CZ20003065A3 - Peptidové analogy insulinu a jejich využití pro léčení diabetes mellitus - Google Patents

Abstract

Peptidové analogy B řetězce insulinu, které jsou odvozené od peptidů obsahujících zbytky (9-23) přirozené sekvence B řetězce. Analogy jsou pozměněny vzhledem k přirozené sekvenci v pozicích (12, 13, 15) a/nebo (16), a mohou být také pozměněny v pozici (19) a/nebo v jiných pozicích. Farmaceutické prostředky obsahující tyto peptidové analogy. Peptidové analogy jsou užitečné při léčbě nebo inhibici vzniku diabetů.

Description

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález se obecně týká peptidových analogů insulinu, přesněji se týká způsobů léčby diabetes mellitus pomocí peptidových analogů odvozených od zbytků 9-23 B-řetězce lidského insulinu.

Dosavadní stav techniky

Diabetes mellitus závislý na insulinu (IDDM) je orgánově specifické autoimunitní onemocnění postihující téměř milion paceintů v různých věkových skupinách ve Spojených Státech Amerických. Onemocnění je charakterizováno rozsáhlou destrukcí beta buněk v pankreatických ostrůvcích produkujících insulin a poruchou regulace metabolismu glukosy, která vede ke klinickému diabetů. Definující vlastností IDDM je lymfocytámí infiltrace ostrůvků. Z infiltrujicích buněk se zdají být T lymfocyty jedním z hlavních mediátorů autoimunitní destrukce.

Diabetes I.typu je dále charakterizován zvýšenou koncentrací protilátek proti různých antigenům asociovaným s ostrůvky, včetně insulinu, GAD65, GAD67 a ICA512. Tyto protilátky mohou být detekovány se značným předstihem vzhledem ke klinickému onemocnění a imunitní odpověď proti takovým antigenům může být použita jako predikční znak vznikajícího diabetů u pacientů s predisponujícími genetickými (HLA) haplotypy.

V současnosti jsou pacienti pro udržování normoglykemie závislí na injekcích insulinu. Insulin je polypeptidový hormon skládající se ze dvou disulfidovou vazbou vázaných řetězců, A • *

řetězce skládajícího se z 21 aminokyselinových zbytků a B řetězce skládajícího se z 30 zbytků. Ačkoliv znamená podávání insulinu značný přínos pro pacienty trpící diabetem, je z důvodu krátkého sérového poločasu insulinu obtížné udržování správného dávkování. Podávání insulinu může vést k rozvoji různých hypoglykemických vedlejších účinků a ke tvorbě neutralizačních protilátek.

Z důvodů problémů spojených s existující léčbou diabetů trvá potřeba zlepšené léčby, která by byla účinější a která by nebyla spojena s takovými nevýhodami. Předkládaný vynález využívá peptidové analogy, které antagonizují odpověď T lymfocytů na insulin, pro účinnou léčbu diabetů, a dále poskytuje s tímto účinkem související výhody.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje sloučeniny a způsoby pro léčbu a prevenci diabetů. V některých aspektech poskytuje předkládaný vynález peptidové analogy obsahující zbytky 9 až 23 B řetězce lidského insulinu (SEQ ID NO: 2), kde sekvence těchto peptidových analogů se liší od sekvence zbytků 9 až 23 přirozeného lidského B řetězce insulinu v substitucích v l až 4 aminokyselinách. Takové substituce mohou být provedeny v jednom nebo více zbytcích vybraných ze skupiny skládající se ze zbytků 12, 13, 15 a 16, s nebo bez dalších substitucí v jiných zbytcích. V některých výhodných provedeních mohou být takové substituce přítomny ve dvou nebo třech aminokyselinových zbytcích uvnitř zbytků 9 až 23 B řetězce insulinu. Substituce mohou být přítomny také ve zbytku 19. Substituce jsou -výhodně nekonzervativní a výhodné jsou analogy, ve kterých jsou změněny zbytky 12, 13, 15, 16 a/nebo 19 (například na alanin). Také jsou výhodné analogy, které dále obsahují zbytek 24 B řetězce .1 insulinu. V některých jiných provedeních obsahují peptidové analogy ne více než 18 zbytků, ne více než 16 zbytků a ne více než 15 zbytků B řetězce lidského insulinu.

V dalších provedeních se skládají peptidové analogy v podstatě ze zbytků 9 až 23 nebo 9 až 24 B řetězce lidského insulinu (SEQ ID NO: 2), kde sekvence těchto peptidových analogů se liší od sekvence zbytků 9 až 23 přirozeného lidského B řetězce insulinu v substitucích v 1 až 4 aminokyselinách, a kde je alespoň jedna substituce provedena ve zbytku vybraném ze skupiny skládající se ze zbytků 12, 13, 15 a 16.

V dalším aspektu vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující peptidový analog popsaný výše v kombinaci s fyziologicky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro léčbu a/nebo inhibici vzniku diabetů, který obsahuje podání terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku, jak byl popsán výše, pacientovi.

Tyto a další aspekty vynálezu budou jasné z následujícího podrobného popisu a připojených výkresů. Dále jsou v textu uvedeny různé odkazy, které podrobně popisují některé postupy nebo prostředky. Tyto odkazy jsou zde všechny uvedeny ve své úplnosti.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci zbytků 9-23 B řetězce insulinu (SEQ ID NO: 2);

Obr. 2 je graf ukazující proliferativní odpověď (měřenou v cpm) klonu T lymfocytů NOD myší na (9-23) peptid přirozeného B řetězce insulinu za přítomnosti různých množství representativních peptidových analogů, ve kterých jsou různé zbytky substituované alaninem, jak je uvedeno.

Obr. 3 je graf ukazující proliferativní odpověď (měřenou v cpm) klonu T lymfocytů NOD myší na (9-23) peptid přirozeného B řetězce insulinu za přítomnosti různých množství representativních peptidových analogů, ve kterých jsou aminokyseliny v pozicích 16 a 19 substituované alaninem (NBI-6024, čtverečky). Pro srovnání je také uvedena proliferativní odpověď za přítomnosti nepříbuzného kontrolního peptidu odvozeného z myelinového bazického proteinu (NBI-5096, kroužky). Odpověď je měřena jako průměr CPM + SEM pro tři kultury.

Obr. 4-6 jsou histogramy ilustrující proliferativní odpověď (měřenou v cmp) buněčné linie T lymfocytů od pacientů s diabetem na (9-23) peptid přirozeného B řetězce nebo na representativní peptidové analogy. Mononukleární buňky periferní krve byly izolovány od. pacientů s diabetem a byly kultivovány za přítomnosti (9-23) peptidu B řetězce insulinu.

Po třech cyklech restimulace B řetězcem insulinu (9-23) bylo do každé jamky s oblým dnem 96-jamkové plotny přidáno v kompletním mediu 1 x 10⁵ T lymfocytů a 7 x 10⁴ ozářených autologních PBMC. Buňky byly kultivovány po dobu 5 dnů s NBI 6024 (insulinový B řetězec 9-23 s alaninovými substitucemi v pozicích 16 a 19), insulinovým B řetězcem (9-23) nebo pouze s mediem. V den 4 byly buňky vystaveny pulsu ³H-thymidinu a byla provedena kultivace po dobu dalších 18 hodin. Kultury byly potom sklízeny, odečítány za použití kapalinového scintilačního počítače a data byla vyjádřena jako průměrný počet pulsů za minutu (cpm) pro opakovaně provedené vzorky + standardní odchylka (SEM).

Obr. 7 je histogram ilustrující proliferativní odpověď (měřenou v cmp) buněčné linie T lymfocytů od pacientů s diabetem na (9-23) peptid přirozeného B řetězce nebo na representativní peptidové analogy obsahující uvedené alaninové substituce. Mononukleární buňky periferní krve byly izolovány od pacientů s diabetem a byly kultivovány za přítomnosti (9-23) peptidu B řetězce insulinu. Po třech cyklech restimulace B řetězcem insulinu (9-23) bylo do každé jamky s oblým dnem 96-jamkové plotny přidáno v kompletním mediu 1 x 10^s T lymfocytů a 7 χ 10⁴ ozářených autologních PBMC. Buňky byly kultivovány po dobu 5 dnů s analogem, insulinovým B řetězcem (9-23) nebo pouze s mediem (BKG), jak je uvedeno. V den 4 byly buňky vystaveny pulsu ³H-thymidinu a byla provedena kultivace po dobu dalších 18 hodin. Kultury byly potom sklízeny, odečítány za použití kapalinového scintilačního měření a data byla vyjádřena jako průměrný počet pulsů za minutu (cpm) pro opakovaně provedené vzorky + standardní odchylka (SEM).

