CZ20001680A3 - Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, a způsoby přípravy inulinu s dlouhým řetězcem - Google Patents
Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, a způsoby přípravy inulinu s dlouhým řetězcem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20001680A3 CZ20001680A3 CZ20001680A CZ20001680A CZ20001680A3 CZ 20001680 A3 CZ20001680 A3 CZ 20001680A3 CZ 20001680 A CZ20001680 A CZ 20001680A CZ 20001680 A CZ20001680 A CZ 20001680A CZ 20001680 A3 CZ20001680 A3 CZ 20001680A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- nucleic acid
- inulin
- cells
- fft
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 73
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 title claims abstract description 69
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 title claims abstract description 69
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 title claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108010042889 Inulosucrase Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 title description 11
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 155
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 94
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 claims description 19
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 claims description 18
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 16
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 13
- 229920002670 Fructan Polymers 0.000 claims description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- VAWYEUIPHLMNNF-OESPXIITSA-N 1-kestose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VAWYEUIPHLMNNF-OESPXIITSA-N 0.000 claims description 7
- GIUOHBJZYJAZNP-DVZCMHTBSA-N 1-kestose Natural products OC[C@@H]1O[C@](CO)(OC[C@]2(O[C@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUOHBJZYJAZNP-DVZCMHTBSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- VAWYEUIPHLMNNF-UHFFFAOYSA-N kestotriose Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OCC1(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(O)C(O)C(CO)O1 VAWYEUIPHLMNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 claims 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 claims 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 claims 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 11
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 6
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 6
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 3
- 101150108309 ftf gene Proteins 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- ZFTFOHBYVDOAMH-XNOIKFDKSA-N (2r,3s,4s,5r)-5-[[(2r,3s,4s,5r)-5-[[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-2-(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 ZFTFOHBYVDOAMH-XNOIKFDKSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODEHMIGXGLNAKK-OESPXIITSA-N 6-kestotriose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 ODEHMIGXGLNAKK-OESPXIITSA-N 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 2
- 235000005255 Allium cepa Nutrition 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 2
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- QNTKVQQLMHZOKP-NEJDVEAASA-N (2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-2-[[(2r,3s,4s,5r)-2-[[(2r,3s,4s,5r)-2-[[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]- Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QNTKVQQLMHZOKP-NEJDVEAASA-N 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 241000209134 Arundinaria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000115658 Dahlia pinnata Species 0.000 description 1
- 235000012040 Dahlia pinnata Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 241000588694 Erwinia amylovora Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- 244000172809 Leuconostoc cremoris Species 0.000 description 1
- 235000017632 Leuconostoc cremoris Nutrition 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- FLDFNEBHEXLZRX-DLQNOBSRSA-N Nystose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FLDFNEBHEXLZRX-DLQNOBSRSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000209049 Poa pratensis Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000018519 Scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 241000189131 Scolymus Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000194024 Streptococcus salivarius Species 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 101150025711 TF gene Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000008848 allosteric regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 235000021311 artificial sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000009109 downstream regulation Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940004208 lactobacillus bulgaricus Drugs 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- FLDFNEBHEXLZRX-UHFFFAOYSA-N nystose Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OCC1(OCC2(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(C(O)C(CO)O2)O)C(O)C(O)C(CO)O1 FLDFNEBHEXLZRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920000157 polyfructose Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- -1 rice Chemical compound 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000004557 technical material Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, a způsoby přípravy inulinu s dlouhým řetězcem
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají enzymatickou fruktosyltransferázovou (FFT) aktivitu. Dále se tento vynález týká vektorů obsahujících takové molekuly nukleové kyseliny, jakož i hostitelských buněk transformovaných popsanými molekulami nukleové kyseliny, zejména rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin. Kromě toho jsou ve vynálezu popsány způsoby produkce transgenních rostlin, které syntetizují inulin s dlouhým řetězcem díky zavedení molekul DNA kódujícím FFT. Předkládaný vynález se také týká způsobů přípravy FFT a produkce inulinu s dlouhým řetězcem v různých hostitelských organismech, zejména rostlinách, a také způsobů in vitro produkce inulinu s dlouhým řetězcem pomocí FFT podle vynálezu. Předkládaný vynález se dále týká hostitelských buněk a také inulinu, který lze připravit způsobem podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
Lineární, ve vodě rozpustné polymery mají velmi široké spektrum aplikací, například jich lze užít ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentů, jako suspendačních činidel nebo pro urychlení sedimentačního procesu a pro komplexování, ale také pro vázání vody. Polymery na bázi sacharidů, například fruktosylové polysacharidy, jsou obzvláště zajímavé materiály, protože jsou biologicky odbouratelné (biodegradovatelné).
Kromě jejich využití jako obnovitelné suroviny pro průmyslovou produkci a zpracování, jsou fruktosylové polymery také zajímavé jako potravinová aditiva, například jako umělá sladidla. Pro různé aplikace jsou potřeba polymery s různou délkou řetězce. Zatímco polymery s krátkým nebo středně dlouhým řetězcem jsou výhodné v potravinářském průmyslu, polymery s vysokým stupněm polymerizace (DP) jsou užitečné pro technické účely, jako je např. výroba surfaktantů.
Doposud byly popsány pouze způsoby produkce fruktanových polysacharidů s dlouhým řetězcem v rostlinách pomocí exprese enzymu fruktosyltransferáz bakteriálního původů. Většina bakteriálních fruktosyltransferáz syntetizuje levan, fruktosylový polymer vázaný β-2,6 vazbou, který má četné β-2,1 větvení. Toto větvení představuje z technického hlediska značnou nevýhodu a proto je levan jakožto technický materiál podstatně méně významný než inulin.
Dosud je znám pouze jeden bakteriální gen, jehož produkt se účastní syntézy inulinu, a sice gen ftf ze Streptococcus mutans. V principu je možné exprimovat gen v rostlinách, pokud by byl získán a upraven metodami genového inženýrství. Avšak výtěžek inulinu z transgenních rostlin je tak nízký, že ekonomicky výhodné využití takových transgenních rostlin nepřipadá v úvahu.
Dále je také znám způsob přípravy transgenních rostlin exprimujících fruktosyltransferázy z Helianthus tuberosus. Exprese těchto genů v transgenních rostlinách vede k tvorbě inulinu s průměrným stupněm polymerizace DP = 6 až DP = 10. Polymery s tímto stupněm polymerizace nelze považovat za inulin s dlouhým řetězcem. Inulin s průměrným stupněm polymerizace DP = 6 až DP - 10 však není vhodný pro většinu technických aplikací.
Způsoby produkce inulinu s dlouhým řetězcem v rostlinách nebo způsoby přípravy vhodných enzymů pro syntézu inulinu nejsou dosud známy.
Patentová přihláška PCT/US89/02729 popisuje možnost tvořit cukerné polymery, zejména dextran nebo polyfruktózu, v transgenních rostlinách, obzvláště v plodech transgennich rostlin. Pro přípravu takových modifikovaných rostlin se navrhovalo použití levansacharózy z mikroorganismů, konkrétně z Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius a Bacillus subtilis, nebo dextransacharózy z Leuconostoc mesenteroides. Avšak ani produkce aktivních enzymů, ani levanu či dextranu a ani příprava transgenních rostlin nebyly popsány. Patentová přihláška PCT/EP93/02110 popisuje způsob produkce transgenních rostlin exprimujících gen lsc levansacharázy z gram-negativní bakterie Erwinia amylovora. V patentové přihlášce PCT/NL93/00279 je popsána transformace rostlin majících chimérické geny, které obsahují gen sacB z Bacillus subtilis nebo gen ftf ze Streptococcus mutans. Transgenní rostliny exprimující gen SacB tvoří rozvětvený levan. Transgenní rostliny exprimující gen ftf syntetizují vysokomolekulární inulin, avšak výnos je tak nízký, že ekonomické využití nepřichází v úvahu.
Patentová přihláška PCT/NL96/00012 popisuje sekvence DNA kódující enzymy syntetizující cukerné polymery a produkci transgenních rostlin s pomocí těchto sekvencí DNA. Popisované sekvence pocházejí z Helianthus tuberosus. Podle dokumentu PCT/NL96/00012 jsou popsané sekvence vhodné nejenom k modifikaci fruktanového profilu například petúnie a brambory, ale také samotné Helianthus tuberosus. Když se v transgenní rostlině exprimuje gen SST a FFT, může se tvořit inulin. průměrný stupeň polymerizace inulinu je však v rozmezí PD = 6 až PD = 10. produkce vysokomolekulárního inulinu není možná způsoby, které byly popsány v PCT/NL96/00012. Přihláška
PCT/EP97/02195 popisuje způsob přípravy transgenních rostlin tvořících inulin pomocí genu f tf ze Streptococcus mutans. Výtěžek vysokomolekulárního inulinu je však nízký, jak tomu bylo i u rostlin popsaných v přihlášce PCT/NL93/00279. Přihláška DE 197 08 744.4 popisuje produkci inulinu s krátkými řetězcem pomocí enzymu, který vykazuje fruktosylpolymerázovou aktivitu. Inulin s krátkým řetězcem lze připravit v transgenních rostlinách. Výtěžek inulinu s krátkým řetězcem je velký a u brambor odpovídá buněčnému obsahu sacharózy. Produkce inulinu s dlouhým řetězcem však nebyla popsána.
Syntéza inulinu u rostlin byla důkladně zkoumána (Pollock a Chatteron, Fructans, The biochemistry of Plants, Vol. 14, 1988, Academie Press, str. 109-140. Avšak přirozeně se v rostlinách vyskytující inulin je inulin s krátkým řetězcem s maximálním stupněm polymerizace přibližně DP = 35 (viz Pollock a Chatteron, výše). Syntéza a metabolismus fruktanú v rostlinách vyžadují aktivitu alespoň třech enzymů: sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze (SST), která tvoří trisacharidovou kestózu, fruktanfruktosyltrnasferázy závislé na fruktanu (FFT), která přenáší fruktosylový zbytek z fruktanových molekul s nejmenším stupněm polymerizace DP = 3 (kestóza) na sacharózu a vyšší řruktany, a fruktanexohydrolázy (FEH), která odstraňuje fruktózové zbytky z fruktanových molekul. Není známo, zda rozdíly v průměrné molekulové hmotnosti inulinu z různých rostlinných druhu, např. 2 x 10J v případě Allium cepa a 5 x 10' v případě Helium tuberosum, vycházejí z rozdílných vlastností jejich SST, FFT a FEH.
