PL194854B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka posiadające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania komórki gospodarza roślinnego, komórka rośliny, materiał rozmnożeniowy i sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny - Google Patents

Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka posiadające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania komórki gospodarza roślinnego, komórka rośliny, materiał rozmnożeniowy i sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny

Info

Publication number
PL194854B1
PL194854B1 PL340364A PL34036498A PL194854B1 PL 194854 B1 PL194854 B1 PL 194854B1 PL 340364 A PL340364 A PL 340364A PL 34036498 A PL34036498 A PL 34036498A PL 194854 B1 PL194854 B1 PL 194854B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
thr
leu
nucleic acid
ala
val
Prior art date
Application number
PL340364A
Other languages
English (en)
Other versions
PL340364A1 (en
Inventor
Arnd G. Heyer
Elke W. Hellwege
Dominique Gritscher
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft filed Critical Max Planck Gesellschaft
Publication of PL340364A1 publication Critical patent/PL340364A1/xx
Publication of PL194854B1 publication Critical patent/PL194854B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

1. Czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialka majace aktywnosc enzymatyczna fruktozy- lotransferazy (FFT), prowadzaca synteze inuliny, o czasteczkach zawierajacych przecietnie wiecej niz 20 reszt fruktozylowych, wybrana z grupy zawierajacej: (a) czasteczki kwasu nukleinowego kodujace bialko zawierajace sekwencje aminokwasowa opisana jako SEQ ID No. 2 i SEQ ID No. 4; (b) czasteczki kwasu nukleinowego majace sekwencje nukleotydowa opisana jako SEQ ID No. 1 albo SEQ ID No. 3 albo odpowiednia sekwencje rybonukleotydowa; (c) czasteczki kwasu nukleinowego, które hybrydyzuja z komplementarnym lancuchem cza- steczki kwasu nukleinowego opisanej w (a) albo (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji i (d) czasteczki kwasu nukleinowego, zawierajace fragment sekwencji nukleotydowej (a), (b) lub (c). PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka posiadające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania komórki gospodarza roślinnego, komórka rośliny, materiał rozmnożeniowy i sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny
Rozpuszczalne w wodzie, liniowe polimery mają wiele zastosowań, na przykład służą do zwiększenia lepkości roztworów wodnych, jako detergenty, jako środki zawieszające albo jako środki przyśpieszając osiadanie, służą do kompleksowania i wiązania wody. Polimery oparte na węglowodanach, takie jak polisacharydy fruktozylowe, są szczególnie interesujące jako surowce, ponieważ ulegają biodegradacji.
Oprócz zastosowania w przemyśle jako odtwarzalne surowce, polimery fruktozylowe są też brane pod uwagę jako dodatki do artykułów żywnościowych, na przykład jako słodzik. Do różnych zastosowań, potrzebne są polimery o różnej długości łańcucha. Podczas gdy krótko i średniołańcuchowe polimery są szczególnie przydatne w przemyśle przetwarzającym żywność, polimery o wysokim stopniu polimeryzacji (DP) są przydatne w technice, jak na przykład środki powierzchniowo czynne.
W opisanych dotychczas sposobach wytwarzania długołańcuchowych polisacharydów fruktanowych w roślinach, w komórkach ulega ekspresji transferaza fruktozylowa pochodzenia bakteryjnego. Większość bakteryjnych transferaz fruktozylowych syntetyzuje lewan, połączony wiązaniami b-2,6 polimer fruktozylowy, który ma liczne b-2,6 odgałęziania. Z powodu tych licznych odgałęzień lewan nie nadaje się do użycia w przemyśle przetwarzającym i ma znacznie mniejsze znaczenie jako surowiec techniczny niż inulina. Obecnie, znany jest tylko jeden gen bakteryjny, którego produkt bierze udział w syntezie inuliny. Jest to gen ftf Streptococcus mutans. W zasadzie możliwa jest ekspresja tego genu w roślinach, pod warunkiem, że gen ten uprzednio był przebudowany genetycznie. Jednak, ilość inuliny otrzymywanej z takich roślin transgenicznych, jest tak niska, że z ekonomicznego punktu widzenia użycie takich roślin transgenicznych jest nieopłacalne.
Znany jest także sposób wytwarzania roślin transgenicznych, które wytwarzają transferazę fruktozylową-Helianthus tuberosus. Ekspresja tych genów w roślinach transgenicznych prowadzi do wytwarzania inuliny ze średnim stopniem polimeryzacji DP=6 do DP=10. Polimery o tym stopniu polimeryzacji nie mogą być określone jako długołańcuchowa inulina. Inulina ze średnim stopniem polimeryzacji DP=6 do DP=10 nie jest przydatna do większości zastosowań technicznych.
Opłacalne z ekonomicznego punktu widzenia sposoby wytwarzania długołańcuchowej inuliny w roślinach i sposoby wytwarzania enzymów ją syntetyzujących nie są znane.
Zgłoszenie patentowe PCT/US89/02729 opisuje możliwość syntezy polimerów węglowodanowych, w szczególności dekstranu albo polifruktozy, w komórkach roślin transgenicznych, szczególnie w owocach roślin transgenicznych. W celu wytworzenia zmodyfikowanej w taki sposób rośliny, zaproponowano użycie sukraz lewanu z mikroorganizmów, w szczególności z Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius i Bacillus subtilis, lub sukraz dekstranu z Leuconostoc mesenteroides. Nie opisuje się tam tworzenia czynnych enzymów, ani wytworzonego lewanu lub dekstranu, ani wytwarzania roślin transgenicznych.
Zgłoszenie patentowe PCT/EP93/02110 opisuje sposób wytwarzania roślin transgenicznych wytwarzających gen Isc sukrazy lewanu z gramujemnej bakterii Erwinia amylovora. Rośliny wytwarzają wysokocząsteczkowy, silnie rozgałęziony lewan. Zgłoszenie patentowe PCT/NL93/00279 opisuje transformację rośliny genami chimerowymi zawierającymi gen sacB Bacillus subtilis lub gen ftf Streptococcus mutans.
Rośliny transgeniczne zawierające gen sacB wytwarzają rozgałęziony lewan. Rośliny transgeniczne zawierające gen ftf syntetyzują wysokocząsteczkową inulinę; jednak ilość wytwarzanej inuliny jest tak niska, że nie można ich wykorzystać w sposób opłacalny. Zgłoszenie patentowe PCT/NL96/00012 opisuje sekwencję DNA kodującą enzymy syntetyzujące polimery węglowodanów, a także wytwarzanie roślin transgenicznych za pomocą tych sekwencji DNA. Opisane sekwencje wyprowadza się do Helianthus tuberosus. Zgodnie ze zgłoszeniem patentowym PCT/NL96/00012, opisane sekwencje mogą być używane w celu modyfikowania profilu wytwarzania fruktanu przez petunię i ziemniaka, ale także przez Helianthus tuberosus. Jeżeli rośliny transgeniczne zawierają gen SST i gen FFT, to jest możliwe wytwarzanie inuliny. Jednak przeciętny stopień polimeryzacji inuliny, wynosi pomiędzy DP=6 i DP=10. Wytwarzanie wysokocząsteczkowej inuliny za pomocą sposobu opisywanego w zgłoszeniu patentowym PCT/NL96/00012 nie jest możliwe.
PL 194 854 B1
Zgłoszenie patentowe PCT/EP97/02195 opisuje sposób wytwarzania transgenicznych, wytwarzających inulinę roślin, zawierających gen ftf Streptococcus mutans. Ilość wysokocząsteczkowej inuliny jest mała, podobnie jak w przypadku roślin opisanych w zgłoszeniu patentowym PCT/NL93/D0279. Dokument patentowy DE 19708774.4 opisuje wytwarzanie krótkołańcuchowej inuliny za pomocą enzymów posiadających aktywność polimerazy fruktozylu. Rośliny transgeniczne mogą wytwarzać krótkołańcuchową inulinę. Ilość wytwarzanej krótkołańcuchowej inuliny jest wysoka, a w ziemniaku odpowiada komórkowej zawartości sacharozy. Wytwarzanie długołańcuchowej inuliny nie jest jednak opisywane. Synteza inuliny w roślinach była dokładnie zbadana (Pollock i Chatterton, Fruktans, The Biochemistry Plants Tom 14 (1988), Academic Press, strony 109-140). Jednak, inulina występująca naturalnie w roślinach jest fruktanem krótkołańcuchowym o maksymalnym stopniu polimeryzacji w przybliżeniu DP=35 (Pollock i Chatterton, 1988, loc.cit.).
Synteza i metabolizm fruktanów w roślinach oparte są na aktywności przynajmniej trzech enzymów: zależnej od sacharozy transferazy sacharoza-fruktozyl (SST) tworzącego trójsacharyd kestozę, zależnej od fruktanu transferazy fruktan-fruktozyl (FFT), która przenosi resztę fruktozylową z cząsteczek fruktanu o minimalnym stopniu polimeryzacji DP=3 (kestoza) na sacharozę i wyższe fruktany, i egzohydrolazy fruktanowej (FEH), która usuwa reszty fruktozy z cząsteczek fruktanu. Nie wiadomo, czy różnice przeciętnej masy cząsteczkowej inuliny w różnych gatunkach roślin, na przykład około 2x103 w przypadku Allium cepa lub 5x103 w przypadku Helianthus tuberosus, wynikają z różnych własności SST, FFT albo FEH.
W związku z tym, obecny stan wiedzy opisującej syntezę inuliny w roślinach, uniemożliwia zidentyfikowanie odpowiednich sekwencji DNA, za pomocą których możliwe by było opłacalne z ekonomicznego punktu widzenia syntetyzowanie wysoko-cząsteczkowej inuliny w roślinach.
Technicznym problemem rozwiązanym przez obecny wynalazek jest dostarczenie cząsteczki kwasu nukleinowego i sposobu, który pozwala na wytwarzanie genetycznie modyfikowanych organizmów, w szczególności roślin, zdolnych do wytwarzania długołańcuchowej inuliny.
Przedmiotem wynalazku jest zatem cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka mające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), prowadząca syntezę inuliny, o cząsteczkach zawierających przeciętnie więcej niż 20 reszt fruktozylowych, wybrana z grupy zawierającej:
(a) cząsteczki kwasu nukleinowegokodujące białkozawierającesekwencję aminokwasowąopisaną jako SEQ ID No. 2 i SEQ ID No. 4;
(b) cząsteczki kwasu nukieinowego jmającesekwencij nukieotydową opisaną jakoSEO ID No. 1 albo SEQ ID No. 3 albo odpowiednią sekwencję rybonukleotydową;
(c) cząsteczki kwasu nukleinowego, które hybrydyzują z komplementarnym łańcuchem cząsteczki kwasu nukleinowego opisanej w (a) albo (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji i (d) cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierające fragment sekwencji nukleotydowej (a), (b) lub (c).
Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczką DNA, a bardziej korzystnie jest cząsteczką cDNA.
Także korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może być cząsteczką RNA. W najbardziej korzystnej postaci wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku pochodzi z karczocha.
Przedmiotem wynalazku jest też wektor, który zawiera zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w całości powyżej.
W korzystnej postaci w wektorze według wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego jest czynnościowo połączona z elementem regulatorowym zapewniającym transkrypcję i syntezę ulegającego translacji RNA w komórkach prokariotycznych i/albo komórkach eukariotycznych, a bardziej korzystnie elementy regulatorowe mogą pochodzić z regionu promotorowego B33 patatyny lub regionu promotorowego 35S CaMV.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej albo wektorem, który zawiera taką cząsteczkę według wynalazku.
Korzystnie w komórce gospodarza według wynalazku może znajdować się dodatkowo zawiera gen kodujący zależną od sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST).
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania FFT, polegający na tym, że komórkę gospodarza hoduje się w warunkach pozwalających na syntezę FFT, a następnie izoluje się FFT z hodowanych komórek i/albo z podłoża do hodowli.
PL 194 854 B1
Przedmiotem wynalazku jest także FFT, kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania komórki gospodarza roślinnego, polegający na tym, że wprowadza się do komórki gospodarza cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku zdefiniowane albo zwierający tą cząsteczkę wektor, zdefiniowane powyżej.
Korzystnie, jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę roślinną, tkankę roślinną lub roślinę.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka rośliny, która zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego wynalazku albo zawierający tą cząsteczkę wektor.
Korzystnie, komórka rośliny według wynalazku, stanowi komórkę rośliny transgenicznej, tkankę rośliny transgenicznej lub roślinę transgeniczną.
Bardziej korzystnie może dodatkowo zawierać gen kodujący zależną od sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST).
Komórka rośliny korzystnie jest komórką rośliny użytkowej, a bardziej korzystnie jest komórką rośliny użytkowej zawierającej sacharozę.
Przedmiotem wynalazku jest również materiał rozmnożeniowy, charakteryzujący się tym, że zawiera komórki roślinne, które dodatkowo zawierają gen kodujący zależną od sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST).