Obr. 8 je graf ukazující procento samic NOD myší, které byly diabetické po 9 týdnech léčby representativními peptidovými analogy. 10 myší bylo léčeno subkutáně od dne 24 peptidovými analogy B řetězce (9-23) obsahujícími alaninové substituce ve zbytku 12 (prázdné trojúhelníčky), 13 (čtverečky) nebo 16 (plné trojúhelníčky). Všechny myši léčené kontrolním peptidem, neurotensinem (kroužky), měly diabetes.

Obr. 9 je graf ukazující stejná data jako obr. 8, ale zobrazuje pouze skupinu léčenou A13 analogem a skupinu léčenou kontrolním peptidem (neurotensinem).

Obr. 10 je graf ukazující procento samic NOD myší, které • ·

byly diabetické po 13 týdnech léčby representativními peptidovými analogy. 10 myší bylo léčeno subkutáně od dne 24

400 ug neurotensinu (čtverečky), B řetězcem (9-23) (kosočtverečky) nebo peptidovým analogem B řetězce (9-23) obsahujícím alaninovou substituci ve zbytku 13 (trojúhelníčky).

Obr. 11 je graf ukazující efekt representativních peptidových analogů na incidenci diabetů u NOD myší. Čtyři týdny staré samice NOD myší (n=9) byly léčeny subkutánními injekcemi 20 mg/kg NBI-6024 (A^16,1®) v týdenních intervalech po dobu 12 týdnů a potom každý druhý týden do věku 35 týdnů. Kontrolní skupina (n=10) se skládala z neléčených zvířat. Myši s koncentrací glukosy v krvi vyšší než 200 mg/dl při dvou následujících měřeních byly považovány za diabetické myši. Data jsou vyjádřena jako procento nediabetických myší v průběhu 35-týdenní studie. Log-rank test byl použit pro hodnocení toho, zda jsou výsledky pro dvě léčebné skupiny statisticky významně odlišné. Procento NOD myší, které byly diabetické po léčbě NBI-6024 (A¹⁶-¹®) je uvedeno pro různé časy čtverečky, a procento myší, které byly diabetické v kontrolní skupině, je uvedeno kolečky.

Obr. 12 je graf ukazující vliv representativních peptidových analogů na incidenci diabetů u NOD myší. Čtyři týdny staré samice NOD myší (n=13-15) byly léčeny subkutánními injekcemi 20 mg/kg NBI-6024 (A¹®'³·⁹) nebo NBI-6201 (kontrolním peptidem, neurotensinem) v týdenních intervalech po dobu 12 týdnů a potom každý druhý týden do věku 35 týdnů. Další kontrolní skupina (n=8) se skládala z neléčených zvířat. Myši s koncentrací glukosy v krvi vyšší než 200 mg/dl při dvou následujících měřeních byly považovány za diabetické myši. Data jsou vyjádřena jako procento nediabetických myší v průběhu 35-týdenní studie. Log-rank test byl použit pro hodnocení toho, • · zda jsou výsledky pro dvě léčebné skupiny statisticky významně odlišné. Procento NOD myší, které byly diabetické po léčbě NBI-6024 (A¹⁶'³-⁹) je uvedeno pro různé časy čtverečky, procento diabetických myší po léčbě neurotensinem je uvedeno trojúhelníčky a procento myší, které byly diabetické v kontrolní skupině, je uvedeno kolečky.

Obr. 13A-13D jsou grafy ilustrující imunogenicitu representativních peptidových analogů obsahujících zbytky 9-23 B řetězce s alaninovými substitucemi ve zbytku 12 (obr. 13A), zbytku 13 (obr. 13B), zbytku 15 (obr. 13C) nebo ve zbytku 16 (obr. 13D). NOD myším byl injekčně podán 2-4-krát podkožně peptidový analog v solubilní formě před tím, než byla testována proliferativní odpověď buněk lymfatických uzlin na různé koncentrace peptidového analogu nebo peptidu (9-23) přirozeného B řetězce. Proliferativní odpověď byla stanovena podle množství radioaktivně značeného thymidinu inkorporovaného do buněk (v grafu uvedeno jako průměrný počet pulsů za minutu (cpm) třech kultivačních jamek), které bylo stanoveno v kapalinovém scintilačním počítači po dokončení kultivační periody.

Obr. 14A-14F jsou grafy ukazující imunogenicitu šesti různých peptidových analogů u NOD myší. Peptidové analogy se dvěma alaninovými substitucemi (A12,13; A12,15; A12,16; A13,15; A13,16 a A15,16) byly injekčně podány NOD myším a po 10 dnech byly jejich buňky lymfatických uzlin použity v proliferačním testu za použití různých koncentrací imunizačního peptidu jako stimulátoru. Proliferativní odpověď byla stanovena podle množství radioaktivně značeného thymidinu inkorporovaného do buněk (v grafu uvedeno jako průměrný počet pulsů za minutu (cpm) třech kultivačních jamek), které bylo stanoveno v kapalinovém scintilačním počítači po dokončení kultivační periody.

• · • ·

Obr. 15A-15D jsou grafy ilustrující imunogenicitu representativních dvojitě substituovaných peptidových analogů insulinového B řetězce (9-23) . Následující peptidy byly testovány na schopnost vyvolávat imunitní odpověď u NOD myší: A12,19 (obr. 15A); A13,19 (obr. 15B); A15,19 (obr. 15C); A16,19 (obr. 15D). Je uvedena proliferativní odpověď (v počtu pulsů za minutu) buněk spádové lymfatické uzliny v reakci na imunizační analog a také na peptid (9-23) přirozeného insulinového B řetězce.

Obr. 16 je graf ukazující schopnost serie trojnásobně substituovaných peptidů vyvolat proliferativní odpověď T-lymfocytů u NOD myší. Myši byly imunizovány jednotlivé representativními peptidovými analogy obsahujícími následující kombinace substitucí: A12,13,19; A12,15,19; A12,16,19; A13,15,19; nebo A13,16,19; A15,16,19. Buňky lymfatických uzlin byly potom použity v proliferačním testu a je uvedena reakce na každý imunizační peptid v různých koncentracích.

Obr. 17A a 17B jsou grafy ukazující schopnost serie dvojnásobně substituovaného peptidu (A^xs'^x9) vyvolat imunitní odpověď. Pět samic NOD myší bylo imunizováno podkožně 20 mg/kg solubilního NBI-6024 ve dny 1, 6 a 12. V den 15 byly myši utraceny, inguinální lymfatické uzliny byly odstraněny a buňky těchto uzlin byly kultivovány za přítomnosti různých koncentrací (0-50 uM) buď NBI-6024 (obr. 17A), nebo peptidu (9-23) insulinového B řetězce (obr. 17B). Rozsah proliferace T-lymfocytů byl stanoven pomocí inkorporace ³H-thymidinu.

Reakce je vyjádřena jako průměrný cpm + SEM ze třech kultur.

Obr. 18 je histogram ukazující srovnání cytokinů produkovaných imunitními buňkami po indukci A^x6'^x9 (NBI-6024) peptidem za přítomnosti nebo za absence pomocného činidla.

• · · ·

Skupiny NOD myší byly imunizované NBI-6024 samostatně nebo v emulsi s CFA. Koncentrace cytokinů IL-2 a IL4, jak jsou označeny, byly měřeny při 25 uM NBI-6024 a jsou uvedeny v pg/ml po odečtení bazálních hodnot.

Před popisem předkládaného vynálezu je pro jeho lepší pochopení vhodné uvést definice některých termínů.

Termín insulinový B řetězec označuje polypeptid o 30 aminokyselinách tvořící jeden ze dvou disulfidovou vazbou spojených polypeptidů v insulinu. Sekvence lidského insulinového řetězce je uvedena v SEQ ID NO: 1 a sekvence zbytků 9-23 lidského B řetězce je uvedena na obr. 1 a v SEQ ID NO: 2 .

