4 • ΦΦ ' Φ Φ ·Φ

Φ Φ φ Φ - ΦΦ Φ Φ 4

Φ Φ Φ Φ Φ 4 • Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

3,9 9 produktu z kroku Β (XVIIIB) se rozpustí ve 100 ul koncentrované HCI a zahřívá se k refltixu přes noc. Reakční směs se ochladí, zalkalizuje 50% NaOH a výsledná směs se extrahuje

CH2CI2. CH2CI2 vrstva se suší MgS0₄, za vakuu se odpaří rozpouštědlo a produkt se usuší. Získá se 3,09g požadovaného produktu (XVIIIC). Hmot. spek. MH⁺ = 423.

Krok D ’·

Za použití způsobu, který je pododný způsobu, který je popsán v preparát ivním příkladě 6, se získá 1,73 g požadovaného produktu (XVIIID).

t.t.= 169,8-170, 1°C, [<x1d^2S= + 48,2°(c=1, MeOH), MH*= 425.

Krok E:

Za použití způsobu, který je podobný způsobu, který je popsán v příkladu 4, se z výchozí látky, produktu z kroku

D (XVIIID), získá požadovaná sloučenina (XVIII).

t.t.= 152, 3-153,3°C, [<řli>²⁵ = + 53,O°(c=l, MeOH), MH+= 593.

Příklad 19

X/X < «» Μ 99 99 * •'•9 9· · 9 · « ‘9 9 9 9 9 9 999' ··«· 9 · · · 99 99*

99 99 ·9

Krok A:

15,0 (44,4 mmol) produktu z preparát ivního příkladu 9, krok B, se ponechá reagovat s 6,52 g (48,9 mmol) H-chlorsuccinimidu způsobem .který je podobný tomu, který je popsaný v příkladu 18, krok A. Extrahuje se, jak je popsáno a získá se 16,56 g požadovaného produktu (XIXÁ).

t.t. = 234,7-235,09C, MH*= 370.

Krok B^:

Cl

16,95 g (45,6mmol) produktu z kroku A (XIXA) se ponechá reagovat způsobem popsaným v příkladu 18, krok B a získá se 13,07 g požadovaného produktu (XIXB).

t.t.= 191,7 192.1«C. MH* = 356.

Krok C:

XlXB

10,0 g (28,0 mmol) produktu z kroku B (XIXB) se ponechá reagovat s NaBH-4 způsobem, který je popsaný v preparát i vním příkladě 9, krok B. Získá se požadovaný produkt (XIXC), který se použije v následujícím kroku bez dalšího čištění.

' • 0

0.0 ·

0 ¹ 00« 0

0 0 0

0 0 0 00

Krok D^:

Χιχ C.

10,0 g (27,9 mmol) produktu z kroku C (XIXC) se rozpustí pod dusíkem v 200 ml CH2CI2 za míchání a při teplotě místnosti. Reakční směs se ochladí na 0°C a přidá se 2,63 g triethylaminu a 4,80 g (41,9 mmol) methansulfonylchloridu. K výslednému roztoku se při O°C přidá roztok 16,84 g (19,6 mmol) piperazinu a 100 ml THF a dále se bez prodlení přidá 100 ml DMF. Míchá se při teplotě místností přes noc. Odpaří se rozpouštědlo a výsledný zbytek se extrahuje s CH2CI2 a nasyceným roztokem NaHC03. CH2CI2 vrstva se suší MgSO/i, filtruje se a koncentruj e, aby se získal surový produkt. Chromatografie surového produktu (1200 ml silikagelu, eluce 5% MeOH (nasycený NH3>/CH2CI2> se získá racemícká směs. Racemícká sloučenina se dělí chirální chromatografií na koloně Chiralpack AD (5 cm x 50 cm) eluce 30% iPrOH/ hexan + 0,2% diethylaminu.

Hmot. spek. MH⁺= 426. Požadovaný isomer je (+)-enantiomer.

Krok E^:

2,0 g (4.7 mmol) produktu z kroku D se míchá v 40 ml DMF pod dusíkem, směs se ochladí na 0°C a přidá se 0,615 g (6,1 mmol) N-raethylmorfolinu, 1,1668 g (6,1 mmol) DEC, O,8225g (6,1 mmol) HOBT a 1,6042 g (6,1 mmol) produktu z preparativního příkladu 1 (PI). Reakční směs se míchá při teplotě místností přes noc. Odpaří se rozpouštědlo a výsledný zbytek se extrahuje CH2CI2, který se promyje vodou, nasyceným NaHCO3, 10% NaHaPO^ a solankou. Oddělí se CH2CI2 vrstva, suší se MgS04, zfiltruje se a zkoncentruje do sucha. Odparek se čistí Flash chromatografií (400 ml silikagelu. eluce 5% MeOH/NHz-CHzCls)Získá se 2,43 g požadovaného produktu (XIX).

t.t.= 145, 3-146, PC, [tf]p²⁵= +33,6° (c= 1 , MeOH). MH⁺= 561.

Příklad 20

200 mg výchozí kyanosloučeníny se zahřívá v 17 g kyseliny polyfosforečné při teplotě 19O-2OO°C 45 minut. Výsledná směs se nalije na led, přidá se 30% HCl a míchá se 30 minut. Reakční směs se extrahuje CHaCla, promyje solankou a suší NažjSO.4 . Extrakt se zfiltruje a zkoncentruje. Čistí se preparativní TLC (eluce EtOAc/hexan) a získá se 21 mg požadované sloučeniny (XXA) (také se získá 59 mg 10-chlorproduktu).

Krok B:

XXe>

Způsobem, který j e popsaný v preparát i vní m př í k 1adě 9, krok

Ε, se ponechá reagovat 1,75 g (5,425 mmol) produktu z kroku

A (XXÁ) s NaBH4 a získá se požadovaný produkt ÍXXB).

φφ

9 • ,ι

9 • ΦΦΦ

ΦΦ 99 9 Φ Φ , Φ

9 99

9 9 9

9 9 Φ.

