CZ20003282A3

CZ20003282A3 - DNA kódující faktor VIII, proteinový produkt exprimovaný touto DNA a modifikovaný faktor VIII

Info

Publication number: CZ20003282A3
Application number: CZ20003282A
Authority: CZ
Inventors: John S. Lollar
Original assignee: Emory University
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2001-01-17
Also published as: AU2995699A; WO1999046274A1; NZ506771A; PL342887A1; CN1297452A; NO20004497D0; IL138281A0; CA2322508A1; AU747644B2; KR20010082521A; US6180371B1; EP1062224A1; EP1062224A4; HUP0101317A2; CZ300959B6; IL138281A; HUP0101317A3; CN1224627C; NO20004497L; KR100490612B1

Description

Oblast techniky 'Předkládaný vynález se týká hybridního faktoru VIII, který má aminokyselinovou sekvenci lidského a zvířecího faktoru VIII, nebo má lidskou aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII a sekvenci jinou než sekvenci faktoru VIII, a také se týká způsobu přípravy a použití tohoto faktoru.

Dosavadní stav techniky

Koagulace (srážení) krve začíná tím, že se destičky přichycují na řez ve stěně poraněné krevní cévy v místě poškození. Pak jsou v kaskádě enzymaticky regulovaných reakcí rozpustné molekuly fibrinogenu přeměněny působením enzymu trombinu na nerozpustné řetězce fibrinu, které drží destičky pohromadě ve sraženině. V každém kroku této kaskády je proteinový prekurzor přeměněn na proteázu, která štěpí následující proteinový prekurzor v řadě. Ve většině kroků jsou nutné kofaktory.

Faktor VIII cirkuluje jako inaktivní prekurzor v krvi, vázaný těsně a nekovalentnim způsobem na von Willebrandův faktor. Faktor VIII je proteolytickv aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru a aktivuje jeho prokoagulačni funkce v kaskádě. Ve své aktivní formě je proteinový faktor Vlila kofaktorem, který zvyšuje katalytickou účinnost faktoru IXa pro aktivaci faktoru X až o několik řádů.

Lidé s nedostatkem faktoru VIII nebo s protilátkami proti faktoru VIII, kteří nejsou léčení faktorem VIII, trpí nekontrolovatelným vnitřním krvácením, které způsobuje celou řadu vážných symptomů od zánětlivých reakcí v kloubech až po předčasná úmrtí. Lidé trpící silnou hemofilií (hemofilici), kterých je v USA asi 10 000, mohou být léčeni infuzemi lidského faktoru VIII, který obnoví normální koagulační schopnost krve, pokud je podáván v dostatečném množství a frekvenci. Klasická definice faktoru VIII je skutečně taková, že je to látka přítomná v normální krevní plazmě, která opraví defekty srážlivosti v plazmě pocházející z jedinců trpících hemofilií A.

Rozvoj protilátek 'inhibičních protilátek' neboli inhibitorů), které inhibují aktivitu faktoru VIII, je vážnou komplikací při léčení pacientů trpících hemofilií. Autoprotilátky se vyvíjejí asi u 20 % pacientů s hemofilií A jako reakce na terapeutické infúze faktoru VIII. U dříve neléčených pacientů s hemofilií A, kteří tvoří inhibitory, se inhibitor vyvine přibližně za jeden rok léčení. Navíc autoprotilátky, které příležitostně vyvíjejí hladinou faktoru VIII inaktivují faktor VIII, se i u jedinců s předtím normální Když je titr inhibitoru dostatečně nízký, lze zvládat potíže zvyšujícími se dávkami faktoru VIII. Avšak často je titr inhibitoru tak vysoký, že ho nelze ···· · » · · · · · • · 9. · ·· «· ·· · * překonat dávkami faktoru VIII. Alternativní- strategií je obejít potřebu faktoru VIII v průběhu normální hemostázy užitím komplexních přípravků faktoru IX (např. KONYNE®, Proplex®) nebo rekombinantním lidským faktorem Vlila. Navíc jelikož prasečí faktor VIII má obvykle podstatně nižší reaktivitu s inhibitory než lidský faktor VIII, užívá se přípravek obsahující částečně purifikovaný prasečí faktor VIII ((HYATEC®). Mnoho pacientů, u kterých se vyvinuly inhibični protilátky k lidskému faktoru VIII, bylo úspěšně léčeno prasečím faktorem VIII, a tolerovalo tuto léčbu po dlouhý čas. Avšak podávání prasečího faktoru VIII není úplné řešení, neboť i na prasečí faktor VIII se po jedné nebo několika infuzích mohou vyvinout inhibitory.

Několik přípravků faktoru VIII získaného z plazmy různé čistoty je komerčně dostupných pro léčení hemofilie A. Patří k nim částečně purifikovaný faktor VIII získaný z plazmy sloučené z několika dárců, která je ošetřena tepelně a také detergentem proti virům, ale obsahuje značné množství antigenních proteinů, faktor · VIII purifikovaný pomocí monoklonálních protilátek, který obsahuje nízkou hladinu antigenních nečistot a virových kontaminací., a nakonec rekombinantní lidský faktor VIII, který je nyní klinicky zkoušen. Naneštěstí je lidský faktor VIII za fyziologických koncentrací a pH nestabilní, je přítomen v krvi v mimořádně nízké koncentraci (0,2 gg/ml plazmy) a má velmi nízkou specifickou koagulační aktivitu.

Hemofilici vyžadují denní náhradu faktoru VIII, aby se zabránilo krvácení a výsledné deformující artropatii hemofiliků. Avšak dodávky jsou nedostatečné a objevují se problémy při terapeutickém použití v důsledku obtíží při izolaci a purifikaci, imunigenicity, a také nutnosti odstranit riziko infekce AIDS a hepatitidy. Avšak ani použití rekombinantního lidského faktoru VIII nebo částečně purifikovaného prasečího faktoru VIII neřeší zcela tyto problémy.

Problémy spojené s všeobecně užívanými komerčně dostupnými přípravky faktoru VIII získanými z plazmy stimulovaly významný zájem na vývoji lepšího přípravku faktoru VIII. Existuje potřeba účinnější molekuly faktoru VIII, tak aby jedna molekula poskytla více koagulační aktivity, aby přitom tato molekula faktoru VIII byla stabilní při vybraném rozsahu pH a fyziologických koncentracích, aby dále měla sníženou schopnost indukovat tvorbu inhibičních protilátek a ještě navíc, aby tato molekula faktoru VIII unikla rozpoznání imunitním systémem pacienta, který již vyvinul protilátky proti lidskému faktoru VIII.

Předkládaný vynález proto poskytuje faktor VIII, který napravuje hemofilii u pacientů s deficitem faktoru VIII nebo s inhibitory faktoru VIII.

Předkládaný vynález se dále týká léčení hemofilie.

Vynález také poskytuje faktor VIII, který je stabilní při vybraném pH a fyziologické koncentraci.

Předkládaný vynález poskytuje faktor VIII, který má vyšší koagulační aktivitu než lidský faktor VIII.

A dále vynález poskytuje faktor VIII, proti kterému se tvoří méně protilátek.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou purifikovanou hybridní molekulu faktoru VIII a její fragmenty s koagulační aktivitou, včetně hybridního faktoru VIII, který má aminokyšelínovou sekvenci faktoru VIII odvozenou z člověka a • · • · prasete nebo jiného savce odlišného od člověka (dále označovaného stručně jako zvíře). A také, ve druhém provedení vynálezu, včetně hybridního ekvivalentu faktoru VIII, který má aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII odvozenou z člověka nebo zvířete nebo obou a aminokyselinovou sekvenci, která nemá žádnou sekvenční identitu s faktorem VIII (aminokyselinová sekvence jiná než sekvence faktoru VIII), výhodně substituovanou v antigenním a/nebo imunogenním úseku faktoru VIII. Odborník sezná, že na základě předkládaného vynálezu je možno připravit četné konstrukty hybridního faktoru VIII, jako je např. (přičemž tento výčet není omezující) lidský/zvířecí faktor VIII s vyšší koagulační aktivitou než má lidský faktor VIII (vyšší koagulační aktivita), neimonogenní lidský/ekvivalentní faktor VIII, neantigenní lidský/ekvivalentní faktor VIII nebo lidský/zvířecí faktor VIII, neimunogenní lidský/zvířečí nebo lidský/ekvivalentní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu, neantigenní lidský/zvířečí nebo lidský/zvířecí/ekvivalentní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu, neantigenní neimunogenní lidský/ekvivalentní a/nebo lidský/zvířečí/ekvivalentní faktor VIII, a neantigenní neimunogenní lidský/zvířečí/ekvivalentní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu.

Molekula hybridního faktoru VIII je připravena izolací a rekombinací podjednotek nebo domén lidského a zvířecího faktoru VIII, nebo metodami genového inženýrství z genů lidského a zvířecího faktoru VIII.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou metody genového inženýrství užity k náhradě elementů lidského faktoru VIII příslušnými elementy zvířecího faktoru VIII, čímž vznikne hybridní molekula lidského/zvířecího faktoru VIII. V druhém výhodném provedení vynálezu jsou metody genového inženýrství užity k nahrazení jedné nebo několika aminokyselin v lidském nebo zvířecím faktoru VIII nebo v hybridním lidském/zvířecím faktoru VIII aminokyselinami, které nemají známou sekvenční identitu s faktorem VIII, výhodně sekvencí aminokyselin, která má menší imunoreaktivitu s přirozeně se vyskytujícími inhibičními protilátkami proti faktoru VIII (neantigenní aminokyselinové sekvence) a/nebo je méně náchylná k vyvolání tvorby protilátek proti faktoru VIII (neimunogenní aminokyselinová sekvence) než sekvence lidského faktoru VIII. Příkladem aminokyselinové sekvence, která může být užita k nahrazení imunogenní nebo antigenní sekvence je sekvence alaninových zbytků.

Alternativně, jedna nebo několik domén nebo částečných domén faktoru VIII jsou izolovány a purifikovány z lidské nebo zvířecí plazmy a hybridní lidský/zvířecí faktor VIII se připraví smícháním domén nebo částečných domén z jednoho druhu s doménami nebo částečnými doménami druhého druhu. Hybridní molekuly se pak izolují iontovou výměnnou chromatografií.

Vynález popisuje způsoby přípravy vysoce purifikovaného faktoru VIII, které obsahují následující kroky:

a) izolace podjednotek lidského faktoru VIII získaného z plazmy a izolace podjednotek zvířecího faktoru VIII získaného z plazmy, po které koagulační aktivity smícháním podjednotek, a dále následuje lidského/zvířecího faktoru VIII hromatografií,

b) izolace domén nebo částečných domén lidského faktoru VIII získaného z plazmy a domén nebo částečných domén zvířecího faktoru VIII získaného z plazmy, po které následuje rekonstituce koagulační aktivity smícháním lidských.

následuj e lidských a 5 izolace iontovou rekonstituce zvířecích hybridního výměnnou • · • · a zvířecích domén, a dále následuje izolace hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII iontovou výměnnou hromatografií,

c) konstrukce domén nebo částečných domén zvířecího faktoru VIII technologií rekombinantní DNA a rekombinantní výměna domén zvířecího a lidského faktoru VIII, aby vznikla hybridní molekula lidského/zvířecího faktoru VIII s koagulační aktivitou,

a) vytvoření hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII nahrazením specifických aminokyselinových zbytků faktoru VIII jednoho druhu odpovídajícími jedinečnými aminokyselinovým zbytky faktoru VIII druhého druhu, nebo

e) vytvoření hybridního ekvivalentu molekuly faktoru VIII mající lidskou nebo zvířecí aminokyselinovou sekvenci nebo obě, kde specifické aminokyselinové zbytky faktoru VIII jsou nahrazeny aminokyselinovými zbytky, které nemají žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII, metodou místně cílené mutageneze.

Stanovení celé DNA sekvence kódující prasečí faktor

VIII, která je zde uvedena, poprvé umožnilo syntézu prasečího faktoru VIII plné délky expresí DNA kódující prasečí faktor VIII ve vhodné hostitelské buňce. Purifikovaný rekombinantní prasečí faktor VIII je proto jedním aspektem předkládaného vynálezu. DNA kódující každou z domén prasečího faktoru VIII stejně tak jako každý její specifický fragment mohou být podobně exprimovány, buďto samostatně nebo v kombinaci s DNA kódující lidský faktor VIII, čímž se vytvoří hybridní lidský/zvířecí faktor VIII popsaný v předkládaném vynálezu. Kromě toho prasečí faktor VIII (fVIII) mající deletovanou (odstraněnou) celou nebo část B-domény (prasečí fVIII bez B domény) je dostupný jako další aspekt předkládaného

vynálezu, a sice užitím exprese DNA kódující prasečí fVIII, která má deleci jednoho nebo několika kodonů v B-doméně.

Některá provedení hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII podle předkládaného vynález mají specifickou aktivitu vyšší než prasečí faktor VIII. Některá provedení hybridního nebo hybridního ' ekvivalentního faktoru VIII mají stejnou nebo nižší imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami proti faktoru VIII a/nebo menší imunogenicitu pro člověka nebo zvíře, ve srovnání s lidskými nebo prasečím faktorem VIII.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek pro léčení pacientů trpících deficiencí faktoru VIII, který obsahuje hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII.

Popis obrázků

Obrázky 1A až 1H společně poskytují porovnání sekvencí nukleových kyselin lidského, prasečího a myšího faktoru VIII.

Podrobný popis vynálezu

Pokud není výslovně uvedeno jinak, termín „faktor VIII v předkládané přihlášce označuje jakoukoliv funkční proteinovou molekulu faktoru VIII z jakéhokoliv zvířete, jakýkoliv hybridní faktor VIII nebo modifikovaný faktor VIII, termíny „hybridní faktor VIII nebo „hybridní protein označují jakoukoliv funkční proteinovou molekulu faktoru VIII nebo její fragment obsahující aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII člověka, prasete a/nebo jiného druhu savce kromě člověka nebo prasete. K takovým kombinacím patří (přičemž tento výčet není omezující) jakýkoliv z -hybridních molekul • · • · faktorů VIII nebo jejich fragmentů: 1) lidská/prasečí,

2)lidská/savčí kromě lidské a prasečí, jako např. lidská/myší, 3) prasečí/ savčí kromě lidské a prasečí, jako např. myší/psí. K takovým kombinacím patří také např. hybridní ekvivalentní molekuly faktoru VIII nebo jejich fragmenty, jak budou definovány dále, obsahující aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII hybridního, lidského, prasečího, savčího jiného než lidského, savčího jiného než prasečího původu, kde byla provedena substituce sekvencí, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII. K takovým hybridním kombinacím patří také aminokyselinová sekvence faktoru VIII odvozená z více než dvou druhů, jako je např. lidská/prasečí/myší, nebo ze dvou a více druhů, kde byla provedena substituce sekvencí, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII. Pokud není výslovně uvedeno jinak, termín „hybridní faktor VIII zahrnuje i fragmenty hybridního faktoru VIII, které mohou být užity, jak bude popsáno dále v jednom provedení vynálezu, jako sondy pro výzkumné účely nebo jako diagnostická činidla.

Termín „savčí faktor VIII v tomto popisu zahrnuje faktor VIII z kteréhokoliv s aminokyselinovou sekvencí odvozenou savce kromě člověka. Termín „zvíře zde označuje prase a jakéhokoliv jiného savce kromě člověka.

Termín „fúzní protein nebo „fúzní faktor VIII nebo jeho fragment označují produkt hybridního genu, kde je kódující sekvence pro jeden protein extenzivně změněna, např. fúzí její části s kódující sekvencí druhého proteinu z jiného genu, aby vznikl hybridní gen, který kóduje fúzní protein. Fůzní protein je tedy v tomto popisupodsoubor celého souboru hybridních proteinů faktoru VIII zde popisovaných.

„Odpovídající sekvence aminokyselinová sekvence nebo nukleové kyseliny, nebo obě, je sekvence přítomná v místě molekuly faktoru VIII nebo hybridního faktoru VIII nebo jeho fragmentu, které má stejnou strukturu a/nebo funkci jako místo molekuly faktoru VIII jiného druhu, ačkoliv počet nukleotidů nebo aminokyselin nemusí být nutně identický. Sekvence „odpovídající jiné sekvenci faktoru VIII v podstatě odpovídá takové sekvenci, a hybridizuje za stringentních podmínek s takovou sekvencí, která je uvedena v tomto popisu vynálezu. Sekvence „odpovídající jiné sekvenci faktoru VIII zahrnuje také sekvenci, která vede k expresi faktoru VIII nebo hybridního prokoagulačního faktoru podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragmentu a hvbridizovala by se sekvencí podle vynálezu nebýt redundance v genetickém kódu.

„Jedinečná aminokyselina nebo aminokyselinový zbytek nebo aminokyselinová sekvence znamená aminokyselinovou sekvenci nebo zbytek v molekula faktoru VIII jednoho druhu, která je odlišná od nomoiogního zbytku nebo sekvence v molekule faktoru VIII jiného druhu.

„Specifická aktivita označuje aktivitu, která napraví koagulační defekt v plazmě s nedostatkem lidského faktoru VIII. Specifická aktivita je měřena v jednotkách srážlivosti krve na miligram celkového proteinu faktoru VIII ve standardním testu, kde se koagulační čas lidské plazma deficitní na faktor VIII srovnává s koagulačním časem normální lidské plazmy. Jedna jednotka aktivity faktoru VIII je aktivita přítomná v jednom mililitru normální lidské plazmy. V testu čím je kratší čas vytvoření sraženiny tím větší je aktivita faktoru VIII, který je testován. Hybridní lidský/prasečí faktor VIII projevuje koagulační aktivitu v testu na lidský faktor VIII. Tato aktivita, stejně jako aktivita ostatních molekul hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů, je menší, shodná nebo i větší než aktivita faktoru VIII získaného z plazmy nebo rekombinantního faktoru VIII.

Nukleotidová sekvence cDNA lidského faktoru VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id.

a sekvence id. č. 2. Faktor VIII je syntetizován jako jednořetězcový protein přibližné velikosti 300 kDa s vnitřní sekvenční homologií, která definuje sekvenci „domény NH;-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. V ' molekule faktoru VIII termín „doména označuje souvislou sekvenci aminokyselin, která je definována vnitřní aminokyselinovou identitou a místy proteolytického štěpení trombinem. Pokud není uvedeno jinak, domény faktoru VIII zahrnují následující aminokyselinové zbytky, když je sekvence přiřazena aminokyselinové sekvenci lidského faktoru VIII (sekvence id. č. 2): Al, zbytky Alal-Arg372, A2, zbtkv Ser373-Arg740, B, zbytky Ser74i-Argl648, A3, zbytky Seri690-Iie2032, Ci, zbytky Arg2033-Asn2172, C2, zbytky Ser2173-Tyr2332. Sekvence A3-C1-C2 zahrnuje zbytky Serl690-Tyr2332. Zbývající sekvence, zbytky Glul649-Argl689, je označována obvykle jako lehký řetězec aktivačního peptidu faktoru VIII. Faktor VIII je proteolyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru a vytváří faktor Vlila, který má prokoagulační funkci. Biologická funkce faktoru Vlila je zvyšovat katalytickou účinnost faktoru IXa pro aktivaci faktoru X o několik řádů. Trombinem ukřivovaný faktor Vlila je heterotrimer A1/A2/A3-C1-C2 velikosti 160 kDa, který tvoří komplex s faktorem IXa a faktorem X na povrchu destiček nebo monocytů. Termín „částečná doména označuje v popisu předkládaného vynálezu souvislou sekvenci aminokyselin tvořící část domény.

Podjednotky lidského a zvířecího faktoru VIII jsou těžké a lehké řetězce proteinu. Těžký řetězec proteinu • · • · • · obsahuje tři domény, Al, A2 a B. Lehký řetězec faktoru VIII obsahuje také tři domény, a sice A3, Cl a C2.

Hybridní faktor VIII nebe jeho fragment může být připraven:

1) nahrazením lidských nebo zvířecích podjednotek (těžké i lehké řetězce) odpovídajícími zvířecími nebu lidskými podjednotkami izolovaných z plazmy,

2) nahrazením lidských nebo zvířecích domén (Al·, A2, A3, B, Cl, C2) odpovídajícími zvířecími nebo lidskými doménami,

Hybridní ekvivalentní jakékoliv faktory

3) nahrazením částí lidských nebo zvířecích domén částmi zvířecích nebo lidských domén,

4) nahrazením odpovídajících lidských nebo zvířecích aminokyselin alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jednu nebo několik jedinečných zvířecích nebo lidských aminokyselin, nebo

5) nahrazením alespoň jedné sekvence zahrnující jednu nebo několik specifických aminokyselin v lidském, zvířecím nebo hybridním faktoru VIII nebo jeho fragmentu aminokyselinovou sekvencí, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII.

faktor VIII bez B-domény, hybridní faktor VIII nebo jejich fragmenty jsou VIII popisované v této přihlášce postrádající B-doménu nebo jejich fragmenty.

Termíny epitop, antigenní místo a antigenní determinanta jsou užívány v tomto popisu jako synonyma a definují úsek lidského, zvířecího, hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII nebo jeho fragmentu, který je specificky rozpoznáván protilátkou. Obsahuje jakýkoliv počet aminokyselin a je závislý na primární, sekundární i terciární struktuře proteinu. Ve smyslu předkládaného vynálezu, hybridní faktor VIII, ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jejich fragmenty, které obsahují alespoň jeden epitop, mohou být užity jako diagnostická činidla v testech, které budou popsány dále. V některých provedeních předkládaného vynálezu není hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jejich fragment křížově reaktivní nebo je méně křížově reaktivní s přirozeně se vyskytujícími protilátkami inhibujícími faktor VIII ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII.

Termín imunogenní místo je definován jako úsek lidského nebo zvířecího faktoru VIII, hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentu, které specificky vyvolá tvorbu protilátek proti lidskému nebo zvířecímu faktoru VIII, hybridnímu nebo ekvivalentnímu hybridnímu faktoru VIII nebo jejich fragmentu u člověka nebo zvířete, jak se dá zjistit rutinním testem, jako je např. radioimunostest, ELISA nebo test Bethesda popsaný v předkládaném vynálezu. Obsahuje jakýkoliv počet aminokyselin a je závislý na primární, sekundární i terciární struktuře proteinu. V některých provedeních předkládaného vynálezu není hybridní nebo ekvivalentní hybridní, faktor VIII nebo jejich fragment imunogenní nebo je méně imunogenní pro člověka nebo zvíře ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII.

Termíny molekula hybridního faktoru VIII nebo její fragment nebo hybridní faktor VIII nebo jeho fragment a ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment označují aktivní faktor VIII nebo molekulu hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmenty, kde alespoň jedna sekvence obsahující jeden nebo několik specifických aminokyselinových zbytků lidského nebo zvířecího faktoru VIII nebo jejich fragmentu byla nahrazena alespoň jednou sekvenci obsahující jeden nebo několik aminokyselinových zbytků, která nemá • · • · • · žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí lidského nebo zvířecího faktoru VIII. Sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí lidského nebo zvířecího faktoru VIII je označována také jak aminokyselinová sekvence odlišná od faktoru VIII. Ve výhodném provedení je aminokyselinová sekvence, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII, sekvence alaninových zbytků. V jiném výhodném provedení vynálezu specifická sekvence faktoru VIII, která je nahrazena sekvencí bez známé sekvenční identity s faktorem VIII, obsahuje antigenní místo, které je imunoreaktivní s přirozeně se vyskytujícími inhibičními protilátkami proti faktoru VIII, takže výsledná ekvivalentní hybridní molekula faktoru VIII nebo její fragment jsou méně imunoreaktivní nebo vůbec nereagují s inhibičními protilátkami proti faktoru VIII. Ještě v dalším výhodném provedení specifická sekvence faktoru VIII, která je nahrazena sekvencí bez známé sekvenční identity s faktorem VIII, obsahuje imunogenní místo, které vyvolává tvorbu inhibičních protilátek proti faktoru VIII u člověka nebo zvířete, takže výsledná molekula ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo její fragment jsou méně imunogenní.

Deficience faktoru VIII nebo nedostatek faktoru VIII označují nedostatečnou srážlivost způsobenou tvorbou defektního faktoru VIII, nedostatečnou či nulovou tvorbou faktoru VIII nebo částečnou či úplnou inhibici faktoru VIII inhibičními faktory. Hemofilie A je typ deficience faktoru VIII, který je důsledkem poruchy X-vázaného genu a nepřítomnosti nebo nedostatku proteinu faktoru VIII, který je tímto genem kódován.

Diagnostický test označuje testy, které nějakým způsobem využívají interakce antigen-protilátka p-ro detekci • · • · k detekci a kvantifikaci Je to právě užiti těchto a/nebo kvantifikaci množství konkrétní protilátky, která je přítomna v testovaném vzorku jako pomocný prostředek k výběru vhodné terapie. DNA hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo její fragment, nebo příslužný protein z ní exprimovaný mohou být použity k nahrazení odpovídájicích reakčních činidel v dosud známých testech, přičemž modifikovaný test se užije protilátek proto faktoru VIII.