Termín peptidové analogy insulinového B řetězce označuje alespoň 15 aminokyselinových zbytků odvozených od zbytků 9-23 lidského insulinového B řetězce (SEQ ID NO: 2), s alespoň jednou odlišnou aminokyselinou v sekvenci mezi analogem a přirozeným B řetězcem. V peptidovém analogu se alespoň jedna odlišnost v aminokyselinové sekvenci vyskytuje ve zbytku 12,

13, 15 a/nebo 16. Dále může být substituovaný zbytek 19 a i další alterace jsou možné. Výhodně obsahuje peptidový analog 1 až 4 substituce ve zbytcích 9-23 vzhledem k přirozené sekvenci (9-23) insulinového B řetězce, ačkoliv je možný i větší počet substitucí (například 5 nebo 6). Mohou být přítomny další zbytky z insulinového B řetězce, do kompletních 30 zbytků přirozeného B řetězce, výhodně do maximálně 25 zbytků, lépe do celkového počtu 16 nebo 18 zbytků peptidového analogu. Ve výhodném provedení obsahuje peptidový analog také zbytek 24 insulinového B řetězce. Sekvence, které nejsou odvozeny od

insulinového B řetězce, mohou, ale nemusí, být přítomny na amino a/nebo karboxylovém konci peptidového analogu. Takové sekvence mohou být použity, například, pro usnadnění syntézy, přečištěni nebo solubilizace peptidového analogu.

Pokud není uvedeno jinak, jsou uvedené aminokyseliny v L-formš. L-aminokyselinový zbytek v přirozené peptidové sekvenci může být alterován na jakoukoliv z 20 L-aminokyselin, které se běžný vyskytují v proteinech, na jakoukoliv z příslušných D-aminokyselin, vzácných aminokyselin, jako je

4-hydroxyprolin nebo hydroxylysin, nebo na neproteinovou aminokyselinu, jako je β-alanin nebo homoserin. Do rozsahu předkládaného vynálezu patří také analogy obsahující aminokyseliny, které byly pozměněny chemickými prostředky, jako je methylace (například -methylvalin); amidace C-koncové aminokyseliny alkylaminem, jako je ethylamin, ethanolamin nebo ethylendiamin; a/nebo acylace nebo methylace skupiny vedlejšího řetězce aminokyseliny (jako je například acylace epsilon-amino skupiny lysinu).

Termíny zbytek 12”, zbytek 13, zbytek 15, zbytek 16 a zbytek 19 (také označované jako pokzice 12, pozice 13, pozice 15, pozice 16 a pozice 19, v příslušném pořadí) označují aminokyseliny 12, 13, 15, 16 a 19 insulinového B řetězce, jak je uveden na obr. 1. Přesněji, systém číslování pro tyto zbytky označuje aminokyselinové pozice v přirozeném lidském proteinu, bez ohledu na délku peptidového analogu nebo na aminokyselinovou pozici v analogu. Peptidové analogy mající alaninové substituce ve zbytcích 12, 13, 15 nebo 16 se označují jako A12, A13, A15 nebo A16, v příslušném pořadí.

Peptidové analogy insulinového B řetězce

Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález poskytuje peptidové analogy obsahující alespoň zbytky 9-23 lidského insulinového B řetězce a obsahující změnu přirozeného L-valinu v pozici 12, L-glutamatu v pozici 13, L-leucinu v pozici 15 a/nebo L-tyrosinu v pozici 16, na jinou aminokyselinu. V jednom provedení obsahují peptidové analogy další alterace jedné až tří L-aminokyselin v pozicích 12, 13, 15, 16 a/nebo 19 insulinového B řetězce. Výhodně obsahující peptidové analogy dvě nebo tři alterace, ve kterých je jeden ze substituovaných zbytků v piozici 19.

Část peptidového analogu, která je odvozena od insulinového B řetězce, má obvykle délku 15-30 zbytků, výhodně 15-18 zbytků, ještě lépe 15-16 zbytků. Zejména výhodné peptidové analogy obsahují 15 aminokyselin odvozených od insulinového B řetězce.

Jak bylo uvedeno výše, peptidové analogy obsahující jakékoliv změny aminokyselin v pozicích uvedených výše spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Výhodné peptidové analogy obsahují nekonzervátivní substituce (t.j. substituce za aminokyselinu mající odlišný náboj, polaritu, hydrofobnost a/nebo velikost). Zejména výhodné analogy obsahují substituce jednoho nebo více zbytků alaninem.

Peptidové analogy mohou být syntetizovány standardními chemickými technikami, včetně automatizované syntézy. Obecně, peptidové analogy mohou být připraveny technikou peptidové syntézy na pevné fázi, které obsahuje navázání každého chráněného aminokyselinového zbytku na pryskyřicový nosič, výhodně na 4-methyl-benzhydrylaminovou pryskyřici, pomocí aktivace dicyklohexylkarbodiimidem, za zisku peptidu s C-terminálním amidem. Alternativně může být použita chlořmethylová pryskyřice (Merrifieldova pryskyřice), za zisku peptidů s volnou karboxylovou kyselinou na C-konci. Funkční skupiny vedlejších řetězců mohou být chráněny následujícím způsobem: benzylem pro serin a threonin; cyklohexylem pro kyselinu glutamovou a asparagovou; tosylem pro histidin a arginin; 2-chlorbenzyloxykarbonylem pro lysin; a

2-brombenzyloxykarbonylem pro tyrosin. Po kopulační reakci může být t-butyloxykarbonylovýá chránící skupina na alfa-amino skupině přidané aminokyseliny odstraněna reakcí s kyselinou trifluoroctovou, po které následuje neutralizace di-isopropylethylaminem. Další chráněný zbytek je potom navázán na volnou amino-skupinu, což vede k prodlužování peptidového řetězce. Po navázání posledního zbytku se chráněný peptid-pryskyřice zpracuje fluorovodíkem pro odštěpení peptidů z pryskyřice a pro odstranění chránících skupin pro funkční skupiny vedlejších řetězců. Surový materiál může být dále přečištěn gelovou filtrací, HPLC, rozdělovači chromatografií nebo iontoměničovou chromatografií, za použití dobře známých technik.

Peptidové analogy podle předkládaného vynálezu by (a) neměly stimulovat klony T lymfocytů NOD myší specifické k přirozenému (9-23) peptidů insulinového B řetězce (SEQ ID NO: 2), ani by neměly stimulovat takové klony na úrovni, která je nižší než úroveň stimulovaná přirozeným peptidem; (b) neměly stimulovat lidské T lymfocyty od pacientů specifické pro insulinový B řetězec (9-23) ; (c) neměly být imunogenní u NOD myší; (d.) měly by snižovat incidenci diabetů u NOD myší a (e) měly by inhibovat reakcí klonů T lymfocytů specifických pro peptid (9-23) přirozeného insulinového B řetězce (SEQ ID NO: 2). Proto mohou být potenciální peptidové analogy vyšetřovány na svou schopnost v léčbě diabetů pomocí testů měřících proliferaci T lymfocytů, imunogenicitu u NOD myší a efekt na incidenci onemocnění u NOD myší. Některé representativní testy pro

použití při hodnocení potenciálních peptidových analogů jsou podrobněji popsány dále. Ty analogy, které splňují výše uvedená kriteria, jsou použitelnými terapeutickými činidly.

Potenciální peptidové analogy mohou být nejprve testovány na schopnost stimulovat T lymfocyty specifické k peptidu (9-23) přirozeného insulinového B řetězce (SEQ ID NO: 2) (z klonálních buněčných linií nebo izolované od pacienta). Takové testy mohou být provedeny za použití přímého proliferačního testu, ve kterém jsou linie T lymfocytů reaktivní s přirozeným B řetězcem (9-23) nebo T lymfocyty od pacienta použity jako cílové buňky. Linie T lymfocytů mohou být získány, za použití dobře známých technik, z lymfatických uzlin získaných od krys, kterým byl injekčně podán B řetězec (9-23). Buňky lymfatických uzlin mohou být izolovány a kultivovány po dobu 5 až 8 dnů s B řetězcem (9-23) a IL-2. Životaschopné buňky jsou izolovány a může být provedeno druhé kolo stimulace B řetězcem (9-23) a ozářenými splenocyty jako zdrojem růstových faktorů. Po 5 až 6 takových pasážích je stanoven proliferativní potenciál každé buněčné linie. Pro provedení proliferačního testu mohou být linie T lymfocytů reaktivní s B řetězcem (9-23) kultivovány po dobu 3 dnů s různými koncentracemi peptidových analogů a ozářených autologních splenocytů. Po třech dnech je na dobu 12-16 hodin přidáno 0,5-1,0 pCi [³H]-thymidinu. Kultury jsou potom sklízeny a stanoví se inkorporace radioaktivity. Průměr cpm a standardní odchylka se vypočítají ze třech kultur. Peptidové analogy s výsledky, které jsou menší než tři standardní odchylky od průměru pro srovnatelnou koncentraci B řetězce (9-23) jsou považovány za nestimulační. Peptidové analogy, které nestimulují proliferaci při koncentracích menších nebo rovných 20-50 uM jsou vhodné pro další testování.