Z tohoto důvodu není možné vzhledem k současným znalostem týkajících se syntézy inulinu u rostlin identifikovat vhodné DNA. sekvence, jejichž pomocí by mohl být syntetizován vysokomolekulární inulin v rostlinách v ekonomicky zajímavých množstvích.
Proto je cílem předkládaného vynálezu poskytnout molekulu nukleové kyseliny a způsoby, které umožní připravit geneticky modifikované organismy, zejména rostliny, schopné tvořit inulin s dlouhým řetězcem.
Výše zmíněný problém je řešen předkládaným vynálezem, který je popsán pomocí následujících příkladů provedení a definován patentovými nároky.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají enzymatickou aktivitu FFT a jsou vybrány ze skupiny obsahující
a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence identifikačního čísla (i. č.) 2 a v sekvenci i. č. 4,
b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence i. č. 1 nebo i. č. 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,
c) molekuly nukleové kyseliny hybridi zující za stringentních podmínek s komplemetárním řetězcem molekul nukleové kyseliny uvedených v a) nebo b) , a
d) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotidové sekvence uvedené v a) , b) nebo c) .
Ve smyslu předkládaného vynálezu se rozumí, že enzym mající fruktosyltransferázovou aktivitu (FFT) je protein, který je schopný katalyzovat vznik β-2,1-glykosidické a/nebo β-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami. Fruktosylový zbytek, který má být přenesen, může pocházet z 1-kestózy nebo fruktanového polymeru.
Vysokomolekulárním fruktosylovým polymerem se ve smyslu předkládaného vynálezu rozumí molekula obsahující v průměru více než dvacet, výhodně více než 25 a ještě výhodněji nejméně fruktosylových zbytků. Navíc se ve smyslu předkládaného vynálezu vysokomolekulárním fruktosylovým polymerem rozumí molekula obsahující v průměru méně než 3000, výhodněji méně než 300 a zvláště výhodně méně než 100 fruktosylových zbytků. Fruktosylové zbytky jsou spojeny buď β-2,1- nebo β-2,6glykosidickou vazbou. V případě inulinu jsou zbytky obecně navázány β-2,1-glykosidickými vazbami. V malé míře se vyskytují také β-2, 6-glykosidické vazby, v méně než 5 %, výhodně méně než ve 3 %, výhodněji méně než v 1,5 i a nej výhodněji méně než v 0,5 i. Fruktosylový polymer může nést na svém konci glukózový zbytek, který je spojen prostřednictvím OH skupiny na atomu C-l glukózy a OH skupiny atomu C-2 fruktosylového zbytku. V takovém případě fruktosylový polymer obsahuje také molekulu sacharózy.
Překvapivě bylo zjištěno, že během exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v transgenních rostlinách se tvořila velká množství inulinu. Inulin tvořený v rostlinách měl průměrný stupeň polymerizace zřetelně vyšší než DP = 20. To bylo neočekávané, neboť podobný enzym z Helianthus tuberosus se podílí na syntéze inulinu s průměrným stupněm polymerizace nižším než DP = 20 v transgenních rostlinách (viz PCT/NL96/00012).
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být jak DNA, tak RNA molekuly. Vhodné molekuly DNA jsou například molekuly genomové DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, výhodně artyčoku, nebo mohou být syntetizovány pomocí známých metod.
Prostřednictvím obvyklých molekulárně biologických metod je možné (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavést do molekul nukleové kyseliny vynálezu odlišné mutace, což vede k tomu, že takto je možné syntetizovat proteiny s modifikovanými biologickými vlastnostmi. Na jedné straně je tu možnost vytvářet deleční mutanty, kdy se tvoří molekuly nukleové kyseliny postupujícími delecemi od 5'- nebo 3'-konce kódující sekvence DNA. Tyto nukleové kyseliny pak poskytují syntézu proteinů, které jsou adekvátně zkráceny. Takovými delecemi na 5'-konci nukleotidové sekvence je například možné identifikovat aminokyselinové sekvence, které jsou odpovědné za translokaci enzymu v plastidech (transitní peptidy). To umožňuje specifickou produkci enzymů, které díky odstranění příslušných sekvencí nejsou již nadále lokalizovány ve vakuolách, ale v cytosolu, nebo které jsou díky připojení dalších signálních sekvencí lokalizovány v jiných kompartmentech.
Na druhé straně další možností je zavedení bodové mutace na pozice, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivňuje např. enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být například tvořeny mutanty, které mají změněnou hodnotu Km nebo které již nadále nepodléhají regulačním mechanismům, které normálně v buňce existují, jako jsou např. alosterické regulace nebo kovalentní modifikace.
Kromě toho mohou být tvořeny mutanty, které vykazují změněnou substrátovou specificitu nebo specificitu pro produkt. Mohou být také tvořeny mutanty, které vykazují změněný profil aktivita-teplota.
Pro manipulaci v prokaryotických buňkách metodami genetického inženýrství mohou být molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo části těchto molekul zavedeny do plazmidů umožňujících mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací sekvence DNA. Prostřednictvím standardních metod (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) se mohou zaměňovat báze a mohou být přidávány přirozené nebo syntetické sekvence. Aby se fragmenty DNA navzájem spojily, mohou k nim být přidány speciální adaptační nebo spojovací sekvence - adaptéry nebo spojky (linkery). Mimoto se mohou provádět manipulace, které poskytují vhodná štěpná místa nebo které odstraňují přebytečnou DNA nebo nadbytečná štěpná místa. Jsou-li možné inzerce, delece nebo substituce, může se provádět in vitro mutageneze, náhrada pomocí primeru, restrikce nebo ligace. Jako metody analýzy se obvykle používají sekvenční analýza, restrikční analýza a další biochemické nebo molekulárně biologické metody.
Termín „hybridizace má ve smyslu tohoto vynálezu význam hybridizace za obvyklých hvbridizačních podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak je například popsáno v Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Příkladem hybridizace ve stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných takto: 50% formamid, 5x SSC, 5x Denhardtův roztok, 40mM fosforečnan sodný pH 6,8, 0,5% (hmot./objem) BSA, 1% (hmot./objem) SDS, 0,1 mg/ml DNA ze spermatu sleďů, a to při 42 °C. Příkladem obvyklé hybridizace v non-stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných stejně jako předchozí, kromě toho, že místo 50% je užit 30% formamid. Promývací podmínky jsou v případě stringentních podmínek výhodně 0,5x SSC/0,5% SDS při 60 °C a v případě non-stringentních podmínek výhodně 2x SSC/0,5% SDS při 56 °C.
Molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být izolovány např. z genomových nebo cDNA knihoven, které byly připraveny z odpovídajících organismů, např. z artyčoku.
Aby se identifikovaly a izolovaly takové molekuly nukleové kyseliny, mohou být použity molekuly vynálezu nebo části těchto molekul nebo reverzní komplementy těchto molekul, » · %, 95 %, 97 % a 99 % například prostřednictvím hybridizace pomocí obvyklých metod (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Jako hybridizační sonda mohou být například použity molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukleotidová sekvence je zcela shodná nebo v podstatě podobná sekvenci uvedené zde jako sekvence i. č. 1 nebo sekvence i. č. 3, nebo části těchto sekvencí. Fragmenty použité jako hybridizační sondy mohou být syntetické fragmenty, které byly vytvořeny prostřednictvím obvyklých způsobů syntézy, a jejichž sekvence jsou v podstatě podobné sekvencím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
Molekuly hybridi zující s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu také zahrnují fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleové kyseliny popsaných výše kódujících protein podle vynálezu. Termínem „fragmenty se rozumí části molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly jeden z proteinů podle vynálezu. Termín „derivát v tomto smyslu znamená, že se sekvence těchto molekul liší od sekvencí molekul nukleové kyseliny popsaných výše v jedné nebo několika pozicích, avšak s těmito sekvencemi mají vysoký stupeň homologie. Homologie znamená sekvenční identitu alespoň 40 i, zejména alespoň v 60 š, výhodně více než 80 i a nejvýhodněji více než 90 %. Proteiny kódované takovými molekulami nukleové kyseliny mají sekvenci identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako sekvenci i. č. 2 alespoň v 80 %, výhodně v 85 % a zejména výhodně ve více než Odchylky od výše popsaných molekul být tvořeny deleci, substitucí, nukleové kyseliny mohou inzercí nebo rekombinací.
Molekuly nukleové kyseliny, které jsou homologní s výše popsanými molekulami, a které představují deriváty těchto molekul, jsou obvykle varianty těchto molekul, které představují modifikace mající tutéž biologickou funkci. Mohou to být přirozeně se vyskytující varianty, například sekvence z jiných organismů nebo mutace, které mohou vzniknout buď přirozeně nebo které byly vneseny specifickou mutagenezí. Kromě toho mohou být tyto varianty synteticky vytvořené sekvence. Alelické varianty mohou být buď přirozeně se vyskytující varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vytvořené metodami rekombinantní DNA.
Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vykazují určité společné vlastnosti, jako je enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita nebo konformace, či fyzikální vlastnosti, jako je elektroforetická pohyblivost, chování při chromatografii, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimum pH, teplotní optimum.
Ve výhodném provedení vynálezu nukleové kyseliny podle vynálezu byly získány z artyčoku (Cynara scolymus) .
Vynález se dále týká vektorů obsahujících molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Výhodně jsou to plazmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané v oboru genového inženýrství.
Ve vektoru podle vynálezu je sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu výhodně operativně spojena s regulačními prvky, což zaručuje transkripci a syntézu RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách, která může být translatována.
Expresní vektory podle vynálezu umožňují produkci inulinu s dlouhým řetězcem v různých hostitelských organismech, zejména v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách jako jsou bakterie, houby, řasy, buňky živočichů a výhodně rostlinné buňky a rostliny. Výhodné hostitelské organismy jsou zvláště kvasinky jako např. S. cerevisiae, bakterie mléčného kvašení jako Streptococcus thermophilus, Lactobacilus ♦ » bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris., Lactobacillus acidophilus a Leuconostoc cremoris.
Kódované enzymy mohou být použity pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem také mimo hostitelské organismy. Zvláště výhodné jsou rostlinné buňky.