Φ· ΦΦ

99 ,/ * * ·<

• · φ* φ·φ > * < φ φ * φ <' ' · φ

Krok C^:

Látka získaná v kroku B (XXB) se při teplotě místnosti rozpustí v 50 ml CH2CI2, přidá se 3,95 ml (5,425 mmol) SOCI2 a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Za vakua se odstraní přebytek SOCI2 a rozpouštědlo. Odparek se rozpustí v CH2CI2, přomyje nasyceným roztokem NaHCO3 a solankou. Suší se NazSO^, zfiltruje se a koncentruje. K vzniklé látce se přidá 25 ml THF a 2,33 g (27,125 mmol) piperazinu a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo se odpaří, přidá se CH2CI2. Promyje se nasyceným roztokem NaHCO3 a solankou. Suší se NazSO.4, zfiltruje se a zkoncentruje. Výsledná látka se čistí chirální chromatografií za použiti kolony Chiralpack AD, eluce 20% íPrOH/hexan s 0,2% diethylaminu.

Hmot. spek. MH⁺ = 392.

Požadovaný isomer je (+)-enantiomer.

Krok D·770 mg (1,960 mmol) produktu z kroku C se smíchá s 323 yl (2,548 mmol) N-methylmorfolinu, mg (2,548 mmol) DEC, 390

344 mg (2,548 mmol) HOBT, 487 mg (2,548 mmol) sloučeniny z preparát ivního příkladu 1 (PI) a 8 ml DMF. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo se odpaří, přidá se EtOAc, promyje se nasyceným roztokem NaHCOa, vodou a solankou.

Suší

Na2S04·

Produkt se čistí flash chromatografií na silikagelu, eluce EtOAc až gradient 10, 12% (1O% NH4OH/MeOH/EtOAc) . Dále se čistí preparativní TLC (silikagel lOOOy) a získá se 750 mg požadované sloučeniny (XX). Cafli>²⁵= + 23,3° (c~ 0,332, MeOH).

* * » ·<' >·* ·< · *~r· * , * ♦ · · ' ·/ ’>.“♦· • ·«·· · · ♦ · · ··· * ·· ·*

V” _; ‘

-· o .

Příklad 21

Krok A

ÍO.Og (29,6 mmol) produktu z preparát ivního příkladu 9, krok B, se rozpustí v 150 ml CH2CI2 a 200 ml CH3CN při teplotě místnosti. Směs se zahřeje na 6O°C, přidá se 10,45 g (32,6 mmol) 1 -f1uor-4-hydroxy-1,4-diazoniabicyklof2,2,21 oktan bistetraf1uorobori tanu a zahřívá se k refluxu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti, extrahuje se CH2CI2 a 1 H NaOH. CH2CI2 vrstva se suší MgSO.4, zfiltruje se a zkoncentruje do sucha. Výsledná látka se čistí flash chromatografií za použití 1400 ml silikagelu s normální fází, eluce 1O% EtOAc-CH2Cl3+ 2 kapky NH4OH. Získá se 2,00 g produktu (XXIA). t.t.= 103, 2-103, 5°C, MH⁺= 355.

Krok B^:

XX/A

Způsobem, který je popsaný v preparát ivníra příkladě 9, krok D, se ponechá reagovat 1,80 g (5,1 mmol) produktu z kroku

00

0 0 «

0 00

0 0 «

0 0 «

00 • 0 0000 » 0 0 0 » 0 00

0 0 0

0 0

0« 00

A (XXIA). Surový produkt se čistí Flash chromatografií za použití 200 ml silikagelu s normální fází, eluce 20% EtOAc/hexan.

Hmot. spek.: MH⁺- 339.

Krok C:

Xx/CZpůsobem, který je popsaný v preparát ivníra příkladě 9, krok E, se ponechá reagovat 0,47 g (1,4 mmol) produktu z kroku B s HéťB11.4 . Získá požadovaný produkt (XXIC).

Hmot. spek.: MH⁺- 342.

Krok D:

0,37 g (1,1 mmol) produktu z kroku C (XXIC) se rozpustí v 20 ml toluenu pod dusíkovou atmosférou a ochladí s místnosti na 0°C. Přidá se 0,3855 g (3,2 mmol) SOCI při teplotě místností, pak se přidá 10 ml CHCla a hodiny. Rozpouštědlo se odpaří a výsledná látka s IN NaOH-CHp.Clz. CH_SC1z vrstva se suší MgSOa, a zkoncentruje do sucha. v-.>, ,. .i,. · >.'·ι , rozr.,’1 í e z teploty z a ra íchá se ra í chá se 3 e ex t r a hu j e zf i lt.ru je se v 10 ra I ΉΤΕ v a tmo s f é ř e d ι λ s i k u. ra 1 THE a ra í ch á se zopakuje extrakce a pipera z i nu novu pr d.< ’ k t.

Hmot. .

spek.: MH⁴- 410.

44 44 44

4 4 4 4 4 4

44 4 4 44

44 44 44 4 ’ kroku D se ponechá reagovat kyseliny 4-pyridy1 octové, DEC

4

4 4

4444 4

4 4 4 4

444 4 44 44

4 4

44

Krok Ε·’

Ο, 44 g (1,1 mmol) produktu s N-uethylmorfolineB, N-oxidem a HOBT v DMF způsobe», který ie popsaný v příkladu 5. Odpaří se rozpouštědlo a výsledná látka nasyceným roztokem NaHCO-;, 1O% vrstva se suší MgSO-4 , f i 1 tru je Výsledná látka se čistí silikagelu s normální fází.

0,41 g požadované sloučeniny (XXI) t.t.= 155, O· 155,6°C.

Hmot. spek.' MH* = 545.

se extrahuje ClfeClz-voda, NaHgPO^ a solankou. CHzCls se a koncentruje do sucha.