Potenciálně vhodné peptidy, které nestimulují T lymfocyty specifické pro B řetězec (9-23) a které výhodně inhibují reakci takových T lymfocytů in vitro, jsou dále testovány na jejich imunogenicitu u NOD myší. Stručně, skupiny NOD myší mohou být imunizovány 100-400 ug potenciálně použitelných peptidů podkožně v manitol-acetatovém pufru třikrát během 10-15 dnů. Po poslední imunizaci mohou být buňky lymfatických uzlin a/nebo sleziny použity v proliferačním testu, ve kterém jsou různé koncentrace imunizačního peptidů kultivovány s buňkami po dobu 3-4 dnů. Posledních 18 hodin kultivace může být provedeno s tritiem značeným tyhmidinem. Buňky mohou být potom sklízeny a odečítány ve scintilačním počítači a proliferační odpověď může být vyjádřena jako CPM + SEM. Potenciálně použitelné peptidy, které indukují proliferací, která je alespoň 2-krát vyšší než pozadí {bez antigenu) při 25 uM peptidů, jsou považovány za imunogenní. Alternativně, potenciální peptidový analog je považován za imunogenní tehdy, pokud vyvolá proliterativní odpověď po imunizaci NOD myší v kompletním Freundově adjuvans. Buňky drenážní lymfatické uzliny nebo sleziny, když jsou kultivovány za přítomnosti imunizujícího analogu, by měly indukovat proliferací, která je alespoň 2-krát vyšší než základní proliferace (bez antigenu) při 25 uM peptidů.

Potenciálně použitelné peptidy, které mohou inhibovat proliferací indukovanou B řetězcem (9-23), jsou dále testovány na schopnost snižovat incidenci diabetů u NOD myší. Stručně, peptidy mohou být podány NOD myším v solubilní formě nebo v emulsi například s nekompletním Freundovým adjuvans (IFA) . Obvykle je dostatečné týdenní podání přibližně 400 ug peptidů. Incidence diabetů u léčených myší, stejně jako u neléčených nebo kontrolních myší, je potom hodnocena týdenním sledováním koncentrací glukosy v krvi. Hodnota 200 mg/dl nebo více glukosy v krvi ve dvou následujících měřeních ukazuje na přítomnost diabetů. Peptidové analogy by měly vést ke statisticky

významnému snížení procenta NOD myší postižených diabetem během sledování délky přibližně 25 týdnů.

Jak bylo uvedeno výše, peptidové analogy mohou také inhibovat odpověď lidských T lymfocytů specifických pro B řetězec (9-23) in vitro. Taková inhibice může být měřena kompetitivními testy, ve kterých jsou potenciálně použitelné peptidové analogy testovány na schopnost inhibovat proliferaci T buněk indukovanou přirozeným B řetězcem (9-23) (SEQ ID NO:

2). V takovém testu jsou antigen-presentující buňky nejprve ozářeny a potom jsou inkubovány s kompetujícím peptidovým analogem a peptidem (9-23) přirozeného B řetězce. T lymfocyty jsou potom přidány do kultury. Kultury obsahují různé koncentrace testovaných peptidových analogů a mohou být inkubovány celkem po dobu 4 dnů. Po inkubaci je každá kultura vystavena pulsu , například, 1 pCi [³H] -thymidinu po dobu dalších 12-18 hodin. Kultury mohou být potom sklízeny na filtrech ze skelných vláken a mohou být odečítány způsobem uvedeným výše. Z dat získaných z trojích kultur mohou být stanoveny průměrné cpm a standardní odchylka. Výhodné jsou ty peptidové analogy, které snižují proliferaci o alespoň 25% při koncentraci 20-50 juM.

Léčba a prevence diabetů

Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález poskytuje způsoby léčby a prevence diabetů I.typu, při kterých je pacientům podáno terapeuticky účinné množství peptidového analogu insulinového B řetězce, jak je zde popsán. Diabetičtí pacienti vhodní pro takovou léčbu mohou být identifikováni podle kriterií pro diagnostiku klinického diabetů. Mezi taková kriteria patří, například, nízká (nižší než 10 nebo 1 percentil kontrol) první fáze sekrece insulinu při intravenosním glukosovém tolerančním testu (IVGTT) nebo persistence vysokého titru protilátek k antigenům ostrůvků, jako je insulin, GAD65 a/nebo ICA512.

Pacienti bez klinického diabetů, pro které může být přínosem profylaktické léčba, mohou být identifikováni podle jakéhokoliv v oboru přijímaného prediktivního kriteria. U paceintů bez klinického diabetů lze předpokládat vznik diabetů v následujících letech (1-5 letech) podle následujících kriterií: (i) rodiná anamnesa - příbuzní prvního stupně jsou automaticky vysoce rizikovou skupinou, pokud nemají protektivní HLA alelu; genetický make-up - t.j. přítomnost nebo nepřítomnost HLA alely, která je asociována s vysokým rizikem vzniku diabetů (například DR3/4; DQ8); (iii) přítomnost nebo nepřítomnost vysokého titru autoprotilátek v krvi proti jakémukoliv z antigenů: insulinu, GAD65 a/nebo ICA512; a (iv) intravenosní glukosový toleranční test (IVGTT): nízká první fáze sekrece insulinu, obvykle definovaná jako desátý nebo první percentil normálních kontrol, obvykle předchází vzniku diabetů I.typu o 1-5 let. Obyčejně se bere v úvahu několik z výše uvedených kriterií. Například, riziko vzniku diabetů v následujících 5 letech pro příbuzné jedince s diabetem prvního stupně je: 100% pro příbuzné se všemi 3 autoprotilátkami uvedenými výše; 44% pro příbuzné se dvěmi protilátkami; 15% pro příbuzné s jednou protilátkou; a 0,5% pro příbuzné bez protilátky. Mezi 50 příbuznými prvního stupně k pacientovi s diabetem I.typu po vzniku diabetů byla přítomná u 49/50 jedna nebo více z výše uvedených autoprotilátek.

Účinná léčba diabetů může být stanovena několika různými způsoby. Splnění jakéhokoliv z následujících kriterií, nebo jiných kriterií přijímaných v oboru, dokazuje účinnou léčbu. Mezi kriteria patří, bez omezení, oddálení vzniku klinické hyperglykemie, snížení frekvence hyperglykemických stavů, a/nebo prodloužení přítomnosti normálních hladin C-peptidu v krvi pacientů.

Peptidové analogy podle předkládaného vynálezu mohou být podány buď samostatně, nebo ve formě farmaceutického prostředku. Stručně, farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více peptidových analogů podle předkládaného vynálezu, v kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky nebo fyziologicky přijatelnými nosiči, ředidly nebo přísadami. Takové prostředky mohou obsahovat pufry jako je neutrální pufrovaný salinický roztok, fosfátem pufrovaný salinický roztok a podobně, karbohydráty, jako je glukosa, manosa, sacharosa nebo dextrany, manitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycin, antioxidační činidla, chelační činidla jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (například hydroxid hlinitý) a konzervační činidla. Kromě toho mohou farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu také obsahovat jednu nebo více dalších aktivních složek, jako jsou například systémy pro prodloužené podání či jiné imunopotenciační činidla.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě vhodné pro orální, nasální, venosní, intrakraniální, intraperitoneální, podkožní nebo inramuskulární podání. Dále mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu podány jako součást implantátu s prodlouženým uvolňováním. V ještě jiných provedeních mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu připraveny ve formě lyofilizovaných prostředků, za použití vhodných přísad vhodných pro dosažení stability lyofilizované formy a/nebo po rehydrataci.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou ♦ · být podány způsobem, který je vhodný pro léčené onemocnění. Množství a frekvence podání bude stanovena podle takových faktorů, jako je celkový stav pacienta a typ a závažnost onemocnění pacienta. V jednom provedení předkládaného vynálezu může být peptidový analog podán v dávce v rozmezí od 0,1 do 100 mg/kg, ačkoliv vhodné dávkování může být stanoveno v klinických pokusech. Pacienti mohu být sledováni na terapeutickou účinnost podle oddálení progrese klinického diabetů a omezení užívání insulinu pro udržování normoglykemie.