Přehled týkající se různých expresních systémů lze najít např. v publikacích Methods in Enzymology 153, 1987, 385-516,
| Bitter et | al., | Methods | in | Enzymology 153, 1987, 516- | 544, |
| Sawers et | al. , | Applied | Microbiology and Biotechnology | 465, | |
| 1996, 1-9, | Billman-Jacobe, | Current Opinion in Biotrechnology |
7, 1996, 500-504, Hockeny, Trends in Biotechnology 12, 1994,
456-463, a Griffiths et al., Methods in Molecular Biology 75, 1997, 427-440. Expresní systémy pro kvasinky byly popsány v publikacích Hensinng et al., Antonie van Leuwenhoek 67, 1995, 261-279, Bussineu et al., Developments in Biological
Standard!zation 83, 1994, 13-198, Gellissen et al., Antonie van Leuwenhoek 62, 1992, 79-93, Fleer, Current Opinion in
Biotechnology 3, 1992, 486-496, Vedvick, Current Opinion in
Biotechnology 2, 1991, 742-745, a Buckholz, Bio/Technology 9,
1991, 1067-1072. V dosavadním stavu techniky byly expresní vektory popsány ve značném rozsahu. Kromě genu selekčního markéru a replikačního počátku, který zajišťuje replikaci ve vybraném hostiteli, obvykle expresní vektory obsahují bakteriální nebo virový promotor, a ve většině případů také terminační signál transkripce. Obvykle je alespoň jedno restrikční místo nebo polylinker (vícečetné klonovací místo) mezi promotorem a terminačním signálem, což dovoluje vložit kódující sekvenci DNA. Jestliže je aktivní ve vybraném hostitelském organismu, může se jako promotorové sekvence užít DNA přirozeně kontrolující transkripci odpovídajícího genu. Tuto sekvenci je možné zaměnit jinou promotorovou sekvencí. Je také možné užít promotor, který umožňuje konstitutivní expresi genu a nebo indukovatelný promotor, který umožňuje cílenou regulaci exprese genu ležícího po směru transkripce (downstream). Bakteriální a virové promotorové sekvence těchto vlastností jsou známy a byly ve stavu techniky popsány. Regulační sekvence pro expresi v mikroorganismech (jako je E. coli nebo S. ceřevisise) byly ve stavu techniky dostatečně popsány. Promotory, které dovolují zvláště silnou expresi downstream ležícího genu jsou např. T7 promotor (Studier et al., Methods in Enzymology 185, 1990, 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez and Chemberlain, Promotors, Structutre and Function, Praeger, New York, 1982, 462-481, DeBoer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1983, 21-25, λρΐ, rac (Boros et al., gene 42, 1986, 97-100. Obvykle je množství proteinu nejvyšší v úseku od středu ke konci logaritmické fáze růstového cyklu mikroorganismu. Z tohoto důvodu se výhodně užívají indukovatelné promotory při syntéze proteinů. To často umožňuje vyšší produkci než užití konstitutivního promotoru. Použití silného konstitutivního promotoru často vede, prostřednictvím permanentní transkripce a translace klonovaného genu, ke ztrátě energie na jiné nezbytné buněčné funkce, což pak zpomaluje růst buněk (Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie, 1995, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oxford, str. 342). Takže aby bylo dosaženo optimálního množství proteinu, často se užívá dvoufázový proces. Nejdříve se hostitelské buňky kultivují v optimálních podmínkách, dokud se nedosáhne relativně vysoké hustoty buněk. Ve druhé fázi je indukována transkripce v závislosti na tom, jaký byl použit promotor. Zvláště vhodný je v takovém případě promotor tac indukovatelný laktózou nebo IPTG (=isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid) (DeBoer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 1983, 21-25). Terminační signály transkripce byly v dosavadním stavu techniky také^dostatečně popsány.
Transformaci hostitelské buňky odpovídající DNA, která kóduje protein, lze provést standardním postupem, jaký je např. popsán v příručce Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Kultivace hostitelských buněk se provádí v živném médiu,které odpovídá nutričním požadavkům použitých hostitelských buněk, zejména pokud jde o pH, teplotu, koncentrace solí, provzdušňování média, přítomnost antibiotik, vitaminů, stopových prvků apod.
Purifikace enzymu produkovaného hostitelskými buňkami se provádí obvyklými purifikačními technikami jako je precipitace, iontová výměnná chromatografie, afinitní chromatografie, gelová filtrace, HPLC s reverzní fází apod.
Modifikací DNA, která je exprimována v hostitelských buňkách, je možné v hostitelských buňkách exprimovat takový polypeptid, který se snáze izoluje z kultivačního média díky určitým vlastnostem, takže je např. možné exprimovat protein jako fúzní protein s další polypeptidovou sekvencí, jejíž specifické vazebné vlastnosti dovolují izolovat fúzní protein pomocí afinitní chromatografie /viz např. Hopp et al., Bio/technology 6, 1988, 1204-1210, Sassenfeld, Trend in Biotechnol. 8, 1990, 88-93.
Pro expresi v rostlinných buňkách jsou výhodné regulační prvky promotoru B33 patatinového genu. dalším výhodným promotorem je promotor 35S CaMV a promotor genu pro alkoholdehydrogenázu ze Saccharomyces cerevisiae.
Vektory podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat další funkční jednotky,které stabilizují vektor v hostitelském organismu, např. bakteriální replikační počátek nebo 2-mikronDNA pro stabilizaci v S. cerevisiae. Kromě toho mohou obsahovat levou a pravou hraniční sekvenci T-DNA z Agrobacterium, což rostlin.
umožňuje stabilní integraci do genomu
Vektory podle vynálezu mohou dále obsahovat funkční terminátory, jako je např. terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium.
V jiném provedení je nukleová kyselina podle vynálezu spojena s molekulou nukleové kyseliny vektoru podle vynálezu, kdy nukleová kyselina kóduje funkční signální sekvence, aby bylo možné směrovat produkt do různých buněčných kompartmentů. taková modifikace může např. spočívat v tom, že se přidá N-koncová sekvence pro sekreci do apoplastu vyšších rostlin, avšak také jakákoliv další modifikace vedoucí k fúzi signálního peptidů se sekvencí kódující FFT je předmětem vynálezu. Molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu může aminokyselinové souvislosti je zejména obsahovat sekvence kódující sekvence způsobující sekreci. v této výhodné užití signálního peptidů ct-CGTázy z Klebsiela oxytoca M5A1 (Fiedler et al. , J. Mol. Biol. 256,
1996, 279-291 ) nebo signálního peptidů, který je kódován nukleotidy 11529 až 11618 sekvence vedené v GeneBank pod číslem X86014.
Zvláště výhodné provedení vynálezu se týká plazmidů p35-csFFT a p33-csFFT a jejich konstrukce, která je popsána v příkladech.
V dalším provedení se vynález týká hostitelských buněk, které přechodně nebo stabilně obsahují molekuly nukleové kyseliny nebo vektory podle vynálezu nebo pocházejí z takových buněk. Hostitelskou buňkou se rozumí organismus, který je schopný vnesení in vitro rekombinantní DNA a pak je případně schopen syntetizovat proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu. Hostitelské buňky jsou prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Výhodně jsou to mikroorganismy. Výhodně podle vynálezu jde o bakterie a protista (jako jsou houby, zejména kvasinky a řasy), jak jsou definovány např. v Schlegelově Allgemaine Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, • »
1985, 1-2). V souvislosti s prokaryotickými hostitelskými organismy je třeba poznamenat, že byl ukázán pozitivní účinek inulínu na růst určitých mikroorganismů, jako jsou např.
bifidobakterie Bifidobakteriím z lidského se přisuzuje intestinálniho zdravotní účinek traktu. (viz např.
navíc obsahuje (SST) závislou
Gibson et al., Int. Sugar J. 96, 1994, 381-386; Roberfroid et al., J. of Nutrition 128, 1998, 11-19). Byl také diskutován inhibiční účinek na nádory (viz např. Reddy et al, Carcinogenesis 18, 1987, 1371-1374; Singh et al. , Carcinogenesis 18, 1997, 833-841. Z tohoto důvodu hostitelské buňky podle vynálezu jako jsou kvasinky (pekařské) nebo bakterie mléčného kvašení (jogurt, podmáslí) jsou vhodné pro použití v potravinářském průmyslu.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu hostitelská buňky gen kódující sacharózafruktosyltransferázu na sacharóze. Takové sekvence byly např..
izolovány z artyčoku (německá patentová přihláška DE-A1 197 08 774), Cíchorium intibus (de Halleux et al., Plant Physiol. 113, 1997, 1003 -1013), Helíanthus tuberosus (WO 96/21023 a Allium cepa (Vijn et al., Plant Phsiol. 117, 1998, 15071513 .
Vynález se zejména týká transgenních rostlinných buněk transformovaných nukleovými kyselinami podle vynálezu nebo jejich deriváty nebo částmi. Transgenní rostlinné buňky jsou výhodně schopné syntetizovat enzymy vhodné pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem díky faktu, že do nich byly vneseny vektorové systémy podle vynálezu, jejich deriváty nebo části. Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány tím, že do nich zavedená molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je buď heterologní vzhledem k transformované buňce, tj . v těchto přirozeně nevyskytuje, nebo na jiném buňkách se lokalizována je v genomu místě, než příslušná přirozeně se vyskytující sekvence. Navíc transgenní buňky podle vynálezu výhodně obsahují sekvenci DNA kódující SST.
Předkládaný vynález se v dalším provedení týká proteinů kódovaných molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také způsobů jejich produkce, kdy se hostitelské buňky podle vynálezu kultivují za podmínek umožňujících syntézu proteinu. Protein se pak izoluje z pěstovaných buněk a/nebo kultivačního média. Kromě toho se vynález týká FFT, připravítelné z hostitelských buněk podle vynálezu nebo způsobem podle vynálezu.
Předkládaný vynález se dále týká molekul nukleových kyselin, které specificky hybridizují s molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, s molekulou k ní komplementární nebo s její částí. Výhodně se jedná o oligonukleotidy s délkou nejméně 10, zejména nejméně 15 a výhodně nejméně 50 nukleotidů. Oligonukleotidy podle vynálezu se mohou využít jako primery v PCR reakci. Mohou sloužit také jako složky antisense konstruktů nebo DNA molekul, které kódují vhodné ribozymy.
Předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, kterýžto způsob obsahuje vnesení molekuly nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
Tím, že předkládaný vynález poskytuje nukleové kyseliny podle vynálezu, dovoluje pomocí metod rekombinantní DNA produkovat inulin s dlouhým řetězcem v různých organismech, zejména v rostlinách, což dosud klasickými šlechtitelskými metodami nebylo možné. Zvýšením aktivity FFT, například nadměrnou expresí (overexpresí) vhodných molekul nukleové kyseliny podle vynálezu nebo poskytnutím mutant, které již nadále nepodléhají buněčně specifickým regulačním mechanismům a/nebo které mají změněné teplotní závislosti vzhledem k jejich aktivitě, je možné zvýšit výtěžek v rostlinách modifikovaných genetickým inženýrstvím.