Flash chromátografií na 150 ml e 1 uce 5% MeOH/ NH-j - CH.·?. Clo. Z í ská se

Nás ledu jící sloučeniny se pař i praví z odpovídajících výchozích sloučenin a způsoby, které jsou popsány výše ^:

Cl (Z-XXíV.o) o

• · ·♦ ·· ♦ » ·* ··· · · · · 9 9 9 ·

9 9 9 9 99 9 9 99

9999 99 99 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 99 99 99 • · ····

Br (άχχιχ.ο)

N-^NHo

ci (tXXX .θ')

Stanovenί

1. In vitro stanovení enzynfl: Inhibice farnesylprotein transferásy a geranylgerany! protein transferázy.

Jak farnesylprotein transferása (FPT), tak geranylgeranyl protein transferása fGGFT) byly částečně čištěny z krysího rcskv sa po ra ne i frakcionacfř síranem amonný» <» r. '.n i--dnou ^: -'i-e,'..,. - -hroma t ·->'! f i í na Q-Sepharcse (Pharmacia.

Inc.), jak je popsaná Yokoyraou a kol. ( Yokoyama a kol..

(1991), A protein gerany 1 gerany 1 transf erase from bovine br-a i n ^: • · · · • « φφφφ ·· ·· φ · φ φ • φ · · φφφφ φ φ φ φ φφ φφ

Implications for protein prenylation spéci f i ci t,y, Proč. Kati. Acad. Sci USA 88 5302-5306. Lidská farnesyl protein transferása byla také vyznačena v E. coli za použití cDNA klonů, které kódovaly jak, a tak b subjednotky. Tyto použité metody byly podobné metodám, které byly publikovány (C.Oaer a kol., (1993), Charakterisation of recombinant huaan farnesyl protein transferase ' Cloníng, expression, farnesyl diphosphate bínding, and functional homology with yeast prenyl-protein transferases, Biochemistry 32^:5167-5176). Lidská farnesyl protein transferása byla částečně čištěna z rozpustné proteinové frakce E. Col i , jak bylo popsáno výše. Tricyklické inhibitory farnesyl protein transferásy, popsané, úči nnost í i nh i buj í jak li dský tak krysí které enzym j sou zde > podobnou

Byly připraveny dvě formy val¹²-Ha-Ras proteinu jako substráty pro tyto enzymy. Tyto formy se liší ve svých karboxy term i nálni ch ie sekvenc í ch. 3edna. f orma cystein-valin-leucm-serin sekvencí (Ras-CVLS) a druhá sekvencí cystein-valín-leucín-leucin (Ras-CVLL). Ras-CVLS je substrát pro farnesyl protein transferásu. zatímco Ras- CVLL je substrát pro gerany 1 gerany 1 protein transf erásu. I. cDNA , které kódují tyto proteiny, byly konstruovány tak, še tyto proteiny obsahují amjno·term iná1ni extenzi 6-histidinových zbytků. Oba proteiny byly vyznačeny v Escherichia coli a čištěny za použití afinitní chromatografie s chetáty kovu. Radioznačené isoprenyl pyrofosfátové substráty, C³H1farnesylpyrofosfát a [³H]gerany1gerany1pyrofosfAí byly získány od DuPont/Hev

England Nuclear.

Několik metod pro měření aktivity Farnesyl protein ukončena transferásy je Schaber a kol . , 1990, PNAS 87' č.5,185,428). t³H]farnesylu po dm í n e k, k t o ré popsáno ·> (Re i ss a kol .

1909, j.Bšol. Chem 265^: 14701

7541 o Parhacid a Manne

1990. Cell 62; 8i_t M.anne a kol . , 1093. US patent

Akt > v i ta s tanovována v Reiss a kol.. <9<?n <CeU mM Hepes. pH 7.5. 20 d i t hi othre i to 1 í 1..

farnesyl protein

Q- Sepharose. Dále

Γ ³B 1 f arnesy 1 pyrofosf átu. •nu podobné podeínkás, ffleren1m přenosu na Ras-CVLS za které jsou popsané jjM

62' 81). Reakční směs obsahovala 40 mM chloridu hořečnatého. 5 mM í³H1farnesylpyrofosfátu, iO ml rpferásy, která byla čištěna přes obsahová1 a i ndi kovanou koncentraci tricyklické sloučeniny nebo dieethylsulfoxid jako slepý pokus s nosiče» (5% DMSO konečného) a 5 raM Ras-CVLS v celkové» objemu

100 ml. Reakce byla ponechána probíhat při teplotě místnosti minut a pak byla zastavena 0,5 ml 4% dodecylsíranu sodného (SDS). pak se přidalo 0.5 ml chladné 30% TCA. Vzorky byly

4 ··»· «· 44

4 4 4

4 44

4 4 4 • 4 4 4

44

4«

4 • 4

4 4

4

4 ponechány stát v ledu 45 minut a sraženina Rar pak spojena na GF/C fitračním papíru za použití Brandelova sběrače buněk. Povlaky na filtru byly proayty pouze 6% TCA, 2% SDS a radioaktivita byla měřena ve Vallac 1204 Betaplate BS kapalném scintilačním počítadle. Procenta inhibice byla vypočtena relativně k DMSO jako slepému pokusu s nosičem.

Stanovení geranylgeranyl protein transferásy I bylo identické ke stanovení farnesyl protein transferásy, které je popsané výše, se dvěma výjimkami:

Farnesylproteinpyrofosfát jako donor isoprenoidu byl nahrazen protei nu byl a [³H]geranylgeranylpyrofosfátem

Ras-CVLL byl akceptor proteinu. Toto stanovení je podobné stanovení, které je popsané Casey a kol. (P..T. Casey a kol., (1991), Enzyaatic aodification of piOleins wit.h a geranyl geranyl isoprenoid, Proč. Hati. Acad. Sci, USA 88: 8631-8635.

2. Stanovení založené na buňkách: Přechodná vyznačení val^,2-Ha-Ras-CVLS a val¹²-Ha-Ras-CVLL v COS v buňkách z opičích ledvin.: VI i v inhibitorů farnesyl protein transferásy na průběh množství Ras a chorobný růst buněk indukovaný transformujícím se Ras.