činidel, a sice DNA hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII'nebo jejího fragmentu, nebo příslužného proteinu z ní exprimovaného, které dovolují modifikovat dosud známé testy pro detekci protilátek proti lidskému nebo zvířecímu faktoru VIII nebo hybridnímu lidskému/zvířecímu faktoru VIII. K takovým testům patří, aniž by výčet byl limitující, ELISA test, imunodifúzní test a imunopřenos (imunobiot). Metody vhodné k provádění těchto testů jsou odborníkům dostatečně známy. Hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment, který obsahuje alespoň jeden epitop proteinu, může být užit jako diagnostické činidlo. Příklady testů, kde se užívá hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment jsou test Bethesda a antokoagulační test.

Obecný popis použitých postupů

Patentová přihláška USA č. 07/864004 popisuje novou molekulu hybridního lidského/prasečího faktoru VIII s koagulační aktivitou, ve které byly určité prvky molekuly lidského nebo zvířecího faktoru VIII nahrazeny odpovídajícími prvky molekuly faktoru VIII jiného druhu. Patentové přihlášky US 08/212133 a PCT/US94/13200 popisují prokoagulační hybridní lidský/zvířecí ekvivalentní faktor VIII, kde byly určité prvky molekuly faktoru VIII jednoho druhu nahrazeny odpovídajícími prvky molekuly faktoru VIII jiného druhu.

Předkládaný vynález poskytuje molekuly hybridního lidského/zvířecího, zvířecího/zvířecíno a ekvivalentního faktoru VIII a jejich fragmenty, a dále nukleovou kyselinu kódující takové hybridní molekuly, z nichž některé mají větší koagulační aktivitu ve standardních koagulačních testech než vysoce purifikovaný lidský faktor VIII a/nebo jsou méně imunoreaktivní s inhibičními protilátkami proti lidskému nebo prasečímu faktoru VIII než lidský nebo prasečí faktor VIII a/nebo jsou méně imunogenní pro člověka nebo zvíře než lidský nebo prasečí faktor VIII. Tyto hybridní molekuly faktoru VIII lze zkonstruovat užitím následujících postupů.

Předkládaný vynález popisuje přinejmenším pět typů aktivních molekul hybridního lidského/prasečího nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmenty a sekvence nukleové kyseliny, které kódují tyto hybridní faktory VIII a také způsoby jejich přípravy:

1) nahrazením lidských nebo prasečích podjednotek (těžké i lehké řetězce) odpovídajícími prasečími nebo lidskými podj ednotkami,

2) nahrazením jedné nebo několika lidských nebo prasečích domén (Al, A2, A3, B, Cl, C2) odpovídajícími prasečími nebo lidskými doménami,

3) nahrazením souvislé části jedné nebo několika lidských nebo prasečích domén odpovídajícími částmi prasečích nebo lidských domén,

4) nahrazením odpovídajících lidských nebo prasečích sekvencí alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jeden nebo několik jedinečných aminokyselinových zbytků lidského, nebo prasečího faktoru VIII, nebo • · • ·

5) nahrazením alespoň jedné specifické sekvence obsahujících jednu nebo několik aminokyselin v lidském, prasečím nebo hybridním lidském/prasečím faktoru VIII alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo několik aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII (tj . aminokyselinovou sekvencí odlišnou od sekvence faktoru VIII).

Stejnými postupy lze připravit přinejmenším pět typů aktivních molekul hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmenty a sekvence nukleové kyseliny, které kódují tyto hybridní faktory'VIII a také způsoby jejich přípravy:

1) nahrazením lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích podjednotek (těžké i lehké řetězce) odpovídajícími savčími jinými než lidskými a prasečími nebo lidskými podjednotkami,

2) nahrazením jedné nebo několika lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích domén (Al, A2, A3, B, Cl, C2) odpovídajícími prasečími nebo lidskými doménami,

3) nahrazením souvislé části jedné nebo několika lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích domén odpovídajícími částmi savčích jiných než lidských a prasečích nebo lidských domén,

4) nahrazením odpovídájicích lidských nebo savčích jiných než lidských a prasečích sekvencí alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jeden nebo několik jedinečných aminokyselinových zbytků lidského nebo savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII, nebo

5) nahrazením alespoň jedné specifické sekvence obsahující jednu nebo několik aminokyselin v lidském, savčím jiném než lidském a prasečím nebo hybridním lidském/savčím jiném ···· · · · · ···· • · ·« ···· ···· • · · · · · · ···· než lidském faktoru VIII alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo několik aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII (tj. aminokyselinovou sekvencí odlišnou od sekvence faktoru VIII) .

Dále je odborníkovi ihned zřejmé, že stejné postupy lze užít k přípravě alespoň pěti typů aktivních molekul hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů, které odpovídají typům uvedeným v bodech 1 až 5 ve dvou předcházejících odstavcích, kdy hybridní faktor VIII obsahuje aminokyselinové sekvence faktoru VIII ze dvou nebo více savců vyjma člověka, např. hybridní prasečí/myší faktor VIII, a déle obsahuje aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence faktoru VIII.

Hybridní lidské/zvířečí, zvířecí/zvířecí a ekvivalentní molekuly faktoru VIII nebo jejich fragmenty uvedené pod body 1 až 3 se připravují izolací podjednotek, domén nebo souvislých částí domén z faktoru VIII získaného z plazmy, po které následuje rekonstituce a purifikace. Hybridní lidské/zvířecí, zvířecí/zvířecí a ekvivalentní molekuly faktoru VIII nebo jejich fragmenty uvedené pod body 3 až 5 se připravují technikami rekombinantní DNA (tj. genového inženýrství). Hybridní molekuly mohou obsahovat menší či větší procento lidské sekvence ve srovnání se zvířecí sekvencí, v závislosti na původu jednotlivých úseků, jak bude popsáno ještě podrobněji dále.

Jelikož současné údaje ukazují, že B doména nemá žádný inhibiční epitop a nemá žádný známý vliv na funkci faktoru VIII, v některých provedeních předkládaného vynálezu je B doména odstraněna z aktivního hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jeho fragmentu • · · · 0 * · ·< • •9 · · · · 00 ·0 (faktor VIII je pak označován jako B(-)faktor VIII) připraveného způsoby podle vynálezu.

V příkladu 4 je ukázáno, že hybridní lidský/prasečí faktor VIII obsahující prasečí těžký řetězec a lidský lehký řetězec, který odpovídá prvnímu typu hybridů uvedených výše, má větší specifickou koagulační aktivitu ve standardním koagulačním testu než lidský faktor VII lidský/zvířecí nebo ekvivalentní faktor VIII, vyšší, stejnou nebo nižší aktivitu než lidský faktor VIII, je užitečný pro léčení pacientů s tvorbou inhibitorů, neboť tyto inhibitory reagují méně s hybridním nebo ekvivalentním faktorem VIII než s původním lidským nebo prasečím faktorem VIII.

Hybridní ať již má

Příprava molekuly hybridního faktoru VIII rekonstitucí izolovaných podjednotek lidského a zvířecího faktoru VIII

Předkládaný vynález poskytuje molekuly hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII nebo jejich fragmenty, sekvence nukleových kyselin kódující tyto hybridní molekuly a způsoby jejich přípravy a izolace a dále metody pro charakterizaci jejich koagulační aktivity. Jedna z metod, která je modifikovaným postupem publikovaným Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 265: 6197, 1990 a Lollar, J.S. et al. , J. Biol. Chem. 263: 10451, 1988, obsahuje izolaci podjednotek (tj. těžký řetězec a lehký řetězec) lidského a zvířecího faktoru VIII, po které následuje rekombinace lidského těžkého řetězce a zvířecího lehkého řetězce nebo lidského lehkého řetězce a zvířecího těžkého řetězce.

Izolace jak lidských tak i zvířecích jednotlivých podjednotek zahrnuje disociaci dimeru těžký řetězec/lehký řetězec. To lze provést např. chelatací vápníku pomocí • Λ • *

kyseliny etylendiamnitetraoctové (EDTA) následované moncS™

Hybridní molekuly pak rekonstituují

HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) lidského/zvířecího faktoru VIII se z izolovaných podjednotek v přítomnosti vápníku. Hybridní faktory VIII lidský lehký řetězec/zvířečí těžký řetězec nebo zvířecí těžký řetězec/lidský lehký řetězec jsou izolovány od nezreagovaných těžkých řetězců pomocí postupu monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) pro izolaci prasečího faktoru VIII, jak byl popsán v Lollar, J.S. et al., Blood 71: 137143, 1988.

Tyto metody, které byly použity v jednom provedení předkládaného vynálezu k přípravě aktivního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII (což je popsáno v následujících příkladech) poskytly aktivní hybridní molekulu faktoru VIII lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec, která vykazovala více než šestkrát vyšší prokoagulační aktivitu než lidský faktor VIII.

Jiné hybridní molekuly faktoru VIII, např. lidské/ savčí jiné než lidské a prasečí, lze připravit, izolovat a charakterizovat stejným způsobem. Dále je odborníkovi ihned zřejmé, že stejné postupy lze užít k přípravě, izolaci a charakterizaci aktivity hybridního zvířecího/zvířecího faktoru VIII, jako je např. hybridní prasečí/myší faktor VIII, který obsahuje lehký řetězec nebo těžký řetězec jednoho biologického druhu kombinovaný s těžkým řetězcem nebo lehkým řetězcem jiného druhu.

Příprava molekuly hybridního faktoru VIII rekonstitucí izolovaných domén lidského a zvířecího faktoru VIII

Předkládaný vynález poskytuje molekuly hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII se substitucemi domén nebo • · · * • · · · · · · · • · · * · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · jejich fragmenty, sekvence nukleových kyselin kódující tyto hybridní molekuly a způsoby jejich přípravy a izolace a dále metody pro charakterizaci jejich koagulační aktivity. Jedna z metod obsahuje izolaci jedné nebo několika domén lidského a jedné nebo několika domén zvířecího faktoru VIII, po které následuje rekombinace lidských a zvířecích domén, takže vznikne hybridní lidský/zvířecí faktor VIII s koagulační aktivitou, jak to popsali Lollar, P. et al., J. Biol. Chem. 267(33): 23652-23657 (25. listopadu 1992) pro hybridní lidský/prasečí faktor VIII.

Předkládaný vynález specificky poskytuje hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde lidská doména A2 je nahrazena prasečí doménou A2, což ilustruje příklad, jak se může konstruovat doménově substituovaný hybridní lidský/savčí jiný než lidský a prasečí faktor VIII. Savčí, jiné než lidské a prasečí dimery a lidské dimery A1/A3-C1-C2 získané z plazmy jsou izolovány disociací domény A2 z faktoru Vlila. To se provádí např. v přítomnosti NaOH a poté zředěním směsi a elucí dimerů pomocí monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) . Doména A2 je izolována od faktoru Vlila jako menšinová složka v monoS™ HPLC. Hybridní molekuly lidského/zvířecího faktoru VIII jsou pak rekonstituovány smícháním stejného objemu domény A2 jednoho biologického druhu a dimerů A1/A3C1-C2 jiného druhu.

Hybridní lidské/zvířecí faktory VIII nebo jejich frty jsou izolovány ze směsi nezreagovaných dimerů a domén A2 pomocí postupu monoS™ HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) pro izolaci prasečího faktoru VIII, jak byl popsán v Lollar, J.S. et al·., Blood 71: 137-143, 1988. Rutinní postupy lze také užít k izolaci domén Al, A3, Cl, C2 a B faktoru VIII jednoho biologického druhu, z nichž pak jedna nebo několik mohou nahradit odpovídající doménu faktoru VIII jiného druhu.

• 4»

Odborníkovi je ihned zřejmé, že stejné postupy lze užít k přípravě, izolaci a charakterizaci aktivity hybridního zvířecího/zvířecího faktoru VIII, jako je např. hybridní prasečí/myší faktor VIII.

Tyto postupy, popsané ještě podrobněji v následujících příkladech, poskytly molekuly hybridního faktoru VIII s prokoagulační aktivitou.

Příprava molekul hybridního faktoru VIII metodami genové inženýrství rekombinací sekvencí kódujících podjednotky, domény nebo části domén lidského, zvířecího a hybridního faktoru VIII

Nahrazování podjednotek, domén nebo souvislých částí domén

Předkládaný vynález poskytuje aktivní rekombinantní hybridní lidský/zvířecí a hybridní ekvivalentní faktor VIII a jeho fragmenty, kde byly nahrazeny podjednotky, domény nebo aminokyseliny, sekvence nukleových kyselin kódujících tyto hybridní molekuly, způsoby jejich přípravy a izolace a dále způsoby charakterizace jejich koagulačních, imunoreaktivních a imunogenních vlastností.

Lidský gen faktoru VIII byl izolován a exprimován v savčích buňkách, jak popsali Toole, J.J. et al., Nátuře

312	: 3 42	-347, 1984 (Genetics	Institute), 1984, Gitschier, J.
et	al.,	Nátuře	312:326-330,	1984	(genetech), Wood, W.I.
et	al.,	Nátuře	312: 330-337,	1984	(Genetech), Vehar, G.A.
et	al. ,	Nátuře	312:337-342,	1984	(Genentech), a dále

v patentových přihláškách WO 87/04187, WO 88/08035, WO 88/03558 a v patentu USA č. 4 757 006, a na základě známé cDNA byla dedukována aminokyselinová sekvence. Patent USA č. 4 965 199 udělený Caponovi et al. popisuje rekombinantní • · · ·· ·· • * · ·· ·· ·· • * · · · v · • · · « · · * • ····· · « « • · · · · · metodu přípravy savčího faktoru VIII v savčích hostitelských buňkách a purifikaci lidského faktoru VIII. Byla popsána exprese lidského faktoru VIII v CHO buňkách (buňky ovarií čínského křečka) a BHKC (fetální ledvinné křeččí buňky). Lidský faktor VIII byl modifikován tak, že byla odstraněna celá nebo část B-domény (patent USA č.4 868 112) a byl učiněn pokus nahradit tuto doménu B faktoru VIII B doménou lidského faktoru V (patent USA č. 5 004 803) . Sekvence cDNA kódující lidský faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 1 a 2.

Prasečí faktor VIII byl izolován a purifikován z plazmy (Fass, D.N. et al., Blood 59: 594, 1982) . Částečná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII odpovídající úseku N-konce lehkého řetězce mající homologii s ceruloplazminem a koagulačním faktorem V a zcela' nesprávně umístěný byl popsán Church et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6934, 1984. Toole J.J. et al., Nátuře 312 popsal částečné sekvencování fragmentů aminokyselin z N-koncového úseku prasečího faktoru VIII, ale nijak necharakterizoval polohu těchto fragmentů v molekule faktoru VIII. aminokyselinová sekvence domén B a části domény A2 byly publikovány v Toole, J.J. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA-83: 5939-5942, 1986. cDNA kódující úplnou doménu A2 prasečího faktoru VIII a predikovaná. aminokyselinová sekvence a také hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde jsou substituovány všechny domény, všechny podjednotky a specifické sekvence aminokyselin byly popsány v přihlášce vynálezu USA č. 07/864 004 nazvané Hybridní lidský/prasečí faktor VIII podané 7. dubna 1992 původci John S. Lollar a Marshall S. Runge, na jejímž základě byl udělen 15. listopadu 1994 patent USA č. 5 364 771 a dále také

WO 93/20093. Sekvence cDNA kódující doménu A2 prasečího

342-347, 1984 ze čtyřech ·· «φ » · ·· » · · « • · « * · ·· ·· · · ·· ·· faktoru VIII mající sekvenční idnetitu se zbytky 373-740 zralého lidského faktoru VIII uvedeného jako sekvence id. č. 1, je zde uvedena jako sekvence id. č. ' 3 a predikovaná aminokyselinová sekvence jako sekvence id. č. 4. Nedávno byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 94/11503 nukleotidové a odpovídající aminokyselinové sekvence domén Al a A2 prasečího faktoru VIII a chimérický faktor VIII, kde prasečí Al a/nebo A2 doména nahrazuje odpovídající lidskou doménu.

Jak prasečí tak i lidský faktor VIII jsou izolovány z plazmy jako protein složený ze dvou podjednotek. Podjednotky, známé jako lehký a těžký řetězec, jsou navzájem spojeny nekovalentními vazbami, které vyžaduji přítomnost vápníku nebo jiného divalentního iontu kovu. Těžký řetězec faktoru VIII obsahuje tři domény Al, A2 a B, které jsou spojeny kovalentně. označované A3, Cl biologickou funkci

Lehký řetězec obsahuje také tři domény,

C2

B doména nemá žádnou a lze ji z molekuly odstranit buďto proteolyticky nebo metodami rekombinantní DNA, aniž by se měřitelně změnily vlastnosti faktoru VIII. Lidský rekombinantní faktor VIII má obdobnou strukturu a funkci jako lidský faktor VIII izolovaný z plazmy, i když není glykosylován, pokud není exprimován v savčích buňkách.

Lidský a prasečí aktivovaný faktor VIII (tj. faktor Vlila) mají tři podjednotky díky štěpení těžkého řetězce mezi doménami Al a A2. Tato struktura se označuje A1/A2/A3-C1-C2. Lidská faktor Vlila není stabilní v podmínkách, které stabilizují prasečí faktor Vlila, pravděpodobně díky slabší asociaci podjednotky A2 lidského faktoru Vlila. Disociace podjednotky A2 lidského i prasečího faktoru Vlila je spojena se ztrátou aktivity molekuly faktoru VIII.

Použitím sond pro dosud známé sekvence částí molekuly prasečího faktoru VIII je možné standardními postupy známou • ·

I « • · sekvencovat ty části prasečího faktoru VIII, které ještě nebyly sekvencovány. tyto standardní postupy jsou popsány např. v publikacích Weis, J.H., Construction of Recombinant DNA Libraries, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1991, a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, jejichž pomocí lze konstruovat hybridy plné délky.

Předkládaný vynález specificky poskytuje jako příklad výhodného provedení aktivní rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII se substituovanou doménou A2, sekvenci nukleové kyseliny kódující tento hybridní faktor VIII a způsoby jeho přípravy, izolace a charakterizace jeho aktivity. Postupy, kterými byly připraveny tyto hybridní molekuly lze užít také k přípravě rekombinantního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII nebo jeho fragmentů, který má nahrazeny podjednotky, souvislé části domén nebo domény jiné než A2. Odborníkovi je také zřejmé, že tyto postupy ukazují, jak je možné připravit i jiné další molekuly rekombinantního hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího nebo rekombinantního hybridního zvířecího/zvířecího faktoru VIII, kde jsou nahrazeny podjednotky, domény nebo souvislé části domén.

Rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII byl připraven z lidské cDNA (Biogen, lne.) a prasečí cDNA popsané v předkládaném vynálezu, které kódují relevantní sekvence faktoru VIII. Ve výhodném provedení vynálezu faktor VIII kóovaný cDNA obsahuje domény A1-A2-A3-C1-C2, postrádá celou doménu B a odpovídá tak aminokyselinovým zbytkům 1-740 a 1649-2332 jednořetězcového lidského faktoru VIII (viz sekvence id. č. 2) podle číslování dle Wood et al., Nátuře 312:330-337, 1984.

• · · ·

Jednotlivé podjednotky, domény nebo souvislé části domén lidského nebo prasečího faktoru VIII lze nahradit odpovídajícími prasečími nebo lidskými podjednotkami, doménami nebo souvislými částmi domén, které byly klonovány a byly k takové substituci použity pomocí odborníkovi známých technik mutageneze. Např. Lubin, I.M. et al. , J. Biol. Chem. 269(12):8639-8641, 1994 popisují metody substituce lidské domény A2 prasečí doménou s využitím vhodných restrikčních míst. Další metody pro substituci jakéhokoliv zvoleného úseku cDNA faktoru VIII jednoho biologického druhu úsekem cDNA faktoru VIII jiného druhu jsou např. metoda splicing by overlap extension (SOE), kterou popsali Horton et al., Meth. Enzymol. 217: 270-279, 1993.

cDNA kódující podjednotky, domény nebo části domén faktoru VIII nebo celé hybridní cDNA. byly klonovány do vektorů pro dočasnou expresi aktivní proteinové molekuly hybridního lidského/prasečího faktoru VIII v buněčných kulturách, a sice v oboru známými metodami, které jsou popsány např. v Selden, R.F., Introduction of DNA into mammalian cells, v A.usubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1991.

Ve výhodném provedení cDNA kódující hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde prasečí sekvence kóduje doménu nebo část domény, např. doménu A2 nebo její část, byla vložena do savčího expresního vektoru jako je např. ReNeo, a byl tak vytvořen konstrukt hybridního faktoru VIII. Předběžná charakterizace hybridního faktoru VIII byla provedena tak, že hybridní cDNA byla vložena do savčího expresního vektoru ReNeo a hybridní protein byl přechodně exprimován v buňkách COS-7. Pak bylo možno stanovit, zda je exprimován aktivní hybridní protein. Expresní vektorový konstrukt se pak dále užil k trvalé transfekci buněk <1 · • « • · • · • « v · · · v buněčné kultuře, např. buněk fetálních křečcích ledvin, a sice metodami v oboru známými, jako je např. liposomy zprostředkovaná transfekce (Lipofectin™, Life Technologies, lne.). Exprese proteinu rekombinantního hybridního faktoru VIII se ověří např. pomocí sekvencování, northernového a westernového přenosu (northern blot, western blot) nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Protein hybridního faktoru VIII se z kultivačního média, ve kterém se kultivují transfekované buňky trvale exprimující protein, precipituje, pak se peletuje, opláchne a resuspenduje ve vhodném pufru, a pak se rekombinantní hybridní faktor VIII purifikuje standardním způsobem, např. imunoafinitní chromatogrtafii pomocí např. Sepharose™ s monoklonální protilátkou anti-A2.

V dalším výhodném provedení je hybridní faktor VIII obsahující substituované podjednotky, domény nebo části domén, exprimován jako fúzní protein z rekombinantní molekuly, kde je na místo sousedící se sekvencí kódující faktor VIII vložena sekvence kódující protein, který např. zvyšuje stabilitu, sekreci nebo zlepšuje detekci, izolaci apod. Odborníkům jsou známé postupy pro použití homologních nebo heterologních sekvencí řídících expresi, jako jsou např. promotory, operátory a regulátory při přípravě fúzních proteinů a jsou v oboru rutinně využívány (viz např. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1991).

Purifikovaný hybridní faktor VIII nebo jeho fragment se testuje na imunoreaktivitu a koagulační aktivitu standardními testy, ke kterým patří např. test s plazmou bez faktoru VIII, jednostupňový koagulační test, nebo ELISA test s purifikovaným rekombinantním faktorem VIII jako standardem.

I jiné vektory, včetně plazmidů a eukaryotických virových vektorů, lze užít k expresi rekombinantních genových konstruktů v savčích buňkách v závislosti na požadavcích a úsudku odborníka (viz např. Sambrook et al., Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, kapitola 16)

Lze také užít pro expresi řada buněčnvch jiné expresní systémy, např. bakterie nebo hmyzí buňky, ale není to výhodné, neboť existují rozdíly v glykosylaci nebo ke glykosylaci vůbec nedochází.

Protein hybridního faktoru VIII může být exprimován v celé řadě buněk rutinně užívaných rekombinantních savčích proteinů. Zejména linií hlodavců je vhodná pro expresi velkých proteinů. K výhodným buňkám, které jsou dostupné v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville, MD) patří buňky fetálních křeččích ledvin a buňky ovarií čínského křečka (CHO), které lze kultivovat užitím rutinních postupů a kultivačních médií.

Stejné metody, které byly užity k přípravě hybridního lidského/prasečího faktoru VIII se substituovanou podjednotkou, doménou nebo aminokyselinovou sekvencí, lze užít také k přípravě dalších rekombinantních hybridních faktorů VIII nebo jejich fragmentů a sekvencí nukleových kyselin kódujících tyto hybridy, a sice např. hybridní lidský/savčí jiný než lidský a prasečí nebo zvířecí/zvířecí faktor VIII. Pomocí primerů ke známých sekvencím lidské DNA byla klonována celá myší cDNA a část prasečí cDNA faktoru VIII. Sekvence faktoru VIII dalších biologických druhů pro přípravu hybridního lidského/zvířecího nebo zvířecího/zvířecího faktoru VIII lze získat pomocí známých lidských a prasečích sekvencí jako výchozího materiálu. Jiným způsobem je využití amplifikace PCR s DNA ze zvířecí tkáně a použití cDNA knihovny ze zvířete ke klonování sekvence faktoru VIII.

Jako příklad výhodného provedení lze uvést následující přípravu proteinu hybridního lidského/myšího faktoru VIII.