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava peptidů

Tento příklad popisuje syntézu representativních peptidových analogů.

Peptidy byly syntetizovány technikou syntézy na pevné fázi na peptidovém syntezátoru (Beckman model 990). Peptidy s amidovaným karboxylovým koncem byly připraveny s p-methylbenzhydrylaminovou pryskyřicí (MBHA pryskyřice); pro peptidy s volným karboxylovým koncem byla použita Merrifieldova pryskyřice s vhodně chráněnou aminokyselinou. Obě pryskyřice byly získány od Bachem Fine Chemicals (Torrance, CA). Derivatizované aminokyseliny (Bachem Fine Chemicals) použité v syntéze byly L-konfigurace, pokud není uvedeno jinak, a měly N-alfa-amino funkci chráněnou výlučně t-butyloxykarbonylovou skupinou. Funkční skupiny vedlejších řetězců byly chráněny následujícím způsobem: benzylem pro serin a threonin; cyklohexylem pro kyselinu glutamovou a asparagovou; tosylem pro histidin a arginin; 2-chlorbenzyloxykarbonylem pro lysin a 2-brombenzyloxykarbonylem pro tyrosin. Navázání karboxy-koncové aminokyseliny na MBHA pryskyřici bylo provedeno pomocí dicyklohexylkarbodiimidu a další aminokyseliny byly navazovány pomocí dicyklohexylkarbodiimidu podle Ling et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 4302, 1984). Po inkorporaci poslední aminokyseliny byla t-butyloxykarbonylová chránící skupina odstraněna a konjugát peptid-pryskyřice reagoval se směsí 14 ml kyseliny fluorovodíkové (HF), 1,4 ml anisolu a 0,28 ml methylethylsulfidu na gram pryskyřicového konjugátu při -20 °C po dobu 0,5 hodiny a při 0 °C po dobu 0,5 hodiny. HF byla odstraněna ve vakuu při 0 °C a výsledná směs peptidu a pryskyřice byla promyta dvakrát diethyletherem a dvakrát chloroformem a diethyletherem střídavě. Peptid byl extrahován pětkrát 2 M kyselinou octovou a extrakt byl lyofilizován.

Lyofilizovaný materiál byl nejprve přečištěn na koloně Sephadex G-25 fine (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) vyvíjené ve 30% kyselině octové pro odstranění zkrácených fragmentů a anorganických solí (Ling et al., 1984). Peptidy byly dále přečištěny CM-32 karboxymethylcelulosovou kationtovou iontoměničovou chromatografií (Ling et al., 1984). Konečné přečištění bylo provedeno rozdělovači chromatografií na Sephadex G-25 fine (Ling et al., 1984). Alternativně může být surový peptid přečištěn preparativní HPLC na Biotage KP-100 gradientovém HPLC systému. Syntetický materiál byl charakterizován aminokyselinovou analýzou, hmotnostní spektrometrií a HPLC s reevrsní fází.

Příklad 2: Dlouhodobé linie T-lymfocytů

Tento příklad ilustruje přípravu dlouhodobých linií T-lymfocytů specifických pro insulin od NOD myší.

• β 9 ♦ · ·*

Insulin-specifické linie NOD T lymfocytů byly připraveny kultivací lymfocytů izolovaných z populací infiltrujících ostrůvky pomocí in vitro stimulace prasečím insulinem v dávce 25 ug/ml a ozářených buněk NOD ostrůvků jako antigfen -presentujících buněk a cytokinů. Pro získání infiltrujících lymfocytů byly provedeny následujcíi procedury (viz Wegmann et al., Eur. J. Immunol. 24: 1853, 1994): pankreas od NOD myší byl tráven kolagenasou a jednotlivé ostrůvky byly izolovány manuálně. Infiltrující lymfocyty byly potom získány mírným trávením ostrůvků trypsinem. Insulin-specifické T-lymfocytární linie nebo klony byly propagovány sériovou stimulací za přítomnosti NOD buněk sleziny, prasečího insulinu a lymfokinů. Klony byly získány limitním ředěním linií T-lymfocytů specifických pro B řetězec (9-23) za přítomnosti antigen presentujících buněk a prasečího insulinu v dávce 25 ug/ml. Jamky s rostoucí populací buněk po limitním ředění byly expandovány ve vhodném mediu a po jednom růstovém cyklu byly testovány na reaktivitu k peptidu (9-23) B řetězce insulinu pomocí hodnocení proliferační odpovědi.

Příklad 3: Vliv peptidových analogů na proliferací insulin-specifických klonů NOD T-lymfocytů

Tento příklad ilustruje vliv representativních peptidových analogů na proliferací T-lymfocytů.

Klony myších (NOD) T-lymfocytů specifických pro insulinový B řetězec (9-23) (SEQ ID NO: 2) byly izolovány z infiltrujících lymfocytů způsobem popsaným v příkladu 2. Peptidové analogy s jedněmi alaninovými substitucemi byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 1. Vliv každého analogu na proliferací T-lymfocytů byl potom hodnocen za použití testu provedeného v 96-jamkových plotnách s plochým dnem (viz Daniel et al., Eur.

4« · · · ···· ··· · · · * · ·· · ··» 0 · · » * · < · ·· ♦ ······ « 0 · · « «··· • « · · · · · · ··· ·· · *

J. Immunol. 25: 1056, 1995). Stručně, 25000 T-lymfocytů s 1000000 ozářených NOD buněk sleziny bylo trojmo kultivováno za přítomnosti 50 pg/ml peptidu 9-23 insulinového B řetězce nebo za přítomnosti jakéhokoliv alaninem substituovaného peptidu uvedeného dále. Plotny byly inkubovány po dobu celkem 72 hodin v atmosféře 7% oxidu uhličitého s pulsem 1 juCi/jamku tritiovaného thymidinu po dobu posledních 6-8 hodin kultivace. Buňky byly sklízeny na filtru ze skelného vlákna a asociovaná radioaktivita byla odečítána v kapalinovém scintilačním počítači. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrný počet pulsů za minutu pro tři jamky.

Data získaná od pěti samostatných klonů T-lymfocytů ukazují buď chybění proliferace, nebo významné snížení proliferace, (vzhledem k přirozenému 9-23 peptidu insulinového B řetězce; SEQ ID NO: 2) za přítomnosti následujících alaninem-substituovaných analogů: A12, A13, A15, A16, A17 a A18. Tato data jsou uvedena v tabulkách 1 a 2.

« «·

Tabulka 1: Odpověď (cpm) klonů NOD T-lymfocytů specifických pro insulin

Klon T-lymfocytů

M P	odifikovaná Přirozený oz-i ce zbytek Substituce	PD6-4.3	PD12-2.40
	9	S	A	12861	42234
10	H	A	12507	1409
11	L	A	14148	2594
12	V	A	8292	671
13	E	A	142	519
14	A	žádná
15	L	A	161	1422
16	Y	A	98	539
17	L	A	553	19321
18	V	A	234	44785
19	c	A	7678	34212
20	G	A	2440	38685
21	E	A	91	39087
22	R	A	6555	51722
23	G	A	14304	75441
Bez antigenu Nativní 9-23			163	682
		10463	32221

• ·

Tabulka 2: Odpověď (cpm) klonů myších NOD T-lymfocytů specifických pro insulin

	Modifikovaná pozice	Přirozený zbytek	Substituce	Klon T-lymfocytů
PD12-4.4	PD 12-4.29	PD12-4.34
	9	s	A	1000	18422	259
	10	H	A	823	15484	356 .
	11	L	A	474	18416	190
	12	V	A	1129	15041	194
	13	E	A	373	891	179
	14	A	žádná			«5
	15	L	A	675	809	191
	16	Y	A	779	63£	202
	17	L	A	332	1460	4360
	18	V	A	225	1193	721
	19	C	A	4295	6054	689
	20	G	A	1323	13736	466
	21	E	A	7900	4904	773
	22	R	A	1313	12635	1555
	23	G	A	3228	18422	791
	3ez antigenů			350	789	231
Nativní .9-23 i. ------------			10000	14820	3614

Tabulka 3 ukazuje odpověď čtyř různých klonů T-lymfocytů získaných od NOD myší na dvojitě alaninem substituovaný peptidový analog A16, A19 (NBI-6024; 16Y>A/19C>A). Klony NOD T-lymfocytů byly inkubovány za přítomnosti 50 μΜ buď peptidu (9-23) přirozeného B řetězce nebo NBI-6024. Data v tabulce 3 představují průměr tří vzorků + standardní odchylka od průměru. V tabulce 3 S.I. (stimulační index) = proliferace (cpm) za přítomnosti peptidu/ proliferace (cpm) v mediu samotném. Tato data ukazují významnou odpověď tehdy, když jsou buňky kultivovány s peptidem (9-23) přirozeného B řetězce, ale slabou nebo žádnou proliferaci proti samotnému mediu (základní hodnotě) za přítomnosti NBI-6024.