Buňky v opičích ledvinách byly přeneseny elektroporacf pSV-SPORT (Gibco/BRL), který obsahuje cDNA štěp. kódovaný buď Ras-CVLS nebo Ras-CVLL. To vede k přechodnému přeznačení Ras substrátu pro farnesyl protein transferásu nebo geranylgeranyl. protein transferázu I (viz výše 1 .

Po e1ektroporaci byly buňky rozprostřeny do Misek s šest i otvory s tkáňovou kulturou, které obsahovaly 1,5 ml Dulbecco med; f ikované Eanlovy kult ivační půdy ÍGTBCO, lne. ) , která byla s ep'zorném který je r ;· *· ?.·> {. cí rn í ] Ví i topy ku 1 I. i vačnf

10% zár farnesyl prel.e i n půda odstraněn··;

! od rov í d > j :

hod i nách bv1 a

7, f, θ J ο < γ í τρ S OKO 18

Ir·-.!·.·*' Ar y . Po ^>χ,θ ?'*? t.· V .5 klíl t. i V 3 í P’°: ·'* ? P 4 r> y' ) bDv ) I či o<1 po v 4 <i?) Ί ϊ c i I Ε L k y í ,1 ovu ργ i Λ π '1° hodin rc ρΊηΡ.ΐ rn-wrr’ byly buňky zkoumán'.- pod Mikroskope?.. aby byl Monitorován chorobný růst buněk indukovaný '.r.ií:-::ÍC'.'En i ící!» se Ran, Buňky, které

Buňky, se vyznačují • 9 99 ‘

9 9 9

9 99 $0 * 5 ♦· · • 9 · φ 9··· 9 9 ·-· «

9 9

9· ·· .

9 9 9

9 99

-999 9 ' 9

9 9 • 9 99 transformujícím se Ras, jsou okrouhlejší, refraktilní a přerůstají monovrstvu, která vypadá jako transformovaný fenotyp. Buňky byly pak fotografovány, promyty dvakrát 1 ml chladného fyziologického roztoku, který byl pufrován fosforečnanem (PBS), a byly odstraněny z misky seškrabáním do 1 ml pufru, který obsahoval 25 mM Tris, pH 8.0, t mM kyseliny ethylendiamíntetraoctové, 1 mM fenylmethylsulFonyl fluoridu, mM leupeptinu a O,1 mM pepstatinu, Buňky byly štěpeny na homogenizát a buněčná tkáň byla odstraněna centrifugacS při 2000 x g po dobu 1O minut.

Buněčný protein byl sražen přídavkem ledem chlazené kyseliny trifluoroctové a znovu rozpuštěn v 100 ml SDS-pufr pro elektroforézu. Vzorky .(5-ÍOil) byly naneseny na 14% polyakrylamidové minigely (Novex,Inc.) a elektroforéza se pás barviva přiblížil ke dnu gelu byly e1ektronaneseny na nitrocelulosové membrány pro íaunodetekci.

Membrány byly vyvíjeny přes noc při 4°C v PBS, který obsahoval 2,5% sušeného mléka a 0,5% Tween-2O a pak byly inkubovány s Ras specifickou monoklonální protilátkou, Y13-259 (M.E.Furth a kol., (1982)· Monoclonal antibodies to tbe p21 produkts of transforming gene of Harvey «urine sarcose virus and of the cellular ras gene family, J. Vírol v PBS, který obsahoval 1% zárodečného telecího teplotě místnosti. Po hodinu pří teplotě protilátkou králičí anti-rat IgG při zředění konjugována s křenovou peroxidásou. Inkubace který obsahoval 1% zárodečného telecího zreagovaného a nezreagovaného Ras-CVLS nebo Ras-CVLL byly detekovány za použití kolorimetrického peroxídásového činidla (4-chlornaftol), jak je popsané výrobcem (Bío-Rad).

3. Stanovení buněčného povlaku

Normální lidské fibroblasty byly rozprostřeny v 3,5 cm miskách při hustotě 5 x 1O-⁴ buněk/misku v 2 ml růstové kultivační půdy. Byly inkubovány 3-5 dní až se dosáhlo sbíhání. Kultivační půda byla odsáta z každé misky a na vršek fíbroblastové monovrstvy pří hustotě 2 x 1O³ buněk na misku v 2 ml růstové kultivační půdy, byl umístěn indikátor probíhala aá do té doby, kdy gelu. Proteiny dělené na hod i ny př i inkubovány 1 promyt i ra í stnost i

43: 294-304), sera po dobu 1 byly membrány s sekundám í

1:5000, která je prob í ha1 a v PBS, séra. Př í t omnost rakovinných buněk T24-BAG4, lidské buňky z karcinomu močového . ·#..··.

) « • φ

».··φ φφ.'

ΦΦ Φ Φ 4 ·Φ Φ ' .4

- »'· · Φ φ· · by1y i nkubovány Stanovení byla měchýře, který se vyznačuje aktivovaným H-ras genem. Vzorek byl ponechán přes noc. Sloučeninou indukovaná inhibice kolonie byla stanovena přídavkem postupně zřeďované sloučeniny přímo do kultivační půdy 24 hodin po umístění nádorových buněk. Buňky dalších 14 dní, aby se kolonie vytvořila, ukončena vymácháním monovrstev dvakrát ve fyziologickém roztoku, který byl pufrován fosforečnanem (PBS). Monovrstvy byly fixovány 1% roztokem glutaraldehydu v PBS. Pak byly nádorové buňky zviditelněny obarvením X-Gal (J.Price a kol., Lineage analysis in vertebrate nervous systém by retrovirus-mediated gene transfer, Proč. Nati. Acad. Sci.84, 156-160 (1987)). Při stanovení inhibice kolonie byly sloučeniny hodnoceny na základě dvou IC50 hodnot: koncentrace látky nutná k zabránění růstu 50% množství nádorových buněk (tICso) koncentrace látky nutná k snížení hustoty buněk, které obsahují buněčný povlak o 50% (mICso). Obě IC50 hodnoty byly získány určením hustoty nádorových buněk a mrtvých buněk vizuálním pozorováním pod mikroskopem. Terapeutický index sloučeniny byl kvantitativně vyjádřen jako poměr mICso/tICso, s hodnotami většími než je hodnota cílové specifikace nádoru.