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny o cząsteczkach zawierających przeciętnie więcej niż 20 reszt fruktozylowych, polegający na tym, że (a) hoduje się komórki gospodarza, transformowane cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie FFT i prze kształcenie 1-kestozy, ewentualnie dostarczoną z zewnątrz, lub równoważnego substratu, do wspomnianej wysokocząsteczkowej inuliny; i (b) odzyskuje się tak wytworzoną inulinę z hodowanych komórek gospodarza lub z podłoża do hodowli.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wysoko-cząsteczkowej inuliny polegający na tym że:
(a) doprowadza się do kontaktu 1-kestozy albo równoważne go substratu z FFT według wynalazku w warunkach, któ re pozwalają na ich zamianę do wysokocząsteczkowej inuliny i (b) odzyskuje się tak wytworzoną inulinę.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania in vitro wysokocząsteczkowej inuliny polegający na tym, że sacharoza będąca substratem jest zamieniana do wysokocząsteczkowej inuliny przez kombinację enzymów zwierającą SST oraz FFT, która jest kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
W kontekście niniejszego wynalazku transferaza fruktozylowa (FFT) jest białkiem zdolnym do katalizowania tworzenia z wiązania b-2,1-glikozylowego i/lub wiązania b-2,6-glikozylowego między resztami fruktozy. Dzięki temu, reszty fruktozylowe, które mają być przenoszone mogą pochodzić z 1-kestozy albo z polimeru fruktanu. W kontekście niniejszego wynalazku, wysokocząsteczkowy fruktan jest polimerem o przeciętnej liczbie cząsteczek większej niż 20, korzystnie większej niż 25 i bardziej korzystnie przynajmniej 32 reszty fruktozylowe.
Ponadto, wysoko cząsteczkowe fruktany korzystnie są polimerami zawierającymi przeciętnie mniej niż 3000 cząsteczek, bardziej korzystnie mniej niż 300 i szczególnie korzystnie mniej niż 100 cząsteczek reszt fruktozylowych. Reszty fruktozylowe mogą być połączone glikozylowo wiązaniem β-2,1 albo wiązaniem b-2,6. W przypadku inuliny reszty połączone są przede wszystkim wiązaniem b-2,1-glikozydowym.
W niewielkim stopniu, występują też wiązania b-2,6-glikozydowe, w szczególności mniej niż 5%, korzystnie mniej niż 3%, bardziej korzystnie mniej niż 1,5% i najbardziej korzystnie mniej niż 0,5%. Polimer fruktozylowy może mieć na końcu resztę glukozy, która jest połączona przez grupę OH C-1 glukozy i grupę OH C-2 reszty fruktozylowej. W tym przypadku, polimer fruktozylowy zawiera także cząsteczkę sacharozy.
Nieoczekiwanie, okazało się, że podczas ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku, w transformowanych roślinach powstają duże ilości wysokocząsteczkowej inuliny. Inulina wytworzona w tych roślinach cechuje się przeciętnym stopieniem polimeryzacji większym niż DP=20. Jest to zaskakujące, ponieważ podobny enzym z Helianthus tuberosus zawarty w roślinach transgenicznych bierze udział w syntezie inuliny o przeciętnym stopniu polimeryzacji, mniej niż DP=20 (PCT/NL96/00012).
PL 194 854 B1
Jak wspomniano, cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku mogą być cząsteczkami DNA jak również RNA. Odpowiednimi cząsteczkami DNA są na przykład genomowy DNA albo cząsteczki cDNA. Cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku mogą być izolowane z naturalnych źródeł, korzystnie z karczocha, lub mogą być syntetyzowane według znanych sposobów. Za pomocą tradycyjnych technik biologii molekularnej (patrz na przykład, Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) do cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku wprowadza się różne mutacje, które prowadzą do syntezy białek z prawdopodobnie modyfikowanymi własnościami biologicznymi.
Możliwe jest wytwarzanie mutantów delecyjnych, w których cząsteczki kwasu nukleinowego są wytwarzane przez zwiększające się delecje przy 5' lub 3' końcu kodującej sekwencji DNA. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego umożliwiają syntezę coraz krótszych białek. Za pomocą takiego postępowania przy 5' końcu sekwencji nukleotydowej, jest na przykład możliwe zidentyfikowanie sekwencji aminokwasowej odpowiedzialnej za przemieszczenie enzymu do wodniczki (peptydów tranzytowych). Pozwala to na ukierunkowane wytwarzanie enzymów które, dzięki usunięciu odpowiedniej sekwencji nie są lokalizowane w wodniczce, ale w cytozolu lub dzięki dodaniu innej sekwencji sygnałowej, w innym przedziale komórkowym.
Z drugiej strony, jest też możliwe wprowadzenie mutacji punktowych w pozycjach, w których modyfikacja sekwencji aminokwasowej wpływa, na przykład, na aktywność enzymu lub na regulację enzymu. Tym sposobem wytwarza się, na przykład mutanty, które mają zmodyfikowaną wartość Km lub które już nie podlegają mechanizmom regulacji aktywności enzymów występujących w komórce, takiej jak regulacja allosteryczna albo modyfikacje kowalencyjne.
Ponadto, można wytwarzać mutanty, które mają zmodyfikowaną specyficzność substratową albo produkt. Ponadto, można wytwarzać mutanty, które mają zmodyfikowany profil aktywności w zależności od temperatury.
W celu manipulacji zrekombinowanymi cząsteczkami DNA w komórkach prokariotycznych, cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku lub części tych cząsteczek wstawia się do plazmidu, który pozwala na mutagenezę albo modyfikację sekwencji przez rekombinację sekwencji DNA. Za pomocą standardowych technik (patrz Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) można wprowadzić zamiany zasad lub dodać naturalną albo syntetyczną sekwencję.
W celu połączenia fragmentów DNA ze sobą, do tych fragmentów można przyłączyć adaptory albo łączniki. Ponadto, można prowadzić manipulacje, które wprowadzają odpowiednie miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne albo które usuwają zbyteczny DNA albo zbyteczne miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Jeżeli korzysta się z insercji, delecji albo substytucji, można wykorzystać mutagenezę in vitro, technikę naprawy z primerami, cięcie przez enzymy restrykcyjne lub ligację. Jako metod analizy, używa się zwykle analizy sekwencji, analizy miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych albo innych metod biologii molekularnej.
W kontekście obecnego wynalazku termin hybrydyzacja oznacza hybrydyzację w warunkach konwencjonalnych, korzystnie w ostrych warunkach, tak jak opisane na przykład w Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 wydanie (1989), CoId Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Przykładem ostrych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 50% formamidzie, 5x SSC, 5x roztworze Denhardta, 40 mM fosforanie sodowym pH 6,8; 0,5% (wagowo/objętościowy) BSA, 1% (wagowo/objętościowy) SDS, 0,1 mg/ml DNA spermy śledzia w temperaturze 42°C. Przykładem konwencjonalnych, łagodnych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w wyżej opisanych warunkach, przy użyciu 30% formamidu zamiast 50% formamidu. Warunki płukania, w przypadku ostrych warunków hybrydyzacji, to korzystnie 0,5x SSC/0,5% SDS w temperaturze 60°C. W przypadku łagodnych warunków hybrydyzacji, warunki płukania to korzystnie 2x SSC/0,5% SDS w temperaturze 56°C.
Cząsteczki kwasu nukleinowego które hybrydyzują z cząsteczkami wytworzonymi sposobem według wynalazku izoluje się na przykład z genomowego DNA albo z biblioteki cDNA wytworzonej z odpowiednich organizmów, takich jak karczoch.
PL 194 854 B1
Takie cząsteczki kwasu nukleinowego identyfikuje się i izoluje, używając cząsteczek wytworzonych sposobem według wynalazku lub części tych cząsteczek albo, jak w tym przypadku, metodą odwrotnej komplementacji tych cząsteczek. Na przykład, przez hybrydyzację według standardowych technik (zobacz na przykład. Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY).
Jako sondy do hybrydyzacji, używa się na przykład cząsteczek kwasu nukleinowego, które mają dokładnie albo w przybliżeniu sekwencję nukleotydową pokazaną jako SEQ ID No. 1 albo SEQ ID No. 3 albo ich części. Fragmenty używane jako sondy do hybrydyzacji mogą być też wytworzonymi przy użyciu zwykłych technik syntezy fragmentami syntetycznymi, których sekwencja jest podobna do sekwencji cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzonej sposobem według wynalazku.
Cząsteczki hybrydyzujące z cząsteczkami kwasu nukleinowego wytworzonymi sposobem według wynalazku mogą także zawierać fragmenty, pochodne i warianty allelowe opisywanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białko wytworzone sposobem według wynalazku. Termin fragmenty oznacza części cząsteczek kwasu nukleinowego, których długość jest wystarczająca do zakodowania cząsteczki białka wytworzonej sposobem według wynalazku.
W tym kontekście, termin pochodny oznacza, że sekwencja tych cząsteczek różni się od opisanych powyżej sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego w jednej albo więcej pozycjach. Jednak, wykazują one wysoki stopień homologii do tych sekwencji. Homologia oznacza, że identyczność sekwencji wynosi przynajmniej 40%, w szczególności identyczność przynajmniej 60%, korzystnie więcej niż 80% i najbardziej korzystnie więcej niż 90%.
Białka kodowane przez te cząsteczki kwasu nukleinowego wykazują identyczność sekwencji z sekwencją aminokwasową pokazaną pod SEQ ID No. 2 przynajmniej w 80%, korzystnie 85% i szczególnie korzystnie więcej niż 90%, bardziej korzystnie więcej niż 95 %, jeszcze bardziej korzystnie więcej niż 97% i najbardziej korzystnie więcej niż 99%. Odchylenia od opisywanych powyżej cząsteczek kwasu nukleinowego mogą wynikać, na przykład z delecji, substytucji, insercji i/albo rekombinacji.
Cząsteczki kwasu nukleinowego, które są homologiczne do opisanych powyżej cząsteczek i są pochodnymi tych cząsteczek, zwykle są odmianami tych cząsteczek będącymi modyfikacjami o tej samej funkcji biologicznej. Mogą to być odmiany występujące naturalnie, na przykład cząsteczki od innych organizmów, lub mutacje, przy czym te mutacje mogą występować naturalnie, albo mogą być wprowadzone za pomocą ukierunkowanej mutagenezy.
Ponadto, odmiany takie mogą być cząsteczkami wytworzonymi syntetycznie. Warianty allelowe także mogą występować naturalnie, albo mogą być wytworzone syntetycznie, albo mogą być wariantami wytworzonymi przez rekombinację.
Białka kodowane przez różne warianty cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku wykazują pewną wspólną charakterystykę, taką jak aktywność enzymatyczna, masa cząsteczkowa, reaktywność immunologiczna, konformacja, albo własności fizyczne, taki jak ruchliwość w żelu elektroforetycznym, charakterystyka chromatograficzna, współczynnik osiadania, rozpuszczalność, własności spektroskopowe, stabilność, optymalne pH, optymalna temperatura.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku sekwencje kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku pochodzą od karczocha (Cynara scolymus).
Przedmiotem wynalazku są też wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku. Korzystnie są to plazmidy, kosmidy, wirusy, bakteriofagi i inne wektory popularne w technologii genów.
Korzystnie, w wektorze wytworzonym sposobem według wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego wytworzona sposobem według wynalazku jest połączona funkcjonalnie z elementem regulatorowym, który zapewnia transkrypcję i syntezę ulegającego translacji RNA w komórkach prokariotycznych i/albo eukariotycznych.
Ekspresja wektorów wytworzonych sposobem według wynalazku pozwala na wytwarzanie długołańcuchowej inuliny w różnych organizmach gospodarza, w szczególności w komórkach prokariotycznych albo eukariotycznych, takich jak bakterie, grzyby, glony, komórki zwierzęce i korzystnie komórki roślinne i rośliny. Organizmem gospodarza mogą być drożdże, takie jak na przykład S. cerevisiae, i bakterie kwasu mlekowego, takie jak Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus acidophilus i Leuconostoc cremoris.
PL 194 854 B1
W celu wytwarzania długołańcuchowej inuliny, kodowane enzymy prawdopodobnie mogą też być używane na zewnątrz organizmów gospodarza. Komórki roślinne są szczególnie korzystne.
Przegląd różnych systemów ekspresji można znaleźć, na przykład w Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, w Bitter i wsp. (Methods w Enzymology 153 (1987), 516-544), Sawers i wsp., Applied Microbiology i Biotechnology 46 (1996), 1-9, Billmann-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-504, Hockney, Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463, i Griffiths i wsp., Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440. Systemy ekspresji w drożdżach były opisane w Hensing i wsp., Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279, Bussineau i wsp., Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19, Gellissen i wsp., Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer, Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496, Vedvick, Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742- 745, i w Buckholz, Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072.
Wektory ekspresyjne były także wcześniej szeroko opisane w sztuce. Oprócz wybranego genu markerowego i początku replikacji zapewniającego replikację w wybranych komórkach gospodarza, zwykle zawierają one bakteryjny albo wirusowy region promotorowy i w większości przypadków sygnał zakończenia transkrypcji. Zawierają one także przynajmniej jedno miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny albo jeden polilinker, pomiędzy regionem promotorowym i sygnałem zakończenia transkrypcji, które pozwalają na wstawienie kodującej sekwencji DNA.
Jeżeli sekwencja taka jest aktywna w wybranym organizmie gospodarza, do kontrolowania transkrypcji odpowiedniego genu można użyć naturalnej sekwencji DNA, takiej jak sekwencja regionu promotorowego. Sekwencja taka może też być zamieniona na inną sekwencję regionu promotorowego. Sposobem według wynalazku wykorzystuje się regiony promotorowe, które prowadzą konstytutywną ekspresję genu, jak również indukowane regiony promotorowe, pozwalające na ukierunkowaną regulację ekspresji zależnego genu.