Tabulka 3: Proliferativní odpověď myších klonů T-lymfocytů specifických pro insulinový B řetězec (9-23) na 50 uM B řetězce (9-23) nebo analog A^x6'^x9 (NBI-6024)

Klon Tlymfocytů	Pokus č.	I Pouze medium '-'mj	nsulinový B řetězec (9-23)	NBI-6024 (A16·19)
Průměr cpm+sem	S.I.	Průměr · cpm+sem	S.I.
PD12-2.35	1	688 ± 227	120,886 ±7,171	175.7	841 ±88	1.22
	2	493 ± 20	100,521 ± 1,581	203.89	452±179	0.91
PD 12-2.40	1	170 ±8	16,730 ±3,835	98.4	272 ± 34 .	1.16
	2	1,834 ±638	176,359 ±36,306	96.16	1,863 ±451	1.01
PD12-4.1	1	215 ± 17	28,593 ± 4664	132.99	566 ± 30	2.63
PD12-4.9	1	9,111 ± 1,889	45,541 ± 5,222	4.99	12,313 ± 1,372	1.35
	2	7,202 ± 2,773	65,624 ± 4,979	9.1	6,171 ±725	0.85

Příklad 4: Antagonisování proliferačního testu T-lymfocytů

Tento příklad ilustruje inhibici odpovědi myších klonů T lymfocytů specifických pro peptid (9-23) B řetězce insulinu representativními peptidovými analogy.

Peptidové analogy B řetězce (9-23) obsahující alaninové substituce ve zbytku 12, 13, 15 nebo 16 nebo dvojité substituce v pozicích 16 a 19 (A^xe'^x9; NBI-6024), byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 1. Antagonistické působení na T lymfocyty bylo detekováno hodnocením schopnosti peptidových analogů inhibovat proliferaci T-lymfocytů indukovanou přirozeným B řetězcem (9-23) (SEQ ID NO: 2). V tomto testu byly antigen-presentující buňky nejprve ozářeny a potom inkubovány s kompetitivním peptidovým analogem a peptidem (9-23) přirozeného B-řetězce. T-lymfocyty byly potom přidány do kultury. Různé koncentrace potenciálních peptidových analogů byly obsaženy v kulturách, které byly inkubovány po celkovou dobu 4 dnů. Po této inkubační periodě byla každá kultura vystavena pulsu 1 juCi [³H]-thymidinu po dobu dalších 12-18 hodin. Buňky byly potom sklízeny na filtrech ze skelného vlákna a byly odečítány způsobem popsaným výše. Průměrný cpm a standardní odchylka byly vypočítány z dat získaných ve třech pokusech. Výsledky, uvedené na obr. 2, ukazují, že peptidové analogy obsahující alaninové substituce ve zbytku 12, 13 nebo 16, jsou schopné zmírnit odpověď patogeních T-lymfocytů specifických pro insulinový B řetězec (9-23) .

Schopnost dvojitě substituovaného peptidu inhibovat insulin-dependentní proliefraci T buněk je uvedena v tabulce 4 a na obr. 3. V tabulce 4 je kontrolním peptidem NBI-5096 nepříbuzný peptid z myelinového bazického proteinu. Procento inhibice bylo vypočítáno jako: (1-pokusné cpm/cpm pro insulinový peptid) x 100%.

• ·

Tabulka 4: Inhibice odpovědi na peptid (9-23) insulinového B řetězce u dvou myších NOD klonů T-lymfocytů peptidovým analogem

Klon	Podmínky	CPM ± SEM	%Inhibice
PD12-2.35	pouze medium	213 ±17
	B(9-23) 5μΜ	7,840 ±528
	B(9-23) 5μΜ + 10 μΜ NBI-6024	4,441 ±626	43.0
	B(9-23) 5μΜ + 50 μΜ NBI-6024	1,389 ± 218	82.0
	B(9-23) 5μΜ + 10 μΜ NBI-5096	10,089 ± 1,113	N/A
	B(9-23) 5μΜ + 50 μΜ NBI-5096	10,125 ±887	N/A
PD12-2.40	pouze medium	305 ±13
	B(9-23) 5μΜ	9,149 ±1,062
	B(9-23) 5μΜ + 10 μΜ NBI-6024	6,379 ± 1,485	30.0
	B(9-23) 5μΜ + 50 μΜ NBI-6024	4,305 ± 941	52.9
	B(9-23) 5μΜ + 10 μΜ NBI-5096	12,336 ±1,556	N/A
	B(9-23) 5μΜ + 50 μΜ NBI-5096	17,988 ±584	N/A

N/A - nepoužitelné, protože nebyla pozorována žádná inhibice

Schopnost NBI-6024 blokovat peptidem (9-23) B řetězce indukovanou stimulaci klonů T lymfocytů získaných z NOD myší naznačuje, že alterace v pozicích 16 a 19 peptidu (9-23) přirozeného insulinového B řetězce nemění rozpoznávání analogu patogenními T-lymfocyty. Kromě toho tyto výsledky naznačují, že analog se také váže na MHC s dostatečnou afinitou pro rozpoznávání T-lymfocyty specifickými pro insulinový B řetězec (9-23) .

Příklad 5: Vliv peptidových analogů na proliferci linií T-lymfocytů a klonů od diabetických pacientů

Tento příklad ukazuje chybění stimulace T-lymfocytárních linií a klonů získaných od diabetických pacientů ··· · « · · · » * · ··· ··· · · · ·· · · representativními peptidovými analogy.

Peptidové analogy B řetězce (9-23) obsahující alaninové substituce ve zybtcích 13, 515, 16 nebo 17 nebo dvojitě alaninem substituovaný analog a³-⁶'^3-9 (NBI-6024) byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 1. Linie T-lymfocytů od diabetických paceintů byly připraveny izolací lymfocytů z krve paceintů tak, že krev byla zpracovány separací podle hustoty. Izolované lymfocyty byly potom kultivovány za přítomnosti peptidu (9-23) insulinového B řetězce (10 juM) a rekombinantního lidského IL-2 za přítomnosti 5-10% autologního séra a ozářených autologních lymfocytů periferní krve v kultivačním mediu. Za čtaři nebo za pět dnů byly buňky sklízeny a cyklus byl opakován 2 až 3-krát.

Proliferace linie T lymfocytů, v odpovědi na peptid (9-23) přirozeného B řetězce (SEQ ID NO: 2) nebo na peptidové analogy, byla měřena kultivací 25000 až 100000 T-lymfocytů za přítomnosti 50000-200000 ozářených autologních PBL a různých koncentrací peptidu (9-23) insulinového B řetězce nebo peptidového analogu ve třech kulturách. Po 4-5 dnech kultivace, včetně posledních 18 hodin s radioaktivně značeným thymidinem, byly buňky sklízeny a asociovaná radioaktivita byla měřena v kapalinovém scintilačním počítači. Výsledky jsou uvedeny jako průměrný počet pulsů za minutu pro každý testovaný peptidový analog.

Výsledky, uvedené na obr. 4-7, ukazují, že klony a linie T-lymfocytů, které proliferují v odpovědi na peptid (9-23) přirozeného insulinového B řetězce (SEQ ID NO: 2), nejsou stimulovány peptidovými analogy. Výsledky od těchto a od jiných pacientů j sou shrnuty v tabulce 5.