Další stanovení byly prováděny následujícím v podstatě stejným způsobem jako je popsán výše, pouze s náhradou indikačních nádorových buněčných řad na místo T24-BAG buněk. Stanovení byla vedena s použitím DLD-l-BAG lidských nádorových buněk tračníku, označující se jako K-ras gen lidskými nádorovými buňkami tračníku aktivovaným K-ras genem. Při použití nebo SV62O-BAG vyznačujícími se j i ných nádorových v tomto oboru známy, může být vynálezu demonstrována proti jiným jaké jsou vyjmenovány zde na buněčných řad, které jsou aktivita sloučenin z tohoto typům rakovinných buněk (takových straně 15 a 16).

4. Jemné agarové stanovení

Ra podkladu závislý růst je charakteristika tumorigenních buněčných řad. Lidské nádorové buňky byly suspendovány v růstové kultivační půdě, která obsahovala 0,3% agarosy a indikovanou koncentraci inhibitoru farnesyl transferásy. Roztokem je převrstvena kultivační půda zahuštěná 0,6% agarosy a která obsahuje tutéž koncentraci inhibitoru farnesyl

transferásy jako vrchní vrstva. Pak byla vrchní vrstva zahuštěna, plátky byly inkubovány 10-16 dní při 37°C pod atmosférou 5% COa, aby se kolonie rozrostla. Po inkubaci jsou kolonie obarveny převrstvením agaru roztokem MTT (3 - [ 4, 5-dímethy1thiazol-2-yl3-2,5-dí fenyltetrazolium brom i du (thiazolylová modř) (lmg/ml v PBS). Kolonie byly spočteny a hodnoty IC50 určeny.

Inhibice růstu 1ídských nádorových buněk jemným agarovým stanovením

Jemné agarové stanovení bylo prováděno se sloučeninou vzorku 10 a následujícími nádorovými buněčnými řadami: K ras NIH 3T3,

HTB 175 (SCLC)

HTB 183 (NCI

H ras NIH 3T3, HTB 177 (NSCLC) (NCIH146)(SCLC) ras autac. neurčena, ras mutace neurčena, H661) (NSCLC) ras

K ras mutace, HTB 173 A549 (plíce) K ras mutace, HTB 119 (NCI H69) (SCLC), mutace neurčena, HPAF II (pancreas) K ras mutace, MCF-7 (prs) ras mutace neurčena, HBL

100 (prs) ras neurčena, MBA mutace MB 468 neurčena, (prs) raí

Bu4475 mutace (prostata) ras mutace neurčena, MBA MB453

PC3 (prostata) (prs) ras mutace neurčena, DU 145 (prs), BT474 (prs), mutace a AsPc-1

BLB 1 (tračník) (pancreas) K ras mutace. Ras mutace byla určena KLISA (oncogene Science) . ICso ( juM) pro každou buněčnou řadu byl v rozsahu O, 04 až 3,O.

Jemné agarové stanovení bylo prováděno se sloučeninou vzorku 18 a následujícími buněčnými řadami: K ras NIH 3T3, H ras NIH

V

3T3, HBT 177 (NSCLC) K ras mutace, A549 (plíce) K ras mutace a HTB 175 (SCLC) ras mutace neurčena. Ras mutace byla určována ELISA (Oncogene Science). ICso (yM) bylo v rozmezí 0,175 až 0,8.

ras pro každou buněčnou řadu

Výsledky^:

1. Enzymologie

Bata demonstrují, že sloučeniny inhibitory Ras-CVLS farnesylace částečně protein transferásou z krysího mozku CFPT) že tyto sloučeniny je možné považovat tohoto vynálezu jsou čištěnou farnesyl Data také ukazu j ί, za velmi účinné (IC₅o<<0,1 jjM) inhibitory Ras-CVLS farnesylace částečně

Čištěným krysím mozkem FPT.

Data také demonstrujί,že sloučeniny 2 tohoto vynálezu jsou horší inhibitory geranylgeranyl protein transferásy (GGPT), stanoveno za použití Ras-CVLL jako akceptoru isoprenoidu. Tato selektivita je důležitá pro terapeutický účinek sloučenin použitých ve způsobech z tohoto vynálezu. Roste možnost, že sloučeniny budou mít vlastnosti jako selektivní inhibitory růstu proti buňkám transformovaným Ras.

2. Stanovení COS buněk založené na buňkách

Analýza Ras proteinu vyznačeného v COS buňkách, které jsou transformované Ras a následující působení tricyklických inhibitorů farnesyl protein transferásy indikuje, že tyto látky inhíbují vývoj Ras-CVLS, což vede k akumulaci nezřeagovaného Ras (viz Tabulka 3). Sloučenina z příkladu 2, například, inhibuje vývoj Ras-CVLS s ICsohodnota®i 0,025 μΜ, ale neblokuje geranylgeranylaci Ras-CVLL při koncentracích až do 33 μΜ.

Tyto výsledky poskytují důkaz pro specifickou inhibici farnesyl protein transferásy, ale ne geranylgeranyl transferásy I sloučeninami z tohoto vynálezu v neporušených buňkách. Také indikují možnost, že tyto látky přicházejí v úvahu k blokováni buněčných transformací aktivovanými Ra® onkogeny.

3. Stanovení buněčného povlaku založené na buňkách

Tricyklické inhibitory farnesyl protein transferásy z tohoto vynálezu také inhibují růst nádorovývh buněk transformovaných Ras ve stanovení povlaku bez vykázání cytotoxické aktivity proti normální monovrstvě.

In vivo anti-tumor studie

Nádorové buňky (od 5x 10⁵ do 8 χ 10⁶) DLD-1 (lidské nádorové buňky tračníku), ATCC slabin 5-6 týdenních o,d Zvířata, která nesla nádor,

CCL 221) byly naočkovány podkožně do athymických nu/nu myší (samic), byla vybrána a randomizována, když byl nádor potvrzen.