Bakteryjne i wirusowe sekwencje regionu promotorowego z tymi własnościami były wcześniejszej obszernie opisywane w sztuce. Sekwencje regulatorowe pozwalające na ekspresję w mikroorganizmach (takich jak E. coli, S. cerevisiae) były wcześniej opisane w sztuce. Regionami promotorowymi, które pozwalają na szczególnie silną ekspresję zależnego genu są, na przykład region promotorowy faga T7 (Studier i wsp., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), Iacuv5, trp, trp lac-UV5 (DeBoer i wsp., w Rodriguez i Chamberlin (ed.), Promoters, Structure i Function; Praeger, Nowy Jork (1982), 462-481; DeBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), Ip1 rac (Boros i wsp., Gene 42 (1986), 97-100).
Największe ilości białka są zwykle wytwarzane w środku i pod koniec logarytmicznej fazy cyklu wzrostu mikroorganizmów. Z tego powodu, w celu wytwarzania białek, korzystnie używa się indukowanych regionów promotorowych. Takie regiony promotorowe często dają większe ilości białka niż konstytutywne regiony promotorowe.
Zastosowanie silnie konstytutywnego regionu promotorowego często prowadzi, ze względu na trwałą transkrypcję i translację klonowanego genu, do straty energii niezbędnej dla innych istotnych funkcji komórki, co w rezultacie spowalnia wzrost komórki (Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oksford, strona 342).
W celu osiągnięcia optymalnych ilości białka często używa się procesu dwuetapowego. Najpierw, komórki gospodarza są hodowane w warunkach optymalnych, aż do osiągnięcia względnie wysokiej gęstości komórek. W drugim etapie, zależnie od rodzaju użytego regionu promotorowego, indukowana jest transkrypcja. W tym kontekście, szczególnie przydatny jest indukowany przez laktozę albo IPTG (= izopropylo-b-D-tiogalactozylopiranozyd) region promotorowy tac (deBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Sygnały zakończenia transkrypcji też były wcześniejszej opisane w sztuce.
Transformację komórek gospodarza odpowiednimi cząsteczkami DNA kodującymi białko, prowadzi się za pomocą standardowych technik, takich jak opisywane przez Sambrook i wsp. (Molecular Cloning : Laboratory Course Manual, 2 wydanie (1989), CoId Spring Harbor Press, Nowy Jork). Komórki gospodarza hoduje się w pożywce, która odpowiada szczególnym wymaganiom używanych komórek gospodarza, przede wszystkim takim jak: wartość pH, temperatura, stężenie soli, napowietrzanie, antybiotyki, witaminy, pierwiastki śladowe.
Oczyszczanie wytworzonego przez komórki gospodarza enzymu prowadzi się za pomocą konwencjonalnych technik oczyszczania takich jak strącanie, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa, filtracja na żelu, chromatografia HPLC z odwróconą fazą.
PL 194 854 B1
Modyfikując DNA, który ma ulegać ekspresji w komórkach gospodarza, można wytworzyć polipeptyd, który dzięki swoim pewnym własnościom, może być łatwiejszy do izolacji z hodowli komórek gospodarza. Tak więc, istnieje możliwość wytwarzania białka, które jest połączone z inną sekwencją polipeptydową, której specyficzne własności wiążące pozwalają na izolację białka połączonego metodą chromatografii powinowactwa (patrz na przykład, Hopp i wsp., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; SassenfeID, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).
Dla ekspresji w komórkach roślinnych, korzystne są elementy regulatorowe regionu promotorowego patatyny B33. Innymi korzystnymi regionami promotorowymi są region promotorowy 35S CaMV i region promotorowy genu dehydrogenazy alkoholowej Saccharomyces cerevisiae.
Wektory wytworzone sposobem według wynalazku mogą zawierać inne elementy funkcjonalne, które ustabilizują wektor w organizmie gospodarza, na przykład, w celu stabilizacji w Saccharomyces cerevisiae np. bakteryjny początek replikacji albo 2-mikronowe-DNA. Ponadto, mogą one zawierać lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA Agrobacterium, które umożliwiają stałą integrację do genomu roślinnego.
Wektory wytworzone sposobem według wynalazku mogą zawierać także funkcjonalne terminatory, takie jak terminator genu syntazy octopiny z Agrobacterium.
W inny przykładzie wykonania sposobu według wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego wytworzona sposobem według wynalazku, jest połączona w wektorze wytworzonym sposobem według wynalazku z cząsteczką kwasu nukleinowego, kodującą funkcjonalną sekwencję sygnałową, umożliwiającą kierowanie enzymu do różnych przedziałów komórki. Ta modyfikacja może na przykład polegać na dodaniu N-końcowej sekwencji sygnałowej umożliwiającej wydzielanie enzymu do apoplastów roślinny wyższej.
Jakakolwiek modyfikacja prowadząca połączenia sekwencji sygnałowej do kodowanego FFT także wchodzi w zakres wynalazku. Cząsteczka kwasu nukleinowego zawarta w wektorze wytworzonym sposobem według wynalazku może zawierać w szczególności sekwencję kodującą sekwencję aminokwasową powodującą wydzielanie. W tym kontekście, korzystnie wykorzystuje się peptyd sygnałowy a-CGTazy z Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler i wsp., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) albo peptyd sygnałowy kodowany przez nukleotydy 11529-11618 sekwencji z numerem dostępu w banku genów X 86014.
W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku przedmiotem wynalazku jest plazmid p35-csFFT i p33-csFFT, budowa ich jest opisana w przykładach (fig. 2 i 4).
W dalszym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, przedmiotem wynalazku są komórki gospodarza, które przejściowo albo trwale zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego albo wektory wytworzone sposobem według wynalazku, lub komórki, które są wyprowadzone od takich komórek. W tym kontekście, komórką gospodarza jest organizm zdolny do przenoszenia rekombinowanego DNA in vitro i, jeżeli to konieczne, do wytwarzania białka kodowanego przez cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku. Komórki gospodarza mogą być komórkami prokariotycznymi, jak również eukariotycznymi. W szczególności są one komórkami mikroorganizmów.
W kontekście obecnego wynalazku, są to komórki wszystkich bakterii i protista (takich jak grzybów, w szczególności drożdży i glonów), tak jak są one zdefiniowane na przykład w Schlegel Allgemeine Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2). W nawiązaniu do prokariotycznego organizmu gospodarza należy zauważyć, że inulina ma pozytywny wpływ na wzrost pewnych mikroorganizmów, takich jak Bifidobacterium, żyjące w ludzkim przewodzie pokarmowym. Bifidobakterie mają działanie zdrowotne (patrz na przykład, Gibson i wsp., Int. Shugar J. 96 (1994), 381-386; Roberfroid i wsp., J. Nutrition 128 (1998), 11-19). Mogą one także mieć działanie hamujące rozwój nowotworów (patrz na przykład. Reddy i wsp., Carcinogenesis 18 (1997), 1371-1374; Singh i wsp., Carcinogenesis 18 (1997), 833-841).
W związku z tym, komórki gospodarza wytworzone sposobem według wynalazku, takie jak drożdże (chleb) lub bakterie kwasu mlekowego (jogurt, maślanka) mają zastosowanie w przemyśle przetwarzania żywności.
W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, komórki gospodarza wytworzone sposobem według wynalazku dodatkowo zawierają gen kodujący zależną od sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST). Takie sekwencje były, na przykład izolowane z karczocha (niemiecki dokument patentowy DE-A1 1970774), Cichorium intibus (de Halleux i wsp., Plant Physiol. 113 (1997), 1003-1013), Helianthus tuberosus (WO 96/21023) i Allium cepa (Vijn i wsp., Plant Physiol. 117 (1998), 1507-1513).
PL 194 854 B1
Przedmiotem wynalazku w szczególności są komórki rośliny transgenicznej transformowane cząsteczkami kwasu nukleinowego wytworzonymi sposobem według wynalazku lub zawierające systemy wektorowe wytworzone sposobem według wynalazku, albo ich pochodne albo ich części. Komórki takie, dzięki wprowadzeniu systemów wektorowych wytworzonych sposobem według wynalazku, albo ich pochodnych, albo ich części są zdolne do syntetyzowania enzymów wytwarzających długołańcuchową inulinę.
Komórki wytworzone sposobem według wynalazku korzystnie zawierają heterogenne odnośnie transformowanej komórki cząsteczki kwasu nukleinowego, to znaczy wytworzone sposobem według wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego, nie występujące naturalnie w tych komórkach, albo cząsteczki kwasu nukleinowego zlokalizowane w innym miejscu genomu niż odpowiednie naturalnie występujące sekwencje cząsteczki kwasu nukleinowego. Ponadto, takie komórki rośliny transgenicznej wytworzone sposobem według wynalazku korzystnie zawierają sekwencję DNA kodującą SST.
Przedmiotem wynalazku jest też białko kodowane przez cząsteczki kwasu nukleinowego wytworzone sposobem według wynalazku, jak również sposób jego wytwarzania, znamienny tym, że komórki gospodarza wytworzone sposobem według wynalazku hoduje się w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie białka. Następnie białko takie izoluje się z hodowli komórek i/albo z podłoża do hodowli. Przedmiotem wynalazku jest też FFT uzyskana z komórek gospodarza wytworzonych sposobem według wynalazku lub wyizolowana sposobem według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku są też cząsteczki kwasu nukleinowego, które specyficznie hybrydyzują z cząsteczkami kwasu nukleinowego wytworzonymi sposobem według wynalazku, z cząsteczkami komplementarnymi do tych cząsteczek, albo do części takich cząsteczek. Są to korzystnie oligonukleotydy o długości przynajmniej 10, w szczególności przynajmniej 15 i szczególnie korzystnie przynajmniej 50 nukleotydów. Oligonukleotydy wytworzone.sposobem według wynalazku mogą na przykład być używane jako primery w reakcji PCR. Mogą też być składnikami konstrukcji antysensownych lub cząsteczkami DNA kodującymi odpowiednie rybozymy.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania komórek rośliny transgenicznej, tkanki roślinnej lub roślinny obejmujący wprowadzenie do komórki roślinnej, tkanki roślinnej lub rośliny cząsteczki kwasu nukleinowego albo wektora wytworzonych sposobem według wynalazku.
Dostarczenie za pomocą technik rekombinacji DNA cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku umożliwia wytwarzanie w różnych organizmach długołańcuchowej inuliny, w szczególności w roślinach, co było dotychczas niemożliwe do osiągnięcia za pomocą technik konwencjonalnych, na przykład metodami hodowlanymi. Zwiększenie aktywności FFT sposobem według wynalazku, na przykład przez nadekspresję cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku, lub przez dostarczenie mutantów, które nie podlegają specyficznym komórkowo mechanizmom regulacyjnym i/albo wykazują odmienną zależność aktywności od temperatury, umożliwia zwiększenie plonów roślinny dzięki odpowiednim modyfikacjom za pomocą technik rekombinacji DNA.
Sposobem według wynalazku możliwe jest uzyskanie w komórkach roślinnych ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku w celu zwiększenia aktywności FFT, lub wprowadzenie tego enzymu do komórek, które normalnie go nie wytwarzają.
Ponadto, w celu otrzymania sposobem według wynalazku FFT, która nie podlega specyficznym komórkowo mechanizmom regulacji lub która wykazuje modyfikowaną zależność temperaturową, albo specyficzność substratową, albo produktową, możliwe jest modyfikowanie cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku sposobami znanymi biegłym w sztuce.
W tym celu, można wykorzystać różne systemy transformacji roślin. Wykorzystanie T-DNA w celu transformowania komórek roślinnych było intensywnie badane i jest opisane w dokumencie patentowym EP-A-120516; Hoekema: Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Rozdział V, Fraley, Crit. Rev. Plant Sci., 4, 1-46 i An, EMBO J. 4 (1985), 277-287.
W celu wprowadzenia DNA do komórek rośliny, eksplanty roślinne korzystnie hoduje się razem z Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes. Z zakażanego materiału roślinnego (na przykład części liści, segmentów wiązki przewodzącej, korzeni, lub protoplastów, albo hodowanych w zawiesinie komórek roślinnych) można w odpowiednim podłożu, które dodatkowo może zawierać antybiotyki albo biocydy umożliwiające wyselekcjonowanie transformowanych komórek, odtworzyć całą roślinę. Rośliny otrzymane w ten sposób bada się czy zawierają wprowadzony DNA.
PL 194 854 B1
Inną możliwością wprowadzenia obcego DNA jest użycie metody biolisticznej lub transformowanie protoplastów. Obie metody znane są biegłym w sztuce (patrz, na przykład Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants, W: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J., Rehm, G. Trzcina, A. Puhler, P. Stadler. redaktorzy), Tom 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
Alternatywnymi systemami transformacji roślin jednoliściennych są transformacje za pomocą metody biolisticznej, elektrycznie albo chemicznie indukowane pobieranie DNA przez protoplasty, elektroporacja częściowo uprzepuszczalnionych komórek, makroiniekcja DNA do kwiatostanów, mikroiniekcja DNA do mikrospor lub do woreczka zarodkowego za pomocą trawienia (patrz na przykład Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571-582; Paszkowski, Biotechnology 24 (1992), 387-392).
Podczas gdy transformacja roślin dwuliściennych przez systemy wektorowe oparte na plazmidzie Ti za pomocą Agrobacterium tumefaciens jest dobrze znanym sposobem, najnowsze badania wskazują, że transformacja wektorami opartymi na Agrobacterium może też być używana w przypadku roślin jednoliściennych (Chan i wsp., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei i wsp., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri i wsp., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould i wsp., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney i wsp., Plant, Cell Tiss. and Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li i wsp., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).