• ·

Tabulka 5: Proliferativní odpověď PBL pacienta na přirozený insulinový peptid nebo na analog NBI-6024

Číslo pacienta	ID pacient1	Stimulační index*
Insulin B (9-23) [50 μΜ]	NBI-6024 [50 μΜ]
l	100	9.9	0.9
2	200	5.3	1.2
o 3	400	7.8	1.0
4	500	2.1	0.9
5	600	5.8	1.6 ·
6	700	3.2	1.5
7	900	2.6	0.9
8	1100	3.7	0.8

* Stimulační index = cpm s antigenem/cpm s mediem samotným (bez antigenu)

Výsledky jasně ukazují, že buňky od diabetických pacientů, které jsou reaktivní na peptid (9-23) insulinového B řetězce, nereagují na alterovaný peptidový ligand NBI-6024, který má substituce v pozicích 16 a 19. Také jsme zjistili, že APL NBI-6024 se váží se podobnou afinitou na DQ8 antigeny. Proto není nepřítomnost stimulace T-lymfocytů diabetických pacientů NBI-6024 způsobena jakoukoliv inkopatibilitou peptidu s presentujícími MHC molekulami, ale spíše pozměněným rozpoznáváním T-lymfocyty specifickými pro B řetězec (9-23) .

Příklad 6: Snížení incidence diabetů u NOD myší

Tento příklad ilustruje schopnost representativních peptidových analogů bránit vzniku diabetů u NOD myší.

• · · · « ···· »· · ·· ··· ·«· ·· «*

U NOD myší se spontálně vyvíjí diabetes přibližně ve 3. měsíci věku (Makino et al., Current Topics in CLinical and Experimental Aspects of Diabetes mellitus, Sakamoto et al., ed., str. 25-32 (Elsevier, Amsterdam, 1985)). Vzniku onemocnění předchází buněčná infiltrace T-lymfocytů do pankreasu, ke které dochází již v 1 měsíci věku. Solubilní peptidové analogy B řetězce (9-23) obsahující alaninové substituce ve zbytcích 12, 13 nebo 16 byly podávány NOD myším v týdenních intervalech. V každé dávce bylo každému z deseti zvířat podáno 400 ug každého peptidů. Po 9 cyklech bylo v každé skupině stanoveno procento myší, u kterých vznikl diabetes, podle měření koncentrace glukosy v krvi v týdenních intervalech pomocí glukometru. Hodnoty koncentrace glukosy v krvi vyšší než 200 mg/dl ve dvou následujících měřeních byly považovány za ukazatel klinického diabetů.

Jak je uvedeno na obr. 8, léčba každým z alaninemsubstituovaných analogů vedla k významnému snížení incidence diabetů. Data pro A13 substituovaný analog jsou uvedena také na obr. 9.

V jiném pokusu byly B řetězec (9-23), A13 substituovaný analog nebo neurotensin (jako kontrola) podávány podkožně NOD myším v týdenních intervalech. V každé dávce bylo každému z deseti zvířat podáno 400 ug každého peptidů. Po 13 cyklech bylo v každé skupině stanoveno procento myší, u kterých vznikl diabetes, za použití způsobu popsaného výše. Jak je uvedeno na obr. 10, peptid (9-23) B řetězce snižoval incidenci diabetů. Toto snížení bylo nejvýraznější pro A13 substituovaný analog.

Pro stanovení schopnosti dvojitě substituovaného peptidů _Ai6,i9 (NBI-6024) kontrolovat vznik diabetů u NOD myší byl peptid podáván zvířatům nízkého věku. Samice myší (n=9, stáří • · přibližně 4 týdny) byly léčeny podkožními injekcemi 20 mg/kg (40 jug/myš) NBI-6024 po dobu 12 týdnů a potom každý druhý týden do týdne 35. Od věku 9-10 týdnů byly myši jednou týdně sledovány na hyperglykemii pomocí měření koncentrace glukosy v krvi. Jako kontrola byla použita skupina 10 neléčených myší.

Jak je vidět, léčba NBI-6024 významně snížila incidenci diabetů o přibližně 60-70% ve srovnání s neléčenou skupinou (p <

0,004) .

Tato pozorování byla potom potvrzena a rozšířena ve druhém pokusu. V tomto pokusu byla zvířata (n=13-15) léčena bud' NBI-6024, nebo nepříbuzným peptidem, neurotensinem, NBI-6201, způsobem uvedeným výše. Další skupina (n=8) byla neléčena. Jak je uvedeno na obr. 12, léčba 20 mg/kg pozměněného peptidu NBI-6024 vedla ke snížení incidence diabetů ve srovnání s neurotensinem léčenu skupinou nebo neléčenou skupinou.

Tyto výsledky ukazují, že alterovaný peptidový ligand NBI-6024, odvozený od peptidu (9-23) insulinového B řetězce, je shcopen bránit spontálnímu vzniku diabetů u rizikových zvířat. Je pravděpodobné, že T-lymfocyty, které rozpoznávají jiné pankreatické antigeny, jsou u těchto zvířat přítomné, ale jsou také pravděpodobně regulované insulinovými APL. Podání bylo pravděpodobně provedeno ve stejnou dobu, ve které autoreaktivní lymfocyty začínají infiltrovat pankreas a iniciují destruktivní proces. Tyto výsledky dávají naději, že časná intervence za použití těchto APL může být účinná v oddálení nebo zabránění vzniku diabetů I.typu u lidí.

Příklad 7: Imunogenicita representativních peptidových analogů

Tento příklad ilustruje imunogenicitu representativních peptidových analogů u NOD myší.

Skupiny 3-4 myší byly imunizovány 100-400 ug peptidových analogů subkutánně v manitol-acetatovém pufru třikrát během 10-15 dnů. Po poslední imunizaci byly buňky lymfatické uzliny a/nebo buňky sleziny použity v proliferačním testu, ve kterém byly kultivovány s různými koncentracemi imunizačního peptidu po dobu 3-4 dnů. Na posledních 18 hodin byl do kultury přidán tritiem značený thymidin. Buňky byly sklízeny a odečítány ve scintilačním počítači a odpověď je vyjádřena jako cpm + sem. Tyto výsledky, uvedené na obr. 13-16, ukazují, že tyto representativní peptidové analogy se mohou vázat na myší MHC molekuly a mohou být rozpoznávány příslušnými T-lymfocyty.

Potom byla stanovena schopnost dvojitě substituovaného peptidu NBI-6024 (A^16,19) indukvat buněčnou imunitní odpověď u NOD myší. Dvě samice NOD myší byly imunizovány 10 mg/kg NBI-6024 buď ve formě vodné suspenze, nebo - pro kontrolu - ve formě emulse s kompletním Freundovým adjuvans (CFA). V den 8, tři dny po poslední injekci, byly myši utraceny, buňky sleziny a inguinální lymfatické uzliny byly odstraněny a shromážděny a byla připravena suspenze jednotlivých buněk. Buňky byly kultivovány za přítomnosti různých koncentrací (0-25 uM) NBI-6024. Schopnost proliferace lymfoidních buněk po stimulaci NBI-6024 byla měřena in vitro podle inkorporace [³H]-thymidinu.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6, ve které je odpověď vyjádřena jako průměrný cpm +. sem ze třech kultivací. Buňky lamfytických uzlin izolované od myši imunizované analogem v CFA měly silnou proliferativní odpověď na stimulaci imunizujícím analogem, která byla závislá na dávce (tabulka 6). Tyto výsledky naznačují, že alterace provedené v sekvenci (9-23) insulinového B řetězce v pozicích 16 a 19 neměly vliv na schopnost peptidu vázat se na molekulu MHC haplotypu asociovanou s onemocněním u NOD myší a - což je významnější 32

že nebylo narušeno rozpoznávání T-lymfocyty.

Tabulka 6: Proliferativní odpověď buněk lymfatické uzliny na NBI-6024 u NOD myší imunizovaných NBI-6024 v CFA

NBI-6024	Proliferativní odpověď
(μΜ)	(CPM ± SEM)
0	2,445 ±137
1	140.061 ±7,289
5	187,711 ±2,548
25	218.149 ±4,462

Dále, jak buňky sleziny, tak lymfatické uzliny izolované od myší, kterým byl podán solubilní peptid, vykazovaly silnou proliferativní odpověď na APL po stimulaci NBI-6024 in vitro (tabulka 7 a obr. 17A a 17B). Ještě významnější bylo zjištění, že NBI-6204-reaktivní lymfocyty od myší imunizovaných solubilním peptidem také reagovaly na insulinový B řetězec (9-23) . Tato zkřížená reaktivita nebyla pozorována pro peptid emulsifikovaný v CFA. Tato schopnost solubilního peptidů indukovat zkříženou reaktivitu může být užitečná při kontrole diabetů, protože může napomoci mobilizaci protektivních NBI-6024 specifických T-lymfocytů do patogenní cílové tkáně.