Zvířata byla léčena pouze nosičem (beta-cyklodextrin pro i.p. nebo kukuřičný olej pro p.o.) nebo nosičem se sloučeninou tohoto vynálezu čtyřikrát denně (QID) po 7 dní v týdnu 4 týdny. Procenta inhibice růstu nádoru byla .: :

0 0 0 0

............. ........ · . · ' ' ·« 0' ’ · ' určena relativně k působení nosiče měřeními nádoru.

Průměrná % inhibice nádoru pro každou sloučeninu z příkladů

1, 2, 4, 5, 6, 7, 7A, 8B, 9, 1O, UA, 11B, 12B, 13, 14A, 16B a 18 byla v rozmezí od 7 do 50% pro dávku 10 mg/kg po. a v rozmezí od 35,4 do 83 pro dávku 50 mg/ kg p.o.

0' > «

0

Pro přípravu farmaceutických prostředků ze sloučenin z tohoto vynálezu se používají inertní, farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou buď tuhé nebo kapalné. Pevná forma prostředků zahrnuje prášky, tablety, disperzibilni granule, kapsle, oplatky a čípky. Prášky a tablety obsahují od 5 do 70% aktivní složky. Vhodné tuhé nosiče, které jsou v tomto oboru známy, jsou např. uhličitan hořečnatý, stearan hořečnatý, talek, cukr, laktosa. Tablety, prášky, oplatky a kapsle se používají jako pevné dávkovači formy vhodné pro orální podávání.

Pro přípravu čípků se používá nízko tající vosk, stejně jako směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaové máslo. Tyto složky se nejprve taví, pak se v nich za míchání homogenně disperguje aktivní složka. Roztavená homogenní směs se pak nalije do forem běžné velikosti a zde se nechá ztuhnout.

Kapalné formy prostředků zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad uveďme vodu nebo roztoky voda-propy1englyko1 pro parenterální injekce.

Kapalné formy prostředků zahrnují také roztoky pro intranasálni podávání.

Aerosolové prostředky vhodné pro inhalaci zahrnují roztoky nebo tuhou složku ve formě prášku, které jsou v kombinací

V s farmaceuticky přijatelným nosičem jako je inertní stlačený plyn.

Dále jsou zde zahrnuty tuhé formy prostředků, které se krátce před použitím převádějí na kapalnou formu prostředků pro orální nebo parenterální podávání. Takové kapalné formy zahrnují roztoky, suspenze a emulze.

Sloučeniny z tohoto vynálezu jsou také aplikovány transdermálně. Transdermální prostředky jsou ve formě krémů, mlék, aerosolů a/nebo emulzí. Lze je trasdermálně aplikovat z matrice nebo z typu zásobníku, který je běžný v tomto oboru pro danné úče1y.

S výhodou jsou sloučeniny podávány orálně.

S výhodou je farmaceutický prostředek v jednotkové dávkové ·· 99 99 ·· • · · · * « · • ·· · · ·· • 9 9 -9.09 .--:.9 9 9 9 · • · · · · ♦ · »t ·' · · '· ·'·< ··

formě. V takové formě, áe prostředek je rozdělen na jednotkové dávky, ketré obsahují dostačující množství aktivní složky, t.j. účinné množství, kterým se dosáhne požadovaného účelu.

Množství aktivní sloučeniny v jednotkové dávce prostředku může být různé nebo je nastaveno od 0,1 mg do ÍOOO mg, výhodněji od 1 mg do 300 mg, podle aplikace.

Aktuální dávka je různá v závislosti na požadavcích pacienta a na vážnosti stavu, který je léčen. Určení správné dávky pro určitou situaci je odborníkovi v tomto oboru zřejmé. Obecně se léčení začíná s menšími dávkami, které jsou menší než optimální dávka sloučeniny. Potom se dávka zvyšuje pomalých přírůstcích až do optimálního účinku za danných okolností. Výhodně je celková denní dávka rozdělena a podávána po částech během dne, je-li potřeba.

Množství a frekvence podávání sloučenin z tohoto vynálezu a jejích farmaceuticky přijatelných solí je regulováno podle tivahy ošetřujícího lékaře vzhledem k takovým faktorům, jako je věk, kondice a velikost pacienta stejně jako vážnost symptomů, které jsou léčeny. Typický doporučený dávkový režim je orální podávání od 10 mg do 2000 mg/den, s výhodou od 1O do ÍOOO mg/den ve dvou nebo čtyřech dávkách, aby se zablokoval růst nádoru. Sloučeniny jsou netoxické, jestliže se podávájí v tomto rozmezí dávek.

Následují příklady farmaceutických dávkových forem, které obsahují sloučeninu z tohoto vynálezu. Rozsah vynálezu zahrnuje aspekt farmaceutický prostředek, který není vymezen poskytnutými př í k1ady.

Farmaceutické dávkové formy -příklady Příklad A Tablety

č. Složky mg/tableta mg/tableta aktivní složka laktosa USP kukuřičný škrob, potrav, kvalita jako 10% pasta v čištěné vodě

1OO 500

122 113 fl.· » « • · • fl « > · · r fl <

··· · • · ·· «

4. 5.	kukuřičný škrob potrav, kvalita stearan hořečnatý	45 3	40 7
	Ce1kově	300	700
Způsob	př í pravý
Složky číslo 1 a 2 se mísí ve	vhodném m í s i č i	10-15 minut.
S1ožkou	č. 3 se směs granuluje. Vlhké granule se	rozdrti přes
hrubé česle (např. 1/4,O,63 cm),	je-li potřeba.	Vlhké granule
se suš í	. Sušené granule se třídí,	jestliže je potřeba, a mísí
se složkou č.4. Mísí se 10-15 minut. Přidá se	s1ožka č. 5
a mísí	se 1-3 minuty. Směs se	st1 ač í na vhodnou ve1 i kost
a zpracuje na vhodném tabletovacím	stroj i.
	Příklad	B
	Kapsle
č.	Složka	mg/kaps1e	mg/kaps1e
1 .	akt i vn í s1oučeni na	ÍOO	500
2.	1 aktosa USP	106	123
3.	kukuř i čný škrob	40	60
	potrav, kvalita
4.	stearan hořečnatý NF	7	7
	Ce1kově	253	700

Způsob př í pravý

Složky č. 1,2a 3 se mísí ve vhodném misiči 10-15 minut.