Trzy wyżej wymienione systemy transformacji były w przeszłości przystosowane do transformacji różnych typów zbóż: elektroporacja tkanek roślinnych, transformacja protoplastów i wprowadzanie DNA przez bombardowanie cząsteczkami komórek i tkanek zdolnych do regeneracji (przegląd metod opisany w Jahne i wsp., Euphytica 85 (1995), 35-44). Transformacja pszenicy różnymi sposobami jest także opisana w odpowiedniej literaturze (przegląd w Maheshwari i wsp., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).
W czasie ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku w roślinach, możliwe jest w zasadzie skierowanie syntetyzowanego białka do jakiegokolwiek przedziału komórki roślinnej. W celu uzyskania lokalizacji w określonym, pożądanym przedziale komórkowym, należy usunąć sekwencję zapewniającą lokalizację w wodniczce, a region kodujący można połączyć z sekwencją DNA, która zapewnia lokalizację w pożądanym przedziale komórkowym. Takie sekwencje są znane w sztuce (patrz na przykład Braun, EMBO. J. 11 (1992). A 3219-1227 a Walter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; SonnewalD, Plant J. l (1991), 95-106; Rocha Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29).
Przedmiotem wynalazku są też komórki rośliny transgenicznej i tkanka roślinna i roślina, które były transformowane jedną albo kilkoma cząsteczkami kwasu nukleinowego wytworzonymi sposobem według wynalazku, jak również komórki rośliny transgenicznej wyprowadzane od komórek transformowanych w taki sposób. Takie komórki zawierają jedną albo kilka cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonych sposobem według wynalazku, przy czym cząsteczki te są korzystnie połączone z regulatorowymi elementami DNA, które zapewniają transkrypcję w komórce roślinnej, w szczególności z regionem promotorowym.
Takie komórki różnią się od naturalnie występujących komórek roślinnych, ponieważ zawierają one przynajmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego wytworzoną sposobem według wynalazku, która nie występuje naturalnie w tych komórkach, albo która jest włączona w genom komórki w pozycji w której nie występuje w naturze, to znaczy występuje w innym otoczeniugenomowym.
Ponieważ 1-kestoza jest naturalnym substratem FFT i powstaje z sacharozy w reakcji katalizowanej przez zależną od sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST), szczególnie korzystne i prawdopodobnie konieczne jest dostarczenie SST razem z cząsteczką kwasu nukleinowego, wektorem albo FFT wytworzonymi sposobem według wynalazku. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku przedmiotem wynalazku są komórki rośliny transgenicznej, tkanka roślinna albo roślina, która dodatkowo zawiera gen kodujący zależną od sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST). To mogą być na przykład rośliny albo komórki roślinne, które naturalnie wytwarzają SST, takie jak cykoria, Helianthus tuberosus, lub dalia, albo rośliny do których sekwencja DNA kodująca SST została wprowadzana za pomocą technik rekombinacji DNA. Sekwencja ta może być wprowadzona niezależnie albo równocześnie z cząsteczką kwasu nukleinowego albo z wektorem wytworzonymi sposobem według wynalazku.
Komórki rośliny transgenicznej i tkanki roślinne regeneruje się do całej roślinny za pomocą technik znanych biegłym w sztuce. Roślinny otrzymane przez regenerację komórek rośliny transgenicznej wytworzonych sposobem według wynalazku też są przedmiotem tego wynalazku. Przedmiotem wynalazku są też rośliny, które zawierają opisywane wyżej komórki rośliny transgenicznej. KoPL 194 854 B1 mórki rośliny transgenicznej mogą w zasadzie, być komórkami jakimikolwiek pożądanego gatunku rośliny, to znaczy rośliny jednoliściennej, jak również rośliny dwuliściennej. Korzystnie są to rośliny użytkowe, w szczególności rośliny zawierające sacharozę, takie jak ryż, kukurydza, burak cukrowy, trzcina cukrowa albo ziemniak, warzywa, na przykład pomidor, marchew, por, cykoria, trawy paszowe, batat, pszenica, jęczmień, rzepak albo soja.
Przedmiotem wynalazku jest też rozmnażanie materiału roślinnego i zbieranie produktów rośliny wytworzonej sposobem według wynalazku, takich jak owoce, nasiona, bulwy, kłącza, rozsada, sadzonka, kallus lub hodowle komórkowe.
Przedmiotem wynalazku jest też dlugołańcuchowa inulina wytworzona w komórkach gospodarza wytworzonych sposobem według wynalazku, w szczególności z komórek rośliny trangenicznej, tkanek roślinnych i roślin, jak również w rozmnożonym materiale roślinnym lub zebranych produktach roślinnych.
W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzanie długołańcuchowej inuliny obejmujący:
(a) hodowanie komórki gospodarza, szczególnie komórki roślinnej, tkanki roślinnej albo rośliny wytworzonej sposobem według wynalazku, w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie FFT i zamianę 1-kestozy, opcjonalnie dostarczoną z zewnątrz, lub równoważnego substratu do długołańcuchowej inuliny i (b) odzyskiwanie tak wytworzonej inuliny z hodowanych komórek gospodarza, w szczególności z komórek roślinnych, tkanek albo roślin, lub z podłoża do hodowli.
W dalszym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania długołańcuchowej inuliny obejmujący:
(a) doprowadzenie do kontaktu 1-kestozy albo równoważnego substratu z FFT wytworzoną sposobem według wynalazku w warunkach, które pozwalają na ich zamianę do długołańcuchowej inuliny i (b) odzyskiwanie tak wytworzonej inuliny.
odzyskiwanie inuliny z różnych źródeł, w szczególności z tkanki roślinnej, jest opisane na przykład w Gibson i wsp., Int. Shugar J. 96 (1994), 381-386; Baxa, Czech J. Food Sci. 16 (19-96), 12-7-6; EP-A-787745; de Leenheer, Carbohydr Org. Raw Mater. III, Workshop (1996), Meeting Date 1994, 67-92, Verlag VCH Weinheim, niemieckim i rosyjskim dokumencie patentowym RU 2001621C1.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dlugołańcuchowej inuliny in vitro obejmujący użycie sacharozy jako substratu i kombinacji enzymów SST i FFT wytworzonych sposobem według wynalazku. W dalszym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania in vitro inuliny obejmujący użycie mieszaniny zawierającej oligomer fruktozylu i FFT wytworzoną sposobem według wynalazku. W tym kontekście, oligomer fruktozylu jest oligomerem składającym się z jednostek fruktozy z DP w przybliżeniu 2 do 7, który może posiadać na końcu resztę glukozy. Wykonując sposób według wynalazku, korzystnie używa się zrekombinowanych białek.
W kontekście obecnego wynalazku są to białka, które były wytworzone przez wprowadzanie poszczególnych kodujących białko sekwencji DNA do komórek gospodarza. Białko takie można potem odzyskać z komórki gospodarza i/lub z podłoża do hodowli. Komórka gospodarza korzystnie jest komórką gospodarza wytworzoną sposobem według wynalazku, tak jak określono powyżej.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku używa się wytworzonych sposobem według wynalazku enzymów, które były wytworzone przez rekombinację i są wydzielane przez komórkę gospodarza do podłoża do hodowli, tak że nie jest konieczne rozrywanie komórek lub dalsze oczyszczanie tego białka, ponieważ wydzielone białko można otrzymać z nadsączu komórkowego.
W celu usunięcia resztek podłoża do hodowli, używa się konwencjonalnych technik obróbki, takich jak dializa, odwrócona osmoza, metody chromatograficzne. To samo odnosi się do zatężania białka wydzielanego do podłoża do hodowli.
Wydzielanie białka przez mikroorganizmy zachodzi zwykle dzięki obecności N-końcowych peptydów sygnałowych (sekwencja sygnałowa, peptyd wiodący). Białka z taką sekwencją sygnałową przenikają przez błonę komórkową mikroorganizmu. Wydzielanie białek można uzyskać przez połączenie sekwencji DNA kodującej taki peptyd sygnałowy z odpowiednim regionem kodującym enzymu.
PL 194 854 B1
Korzystnie używa się peptydu sygnałowego a-CGTazy z Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler i wsp., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) albo peptydu sygnałowego kodowanego przez nukleotydy 11529-11618 sekwencji z numerem dostępu w banku genów X 86014.
Enzymy używane sposobem według wynalazku alternatywnie wytwarza się w systemach transkrypcji i translacji in vitro, które prowadzą do ekspresji białek. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku FFT wytwarzana jest w protoplastach tkanki liścia roślin.
Przedmiotem wynalazku jest inulina, która jest wytwarzana w komórkach gospodarza, w szczególności w komórce roślinnej, tkance roślinnej albo roślinie wytworzonych sposobem według wynalazku, jak również w rozmnożonym materiale roślinnym lub zebranych produktach rośliny i komórek rośliny wytworzonej sposobem według wynalazku lub rośliny, która jest uzyskana jednym z wyżej wymienionych sposobów.
Inulina korzystnie jest używana w celu wytwarzania środków powierzchniowo czynnych do zwiększenia lepkości roztworów wodnych, jako detergent, jako środek zawieszający, w celu przyśpieszenia osiadania, w celu kompleksowania lub wiązania wody.
Te lub inne opisane przykłady wykonania sposobu według wynalazku są oczywiste dla biegłych w sztuce. Są one zawarte przez opis i przykłady sposobu według wynalazku. Ponadto, znana jest w sztuce i dostępna w bibliotekach publicznych albo ze źródeł elektronicznych literatura, która dotyczy wyżej wymienionych sposobów, środków albo zastosowań, i która może być wykorzystana w zakresie obecnego wynalazku. Publiczne bazy danych, które mogą służyć temu celowi, to na przykład, Medline, która jest dostępna przez Internet, na przykład pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Inne bazy danych i ich adresy znane są osobom biegłym w sztuce i mogą być znalezione przez Internet, na przykład pod adresem http://www.lycos.com. Przegląd źródeł i informacji na temat patentów lub zgłoszeń patentowych z dziedziny biotechnologii można znaleźć w Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Figury przedstawiają:
Figura 1 pokazuje analizę metodą HPLC pełnego ekstraktu protoplastów. Protoplasty były transformowane różnymi wektorami:
A: transformowane wektorem pA7, który nie zawiera regionu kodującego połączonego z regionem promotorowym CaMV 35S.
B: transformowane wektorem pA7-csFFT, który zawiera region kodujący transferazę fruktan:fruktan-fruktozyl z karczocha połączony z regionem promotorowym CaMV 35S.
C: transformowane wektorem pA7-htFFT, który zawiera region kodujący transferazę fruktan:fruktanfruktozyl z Helianthus tuberosus połączony z regionem promotorowym CaMV 35S. Przed analizą, każdy pełny ekstrakt protoplastów inkubuje się z mieszaniną oligomeru fruktozylowego przez 12 godzin. Analizę wykonuje się tak jak opisano w przykładzie 1.
Figura 2 pokazuje budowę plazmidu p35-csFFT
Figura 3 pokazuje analizę metodą HPLC rośliny transgenicznej, która była transformowana konstruktem p35-csFFT. Analiza wykazuje, że w roślinach transgenicznych, które wytwarzają SST, jak również FFT z karczocha (35S-SST/FFT 22/19) tworzą się cząsteczki długołańcuchowej inuliny.
Figura 4 pokazuje budowę plazmidu p33-csFFT
Figura 5 pokazuje analizę metodą HPLC rośliny transgenicznej, która była transformowana konstruktem p33-csFFT. Analiza wykazuje, że w roślinach transgenicznych, które wytwarzają SST, jak również FFT z karczocha (B33-SST/FFT 47) tworzą się cząsteczki długołańcuchowej inuliny.
Przykłady ilustrują wynalazek.
P r z y k ł a d 1: Identyfikacja, izolacja i charakteryzacja cDNA kodującego transferaze fruktozylu z karczocha (Cynara scolymus)
Z naczyń karczocha izoluje się całkowity RNA (Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 wydanie, CoId Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Poli(A)+ mRNA izoluje się za pomocą systemu mRNA izolacji PolyATract (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się z 5 mg tego RNA za pomocą zestawu do syntezy ZAP-cDNA z Stratagene (Heidelberg) według instrukcji wytwórcy.
Uzyskuje się 2x106 niezależnych zrekombinowanych klonów bakteriofagów. Namnożoną bibliotekę cDNA bada się standardowymi sposobami w łagodnych warunkach hybrydyzacji, używając znakowanych 32P fragmentów DNA odpowiadających cDNA SST karczocha (fragment Notl plazmidu pCy21 opisanego w dokumencie patentowym DE 1970874.4).
PL 194 854 B1
Sekwencja SST z karczocha jest opisana w dokumencie patentowym DE 19708774.4. Pozytywne klony bada się w ostrych warunkach hybrydyzacji, używając jako sondy SST. Klony, które dały pozytywną hybrydyzację podczas tego badania, usuwa się ponieważ ewidentnie jest to SST cDNA. Z pozostałych klonów cDNA izoluje się insert przez cięcie wyizolowanego w standardowy sposób plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego Notl i wstawia się do wektora pA7. Lepkie końce fragmentu Notl wypełnia się przy użyciu polimerazy T4. Następnie, fragment taki włącza się w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Smal wektora pA7. Wektor pA7 jest pochodnym wektora pUC18 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119), który między miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI i miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SacI polilinkera ma wstawiony region promotorowy 35S wirusa mozaiki kalafiora (nukleotydy od 7146 do 7464, tak jak opisano w Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2871-2888).
Oprócz regionu promotorowego 35S, wektor pA7 zawiera sygnał poliadenylacji genu 3 T-DNA Ti plazmidu pTi ACH 5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846), nukleotydy od 11749 do 11939, który był wyizolowany jako fragment PvuII-HindIII z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella, Nature 303 (1983), 209-213) i po dodaniu łącznika Sphl w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny PvuII, wklonowany między miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Sphl i miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Hindlll polilinkera.