β·. · · ·

DNA klony odpovídající myšímu homologů genu lidského faktoru VIII byly izolovány a sekvencovány a byla predikována aminokyselinová sekvence proteinu faktoru VIII, jak popsali Elder G. et al., Genomics 16(2):374-379,1993, přičemž v této publikaci bylo také provedeno srovnání predikované aminokyselinové sekvence myši a člověka a pouze části sekvence molekuly faktoru VIII prasete. Myší cDNA sekvence kódující faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 5 a 8. Ve výhodném provedení byla užita metoda amplifikace RNA se sekvencováním transkriptu (RAWTS), jak ji popsali Sarkar G. et al., Science 244: 331-334, 1989. Stručně shrnuto, jednotlivé kroky této metody jsou: 1) syntéza cDNA pomocí oligo(dT) primeru nebo oligonukleotidového primeru specifického k mRNA,

2) polymerázová řetězová reakce, PCR, kde jeden nebo oiigonukleotidové primery obsahují fágový promotor připojený k sekvenci komplementární k úseku, který má být amplifikován,

3) transkripce s fágovým promotorem a 4) sekvencování transkriptu pomocí dideoxynukleotidů zprostředkované reverzní transkriptázou, která žívá jako primer vnitřní (nested) oligonukleotid. Tato metoda, kromě toho, že poskytne informaci o sekvenci, vede také ke vzniku translačního produktu in vitro tím, že iniciační translační signál je inkorporován do vhodného PCR primeru. Metodu lze také užít k získání informací o sekvenci nové mRNA z jiných biologických druhů.

Substituce aminokyselin

Předkládaný vynález poskytuje aktivní hybridní molekuly lidského/zvířecího a zvířecího/zvířecího faktoru VIII nebo jejich fragmenty, kde aminokyselinová sekvence jednoho • · · biologického druhu je nahrazena alespoň jednou sekvencí obsahující jednu nebo několik jedinečných aminokyselin jiného druhu, sekvence nukleové kyseliny kódující tyto hybridní molekuly, způsoby jejich přípravy a izolace a dále způsoby pro charakterizace jejich koagulačních, imunogenních a imunoreaktivních vlastností.

Doména A2 je nutná pro prokoagulační aktivitu molekuly faktoru VIII. Studie ukázaly, že prasečí faktor VIII má šestkrát vyšší prokoagulační aktivitu než lidský faktor VIII (Lollar P. et al., J. Biol. Chem. 266: 12481-12486, 1991) a že rozdíl v koagulační aktivitě mezi lidským a prasečím faktorem VIII je způsoben rozdílnými aminokyselinovými sekvencemi jednoho nebo více zbytků v doméně A2 (Lollar P. et al., J. Biol. Chem. 267: 23652-23657, 1992) . Dále se má za to, že domény A2 a C2 a možná i třetí úsek lehkého řetězce v molekule lidského faktoru VIII nesou epitopy, se kterými reaguje většina, ne-li všechny, inhibující protilátky (Hoyer, Semin. Hematol. 31: 1-5, 1994).

Molekuly rekombinantního hybridního lidského/zvířecího, zvířecího/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII nebo jejich fragmenty lze připravit substitucí alespoň jedné specifické sekvence obsahující jednu nebo několik jedinečných aminokyselin z domén A2, C2 a/nebo jiných domén faktoru VIII jednoho biologického druhu odpovídajícími sekvencemi jiného druhu, přičemž aminokyselinové sekvence se mezi oběma biologickými druhy liší, jak bude ještě ukázáno podrobněji dále. Ve zde popsaném příkladu výhodném provedení poskytuje vynález aktivní rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII, kde prasečí sekvence je užita k nahrazení lidské sekvence -obsahující epitop, přičemž hybridní faktor VIII má sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami proti faktoru VIII. V dalším provedení je připravena aktivní hybridní molekula faktoru VIII, která obsahuje sekvence z více než jednoho biologického druhu, kterými byly nahrazeny původní sekvence třetího druhu. Lze také připravit rekombinantní hybridní molekuly lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru VIII, obsahující alespoň jednu sekvenci obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí faktoru VIII, jak je dále podrobněji popsáno.

Jakýkoliv hybridní faktor VIII obsahující specifickou aminokyselinovou substituci podle vynálezu může být testován standardními testy koagulační aktivity a reaktivity s inhibičními protilátkami faktoru VIII, aby se identifikovaly molekuly faktoru VIII se zvýšenou koagulační aktivitou a/nebo sníženou imunoreaktivitou. Mohou být identifikovány také hybridní molekuly, které mají sice nižší koagulační aktivitu než lidský nebo prasečí faktor VIII, ale mají také sníženou reaktivitu s protilátkami. Odborníkovi je zřejmé, že molekuly faktoru VIII nebo jejich fragmenty, které mají nižší, stejnou nebo větší koagulační aktivitu ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII, jsou užitečné k léčení pacientů s deficiencí faktoru VIII. Zde popsané metody přípravy aktivního hybridního rekombinantního lidského/prasečího faktoru VIII se substitucí specifických aktivního jiného než aminokyselin lze užít také k přípravě rekombinantního hybridního lidského/savčího lidského a prasečího, hybridního zvířecího-l/zvířecího-2 faktoru VIII nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů.

• · · • * · fc · · ·

Hybridní molekuly faktoru VIII se změněnou koagulační aktivitou

Předkládaný vynález poskytuje prokoagulační rekombinantní hybridní lidský/zvířečí, zvířecí/zvířecí nebo ekvivalentní faktor VIII nebo jeho fragment, kde odpovídající aminokyselinová sekvence jednoho biologického druhu je nahrazena alespoň jednou specifickou sekvencí obsahující jednu nebo více jedinečných aminokyselin majících prokoagulační aktivitu ve faktoru VIII jiného druhu, a sice připravený v oboru známými metodami místně cílené mutageneze, jak je zde popisováno. Specifické sekvence pro substituce byly vybrány a hybridní konstrukty byly připraveny a testovány na koagulační aktivitu následujícím způsobem. Jako specifický příklad výhodného provedení vynález poskytuje hybridní lidský/prasečí faktor VIII obsahující aminokyselinovou substituci v. doméně A2. Je zřejmé, že odborník může stejné metody využít k přípravě dalších hybridních molekul jako je hybridní lidský/zvířecí, zvířečí/zvířečí nebo hybridní faktor VIII nebo jeho fragment, které mají změněnou koagulační aktivitu, výhodně zvýšenou koagulační aktivitu, ve srovnání s lidským faktorem VIII.

Základem vyšší koagulační aktivity prasečího faktoru VIII je zřejmě rychlejší spontánní disociace podjednotky A2 lidského faktoru Vlila než u prasečího faktoru Vlila, která vede ke ztrátě aktivity podle Lollar, P.

Chem. 265: 1688-1692, 1990, Lollar, P.

Chem. 267: 23652-23657, 1992 a Fay, P.J.

Chem. 267: 13246-13250, 1992.

Porovnání přiřazených aminokyselinových sekvencí domén A2 (počítání zbytků začíná v poloze 373 vzhledem k aminokyselinové sekvenci lidského faktoru VIII plné délky

et	al.,	J.	Biol
et	al.,	J.	Biol
et	al.,	J.	Biol

u · • · uvedené zde jako sekvence id. č. 2) lidského a prasečího faktoru VIII jsou ukázány na obr. 1C. Pro přípravu molekuly hybridního lidského/prasečího faktoru VIII se změněnou koagulační aktivitou byly vybrány kandidátní sekvence pro mutagenezi srovnáním aminokyselinových sekvencí lidské a prasečí domény A2 (sekvence id. č. 2 a 6), jak je uvedeno v tabulce I.

Tabulka I

Sekvence lidského faktoru VIII Vybrané jako vhodné pro mutagenezi.

sekvence	zbytky	neshody	hodnocení změn
398-403	6	4	1
434-444	10	4	3
484-496	13	7	3
598-603	6	4	2
536-541	6	4	0
713-722	10	6	2
727-737	11	6	2

Tabulka I a tučná písmena na obr. 1A-1B ukazují sedm sekvencí v lidské a prasečí aminokyselinové sekvenci A2 doména (sekvence id. č. 2 a 6) , které představují pouze 17 % domény A2, ale obsahuje 70 % sekvenčních rozdílů mezi lidskými a prasečími doménami.

Vynález poskytuje rekombinantní hybridní lidský/prasečí konstrukt, kde aminokyseliny Ser373-Glu604 v doméně A2 (Ser373-Arg740) byly nahrazeny homologní prasečí sekvencí. Tato zkonstruovaná molekula nereaguje s inhibitory A2, a má stejnou koagulační aktivitu jako lidský (B-)faktor VIII. Dále se popisuje molekula faktoru VIII získaná z plazmy, obsahující úplnou doménu A2 z prasete užitou k substituci v molekula lidského faktoru VIII, kterážto hybridní molekula ma zvýšenou faktorem VIII koagulační aktivitu ve srovnání lidským

Srovnání těchto konstruktů ukázalo, že úsek mez:

zbytky Asp605 za rozdíl

Tento úsek vytvářením chromatografií chromatografií.

imunoafinitní pak stanoví i Arg740 je zodpovědný v aktivitě mezi lidským a prasečím faktorem VIII lze podrobněji definovat systematickým rekombinantních molekul hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, kde úsek mezi Asp605 a Au:g740 je nahrazován prasečími sekvencemi v oboru známým způsobem místně cílené mutageneze, např. metodou SOE, která byla využita extenzivně k vytváření hybridních molekul faktoru VIII obsahujících prasečí sekvence substituované v NH₂-terminálním úseku domény A2. Tyto molekuly lze exprimovat v COS-7 buňkách a ve fetálních ledvinných křeččích buňkách, jak bylo již zmíněno výše. Ty lze'purifikovat do homogenity metodami v oboru známými, např. s heparin-Sepharose™ nebo Proteinová koncentrace se absorpcí UV světla při vlnové délce 280 nm a specifická aktivita konstruktů se stanoví dělením koagulační aktivity (měřené v jednotkách na 1 ml v jednofázovém koagulačním testu) hodnotou A₂go· Lidský faktor VIII má specifickou aktivitu přibližně 3000-4000 U/A.₂go, zatímco prasečí faktor VIII má specifickou aktivitu přibližně 20 000 U/A_2S0. Ve výhodném provedení prokoagulační rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII má specifickou aktivitu 20 000 U/A₂₃o a obsahuje co nejméně prasečích substitucí v doméně A2.

Jak je zde popsáno, metody místně cílené mutageneze byly užity k identifikaci hybridního proteinu s koagulační aktivitou, která je vyšší, stejná nebo nižší než aktivita « · lidského faktoru VIII, ale výhodně vyšší. V provedení hybridního lidského/prasečího faktoru byly specifické lidské sekvence nahrazeny prasečími sekvencemi, výhodné užitím metody SOE, jak ji popsali Ho, S.N. et al., Gene 77: 51-59, 1994 nebo dle příkladů 7 a 8. Lze také užít oligonukleotidy řízenou mutagenezi, jak to bylo provedeno pro vyčlenění části lidské domény A2 (viz příklad 7). Když funkční analýza hybridů prokáže koagulační aktivitu, sekvence lze pak dále dělit a mapovat jejich prokoagulační sekvence standardními technikami analýzy bodových mutací.

Předkládaný vynález předpokládá, že cDNA hybridního faktoru VIII a samotný protein jsou charakterizovány v oboru známými a rutinními metodami jako je např. sekvencování DNA, test koagulační aktivity, ELISA test purifíkovaného faktoru VIII s měřením UV absorbance při 280 nm, test specifické koagulační aktivity (U/'mg) , SDS-PAGE analýza purifíkovaného faktoru VIII a další. Lze také provádět jiné testy potřebné k testování klinické účinnosti jako je např. analýza aminokyselin, cukrů, síranů nebo kovových iontů.

Rekombinantní hybridní faktor VIII mající vyšší koagulační aktivitu, ve srovnání s lidským faktorem VIII, je výhodný z hlediska levnější výroby než získávání faktoru VIII z plazmy a také proto, že snižuje množství faktoru VIII potřebné pro účinné léčení deficience faktoru VIII.

Hybridní faktor VIII se sníženou imunoreaktivitou

Epitopy, které jsou imunoreaktivní s protilátkami, které inhibují koagulační aktivitu faktoru VIII (inhibitory nebo inhibiční protilátky) byly charakterizovány na základě znalostí vztahů mezi strukturou a funkcí v molekula faktoru VIII. Předpokládá se ,-že inhibitory působí tak, že narušují • · • · • · • · některou z makromolekulám! ch interakcí spojenou se strukturou domén faktoru VIII nebo asociaci faktoru VIII s von Willebrandovým faktorem, trombinem, faktorem Xa, faktorem IXa nebo faktorem X. Avšak 90 % inhibičních protilátek proti lidskému faktoru VIII působí tak, že se váží na epitopy lokalizované v doméně faktoru VIII A2 velikosti 40 kDa nebo doméně C2 velikosti 20 kDa, čímž narušují specifické funkce těchto domén, jak to popsali Fulcher et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732, 1935 a Scandella et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156, 1988. Kromě epitopů v doménách A2 a C2 může být třetí epitop v doméně A3 nebo Cl lehkého řetězce faktoru VIII (podle Scandella et al, Blood 82: 1767-1775, 1993). Význam tohoto třetího předpokládaného epitopu je neznámý, ale zdá se že je zodpovědný za malý podíl epitopové reaktivity faktoru VIII.

Protilátky anti-A2 blokují aktivaci faktoru X jak popsali Lollar et al., J. Clin. Invest. 93: 2497-2504, 1994. Předchozí mapovací studie pomocí deleční mutageneze popsané v Ware et al., Blood Coagui. Fibrinolysis 3: 703-716, lokalizovaly epitop A2 do 20 kDa úseku NH₂-konce domény A2 velikosti 40 kDa. Kompetitivní imunoradiometrický test ukázal, že A2 inhibitory rozpoznávají buďto prostý epitop nebo blízce nahloučené epitopy, jak popsali Scandella et al., Throm. Hemostas. 67: 665-671, 1992 a jak je také ukázáno v příkladu 8.

Předkládaný vynález poskytuje aktivní rekombinantní hybridní a hybridní ekvivalentní faktor VIII nebo jeho fragmenty, sekvence nukleové kyseliny kódující takové hybridy, způsoby jejich přípravy a izolace a způsoby jejich charakterizace. lidský/zvířecí, faktor VIII,

K takovým hybridům patří např.

zvířečí/zvířečí nebo ekvivalentní hybridní kde aminokyselinová sekvence jednoho

biologického druhu byla nahrazena alespoň jednou specifickou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo více jedinečných aminokyselin faktoru VIII druhého druhu, nebo kde specifická sekvence lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru VIII byla nahrazena alespoň jednou specifickou aminokyselinovou sekvencí, obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí faktoru VIII. Výsledný hybridní faktor VIII má sníženou imunoreaktivitu s ininhibičními protilátkami faktoru VIII ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII nebo nemá žádnou imunoreaktivitu s ininhibičními protilátkami faktoru VIII.

Užitím postupů pro substituce aminokyselin v molekule faktoru VIII popsaných v předchozích částech přihlášky byla provedena mutační analýza, aby byly vybrány odpovídající aminokyselinové sekvence faktoru VIII jednoho biologického druhu, výhodně prasečí, které se užijí k nahrazení alespoň jedné sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin faktoru VIII jiného druhu, výhodně lidských, nebo aminokyselinové sekvence ekvivalentního hybridního faktoru VIII obsahující jednu nebo více kritických oblastí domény A2, C2 nebo jiné, proti kterým jsou namířeny inhibiční protilátky. Dále v textu jsou tyto postupy popsány Výsledný prokoagulační rekombinantní hybridní má sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami při srovnání s lidským faktorem VIII pomocí standardních testů. Systematickým nahrazováním stále menších aminokyselinových sekvencí, po kterém vždy následuje test hybridního konstruktu na imunoreaktivitu, jak bude dále popsáno, epitopy všech' domén faktoru VIII byly zmapovány, substituovány aminokyselinovými sekvencemi s menší podrobněj i konstrukt

• · · nebo nulovou imunoreaktivitou a byl připraven hybridní faktor VIII.

Je zřejmé, že odborník může využít tyto postupy kombinující mapování epitopů, konstrukci molekul hybridního faktoru VIII a mutační analýzu konstruktů, pro identifikaci a nahrazení alespoň jedné sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin obsažených v epitopu domény A2, C2 a/nebo jiné domény, proti kterým jsou namířeny inhibiční protilátky, a pro konstrukci prokoagulačního hybridního rekombinantního lidského/zvířecího, zvířecího/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII nebo jeho fragmentů, který má ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu. Takový postup byl užit v jednom provedení vynálezu, jak je popsáno v příkladu 8, k přípravě rekombinantního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, který má substituci v lidské A2 doméně a neprojevuje žádnou antigenicitu pro protilátky k faktoru VIII.

Obvykle prasečí faktor VIII má omezenou nebo i žádnou reaktivitu s protilátkami proti lidskému faktoru VIII. Rekombinantní hybridní molekuly lidského/prasečího faktoru VIII se sníženou nebo nulovou reaktivitou s inhibičními protilátkami, která je důsledkem aminokyselinové substituce v doméně A2, byly připraveny jako příklad hybridního faktoru VIII připraveného pomocí faktoru VIII jiného biologického druhu a substituci v doménách jiných než A2. Prasečí doména A2 byla klonována rutinními postupy, jak jsou popsány v příkladech 6,7 a 8, a pak byla štěpena uvnitř s využitím restrikčních míst pro štěpení cDNA a nebo pomocí metody SOE. Výsledné aminokyselinové sekvence byly užity k nahrazení sekvencí lidské domény A2 a byl tak vytvořen hybridní konstrukt faktoru VIII,který byl vložen do savčího expresního vektoru, výhodně ReNeo, stabilně transformován do buněk ► · · «

I · · « • · · · v kultuře, výhodně buněk fetálních křečcích ledvin, a exprimován. Hybridní faktor VIII byl testován na imunoreaktivitu, např. s protilátkami anti-A2 v rutinním Bethesda testu nebo v testu s čistou plazmou a chromogenním substrátem. Bethesda jednotka (BU) se užívá jako standardní měřítko titru inhibitoru. Pokud není Bethesda titr protilátek měřitelný (<0,7 BU/mg IgG) u hybridního konstruktu, pak to znamená, že lidský A2 epitop byl eliminován v daném úseku substitucí odpovídající prasečí sekvencí. Epitop se postupně progresivně zužuje, takže je možné stanovit specifický epitop A2, aby bylo možné vytvořit hybridní lidskou/prasečí molekulu s co možná nejmenším množstvím prasečí sekvence. Jak je podrobněji dále popsáno, sekvence 25 aminokyselinových zbytků odpovídající sekvenci Arg484-Ile508, která je kritická pro imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami, byla identifikována a nahrazena v doméně A2. V této sekvenci je pouze 9 rozdílů mezi lidskou a prasečí sekvencí faktoru VIII. Tento úsek lze dále analyzovat a substituovat.

Lze také připravit hybridní lidský/prasečí faktor VIII, který má sníženou nebo nulovou reaktivitu s inhibičními protilátkami, kde jsou substituce v doménách Cl, C2 nebo jiných, společně a nebo bez substituce v doméně A2. Epitop C2 lze např. mapovat metodou skenování homologů v kombinaci s místně cílenou mutagenezí. Konkrétně je takový postup shodný nebo podobný postupu,který byl zde užit pro substituce v doméně A2, včetně klonování prasečí domény A2 pomocí RT-PCR nebo vyhledáváním z cDNA knihovny prasečích jater pomocí DNA lidské C2 nebo jiné domény, využití restrikčních míst a/nebo následné metody SOE k mapování a současnému nahrazení epitopů domény C2 nebo jiné, substituce domény C2 nebo jiné v (B-)faktoru VIII, inzerce do expresního vektoru, jako je • · · · ·· ·· ·· • · · · « ·· · · · « » · · · · · ·« I · · · « • · · · · · např. pBluescript, exprese v buněčné kultuře a rutinní testy na imunoreaktivitu. Pro tyto testy lze využít reaktivitu C2 hybridního faktoru VIII s C2-specifickém inhibitorem MR (Scandella et al., Throm. Homeostasis 67: 665-671, 1992 a Lubin et al., 1994) a/nebo jiné C2-specifické protilátky připravené afinitní chromatografií.

Doména C2 obsahuje aminokyselinové zbytky 2173 až 2332 (sekvence id. č. 2). V tomto úseku 154 aminokyselin je zřejmě inhibiční aktivita namířena na úsek v délce 65 aminokyselin mezi zbytky 2248 a 2312 (podle Shima, M. et al., Throimb. Haemostas. 69: 240-246, 1993. ' Jestliže jsou lidská C2 a prasečí C2 sekvence faktoru VIII v tomto úseku z 85 % identické, jako je tomu v jiných funkčně aktivních úsecích faktoru VIII, pak je přibližně 10 rozdílných aminokyselin mezi lidskou a prasečí aminokyselinovou sekvencí C2 faktoru VIII, které lze využít jako počáteční cíle ke konstrukci hybridů se substitucemi v C2 sekvenci.

Je pravděpodobné, že klinicky významné epitopy faktoru VIII jsou vázány na domény A2 a C2. Avšak byly identifikovány i protilátky k jiným úsekům (Al, A3, B nebo Cl) faktoru VIII, jejichž epitopy lze mapovat a eliminovat postupy popsanými v předkládaném vynálezu, aby se získaly molekuly neantigenního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII.

může mapovat domnělý druhý epitop jakýkoliv další epitop v kterékoliv doméně lidského nebo zvířecího faktoru VIII. Na počátku se provede stanovení přítomnosti třetího inhibitorového epitopu v doménách A2 nebo Cl následujícím postupem. Užitím lidské aminokyselinové sekvence faktoru VIII konstruovaly hybridy Alp-A2p-A3p-ClH-C2P a Alp-A2p-A3H-Clp-C2p bez domén B. Inhibiční IgG z plazmy asi 20 pacientů (Dr. Dorothea Scandella, Americký červený kříž),

Konkrétně se např. lehkého řetězce a/nebo (H) a prasečí (p) jakožto modelů, se • to • · • · · · » · ♦ « » · ·· » ·· « i ·· <

• · ·· • to to · • · kteří měli nízký nebo nedetekovatelný titr protilátek proti prasečímu faktoru VIII, byl užit v testu proti hybridům. Pokud je třetí epitop v doméně A3, inhibiční IgG bude reagovat s Alp-A2p-A3H-Clp-C2p ale nikoliv s Alp-A2p-A3p-C1HC2P hybridem. A naopak, pokud je třetí epitop v doméně Cl, inhibiční IgG bude reagovat s Alp-A.2p-A3p-ClH-C2P ale nikoliv s Alp-A2p-A3H-Clp-C2p hybridem. Pokud se identifikuje třetí epitop, charakterizuje se stejným postupem jaký byl popsán pro epitopy A2 a C2. Např. protilátky specifické proti epitopům domén Cl nebo A3 lze izolovat z celkového IgG pacienta pomocí afinitní chromatografie s užitím hybridů AlpA2p-A3p-ClH-C2P a Alp-A2p-A3H-Clp-C2p, a eliminací C2 specifických protilátek průchodem Sepharose™ s rekombinantním faktorem VIII. předpokládaný třetí epitop je pak identifikován pomocí konstruktů metodou SOE, kdy ve výhodném provedení části domén A3 nebo Cl lidského faktoru VIII se systematicky nahrazují prasečími sekvencemi.

Hybridní faktor VIII se sníženou imunogenicitou

Molekula je imunogenní, když může indukovat tvorbu protilátek u člověka nebo zvířete. Předkládaný vynález poskytuje prokoagulační rekombinantní hybridní lidský/zvířecí nebo zvířecí/zvířecí faktor VIII, hybridní ekvivalentní faktor VIII nebo jejich fragmenty, které jsou méně imunogenní než lidský nebo prasečí faktor VIII divokého typu u člověka nebo zvířete, kde odpovídající aminokyselinová sekvence, která má imunogenní aktivitu faktoru VIII jednoho biologického druhu je nahrazena alespoň jednou specifickou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo více jedinečných aminokyselin faktoru VIII jiného druhu, nebo aminokyselinová sekvence lidského, zvířecího nebo hybridního • · • · • · • · • · faktoru VIII je nahrazena alespoň jednou sekvencí obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu se sekvencí faktoru VIII. Taková hybridní molekula se· užije ke snížení výskytu vývoje inhibitorů u člověka nebo zvířete a k léčení deficience faktoru VIII, a zvláště výhodně u pacientů s hemofilií dosud neléčených. Ve výhodném provedení hybridní faktor VIII obsahuje lidskou aminokyselinovou sekvenci faktoru VIII, kde jeden nebo několik alaninových zbytků bylo užito k nahrazení lidské aminokyselinové sekvence s imunogenní aktivitou, čímž vznikla prokoagulační rekombinantní hybridní molekula nebo její fragment, které mají sníženou nebo nemají žádnou imunogenicitu pro člověka nebo zvíře.

Zde popsaný postup mapování epitopů a mutační analýzy, kombinovaný se substitucí neantigenních aminokyselinových sekvencí za antigenní v molekule faktoru VIII, užitím hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, vede k přípravě hybridní molekuly s nízkou antigenicitou. Pomocí tohoto modelu a souvisejících postupů lze jakýkoliv konstrukt zde popsaný změnit metodou místně cílené mutageneze tak, že se odstraní co možná největší část funkčního epitopu, aby se snížila možnost imunitního systému rozpoznat hybridní faktor VIII, čímž se níží imunogenicita.