Přidá se složka č.4 a mísí se 1-3 minuty. Směs se naplní do vhodných stroj i na dvoudílných tvrdých výrobu kapslí.

želat i nových kapslí na vhodném

Protože tento vynález byl popsán ve shodě se specifickými složeními, které jsou uvedené výše, odborníkovi je zřejmé množství alternativ, modifikací a variací. Všechny takové alternativy, modifikace a variace jsou uvažovány, že spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

•· > ' · .·* ' . «'«. ' e - ?.'«« • · · · « 9 9 9 · 9 9 9 9 9

Tabulka 1 - inhibice FPT

VZOREK	FPT ICso (raM)	VZOREK	FPT ICso (mM)
1	<0.034	2	0.010 0.016
4	O. 046	16A	0.026 0.032
16B	0.038 0.023	11B	>0.095
15	0. 022	7	0.012
8	0.021	11A	0.0018 0.0021
5	0.0023	12B	0.0025
9	0.0013	10	0.0019
7B	<0.003	8B	0.013
14A	0.0026	14	0.062
13A	0.078	13	0.005
5A	> 0.099	7A	>O. 1
8A	> 0.094	10A	>0.094
9A	>0.088	6	0.0031
11	0.002	5B	0.003
12A	> 0.094	13B	0.005
14B	0.005	5.HCl sůl	0.0038
14A.HC1 sůl	<0.0031	9B	0.003
1OB	0.003	17	0.043
17A	0.048	18	0.0031
19 21	<0.0038 0.0084	20	0.0062

'· · •φ·· · ·· » · ·' · <

ι · · Φ • φ φ · « • « 1 ·· ··

Tabulka 2

SrovnáníFPT inhibice a GCPT inhibice

VZOREK

INHIBICE enzymu

FPT ICsomM

INHIBICE enzymu

GCPT ICbo mM

5B

16A

16B

11A

14A

7B

8B

0.010

0.016

0.046

0.003

0.032

0.026

0.038

0.023

0.012

0.0018

0.0021

0.0013

O.0023

O.0026

0.005 <0.003

0.013

0.0031

O.0062 >300 >35.7 >300 >38 >76 >300 >66 >59 >66 >62 >63 >66 >60 >50 >38 · « '· ·· 00 ' 00 · 0· '

0 0 ..·': ·.:····· 0 ·. 0 0 · · · . 0 0 0 ' · . 0 .·«·.·: .'0 , 0 0* , 0 : · · ·

00000 0000 · 0 0000 · . 0. ... 0: ,...-...0. .::.,0 9-..9 · · . · '000' ·0 0 0. '00 0 · 0 ·

Tabulka 3

Aktivita v COS buňkách

Vzorek

Inhibice vývoje Ras

ICsoCuM)

Vzorek

Inhibice vývoje Ras

ICsoCuM)

8	<025	2	O.25
1.5	0.60	16A	O. 5
7	0. 125	11	<0.25
1O	<0.025	10A	2.0
12B	<0.025	12A	0.95
11A	<0.025	1 1B	2.25
5	0.098	14A.HC1	0015
13	0. 420	9	0.010
7B	0.025	8B	O. 280
9A	0.85	5. HCI	0.010
5A	5.0 1.0	14A	0.480
14	>1.0	13A	>1.0
7A	>1.0	8A	>1.0
17	0.350	17A	0.500
14B	0.045	6	O. 040
18	0.025	19	0.045
20	0.030	21	0.42

4. * • 4 .4 4 .. 44 . ·,4 4 / • 4 4 · . 4 :--4: *4 ,:44 4-44 4 .4' 4 * !« 4 4 4 44 4 « --.4 * 4 4 4 4 4

4« 4 4 ' . »4.......4 .4

Tabulka 4

Inhibice růstu nádorových buněk Stanovení buněčného povíaku

Vzorek	Nádor (T-24) ICsoí/iM)	Nádor* (DLD-1> ICsoíjjM)	Nádor (SW620) ICsoC JJM)	Normální ICso (pM)
1	<1.6		- -	>25
4	3. 1			>25
7	<1.6	<1.6	6.25	>25
5B	<1.6	3. 1	1O	>25
13B	<1.6	3 1	>3. 1	25
11B	<1.6	8	18	>25
9 A	<1.6	12.5	12.5	18
10A	<1.6	2.0	1.6	8
5	<1.6	3. 1	6.25	>25
14A	<1.6	6.25	12.5	>25
13A	3.1	6.25	6.25	>25
7B	<1.6	i . 6	3. 1	>25
8A	<1.6	<1.6	3. 1	>25
2	<1.6	6.25	6. 25	>25
16B		6.25	25	>25
8	<1.6	3. 1	3. 1	>25
15	3. 1	6.25	>6.25	>25
11A	<1.6	<1.6	>6.25	>25
9	<1.6	<1.6	6.25	>25 v
1O	<1.6	<1.6	3.1	>25
12A	<1.6	2. 0	4	>25
5A	12.5	12.5	>25	>25
14	<1.6	6.25	>12.5	>25
13	<1.6	3. 1	>1.6	>25
8B	<1.6	<1.6	3. 1	>25
17	1.6	6.25	25	>25
17A	3. 1	4	18	>25
10B	<1.6	1.6	1.6	>25
12B	<1.6	3. 1	6.25	>25
7A	<1.6	1.6	3. 1	>25
6	<1.6	4.0	6.24
19	<1.6	<1.6	6. 25	>25

• · « · * . 9»

9 99 9 .9 ·♦ ·«.