Pochodnymi wektora pA7, które zawierały cDNA z karczocha, transformuje się tytoń protoplast stosownie do sposobu opisanego przez Negrutiu (Plant Mol. Biol. 8, (1987), 363-373). Transformowane protoplasty hoduje się w podłożu K3 (Nagy i Maliga, Z. Pflanzenphysiologie 78 (1976), 453-455) w temperaturze 25°C przez dwa dni w ciemności. Następnie, przez powtarzanie zamrażania i rozmrażania otrzymuje się ekstrakty komórkowe. Ekstrakty inkubuje się z oligofruktanami (67,5% 1-kestozy, 28,4% nystozy, 3,6% fruktozylonystozy, 0,5% sacharozy) przez 12 godzin w temperaturze 28°C i analizuje metodą HPLC. Analizę metodą HPLC prowadzi się na anionowymiennej kolumnie CarboPac PA 100, która podłączona jest do chromatografu gradientowego Dionex DK-300 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Monomery, oligomery i polimery cukrów wykrywa się za pomocą detektora pulsoamperometrycznego. Używa się następujących nastaw detektora: T i = 0,48 sekundy; T2 = 0,12 sekundy; T3 = 0,12 sekundy; E1 = 0,05 V; E2 = 0,65 V; E3 = 0,95 V; czułość =0,1 liC; integracja = 0,28-0,48 sekundy; faza ruchoma A = 0,15 M NaOH; faza ruchoma B = 1 M NaAc w 0,15 M NaOH; gradient: 10 minut 100% A; 2 minuty liniowy gradient od 0% B do 100% B; 2 minuty 100% B; 2 minuty liniowy gradient od = 0% A do 100% A; 5 minut A. Przed użyciem próbki odsala się i filtruje (microcon 10, amicon, Beverly, USA). Szybkość przepływu wynosi 1 ml minutę. W niektórych ekstraktach, znajduje się wysokocząsteczkową inulinę (porównaj figura 1).
P r z y k ł a d 2 : Analiza sekwencji cDNA. insertu plazmidu pCy3
Insert cDNA z wektora pochodnego pA7 (pCy3), który powodował syntezę wysokocząsteczkowej inuliny w protoplastach sekwencjonuje się za pomocą techniki didezoksynukleotydów (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Insert klonu pCy3 jest DNA o długości 2073 par zasad. Jego sekwencja nukleotydowa pokazana jest pod SEQ ID No. 1. Odpowiednia sekwencja aminokwasowa jest pokazana pod SEQ ID No. 2. SEQ ID No. 3 jest wariantem SEQ ID No. 1, który koduje to samo białko, które jest kodowane przez SEQ ID No. 1.
Analiza sekwencji i porównanie z już publikowaną sekwencją wykazały, że sekwencja pokazana pod SEQ ID No. 1 jest nowa i zawiera region kodujący, posiadający homologię do FFTs z innych organizmów.
P r z y k ł a d 3: Wytwarzanie plazmidu p35-csFFT i integracja tego plazmidu do genomu ziemniaka
Plazmid p35-csFFT (figura 2) zawiera trzy fragmenty A, B i C binarnego wektora pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711, modyfikowane według Becker, Nucleic Acids Res. 18 (1990), 203).
Fragment A zawiera region promotorowy 353 wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). Zawiera on nukleotydy od 7146 do 7464 (Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2871-2888), wstawione między miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI i miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SacI polylinkera pBin19 Hyg.
Fragment B zawiera nukleotydy 1 do 2073 sekwencja SEQ ID No. 1. Fragment B otrzymuje się jako fragment Notl wektora pBK-CMV, do którego była wstawiana w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI przy użyciu łącznika EcoRI/Notl. Fragment C zawiera sygnał poliadenylacji genu 3 T-DNA Ti plazmid pTi ACH 5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846), nukleotydy od 11749 do 11939, który był wyizolowany jako fragment PvuII-HindIII z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella,
PL 194 854 B1
Nature 303 (1983), 209-213) i po dodaniu łącznika Sphl do miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny PvuII, został wklonowany między miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Sphl i miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny HindIII polilinkera pBin19 Hyg.
Plazmid p35-csSST wprowadza się do Agrobacteria (Hofgen i Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877) i następnie wprowadza się do ziemniaka metodą przenoszenia genów przy użyciu Agrobacterium, stosownie do opisanych powyżej standardowych technik. Ziemniak transformuje się sekwencją DNA kodującą SST karczocha (patrz niemieckie zgłoszenie patentowe DE-A119708774), i uzyskuje się ekspresję tej sekwencji pod kontrolą regionu promotorowego 35S. Z transformowanych komórek odtwarza się całe rośliny. Z liści odtworzonych roślin otrzymuje się ekstrakty i bada je pod kątem obecności polimerów fruktozylu. Analizę prowadzi się tak jak opisaną w przykładzie 1.
Analiza liści wielu roślin transformowanych tym wektorem jednoznacznie wykazała występowanie wysokocząsteczkowej inuliny, co wynika z ekspresji genu FFT karczocha, zawartego w p35-csFFT (patrz figura 3).
T ab ela I
Analiza zawartości inuliny w transgenicznych bulwach ziemniaka zdolnych do ekspresji genów SST i FFT karczocha
Numer rośliny Zawartość fruktanu mmol fruktozy/g Średni stopień polimeryzacji
świeżej masy (stosunek fruktoza/glukoza)
35 SST/FFT 22/26 30,81 21 (20/1)
35 SST/FFT 36/17 27,34 20 (19/1)
P r z y k ł a d 4: Wytwarzanie plazmidu p33-csFFT i integracja plazmidu do genomu ziemniaka
Plazmid p33-csFFT (figura 4) jest identyczny z plazmidem p35-csFFT, z wyjątkiem fragmentu A, który zamiast regionu promotorowego 35S CaMV zawiera region promotorowy B33 genu b33 patatyny ziemniaka. Zawiera on fragment Dral (pozycja -1512 do pozycji +14) genu b33 patatyny (Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29), który wstawia się między miejsce rozpoznawane przez enzym, restrykcyjny EcoRI i miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SacI polilinkera pBin19Hyg. Plazmid p33-csFFT ma wielkość w przybliżeniu 14 par zasad.
Plazmid p33-csSST wprowadza się do ziemniaka metodą przenoszenia genów przy użyciu Agrobacterium, tak jak opisano w przykładzie 3. Ziemniak transformuje się sekwencją DNA kodującą SST karczocha (patrz niemieckie zgłoszenie patentowe DE-A119708774), i uzyskuje się ekspresję tej sekwencji pod kontrolą regionu promotorowego B33. Z transformowanych komórek odtwarza się całe rośliny. Analiza bulw wielu roślin transformowanych tym wektorem jednoznacznie wykazała występowanie wysokocząsteczkowej inuliny, co wynika z ekspresji genu FFT karczocha, zawartego w p33-csFFT (patrz figura 5).
PL 194 854 Β1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) APPLIKANT:
(A) NAZWA: Max-Planck-Gesellschaft zur Fórderung der Wissenschaften, e.V.
(B) ULICA: brak (C) MIASTO: Berlin (D) STAN: brak (D) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY : brak (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białka posiadające aktywność fruktozylotransferazy i sposoby wytwarzania długołańcuchowej inuliny (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) FORMA NOŚNIKA KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0,
Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:1:
PL 194 854 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(Aj DŁUGOŚĆ: 2073 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW:pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE:21..1872 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:
TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT 50
Met Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu
10
GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA 98
Glu His Ala Pro Asn His Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro
15 20 25
CCG GCC GCC GTG AGA AAC CGG TTG TTG ATT AGG GTT TCG TCC AGT ATC 146
Pro Ala Ala Val Arg Asn Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile
30 35 40
ACA TTG GTC TCT CTG fpipip TTT GTT TCA GCA TTC CTA CTC ATT CTC CTG 194
Thr Leu Val Ser Leu Phe Phe Val Ser Ala Ehe Leu Leu Ile Leu Leu
45 50 55
TAC CAA CAC GAT TCC ACT TAC ACC GAT GAT AAT TCA GCA CCG TCG GAA 242
Tyr Gin His Asp Ser Thr Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu
PL 194 854 Β1
60 65 70
AGT TCT TCC CAG CAG CCC TCC GCT GCC GAT CGC CTG AGA TGG GAG AGA 290
Ser Ser Ser Gin Gin Pro Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg
75 Θ0 85 90
ACA GCT TTT CAT TTC CAG CCC GCC AAA AAT TTC ATT TAT GAT CCC AAC 338
Thr Ala Phe His Phe Gin Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn
95 100 105
GGT CCA TTG TTC CAT ATG GGT TGG TAC CAT CTT TTC TAC CAA TAC AAC 386
Gly Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn
110 115 120
CCG TAC GCA CCG TTT TGG GGC AAC ATG ACA TGG GGT GAC GCC GTG TCC 434
Pro Tyr Ala Pro Phe Trp Gly Asn Met' Thr Trp Gly His Ala Val Ser
125 130 135
AAA GAC ATG ATC AAC TGG TTC GAG CTT CCG ATC GCC TTG GCC CCA ACC 482
Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr
140 145 150
GAA TGG TAC GAT ATC GAG GGT GTT TTA TCA GGC TCA ACC ACG ATC CTC 530
Glu Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu
155 160 165 170
CCT GAT GGT CGA ATC TTT GCT CTC TAT ACC GGA AAC ACA AAC GAT CTC 578
Pro Asp Gly Arg Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu
175 180 185
GAG CAA CTT CAA TGC AAA GCC GTG CCA GTT AAT GCA TCC GAC CCA CTT 626
Glu Gin Leu Gin Cys Lys Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu
190 195 200
CTT GTT GAA TGG GTC AGG TAC GAT GCT AAC CCG ATC CTG TAT GCT CCA 674
Leu Val Glu Trp Val Arg Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro
205
210
215
PL 194 854 B1
TCA GGG ATC GGG TTA ACA GAT TAC CGG GAC CCG TCA ACA GTT TGG ACG 722
Ser Gly Ile Gly Leu Thr Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr
220 225 230
GGT CCC GAT GGA AAA CAT CGG ATG ATC ATA GGG ACT AAA CGA AAT ACT 770
Gly Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr
235 240 245 250
ACA GGA CTC GTA CTT GTA TAC CAT ACC ACC GAT TTC ACA AAC TAC GTA 818
Thr Gly Leu Val Leu Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val
255 260 265
ATG TTG GAC GAG CCG TTG CAC TCG GTC CCC AAC ACT GAT ATG TGG GAA 866
Met Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu
270 275' 280
TGT GTC GAC CTT TAC CCT GTG TCA ACG ACC AAC GAT AGT GCA CTT GAT 914
Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp
285 290 295
GTT GCG GCC TAT GGT CCG GGT ATC AAG CAT GTG CTT AAA GAA AGT TGG 962
Val Ala Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp
300 305 310
GAG GGA CAC GCG ATG GAC TTT TAC TCG ATC GGG ACA TAC GAT GCA TTT 1010
Glu Gly His Ala Met Asp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe •
315 320 325 330
AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA CTA GAC GTC GGT ATC GGG 1058
Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly
335 340 345
TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106
Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp
350 355 360
CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154
PL 194 854 B1
Pro Leu Lys 365 Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala GLu Ser Asp
370 375
AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202
Ser Tyr Asp GLn Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val
380 385 390
GCA AGG ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA 1250
Ala Arg Thr Ile Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin
395 400 405 410
TGG CCG GTG GAG GAA ATC GAG AGC TTG AGA TCC AAC GGT CAT GAA TTC 1298
Trp Pro Val Glu GLu He Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe
415 420 425
AAA AAT ATA ACA CTT GAG CCG GGC TCG ATC ATT CCC CTC GAC GTA GGC 1346
Lys Asn Ile Thr Leu GLu Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly
430 435 440
TCA GCT ACG CAG TTG GAC ATC GTT GCA ACA Τψτ GAG GTG GAT CAA GAG 1394
Ser Ala Thr GLn Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp GLn Glu
445 450 455
GCG TTA AAA GCA ACA AGT GAC ACG AAC GAC GAA TAC GGT TGC ACC ACA 1442
Ala Leu Lys Ala Thr Ser Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr
460 465 470 z
AGT TCG GGT GCA GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT GCA 1490
Ser Ser Gly Ala Ala Lys Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile ALa
475 480 485 490
GTT CTT GCC CAC GGA ACC CTT TCG GAG TTA ACT CCG GTG TAT TTC TAC 1538
Val Leu Ala His GLy Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr
495 500 505
ATT GCT AAA AAC ACC AAG GGA GGT GTG GAT ACA CAT TTT TGT ACG GAT 1586
Ile Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp
PL 194 854 B1
510 515 520
AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 1634
Lys Leu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly
525 530 535
AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682
Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu
540 545 550
GTG GAT CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 1730
Val Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe ALa Gin Gly Gly Arg Thr Val
555 560 565 570
ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA aTA TAC GAA GCA GCC AAG 1778
Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys
575 580 585
CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1826
Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu
590 595 600
AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1872
Lys Val Trp Gin Mer Ser Gin Ala Phe Val .Lys Ala Tyr Pro Phe
605 610 615
AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT TTATCTGTGT 1932
GTTATGTTAA GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992
AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTAITTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2073
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 617 aminokwasów (B) TYP: aminokwas
PL 194 854 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:
M«t Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu Glu His Ala Pro Asn His
1 5 10 15
Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro Pro Ala Ala Val Arg Asn
20 25 30
Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile Thr Leu Val Ser Leu Phe
35 40 45
Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu Tyr GLn His Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu Ser Ser Ser GLn GLn Pro
65 70 75 80
Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg Thr Ala Phe His Phe GLn
85 90 95
Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn Gly Pro Leu Phe His Met
100 105 110
Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn Pro Tyr Ala Pro Phe Trp
115 120 125
Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp
130 135 140
Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr Glu Trp Tyr Asp Ile Glu
145 150 155 160
Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu Pro Asp Gly Arg Ile Phe
165 170 175
Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu Glu GLn Leu GLn Cys Lys
180 185 190
PL 194 854 Β1
Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Leu Val Glu Trp Val Arg
195 200 205
Tyr Asp Ala Asn Pro Ile leu Tyr Ala Pro Ser Gly Ile Gly Leu Thr