Jednou z metod, která se může užít k dalšímu snížení antigenicitv a ke konstrukci méně imunogenních hybridů faktoru VIII je metoda alaninové skenovací mutageneze, kterou popsali Cunningham, B.C. et al . , Science 244: 1081-1085, 1989, vybraných specifických aminokyselinových sekvencí lidského, zvířecího nebo hybridního faktoru VIII. Při této metodě alaninové skenovací mutageneze jsou vedlejší aminokyselinové řetězce, které jsou dle předpokladu součástí epitopu, nahrazeny alaninovými zbytky pomocí místně cílené • · » · ¹» · · · · » · ·· ♦ » · · · · · » · · · · • · · · « • fc » · · 1 » · · ‘

I · · » · · ’ • · · · mutageneze. Srovnáním vazby protilátky na alaninové mutanty a na protein divokého typu dovolí stanovit. relativní příspěvek jednotlivých postranních řetězců k vazebné interakci. Alaninové substituce jsou zvláště užitečné, neboť příspěvky postranních řetězců k vazbě protilátek jsou eliminovány za β uhlíkem, ale na rozdíl od substituce glycinem konformace hlavního řetězce je obvykle nezměněna. Alaninová. substituce nemá žádné hlavní sterické, hydrořobní nebo elektrostatické účinky, které by ovládaly proteinproteinové interakce.

V proteinových interakcích antigen-protilátka je obvykle 15 až 20 postranních řetězců antigenů s protilátkou. Interakce postranních řetězců, na interakcí vedlejších řetězců, jsou pro interakce proteinprotein dominantní. Na základě nedávných studií se v kontaktu rozdíl od předpokládá, že pouze několik málo (3

5)

Z lěCftlO interakcí postranních řetězců přispívá k většině vazebné energie (viz Clackson, T. et al., Science 267: 383-386, 1995). Rozsáhlá analýza epitopů růstových hormonů pro několik myších monoklonálních protilátek ukázala následující hierarchii příspěvků postranních řetězců k celkové vazebné energii: Arg > Pro > Glu - Asp - Phe - Ile, přičemž Trp, Ala, Gly a Cys nebyly testovány (Jin, L. et al., J. Mol. Biol. 226: 851-865). Výsledky s epitopem A2 popsané v předkládaném vynálezu jsou v souladu s tímto zjištěním, neboť dvanáct z 25 zbytků v segmentu 484-508 A2 obsahuje tyto postranní řetězce (viz tabulka 1).

Zjištění, že určité aminokyselinové zbytky jsou zvláště dobře rozpoznávány protilátkami, ukazuje, že odstranění těchto zbytků ze známého epitopu může snížit schopnost imunitního systému rozpoznávat tyto epitopy, tj . učiní danou molekulu méně imunogenní. V případě epitopu A2 lze imunogenní • · · · fcfc ·· > · * ’ » · · <

zbytky nahradit, aniž by došlo ke ztrátě koagulační aktivity. Tak např. v HP9 je Arg484 nahrazen Ser, Pro485 je nahrazen Ala, Arg489 je nahrazen Gly, Pro492 je nahrazen Leu a Phe501 je nahrazen Met. A dále výsledky získané s plazmou pacientů použitou k testování imunoreaktivity hybridních konstruktů lidských/prasečích faktorů VIII popisované v příkladu 8, ukazují, že protilátky z různých pacientů rozpoznávají stejný nebo velmi podobný strukturní úsek domény A2 a že aminokyselinové zbytky domény A2 podílející se na na vazbě A2 inhibitorů vykazují minimální proměnlivost. Takže A2 epitop obsažený v úseku lidského faktoru VIII 484-508 je imunodominantní epitop v tom smyslu, že je rozpoznáván imunitním systémem lépe než jiné strukturní úseky faktoru VIII. Nahrazení této struktury neantigenní sekvencí faktoru VIII z jiného biologického druhu nebo aminokyselinovou sekvencí odlišnou od sekvence faktoru VIII při současném zachování plné koagulační aktivity, vede ke změně rozpoznávání hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII imunitním systémem.

Má se za to, že místně cílená mutageneze pro náhradu velkých a/nebo nabitých aminokyselinových zbytků, které převládají v epitopech, malými neutrálními postranními řetězci (např. alaninem) vede ke vzniku méně imunogenních úseků. Očekává se, že molekuly obsahující několik takových substitucí v každém významném inhibičním epitopu budou obtížně rozpoznatelné imunitním systémem, neboť nebudou pasovat do mechanismu zámku a klíče, který je typický pro tento druh interakcí antigen-protilátka. Vzhledem k jejich nízké antigenicitě takové hybridní molekuly jsou užitečné k léčení deficience faktoru VIII u pacientů s inhibitory, a vzhledem k jejich nízké imunogenicitě jsou užitečné k léčení dříve neléčených pacientů s hemofilí A.

»« ·· ·· ·» ·· *· • · · · .·»· »»·· • · «* »·«· ···· • « 9 9 · · · · · · · · ·« · ···· ·· · · · · ·

Obecným výsledkem je, že náhrada jednoho z klíčových zbytků je dostatečná ke snížení vazebné konstanty pro danou protein-proteinovou interakci o několik řádů. Takže je pravděpodobné, že všechny epitopy faktoru VIII obsahují omezený počet aminokyselin, které jsou kritické pro to, aby se vyvinuly inhibitory. Pro každý epitop faktoru VIII náhrada alespoň jedné sekvence obsahující jednu nebo několik specifických aminokyselin mající imunogenní aktivitu alaninem, může poskytnout aktivní molekulu, která je méně imunogenní než faktor VIII divokého typu. Ve výhodném provedení vynálezu je faktor VIII bez domény B.

Způsob přípravy aktivního rekombinantního hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII substitucí aminokyselin s malou nebo nulovou imunogenní aktivitou za původní aminokyselinové sekvence faktoru VIII, při kterých se užívá hybridní lidský/prasečí faktor VIII se substitucí aminokyselin v doméně A2, je popsán dále jako jeden z příkladů provedení předkládaného vynálezu. Úsek 484-508 lidského faktoru VIII obsahuje 25 aminokyselinových zbytků. Místně cílené mutageneze lze užít k tomu, že se každý z těchto zbytků nahradí kteroukoliv ' z ostatních 19 aminokyselin v celkovém počtu 475 mutant. Kromě toho se mohou konstruovat také mutantní molekuly obsahující více než jednu mutaci.

Hybridní konstrukty se pak testují na antigenicitu měřením vazebné konstanty pro inhibiční protilátky, jak popsali' Friguet et al., J. Immuno1 . Methods 77: 305-319, 1935. Ve výhodném provedení vynálezu je hodnota vazebné konstanty snížena nejméně o tři řády, což by vedlo ke snížení Bethesda titru na klinicky nevýznamnou hladinu. Např. IC50(hrubé měřítko vazebné konstanty) inhibice pro A2 protilátky byla snížena u hybridního konstruktu • 0 • · ·· ·· ·* • · · · · · · • · ·· · · · • · · ·♦· · ··

0 0 0 ·· • 0 00 00 «·

00 · * «· · ♦ 0 «

0 0

00 lidského/prasečího faktoru VIII HP2, HP4, HP5, HP7 a HP9, které jsou popsány v příkladu 8, a to bylo spojeno se snížením Bethesda titru na neměřitelnou hladinu. Lze předpokládat, že např. dvojitá nebo trojitá alaninová mutanta lidského faktoru VIII (např. trojitá mutanta lidského faktoru VIII Arg434 -> xAla, Arg489 -> Ala, Phe501 —> Ala) poskytne molekulu s dostatečně nízkou antigenicitou pro terapeutické použití. Podobné mutace lze provést v epitopu C2 a také v předpokládaném třetím epitopu. Výhodné provedení vynálezu obsahuje dvě nebo tři alaninové substituce ve dvou nebo třech epitopech faktoru VIII. Lze také provést další substituce v těchto dvou úsecích.

Ve výhodném provedení vynálezu byl identifikován hybridní ekvivalentní faktor VIII, který je méně antigenní a/nebo imunogenní pro člověka a zvíře než lidský nebo prasečí faktor VIII. Takový hybridní ekvivalentní konstrukt se testuje na zvířatech, zda má sníženou antigenicitu a/nebo imunogenicitu. Jako zvířecí modely lze užít např. králíky, prasata, psy, myši, primáty a jiné savce, a to jak kontroly tak zvířata s deficiencí faktoru VIII. Podle jednoho experimentálního protokolu se hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII podává systematicky po dobu šesti měsíců až jednoho roku zvířeti, výhodně intravenózními infuzemi a v dávce 5 až 50 jednotek/kg (U/kg) tělesné hmotnosti, výhodně 10 až 50 U/kg a nej výhodněji 40 U/kg tělesné hmotnosti. Protilátky se měří ve vzorcích plazmy odebrané v intervalech po infúzi po dobu testování rutinními metodami jako je imunotest a Bethesda test. Ve vzorcích se také měří koagulační aktivita rutinním postupem, např. jednofázovým koagulačním testem.

Hybridní ekvivalentní molekuly faktoru VIII se testují na člověku, zda mají sníženou antigenicitu a/nebo • · • · imunogenicitu, a to alespoň ve dvou typech klinických testů. V jenom typu klinického testu, který je navržen ke stanovení toho, zda je hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII imunoreaktivní s inhibičními protilátkami, se .podává hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII, výhodně íntravenózní infúzí, přibližně 25 pacientům s deficiencí faktoru VIII, kteří mají plky proti faktoru VIII, které inhibují koagulační aktivitu terapeutického lidského nebo prasečího faktoru VIII. Dávka hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII je 5 až 50 jednotek/kg (U/kg) tělesné hmotnosti, výhodně 10 až 50 U/kg a nejvýhodněji 40 U/kg tělesné hmotnosti. Přibližně 1 hodinu po každém podání se měří obnova faktoru VIII ve vzorcích krve jednofázovým koagulačním testem. Vzorky se odebírají znovu přibližně 5 hodin po infúzi a znovu se měří obnova. Celková obnova a rychlost úbytku faktoru VIII ze vzorků slouží k predikci titru protilátek a inhibiční aktivity. Když je titr protilátek vysoký, obnova faktoru VIII je obvykle neměřitelná. Výsledky obnovy se srovnávají s obnovou u pacientů, kteří jsou léčeni lidským, faktorem VIII získaným z plazmy, rekombinantním lidským faktorem VIII, prasečím faktorem VIII a dalšími obecně užívanými terapeutickými formami faktoru VIII nebo náhražkami faktoru VIII.

Ve druhém typu klinických testů, které jsou navrženy ke zjištění, zda je hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII imunogenní, tj . zda se proti faktoru VIII u pacienta vytvoří inhibiční protilátky, hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII se podává, jak bylo již popsáno, přibližně 100 dosud neléčených pacientů s hemofilii, u kterých se nevyvinuly protilátky proti faktoru VIII. Léčení se provádí přibližně jednou za dva týdny po dobu 6 měsíců až jednoho roku. V intervalech 1 až 3 měsíců se odebírají vzorky krve a provádí se Bethesda test a další testy ke stanovení přítomnosti inhibičních protilátek. Také se po každé infúzi může provést test obnovy faktoru VIII, jak bylo již výše popsáno. Výsledky se porovnávají u hemofilických pacientů, kteří dostali faktor VIII získaný z plazmy, rekombinantní lidský faktor VIII, prasečí faktor VIII nebo jinou obecně užívanou terapeutickou formu faktoru VIII nebo náhražku faktoru VIII.

Příprava hybridního faktoru VIII užitím aminokyselinové sekvence lidského a savčího, jiného než lidského a prasečího, faktoru VIII

Stejné metody, jaké byly užity k přípravě hybridního lidského/prasečího faktoru VIII substitucí specifických aminokyselin se užijí také k přípravě rekombinantního hybridního lidského/savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII nebo zvířecího/zvířecího faktoru VIII, který má ve srovnání s lidským nebo prasečím faktorem VIII, změněnou nebo stejnou koagulační aktivitu a/nebo stejnou nebo sníženou imunoreaktivitu a/nebo imunogenicitu, a to na základě substituce jedné nebo více aminokyselin v doméně A2, C2 nebo jiní doméně.

Podobná srovnání aminokyselinové sekvenční identity se provedou pro lidská a savčí jiný než lidský a prasečí protein faktoru VIII, aby se stanovily aminokyselinové sekvence, ve kterých spočívá prokoagulační aktivita, anti-A2 a anti-C2 imunoreaktvita a/nebo imunogenicita nebo imunoreaktivíta a/nebo imunogenicita jiných domén. Podobné metody se užijí k přípravě hybridního lidského/savčího jiného než lidského prasečího faktoru VIII. Jak bylo již popsáno výše, funkční analýza hybridů umožní odhalit ty, které, mají sníženou • · ·· | · · « » · · sníženou a sekvence reaktivitu s inhibičnimi protilátkami a/nebo imunogenicitu a/nebo zvýšenou koagulační aktivitu, se mohou dále podrobněji analyzovat pomocí bodových mutací.

Tak např. výše popsaným postupem lze připravit hybridní lidský/myší faktor VIII. Srovnání a přiřazení aminokyselin lidské domény A2 (sekvence id. č. 2) a myší A2 (sekvence id. č. 6) je ukázáno na obr. 1C. Jak popsali Elder et al. , protein faktoru VIII kódovaný myší cDNA (sekvence id. č. 5) obsahuje 2319 aminokyselinových zbytků se 74% sekvenční identitou s lidskou sekvencí (sekvence id. č. 2) v celém rozsahu sekvence (87 % identita při vyloučení domény B) a je o 32 aminokyselin kratší než lidský faktor VIII. Aminokyselinové sekvence myší domény A a C jsou vysoce konzervativní (sekvence id. č. 6) s 84% a 93% sekvenční identitou s lidskou sekvencí (sekvence id. č. 2), zatímco doména B a dvě krátké kyselé domény mají 42% a 7 0 % sekvenční identitu. Specificky myší aminokyselinové sekvence Al, A2 a A3 (sekvence id. č. 6) jsou v 85%, 85% a 90 % identické s odpovídající lidskou sekvencí (sekvence id. č. 2) . Myší aminokyselinové sekvence Cl a C2 jsou v 93 a 84 % identické s odpovídající lidskou sekvencí. V predikované aminokyselinové sekvenci myšího faktoru VIII (sekvence id. č. 6), když se užije identita aminokyselin pro účely číslování, jsou domény Al, A2 a A3 homologní s aminokyselinami 1-372, 373-740 a 1690-2032 sekvence lidského faktoru VIII.

Štěpné místo trombinu/faktoru Xa a všechna ostatní kromě štěpného místa aktivovaného proteinu C jsou zachována v myším faktoru VIII. Také tyrosinový zbytek pro vazbu von Willebrandova faktoru je zachován.

Podle Eldera et al. nukleotidová sekvence myšího faktoru VIII (sekvence id. č. 5) obsahuje 7519 baží a má 67% • * • · * ř ♦ · ’ • · · · • · · » · · · , · · · · · > · · • · · · sekvenční identitu v celém rozsahu sekvence s lidskou nukleotidovou sekvencí (sekvence id. č. 1). Myší kódující sekvence velikosti 6957 párů baží má 82% sekvenční identitu s kódující sekvencí velikosti 7053 párů baží lidského faktoru VIII. Pokud se ze srovnání vynechá doména B, pak je zde 88% nukleotidová sekvenční identita.

Elder et al. popsali, že lidský a myší mají celkovou identitu 74 % a že 95 % zbytků v lidské sekvenci, které, jsou-li změněny, způsobují hemofilii,· je zachováno v myší sekvenci. Tyto údaje podporují využití stejných postupů, které byly použitý k identifikaci aminokyselinové sekvence s koagulační aktivitou a/nebo imunoreaktivitou k protilátkám u prasečího faktoru VIII, také u faktoru VIII myší a jiných zvířat ke stanovení obdobných aminokyselinových sekvencí a přípravě hybridních molekul.

Příprava hybridního faktoru VIII se sníženou křížovou reaktivitou užitím aminokyselinové sekvence lidského a savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII a aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence faktoru VIII

Prasečí faktor VIII se užívá klinicky k léčení deficience faktoru VIII u pacientů, kteří mají inhibiční protilátky proti faktoru VIII. Křížová reaktivita, kterou lidská plazma reaguje s prasečím faktorem VIII, může být snížena přípravou hybridního lidského a savčího jiného než lidského a prasečího faktoru VIII nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII. Ve výhodném provedení vynálezu se provádí stanovení, zda inhibitor specifický proti lidské doméně A2, C2 nebo jiné reaguje se savčím jiným než lidským a prasečím faktorem VIII, a sice pomocí rutinního Bethesda festu a plazmy jiného savce jako standardu. Titry inhibitoru • · • · se měří obvykle v plazmě, takže purifikovaný faktor VIII jiného savce není nutný. Pokud inhibitory nereagují s faktorem VIII jiného savce, např. myším faktorem VIII, jehož sekvence je známá, je možné užít sekvence jiného savce k nahrazení sekvencí v úseku epitopu prasečího faktoru VIII, který byl identifikován u lidských/prasečích hybridů. Jakmile je jednou zvířecí sekvence známa, je možné užít metodu místně cílené mutageneze, např. oligonukleotidem zprostředkované mutageneze jak bylo popsáno v práci Kunkel, T.A. et al., Meth. Enzymol. 204: 125-139, k přípravě hybridního prasečího/zvířecího faktoru VIII.

zvířete méně reaktivní s A2, C2 inhibitory faktoru VIII než myší nebo prasečí faktor VIII, zvířecí sekvence odpovídající prasečímu epitopu může být určena rutinním postupem, jako např. RT-PCR a hybridní lidský/zvířecí nebo prasečí/zvířecí zkonstruovat místně cílenou mutagenezí hybridní lidský/zvířecí nebo prasečí/savčí jiný než prasečí faktor VIII, který má sníženou křížovou reaktivitu s lidskou plazmou ve srovnání s prasečím faktorem VIII, aminokyselinová sekvence nahrazena odpovídající jednoho nebo několika zvířat. V dalším provedení vynálezu je možné snížit křížovou reaktivitu tím, že se sekvence prasečího epitopu nahradí aminokyselinovou sekvencí, která nemá žádnou známou identitu s faktorem VIII, výhodně alaninovými zbytky metodou alaninové skenovací mutageneze.

Pro identifikaci klinicky významných epitopů jsou exprimovány molekuly rekombinantního hybridního faktoru VIII, které mají menší nebo stejnou křížovou reaktivitu ve srovnání s prasečím faktorem VIII, když se testují in vitro proti celé řadě vzorků plazmy s inhibitory. Výhodně jsou tyto molekuly kombinované hybridy A2/C2, kde je

Pokud, je plazma jiného inhibitory nebo jinými faktor VIII lze Lze také připravit kde j e sekvencí imunoreaktivní aminokyselinová sekvence v těchto doménách nahrazena doménou jiného savce. Lze provést další mutagenezi těchto úseků, aby se snížila křížová reaktivita. Snížená křížová reaktivita, ačkoliv je žádoucí, není nutným požadavkem u produktu, který je výhodnější než současný existující koncentrát prasečího faktoru VIII, který má vedlejší účinky díky kontaminaci prasečími proteázami a může způsobovat nežádoucí účinky díky imunogenicitě sekvencí prasečího faktoru VIII. Hybridní lidský/savčí nebo prasečí/savčí faktor VIII neobsahuje cizorodé prasečí proteiny. Kromě toho, extenzivní mapování epitopů dokončené u prasečí domény A2 ukázalo, že více než 95 % sekvence terapeutického hybridního lidského/prasečího faktoru VIII je lidského původu.

Příprava ekvivalentů hybridního faktoru VIII

Metody substitucí aminokyselin ve faktoru VIII popsané zde a v příkladech lze užít k přípravě ekvivalentních molekul prokoagulačního rekombinantního hybridního faktoru VIII nebo jejich fragmentů, kde alespoň jedna specifická aminokyselinová sekvence obsahující antigenní a/nebo imunogenní místo v lidském, zvířecím nebo hybridním faktoru VIII, byla nahrazena alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou aminokyselinovou sekvenční identitu s faktorem VIII (sekvencí odlišnou od faktoru VIII). Výsledný ekvivalentní aktivní hybridní faktor VIII má menší nebo stejnou reaktivitu s inhibičními protilátkami faktoru VIII a/nebo menší imunogenicitu pro člověka a zvířata než lidský, zvířecí nebo hybridní faktor VIII bez substituce.

K vhodným aminokyselinovým sekvencím, které se mohou užít k nahrazení sekvencí kritických pro koagulační ar/nebo • · • ·

antigenní a/nebo imunogenní aktivitu v lidském, zvířecím nebo hybridním lidském/zvířecím faktoru VIII, aby se připravil hybridní ekvivalentní faktor VIII, patří jakákoliv aminokyselinová sekvence, která nemá žádnou sekvenční identitu se sekvencí lidského nebo zvířecího faktoru VIII, která má koagulační,antigenní nebo imunogenní aktivitu. Ve výhodném provedení se k nahrazení užije sekvence alaninových zbytků a metoda alaninové skenovací mutageneze.

K ekvivalentním molekulám hybridního faktoru VIII podle vynálezu patří také molekuly, kde sekvencemi, které nemají žádnou známou identitu se zvířecím faktorem VIII, jsou nahrazeny aminokyselinové sekvence, které nejsou kritické pro koagulační, antigenní nebo imunogenní aktivitu.

Jak bylo již popsáno výše, v jednom provedení ekvivalentního hybridního faktoru VIII má faktor VIII sníženou křížovou reaktivitu s plazmou. Byly identifikovány v křížově reagujícím faktoru VIII jeden a více epitopů, které byly nahrazeny aminokyselinovou sekvencí odlišnou od faktoru VIII, výhodně alaninovými zbytky, např. metodou alaninové skenovací muateneze.

Ve výhodném provedení vynálezu byla připravena ekvivalentní molekula prokoagulačního rekombinantního hybridního faktoru VIII, kde alespoň jedna sekvence obsahující jednu nebo více aminokyselin obsahujících epitop a/nebo obsahující jednu nebo více aminokyselin obsahujících imunogenní místo, výhodné lidského faktoru VIII, je nahrazena alespoň jednou sekvencí obsahující jednu nebo více aminokyselin, která nemá žádnou známou sekvenční identitu s faktorem VIII, výhodně sekvencí alaninových zbytků. Výsledný ekvivalentní hybridní faktor VIII nebo jeho fragment má sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s inhibičními protilátkami k faktoru VIII a/nebo sníženou nebo nulovou • · • « imunogenicitu pro člověka nebo zvíře. Způsoby identifikace specifické antigenní sekvence aminokyselin v doméně A2 lidského faktoru VIII jsou popsány v příkladech 7 a 8 a slouží jako příklad identifikace antigenních sekvencí v doméně A2 nebo jiných doménách lidského a zvířecího faktoru VIII a užití metod místně cílené mutageneze, jako je alaninové skenovací mutageneze, k substituci aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence faktoru VIII.

Jelikož lidský epitop A2 byl zúžen na 25 aminokyselin, jak je popsáno v příkladu 8, lze provést alaninovou skenovací mutagenezi na omezeném počtu konstruktů hybridního faktoru VIII s lidskou aminokyselinovou sekvencí, aby se stanovilo, které konstrukty hybridního faktoru VIII založené na substituci aminokyselin v A2 jsou prokoagulační, nejsou imunoreaktivní a/nebo imunogenní. V doméně A2 jsou kandidáty pro substituci v hybridním konstruktu pro dosažení snížené imunogenicity a imunoreaktivitv aminokyseliny Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, Arg489, Pro492, Val495, Phe501 a Ile508. Vazebná afinita hybridních konstruktů obsahujících každou z těchto mutant s monoklonální protilátkou mAB413 a panelem IgG specifických pro A2 z pacientů se stanovuje testem ELISA. Kterákoliv mutanta, která je aktivní a má vazebnou afinitu k A2 inhibitorům nižší nejméně o 2 řády je kandidátem pro A2 substituci v molekule faktoru VIII. vyberou se konstrukty, které mají více než jednu mutaci na základě předpokladu, že čím více je epitop změněn, tím méně je imunogenní. Je možné, že jsou v úseku Arg484-Ile508 i další zbytky jako kandidáti, neboť zde mohou být klíčové zbytky epitopu, které jsou společné pro lidský a prasečí faktor VIII. Tak např. nabité zbytky se často účastní protein-proteinových interakcí a skutečně substitucí Arg490 alaninem byl získán prokoagulační faktor VIII mající pouze 0,2% reaktivitu s inhibitory lidského faktoru VIII (viz tabulka VI). Podobně náhrada Lys493 alaninem je také kandidátem.

Tyto postupy se provedou také na epitopu C2 a na předpokládaném třetím epitopu, který zřejmě leží v doméně A3 nebo Cl, a také na kterémkoliv epitopu identifikovaném na faktoru VIII, pro přípravu hybridních konstruktů faktoru VIII.