Je tudíž také možná exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách proto, aby se zvýšila aktivita příslušné FFT nebo proto, aby se FFT vnesla do buněk, které normálně tento enzym neexprimují. Nadto je možné modifikovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu metodami odborníkovi známými, aby se získala FFT podle vynálezu, která již nadále nepodléhá buněčně specifickým regulačním mechanismům nebo která má modifikovanou teplotní závislost nebo specifičnost k substrátu či produktu.
Pro tento účel odborník užije řadu různých rostlinných transformačních systému. Tak např. použiti T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo extenzivně zkoumáno a je popsáno např. v patentové přihlášce EP-A-120 516 a dále v publikaci Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., A-lblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An, EMBO J. 4 (1985), 277-287.
Pro přenos DNA do rostlinných buněk se rostlinné explantáty společně kultivují (kokultivují) s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (např. segmentů listu, stonku nebo kořenu, ale také z protoplastů nebo suspenzní buněčné kultury) lze regenerovat celou rostlinu ve vhodném médiu, které obsahuje antibiotika nebo biocidní látky vhodné pro selekci transformovaných buněk. Rostliny připravené takovým způsobem se pak musí testovat, aby se zjistilo, zda je přítomna vnesená DNA. Jinou možností je vnesení DNA do rostlinných buněk biolistickou metodou nebo transformací protoplastů, což je odborníkovi známo (viz např. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Piihler, P. Stadler, editors), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-BaselCambridge).
Alternativním systémem pro transformaci jednoděložných rostlin je transformace biolistickou metodou, elektricky nebo chemicky indukovaným příjmem DNA do protoplastu, elektroporací částečně permeabilizovaných buněk, makroinjekcí DNA do květú, mikroinjekcí DNA do mikrospor nebo proembrya metodou bobtnání (viz např. Lusardi, Plant J. 5, 1994, 571-582; Paszkowski,
Biotechnology 24, 1992, 387-392). Zatímco transformace dvouděložných rostlin vektorovým systémem založeným na Ti-plazmidu prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens je již dávno zavedenou technikou, novější studie ukazují, že transformace vektory založenými na Agrobacterium tumefaciens muže být úspěšně použita i v případě jednoděložných rostlin (Chán et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al . ,
Bio/Technology 8 (1990), 3338; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991 ), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991 ), 209-218; Li et al . , Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).
Tři z výše jmenovaných systému pro transformaci byly úspěšně zavedeny také pro různé druhy obilovin: elekroporace rostlinného pletiva, transformace protoplastú a přenos DNA ostřelováním regenerovatelné tkáně a buněk (přehled viz Jahne et al. , Euphytica 85 (1995), 3544) . V odborné literatuře bylo popsáno několik způsobu transformace pšenice (přehledy viz. Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).
Když jsou molekuly nukleové kyseliny exprimovány v rostlinách, může být syntetizovaný protein lokalizován v principu v jakémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Tiby se dosáhlo lokalizace ve specifickém kompartmentu, musí být odstraněna sekvence zaručující lokalizaci ve vakuole, a je-li nutné, zbylá kódující oblast musí být spojena se sekvencemi DNA zaručujícími lokalizaci ve specifickém kompartmentu. Takové sekvence jsou odborníkovi známy (viz např. Braun et al., EMBO J., 11, 1992, 3219-3227; Wolter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 1988, 846-850; Sonnewald et al. , Plant J., 1, 1991, 95-106, Rocha-Sosa, EMBO J. 8, 1989,
23-29).
která se že tato
Předkládaný vynález se tudíž také týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které byly transformovány jednou nebo několika molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také transgenních rostlinných buněk pocházejících z takových transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodně spojeny s regulačními DNA prvky zaručujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem. Takové rostlinné buňky se odlišují od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, že obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, v těchto buňkách přirozeně nevyskytuje, nebo tín molekula je vložena do genomu buňky na místo, kde se přirozeně nevyskytuje, tj . do jiné genomově oblasti. Jelikož 1-kestóza je přirozeným substrátem FFT a sama je tvořena v reakci fruktosyltransferázy (SST) závislé na sacharóze se scharózou, je zvláště výhodné a pravděpodobně dokonce nutné poskytnout, kromě molekul nukleové kyseliny, vektoru a FFT podle vynálezu, také SST. Takže výhodné provedení vynálezu se týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které navíc obsahují gen kódující fruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze. To mohou být např. rostliny nebo rostlinné buňky, které již přirozeně exprimují SST jako např. čekanka, Helianthus tuberosus nebo jiřina, a nebo rostliny, do kterých byla sekvence DNA kódující SST vnesena metodami genového inženýrství. Tyto sekvence je možné vnést navzájem nezávisle nebo současně s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
Z transgenních rostlinných buněk mohou být regenerovány celé rostliny použitím metod odborníkům známých. Rostliny připravitelné regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dalším předmětem vynálezu jsou rostliny obsahující transgenní rostlinné buňky popsané výše. Transgenní rostliny mohou být v podstatě rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak jednoděložné, tak dvouděložné. Výhodně jsou to plodiny, zejména rostliny, které obsahují sacharózu, jako jsou rýže, kukuřice, cukrová řepa, cukrová třtina, brambory a zelenina (rajčata, karotka, pór, čekanka apod.), krmné nebo luční trávy, sladké brambory, pšenice, ječmen, řepka a sója.
Vynález se také týká množitelského materiálu a produktů sklizně rostlin podle vynálezu, například ovoce, semen, hlíz, podnoží, sadby, řízků, kalusů, buněčných kultur apod.
Dalším předmětem vynálezu je inulin s dlouhým řetězcem, který lze získat z hostitelských buněk podle vynálezu, zejména z transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv nebo rostlin, a také z jejich množitelského materiálu nebo sklizňových produktu.
V dalším provedení se vynález týká způsobů produkce inulinu s dlouhým řetězcem, který obsahuje kroky, kdy se:
a) kultivují hostitelské buňky, zejména rostlinné buňky, rostlinné pletivo nebo rostlina podle předkládaného vynálezu v podmínkách, které dovolují produkci FFT a konverzi 1-kestózy, případně doplňované zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu na inulin s dlouhým řetězcem,
b) takto produkovaný inulin se izoluje z kultivovaných rostlinných buněk, zejména rostlinných buněk, rostlinného pletivo nebo rostliny podle vynálezu nebo z kultivačního média.
. Další provedení vynálezu se týká způsobu produkce inulinu s dlouhým řetězcem, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se
a) přivede do kontaktu 1-kestóza nebo ekvivalentní substrát s FFT podle vynálezu za podmínek umožňujících konverzi na inulin s dlouhým řetězcem, a
b) izoluje se takto produkovaný inulin
Izolace inulinu z různých zdrojů, zejména rostlinných pletiv, byla např. popsána v Gibson et al., Int. Sugar J. 96, 1994, 381-386, Baxa, Czech J. Food Sci. 16, 1998, 72-76, a dále v EP-A-787 745, DeLeenheer, Cyrbohydr. Org. Raw Matter III, Workshop, 1996, Meeting dáte 1994, 67-92, Verlag VCH
Weinheim, Germany, a Ruský patent RU 20011621 Cl.
Předkládaný vynález se dále týká způsobu in vitro produkce inulinu s dlouhým řetězcem využitím sacharózy a kombinace enzymu SST a enzymu FFT podle vynálezu. Dále se vynález týká způsobu in vitro produkce inulinu užitím směsi obsahující fruktosylové oligomery a FFT podle vynálezu. V této souvislosti fruktosylový oligomer je oligomer složený z fruktózových jednotek s DP přibližně 2 až 7, který může mít na koncích glukózové zbytky. Když se provádí způsob podle vynálezu, užívají se , výhodně rekombinantně produkované proteiny, které jsou tvořeny tak, že se vloží DNA kódující příslušný protein do hostitelské buňky a tam se exprimuje. Protein je pak izolován buďto z hostitelských buněk nebo buňky jsou výhodně definované v předchozím z kultivačního média. Hostitelské hostitelské buňky podle vynálezu textu. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užijí enzymy, které byly připraveny rekombinantní technologií a secernovány z hostitelských buněk do kultivačního média, nebo dále purifikovat lze snadno získat ze takže není nutné narušovat buňky protein, neboť secernovaný protein supernatantu. Aby se odstranila rezidua kultivačního média, užijí se obvyklé způsoby jako je dialýza, reverzní osmóza, chromatografické metody apod. To samé platí pro koncentrování proteinu vylučovaného do média. Sekrece proteinu mikroorganismy je normálně zprostředkována N-koncovým sekvence, vedoucí peptid).
procházet membránou dosáhnout spoj enim signálním peptidem (signální Proteiny se signální sekvencí mohou mikroorgansmu. Sekrece proteinů lze sekvence DNA kódující signální peptid s odpovídajícím úsekem kódujícím enzym. Zvláště výhodné je použití signálního peptidu α-CGTázy z Klebsiela oxytoca M5A.1 (Fielder et al., J. Mol. Biol. 256, 1996, 279-291) nebo signálního peptidu, který je kódován nukleotidy 11529 až 11618 sekvence uložené v GeneBank pod č. X86014.
Enzymy použité ve způsobu podle vynálezu mohou být alternativně připraveny nikoliv využitím mikroorganismů, ale užitím in vitro transkripčních a translačních systémů, které umožňují exprimovat protein. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je FFT produkována v protoplastěch z listovém pletiva rostlin.
Dále se vynález týká inulinu, produkovaného hostitelskou buňkou, zejména rostlinnou buňkou, pletivem nebo rostlinou podle vynálezu, nebo získaného z rozmnožovacího materiálu nebo produktu sklizně rostlin nebo rostlinných buněk podle vynálezu nebo získaných výše popsaným způsobem podle vynálezu. Takový inulin se může výhodně použít pro přípravu surfaktantů ke zvýšení viskozity ve vodných systémech, jako detergent, jako suspendující činidlo nebo pro urychlení sedimentačního procesu a komplexování a pro vázání vody.
Tato a ještě jiná provedení vynálezu byla popsána, jak je odborníkovi zřejmé. Jsou obsažena v popisu příkladů provedení vynálezu. Další odborná literatura týkající se výše popsaných způsobů, prostředků nebo použití, který lze využít ve smyslu předkládaného vynálezu, je obsažena ve stavu techniky, např. ve veřejných knihovnách nebo v elektronické podobě. Veřejnou databází je např. databáze Medline, na kterou je přístup prostřednictvím Internetu na adrese:
http://www.nebi.nim. nih.gov/PubMed/medline.html.