210 215 220
Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr Gly Pro Asp Gly Lys His
225 230 235 240
Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr Thr Gly Leu Val Leu Val
245 250 255
Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val Met Leu Asp Glu Pro Leu
260 265 270
His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro
275 280 285
Val Ser Thr -Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro
290 295 300
Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Ala Met Asp
305 310 315 320
Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala The Asn Asp Lys Trp Thr Pro
325 330 335
Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly
340 345 350
Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser -Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg
355 360 365
Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Tyr Asp Gin Asp Val
370 375 380
Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Ala Arg Thr Ile Val Leu
385 390 395 400
Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin Trp Pro Val Glu Glu Ile
405 410 415
PL 194 854 Β1
Glu Ser Leu Arg 420 Ser Asn Gly His Glu Phe Lys Asn Ile Thr Leu Glu
425 430
Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly Ser Ala Thr Gin Leu Asp
435 440 445
Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu Ala Leu Lys Ala Thr Ser
450 455 460
Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Lys
465 470 475 480
Gly Glu Val Leu Asp His -Ser Gly Ile Ala Val Leu Ala His Gly Thr
485 490 495
Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys
500 505 510
Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Tyr
515 520 525
Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Val Pro Val Leu
530 535 540
Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val
545 550 555 560
Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Vał Ile Thr Ser Arg Val Tyr
565 570 575
Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Phe Vał Phe Asn Asn
580 585 590
Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu Lys Val Trp Gin Met Ser
595 600 605
Gin Ala Phe val Lys Ala Tyr Pro Phe
610 615 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
PL 194 854 Β1 (A) DŁUGOŚĆ: 2073 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW:pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy (iii) HIPOTETYCZNY: tak (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE:21..1872 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:
TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT 50
Met Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu
620 625
GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA 98
Glu His Ala Pro Asn His Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro
630 635 640
CCG GCC GCC GTG AGA AAC CGG TTG TTG ATT AGG GTT TCG TCC AGT ATC 146
Pro Ala Ala Val Arg Asn Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile
645 650 655
ACA TTG GTC TCT CTG TTT TTT GTT TCA GCA TTC CTA CTC ATT CTC CTG 194
Thr Leu Val Ser Leu Phe Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu
660 665 670 675
TAC CAA CAC GAT TCC ACT TAC ACC GAT GAT AAT TCA GCA CCG TCG GAA 242
Tyr Gin His Asp Ser Thr Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu
680 685 690
AGT TCT TCC CAG CAG CCC TCC GCT GCC GAT CGC CTG AGA TGG GAG AGA 290
PL 194 854 Β1
Ser Ser Ser Gin 695 Gin Pro Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg
700 7 05
ACA GCT TTT CAT TTC CAG CCC GCC AAA AAT TTC ATT TAT GAT CCC AAC 338
Thr Ala Phe His Phe Gin Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn
710 715 720
GGT CCA TTG TTC CAT ATG GGT TGG TAC CAT CTT TTC TAC CAA TAC AAC 386
Gly Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn
725 730 735
CCG TAC GCT ccc TTT TGG GGA AAC ATG ACT TGG GGA CAT GCC GTC AGT 434
Pro Tyr Ala Pro Phe Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser
740 745 750 755
AAG GAT ATG ATA AAT TGG TTT GAA TTA CCG ATA GCC TTA GCG CCA ACT 482
Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr
760 765 770
GAG TGG TAC GAC ATA GAA GGT GTT CTG AGT GGC AGT ACT ACC ATT TTA 530
Glu Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu
775 780 785
CCT GAC GGA AGA ATT TTC GCT CTC TAC ACC GGA AAT ACA AAC GAC CTC 578
Pro Asp Gly Arg Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu
790 795 800 -
GAG CAG CTC CAG TGT AAG GCC GTG CCA GTT AAT GCT AGT GAT CCA TTA 626
Glu Gin Leu Gin Cys Lys Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu
805 810 815
TTG GTA GAA TGG GTT CGC TAC GAT GCC AAT CCG ATA TTA TAT GCC CCT 674
Leu Val Glu Trp Val Arg Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro
Θ20 825 830 835
AGT GGC ATC GGC CTC ACA GAT TAC AGA GAT CCT AGT ACT GTG TGG ACG 722
Ser Gly Ile Gly Leu Thr Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr
PL 194 854 Β1
840 845 850
GGC CCT GAC GGT AAA CAC CGT ATG ATA ATC GGG ACG AAG AGG AAT ACG 770
Gly Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr
855 860 865
ACT GGA CTC GTC TTA GTA TAT CAC ACT ACC GAC TTT ACA AAT TAT GTA 818
Thr Gly Leu Val Leu Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val
870 875 880
ATG TTG GAC GAG CCG TTG CAC TCG GTC CCC AAC ACT GAT ATG TGG GAA 866
Met Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu
385 890 895
TGT GTC GAC CTT TAC CCT GTG TCA ACG ACC AAC GAT AGT GCA CTT GAT 914
Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp
900 905 910 915
GTT GCG GCC TAT GGT CCG GGT ATC AAG CAT GTG CTT AAA GAA AGT TGG 962
Val Ala Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp
920 925 930
GAG GGA CAC GCG ATG GAC TTT TAC TCG ATC GGG ACA TAC GAT GCA TTT 1010
Glu Gly His Ala Met Asp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe
935 940 945
AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA CTA GAC GTC GGT ATC GGG 1058
Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly
950 955 960
TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106
Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp
965 970 975
CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154
Pro Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp
980
985
990
995
PL 194 854 Β1
AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202
Ser Tyr Asp Gin Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val
1000 1005 1010
GCA AGG ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA 1250
Ala Arg Thr Ile Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin
1015 1020 1025
TGG CCG GTG GAG GAA ATC GAG AGC TTG AGA TCC AAC GGT CAT GAA TTC 1298
Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe
1030 1035 1040
AAA AAT ATA ACA CTT GAG CCG GGC TCG ATC ATT CCC CTC GAC GTA GGC 1346
Lys Asn Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly
1045 1050 1055
TCA GCT ACG CAG TTG GAC ATC GTT GCA ACA TTT GAG GTG GAT CAA GAG 1394
Ser Ala Thr Gin Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu
1060 1065 1070 1075
GCG TTA AAA GCA ACA AGT GAC ACG AAC GAC GAA TAC GGT TGC ACC ACA 1442
Ala Leu. Lys Ala Thr Ser Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr
1080 1085 1090
AGT TCG GGT GCA GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT GCA 1490
Ser Ser Gly Ala Ala Lys Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala
1095 1100 1105
GTT CTT GCC CAC GGA ACC CTT TCG GAG TTA ACT CCG GTG TAT TTC TAC 1538
Val Leu Ala His Gly Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr
1110 1115 1120
ATT GCT AAA AAC ACC AAG GGA GGT GTG GAT ACA CAT TTT TGT ACG GAT 1586
Ile Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp
1125 1130 1135
AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 1634
PL 194 854 B1
Lys Leu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly
1140 1145 1150 1155
AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682
Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu
1160 1165 1170
GTG GAT CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 1730
Val Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val
1175 1180 1185
ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA ATA TAC GAA GCA GCC AAG 1778
Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala He Tyr Glu Ala Ala Lys
1190 1195 1200
CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1826
Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu
1205 1210 1215
AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1872
Lys Val Trp Gin Met Ser Gin Ala Phe Vai Lys Ala Tyr Pro Phe
1220 1225 1230
AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT TTATCTGTGT 1932
gttatgttaa GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992
AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTATTTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2073
¢2) INFORMACJA O SEQ ID NO:4:
i i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 617 aminokwasów (B) TYP; aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
PL 194 854 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4:
Met Arg 1 Thr Thr Glu 5 Pro Gin Thr Asp Leu Glu His Ala 10 Pro Asn 15 His
Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro Pro Ala ALa Val Arg Asn
20 25 30
Ai:g Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile Thr Leu Val Ser Leu Phe
35 40 45
Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu Tyr Gin His Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gin Gin Pro
65 70 75 80
Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg Thr Ala Phe His Phe GLn
85 90 95
Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn Gly Pro Leu Phe His Met
100 105 110
Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn Pro Tyr ALa Pro Phe Trp
115 120 125
Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp
130 135 140
Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr Glu Trp Tyr Asp Ile Glu
145 150 155 160
Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu Pro Asp Gly Arg Ile Phe
165 170 175
Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu Glu GLn Leu GLn Cys Lys
180 185 190
Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Leu Val Glu Trp Val Arg
195
200
205
PL 194 854 B1
Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro Ser Gly 220 Ile Gly Leu Thr
210 215
Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr GLy Pro Asp Gly Lys His
225 230 235 240
Arg Met Ile He Gly Thr Lys Arg Asn Thr Thr Gly Leu Val Leu Val
245 250 255
Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val Met Leu Asp Glu Pro Leu
260 265 270
His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro
275 280 265
Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro
290 295 300
Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Ala Met Asp
305 310 315 320
Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe Asn Asp Lys Trp Thr Pro
325 330 335
Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly He Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly
340 345 350
Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg
355 360 365
Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Tyr Asp Gin Asp Val
370 375 380
Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Ala Arg Thr Ile Val Leu
385 390 395 400
Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin Trp Pro Val Glu Gru Ile
405 410 415
Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe Lys Asn He Thr Leu Glu
420 425 430
PL 194 854 Β1
Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp 440 Val Gly Ser Ala Thr Gin Leu Asp 445
435
Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu Ala Leu Lys Ala Thr Ser
450 455 460
Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Lys
465 470 475 480
Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala Val Leu Ala His Gly Thr
485 490 495
Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys
500 505 510
Gly Gly Val Asp Thr His Phe cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Tyr
515 520 • 525
Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Val Pro Val Leu
530 535 540
Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val
545 550 555 560
Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr
565 570 575
Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Phe Val Phe Asn Asn
580 585 590
Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu Lys Val Trp Gin Met Ser
595 600 605
Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe
610 615
Max Planck Gesellschaft zur Fórderung der Wissenschaften E.V.

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka mające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), prowaUzczc syntezę inuliny, o cząsteczkach zawierajczyzh przeziętnie więcej niż 20 reszt fruktozylowych, wybrana z grupy zawierającej:
    (a) cząsteezm kawas nukteinowaeo kadującc białko zzwierającc suCwacoją aminokwaaową opisane jako SEQ ID No. 2 i SEQ ID No. 4;
    (b) czzst(5eczi kwasun nkleinowaeo mającz e uCwacojęn nklee-yyuwaooP;usąjaSoSSQ ID No.1 albo SEQ ID No. 3 albo odpowiednie sekwencję rybonkOleotyUowe;
    (z) cząstoezkl kwasu nukleinowaeo, które z komalemacUomom naScakaem cząsteczki kwasu nukleinowego opisanej w (a) albo (b) w ostrych warunkach hybryUyzazji i (U) cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierające fragment sekwencji nukleotyUowej (a), (b) lub (z).
  2. 2. Zząsteczka kwasu nukleinowego weUkug zastrz. 1, która jest cząsteczką DNA.
  3. 3. Zząsteczka kwasu nukleinowego weUkug zastrz. 2, która jest cząsteczką cDNA.
  4. 4. Zząsteczka kwasu nukleinowego weUkug zastrz. 1, która jest cząsteczką RNA.
  5. 5. Cząsteecko nwasu nnkleinowaeo waełukj ąeuoeo a ι^^ζ. b, albb b, albb b, albb b, nznmienna tym, że pochoUzi z karczocha.
  6. 6. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu jak zUeriniowano w zastrz. 1
  7. 7. WeCto-waeUJkzkstrz. 6,zznmieenn tym. żż ccąsteeckokwasunnkleinowaeo-ectcczcnoćciowo pokączona z elementem regulatorowym zapewniającym transkrypcję i syntezę ulegającego translacji RNA w komórkach prokariotycznych i/albo komórkach eukariotycznych.
  8. 8. WeCto- waełuk η^^. b, aznmieenn tym, bż ηΐθϋ^ eueolało-uwa ppoaoOuą a eueiodn promotorowego B33 patatyny lub regionu promotorowego 35S ZaMV.
  9. 9. Komóóka godpodutuz etunuto-mawaso ccąstoecką kwasu nukleinoweeo jjk zZuCiniowano w zastrz. 1 albo wektorem jak zUeriniowano w zastrz. 6.
  10. 10. KomarUo godUPOutzkwaeUuk nzstrz. b, nznmieenntym. żż nu0utkowa azwieeagge jący zależną oU sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST).
  11. 11. SppduówaCwatzzsia bFT, z znmieenntym. żż komarkogodUPOutzkzZuCniowarłoeow z^ strz. 9, hoUuje się w warunkach pozwalających na syntezę FFT, a następnie izoluje się FFT z hoUowanych komórek i/albo z poUkoża Uo hoUowli.
  12. 12. FFT, koUowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zUeriniowano w zastrz. 1.