Diagnostické testy cDNA hybridního lidského/zvířecího, zvířecího/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII a/nebo z ní exprimovaný protein, celek nebo část, se mohou užít jako diagnostické činidlo v testech pro detekci inhibičních protilátek k lidskému nebo zvířecímu faktoru VIII nebo hybridního lidského/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII v substrátech, jako jsou např. vzorky séra a tělních tekutin z pacientů, kteří trpí deficiencí faktoru VIII. K těmto protilátkovým testům patří např. ELISA test, imunopřenos (immunoblot) , radioimunotest, imunodifúzní test a test biologické aktivity faktoru VIII, tj. koagulační test. Způsoby přípravy reagencií a postupy těchto testů jsou odborníkům známy, tak např. imunotest pro detekci inhibičních protilátek ve vzorku pacientova séra spočívá v reakci testovaného vzorku s dostatečným množstvím hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII, který obsahuje alespoň jedno antigenní místo, přičemž toto množství je dostatečné k tomu, že se ve vzorku vytvoří detekovatelný komplex s inhibičními protilátkami.

Sondy z nukleových kyselina nebo aminokyselin lze připravit z cDNA nebo příslušných proteinů hybridního lidského/prasečího, lidského/savčího -jiného než lidského »· · · · a prasečího, zvířecího/zvířecího nebo ekvivalentního faktoru VIII nebo jejich fragmentů. V některých provedeních předkládaného vynálezu se tyto sondy značí užitím barviv nebo fluorescenčně nebo chemiluminiscencí nebo značkou, které .jsou komerčně dostupné.

enzymaticky, radioaktivní

Aminokyselinové sondy se užívají např. pro screening séra jsou v podezření zvířecímu nebo nebo jiné tělesné tekutiny, pokud z přítomnosti inhibitorů k lidskému, hybridnímu lidskému/zvířečí faktoru VIII. Lze tak kvantifikovat hladiny inhibitorů u pacientů s rovnat se zdravými kontrolními jedinci, což lze užít např. ke stanovení toho, zda pacient s deficiencí faktoru VIII může být léčen hybridním nebo ekvivalentním hybridním faktorem VIII. Sondy cDNA se mohou užít pro výzkumné účely ke ' screeningu DNA knihoven.

Farmaceutické přípravky

Farmaceutické přípravky obsahující hybridní lidský/zvířecí, prasečí/savčí jiný než lidský a prasečí, zvířecí-1/zvířecí-2 nebo ekvivalentní faktor VIII, samotný nebo v kombinaci s vhodnými farmaceutickými stabilizátory, vehikuly a/nebo nosiči, jsou připravovány známými metodami, např. jak je popsal E.W. Martin v Remington's Pharmaceutical Sciences.

V jednom výhodném provedení vynálezu výhodným nosičem nebo vehikulem pro intravenózní infúze je fyziologický roztok nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok.

V jiném výhodném provedení vynálezu vhodnou stabilizační sloučeninou, vehikulem a nosičem je např. jiný lidský nebo zvířecí protein, jako např. albumin, přičemž vynález není omezen pouze na tento protein.

• · • · · · ·

Fosfolipidové vesikuly nebo liposomové suspenze jsou také výhodné farmaceuticky přijatelné nosiče nebo vehikula. Lze je připravit odborníkům známými metodami a patří k nim např. sloučeniny fosfytidylserin/fosfatidylcholin nebo jiné sloučeniny fosfolipidů nebo detergentů, které společně propůjčují na povrch negativní náboj, jelikož se faktor VIII váže na negativně nabité fosfolipidové membrány. Liposomy lze připravit rozpuštěním vhodných lipidů (jako je např. stearoylfosfatidyletanolamin, stearoylfosfatidylcholin, arachidoylfosfatidylcholin nebo cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se pak odpaří a zanechá tenký film suchého lipidu na stěně nádoby. Vodný roztok hybridního faktoru VIII se pak přidá do nádoby a nádob se pak v ruce otáčí, aby se lipidový materiál uvolnil ze stěn nádoby a dispergovaly se lipidové agregáty, čímž se vytvoří suspenze liposomů.

Hybridní faktor nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII se může kombinovat s dalšími vhodnými stabilizujícími sloučeninami, vehikuly a/nebo nosiči, k nimž patří koagulační faktor závislý na vitaminu K, tkáňový faktor von

Willebrandův faktor (vWf) nebo jeho fragment, který obsahuje vazebné místo pro faktor VIII, a polysacharidy jako je- např. sacharóza.

Hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII lze podávat také pomocí genové terapie stejně jako se může podávat lidský faktor VIII, např. pomocí retrovirových vektorů, tento postup spočívá v inkorporací cDNA faktoru VIII do lidských buněk, které se pak transplantují přímo pacientovi s deficiencí faktoru VIII nebo se vloží do implantátu, který je propustný pro faktor VIII a nikoliv pro buňky, který se pak implantuje pacientovi. Výhodným způsobem přenosu je retrovirem zprostředkovaný přenos genu. Při tomto • · · · způsobu se exogenní gen (např. cDNA faktoru VIII) klonuje do genomu modifikovaného retroviru. Gen je pak vložen do genomu hostitelské buňky mechanismem retrovirové integrace, kde je pak buňkou epxrimován. Retrovirový vektor je modifikován tak, že neprodukuje virus, čímž je zabráněno virové infekci hostitele. Obecné principy takové terapie jsou odborníkům známy a jsou přehledně popsány v odborné literatuře (viz např. Kohn, D.B., et al., Transfusion 29: 812-820, 1989) .

Hybridní faktor VIII se může uchovávat navázaný na von Willebrandův faktor (vWf), aby se zvýšil poločas a doba skladovatelnosti hybridní molekuly, kromě toho lyofilizace faktoru VIII může zlepšit výtěžek aktivních molekul v přítomnosti vWf. Současné způsoby . skladování lidského a zvířecího faktoru VIII užívané komerčními dodavateli lze užít i k uskladnění hybridního faktoru VIII. K těmto metodám patří např. 1) lyofilizace faktoru VIII v částečně purifikovaném stavu, tj . jako tzv. koncentrát faktoru VIII, který se bez další purifikace podává infúzí, 2) imunoafinitní purifikace faktoru VIII Zimmermanovou metodou a lyofilizace v přítomnosti albuminu, která stabilizuje faktor VIII a 3) lyofilizace rekombinantního faktoru VIII v přítomnosti albuminu.

Kromě toho faktor VIII je stabilní nekonečně dlouho při 4°C v roztoku obsahujícím 0, 6M NaCl, 20mM MES a 5mM CaCl?, pH 6,0, a také může být uchováván jako zmražený v tomto pufru, kdy po roztátí dochází k minimální ztrátě aktivity.

Použití faktoru VIII k léčení

Hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII se užívá k léčení nekontrolovatelného krvácení v důsledku deficience faktoru VIII (napřu intraartikulárního, intrakraniálního nebo gastrointestinálního krvácení) u hemofiliků s inhibičními protilátkami nebo bez nich a u pacientů se získanou deficiencí faktoru VIII po rozvinutí inhibičních protilátek. Aktivní materiály jsou výhodně podávány intravenózně.

Kromě toho hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII může být podáván transplantací geneticky upravených buněk, které produkují hybridní faktor VIII, nebo implantací zařízení, které obsahuje takové buňky, jak již bylo zmíněno.

Ve výhodném provedení vynálezu farmaceutické přípravky obsahující hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII samotný nebo v kombinaci se stabilizátory, vehikuly a/nebo nosiči, jsou podávány pacientovi intravenózní infúzí stejným způsobem, jaký se užívá k infúzi lidského faktoru VIII.

Dávky přípravku hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII, které je třeba podávat pacientovi, který takové léčení potřebuje, kolísají v závislosti na závažnosti deficience faktoru VIII. Obecně je frekvence, trvání a velikost dávky nastavena v souladu se závažností a trváním krvácivé episody každého pacienta. Tudíž hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII je přítomen ve farmaceuticky přijatelném nosiči, vehikulu nebo stabilizátoru v množství dostatečném k tomu, aby pacientovi bylo podáno terapeuticky účinné množství hybridního faktoru VIII k zastavení krvácení, jak je měřeno standardními koagulačními testy.

Faktor VIII je klasicky definován jako látka přítomná v krevní plazmě, která napravuje defekt koagulace v plazmě jedince s hemofilií A. Koagulační aktivita in vitro purifikovaných a částečně purifikovaných forem faktoru VIII se užívá k výpočtu dávek pro infúze pacientům a je spolehlivým indikátorem aktivity obnovené v plazmě pacienta a nápravy jeho krvácení in vivo. Nebyly popsány žádné rozpory • · mezi standardními testy nových molekul faktoru VIII in vitro a jejich chováním při infúzích na psím modelu nebo u lidí (viz Lusher J.M. et al. , New England J. med. 328: 453-459,

Pittman, D.D. et al. , Blood 79: 389-397, 1992 a Brinkhous et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 8752-8755, 1985) .

Obvykle plazmatická hladina faktoru VIII, které je třeba dosáhnout u pacienta podáváním hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII, je v rozmezí 30 až 100 % normální hodnoty. Při výhodném způsobu podávání hybridního nebo hybridního ekvivalentního faktoru VIII se přípravek podává intravenózně ve výhodné dávce 5 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 10 až 50 a nejvýhodněji 20 až 40 jednotek/kg tělesné hmotnosti, s frekvencí 8 až 24 hodin (u silně postižených hemofiliků) a délkou trvání léčení 1 až 10 dnů nebo až do zastavení krvácení (viz např. Roberts H.R. a M.R. Jones, Hemophilia and related condit-ions - Congenital Deficinces of Prothrombin (Factor II, Factor IV and Factors

VII to XII), kapitola Hematology, Williams, W.J

153, s

al.

1453-1474, (ed.

1990’

1460, v: Pac i enti s inhibičními protilátkami vyžadují vyšší dávky hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII nebo pacienti vyžadují méně hybridního nebo ekvivalentního hybridního faktoru VIII vzhledem k jeho vyšší specifické aktivitě ve srovnání s lidským faktorem VIII nebo snížené reaktivitě s protilátkami nebo snížené imunogenícítě. Stejně jako při léčení lidským nebo prasečím faktorem VIII, množství ekvivalentního hybridního faktoru VIII je určeno na základě koagulačního testu a ve vybraných případech in vivo měřením faktoru VIII v plazmě pacienta po infúzi. Je třeba mít na zřeteli, že pro každého jednotlivého pacienta je třeba stanovit specifický dávkovači režim na základě jeho hybridního nebo podávané infúzi j ednofázového se určí obnova

individuální potřeby a dle profesionálního úsudku odborníka, který podává nebo dohlíží na podávání přípravku, a tedy že koncentrace uvedené zde slouží jen jako příklady a nijak neomezují použití přípravku podle předkládaného vynálezu.

Léčení může mít formu podávání jednotlivých intravenózních dávek přípravku nebo periodických nebo souvislých podávání po určité delší období v závislosti na potřebě. Alternativně hybridní nebo hybridní rekombinantní faktor VIII může být podáván subkutánně nebo perorálně pomocí liposomů v jedné nebo několika dávkách v různých časových intervalech.

Hybridní nebo hybridní rekombinantní faktor VIII může být užit také k léčení nekontrolovatelného krvácení způsobeného deficitem faktoru VIII u hemofiliků, u kterých se vyvinuly protilátky proti lidskému faktoru VIII. V takovém případě koagulační aktivita vyšší než koagulační aktivita lidského nebo zvířecího faktoru VIII není nutná. Koagulační aktivita i nižší než koagulační aktivita lidského faktoru VIII (tj . menší než 3000 jednotek/mg) je užitečná, pokud nedochází k její neutralizaci v plazmě pacienta.

Hybridní nebo ekvivalentní hybridní faktor VIII a způsoby jeho izolace, charakterizace, přípravy a použití dosud jen obecně popisované jsou pro lepší pochopení dále popsány formou příkladů, které však předmět vynálezu nijak neomezuj í.

• · ·· ·· » · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test prasečího faktoru VIII a hybridního prasečího/lidskéno faktoru VIII

Prasečí faktor VIII má na základě specifické aktivity molekuly větší koagulační aktivitu než lidský faktor VIII. Tyto výsledky jsou ukázány v tabulce III v přikladu 4. Tento závěr je založen na použití příslušných standardních křivek, které umožňují přímé srovnání lidského a prasečího faktoru VIII. Koagulační testy jsou založeny na schopnosti faktoru VIII zkrátit dobu srážlivosti plazmy pocházející od pacienta s hemofilií A. Byly použity dva typy testů: jednostupňový a dvoustupňový test.

V jednostupňovém testu se 0,1 ml plazmy od pacienta s hemofilií A (George King Biomedical, lne.) inkubovalo 5 minut ve 37 °C ve vodní lázni s 0, 1 ml reagencie pro aktivovaný parciální tromboplastinový test (APTT) (Organon Teknika) a 0,01 ml vzorku nebo standardu, který se skládal z naředěné citrátové normální lidské plazmy. Po inkubaci bylo přidáno 0,1 ml 20mM CaCl?, a vizuálně se určoval čas vzniku fibrinové sraženiny.

Jednotka faktoru VIII je definována jako množství přítomné v 1 ml citrátové normální lidské plazmy. Aktivita prasečího a lidského faktoru VIII se srovnávala přímo při použití lidské plazmy jako standardu. Ředění plazmatického standardu nebo purifikovaných proteinů se provádělo 0,15M NaCl, 0,02M HEPES, pH 7,4. Standardní křivka se konstruovala na základě 3 nebo 4 ředění plazmy, nejvyšší ředění bylo 1/50, vynesením logio koagulačního času do grafu • « ♦ ·

proti logio koncentraci v plazmě, což vedlo k vytvoření lineárního grafu. Jednotky faktoru VIII v neznámém vzorku se určovaly interpolaci z této standardní křivky.

Jednostupňový test spočívá v endogenní aktivaci faktoru VIII prostřednictvím aktivátorů tvořených v plazmě hemofilika Ά, zatímco dvoustupňový test měří prokoagulační aktivitu předem aktivovaného faktoru VIII. Ve dvoustupňovém testu jsou vzorky obsahující faktor VIII, který reagoval s trombinem, přidány ke směsi aktivovaného parciálního tromboplastinu a lidské plazmy hemofilika A, která byla předem inkubována 5 minut ve 37 °C. Výsledné koagulační časy pak byly konvertovány na jednotky/ml na základě stejné lidské standardní křivky popsané výše. Relativní aktivita ve dvoustupňovém testu byla vyšší než v jednostupňovém, protože faktor VIII byl předem aktivován.

Příklad 2

Charakteristika funkční odlišnosti mezi lidským a prasečím faktorem VIII

Izolace prasečího a z lidské plazmy pocházejíčího faktoru VIII a lidského rekombinantního faktoru VIII byla v literatuře popsána v práci autorů (Fulcher, C.A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 1648-1652, 1982, Toole et al., Nátuře, 312, 342-347, 1984, (Genetics Institute), Gitschier et al., Nátuře, 312, 326-330, 1984, (Genentech), Wood et al., Nátuře, 312, 330-337, 1984, (Genentech), -Vehar et al., Nátuře, 312, 337-342, 1984, (Genentech), Fass et al., Blood, 59, 594, 1982, Toole et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 5939-5942, 1986). To se může provádět' několika

způsoby. Co se týče složení podjednotek, všechny tyto izolace jsou podobné, přestože je ve stabilitě mezi lidským a prasečím faktorem VIII funkční rozdíl.

Pro srovnání lidského rekombinantního a prasečího faktoru VIII byly preparáty vysoce purifikovaného lidského rekombinantního faktoru VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) a prasečího faktoru VIII (imunologicky purifikovaného tak, jak je popsáno v práci Fass et al., Blood, 59, 594, 1982) podrobeny analýze vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na iontoměničové koloně (Pharmacia, lne.) Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) . Účelem kroku na HPLC Mono Q™ byla eliminace menších nečistot při změně pufru specifického pro lidský a prasečí faktor VIII na společný pufr pro účely srovnávání. Zkumavky obsahující 1000 až 2000 jednotek faktoru VIII byly rekonstituovány 5 ml H₂O. Pak byl přidán HEPES (2M, pH 7,4) do finální koncentrace 0,02 M. Faktor VIII byl pak nanesen na kolonu Mono Q™ HR 5/5 ekvilibrovanou 0,15M NaCl, 0,02 HEPES, 5mM CaCl₂, pH 7,4, (pufr A plus 0,15M NaCl), promyt 10 ml pufru A + 0,15M NaCl a eluován 20 ml lineárním gradientem 0,15M až 0,90M NaCl v pufru A při rychlosti průtoku 1 ml/minutu.

Pro srovnávání faktoru VIII pocházejícího z lidské plazmy (purifikovaného prostřednictvím Mono Q™ HPLC) a prasečího faktoru VIII, purifikovaného imunoafinitně, byl faktor VIII pocházející z prasečí plazmy naředěn 1:4 s 0, 04M HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, a podroben Mono Q™ HPLC ve stejných podmínkách, jak jsou popsané v předchozím odstavci pro lidský faktor Vin. Tyto postupy izolace lidského a prasečího faktoru VIII jsou pro odborníka standardními postupy.

Frakce z kolon byly testovány na aktivitu faktoru VIII prostřednictvím jednostupňového koagulačního testu. Průměrné • ·« · · • · výsledky testů vyjádřené v jednotkách aktivity na A₂₉₀materiálu jsou uvedeny v tabulce II, a ukazují, že prasečí faktor VIII má při použití jednostupňového testu alespoň šestkrát větší aktivitu než lidský faktor VIII.

Tabulka II

Srovnání koagulační aktivity lidského a prasečího faktoru VIII

Faktor VIII	Aktivita (U/A280)
Prasečí	21 300
Pocházející z lidské plazmy	3 600
Lidský rekombinantní	2 400

Příklad 3

Srovnání stability lidského a prasečího faktoru VIII

Výsledky jednostupňového testu pro faktor VIII jsou odrazem aktivace faktoru VIII na faktor Vlila ve vzorku a možné ztráty aktivity vytvářeného faktoru Vlila. Bylo prováděno přímé srovnání stability lidského a prasečího faktoru VIII. Vzorky z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, lne., Piscataway, N.J.) byly naředěny na stejnou koncentraci a složení pufru a ponechaly se reagovat s trombinem. V různé časy byly vzorky přeneseny do dvojstupňového koagulačního testu. Typicky byla vrcholná aktivita (ve 2 minutách) 10 krát větší u prasečího faktoru Vlila než u lidského faktoru Vlila, a potom se aktivity obou faktorů Vlila, prasečího i lidského, snižovaly, přičemž aktivita lidského faktoru Vlila klesala rychlej i.

• · • ·

• · · · • « • · • « • ·

Obecně pokusy izolovat stabilní lidský faktor Vlila nejsou úspěšné, dokonce i když jsou použity podmínky, ve kterých vzniká stabilní prasečí faktor Vlila. Aby se toto prokázalo, byl lidský faktor VIII purifikovaný na Mono Q™ HPLC aktivován trombinem a podroben kationtoměničové (Pharmacia, lne.) Mono S™ HPLC v podmínkách, ve kterých se tvoří stabilní prasečí faktor Vlila, jak je popsáno autory Lollar et al. (Biochemistry, 28, 666, 1989) .

Lidský faktor VIII, 43 pg/ml (0,2 μΜ) v 0,2M NaCl, 0/01M HEPES, 2,5mM CaCl₂, v pH 7,4, v celkovém objemu 10 ml, se nechal reagovat s trombinem (0,036 μΜ) 10 minut, v této době byl přidán FPR-CH₂C1 D-fenylprolylarginylchlormetylketon do koncentrace 0,2μΜ pro ireverzibilní inaktivaci trombinu. Směs se pak naředila morfolino)etansulfonovou kyselinou (MES) a nanesla rychlostí 2 ml/minutu na koloi (Pharmacia, lne.) ekvilibrovanou 5mM MEí (pufr B) a 0,lM NaCl. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony s 20 ml gradientu 0,lM NaCl až 0, 9M NaCl v pufru B rychlostí 1 ml/min.

V těchto podmínkách byla ve dvoustupňovém testu eluována frakce s koagulační aktivitou jako jeden vrchol. Specifická aktivita vrcholové frakce byla přibližně 7 500 U/A₂₈o.

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) vrcholové frakce Mono S™ faktoru Vlila, po které následovalo barvení proteinu stříbrem, odhalila dva pásy odpovídající heterodimerickému (A3-C1-C2/A1) derivátu faktoru VIII. Ačkoliv díky nízké koncentraci nebyl identifikován barvením stříbrem za těchto podmínek fragment A2, byl identifikován jako stopová složka pomocí značení ¹²⁵I.

Na rozdíl od výsledků s lidským faktorem VIII měl prasečí faktor Vlila izolovaný prostřednictvím Mono S™ HPLC

1 :	5 4 OmM	2	- (N-
5mM	CaC1₂,	v	pH	6, 0
Mono	S™ HR	5/5	HPLC
5mM	CaCl₂,	v	pH	6, 0

za stejných podmínek specifickou aktivitu 1,6 x 10° U/A₂q₀Analýza prasečího faktoru Vlila prostřednictvím SDS-PAGE odhalila 3 fragmenty odpovídající podjednotkám Ai, A2 a A3-C1-C2, což dokazuje, že prasečí faktor Vlila má tři podj ednotky.

Výsledky analýzy Mono S™ HPLC preparátů lidského faktoru VIII aktivovaného trombinem v pH 6,0 ukazují, že lidský faktor Vlila je labilní v podmínkách, které poskytují stabilní prasečí faktor Vlila. A1& ačkoliv bylo ve vrcholové frakci identifikováno stopové množství fragmentu A2, nebylo možné z této metody samotné určit, zda koagulační aktivita byla důsledkem malého množství heterotrimerického faktoru Vlila nebo heterodimerického faktoru VIII, který má nízkou specifickou aktivitu.

Aby se vyřešila tato otázka, je žádoucí izolovat lidský faktor Vlila před tím, než ztratí svou podjednotku A2. Za tím účelem se prováděla izolace podle postupu, který zahrnoval snížení pH pufrů Mono S™ na pH 5. Lidský faktor VIII purifikovaný Mono Q™ (0,5 mg) byl naředěn H?O za vzniku konečné koncentrace 0,25 mg/ml (1 μΜ) faktoru VIII v 0,25M NaCl, 0,01M HEPES, 2,5mM CaCl₂, 0, 005% Tween-80, ' pH 7,4, (celkový objem 7,0 ml) . Trombin byl přidán do konečné koncentrace 0,072 μΜ a 3 minuty ponechán reagovat. Trombin byl pak inaktivován FPR-CH2C1 (0,2 μΜ) . Směs se pak naředila 1:1 40mM acetátem sodným, 5mM CaCÍ2, 0,01% Tween-80, pH 5,0, a nanesla rychlostí 2 ml/minutu na kolonu Mono S™ HR 5/5 HPLC ekvilibrovanou 0,01M acetátem sodným, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 5,0, a 0,lM NaCl. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony s 20 ml gradientu 0,lM NaCl až l,0M NaCl ve stejném pufru rychlostí 1 ml/minutu. To mělo za následek obnovu koagulační aktivity ve vrcholu, který obsahoval detekovatelné množství fragmentu A2, jak ukázáno pomocí ··

SDS-PAGE a barvení stříbrem. Specifická aktivita vrcholové frakce byla desetkrát větší než frakce získané v pH 6, 0 (75 000 U/A₂so proti 7 500 U/A_23ů) . Ale na rozdíl do prasečího faktoru Vlila izolovaného v pH 6,0, který je trvale stabilní ve 4 °C, aktivita lidského faktoru Vlila klesala rovnoměrně po dobu několika hodin po eluci z kolony Mono S™. Navíc specifická aktivita faktoru Vlila purifikovaného v pH 5,0 a okamžitě testovaného je pouze 5 % aktivity prasečího faktoru Vlila, což svědčí pro to, že před testem nastala podstatná disociace.

Tyto výsledky dokazují, že jak lidský tak prasečí faktor Vlila jsou složeny ze tří podjednotek (Al, A2 a A3-C1-C2) . Disociace podjednotky A2 je za určitých podmínek, jako je fyziologická iontová síla, pH a koncentrace, odpovědná za ztrátu aktivity jak lidského tak prasečího faktoru Vlila. Relativní stabilita prasečího faktoru Vlila za určitých podmínek je způsobena silnější asociací podjednotky A2.