Další obdobné databáze jsou odborníkům známy a jejich adresy lze získat pomocí Internetu např. na adrese: http://www.lycos.com.
Přehled informačních zdrojů týkajících se biotechnologických patentů a patentových přihlášek lze nalézt v publikaci Berks, Tibtech 12, 1994, 352-364.
Přehled obrázků
Obrázek 1: ukazuje analýzu celkového extraktu z protoplastu pomocí HPLC. protoplasty byly transformovány různými vektory: A: Transformace byla provedena vektorem pA7, který neobsahuje kódující úsek fúzovaný s promotorem cAMV 35S. B: Transformace byla provedena vektorem pA7-csFFT, který obsahuje kódující úsek fruktan:fruktosyltransferázy z artyčoku fúzovaný s promotorem cAMV 35S. C: Transformace byla provedena vektorem pA7-htFFT, který obsahuje .kódující úsek fruktan:fruktosyltransferázy z Helianthus tuberosus fúzovaný s promotorem cAMV 35S. Před analýzou byly úplné extrakty z protoplastů inkubovány ve směsi fruktosylových oligomerů po dobu 12 hodin. Analýza byla provedena jak je popsáno v příkladu 1.
Obrázek 2: ukazuje konstrukci plazmidu p35-csFFT.
• v
Obrázek 3: ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, které byly připraveny transformací konstruktem p35-csFFT. Analýza ukázala, že se tvořily molekuly inulinu s dlouhým řetězcem v transgenních rostlinách, které exprimovaly SST a také FFT z artyčoku (35S-SST/FFT 22/19).
Obrázek 4: ukazuje konstrukci plazmidu p33-csFFT.
Obrázek 5: ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, které byly připraveny transformací konstruktem p33-csFFT. Analýza ukázala, že se tvořily molekuly inulinu s dlouhým řetězcem v transgenních rostlinách, které exprimovaly SST a také FFT z artyčoku (B33-SST/FFT 47) .
Předkládaný vynález je dále podrobněji ilustrován pomocí následujících příkladů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace, izolace a charakterizace cDNA kódující fruktosyltransferázu z artyčoku (Cynare scolymus}
Celková RNA byla izolována z češule (receptaculum) artyčoku (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Póly(A)+ mRNA se izolovala za použití mRNA izolačního systému PolyATtract (Promega Corporation, Madison, Wl, USA). Komplementární DNA (cDNA) se syntetizovala z 5 μς této RNA pomocí soupravy pro syntézu ZAp-cDNA synthesis kit od firmy Stratagene podle instrukcí výrobce. Získalo se 2xl0': nezávislých rekombinantních fágú. Amplifikovaná cDNA knihovna se testovala obvyklými metodami pomocí fragmentu DNA značeného '~P a odpovídajícího cDNA pro SST z artyčoku (Notl fragment z plazmidu pCy21 podle DE 197 08 774.4) . Sekvence SST z artyčoku byla popsána v patentové přihlášce DE 197 08 774.4. Pozitivní klony byly screenovány pomocí sondy SST v silně stringentních podmínkách. Klony reagující pozitivně ve screeningu byly vynechány, neboť se evidentně jednalo o SST cDNA. Ze zbývajících klonů byly izolovány inzerty cDNA tak, že se plazmidová DNA izolovaná standardním postupem vyštěpila restrikčním enzymem Notl a pak byla klonována do vektoru pA7. Kohezní konce Notl fragmentu byly zaplněny užitím T4 polymerázy. Poté byl fragment ligován do míst Smál v pA7. vektor pA7 je derivátem pUC18 (Yanish-Perron, gene 33, 1985,
103-119), který obsahuje vložený promotor 35 S z viru mozaiky květáku, CaMV (nukleotidy 7146 až 7464, dle Gardner, Nucl. Acids Res. 9, 1981, 2871-2888) mezi místa EcoRI a Sací v polylinkeru. Kromě promotoru 35S obsahuje vektor pA7 polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plazmidu pTiACH5 (Gielen, EMBO J. 3, 1984, 835-846), tj . nukleotidy 11749 až 11939, který byl izolován jako fragment PvuII-HindlII z plazmidu pAGV40 (Kerrera-Strella, Nátuře 303, 1983, 209-213) a klonován mezi místa Spnl a HindlII polylinkeru po adici linkeru Sphl k místu PvuII.
Protoplasty tabáku byly transformovány užitím derivátů pA7 obsahujících cDNA z artyčoku, a sice metodou, kterou popsal Negrutiu, Plant Mol. Biol. 8, 1987, 363-373. Transformované protoplasty byly kultivovány v médiu K3 (Nagy a Maliga, Z. Pflanezenphysiologie 78, 1976, 453-455) při 25 °C po dva dny ve tmě. Pak byly získány buněčné extrakty opakovaným zmrazením a roztátím. Extrakty byly inkubovány 12 hodin s oligofruktany (67,5 1 1-kestóza, 28,4 i nystóza, 3,6 * fruktosylnystóza, 0,5 i sacharóza) při 28 °C a pak analyzovány užitím HPLC. Analýzy HPLC byly provedeny na aniontové výměnné koloně CarboPAc PA 100, napojené na gradientový chromatografický systém Dionex DX-300 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) . Monomery, oligomery a polymery cukrů byly stanoveny pomocí pulzampérometrické detekce. Nastavení detektoru pro tento účel bylo následující: Ti - 0,48 s, T2 - 0,12 s, T3 = 0,12 s, Ei = 0,05 V, E2 = 0,65 V, E3 = -0,95 V, citlivost = 0,1 μθ, integrace = 0,28 až 0,48 s, průtokové médium A = 0,15M NaOH, průtokové médium Β = 1M NaAc v 0, 15M NaOH, gradient: 10 minut 100% A, 2 minuty lineární zvýšení z 0% B na 100% B, 2 minuty 100% B, 2 minuty lineární zvýšení z 0% A na 100% A, 5 minut A. Vzorky byly před aplikací odsoleny a filtrovány (Microcon 10, Amicon, Beverly, USA) . Průtoková rychlost byla 1 ml min-1. V několika extraktech (viz obr. 1) byl nalezen vysokomolekulární inulin.
Příklad 2
Sekvenční analýza inzertu cDNA plazmidu pCy3
Inzert cDNA z derivátu pA7 (pCy3), který byl zodpovědný za syntézu vysokomolekulárního inulinu v testu s protoplasty, byl sekvencován obvyklou dideoxynukleotidovou metodou (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 1977, 5463-5467).
Inzert klonu pCy21 je DNA velikosti 2073 bp. Nukleotidová sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 1. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 2. Sekvence id. č. 3 je varianta sekvence id. č. 1, která kóduje stejný protein jako sekvence id. č. 1.
Sekvenční analýza a srovnání s již publikovanými sekvencemi ukázaly, že sekvence uvedená jako sekvence id. č. 1
Γ Γ ř r je nová a obsahuje kódující úsek vykazující homologii s FFT jiných organismů.
Příklad 3
Syntéza plazmidu p35-csFFT a vložení plazmidu do genomu bramboru
Plazmid p35-csFFT (obr. 2) obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12: 8711, modifikováno podle Becker, 1990, Nucl. Acids Res., 18: 203) .
Fragment A obsahuje promotor 35S z viru mozaiky květáku (CaMV) . Obsahuje úsek nukleotidů 7146 až 7464 (Gardner, Nucl. Acids Res. 9, 1981, 2871-2888), který je vložen mezi štěpná místa EcoRI a Sací polylinkeru z pBinl9-Hyg.
Fragment B obsahuje nukleotidy 1 až 2073 sekvence id. č. 1. Fragment B byl získán jako fragment Notl z vektoru pBK-CMV, ve kterém byl vložen do štěpného místa EcoRI prostřednictvím linkerové sekvence EcoRI/Notl.
Fragment C obsahuje polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plazmidu pTi ACH 5 (Gielen et al., 1984 ; EMBO J., 3, 835846), nukleotidy 11749 .až 11939, který byl izolován jako fragment PvuII - HindlII z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nátuře, 303, 209-213) a klonován mezi štěpná místa Sphl a Hind III polylinkeru z pBinl9-Hyg po přidání linkerů Sphl ke štěpnému místu PvuII.
Plazmid p35-csSST byl vnesen do Agrobacterium (Hófgen a Willmitzer, Nucleic Acids Res., 16, 1988, 9877) a pak byl zaveden do rostlin bramboru prostřednictvím genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium užitím výše popsaných v oboru známých metod. Tyto rostliny bramboru byly transformovány e r sekvencí DNA kódující SST z artyčoku (viz německá patentová přihláška DE Al 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk. Z listů regenerovaných rostlin byly získány extrakty a ty byly testovány na přítomnost fruktosylových polymerů. Analýzy se prováděly postupem popsaným v příkladu 1. Analýzy listů velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem nepochybně prokázaly výskyt vysokomolekulárního inulinu, který je důsledkem exprese genu FFT artyčkou obsaženém v plazmidu p35-csFFT (srov. obr. 3) .
Tabulka 1
Analýza obsahu inulinu v hlízách transgenních rostlin bramboru exprimujících geny SST a FFT z artyčoku
| Rostlina | obsah fruktanu μιηοΐ fruktózy/g čerstvé hmotnosti | průměrný stupeň polymerizace (poměr fruktóza/glukóza) |
| 35-SST/FFT 22/26 | 30,81 | 21 (20/1) |
| 35-SST/FFT 36/17 | 27,34 | 20 (19/1) |
Příklad 4
Příprava plazmidu p33-csFFT a vnesení plazmidu do genomu bramboru
Plazmid p33-csFFT (obr. 4) je shodný s píazmidem p35csFFT, s výjimkou toho, že fragment A A obsahuje promotor B33 patatinového genu b33 z bramboru místo promotoru 35 S CaMV.
Obsahuje fragment Dral (pozice -1512 až pozice +14) patatinového genu B33 (Rocha-Sosa et al. , 1989, EMBO J., 8:2329), který byl vložen mezi štěpná místa EcoRI a Sací polylinkeru z pBinl9-Hyg.
Plazmid p33-csFFT byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium, jak bylo již popsáno v příkladu 3. Tyto rostliny bramboru byly transformovány sekvencí DNA kódující SST z artyčoku (viz německá patentová přihláška DE Al 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk.
Analýzy hlíz velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem nepochybně prokázaly výskyt vysokomolekulárního inulinu, který je výsledkem exprese genu FFT z artyčoku obsaženého v p33-csFFT (srov. obr. 5).