• ·

Tabulka 7: Proliferativní odpověď T-lymfocytů od NOD myší imunizovaných rozpustným NBI-6024 na NBI-6024 nebo na přirozený insulinový B řetězec (9-23)

ΝΒΪ-6024 indukovaná buněčná linie	Konc. peptidu [μΜ]	CPM ± SEM NBI-6024	CPM ± SEM Insulin B(9-23)
Myš; # 1	0	19,130±2191	19,130 ±2191
	1	48,319 ± 191»	16,870 ±4469
	5	160,673 ± 2269	21,292 ±3216
	25	268,005 ± 11198	33,317±3619
I Myš #2	0	21,588 ±2326	21,588 ±2326
	1	54,519 ±5666	17,262 ±602
	5	126,123 ± 13851	19,648 ±2169
	25	202,707 ±8125	30,612 ±3557
Myš #3	0	24,006 ±2803	24,006 ±2803
	1	64,239 ± 9493	25,825 ±3841
	5	140,836 ±11778	58,567 ± 2737
	25	240,278 ± 15015	113,366 ±515

Pro určení typu T-lymfocytů produkovaných po podání rozpustného NBI-6024 byly supernatanty kultur imunitních lymfoidních buněk odstraněny 48 hodin po zahájení kultivace a za použití standardní ELISA technologie byly měřeny koncentrace různých cytokinů. Překvapivě bylo zjištěno, že T-lymfocyty od myší imunizovaných rozpustným NBI-6024 produkovaly Th2 cytokiny, interleukin-4 (obr. 18) a interleukin-5 (tabulka 8), a nikoliv Thl cytokin interleukin-2. V tabulce 8 jsou hodnoty uvedeny v pg/ml jako průměr ze třech pokusů + SEM. Jako kontrola byl použit NBI-6024 v emulsi s CFA, který indukoval • ·

očekávaný Thl-profil cytokinů (IL-2) v imunitních T-lymfocytech po stimulaci in vitro.

Tabulka 8: Cytokinová odpověď T-lymfocytů indukovaných rozpustným NBI-6024 na NBI-6024

NBI-6024 [mM]	Cytokin (pg/ml)
IL-2	IL-4	IL-5
0	< 15 pg/ml	134 ±0	1,814 ±332
1	< 15 pg/ml	684 ±92	9,999 ± 503
5	< 15 pg/ml	1,653 ±51	23,496 ± 684
25	< 15 pg/ml	2,102 ±85	28,062 ± 141

Možnost indukce Th-2 podobných lymfocytů podkožním podáním rozpustného NBI-6024 je žádoucí vlastností, protože takové buňky jsou asociovány s úzdravou při diabetů a jiných orgánově specifických autoimunitních onemocněních (Sarventick, J. Exp. Med. 184: 1597-1600, 1996; Shaw et al., 1997; Balasa et al., J. Exp. Med. 186: 385-391, 1997). Tyto cytokiny odvozené od Th2 lymfocytů mají silné protizánětlivé účinky, které potlačují vznik autoreaktivních Thl lymfocytů produkujících prozánětlivé cytokiny, které způsobují onemocnění.

Z uvedeného popisu je jasné, že ačkoliv byla popsána specifická provedení vynálezu, existují různé jeho modifikace, které se neodchylují od rozsahu a duchu předkládaného vynálezu. V souladu s tím je vynález vymezen pouze připojenými patentovými nároky.

• ·

Seznam sekvencí <110> Neurocrine Biosciences, lne.

<120> Způsob léčby diabetes mellitus využívající peptidových analogů insulinu <130> 690068.448PC <140> PCT <141> 23.2.1999 <160> 2 <170> Patentln ver. 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> B řetězec lidského insulinu <400> 1

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Zbytky 9-23 B řetězce lidského insulinu <400> 2

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly

Claims (27)

1. Peptidový analog obsahující zbytky 9 až 23 lidského B řetězce insulinu, který se liší od sekvence zbytků 9 až 23 přirozeného lidského B řetězce insulinu substitucemi v l až 4 aminokyselinových pozicích, kde alespoň jedna substituce je přítomná ve zbytku vybraném ze skupiny skládající se ze zbytků 12, 13, 15 a 16.

2. Peptidový analog podle nároku 1, který má sekvenci, která se liší od přirozeného lidského B řetězce insulinu ve dvou aminokyselinových zbytcích.

3. Peptidový analog podle nároku 1, který má sekvenci, která se liší od přirozeného lidského B řetězce insulinu ve třech aminokyselinových zbytcích.

4. Peptidový analog podle nároku 1, ve kterém je aminokyselinová substituce přítomná ve zbytku 19.

5. Peptidový analog podle nároku 1, ve kterém je alespoň jedna aminokyselinová substituce nekonzervativní.

6. Peptidový analog podle nároku 1, ve kterém je zbytek 12 substituovaný.

7. Peptidový analog podle nároku 6, ve kterém je zbytek 12 alaninový zbytek.

8. Peptidový analog podle nároku 1, ve kterém je zbytek 13 substituovaný.

9. Peptidový analog podle nároku 8, ve kterém je zbytek 13 alaninový zbytek.

10. Peptidový analog podle nároku 1, ve kterém je zbytek 15 substituovaný.

11. Peptidový analog podle nároku 10, ve kterém je zbytek 15 alaninový zbytek.

12. Peptidový analog podle nároku 1, ve kterém je zbytek 16 substituovaný.

13. Peptidový analog podle nároku 12, ve kterém je zbytek 16 alaninový zbytek.

14. Peptidový analog podle jakéhokoliv z nároků 6-13, ve kterém je zbytek 19 substituovaný.

15. Peptidový analog podle nároku 14, ve kterém je zbytek 19 alaninový zbytek.

16. Peptidový analog podle nároku 1. který dále obsahuje zbytek 24 lidského B řetězce insulinu.

17. Peptidový analog podle nároku 1, který neobsahuje více než 18 zbytků lidského B řetězce insulinu.

18. Peptidový analog podle nároku 1, který neobsahuje více než 16 zbytků lidského B řetězce insulinu.

19. Peptidový analog podle nároku 1, který neobsahuje více než 15 zbytků lidského B řetězce insulinu.

20. Peptidový analog skládající se v podstatě ze zbytků 9 až • · · · · ··· • · · · · ···»· • · · · · ··· ·· · ·· ··· · · · ·· • ·

23 lidského B řetězce insulinu, který se liší od sekvence zbytků 9 až 23 přirozeného lidského B řetězce insulinu substitucemi v 1 až 4 aminokyselinových pozicích, kde alespoň jedna substituce je přítomná ve zbytku vybraném ze skupiny skládající se ze zbytků 12, 13, 15 a 16.

21. Peptidový analog skládající se v podstatě ze zbytků 9 až

24 lidského B řetězce insulinu, který se liší od sekvence zbytků 9 až 23 přirozeného lidského B řetězce insulinu substitucemi v 1 až 4 aminokyselinových pozicích, kde alespoň jedna substituce je přítomná ve zbytku vybraném ze skupiny skládající se ze zbytků 12, 13, 15 a 16.

22. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje peptidový analog podle jakéhokoliv z nároků 1-19 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem či ředidlem.

23. Způsob pro inhibici vzniku diabetů vyznačuj ící se t i m, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku podle nároku 22 pacientovi.

24. Způsob pro léčbu diabetů vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku podle nároku 22 pacientovi.

25. Peptidový analog obsahující zbytky 9 až 23 lidského B řetězce insulinu, který se liší od sekvence zbytků 9 až 23 přirozeného lidského B řetězce insulinu substitucemi ve zbytcích 16 a 19.

26. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje peptidový analog podle nároku 25 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem či ředidlem.

• · * · « · * ·' · · «» · · ♦ · « · · • 00 0 0 0 ·

27. Způsob pro inhibici vzniku diabetů vyznačuj ící se t í rn, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku podle nároku 26 pacientovi.