Příklad 4

Příprava hybridního lidského/prasečího faktoru VIII rekonstitucí podjednotek

Lehké řetězce prasečího faktoru VIII a těžké řetězce faktoru VIII byly izolovány následujícím způsobem. K prasečímu faktoru VIII purifikovanému pomocí Mono Q™ byl přidán 0,5M roztok EDTA, pH 7,4, do konečné koncentrace 0,05M a byl ponechán při teplotě místnosti 18-24 hodin. Byl přidán stejný objem lOmM histidin-Cl, lOmM EDTA, 0,2% (objem.) Tween 80, pH 6,0 (pufr Β), a roztok byl nanesen rychlostí 1 ml/minutu na kolonu Mono S™ HR 5/5 předem ekvilibrovanou • · pufrem A

0,25M NaCl. Těžké ř« iktoru VIII lineárního i ml/minutu nenavázaly na pryskyřici, jak bylo vyhodnoceno .pomocí SDSPAGE. Lehký řetězec faktoru VIII byl eluován pomocí 20 ml gradientu 0,l-0,7M NaCl v pufru A rychlostí a byl homogenní na SDS-PAGE. Těžké řetězce faktoru VIII byly izolovány prostřednictvím Mono Q™ HPLC (Pharmacia, lne., Piscataway, N.J.) následujícím způsobem. Těžké řetězce faktoru VIII se neadsorbují na Mono S™ během purifikace lehkých řetězců faktoru VIII. V látce prošlé kolonou, která obsahovala těžké řetězce faktoru VIII, bylo upraveno pH na 7,2 přidáním 0,5M pufru HEPES, pH 7,4, a byla nanesena na kolonu Mono Q™ HR 5/5 HPLC (Pharmacia, lne.) ekvilibrovanou 0, IM NaCl, 0,02M HEPES, 0,01% Tween-80, pH 7,4. Kolona byla promyta 10 ml tohoto pufru a těžké řetězce faktoru VIII byly eluovány 20 mi gradientu 0,l-l,0M NaCl v tomto pufru. Lidské lehké řetězce a těžké řetězce byly izolovány stejným způsobem. Lidské a prasečí řetězce byly lehké a těžké rekonstituovány podle následujících kroků. 10 μί lehkého řetězce lidského nebo prasečího faktoru VIII, 100 pg/ml, bylo smícháno v IM NaCl, 0,02M HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, s 1) 25 pi heterologního těžkého řetězce, 60 pg/ml, ve stejném pufru, 2) 10 μί 0,02M HEPES, 0,01% Tween-80, pH 7,4, a 3) 5 pl 0,6M CaCl₂, po dobu 14 hodin při teplotě místnosti. Směs byla naředěna 1/4 0,02M MES, 0,01% Tween-80, 5mM CaCl₂, pH 6, a nanesena na kolonu Mono S™ HR 5/5 ekvilibrovanou 0,IM NaCl, 0,02M MES, 0,01% Tween-80, 5mM CaCl₂, pH 6,0. 20 ml gradient byl puštěn s 0,l-l,0M NaCl ve stejném pufru rychlostí 1 ml/minutu' a sbíraly se 0,5 ml frakce. Ve 280 nm se odečítala absorbance frakcí a frakce se testovaly pomocí měření absorbance na aktivitu faktoru VIII jednostupňovým koagulačním testem. Těžké řetězce se

Těžké řetězce • · » ί • · • · · vyskytovaly v nadbytku, protože volný lehký řetězec (neasociovaný s těžkým řetězcem) také váže Mono S™, nadbytek těžkých řetězců zajišťuje, že částí preparátu nejsou volné lehké řetězce. Rekonstituční pokusy následované puriřikací Mono S™ HPLC byly prováděny se všemi čtyřmi možnými kombinacemi řetězců: lidský lehký řetězec/lidský těžký řetězec, lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec, prasečí lehký řetězec/prasečí těžký řetězec, prasečí lehký řetězec/ lidský těžký řetězec. Tabulka III ukazuje, že faktor VIII kombinující lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec má aktivitu srovnatelnou s nativním prasečím faktorem VIII (tabulka II) , což ukazuje, že strukturální prvky prasečího těžkého řetězce jsou odpovědné za zvýšenou koagulační aktivitu prasečího faktoru VIII ve srovnání s lidským faktorem VIII.

Tabulka III

Srovnání koagulační aktivity hybridního lidského/prasečího faktoru VIII s lidským a prasečím faktorem VIII

	Aktivita (U/A^go)
Prasečí lehký řetězec/prasečí těžký řetězec	30 600
Lidský lehký řetězec/prasečí těžký řetězec	44 100
Prasečí lehký řetězec/ lidský těžký řetězec	1 100
lidský lehký řetězec/lidský těžký řetězec	1 100

Příklad 5

Příprava aktivního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII rekonstitucí domén

Z prasečí nebo lidské krve byl izolován prasečí dimer A1/A3-C1-C2, prasečí doména Ά2, lidský dimer A1/A3-C1-C2 a lidská doména A2, podle metody popsané v práci autorů Loilar et al. (J. Biol. Chem., 267(33), 23 652-23657,.1992).

Například, aby se izoloval prasečí dimer A1/A3-C1-C2, bylo zvýšeno pH prasečího faktoru Vlila (140 pg) z pH 6,0 na pH 8,0 přidáním 5N NaOH po dobu 30 minut, za vzniku disociované domény A2 a 95% inaktivace při koagulačním testu. Směs byla naředěna 1:8 pufrem B (20mM HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4) a nanesena na kolonu Mono S™ ekvilibrovanou v pufru B. Dimer A1/A.3-C1-C2 byl eluován jako jeden ostrý vrchol v přibližně 0,4M NaCl při použití gradientu 0,l-l,0M NaCl v pufru B. Pro izolaci prasečí domény A,2 byl získán prasečí faktor VIII podle metody autorů Loliar et al. (Biochem., 28, 666-674, 1989), začínalo se s 0,64 mg faktoru VIII. Volná prasečí doména A2 byla izolována jako minoritní složka (50 pg) v 0,3M NaCl na chromatogramu Mono S^m.

Hybridní prasečí/lidské molekuly faktoru VIII byly rekonstituovány z dimerů a domén následujícím způsobem. Koncentrace a podmínky pufrů byly tyto: prasečí A2, 0,63 pM v pufru A. (5mM MES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 6,0) a 0,3M NaCl, prasečí A1/A3-C1-C2, 0,27 pM v pufru B a 0,4M NaCl, pH 7,4, lidská A2, lpM v 0,3M NaCl, lOmM histidin-HCl, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-20, pH 6,0, lidský A1/A3-C1-C2, 0, 18pM v 0,5M NaCl, lOmM histidin-Cl, 2,5mM CaCl₂, 0,1% Tween-20, pH 6,0. Rekonstituční pokusy se > · · 4 ► · · <

» · · 4 • · · · prováděly smísením stejných objemů domény A2 a dimeru A1/A3C1-C2. Ve směsných pokusech s prasečím dimerem A1/A3-C1-C2 bylo pH sníženo na β,0 přidáním 0,5M MES, pH 6,0, na 70mM.

Koagulační aktivity všech čtyř možných hybridních molekul faktoru Vlila - [pA2/(hAl/A3-Cl-C2Π , [hA2/(pAl/A3C1-C2) ], [pA2/(pAl/A3-Cl-C2) ] a [hA2/(hAl/A3-Cl-C2) ] - byly zjištěny pomocí dvoustupňového koagulačního testu v různých časech.

Vytvoření aktivity po smíchání domén A2 a dimerů A1/A3C1-C2 bylo téměř kompletní po jedné hodině a bylo stabilní po přinejmenším 24 hodin při 37 °C. Tabulka IV ukazuje aktivitu rekonstituovaných hybridních molekul faktoru Vlila, když byly testovány v 1 hodině. Dvoustupňový test, kterým byly získány specifické aktivity molekul faktoru Vlila, se liší od jednostupňového testu a hodnoty nemohou být srovnány s hodnotami aktivity molekul faktoru VIII získanými jednostupňovým testem.

Tabulka IV

Srovnání koagulačních aktivit hybridního lidského/prasečího faktoru Vlila se substituovanou doménou

Hybridní fVIIIa	Specifická aktivita (U/mg)
Prasečí A2 + lidský A1/A3-C1-C2	140 000
Prasečí A2 + prasečí A1/A3-C1-C2	70 000
Lidská A2 + prasečí A1/A3-C1-C2	40 000
Lidská A2 + lidský A1/A3-C1-C2	40 000

Tabulka IV ukazuje, že největší aktivitu vykazovaly prasečí doména A2/lidský dimer A1/A3-C1-C2, po kterém následovaly prasečí doména A2/prasečí dimer A1/A3-C1-C2.

• ·

Když byla doména A2 prasečího faktoru Vlila spojena s dimerem A1/A3-C1-C2 lidského faktoru Vlila, bylo tedy dosaženo koagulační aktivity. Dále bylo dosaženo koagulační aktivity, když byla spojena doména A.2 lidského faktoru Vlila s dimerem A1/A3-C1-C2 prasečího faktoru Vlila. Samotné oblasti A2, Al a A3-C1-C2 neměly koagulační aktivitu.

Příklad 6

Izolace a sekvencování domény A2 prasečího faktoru VIII

Pouze nukleotidová sekvence kódující doménu B a část domény A2 prasečího faktoru VIII byly dříve sekvencovány (Toole et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 5939-5942, 1986). Zde jsou popsány cDNA. a predikované aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 3 a 4) pro celou doménu A2 prasečího faktoru VIII.

Doména A2 prasečího faktoru VIII byla klonována pomocí reverzní transkripce z celkové RNA. prasečí sleziny a pomocí amplifikace PCR (polymerázovou řetězovou reakcí), byly použity degenerované primery založené na známé sekvenci cDNA lidského faktoru VIII a přesný prasečí primer založený na části sekvence prasečího faktoru VIII. Byl izolován produkt PCR o velikosti 1 kb a byl amplifikován pomocí inzerce do fagemidového vektoru Bluescript™ (Stratagene).

Prasečí doména A2 byla kompletně sekvencována prostřednictvím dideoxynukleotidového sekvencování. cDNA a predikované aminokyselinové sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 3 a 4, v daném pořadí.

• · ·· ·· ·· • ·· · · ·· · • · ·· · · · · • · · · » · • « ·· ·· ··

Příklad 7

Příprava rekombinantního hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII

Nukleotidová a predikované aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 1 a 2) lidského faktoru VIII byly popsány v literatuře [Toole et al., Nátuře, 312, 342-347, 1984, (Genetics Institute), Gitschier et al. , Nátuře, 312, 326-330, 1984, (Genentech) , Wood et al., Nátuře, 312, 330-337, 1984, (Genentech), Vehar et al., Nátuře, 312, 337-342, 1984, (Genentech)].

Vytvoření rekombinantního hybridního lidského/zvířecího faktoru VIII vyžaduje odstranění cDNA oblasti lidského faktoru VIII (Biogen Corp.) a vložení zvířecí sekvence cDNA, která má určitou sekvenční identitu. Pak je hybridní cDNA exprimována v příslušném expresním systému. Lze uvést příklad, kdy byly klonovány cDNA hybridního faktoru VIII, ve kterých některé nebo všechny lidské sekvence A2 byly nahrazeny odpovídajícími prasečími doménami A.2. Nejprve byla vystřižena celá sekvence cDNA odpovídající doméně A2 lidského faktoru VIII, a pak menší část domény A2 pomocí oligonukleotidem zprostředkované mutageneze, metody odborníkovi obecně známé (viz např. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, kapitola 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989) . Jednotlivé kroky celého postupu byly prováděné následujícím způsobem.

Materiál

Metoxykarbony1-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-pnitroanilid (Spectrozyme™ Xa) a monoklonální protilátky anti• · • · • · « · · · · · · · · · ···· ···· ·♦·· • · · · · · · ····· ·· · • · · · ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· faktor VIII ESH4 a ESH8 byly zakoupeny od firmy American Diagnostica (Greenwich, CT). Unilamelární (jednovrstevné) fosfatidylcholin/fosfatidylserinové (75/25, hmot.) vezikuly byly připraveny podle metody autorů Barenholtz, Y, et al. (Biochemistry, 2806-2810, 1977). Přípravek rekombinantního desulfatohirudinu byl získán od Dr. R.B. Wallise, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA) . Prasečí faktory IXa, X, Xa a trombin byly izolovány podle metod autorů Lollar et al. (Blood, 63, 1303-1306, 1984) a Duffy, E.J., et al. (J. Biol.

Chem., 207, 7621-7827, 1992). Čistý rekombinantní lidský faktor VIII bez albuminu byl získán od firmy Baxter-Biotech (Deerfield, IL).

Klonování domény A2 prasečího faktoru VIII cDNA kódující prasečí doménu Ά2 byla získána po PCR reverzně transkribované mRNA z prasečí sleziny izolované podle popisu autorů Chromczynski et al. (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987) . cDNA byla připravena s použitím soupravy pro syntézu cDNA (First-strand cDNA Synthesis Kit) s náhodnými hexamery jako primery (Pharmacia, Piscataway, N.J.). PCR se provádělo s použitím degenerovaného 5' koncového primeru:

5'-AARCAYCCNAARACNTGGG-3' (sekvence id. č. 11) založeném na krátké známé aminokyselinové sekvenci prasečí A2 a s použitím 3' koncového přesného primeru 5'-GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC-3 ' (sekvence id. č. 12), založeném na známé prasečí sekvenci DNA bezprostředně 3' od prasečí domény A2. Tyto oligonukleotidy odpovídají’ nukleotidům 1186-1203 a 2289-2313 v lidské sekvenci (sekvence id. č. 1). Amplifikace se prováděla 35 cyklů (1 minuta 94 °C, 2 minuty 50 °C, 2 minuty 72 °C) s použitím Taq DNA polymerázy (Promega Corp, Madison, WI) . Amplifikovaný fragment o velikosti 1,1 kb byl klonován do pBluescript II KS- (Stratagene) v místě EcoRV s použitím v obou směrech Biochemical Corp Arlington Hts, postupu s T-vektorem, jak je popsán autory Murchuk, D., et al. (Nucl. Acids Res., 19, 1154, 1991). Byly transformovány kompetentní buňky Escherichia coli XLl-Blue a byla izolována plazmidová DNA. Sekvencování se provádělo použitím Sequenase™ verze 2.0 (U.S.

Division of Amersham LifeScience, lne., IL). Tato sekvence byla ověřena prostřednictvím totožné sekvence, která byla získána přímým sekvencováním produktu PCR z nezávislé reverzní transkripce RNA ze sleziny z téhož prasete (CircumVent™, New England Biolabs, Beverly, MA) . Oblast obsahující epitop pro autoprotilátku RC byla identifikována jako 373-536 v lidském faktoru VIII (sekvence id. č. 2) .

Konstrukce a exprese cDNA. hybridního lidského/prasečího faktoru VIII·

Lidský faktor VIII bez domény Β (HB, Biogen, lne., Cambridge, MA) , který nemá sekvence kódující aminokyselinové zbytky 741-1648 (sekvence id. č. 2), byl použit jako výchozí materiál pro konstrukci hybridního lidského/prasečího.faktoru VIII. HB byl klonován do expresního vektoru ReNeo. Aby se usnadnila manipulace, byla cDNA. faktoru VIII izolována jako fragment Xhol/Hpal z ReNeo a klonována do pBlueScript II KS štěpeného Xhol/EcoRV. Oligonukleotid 5'-CCTTCCTTTATCCAAATACG TAGATCAAGAGGAAATTGAC-3' (sekvence id. č. 7) byl použit v reakci pro místně cílenou mutagenezi při použití fágové DNA obsahující uráčil, jak je popsáno autory Kunkel, T.A. et al. (Meth. Enzymol., 204, 125-139, 1991), aby současně vystřihl lidskou sekvenci A2 (nukleotidy 1169-2304 ze sekvence id. č. 1) a vnesl restrikční místo SnaBI. Plazmid obsahující lidský faktor VIII bez domény A2 byl naštěpen se SnaBI, po čemž následovalo přidání linkerů Clal. Prasečí doména A2 pak byla amplifikována pomocí PCR při použití fosforylovaného 5' primeru (sekvence id. č. 8):

5'-GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG-3' a 3' primeru (sekvence id. č. 9) :

5'-GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC-3'.

K produktu PCR byly přidány linkery Clal, po čemž následovala ligace do vektoru obsahujícího lidský faktor VIII. Spojení A1/A2 a A2/A3 byla opravena, aby se obnovily přesné sekvence pro štěpení trombinem a hraniční sekvence, ' pomocí místně cílené mutageneze s použitím oligonukleotidu uvedeného v sekvenci id. č. 8 a nukleotidů 1-22 (5' GAA..TTC ze sekvence id. č. 9) pro korekci 5' a 3' koncových spojení. Ve výsledném konstruktu označeném HP1 byla lidská doména A2 přesně nahrazena prasečí doménou A2. Předběžný produkt obsahoval nežádoucí thymidinn ve spojení A1-A2 jako důsledek PCR amplifikace prasečí domény A2. Tato jedna báze byla vystřižena při použití mutagenního oligonukleotidu 5'-CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG-3' (sekvence id. č. 10). Výsledná hybridní nukleotidová sekvence kódovala aktivní faktor VIII mající lidskou doménu Al, prasečí doménu A2 a lidské domény A3, Cl a C2.

Oblast obsahující 63 % NH₂-koncové prasečí domény A2, která obsahuje předpokládaný epitop A2, nahradila homologní lidskou sekvenci v cDNA bez domény B tak, že se vyměnily fragmenty Spel/BamHI mezi plazmidy pBlueScript, které obsahovaly cDNA lidského faktoru VIII a cDNA lidského/prasečí A2 faktoru VIII. Sekvence byla ověřena sekvencováním domény A2 a míst sestřihu. Nakonec byl fragment Spel/Apal obsahující celou sekvenci A2 dosazen na odpovídající místo v sekvenci HB~ za vzniku konstruktu HP2.

Přechodná exprese HB a HP2 v buňkách COS-7 byla testována po transfekci DNA - zprostředkované DEAE-dextraném, · · · • · · · • · · · • · · · • · · · · · · • · · ·· · · jak je popsáno autorem Seldon, R.F. (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. , editor, 9.21-9.36, Wiley Interscience, N.Y.). Poté, co byla ověřena exprese aktivního faktoru VIII a byly provedeny předběžné inhibiční studie s protilátkou, byla HB’ a HP2 DNA trvale transfekována do fetálních buněk ledvin křečka při použití transfekce zprostředkované lipozomy lne., Gaithersburg, MD).

(Lipofectin® Life Technologies, Klony obsahující plazmidy byly selektovány na rezistenci na G418 v médiu F12 podle Eagla modifikovaného Dulbeccem, s 10% fetálním telecím sérem (DMEMF12/10% fetální telecí sérum), obsahujícím 400 pg/ml G418, po čemž následovalo pěstování v DMEM-F12/10% fetálním telecím séru obsahujícím 100 pg/ml G418. Kolonie vykazující maximální expresi aktivity HB’ a HP2 faktoru VIII byly selektovány pomocí kruhového klonování a množeny pro další charakterizaci.

Exprese HB' faktoru VIII a HP2 faktoru VIII byla srovnávána prostřednictvím testu faktoru VIII bez plazmy, jednostupňovým koagulačním testem a testem ELISA při použití purifikovaného rekombinantního lidského faktoru VIII jako standardu. Pro HB' a HP2 byly dosaženy specifické koagulační aktivity 2600 a 2580 jednotek/mg, v daném pořadí. HB’ a HP2 produkovaly 1,2 a 1,4 jednotek/ml/48 hodin/10⁷ buněk. To je totožné s konstruktem divokého typu (2600 ± 200 jednotek/mg). V testu faktoru VIII bez plazmy byly specifické aktivity HB’ a HP2 nerozeznatelné.

Biologická aktivita rekombinantního hybridního lidského/zvířecího a odpovídajícího faktoru VIII se substitucemi domén Al, A2, A3, Cl a/nebo C2 může být vyhodnocena nejprve při použití přechodného expresního systému se savčími buňkami COS. Hybridní lidská/zvířečí a odpovídající cDNA může být transfekována do buněk COS • · • · • · ···· ···· ·♦·· ···· ···· ···· • ·· · · · ······ ·· · ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· a supernatanty mohou být analyzovány na aktivitu faktoru VIII při použití jednostupňového a dvoustupňového koagulačního testu, jak je popsáno výše. Navíc aktivita faktoru VIII může být měřena při použití testu s chromogenním substrátem, což je citlivější a umožňuje analýzu velkého množství vzorků. Podobné testy jsou standardní v testování aktivity faktoru VIII (Wood et al., Nátuře, 312, 330-337, 1984, Toole et al.,

Nátuře, 312, 342-347, 1984). Exprese rekombinantního faktoru

VIII v buňkách COS je také standardní postup (Toole et al. , Nátuře, 312, 342-347, 1984, Pittman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 2429-2433, 1988).

cDNA. lidského faktoru VIII použitá jako výchozí materiál pro rekombinantní molekuly zde popsané byla exprimována v buňkách COS za vzniku produktu s biologickou aktivitou. Tento materiál, jak je popsáno výše, může být použit jako standard ke srovnávání hybridních lidských/zvířecích molekul faktoru VIII. Aktivita v testech je přeměněna na specifickou aktivitu pro řádné srovnávání hybridních molekul. Za tímto účelem je nezbytné měření množství faktoru VIII tvořeného buňkami a může se provádět pomocí imunotestu s purifikovaným lidským a/nebo zvířecím faktorem VIII jako standardy. Imunotestv pro faktor VIII jsou pro odborníka rutinním postupem (viz např. Lollar et al., Blood, 71, 137-143, 1988).

Příklad 8

Určování inhibiční aktivity u hybridního lidského/zvířecího a ekvivalentního faktoru VIII

Sekvence lidského a zvířecího faktoru VIII přicházející v úvahu jako' epitopy (tj . jako rozpoznávací místa pro • · • 4

4

4 • 4 4 4 být tvořeny a odstranění inhibiční protilátky, které reagují s faktorem VIII) mohou být určovány s použitím rutinních postupů, například použitím testu s protilátkami k faktoru VIII spojeným s technikami místně cílené mutageneze, jako je metoda SOE, jak je ukázáno níže. Mohou být identifikovány sekvence zvířecího faktoru VIII, které nejsou antigenní ve srovnání s odpovídajícími antigenními lidskými sekvencemi, a mohou substituce pro vnesení zvířecích sekvencí lidských sekvencí podle standardních metod rekombinantní DNA. Sekvence aminokyselin, jako jsou alaninové zbytky, které nemají žádnou známou identickou sekvenci s faktorem VIII, mohou být také substituovány standardními metodami rekombinantní DNA nebo alaninovou skenovací mutagenezí. Prasečí faktor VIII reaguje s některými inhibičními protilátkami slaběji než lidský faktor VIII, což poskytuje základnu pro současnou léčbu pacientů inhibitory. Poté, co jsou vytvořeny rekombinantní hybridy, mohou být testovány in vitro na reaktivitu rutinními testy, včetně inhibitorového testu Bethesda. Tyto konstrukty, které jsou méně reaktivní než nativní lidský faktor VIII a nativní zvířecí faktor VIII jsou kandidáty pro substituční léčbu.

Má se za to, že epitopy, proti kterým je namířena většina (ne-li všechny) inhibičních protilátek reaktivních s lidským faktorem VIII, jsou umístěny ve dvou oblastech v molekule lidského faktoru VIII o 2332 aminokyselinách, doméně A2 (aminokyselinové zbytky 373-740) a doméně C2 (aminokyselinové zbytky 2173-2332, obě sekvence uvedené v sekvenci id. č. 2) . Epitop A2 byl eliminován tvořením rekombinantního hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, ve kterém je část lidské domény A2 nahrazena prasečí sekvencí, která má sekvenci shodnou s nahrazenou lidskou aminokyselinovou sekvencí. To bylo provedeno, ják je popsáno • · v příkladu 7, klonováním prasečí domény A2 standardními technikami molekulární biologie, a pak štěpením a sestřihem v doméně A2 s použitím restrikčních míst. Ve výsledném konstruktu označeném HP2, byly zbytky 373-604 (sekvence id. č. 4) prasečího faktoru VIII substituovány do lidské domény A2. HP2 byl testován na imunoreaktivitu s protilátkami proti lidskému faktoru VIII s použitím následujících metod.

Test ELISA na faktor VIII

Jamky mikrotitrační destičky byly povlečeny 0,15 ml 6 pg/ml ESH4, protilátky proti lehkému řetězci lidského faktoru VIII, a inkubovány přes noc. Poté byla destička třikrát promyta H₂O, jamky byly blokovány 1 hodinu roztokem 0,15M NaCl, lOmM fosfát sodný, 0,05% Tween 20, 0,05% netučné sušené mléko, 0,05% azid sodný, pH 7,4. Aby se zvýšila senzitivita, byly vzorky obsahující faktor VIII 15 minut aktivovány 30nM trombinem. Aby se inhiboval trombin, byl pak přidán rekombinantní desulfatohirudin. Destička byla opět promyta a bylo přidáno 0,1 ml vzorku nebo čistého rekombinantního lidského faktoru VIII (10—600 ng/ml) jako standardu. Po 2 hodinách inkubace byla destička promyta a do každé jamky bylo přidáno 0,1 ml biotinylované ESH8, další protilátky proti lehkému řetězci lidského faktoru VIII. ESH8 byla biotinylována s použitím biotinylační soupravy firmy Pierce se sulfosukcinimidyl-6-(biotinamid)hexanoátem. Po 1 hodině inkubace byla destička promyta a do každé jamky bylo přidáno 0,1 ml streptavidinu s alkalickou fosfatázou. Destička byla vyvolána při použití soupravy firmy Biorad se substrátem reagujícím s alkalickou fosfatázou a výsledná absorbance se určovala ve 405 nm pro každou jamku při použití čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky Vmax (Molecular Devices, lne., Sunnyville, CA). Neznámé koncentrace faktoru • · · · · · • · · · · • · · · · • ·· ··· ······ ·· · ···· ·· · ····

VIII se určovaly z lineární části standardní křivky pro faktor VIII.