  13. 13. Saposó waCwatuzsia komarUl godupdutua eedlinnoeo, zznmieeny t^m, że warewaaua bię Uo komórki gospoUarza cząsteczki kwasu nukleinowego zUefiniowane w zastrz. 1, albo wektor zUefiniowany w zastrz. 6.
  14. 14. Saposó waełuk zzata. a 3, zr^na^^^r^r^^ t^m, żż j ćj^o komarUo godupdutua stodują ssę komórkę roćlinną, tkankę roćlinną lub roćlinę.
  15. 15. KomarUo ωόϋηο, któru azwiera ncąsUoecko kwasu knkleinowaeo nZuCiniowasą w nzstrz. j, albo wektor zUeriniowany w zastrz. 6.
  16. 16. KomarUo ωόϋηο, waeUkk nzstrz. H, nzymieenytym, żż stasowi komarUo eudlinotrusuuoc nicznej, tkankę roćliny transoenicznej lub roćlinę transoeniczną.
  17. 17. KomarUo ωόϋηο, waeUkkzzstrz. H, nzymieenytym, bż duOutkowazzwieragoc koOującc zależną oU sacharozy transferazę sacharoza-fruktozyl (SST).
  18. 18. Komórka roćliny weUkug zastrz. 17, znamienna tym, że jest komórką roćliny użytkowej.
  19. 19. KomarUo rodlinowaeu.ιkzzstrz. 11,z znmieenntym. żż j ee komarUo ΓοόΙίηο ukeCkowajzZł wierającej sacharozę.
  20. 20. ΜηΙοι^Ι ruomaoOżciowa, znymieeny tym, żż zzwinca ^πίο^Ι rudlinno bek zZuCnic>waso w zastrz. 17.
  21. 21. SaPduó waCwatuzsia wacudoocąsteeckowaj i nuHną a ncąstoeckoaa nzwiecąjąccya arzzeiętnie więcej niż 20 reszt fruktozylowych, znamienny tym, że (a) hoUuje się komórki gospoUarza, jak zUefiniowano w zastrz. 9, w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie FFT i przeksztakcenie 1-kestozy, ewentualnie Uostarczoną z zewnątrz, lub równoważnego substratu, Uo wspomnianej wysokocząsteczkowej inuliny; i (b) oUzyskuje się tak wytworzoną inulinę z hoUowanych komórek gospoUarza lub z poUkoża Uo hoUowli.
    PL 194 854 B1
  22. 22. Sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny, znamienny tym, że (a) doprowadza się do kontaktu 1-kestozy albo równoważnego substratu z FFT zdefiniowanego w zastrz. 12 w warunkach, które pozwalają na ich zamianę do wysokocząsteczkowej inuliny; i (b) odzyskuje się tak wytworzoną inulinę.
  23. 23. Sppsoó wytwarzznia in ν/Trowysokoocąsteeckowej i nnliny, zznmieenntym. żż saahhrooz będąca substratem jest zamieniana do wysokocząsteczkowej inuliny przez kombinację enzymów zwierającą SST i FFT jak zdefiniowano w zastrz. 12.
PL340364A 1997-11-06 1998-11-06 Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka posiadające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania komórki gospodarza roślinnego, komórka rośliny, materiał rozmnożeniowy i sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny PL194854B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19749122A DE19749122A1 (de) 1997-11-06 1997-11-06 Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen
PCT/EP1998/007115 WO1999024593A1 (en) 1997-11-06 1998-11-06 Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL340364A1 PL340364A1 (en) 2001-01-29
PL194854B1 true PL194854B1 (pl) 2007-07-31

Family

ID=7847857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL340364A PL194854B1 (pl) 1997-11-06 1998-11-06 Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białka posiadające aktywność enzymatyczną fruktozylotransferazy (FFT), wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania komórki gospodarza roślinnego, komórka rośliny, materiał rozmnożeniowy i sposób wytwarzania wysokocząsteczkowej inuliny

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6559356B1 (pl)
EP (1) EP1029067B1 (pl)
JP (1) JP4287046B2 (pl)
CN (1) CN1202255C (pl)
AR (1) AR017767A1 (pl)
AT (1) ATE427357T1 (pl)
AU (1) AU753390B2 (pl)
BR (2) BRPI9816319B1 (pl)
CA (1) CA2309133C (pl)
CZ (1) CZ299825B6 (pl)
DE (2) DE19749122A1 (pl)
DK (1) DK1029067T3 (pl)
ES (1) ES2324188T3 (pl)
HU (1) HU226813B1 (pl)
PL (1) PL194854B1 (pl)
WO (1) WO1999024593A1 (pl)
ZA (1) ZA9810110B (pl)

Families Citing this family (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0952222A1 (en) 1998-04-17 1999-10-27 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile
DE19840028A1 (de) * 1998-09-02 2000-03-09 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung
DE19857654A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Max Planck Gesellschaft Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine
US6791015B2 (en) 2000-10-30 2004-09-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fructan biosynthetic enzymes
WO2002050257A2 (de) * 2000-12-21 2002-06-27 Südzucker Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von polyfructanen
EP1597978A1 (en) 2004-05-17 2005-11-23 Nutricia N.V. Synergism of GOS and polyfructose
AR052059A1 (es) 2004-12-21 2007-02-28 Bayer Cropscience Gmbh Plantas de cana azucarera con contenido incrementado de carbohidratos de almacenamiento
FR2888971B1 (fr) * 2005-07-20 2007-11-02 Nicolas Bara Procede d'identification sequentielle d'echantillons
EP2016104B1 (en) * 2006-04-28 2010-12-22 Bayer CropScience AG Inulin of very high chain length
ATE506376T1 (de) * 2006-04-28 2011-05-15 Bayer Cropscience Ag Inulin mit sehr grosser kettenlänge
EP2027161B9 (en) * 2006-04-28 2011-09-14 Bayer CropScience AG Inulin of very high chain length
CN101432313B (zh) * 2006-04-28 2013-08-07 拜尔作物科学股份公司 极长链菊粉
CL2007003743A1 (es) * 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
CL2007003744A1 (es) 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
EP1969931A1 (de) * 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
JP2010520900A (ja) 2007-03-12 2010-06-17 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト フェノキシ置換されたフェニルアミジン誘導体及び殺真菌剤としてのその使用
EP1969929A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP2120558B1 (de) * 2007-03-12 2016-02-10 Bayer Intellectual Property GmbH 3,4-Disubstituierte Phenoxyphenylamidin-Derivate und deren Verwendung als Fungizide
BRPI0808786A2 (pt) 2007-03-12 2014-09-16 Bayer Cropscience Ag Di-halogenofenoxifenilamidinas e seu uso como fungicidas
EP1969934A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
WO2008128639A1 (de) * 2007-04-19 2008-10-30 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide
DE102007045922A1 (de) 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045953B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045920B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistische Wirkstoffkombinationen
DE102007045919B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045956A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2090168A1 (de) 2008-02-12 2009-08-19 Bayer CropScience AG Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2072506A1 (de) 2007-12-21 2009-06-24 Bayer CropScience AG Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP2168434A1 (de) 2008-08-02 2010-03-31 Bayer CropScience AG Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
BRPI0918430A2 (pt) 2008-08-14 2015-11-24 Bayer Cropscience Ag 4-fenil-1h-pirazóis inseticidas.
DE102008041695A1 (de) 2008-08-29 2010-03-04 Bayer Cropscience Ag Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2201838A1 (de) 2008-12-05 2010-06-30 Bayer CropScience AG Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2198709A1 (de) 2008-12-19 2010-06-23 Bayer CropScience AG Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge
EP2381781B1 (de) 2008-12-29 2016-06-08 Bayer Intellectual Property GmbH Verfahren zur verbesserten nutzung des produktionspotentials genetisch modifizierter pflanzen
EP2204094A1 (en) 2008-12-29 2010-07-07 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction
EP2223602A1 (de) 2009-02-23 2010-09-01 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen
EP2039771A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039772A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction
EP2039770A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2227951A1 (de) 2009-01-23 2010-09-15 Bayer CropScience AG Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren
PT2391608E (pt) 2009-01-28 2013-05-13 Bayer Cropscience Ag Derivados de n-cicloalquil-n-biciclíco-metilenocarboxamida fungicidas
AR075126A1 (es) 2009-01-29 2011-03-09 Bayer Cropscience Ag Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas
EP2398770B1 (en) 2009-02-17 2016-12-28 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicidal n-(phenylcycloalkyl)carboxamide, n-(benzylcycloalkyl)carboxamide and thiocarboxamide derivatives
EP2218717A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Bayer CropScience AG Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives
TW201031331A (en) 2009-02-19 2010-09-01 Bayer Cropscience Ag Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance
BRPI0924986A8 (pt) 2009-03-25 2016-06-21 Bayer Cropscience Ag "combinações de substâncias ativas com propriedades inseticidas e acaricidas, seus usos e método para o controle de pragas animais".
JP5462354B2 (ja) 2009-03-25 2014-04-02 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺虫特性及び殺ダニ特性を有する活性成分組合せ
EP2232995A1 (de) 2009-03-25 2010-09-29 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
WO2010108508A2 (de) 2009-03-25 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften
MX2011009732A (es) 2009-03-25 2011-09-29 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de principios activos sinergicas.
MX2011009918A (es) 2009-03-25 2011-10-06 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de principios activos propiedades insecticidas y acaricidas.
EP2239331A1 (en) 2009-04-07 2010-10-13 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2427059B1 (en) 2009-05-06 2015-06-03 Bayer Intellectual Property GmbH Cyclopentanedione compounds and their use as insecticides and acaricides
AR076839A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Bayer Cropscience Ag Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas
EP2251331A1 (en) 2009-05-15 2010-11-17 Bayer CropScience AG Fungicide pyrazole carboxamides derivatives
EP2255626A1 (de) 2009-05-27 2010-12-01 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
HRP20190216T1 (hr) 2009-06-02 2019-03-22 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Uporaba fluopirama za suzbijanje sclerotinia ssp
MX2012000566A (es) 2009-07-16 2012-03-06 Bayer Cropscience Ag Combinaciones sinergicas de principios activos con feniltriazoles.
WO2011015524A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Bayer Cropscience Ag Fungicide heterocycles derivatives
EP2292094A1 (en) 2009-09-02 2011-03-09 Bayer CropScience AG Active compound combinations
EP2343280A1 (en) 2009-12-10 2011-07-13 Bayer CropScience AG Fungicide quinoline derivatives
US9000012B2 (en) 2009-12-28 2015-04-07 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives
US20130012546A1 (en) 2009-12-28 2013-01-10 Christian Beier Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
KR20120102133A (ko) 2009-12-28 2012-09-17 바이엘 크롭사이언스 아게 살진균제 히드록시모일-테트라졸 유도체
CN102811617A (zh) 2010-01-22 2012-12-05 拜耳知识产权有限责任公司 杀螨和/或杀虫活性物质结合物
ES2523503T3 (es) 2010-03-04 2014-11-26 Bayer Intellectual Property Gmbh 2-Amidobencimidazoles sustituidos con fluoroalquilo y su uso para el aumento de la tolerancia al estrés en plantas
CN102933078A (zh) 2010-04-06 2013-02-13 拜耳知识产权有限责任公司 4-苯基丁酸和/或其盐用于提高植物应激耐受性的用途
AU2011237909B2 (en) 2010-04-09 2015-08-20 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of derivatives of the (1-cyanocyclopropyl)phenylphosphinic acid, the esters thereof and/or the salts thereof for enhancing the tolerance of plants to abiotic stress
EP2563772A1 (en) 2010-04-28 2013-03-06 Bayer Cropscience AG Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives
WO2011134911A2 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
US20130116287A1 (en) 2010-04-28 2013-05-09 Christian Beier Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives
CN102933556B (zh) 2010-06-03 2015-08-26 拜尔农科股份公司 N-[(杂)芳基乙基]吡唑(硫代)羧酰胺及其杂取代的类似物
UA110703C2 (uk) 2010-06-03 2016-02-10 Байєр Кропсайнс Аг Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду
MX2012013896A (es) 2010-06-03 2012-12-17 Bayer Cropscience Ag N-[(het)arilalquil)]pirazol(tio)carboxamidas y sus analogos heterosustituidos.