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy (EET) vedoucí k syntéze vysokomolekulárních fruktanových polymerů, jejichž molekuly obsahují v průměru více 20 fruktosylových zbytků, přičemž molekuly nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny obsahuj ícía) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č.
- 2 a id. č. 4,b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 1 nebo id. č.
- 3,c) molekuly nukleové kyseliny hybridizující za stringentních podmínek s komplementárním řetězcem molekul nukleové kyseliny uvedených v bodě a) nebo b) ,d) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotidové sekvence z bodu a), b) nebo c).
2. Molekula molekula nukleové DNA. kyseliny podle nároku 1, která je 3 . Molekula molekula nukleové cDNA. kyseliny podle nároku 2, která je 4 . Molekula molekula nukleové RNA. kyseliny podle nároku 1, která je 5. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až - 4, která pochází z artyčoku.
- 6. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
- 7. Vektor podle nároku 6, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách.
- 8. Vektor podle nároku 7, kde regulační prvky jsou odvozeny z promotoru B33 genu patatinu nebo promotoru 35S CaMV.
- 9. Hostitelská buňka transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 nebo buňka, která pochází z takové buňky.
- 10. Hostitelská buňka podle nároku 9, která navíc obsahuje gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze.
- 11. Způsob přípravy FFT vyznačující se tím, že hostitelské buňky podle nároku 9 se kultivují v podmínkách, které umožňují syntézu FFT a pak se FFT izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
- 12. FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo připravená způsobem podle nároku 11.
- 13. Molekula nukleové kyseliny, která specificky hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo jejím komplementárním řetězcem.
- 14. Způsob přípravy transformovaných hostitelských buněk podle nároku 9 nebo 10, zejména transgenních rostlinných buněk, transgenních rostlinných pletiv a transgenních rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se vnese molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároku 1 až 5 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 do hostitelské buňky, rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
- 15. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které obsahují molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 nebo které jsou připravitelné způsobem podle nároku 14 nebo které pocházejí z takových buněk, pletiv nebo rostlin.
- 16. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina podle nároku 15, které navíc obsahují gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze.
- 17. Rostlina obsahující rostlinné buňky nebo rostlinné tkáně podle nároku 15 nebo 16.
- 18. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17, která je užitková rostlina.
- 19. Rostlina podle nároku 18, kdy užitková rostlina je rostlina obsahující sacharózu.
- 20 . Množitelský materiál rostlin podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19, obsahující rostlinné buňky podle nárok 15 nebo 16.
- 21.Sklizňové produkty rostlin podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19, obsahující rostlinné buňky podle nárok 15 nebo 16.
- 22. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdya) kultivují se transformované hostitelské buňky, transgenní rostlinné buňky nebo rostlinná pletiva podle nároku 15 nebo 16 nebo rostlina podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19 v podmínkách, které umožňují tvorbu FFT a přeměnu 1-kestózy, případně dodávané zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu, na vysokomolekulární inulin, ab) takto tvořený inulin se izoluje z kultivovaných buněk, pletiv nebo rostlin nebo z kultivačního média.
- 23. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdya) 1-kestóza nebo ekvivalentní substrát se přivede do kontaktu s FFT podle nároku 12 v podmínkách, které umožňují přeměnu na vysokomolekulární inulin, ab) izoluje se takto tvořený inulin.
- 24. Způsob in vitro výroby vyznačující se substrát je přeměňována kombinací enzymů obsahující vysokomolekulárního inulinu tím, že sacharóza jakožto na vysokomolekulární inulinSST a FFT.
- 25. Vysokomolekulární inulin získatelný z hostitelských buněk, rostlinných buněk nebo rostlinných pletiv podle nároku 15 nebo 16, z rostlin podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19, z množitelského materiálu podle nároku 20 nebo ze sklizňových produktů podle nároku 21 a nebo způsobem podle kteréhokoliv z nároků 22 až 24.
- 26. Použití inulinu podle nároku 25 k výrobě surfaktantů ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentů, suspendačního činidla, pro urychlení sedimentace a pro komplexování nebo vázání vody.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19749122A DE19749122A1 (de) | 1997-11-06 | 1997-11-06 | Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001680A3 true CZ20001680A3 (cs) | 2000-10-11 |
| CZ299825B6 CZ299825B6 (cs) | 2008-12-03 |
Family
ID=7847857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001680A CZ299825B6 (cs) | 1997-11-06 | 1998-11-06 | Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6559356B1 (cs) |
| EP (1) | EP1029067B1 (cs) |
| JP (1) | JP4287046B2 (cs) |
| CN (1) | CN1202255C (cs) |
| AR (1) | AR017767A1 (cs) |
| AT (1) | ATE427357T1 (cs) |
| AU (1) | AU753390B2 (cs) |
| BR (2) | BR9813968B1 (cs) |
| CA (1) | CA2309133C (cs) |
| CZ (1) | CZ299825B6 (cs) |
| DE (2) | DE19749122A1 (cs) |
| DK (1) | DK1029067T3 (cs) |
| ES (1) | ES2324188T3 (cs) |
| HU (1) | HU226813B1 (cs) |
| PL (1) | PL194854B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999024593A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA9810110B (cs) |
Families Citing this family (193)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0952222A1 (en) | 1998-04-17 | 1999-10-27 | Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) | Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile |
| DE19840028A1 (de) * | 1998-09-02 | 2000-03-09 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung |
| DE19857654A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Max Planck Gesellschaft | Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine |
| US6791015B2 (en) | 2000-10-30 | 2004-09-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fructan biosynthetic enzymes |
| EP1346032A2 (de) * | 2000-12-21 | 2003-09-24 | Südzucker Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von kohlenhydraten |
| EP1597978A1 (en) | 2004-05-17 | 2005-11-23 | Nutricia N.V. | Synergism of GOS and polyfructose |
| AR052059A1 (es) | 2004-12-21 | 2007-02-28 | Bayer Cropscience Gmbh | Plantas de cana azucarera con contenido incrementado de carbohidratos de almacenamiento |
| FR2888971B1 (fr) * | 2005-07-20 | 2007-11-02 | Nicolas Bara | Procede d'identification sequentielle d'echantillons |
| ES2356690T3 (es) * | 2006-04-28 | 2011-04-12 | Bayer Cropscience Ag | Inulina de longitud de cadena muy larga. |
| DK2027161T3 (da) * | 2006-04-28 | 2011-08-01 | Bayer Cropscience Ag | Inulin med meget stor kædelængde |
| ES2363380T3 (es) | 2006-04-28 | 2011-08-02 | Bayer Cropscience Ag | Inulina de longitud de cadena muy elevada. |
| MX2008013706A (es) * | 2006-04-28 | 2008-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Inulina de cadena muy larga. |
| CL2007003743A1 (es) * | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| CL2007003744A1 (es) | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| WO2008110281A2 (de) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Bayer Cropscience Ag | 3,4-disubstituierte phenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide |
| BRPI0808846A2 (pt) | 2007-03-12 | 2019-09-24 | Bayer Cropscience Ag | fenoxifenilamidinas 3-substituídas e seu uso como fungicidas |
| WO2008110279A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Bayer Cropscience Ag | Dihalogenphenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide |
| EP1969934A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969931A1 (de) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969929A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| BRPI0810654B1 (pt) * | 2007-04-19 | 2016-10-04 | Bayer Cropscience Ag | tiadiazoliloxifenilamidinas, seu uso e seu método de preparação, composição e método para combate de micro-organismos indesejados, semente resistente a micro-organismo indesejado, bem como método para proteger a dita semente contra micro-organismos |
| DE102007045956A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-09 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045920B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Synergistische Wirkstoffkombinationen |
| DE102007045953B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045919B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045922A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2090168A1 (de) | 2008-02-12 | 2009-08-19 | Bayer CropScience AG | Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| EP2072506A1 (de) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Bayer CropScience AG | Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2168434A1 (de) | 2008-08-02 | 2010-03-31 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| AU2009281457A1 (en) | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Bayer Cropscience Ag | Insecticidal 4-phenyl-1H-pyrazoles |
| DE102008041695A1 (de) | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Bayer Cropscience Ag | Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| EP2201838A1 (de) | 2008-12-05 | 2010-06-30 | Bayer CropScience AG | Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2198709A1 (de) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge |
| US9763451B2 (en) | 2008-12-29 | 2017-09-19 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Method for improved use of the production potential of genetically modified plants |
| EP2223602A1 (de) | 2009-02-23 | 2010-09-01 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen |
| EP2204094A1 (en) | 2008-12-29 | 2010-07-07 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction |
| EP2039771A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| EP2039772A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction |
| EP2039770A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| EP2227951A1 (de) | 2009-01-23 | 2010-09-15 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren |
| ES2406131T3 (es) | 2009-01-28 | 2013-06-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Derivados fungicidas de N-cicloalquil-N-biciclometileno-carboxamina |
| AR075126A1 (es) | 2009-01-29 | 2011-03-09 | Bayer Cropscience Ag | Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas |
| JP5728735B2 (ja) | 2009-02-17 | 2015-06-03 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 殺菌性ｎ−（フェニルシクロアルキル）カルボキサミド、ｎ−（ベンジルシクロアルキル）カルボキサミド及びチオカルボキサミド誘導体 |
| EP2218717A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-18 | Bayer CropScience AG | Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives |
| TW201031331A (en) | 2009-02-19 | 2010-09-01 | Bayer Cropscience Ag | Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance |
| EP2232995A1 (de) | 2009-03-25 | 2010-09-29 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| MA33140B1 (fr) | 2009-03-25 | 2012-03-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaisons d'agents actifs ayant des proprietes insecticides et acaricides |
| CN102448305B (zh) | 2009-03-25 | 2015-04-01 | 拜尔农作物科学股份公司 | 具有杀昆虫和杀螨虫特性的活性成分结合物 |
| US8828906B2 (en) | 2009-03-25 | 2014-09-09 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations having insecticidal and acaricidal properties |
| MX2011009732A (es) | 2009-03-25 | 2011-09-29 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de principios activos sinergicas. |
| CN102395271A (zh) | 2009-03-25 | 2012-03-28 | 拜尔农作物科学股份公司 | 具有杀虫和杀螨特性的活性化合物结合物 |
| EP2239331A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-13 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| US8835657B2 (en) | 2009-05-06 | 2014-09-16 | Bayer Cropscience Ag | Cyclopentanedione compounds and their use as insecticides, acaricides and/or fungicides |
| EP2251331A1 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-17 | Bayer CropScience AG | Fungicide pyrazole carboxamides derivatives |
| AR076839A1 (es) | 2009-05-15 | 2011-07-13 | Bayer Cropscience Ag | Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas |
| EP2255626A1 (de) | 2009-05-27 | 2010-12-01 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| CN102595889A (zh) | 2009-06-02 | 2012-07-18 | 拜耳作物科学公司 | 琥珀酸脱氢酶抑制剂在控制核盘菌属真菌中的应用 |
| KR20120051015A (ko) | 2009-07-16 | 2012-05-21 | 바이엘 크롭사이언스 아게 | 페닐 트리아졸을 함유하는 상승적 활성 물질 배합물 |
| WO2011015524A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide heterocycles derivatives |
| EP2292094A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-09 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EP2343280A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-07-13 | Bayer CropScience AG | Fungicide quinoline derivatives |
| KR20120102142A (ko) | 2009-12-28 | 2012-09-17 | 바이엘 크롭사이언스 아게 | 살진균제 히드록시모일-헤테로사이클 유도체 |
| EP2519103B1 (en) | 2009-12-28 | 2014-08-13 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| CN102725282B (zh) | 2009-12-28 | 2015-12-16 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| EA022553B1 (ru) | 2010-01-22 | 2016-01-29 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Применение комбинации биологически активных веществ, набор и средство, содержащие комбинацию биологически активных веществ, для борьбы с вредителями животного происхождения и способ улучшения использования продукционного потенциала трансгенного растения |
| ES2523503T3 (es) | 2010-03-04 | 2014-11-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | 2-Amidobencimidazoles sustituidos con fluoroalquilo y su uso para el aumento de la tolerancia al estrés en plantas |
| JP2013523795A (ja) | 2010-04-06 | 2013-06-17 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 植物のストレス耐性を増強させるための４−フェニル酪酸及び／又はその塩の使用 |
| BR112012025848A2 (pt) | 2010-04-09 | 2015-09-08 | Bayer Ip Gmbh | uso de derivados do ácido (1-cianociclopropil) fenilfosfínico, os ésteres do mesmo e/ou os sais do mesmo para aumentar a tolerância de plantas a estresse abiótico. |
| US20130116287A1 (en) | 2010-04-28 | 2013-05-09 | Christian Beier | Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives |
| WO2011134911A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| BR112012027558A2 (pt) | 2010-04-28 | 2015-09-15 | Bayer Cropscience Ag | ''composto da fórmula (i), composição fungicida e método para o controle de fungos fitogênicos de colheitas'' |
| WO2011151370A1 (en) | 2010-06-03 | 2011-12-08 | Bayer Cropscience Ag | N-[(het)arylalkyl)] pyrazole (thio)carboxamides and their heterosubstituted analogues |
| AU2011260332B2 (en) | 2010-06-03 | 2014-10-02 | Bayer Cropscience Ag | N-[(het)arylethyl)] pyrazole(thio)carboxamides and their heterosubstituted analogues |
| UA110703C2 (uk) | 2010-06-03 | 2016-02-10 | Байєр Кропсайнс Аг | Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду |
| US9593317B2 (en) | 2010-06-09 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| CN109504700A (zh) | 2010-06-09 | 2019-03-22 | 拜尔作物科学公司 | 植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具 |
| CN103003246B (zh) | 2010-07-20 | 2015-11-25 | 拜尔农科股份公司 | 作为抗真菌剂的苯并环烯烃 |
| WO2012028578A1 (de) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Bayer Cropscience Ag | Substituierte anellierte pyrimidinone und dihydropyrimidinone |
| EP2460406A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops |
| BR112013006611B1 (pt) | 2010-09-22 | 2021-01-19 | Bayer Intellectual Property Gmbh | método para o controle do nematoide de cisto de soja (heterodera glycines) infestando uma planta de soja resistente a nematoide compreendendo a aplicação de n- {2- [3-cloro-5- (trifluorometil)-2-piridinil]etil}-2-(trifluorometil) benzamida (fluorpiram |
| US9408391B2 (en) | 2010-10-07 | 2016-08-09 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a thiazolylpiperidine derivative |
| BR112013009580B1 (pt) | 2010-10-21 | 2018-06-19 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Composto de fómrula (i), composição fungicida e método para controlar fungos fitopatogênicos |
| EP2630135B1 (en) | 2010-10-21 | 2020-03-04 | Bayer Intellectual Property GmbH | 1-(heterocyclic carbonyl) piperidines |
| CA2815117A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-10 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-hetarylmethyl pyrazolylcarboxamides |
| AR083875A1 (es) | 2010-11-15 | 2013-03-27 | Bayer Cropscience Ag | N-aril pirazol(tio)carboxamidas |
| CN103391925B (zh) | 2010-11-15 | 2017-06-06 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 5‑卤代吡唑甲酰胺 |
| US20130231303A1 (en) | 2010-11-15 | 2013-09-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | 5-halogenopyrazole(thio)carboxamides |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| KR20180096815A (ko) | 2010-12-01 | 2018-08-29 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 작물에서 선충류를 구제하고 수확량을 증가시키기 위한 플루오피람의 용도 |
| US20130289077A1 (en) | 2010-12-29 | 2013-10-31 | Juergen Benting | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2474542A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-07-11 | Bayer CropScience AG | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2471363A1 (de) | 2010-12-30 | 2012-07-04 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| EP2494867A1 (de) | 2011-03-01 | 2012-09-05 | Bayer CropScience AG | Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden |
| BR112013022998A2 (pt) | 2011-03-10 | 2018-07-03 | Bayer Ip Gmbh | método para aprimorar a germinação das sementes. |
| CN103502238A (zh) | 2011-03-14 | 2014-01-08 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| CN103517900A (zh) | 2011-04-08 | 2014-01-15 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| AR085568A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas |
| AR090010A1 (es) | 2011-04-15 | 2014-10-15 | Bayer Cropscience Ag | 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento |
| EP2511255A1 (de) | 2011-04-15 | 2012-10-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate |
| AR085585A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas |
| WO2012143127A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-10-26 | Bayer Cropsciences Ag | Active compound combinations comprising a (thio)carboxamide derivative and a fungicidal compound |
| US20140173770A1 (en) | 2011-06-06 | 2014-06-19 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a preselected site |
| JP2014520776A (ja) | 2011-07-04 | 2014-08-25 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 植物における非生物的ストレスに対する活性薬剤としての置換されているイソキノリノン類、イソキノリンジオン類、イソキノリントリオン類およびジヒドロイソキノリノン類または各場合でのそれらの塩の使用 |
| EP2549788B1 (en) | 2011-07-22 | 2016-10-12 | Thales | A method for managing single channel spatial reuse in the presence of potentially disruptive nodes in a mobile ad-hoc network |
| IN2014DN00156A (cs) | 2011-08-10 | 2015-05-22 | Bayer Ip Gmbh | |
| BR112014003919A2 (pt) | 2011-08-22 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Ag | métodos e meios para modificar um genoma de planta |
| WO2013026836A1 (en) | 2011-08-22 | 2013-02-28 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| RU2014113760A (ru) | 2011-09-09 | 2015-10-20 | Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх | Ацил-гомосериновые лактоновые производные для повышения урожая растений |
| CN103874681B (zh) | 2011-09-12 | 2017-01-18 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌性4‑取代的‑3‑{苯基[(杂环基甲氧基)亚氨基]甲基}‑1,2,4‑噁二唑‑5(4h)‑酮衍生物 |
| EP2755484A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-07-23 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield |
| AR087873A1 (es) | 2011-09-16 | 2014-04-23 | Bayer Ip Gmbh | Uso de fenilpirazolin-3-carboxilatos para mejorar el rendimiento de las plantas |
| UA115971C2 (uk) | 2011-09-16 | 2018-01-25 | Байєр Інтеллектуал Проперті Гмбх | Застосування ацилсульфонамідів для покращення врожайності рослин |
| BR112014006940A2 (pt) | 2011-09-23 | 2017-04-04 | Bayer Ip Gmbh | uso de derivados de ácido 1-fenilpirazol-3-carboxílico 4-substituído como agentes contra estresse abiótico em plantas |
| ES2628436T3 (es) | 2011-10-04 | 2017-08-02 | Bayer Intellectual Property Gmbh | ARNi para el control de hongos y oomicetos por la inhibición del gen de sacaropina deshidrogenasa |
| WO2013050324A1 (de) | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b) |
| WO2013075817A1 (en) | 2011-11-21 | 2013-05-30 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicide n-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives |
| US9725414B2 (en) | 2011-11-30 | 2017-08-08 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal N-bicycloalkyl and N-tricycloalkyl pyrazole-4-(thio)carboxamide derivatives |
| WO2013092519A1 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Bayer Cropscience Ag | Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops |
| WO2013098147A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives |
| CN104039769B (zh) | 2011-12-29 | 2016-10-19 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌的3-[(1,3-噻唑-4-基甲氧基亚氨基)(苯基)甲基]-2-取代的-1,2,4-噁二唑-5(2h)-酮衍生物 |
| US9408386B2 (en) | 2012-02-22 | 2016-08-09 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) for controlling wood diseases in grape |
| PE20190345A1 (es) | 2012-02-27 | 2019-03-07 | Bayer Ip Gmbh | Combinaciones de compuestos activos |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| JP2015517996A (ja) | 2012-04-12 | 2015-06-25 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | 殺真菌剤として有用なｎ−アシル−２−（シクロ）アルキルピロリジンおよびピペリジン |
| EP2838363A1 (en) | 2012-04-20 | 2015-02-25 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| AU2013251109B2 (en) | 2012-04-20 | 2017-08-24 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-N-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| CN104245940A (zh) | 2012-04-23 | 2014-12-24 | 拜尔作物科学公司 | 植物中的靶向基因组工程 |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| BR112014027644A2 (pt) | 2012-05-09 | 2017-06-27 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopirazol-indanil-carboxamidas |
| CN104768934B (zh) | 2012-05-09 | 2017-11-28 | 拜耳农作物科学股份公司 | 吡唑茚满基甲酰胺 |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| AU2013289301A1 (en) | 2012-07-11 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Ag | Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress |
| US20150216168A1 (en) | 2012-09-05 | 2015-08-06 | Bayer Cropscience Ag | Use of substituted 2-amidobenzimidazoles, 2-amidobenzoxazoles and 2-amidobenzothiazoles or salts thereof as active substances against abiotic plant stress |
| CN105357968A (zh) | 2012-10-19 | 2016-02-24 | 拜尔农科股份公司 | 包含羧酰胺衍生物的活性化合物复配物 |
| ES2665320T3 (es) | 2012-10-19 | 2018-04-25 | Bayer Cropscience Ag | Procedimiento de tratamiento de plantas contra hongos resistentes a fungicidas usando derivados de carboxamida o de tiocarboxamida |
| PL2908640T3 (pl) | 2012-10-19 | 2020-06-29 | Bayer Cropscience Ag | Sposób stymulowania wzrostu roślin przy pomocy pochodnych karboksamidu |
| CA2888559C (en) | 2012-10-19 | 2021-03-02 | Bayer Cropscience Ag | Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| WO2014079957A1 (de) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Bayer Cropscience Ag | Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion |
| BR112015012473A2 (pt) | 2012-11-30 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | misturas binárias pesticidas e fungicidas |
| WO2014083033A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropsience Ag | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| EP2925138A1 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Ternary fungicidal and pesticidal mixtures |
| EP2925134B1 (en) | 2012-11-30 | 2019-12-25 | Bayer CropScience AG | Ternary fungicidal mixtures |
| WO2014083088A2 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal mixtures |
| EP2740720A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| WO2014086751A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung substituierter 1-(arylethinyl)-, 1-(heteroarylethinyl)-, 1-(heterocyclylethinyl)- und 1-(cyloalkenylethinyl)-cyclohexanole als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| EP2740356A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate |
| AR093909A1 (es) | 2012-12-12 | 2015-06-24 | Bayer Cropscience Ag | Uso de ingredientes activos para controlar nematodos en cultivos resistentes a nematodos |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| BR112015014307A2 (pt) | 2012-12-19 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | difluorometil-nicotínico- tetrahidronaftil carboxamidas |
| JP2016515100A (ja) | 2013-03-07 | 2016-05-26 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 殺菌性３−｛フェニル［（ヘテロシクリルメトキシ）イミノ］メチル｝−ヘテロ環誘導体 |
| CA2908403A1 (en) | 2013-04-02 | 2014-10-09 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in eukaryotes |
| CA2909213A1 (en) | 2013-04-12 | 2014-10-16 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Novel triazole derivatives |
| EP2984080B1 (en) | 2013-04-12 | 2017-08-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Novel triazolinthione derivatives |
| US9554573B2 (en) | 2013-04-19 | 2017-01-31 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Binary insecticidal or pesticidal mixture |
| BR112015026235A2 (pt) | 2013-04-19 | 2017-10-10 | Bayer Cropscience Ag | método para melhorar a utilização do potencial de produção de plantas transgênicas envolvendo a aplicação de um derivado de ftaldiamida |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| US9770022B2 (en) | 2013-06-26 | 2017-09-26 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| WO2015004040A1 (de) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung ausgewählter pyridoncarboxamide oder deren salzen als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| CN105793243A (zh) | 2013-12-05 | 2016-07-20 | 拜耳作物科学股份公司 | N-环烷基-n-{[2-(1-取代的环烷基)苯基]亚甲基}-(硫代)甲酰胺衍生物 |
| US10071967B2 (en) | 2013-12-05 | 2018-09-11 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-N-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| AR101214A1 (es) | 2014-07-22 | 2016-11-30 | Bayer Cropscience Ag | Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas |
| CN104145825B (zh) * | 2014-09-04 | 2016-04-13 | 东莞市睿绅生物技术有限公司 | 朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法 |
| AR103024A1 (es) | 2014-12-18 | 2017-04-12 | Bayer Cropscience Ag | Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas |
| EP3283476B1 (en) | 2015-04-13 | 2019-08-14 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| WO2016205749A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| WO2017079818A1 (en) | 2015-11-12 | 2017-05-18 | Ctc - Centro De Tecnologia Canavieira S.A | Polypeptides having hydrolytic activity on 1-kestose in the presence of sucrose but lacking sucrase (invertase) activity, polynucleotides encoding same and methods of producting and using same in industrial sucrose production from 1-kestose |
| BR112019001764A2 (pt) | 2016-07-29 | 2019-05-07 | Bayer Cropscience Ag | combinações de compostos ativos e métodos para proteção de material de propagação de plantas |
| US20190281828A1 (en) | 2016-09-22 | 2019-09-19 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Novel triazole derivatives |
| CN109715621A (zh) | 2016-09-22 | 2019-05-03 | 拜耳作物科学股份公司 | 新的三唑衍生物 |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| CN106617081B (zh) * | 2016-09-26 | 2020-08-04 | 江南大学 | 长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用 |
| US12499971B2 (en) | 2016-09-28 | 2025-12-16 | The Broad Institute, Inc. | Systematic screening and mapping of regulatory elements in non-coding genomic regions, methods, compositions, and applications thereof |
| WO2018077711A2 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Use of pyraziflumid for controlling sclerotinia spp in seed treatment applications |
| RU2755433C2 (ru) | 2016-12-08 | 2021-09-16 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Применение инсектицидов для борьбы с проволочниками |
| EP3332645A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-13 | Bayer Cropscience AG | Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| WO2018108627A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| US11591601B2 (en) | 2017-05-05 | 2023-02-28 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes |
| WO2018213726A1 (en) | 2017-05-18 | 2018-11-22 | The Broad Institute, Inc. | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| WO2019025153A1 (de) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| AU2018338318B2 (en) | 2017-09-21 | 2022-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| WO2019126709A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | The Broad Institute, Inc. | Cas12b systems, methods, and compositions for targeted dna base editing |
| US10968257B2 (en) | 2018-04-03 | 2021-04-06 | The Broad Institute, Inc. | Target recognition motifs and uses thereof |
| EP3802521A1 (de) | 2018-06-04 | 2021-04-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole |
| CN113544266A (zh) | 2018-12-17 | 2021-10-22 | 博德研究所 | Crispr相关转座酶系统和其使用方法 |
| KR20220094189A (ko) * | 2019-09-24 | 2022-07-05 | 징코 바이오웍스, 인크. | 올리고사카라이드의 생산 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL100908A0 (en) * | 1991-02-22 | 1992-11-15 | Salk Inst Biotech Ind | Invertase genes and their use |
| PL178789B1 (pl) * | 1992-12-28 | 2000-06-30 | Stichting Scheikundig Onderzoe | Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów |
| DE4316425C2 (de) * | 1993-05-17 | 1998-05-20 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung von langkettigem Inulin, das so hergestellte Inulin sowie dessen Verwendung |
| PT795018E (pt) * | 1995-01-06 | 2007-12-21 | Plant Res Int Bv | Sequências de adn codificando enzimas de síntese de polímeros de hidratos de carbono e método para a produção de plantas transgénicas |
| DE19617687C2 (de) * | 1996-05-03 | 2000-11-16 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen |
-
1997
- 1997-11-06 DE DE19749122A patent/DE19749122A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-11-05 ZA ZA9810110A patent/ZA9810110B/xx unknown
- 1998-11-06 DE DE69840704T patent/DE69840704D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 CN CNB988116901A patent/CN1202255C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 CZ CZ20001680A patent/CZ299825B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 AR ARP980105613A patent/AR017767A1/es active IP Right Grant
- 1998-11-06 PL PL340364A patent/PL194854B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 BR BRPI9813968-1A patent/BR9813968B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 AU AU16674/99A patent/AU753390B2/en not_active Expired
- 1998-11-06 HU HU0100111A patent/HU226813B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 JP JP2000519587A patent/JP4287046B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-06 AT AT98961152T patent/ATE427357T1/de active
- 1998-11-06 EP EP98961152A patent/EP1029067B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 CA CA2309133A patent/CA2309133C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 BR BRPI9816319A patent/BRPI9816319B1/pt active IP Right Grant
- 1998-11-06 WO PCT/EP1998/007115 patent/WO1999024593A1/en not_active Ceased
- 1998-11-06 ES ES98961152T patent/ES2324188T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 DK DK98961152T patent/DK1029067T3/da active
-
2000
- 2000-05-05 US US09/565,264 patent/US6559356B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-03-13 US US10/388,796 patent/US7083963B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ299825B6 (cs) | 2008-12-03 |
| JP2001521757A (ja) | 2001-11-13 |
| BR9813968B1 (pt) | 2011-03-09 |
| PL340364A1 (en) | 2001-01-29 |
| AU753390B2 (en) | 2002-10-17 |
| US6559356B1 (en) | 2003-05-06 |
| ATE427357T1 (de) | 2009-04-15 |
| WO1999024593A1 (en) | 1999-05-20 |
| US7083963B2 (en) | 2006-08-01 |
| US20040014092A1 (en) | 2004-01-22 |
| DE69840704D1 (de) | 2009-05-14 |
| AR017767A1 (es) | 2001-10-24 |
| CA2309133A1 (en) | 1999-05-20 |
| BR9813968A (pt) | 2000-09-26 |
| DE19749122A1 (de) | 1999-06-10 |
| CA2309133C (en) | 2011-09-06 |
| CN1280624A (zh) | 2001-01-17 |
| DK1029067T3 (da) | 2009-06-22 |
| JP4287046B2 (ja) | 2009-07-01 |
| BRPI9816319B1 (pt) | 2016-05-17 |
| CN1202255C (zh) | 2005-05-18 |
| EP1029067A1 (en) | 2000-08-23 |
| HUP0100111A3 (en) | 2003-04-28 |
| ZA9810110B (en) | 1999-05-05 |
| ES2324188T3 (es) | 2009-07-31 |
| PL194854B1 (pl) | 2007-07-31 |
| EP1029067B1 (en) | 2009-04-01 |
| AU1667499A (en) | 1999-05-31 |
| HUP0100111A2 (hu) | 2001-05-28 |
| HU226813B1 (en) | 2009-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6559356B1 (en) | Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin | |
| JP4101304B2 (ja) | フルクトシルポリメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子 | |
| JP3840259B2 (ja) | 炭水化物ポリマー合成酵素をコードするｄｎａ配列及びトランスジェニック植物を製造するための方法 | |
| KR100352532B1 (ko) | 식물,진균류및미생물에서선형알파-1,4글루칸의형성을용이하게할수있는효소를코딩하는dna서열 | |
| AU713978B2 (en) | DNA molecules that code for enzymes involved in starch synthesis,vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing these molecules | |
| JP4659983B2 (ja) | フルクトース転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸分子、およびその使用 | |
| AU777455B2 (en) | Nucleic acid molecules from artichoke (cynara scolymus) encoding enzymes having fructosyl polymerase activity | |
| AU2002314061B2 (en) | DNA molecules that code for enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules | |
| HK1034286A (en) | Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20131106 |