Testy faktoru VIII

HB- faktor VIII a HP2 faktor VIII byly testovány v jednostuptnovém koagulačním testu, který byl proveden jak bylo již dříve popsáno (Bowie, E.J.W. a C.A.Owen, Disorders of Hemostasis, Ratnoff a Forbes, ed., s. 43-72, Grunn & Stratton, lne., Orlando, FL, 1984) nebo testem bez plazmy, jak je dále popsáno. Vzorky HB- a HP2 faktoru VIII byly aktivovány 40nM trombinem v pufru obsahujícím 0,15mM NaCl, 20mM HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, v přítomnosti lOnM faktoru IXa, 425nM faktoru X a 50 μΜ j ednovrstevných fosfatidylserin-fofstatidylcholinových (25/75hmot.) vesikulů. Po pěti minutách byla reakce zastavena 0, 05 M EDTA a lOOmM rekombinantního desulfatohirudinu a výsledný faktor Xa byl měřen testem s chromogenním substrátem způsobem, který popsali Hill-Eubanks et al., J. Biol. Chem. 265: 17854-17858. Za těchto podmínek bylo množství vytvářeného faktoru Xa lineárně úměrné počáteční koncentraci faktoru VIII, jak lze soudit podle purifikovaného rekombinantního faktoru VIII (Baxter Biotech, Deerfield, IL) užitého jako standard.

Před koagulačním testem byly vzorky HB- a HP2 faktoru VIII koncentrovány ze 48 hodin kondiciovanéno média užitím chromatografie s heparin-Sepharose na koncentraci 10 až 15 jednotek/ml. HB- nebo HP2 faktor VIII se přidal k plazmě s hemofilii A (George King Biomedical), aby byla finální koncentrace 1 jednotka/ml. Titry inhibitoru v RC nebo MR plazmě nebo v zásobním roztoku byly měřeny Bethesda testem, jak to popsali Kasper, C.K. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 869-872, 1975. Inhibitorový IgG byl připraven podle

Leyte/A., et al., J. Biol. Chem. 266: 740-746, 1991.

• to ·· i · · » to toto » ·· » ·· • to ·· • to ··· · ·····

HP2 faktor VIII nereagoval s protilátkami anti-A2. Tudíž zbytky 373-603 musí obsahovat epitop pro anti-A2 protilátky.

Příprava hybridního lidského/prasečího faktoru VIII a testy pomocí metody sestřihu překrývající se extenzí (SOE)

Byly připraveny další molekuly prokoagulačního rekombinantního hybridní lidského/prasečího faktoru VIII bez domény B, kde je lidský úsek domény A2 nahrazen prasečími aminokyseliny, aby byl dále úžeji definován epitop A2. Kromě metody restrikčních míst byla užita metoda sestřihu překrývající se extenzí, SOE, jak ji popsali Ho et al., Gene 77: 51-59, 1989, aby se nahradil jakýkoliv zvolený úsek cDNA. prasečího faktoru VIII. Při metodě SOE je sestřihové místo definováno překrývajícími se oligonukleotidy, které lze amplifikovat a vytvořit požadovanou cDNA. pomocí PCR. Byly tak připraveny cDNA konstrukty označené postupně HP4 až HP13. Byly vloženy do expresního vektoru ReNeo, stabilně transfekovány do fetálních ledvinných buněk křečka a exprimovány (0,5 až 1 pg, tj. přibližně 3 až 6 jednotek/10⁷ buněk/24 hodin) jak bylo popsáno v příkladu 7. Koagulační aktivita testovaného faktoru VIII byla stanovena za přítomnosti a bez přítomnosti monoklonálních modelových myších inhibičních protilátek specifických proti doméně A2, mAb413. V nepřítomnosti inhibitoru měly všechny testované konstrukty koagulační aktivitu, která byla neodlišitelná od aktivity lidského faktoru VIII bez domény B.

Konstrukty hybridního lidkého/prasečího faktoru VIII byly testovány na reaktivitu s anti-A2 inhibitorovou protilátkou mAb413 užitím tzv. Bethesda testu (Kasper, C.K. et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 869-872, 1975). Měření Bethesda jednotek (BU) je standardní postup pro měření titru

inhibitoru. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V a jsou porovnány s rekombinantním lidským faktorem VIII.

Tabulka V

Srovnání imunoreaktivity hybridních lidských/prasečícn faktorů VIII s aminokyselinovými substitucemi

Konstrukt	Substituce prasečí sekvence	Inhibice (BU/mg IgG)	mAb413
lidský (B-)fVIII	žádná	1470
HP4	373-540	<0, 7
HP5	373-508	<0,7
HP 6	373-444	1450
HP7	445-508	<0,7
HP8	373-483	1250
HP 9	484-508	<0,7
HP 10	373-403	1170
HP 11	404-508	<0, 7
HP 12	489-508	<0,7
HP 13	484-488	<0, 7

Hranice substituované prasečí sekvence jsou definovány první aminokyselinou,která se odlišuje mezi lidským a prasečím faktorem VIII na NH2-konci a C-konci vloženého úseku. Jak je ukázáno v tabulce V, když Bethesda titr není měřitelný (<0,7 BU/mg IgG), pak A2 epitop leží v úseku nahrazeném prasečí sekvencí. Epitop byl tak postupně zúžen do úseku aminokyselinových zbytků 484-509 (sekvence id. č. 2) obsahujícího pouze 25 aminokyselin, jak ukazuje to, že HP9 je nereaktivní s mAB413. Z konstruktů HP4 až HP 11 byl HP9 nejvíce humanizovaný konstrukt, který nereagoval ·· ·· • · · · · • · · · · <···· ·· * • · · · · ·· · · · · «· ·· ·* • · · · · · • · »· · · • · · · · · · • · · · · · + · ·· ·· s inhibitorem. To ukazuje na to, že kritický úsek A2 epitopu leží v sekvenci Arg484-Ile508.

Na základě srovnání aminokyselinových sekvencí tohoto kritického úseku lidského a prasečího faktoru VIII byly připraveny dva další konstrukty HP12 a HP13, kde lidská sekvence aminokyselin odpovídající prasečí s mAb413. To ukazuje,

489-508 a 484-483 byla nahrazena sekvencí. Žádný z nich nereagoval že aminokyselinové zbytky na každé straně spojení Arg488-Ser489 jsou důležité pro reakci s A2 aminokyselinových zbytků v HP13 jsou to pouze 4 s prasečí substitucí inhibitory. V HP12 je pouze 5 odlišných od lidské sekvence a aminokyselinové zbytky. Hybridy v úsecích 484-508, 484-488 a 489-508 vykazovaly sníženou inhibici A2 inhibitory ve čtyřech vzorcích plazmy, což ukazuje na to, že je jen malá variabilita struktury epitopu A2 .

Reaktivita nejvíce humanizovaných konstruktů HP9, HP12 a HP13 se dvěma anti-A2 IgG preparáty získanými z inhibiční plazmy byla také stanovena. Podobně jako mAb413 ani tyto protilátky nereagovaly s HP9, HP12 ani HP13, ale reagovaly s kontrolními konstrukty HP(-) a HP8.

Pro konečnou identifikaci kritického epitopu A2 může být úsek mezi aminokyselinami 484-508 dále analyzován stejným postupem.

Postupy popsané v příkladech 7 a 8 lze užít k přípravě dalších hybridních lidských/savčích jiných než prasečích faktorů VIII, kde jsou aminokyselinové substituce v lidské A2 doméně, a dále hybridních lidskýcn/zvířečích nebo zvířecích/zvířecích faktorů VIII, kde jsou aminokyselinové substituce v kterékoliv doméně, nebo ekvivalentních hybridních faktorů VIII nebo jejich fragmentů, které mají ·

• · · sníženou nebo nulovou imunoreaktivitu s protilátkami proti faktoru VIII.

Příklad 9

Eliminace reaktivity lidského faktoru VIII s A2 inhibitory metodou místně cílené mutageneze

Příklad 8 ukázal, že substituce části lidské domény A2 faktoru VIII prasečí sekvencí aminokyselinových zbytků 484-508 poskytne molekulu, která má výrazně sníženou reaktivitu s panelem specifických inhibitorů proti A2 faktoru VIII (viz také Healey et al., J. Biol. Chem. 270: 1450514509, 1995). V tomto úseku je 9 aminokyselin odlišných v lidském a prasečím faktoru VIII. Těchto 9 odlišných aminokyselin R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501 a 1508 (jednopísmenné kódy aminokyselin), bylo ve faktoru VIII bez domény B jednotlivě nahrazeno alaninem metodou místně cílené mutageneze. Kromě toho, pro usnadnění klonování byla restrikční místa Mlul a Sac2 vnesena na 5'a 3'-konce sekvence cDNA A2 faktoru VIII, aniž by došlo ke změně aminokyselin odpovídajícím těmto místům. 9 mutant bylo stabilně transfekováno do buněk fetálních ledvin křečka a exprímováno. Všech devět produkovalo biologicky aktivní faktor VIII. Tyto faktory VIII byly částečně purifikovány a koncentrovány heparin-Sepharose chromatogfrafií podle Healey et al.

Mutanty byly charakterizovány na základě jejich reaktivity s protilátkou mAb413, jak bylo popsáno v příkladu

7. Tato inhibiční protilátka rozpoznává stejný nebo velmi blízko přilehlý epitop v doméně A2 jako všechny dosud

• 9 • · • · · • · • · · • · · zkoumané lidské inhibitory. Reaktivita s inhibitorem byla měřena Bethesda testem. Stručně shrnuto, Bethesda titr inhibitoru je takové ředění inhibitoru, které inhibuje faktor VIII z 50 % ve standardním jednostupňovém koagulačním testu faktoru VIII. Tak např. jestliže je roztok protilátky ředěn 1/420 a inhibuje testovaný vzorek rekombinantního faktoru VIII z 50 %, pak je Bethesda titr 420 U. V případě čisté monoklonální protilátky jako je mAb413 je hmotnost protilátky známa, takže se Bethesda titr vyjadřuje v Bethesda jednotkách (BU) na miligram protilátky mAb413. Aby byl nalezen bod 50% inhibice, provede se ředící řada protilátky mAb413 a hodnota odpovídající 50 % se hledá metodou prokládání příslušné křivky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce VI.

Tabulka VI

Mutace	Titr mAb413 (BU/mg)	% reaktivity*
Divoký typ, B(-)fVIII	9400	--
R484 -e· A	160	,—1
P485 -> A	4000	42
Y4 8 7 —> A	50	0,53
P4 8 8 -> A	3500	37
R4 3 9 -> A	1, 6	0, 015
R490 -> A	—	(0,2)
P4 92 -> A	630	6,7
V495 _> A	10700	113
F501 -> A	11900	126
1508 A	5620	60

* vztaženo k divokému typu • · · ► · · · • · · · » · · · • · · · snížena o substitucí

Tyto výsledky ukazují, že je možné snížit antigenicitu faktoru VIII vzhledem k modelovému A2 inhibitoru více než 10 x tím, že se provedou alaninové substituce v polohách 484, 487, 489 a 492. Reaktivita mutanty R489 —» A j e dokonce čtyři řády. Kterákoliv z těchto alaninových může být terapeuticky užitečná pro snížení antigenicity a imunogenicity faktoru VIII.

Výsledky potvrdily účinnost alaninové skenovací mutageneze a dále ukázaly, že biologická aktivita faktoru VIII je zachována, i když byla změněna aminokyselinová sekvence epitopu, který reaguje s inhibičními protilátkami. Pět z devíti míst, kde se lidská a prasečí sekvence faktoru VIII liší, jsou také místy, kde se liší lidská a myší sekvence. Molekuly faktoru VIII s alaninovými substitucemi v těchto místech jsou proto příklady hybridního ekvivalentního faktoru VIII, který obsahuje sekvence, které nemají sekvenční identitu s žádným dosud známých savčím faktorem VIII.

Další modifikace, např. kombinace dvou alaninových substitucí, mohou také poskytnout silně sníženou antigenicitu pro celou řadu pacientů, neboť varianty polvklonální protilátky se liší pacient od pacienta a mohou reagovat s variantami epitopu A2 faktoru VIII. Kromě toho imunogenicita (schopnost indukovat tvorbu protilátek) je dále snížena inkorporací více než jedné aminokyselinové substituce. K takovým substitucím patří jak alanin tak aminokyseliny specifické pro prasečí sekvenci nebo i jiné aminokyseliny, která mají nízký imunogenní potenciál. Substituce v polohách 490, 495 a 501 jsou užitečné ke snížení imunogenicity. Navíc tyto substituce pravděpodobně sníží reaktivitu s protilátkami u některých pacientů.

• · • · • · • · • · • · • · • · • · « t · · · ► · · « » · · <

• · · · • · · · • · · · • · · · · • · · • · · ·

Jiné účinné, antigenicitu snižující substituce, kromě alaninu, lze provádět, pokud se věnuje péče tomu, aby se vyhnulo užití těch, které jsou hlavními přispěvateli k vazebné energii antigen-protilátka nebo mají velké a nebo nabité postranní řetězce. Aminokyseliny, jejichž substituce vede ke snížení antigenní reaktivity jsou zde proto nazývány aminokyseliny snižující imunoreaktivitu. Kromě alaninu k dalším aminokyselinám snižujícím imunoreaktivitu patří methionin, leucin, serin a glycin, aniž by však výčet byl omezující. Je třeba mít namysli, že míra snížení imunoreaktivity dosažená danou aminokyselinou také závisí na účinku dané substituce na konformaci proteinu, přístupnost epitopu a podobně.

Příklad 10

Klenowův fragment, fosforylované linkery Clal, Notl linkery, T4 ligáza a Taq DNA polymeráza byly koupeny od Promega (Madison, Wisconsin). Polynukleotidylkináza byla získána od Life Technologies, lne. (Gaithersburg, Maryland). γ³²Ρ—ATP (Redivue, >5000 Ci/mmol) byl koupen od Amersham. pBluescript II KS- a buňky E. coli Epicurean XLl-Blue byly získány od Strategene (La Jolla, California). Syntetické oligonukleotidy pocházely od Life Technologies, lne. nebo Curachem, lne. Když byly PCR produkty připravovány pro klonovací účely, byly užity oligonukleotidové primery. Číslování oligonukleotidů užitých jako primery polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) prasečí cDNA fVIII nebo genomové DNA je vztaženo k cDNA lidského fVIII (Wood et al., 1984, vřz výše).

5' - fosforylované nukleotidů (nt) pro amplifikaci • ·

Celková RNA ze sleziny prasete byla izolována metodou užívající guanidinium-thiokyanát-fenol-chloroformové extrakce (Chromczynski et al., Anal. Bioechem. 162: 156-159, 1987). Prasečí cDNA byla připravena z celkové RNA užitím reverzní transkriptázy (RT) z viru Moloneyho myší leukémie a náhodných hexamerů jakožto primerů reakce (souprava First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), pokud není uvedeno jinak. RT reakce obsahovala 45mM Tris-Cl, pH 8,3, 68mM KCl, 15mM DTT, 9mM MgCl₂, 0,08 mg/ml hovězího sérového albuminu (BSA) a l,8mM deoxynuleotidtrifosfátů (dNTP). Prasečí genomová DNA byla izolována ze sleziny standardním postupem (Strauss, W.M. v Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1995, str. 2.2.1 - 2.2.3). Izolace DNA z agarózového gelu byla provedena pomocí soupravy Geneclean II (Bio 101) nebo Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

PCR reakce byla provedena pomocí termocyklovacího zařízení Hybaid OmniGene. Pro PCR reakci užívající Taq DNA polymerázu reakčni směs obsahovala 0,6mM MgCl·?, 0,2mM směs dNTP, 0,5mM oligonukleotidové primery, 50 U/ml polymerázy a 0,1 objemu reakčni směsi ze syntézy prvního řetězce cDNA. Pokud není uvedeno specificky jinak, PCR produkty byly purifikovány z agarózového gelu, zatupeny užitím Klenowova fragmentu, precipitovány etanolem, a pak buďto ligovány do míst EcoRV v defosforylovaném pBluescript II SK- nebo ligovány s fosforylovanými linkery Clal pomocí T4 ligázy, naštěpeny Clal, purifikovány chromatogfrafií na Sephacrvl 400 a pak ligovány do pBluescript II KS- naštěpeného Clal a defosforylovaného. Ligace byly provedeny pomocí T4 DNA ligázy (Souprava rapid DNA LIgation Kit, Boehringer Mannheim), pokud není uvedeno jinak. Inzerty obsahující • · • « • · · · plazmidy pBluescript KS- byly užity k transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue.

provedeno užitím Biosystems 373a

Sekvencování plazmidu bylo automatického sekvenátoru Applied a terminační soupravy s fluoresenčními barvivý PRISM nebo ručním sekvencováním užitím soupravy Sequenase v. 2 (Amersham Corp.). Přímé sekvencování produktů PCR včetně koncového značení ³²P oligonukleotidů bylo provedeno pomocí cyklického sekvencovacího protokolu (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).

Izolace klonů prasečí cDNA fVIII obsahujících netranslatované sekvence 5'-konce, signálního peptidu a kodony domény Al

Úsek prasečí fVIII cDNA od 5'-konce k doméně A2 byl amplifikován „hnízdovou PCR užitím celkové RNA ze sleziny se samice prasete metodou rychlé ampiifikace cDNA konců (5'-RACE) užitím soupravy Marathon cDNA Amplification (Clontech, verze PR55453). To zahrnuje syntézu prvního řetězce pomocí „lock-docking oligo(dT) primeru (viz Borson et al., PCR Methods Appl. 2: 144-148, 1992), syntézu druhého řetězce cDNA užitím polymerázy I z E. coli a ligaci s 5' prodlouženým dvoj řetězcovým adaptorem (sekvence id. č. 13) :

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'

3'- 3'-NH2-CCCGTCCA-PO4-5', jehož krátký řetězce byl blokován na 3'-konci aminoskupinou, aby se snížilo nespecifické PCR a byl komplementární k 8 nukleotidům 3'-konce (Siebert P.D. et al., Nucleic Acids· Res. 23: 1087-1088, 1995). První běh PCR byl proveden s adaptorově-specifickým oligonukleotidem (sekvence id. č. 14) :

5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(označeným API) • ··· · ·· · · ·· • ·· ··· · ····· · · ···· · · · ··· • · ·· ·· · · ·· · jakožto „sense primerem a oligonukleotidem specifickým pro A3 doménu prasečího fVIII (sekvence id. č. 15) :

5'-CCATTGACATGAAGACCGTTTCTC-3' (nt2081-2104 ) jakožto antisense primerem. Druhý běh PCR byl proveden pomocí hnízdových adaptorově specifických oligonukleotidů, a sice AP2 (sekvence id. č. 16):

5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' jakožto „sense primeru a hnízdového oligonukleotidů specifického pro prasečí doménu A2 (nt 1497-1520) jakožto „antisense primer (sekvence id. č. 17):

5'-GGGTGCAAAGCGCTGACATCAGTG-3'.

PCR se prováděly pomocí komerčně dostupné soupravy (Advantage cDNA PCR COre Kit), která užívá protilátkou zprostředkovaný protokol pro horký start (Kellog, D.E. et al., BioTechnoques 16: 1134-1137, 1994). PCR podmínky obsahovaly denaturaci 60 s 94 °C, nasednutí primerů 30 s při 60 °C a prodlužování minuty při 68 °C s kontrolou teploty ve zkumavce. Tento postup vedl k vytvoření hlavního produktu tvořícího pás velikosti 1,6 kb, což je v souladu s amplifikací fragmentu zasahujícího přibližně 150 bp do netranslatovaného úseku 5'-konce. Produkt PCR byl klonován do pBluescript pomocí linkerů Clal. Inzerty ze čtyř klonů byly sekvencovány v obou směrech.

Sekvence těchto klonů obsahovaly úsek zahrnující 137 bp netranslatovaného úseku 5'-konce, signální peptid, doménu Al a část domény A2. Shoda byla dosažena přinejmenším vždy ve 3 ze 4 míst. Avšak klony obsahovaly 4 mutace zjevně vnesené prostřednictvím PCR, pravděpodobně díky četným běhům PCR potřebným k vytvoření klonovatelného produktu. Proto byla užita sekvence z úseku signálního peptidu k navržení sekvence fosforylovaného sense primeru (sekvence id. č. 18):

5'-CCTCTCGAGCCACCATGTCGAGCCACCATGCAGCTAGAGCTCTCCACCTG-3' označeného RENEOPIGSP pro syntézu jiného produktu PCR k potvrzení sekvence a pro klonování do expresního vektoru. Sekvence uvedená tučně představuje počáteční kodon. Sekvence Směrem 5'od něho je sekvence identická s místem inzerce do savčího expresního vektoru ReNeo použitého pro expresi fVIII (Lubin et al, 1994 viz výše). Místo obsahuje štěpné místo Xhol (podtržené). RENEOPIGSP a oligonukleotid nt 1497-1420 byly užity pro PCR reakci s Taq polymerázou na templátu s cDNA ze sleziny samice prasete. Polymeráze od několika dalších výrobců selhala a neposkytla detekovatelný produkt. PCR podmínky obsahovaly denaturaci 4 min při 94 °C, nasednutí primerů 2 min při 55 °C a prodlužování 2 minuty při 72 °C s konečným prodlužovacím krokem 5 minut při 72 °C. PCR produkt byl klonován do pBluescript užitím linkerů Clal. Inzerty ze dvou takových klonů byly sekvencovány a v obou směrech a shodovaly se s kanonickou sekvencí.

Izolace prasečích klonů fVIII cDNA obsahujících A3, Cl a 5'-polovinu domény C2

Nejdříve byly klonovány dva RT-PCR produkty z prasečí sleziny odpovídající fragmentu domén B-A3 (nt 4519-5571) a C1-C2 (nt 6405 - 6990). 3'-konec domény C2 byl získán prodloužením úseku exonu 26, což je koncový exon fVIII. Produkt B-A3 byl připraven užitím primeru specifického pro prasečí doménu B (sekvence id. č. 19):

5'-CGGGCGGCCGCGCATCTGGCAAAGCTGAGTT-3', kde podtržená část odpovídá úseku prasečího fVIII, který se shoduje s úsekem nt 4519-4530 lidského fVIII. 5'-konec oligonukleotidu obsahuje místo Notl, které bylo zamýšleno pro účely klonování. Antisense primer použitý k vytvoření produktu B-A3 (sekvence id. č. 20):

5'-GAAATAAGCCCAGGCTTTGCAGTCRAA-3' • ·

• · · · · · · • · ·· ·· · ♦ byl založen ne reverzním komplementu sekvence cDNA lidského fVIII nt 5545-5571. Reakce PCR obsahovala 50mM KCl, lOmM Tris-Cl, pH9,0, 0,1% Triton X-100, l,5mM MgCl₂, 2,5mM směs dNTP, 20 μΜ oligonukleotidové primery, 25U/ml Taq polymerázy a 1/20 objemu směsi RT reakce. PCR podmínky obsahovaly denaturaci 3 min při 94 °C po které následovaly cykly obsahující denaturaci 1 min při 94 °C, nasednutí primerů 2 min při 50 °C a prodlužování 2 minuty při 72 °C.

Produkty PCR byly fosforylovány užitím T4DNA kinázy a byly přidány linkery Notl. Po naštěpení Notl byly PCR fragmenty klonovány do místa Notl plazmidu pBluescript II KSa transformovány do buněk E. coli XLl-Blue.

Produkt C1-C2 byl připraven využitím známé sekvence lidské cDNA pro syntézu oligonukleotidových primerů nt 64056426 (sekvence id. č. 21):

5'-AGGAAATTCCACTGGAACCTTN-3' a reverzního komplementu k nt 6966-6990 (sekvence id. č. 22):

5'-CTGGGGGTGAATTCGAAGGTAGCGN-3'.

Podmínky pro PCR byly shodné s podmínkami pro přípravu produktu B-A2. Výsledný fragment byl vložen do klonovacího vektoru pNOT užitím soupravy Prime PCR Cloner Cloning Systém (5-Prime3, lne., Boulder, Colorado) a klonován v buňkách JM109.

Plazmidy B-A3 a C1-C2 byly částečně sekvencovány, aby bylo možné připravit sense a antisense oligonukleotidy specifické pro prasečí sekvence, nt 4551-4573 (sekvence id. č. 23):

5'- GAGTTCATCGGGAAGACCTGTTG -3' a nt 6541-6564 (sekvence id. č. 24):

5'- ACAGCCCATCAACTCCATGCGAAG -3'.