« · . 0 0 · ♦ 0 ♦ * • «0 0 ·

0 1 ·* 00

Průmyslová využité! nost '

Sloučeniny z tohoto vynálezu se používají v famiaceutických prostředcích pro léčbu proliferativních chorob a nádorových onemocnění.

Claims (15)

1. P A T E N T O V É N ÁR OKY

   1. Sloučenina, která je vybraná ze skupiny, která se skládá z- • 9

   99*9 9 9 ··

   9 . 9 9 '· .9:

   • .· · · 99

   9 9 9 9 9'

   9 9 9 9 ''-99 9 9

   I 9 99

   99999 9

   9 9 9

   99 99

   9 9 9.9

   9 9 9 • ··.»·

   Br

   9·'.: 9 9'9 9' • 9999 ' 9 999 ··' 99 9 9 .·

   9 9 9 9 \9 *·.··

   999 · 9

   9 9 9

   99 99

   Br (+) -enantiomer

   Br (-) - enantiomer (+) - enantiomer

   Br

   O (-) - enantiomer • 0· '

   00 00 ·· 0 0 »* 00

   ί.Λ 0-0 · • 0 0« 0 0 00 • ·> 0 0 · · 0 ·#· · - 0.

   0 0 0 0 0 0 0'

   00 . 00 · · .00- .-00 :· ' θ' θ'

   00 .. 00 ' , 0· »· 0 ' 0 4' · 0 0 · 0 0.

   ·. 0 ' ..0 00 0 · 0 0« -.

   0.0 '0 0. 0 0 000,0 ' ' 0 0 0 0 0 0 0 0 * 0 00 00 00 '00 ' ' • 000

   100 φ φ • •ΦΦ 'φ φ ΦΦ Φ· . φ φ ' '·· ·' \ .· : Φ .· Φ. φ . Φ ' Φ · · · ·· · Φ .·: 9 99 • ·Φ· φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ · · ·· ·«..·. :· .. φ,.φ. .. · .

   Φ ·Φ ···· ··

   Ο ο

   o těchto sloučenin nebo farmaceuticky přijatelných solí
2. 2. Sloučenina podle která se skládá z^: vybrána ze skupiny, nároku ί, která je ··

   103 • ·· · ··· • · · · ···· · · · · • · · · • · ·* ·· ··

   ·.·. • · · · • · • · ··· · · • · · ·

   ·.· ·· »·

   Br racemát

   104 racemát

   105 •' · • ·· · ··· ·

   Br (+) - enantiomer

   106

   Br (+) - cnantioiner (-) - enantiomer . (-)-enantiomer

   107 • · • · · · · · · · ··· · • - · .....

   ·· «4 (+)-enantiomer (-) - enantiomer (+) - enantiomer

   108

   109 • · o

   110

   111 • ·

   112 ' · 0 0·'··· -00- • 0 0'..··· ♦ 0. 00' . 0*0 0 0 • 0 0 • · · ·
3. 3. Sloučenina podle nároku 1 která se skládá z= která je vybrána ze skupiny,

   Br Br (-) - enantiomer and

   113

   9 * · 9 9 • 9 9 ·. « 9 9 9:

   ♦ 9 «

   9 9« ··' ··
4. 4, Sloučenina podle která se skiádá z nároku 1; která je vybrána ze skupiny.

   O o
5. 5.

   Br

   115

   Φ ·φ

   Φφφφ • *· φφ » φ φ φ » φ φφ.

   • φ « φ φ « ,·φφ φφ φφ. · » « φ φ » φ φφ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ
6. 6. Sloučenina podle se skládá ζ· nároku 5,která je vybrána ze skupiny, která

   Sloučenina podle nároku 5, která má strukturní vzorec:

   8.

   Sloučenina podle nároku 5 která má strukturní vzorec:

   ze skupi ny,
7. 11. Farmaceutický prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nos i čem.
8. 12. Použití sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až 1O pro přípravu léčiva pro inhibici farnesyl protein transferásy.
9. 13. Použití sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až 1O pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny pankreatu, plic, myeloidní leukémie, thyroidní rakoviny folikula, mye1odysplastického syndromu, epidermálních nádorů.

   nádoru močového měchýře, ·· • · ···· · · · · ♦ · ···'·' · ‘ ·*·· ···

   117 ·· » *· ' ·. · ·<

   • · 4 • · 4 ·· ·· ·· «· rakoviny tračníku, rakoviny prsu nebo rakoviny prostaty.
10. 14. Použití sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až 1O pro inhibici farnesyl protein transferásy u pacientů, kteří takovou léčbu potřebují, která zahrnuje podávání účinného množství sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 1 až 1O.
11. 15. Použití sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 léčení rakoviny pankreatu, rakoviny plic, ayeloidní thyroidní rakoviny foli kul a, myelodysplastického epidermálního karcinomu, karcinomu močového měchýře, tračníku, rakoviny prsu nebo rakoviny prostaty u kteří takovou léčbu potřebují, které zahrnuje podávání množství sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až 10.

    až 1O pro 1eukemi e, syndromu, rakov i ny pacientů, úč i nného
12. 16. Použití sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až přípravu léčiva pro inhibici abnormálního růstu buněk.

    10 pro
13. 17. Použiti sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až 1O pro přípravu léčiva pro inhibici abnormálního růstu buněk, kde inhibované buňky jsou nádorové buňky, které se vyznačují aktivovanými ras onkogeny.
14. 18. Použití sloučeniny podle jakéhokoli z nároků 1 až 1O pro přípravu léčiva pro inhibici abnormálního růstu buněk, kde jsou inhibované buňky, ve kterých je Ras protein aktivován jako výsledek onkoqenní mutace v jiných genech než je Ras gen.
15. 19. Použití sloučeniny podle nároku 11 pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny pankreatu, rakoviny plic, ayeloidní leukeraie, thyroidní rakoviny foli kul a, aye1odysplastického syndromu, epidermálního karcinomu, karcinomu močového měchýře, rakoviny tračníku, rakoviny prsu nebo rakoviny prostaty.