CN103119169B (zh) 2010-06-09 2018-11-20 拜尔作物科学公司 植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具
CA2801834A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Kathleen D'halluin Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
EP3181550B1 (en) 2010-07-20 2019-11-20 Bayer Intellectual Property GmbH Benzocycloalkenes as antifungal agents
EP2611300B1 (de) 2010-09-03 2016-04-06 Bayer Intellectual Property GmbH Substituierte anellierte dihydropyrimidinonderivate
EP2460406A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops
WO2012038476A1 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Bayer Cropscience Ag Use of active ingredients for controlling nematodes in nematode-resistant crops
RS58401B1 (sr) 2010-10-07 2019-04-30 Bayer Cropscience Ag Sastav fungicida koji sadrži derivat tetrazoliloksima i derivat tiazolilpiperidina
EP2630125B1 (en) 2010-10-21 2016-08-24 Bayer Intellectual Property GmbH N-benzyl heterocyclic carboxamides
AR083501A1 (es) 2010-10-21 2013-02-27 Bayer Cropscience Ag 1-(heterociclo carbonil)piperidinas
UA109460C2 (uk) 2010-11-02 2015-08-25 Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх N-гетарилметилпіразолілкарбоксаміди
EP2640191A1 (en) 2010-11-15 2013-09-25 Bayer Intellectual Property GmbH 5-halogenopyrazole(thio)carboxamides
JP5833663B2 (ja) 2010-11-15 2015-12-16 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ ５−ハロゲノピラゾールカルボキサミド類
WO2012065944A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Bayer Cropscience Ag N-aryl pyrazole(thio)carboxamides
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
KR20130123416A (ko) 2010-12-01 2013-11-12 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 작물에서 선충류를 구제하고 수확량을 증가시키기 위한 플루오피람의 용도
EP2474542A1 (en) 2010-12-29 2012-07-11 Bayer CropScience AG Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
CN103380124A (zh) 2010-12-29 2013-10-30 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
EP2471363A1 (de) 2010-12-30 2012-07-04 Bayer CropScience AG Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2494867A1 (de) 2011-03-01 2012-09-05 Bayer CropScience AG Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden
US20130345058A1 (en) 2011-03-10 2013-12-26 Wolfram Andersch Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds
US20140005230A1 (en) 2011-03-14 2014-01-02 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
BR112013025871A2 (pt) 2011-04-08 2016-07-26 Bayer Ip Gmbh composto de fórmula (i) e sua utilização, composição para o controle dos fungos nocivos fitopatogênicos, método para o controle de fungos fitopatogênicos das culturas e processo para a produção das composições
AR085568A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas
EP2511255A1 (de) 2011-04-15 2012-10-17 Bayer CropScience AG Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate
AR090010A1 (es) 2011-04-15 2014-10-15 Bayer Cropscience Ag 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento
AR085585A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas
PL2699093T3 (pl) 2011-04-22 2016-04-29 Bayer Cropscience Ag Kombinacje związku aktywnego zawierające pochodną karboksyamidową i związek grzybobójczy
EP2718443B1 (en) 2011-06-06 2017-11-29 Bayer CropScience NV Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
JP2014520776A (ja) 2011-07-04 2014-08-25 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 植物における非生物的ストレスに対する活性薬剤としての置換されているイソキノリノン類、イソキノリンジオン類、イソキノリントリオン類およびジヒドロイソキノリノン類または各場合でのそれらの塩の使用
ES2612126T3 (es) 2011-07-22 2017-05-12 Thales Un procedimiento de gestión para reutilización espacial de único canal en presencia de nodos potencialmente perjudiciales en una red ad-hoc móvil
WO2013020985A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
CN103748092A (zh) 2011-08-22 2014-04-23 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
MX348003B (es) 2011-08-22 2017-03-08 Bayer Cropscience Nv Metodos y medios para modificar un genoma vegetal.
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
EP2753177A1 (en) 2011-09-09 2014-07-16 Bayer Intellectual Property GmbH Acyl-homoserine lactone derivatives for improving plant yield
MX347562B (es) 2011-09-12 2017-05-03 Bayer Ip Gmbh Derivados fungicidas de 3-fenil[(heterociclilmetoxi)imino]metil}-1 ,2,4-oxadiazol-5(4h)-ona sustituidos en 4.
PH12014500562A1 (en) 2011-09-16 2014-04-14 Bayer Ip Gmbh Use of acylsulfonamides for improving plant yield
JP6100265B2 (ja) 2011-09-16 2017-03-22 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ 植物収量を向上させるためのフェニルピラゾリン−３−カルボン酸化合物の使用
AU2012307322B2 (en) 2011-09-16 2016-07-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield
AR087971A1 (es) 2011-09-23 2014-04-30 Bayer Ip Gmbh Uso de derivados del acido 1-fenil-pirazol-3-carboxilico 4-sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas
EA028662B1 (ru) 2011-10-04 2017-12-29 Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх Рнк-интерференция для борьбы с грибами и оомицетами путем ингибирования гена сахаропиндегидрогеназы
WO2013050324A1 (de) 2011-10-06 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b)
MX2014005976A (es) 2011-11-21 2014-08-27 Bayer Ip Gmbh Derivados de n-[(silil trisustituido)metil]-carboxamida fungicidas.
CA2857438A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal n-bicycloalkyl and n-tricycloalkyl (thio)carboxamide derivatives
IN2014CN04325A (pl) 2011-12-19 2015-09-04 Bayer Cropscience Ag
KR102028903B1 (ko) 2011-12-29 2019-10-07 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 살진균 3-[(피리딘-2-일메톡시이미노)(페닐)메틸]-2-치환-1,2,4-옥사디아졸-5(2h)-온 유도체
BR112014015993A8 (pt) 2011-12-29 2017-07-04 Bayer Ip Gmbh composto, composição, método para o controle dos fungos, utilização dos compostos e processo para a produção das composições
NZ722687A (en) 2012-02-22 2017-03-31 Bayer Ip Gmbh Use of succinate dehydrogenase inhibitors (sdhis) for controlling wood diseases in grape.
BR122019010639B1 (pt) 2012-02-27 2020-12-22 Bayer Intellectual Property Gmbh combinação, método para controle de fungos fitopatogênicos prejudiciais e uso da referida combinação
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
US9357778B2 (en) 2012-04-12 2016-06-07 Bayer Cropscience Ag N-acyl-2-(cyclo)alkypyrrolidines and piperidines useful as fungicides
CA2865599C (en) 2012-04-20 2020-10-27 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-n-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
WO2013156560A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
WO2013160230A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
US9375005B2 (en) 2012-05-09 2016-06-28 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides
MX2014013497A (es) 2012-05-09 2015-02-10 Bayer Cropscience Ag Pirazol indanil carboxamidas.
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
WO2014009322A1 (en) 2012-07-11 2014-01-16 Bayer Cropscience Ag Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress
EP2892345A1 (de) 2012-09-05 2015-07-15 Bayer CropScience AG Verwendung substituierter 2-amidobenzimidazole, 2-amidobenzoxazole und 2-amidobenzothiazole oder deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
WO2014060519A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bayer Cropscience Ag Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
MX380476B (es) 2012-10-19 2025-03-12 Bayer Cropscience Ag Método de promoción de crecimiento de planta usando derivados de carboxamida.
LT2908641T (lt) 2012-10-19 2018-04-25 Bayer Cropscience Ag Būdas, skirtas augalų apdorojimui kovojant prieš grybus, kurie yra atsparūs fungicidams, panaudojant karboksamido arba tiokarboksamido darinius
CA2888600C (en) 2012-10-19 2021-08-10 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
WO2014079957A1 (de) 2012-11-23 2014-05-30 Bayer Cropscience Ag Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion
PY1356939A (es) 2012-11-30 2017-08-01 Bayer Cropscience Ag Mezclas de fungicidas ternarios y pesticidas
UA116223C2 (uk) 2012-11-30 2018-02-26 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт Подвійна фунгіцидна суміш
CN104981162B (zh) 2012-11-30 2017-11-28 拜耳作物科学股份公司 三元杀真菌混合物
CN104994736B (zh) 2012-11-30 2018-02-06 拜耳作物科学股份公司 二元农药和杀真菌混合物
BR112015012054A2 (pt) 2012-11-30 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag mistura fungicida ou pesticida binária
EP2740356A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate
WO2014086751A1 (de) 2012-12-05 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Verwendung substituierter 1-(arylethinyl)-, 1-(heteroarylethinyl)-, 1-(heterocyclylethinyl)- und 1-(cyloalkenylethinyl)-cyclohexanole als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
EP2740720A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
WO2014095677A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Bayer Cropscience Ag Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides
US20160016944A1 (en) 2013-03-07 2016-01-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Fungicidal 3--heterocycle derivatives
CN105121650A (zh) 2013-04-02 2015-12-02 拜尔作物科学公司 真核生物中的靶向基因组工程
WO2014167009A1 (en) 2013-04-12 2014-10-16 Bayer Cropscience Ag Novel triazole derivatives
US9550752B2 (en) 2013-04-12 2017-01-24 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Triazolinthione derivatives
CA2909725A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
KR20150144779A (ko) 2013-04-19 2015-12-28 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 살충성 또는 농약성 2성분 혼합물
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
CN105636939B (zh) 2013-06-26 2018-08-31 拜耳作物科学股份公司 N-环烷基-n-[(二环基苯基)亚甲基]-(硫代)甲酰胺衍生物
EA201600097A1 (ru) 2013-07-09 2016-06-30 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение выбранных пиридон карбоксамидов или их солей в качестве активных веществ против абиотического стресса растений
US10070645B2 (en) 2013-12-05 2018-09-11 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-N-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
TW201607929A (zh) 2013-12-05 2016-03-01 拜耳作物科學公司 Ｎ－環烷基－ｎ－｛［２－（１－經取代環烷基）苯基］亞甲基｝－（硫代）甲醯胺衍生物
AR101214A1 (es) 2014-07-22 2016-11-30 Bayer Cropscience Ag Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas
CN104145825B (zh) * 2014-09-04 2016-04-13 东莞市睿绅生物技术有限公司 朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法
AR103024A1 (es) 2014-12-18 2017-04-12 Bayer Cropscience Ag Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas
EP3283476B1 (en) 2015-04-13 2019-08-14 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11306337B2 (en) 2015-11-12 2022-04-19 Ctc—Centro De Tecnologia Canavieira S.A. Polypeptides having hydrolytic activity on 1-kestose in the presence of sucrose but lacking sucrase (invertase) activity, polynucleotides encoding same and methods of producting and using same in industrial sucrose production from 1-kestose
BR112019001764A2 (pt) 2016-07-29 2019-05-07 Bayer Cropscience Ag combinações de compostos ativos e métodos para proteção de material de propagação de plantas
WO2018054829A1 (en) 2016-09-22 2018-03-29 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives and their use as fungicides
CN109715621A (zh) 2016-09-22 2019-05-03 拜耳作物科学股份公司 新的三唑衍生物
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN106617081B (zh) * 2016-09-26 2020-08-04 江南大学 长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用
US12499971B2 (en) 2016-09-28 2025-12-16 The Broad Institute, Inc. Systematic screening and mapping of regulatory elements in non-coding genomic regions, methods, compositions, and applications thereof
RU2019115286A (ru) 2016-10-26 2020-11-27 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение ниразифлумида для борьбы с sclerotinia spp при обработке семян
CN110248547A (zh) 2016-12-08 2019-09-17 拜耳农作物科学股份公司 杀虫剂用于控制金针虫的用途
WO2018108627A1 (de) 2016-12-12 2018-06-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
EP3332645A1 (de) 2016-12-12 2018-06-13 Bayer Cropscience AG Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
WO2018213726A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
WO2019025153A1 (de) 2017-07-31 2019-02-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
WO2019060746A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 The Broad Institute, Inc. SYSTEMS, METHODS, AND COMPOSITIONS FOR THE TARGETED EDITING OF NUCLEIC ACIDS
WO2019126709A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 The Broad Institute, Inc. Cas12b systems, methods, and compositions for targeted dna base editing
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
CN112513033A (zh) 2018-06-04 2021-03-16 拜耳公司 除草活性的双环苯甲酰基吡唑
CA3124110A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
WO2021061910A1 (en) * 2019-09-24 2021-04-01 Ginkgo Bioworks, Inc. Production of oligosaccharides

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL100908A0 (en) * 1991-02-22 1992-11-15 Salk Inst Biotech Ind Invertase genes and their use
ATE235557T1 (de) * 1992-12-28 2003-04-15 Stichting Scheikundig Onderzoe Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit modifiziertem fructanmuster
DE4316425C2 (de) * 1993-05-17 1998-05-20 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung von langkettigem Inulin, das so hergestellte Inulin sowie dessen Verwendung
AU4634396A (en) * 1995-01-06 1996-07-24 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro - Dlo) Dna sequences encoding carbohydrate polymer synthesizing enzymes and method for producing transgenic plants
DE19617687C2 (de) * 1996-05-03 2000-11-16 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI9816319B1 (pt) 2016-05-17
BR9813968A (pt) 2000-09-26
AU753390B2 (en) 2002-10-17
DK1029067T3 (da) 2009-06-22
WO1999024593A1 (en) 1999-05-20
DE19749122A1 (de) 1999-06-10
ES2324188T3 (es) 2009-07-31
CA2309133A1 (en) 1999-05-20
CZ20001680A3 (cs) 2000-10-11
EP1029067A1 (en) 2000-08-23
CZ299825B6 (cs) 2008-12-03
AU1667499A (en) 1999-05-31
HUP0100111A3 (en) 2003-04-28
US6559356B1 (en) 2003-05-06
HU226813B1 (en) 2009-11-30
AR017767A1 (es) 2001-10-24
CA2309133C (en) 2011-09-06
US7083963B2 (en) 2006-08-01
JP4287046B2 (ja) 2009-07-01
HUP0100111A2 (hu) 2001-05-28
ZA9810110B (en) 1999-05-05
PL340364A1 (en) 2001-01-29
EP1029067B1 (en) 2009-04-01
CN1202255C (zh) 2005-05-18
BR9813968B1 (pt) 2011-03-09
ATE427357T1 (de) 2009-04-15
JP2001521757A (ja) 2001-11-13
US20040014092A1 (en) 2004-01-22
DE69840704D1 (de) 2009-05-14
CN1280624A (zh) 2001-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6559356B1 (en) Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin
US6515203B1 (en) Nucleic acid molecules encoding enzymes having fructosyl polymerase activity
JP3840259B2 (ja) 炭水化物ポリマー合成酵素をコードするｄｎａ配列及びトランスジェニック植物を製造するための方法
AU699552B2 (en) DNA sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alpha-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms
HUT70977A (en) Dna sequences waich lead to the formation of polyfructans (levans) plasmids containing these sequences as' wells as a process for preparing transgenic plants
US6664444B1 (en) Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile
AU777455B2 (en) Nucleic acid molecules from artichoke (cynara scolymus) encoding enzymes having fructosyl polymerase activity
HK1034286A (en) Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20131106