Tyto oligonukleotidy byly užity jako primery pro přípravu RT-PCR produktu velikosti 2013 bp pomocí soupravy Advantage ·· ·· · · ·· ···· · · · · ···· ···· ···· ···· • ·· ··· · ····· ·· · ···· ·· · ···· • · ·· ·· ·· ·· ·· cDNA PCR (Clontech). Tento produkt odpovídající nt 4551-6564 v lidské sekvenci, obsahuje úsek zodpovědný za aktivační peptid lehkého řetězce (nt 5002-5124), doménu A3 (nt 51256114) a většinu domény Cl (nt 6115-6573). Sekvence C1-C2 klonu potvrdila, že sekvence lidské a prasečí cDNA od nt 6565 do 3'-konce Cl domény jsou identické. Produkt PCR byl klonován do místa EcoRV plazmidu pBluescript KS-. Čtyři klony byly plně sekvencovány v obou směrech. Shody bylo dosaženo přinejmenším vždy ve 3 místech ze 4.

Izolace klonů cDNA prasečího fVIII obsahujících 3'-polovinu C2 domény

Doména C2 lidského fVIII (nukleotidy 6574-7053) je obsažena v exonech 24 až 26 (Gitscher J. et al., Nátuře 312: 326-330, 1984). Lidský exon 26 obsahuje 1958 nukleotidů a odpovídá poloze nt 6901-8858. Zahrnuje také úsek 1478 bp netranaslatované sekvence 3'-konce (3'UTR). Pokusy klonovat cDNA exonu 26 odpovídající 3'-konci domény C2 a 3'UTR, ať už metodou 3'RACE (Siebert et al., 1995, viz výše), inverzní PCR (Ochman, H. et al., Biotechnology (N.Y.)8: 759-760, 1990),

PCR s restrikčními místy (Sarkar G. et al., PCR Meth. Appl. 2: 318-322, 1993), PCR s nepredikovatelným nasednutím primerů (Dominguez, O. et al., Nucl. Acids Res. 22: 32473248, 1994) nebo screeningem cDNA prasečích jater, byly neúspěšné. Metoda 3'RACE byla znovu vyzkoušena s cDNA knihovnou ligovanou stejnými dvouřetězcovými adaptory, která byla užita k úspěšnému klonování 5'-konce cDNA prasečího fVIII. Tudíž selhání této metody nebylo způsobeno nepřítomností cDNA. odpovídající exonu 26.

Ke klonování 3'-poloviny domény C2 byla užita metoda cíleného procházení genu pomocí PCR (Parker J.D. et al., Nucl. Acids Res.19: 3055-3060, 1991). Sense primer • · • · • · · · 4 • · · · <

ι · · · · · l • · · · <

» · · · · specifický pro prasečí sekvenci nt 6904-6924 (sekvence id. č. 25) :

5'- TCAGGGCAATCAGGACTCC -3' byl syntetizován na základě počáteční sekvence domény C2 a byl použit v PCR společně s nespecifickým kráčejícím primerem vybraným z oligonukleotidů dostupných v laboratoři. PCR porodukty pak byly zaměřeny analýzou extenze primeru (Parker et al., BioTechniques 10: 94-101, 1991) užitím vnitřního primeru značeného ^j2P specifického pro prasečí sekvenci nt 6932-6952 (sekvence id. č. 26):

5'- CCGTGGTGAACGCTCTGGACC -3'

Bylo zajímavé, že ze 40 testovaných nespecifických primerů pouze dva poskytly pozitivní produkt analýzou extenze primeru a odpovídaly přesné a degenerované lidské sekvenci 3'-konce domény C2, a sice primer sekvence id. č. 27 (nt 7030-7053):

5'- GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' a primer sekvence id. č. 28 (nt 7027-7053):

5'- GTAGAGSTSCTGKGCCCTCRCAKCCYAG -3'.

Tyto primery byly původně navrženy pro získání produktu pomocí konvenční RT-PCR, ale selhaly a neposkytly dostatečné množství produktu, které by mohlo být vizualizováno barvením etidiumbromidem. Avšak produkt byl identifikován citlivější metodou extenze primeru. Produkt pak byl purifikován na agarózovém gelu a přímo sekvencován. To prodloužilou sekvenci prasečího fVIII k nukleotidu 7026.

Další sekvence byla získána analýzou extenze primeru produktu získaného hnízdovou PCR na dvouřetězcové adaptory ligované cDNA knihovně užitím 5'RACE protokolu popsaného již dříve. První běh reakce užíval přesný primer prasečí sekvence sekvence id. č. 29 (nt 6541-6564):

5'- CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT -3' • · • · · · • · · ·

a primer API. Druhý běh reakce užíval primer sekvence id. č. 30 (nt 6913-6934) :

5'- AATCAGGACTCCTCCCACCCCCG-3' a primer AP2. Přímě PCR ·sekvencování prodloužilo sekvenci směrem 3' ke konci domény C2 (nt 7053) . Sekvence C2 domény byla jednoznačná až na nt 7045 blízko 3'-konce C2 domény. Analýza opakovaných PCR reakcí ukázala buďto A, G nebo dvojité A/G v tomto místě.

Sekvencování bylo prodlouženo do 5'UTR užitím dalších dvou primerů, a sice sekvence id. č. 31 (NT 6977-6996):

5'- GGATCCACCCCACGAGCTGG -3' a sekvence id. č. 32 (nt 7008-7031) :

5'- CGCCCTGAGGCTCGAGGTTCTAGG -3'

Úsek přibližně 15 bp ze 3'UTR sekvence byl získán, ačkoliv sekvence byla na několika místech nejasná. Pak bylo syntetizováno několik antisense primerů na základě co nej lepšího určení 3'netranslatované sekvence. Tyto primery obsahovaly reverzní komplement stop kodonu TGA ne svém 3'-konci. PCR produkty byly získány jak s genomové DNA tak i cDNA prasečí sleziny pomocí specifických primerů sekvence id. č. 33 (nt 6913-6934):

5'- AATCAGGACTCCTCCACCCCCG -3' a 3'UTR antisense primerů sekvence id. č. 34:

5'- CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3' a byly vizualizovány barvením etidiumbromidem na agarózovém gelu. Pro získání dostatečné množství materiálu pro klonování byl proveden druhý běh PCR s hnízdovými primery sekvence id. č. 35 (nt 6932) :

5'- CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' a shodným antisense primerem. Výsledný produkt PCR velikosti 141 bp byl klonován do pBluescript II KSnaštěpeného EcoRV. Sekvence třech klonů získaných z genomové • · ·· · · · · · · • · · * · ·· · · ·· • · · · · ·· · · ·· · • · · · · · · ··· · · · · · ···· · · · · · · ·

DNA a třech klonů pocházejících z cDNA byla získána sekvencováním v obou směrech. Sekvence byla zcela jednoznačná až na nt 7045, kde genomová DNA ukázala vždy A a cDNA vždy G.

Srovnání sekvencí lidského, prasečího a myšího faktoru VIII (obrázky 1A až 1H).

Srovnání přiřazením sekvencí úseků signálního peptidu, Al, A2, A3, Cl a C2 bylo provedeno pomocí počítačového programu CLUSTALW (Thompson, J.D. et al., 'Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680, 1994). Negativní bodové ohodnocení pro otevřenou mezeru a rozšířenou mezeru bylo 10 a 0,5. Srovnání domény B člověka, prasete a myši bylo již publikováno dříve (Elder et al., 1993, viz výše) . Lidská sekvence A2 odpovídá úseku aminokyselin 373-740 v sekvenci id. č. 2. Aminokyselinová sekvence prasečí domény A2 je uvedena v sekvenci id. č. 4 a aminokyselinová sekvence myší domény A2 je uvedena v sekvenci id. č. 6 (aminokyseliny 392-759).

Příklad 11

Exprese aktivního rekombinantního prasečího faktoru VIII bez domény B (PB‘)

Použité materiály

Plazma ošetřená citrátem z pacientů s hemofilií A a kontrolních zdravých jedinců byla získána od firmy George King Biomedical lne. Fetální sérový albumin, geneticin, penicilín, streptomycin, médium DMEM/F12 a AIM-V byly koupeny od Life Technologies, lne. Taq DNA polymeráza byla od Promega, Vent polymeráza byla koupena od New England Biolabs, Pfu DNA polymeráza a fagemid pBluescript KS- byly od • · · · · · > · · · · » · · · · ř · · · · · • · • ·

Stratagene. Syntetické oligonukleotidy byly koupeny od Life Technologies a Curachem, lne. Restrikční enzymy pocházely New England Biolabs nebo Promega. 5'-fosforylované primery byly užity, když PCR produkty byly připravovány pro klonovací účely. Číslování nukleotidů (nt) oligonukleotidů použitých jako primery pro amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) prasečí genomové DNA nebo cDNA užívá pro srovnání cDNA lidského faktoru VIII (Wood et al., Nátuře 312: 330-337, 1984). Expresní vektor fVIII označený ΗΒ'/ReNeo byl získán od Biogen, lne. ΗΒ’/ReNeo obsahoval geny rezistence k ampicilinu a geneticinu a cDNA lidského fVIII postrádající 'doménu B, která je vymezena úsekem Ser741-Argl648 , což je fragment vzniklý štěpením trombinem. Pro zjednodušení mutageneze cDNA C2 domény fVIII, která je na 3'-konci fVIII inzertu v plazmidu ReNeo, bylo vneseno místo Notl směrem 3'o dvě báze ke stop kodonu ΗΒ'/ReNeo mutagenezí metodou SOE (splioing by overlap extension, Horton, R.M. et al., Methods Enzymol. 217: 270-279, 1993). Výsledný konstrukt byl označen HB-ReNeo/Notl.

Celková RNA byla izolována guanidinium-thiokyanát-fenolchloroformovou extrakcí (Chromczynski et al., Anal. Bioechem. 162: 156-159, 1987). cDNA byla připravena z celkové RNA užitím reverzní transkriptázy (RT) z viru Moloneyho myší leukémie primerů reakce Kit, Pharmacia a náhodných hexamerů jakožto (souprava First Strand cDNA Synthesis Biotech). Plazmidová DNA bylá purifikována pomocí soupravy Qiagen Plazmid Maxi Kit (Qiagen). PCR reakce byla provedena pomocí termocyklovacího zařízení Hybaid OmniGene s' užitím Taq DNA polymerázy, Vent DNA polymerázy nebo Pfu DNA polymerázy. PCR produkty byly purifikovány z agarózového gelu, zatupeny užitím Klenowova fragmentu, precipitován etanol-em, a pak ligovány do plazmidové DNA užitím T4 ligázy • to ·· » · · I » to · to

100 ·· toto » · · · > toto · » · · · » to · · · » · · • to · to • to toto ► · · 4

I ·· <

I ·· l » ·· <

• · * to (Souprava Rapid DNA Ligation Kit, Plazmidy obsahující inzerty byly

Boehringer Mannheim). užity k transformaci k transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue. Všechny nové sekvence fVIII sekvencováním automatického

DNA vytvořené užitím dideoxynukleotidovou sekvenátoru Applied

PCR byly metodou Biosystems overeny pomocí

373a a terminační soupravy s barvivý PRISM.

Konstrukce expresního vektoru hybridního faktoru VIII HP20, který obsahuje prasečí doménu C2 cDNA. prasečího fVIII odpovídající 3'-konci domény Cl a celé doméně C2 byla klonovány pBluescript pomocí RT-PCR z celkové RNA užitím RT-PCR na celková RNa a primerů založených na známé sekvenci cDNA prasečího fVIII (Healy, J.F. et al., Blood 88: 4209-4214, 1996). Tento konstrukt a HB/ReNeo byly užity jako templáty ke konstrukci fúzního produktu lidská Cl - prasečí C2 v plazmidu pBluescript mutagenezí metodou SOE. Fragment C1-C2 z tohoto plazmidu byl odstraněn restrikčními enzymy Apal a Notl a ligován do ΗΒ’/ReNeo/NotI naštěpeného Apal/Notl, čímž byl vytvořen HP20/ReNEo/NotI.

Konstrukce hybridního lidského/prasečího faktoru VIII bez domény B obsahujícího prasečí lehký řetězec (HP18)

Lehký řetězec lidského faktoru VIII obsahuje aminokyselinové zbytky Aspl649-tyr2332. Tento úsek v mutantě bez domény B (HB~) byl nahrazen odpovídajícími zbytky prasečí cDNa fVIII, čímž byla vytvořena molekula hybridního lidského/prasečího faktoru VIII nazvaná HP18. To bylo provedeno nahrazením odpovídajícího úseku v HP20 nahrazením PCR produktem, který odpovídal úseku A2, doméně A3, doméně Cl a části domény C2 prasete. Pro usnadnění konstrukce bylo • 9 ιι r« ► · » ι » · · ·

101 synonymní místo AvrlI vneseno do nt 2273 na spoji domén A2 a A3 v HP20 metodou SOE mutageneze.

Konstrukce hybridního lidského/prasečího faktoru VIII bez domény B obsahujícího prasečí signální peptid a domény Al a A2 (HP22)

Signální peptid a domény Al a A2 lidského faktoru VIII zaujímají úsek aminokyselin Met (-19)-Arg740. Tento úsek v mutantě bez domény B (HB‘) byl nahrazen odpovídajícími úseky prasečí cDNA fVIII, čímž byla vytvořena molekula nazvaná HP22. Navíc synonymní místo AvrlI bylo vneseno do nt 2273 na spoji domén A2 a A3 v HP20 metodou SOE mutageneze. HP22 byl konstruován fúzí prasečího fragmentu signální peptid-Al-část A2 v pBluescript (Helay et al., 1996, viz výše) s hybridním lidským/prasečím faktorem VIII bez domény B obsahujícím prasečí doménu A2 nazvaným HP1 (Dubin et al., 1994, viz výše).

Konstrukce prasečího faktoru VIII bez domény B (PB‘)

Fragment Spel/Notl z HP18/BS (+AvrII) byl štěpen AvrH/Notl a ligován do HP22/BS (+AvrII) štěpeného AvrlI/Notl, který obsahoval prasečí fVIII postrádající celou doménu Β. PB- byl klonován do ReNeo ligací fragmentu Xbal/Notl z PB-/BS(+AvrII) do HP22/ReNeo/NotI (+AvrII).

Exprese rekombinantních molekul faktoru VIII

PB-/ReNeo/NotI(+AvrII) a HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) byly transfekovány do COS buněk a dočasně exprimovány, jak bylo dříve publikováno (Lubin, I.M. et al., J. Biol. Chem. 269: 8639-8641). HB-/ReNeo/NotI a žádná DNA (slepá kontrola) byly transfekovány jako kontroly.

102

4· 44 44 44 ·· • «4 4 4 · · 4 · · · 4

4* ·*·· · · 4 4

44 444 4 · V V 4 · · · »

444 4 44 4 4444

44 44 44 4* 44

Aktivita faktoru VIII mutant PB-, HP22 a HB- byla měřena následujícím chromogenním testem. Vzorky fVIII v supernatantu z ' buněk COS byly aktivovány 40nM trombinem v pufru obsahujícím 0,15mM NaCl, 20mM HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4, v přítomnosti lOnM faktoru IXa, 425nM faktoru X a 50 μΜ jednovrstevných fosfatidylserinfofstatidylcholinových (25/75 hmotn.) vesikulů. Po pěti minutách byla reakce zastavena 0,05 M EDTA a lOOmM rekombinantního desulfatohirudinu a výsledný faktor Xa byl měřen testem s chromogenním substrátem. V testu s chromogenním substrátem byl přidán 0,4mM Spectrozyme Xa a byla stanovena rychlost uvolňování para-nitoanilidu měřením absorbance při 405 nm.

Výsledky ze supernatantu dvou nezávisle transfekovaných buněčných kultur (změna absorbance ve 405 nm za minutu):

HB': 13,9, PB”: 139, HP22: 100 a slepá kontrola: < 0,2.

Tyto výsledky ukazují, že prasečí faktor VIII bez domény B a faktor VIII bez domény B obsahující prasečí podjednotky Al a A2 jsou aktivní a mají vyšší aktivitu než lidský fVIII bez domény B.

PB’ byl částečně purifikován a koncentrován z růstového média chromatografii na heparin-Sepharose. Heparin-Sepharose (10 ml) byla ekvilibrována pufrem obsahujícím 0,075 NaCl, lOmM HEPES, 2,5mM CaCl₂, 0,005% Tween-80, 0,02% azid sodný, pH 7,4. Médium (100 až 200 ml) z exprimujících buněk bylo naneseno na kolonu s heparin-Sepharose, která pak byla propláchnuta 30 ml ekvilibračního pufru bez azidu sodného. PB’ pak byl eluován pufrem obsahujícím 0,65 NaCl, 20mM HEPES, 5mM CaCl-₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4 a pak uschován do -80 °C. Výtěžek koagulační aktivity faktoru VIII byl typicky 50 až 75 %.

• · • ·

103

Stálá exprese prasečího faktoru VIII bez domény Β (PB)

Transfekované buněčné linie byly udržovány v médiu DMEM-F12 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum, 50 U/ml penicilinu a 50 gg/ml streptomycinu. Fetální hovězí sérum bylo před použitím tepelně inaktivováno 1 hodinu v 50 °C.

HB/ReNeo a PB/ReNeo/NotI(+AvrII) byly trvale transfekovány do buněk BHK a selektovány na rezistenci ke geneticinu podle obecně známého protokolu popsaného v Lubin et al, Biol. Chem 269: 8639-8641, 1994, kromě toho, že exprimující buňky byly kultivovány v médiu s 600 gg/ml geneticinu. Buňky z kultivačních lahví Corning T-75 pěstované do konfluence byly přeneseny do trojitých lahví Nunc do média s 600 gg/ml geneticinu a opět kultivovány do konfluence. Médium bylo odstraněno a nahrazeno médiem bez séra AIM-V (Life Technologies, lne.) a bez geneticicnu. Exprese faktoru VIII byla sledována jednostupňovým testem koagulační aktivity (popsaným výše) a 100 až 150 ml média bylo odebráno jednou denně po 4 až 5 dnů. Maximální hladina exprese v médiu pro HB a PB byla 1 až 2 jednotky/ml a 10 až 12 jednotek/ml koagulační aktivity faktoru VIII.

Purifikace PB

PB byl precipitován ze supernatantu buněčné kultury užitím 60% nasyceného síranu amonného a pak byl puřifikován imunoafinitní chromatografíi a vysokotlakovou kapalinovou chromatografíi na koloně monoQ, jak bylo již popsáno pro purifikaci prasečího faktoru VIII získaného z plazmy (Lollar et al., Factor VlII/factor Vlila. Methods in Enzymol. 222: 128-143, 1993). Specifická koagulační aktivita PB byla měřena jednostupňovým testem koagulační aktivity (viz Lollar et al., 1993) a byla podobná jako u prasečího faktoru Vlil získaného z plazmy.

• ·

104

Při analýze elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu se ukázalo, že preparát PB’ obsahuje tři pásy se zjevnou molekulovou hmotností 160 kDa, 82 kDa a 76 kDa. Pásy velikosti 82 kDa a 76 kDa byly již dříve popsány jako heterodimer obsahující domény A1-A2 a ap-A3-Cl-C2 (kde ap označuje aktivační peptid) (viz Toole et al., Nátuře 312: 342347, 1984) . Pás velikosti 160 kDa byl přenesen na polyvinylidenfluoridovou membránu a podroben NH₂-terminálnímu sekvencování, které poskytlo sekvenci Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (kde Xx představuje neurčenou aminokyselinu), což je NH₂-koncová sekvence jednořetězcového faktoru VIII (Toole et al., 1984). takže PB‘je částečně upravován štěpením mezi doménami A2 a A3, takže je tvořen dvěma formami, jednořetězcovým proteinem Al-A2-ap-A3-Cl-C2 a heterodimerem Al-A2/ap-A3-ClC2. Podobné úpravy rekombinantního HB byly také popsány (Lind et al., Eur. J. Biocnem. 232: 19-27, 1995).

Charakterizace prasečího faktoru VIII

Byla určena sekvence cDNA prasečího faktoru Vin odpovídající úsek obsahující 137 bp 5'UTR, kódující sekvenci signálního peptidu (57 bp) a domény Al (1119 bp) , A3 (990 bp) , Cl (456 bp) a C2 (483bp) . A tato sekvence společně s dříve publikovanými sekvencemi B domény a úseků lehkého řetězce aktivačního peptidu (Toole et al., 1986, viz výše) a domény A2 (Lubin et al., 1994, viz výše) doplňuje a zakončuje stanovení sekvence cDNA prasečího faktoru VIII odpovídající translatovanému produktu. Fragment cDNA obsahující úsek 5'UTR, signální peptid a doménu Al byl klonován pomocí protokolu 5'RACE RT-PCR. Oligonukleotidovžý primer založený na sekvenci lidské C2 byl úspěšný při vytvoření RT-PCR produktu, který umožnil klonování A3, Cl a 5'poloviny domény C2. cDNA odpovídající 3'polovině domény C2 a 3'UTR-cDNA byla • ·

105 obtížně klonovatelné. Zbytek domény C2 byl nakonec klonován metodou cíleného procházení genu PCR (Parker et al., 1991, viz výše).

Sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 36 byla zcela jednoznačná až na nt 7045 v blízkosti 3'-konce domény C2, kterým je buďto A nebo G,jak bylo již uvedeno výše. Odpovídající kodony pak jsou GAC (Asp) nebo AAC (Asn). Lidské a myší kodony jsou GAC a CAG (Gin) . Zda se jedná o polymorfismus nebo reprodukovatelný artefakt vnesený PCR není známo. cDNA pro rekombinantní hybridní lidský/prasečí faktor VIII bez domény B obsahující substituci prasečí domény C2 jak s kodonem GAC tak AAC byly trvale exprimovány, aniž by byl zjištěn detekovatelný rozdíl v prokoagulační aktivitě. To ukazuje, že mezi těmito dvěma variantami C2 domény není funkční rozdíl.

Srovnání predikovaných aminokyselinových sekvencí úplné sekvence prasečího faktoru VIII, sekvence id. č. 37, s publikovanou lidskou sekvencí (Wood et al., viz výše) a myší sekvencí (Elder et al., 1993, viz výše) je uvedeno na obr. 1A až IH společně s vyznačenými místy potranslačních modifikací, proteolytického štěpení a rozpoznávání jinými makromolekulami. Stupeň identity přiřazených sekvencí je uveden v tabulce VII. Jak již bylo zmíněno dříve, B domény těchto druhů jsou více rozdílné (divergentní) než domény A nebo C. To je v souladu s pozorováním, že B doména nemá i přes svou značnou velikost žádnou známou funkci (Elder et al. 1993, Tool et al. 1986) . Výsledky uvedené v předkládaném vynálezu potvrdily doména .B v prasečím faktoru VIII není nutná pro jeho aktivitu. Na základě sekvenčních dat zde představených prasečí faktor VIII mající odstraněnou celou nebo část domény B se dá syntetizovat expresí cDNA kódující prasečí faktor VIII, která má deletované kodony pro část nebo • · · · ·

106 celou doménu B. Je také rozsáhlejší divergence v sekvenci odpovídající peptidu Al doména APC/štěpné místo faktoru IXa (zbytky 337-372) a lehkého řetězce aktivačního peptidu (tabulka VII) . Štěpné místo pro trombin v poloze 336 tvořící peptid 337-372 je zjevně ztraceno v myší sekvenci, neboť je zde glutamin místo argininu (Elder et al., 1993, viz výše) .

Relativně rychlá divergence štěpného peptidu pro trombin (u myšího faktoru VIII naznačený aktivační peptid 337-372) byla zaznamenána již dříve u fibrinopeptidů (Creighton, T.E., Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H.Freeman, New York, s. 105-138, 1993). Nepřítomnost biologické funkce u těchto peptidů jakmile jsou naštěpeny, byla popsána jako možný důvod rychlé divergence. Arg562 v lidském fVIII byl navržen jako důležitější štěpné místo pro aktivační protein C v průběhu inaktivace fVIII a fVIIIa (Fay P.J. et al., J. Biol. Chem. 266: 20139-20145, 1991) . Toto místo je zachováno v lidské, prasečí i myší sekvenci faktoru VIII.

Na obrázcích 1A až 1H jsou tučně označena potenciální místa N-vázané glykosylace. Je zde 8 konzervativních míst potenciální místa N-vázané glykosylace, a sice jedno v doméně Al, jedno v doméně A2, čtyři v doméně B, jedno v doméně A3 a jedno v doméně Cl. 19 cysteinů domén A a C je zachováno, zatímco v cysteinech domény B je značná divergence. Šest z těchto sedmi disulfidických ' vazeb faktoru VIII bylo zjištěno také na homologních místech faktoru V a cerulopllasminu a obě disulfidiké vazby domény C byly nalezeny u faktoru V (McMullen, B.A. et al., protein Sci. 4: 740-746, 1995). Lidský faktor VIII obsahuje sulfatované tyrosiny v polohách 346, 718, 719, 723, 1664 a 1680 (Pittmann, D.D. et al., Biochemistry 31: 3315-3325, 1992,

Michnick, D.A. et al., J. Biol. Chem. 269: 20095-20102,

1994). Tyto aminokyselinové zbytky jsou konzervativní v myším • «

107 a prasečím faktoru VIII (obr. 1), i když program CLUSTALW nepřiřadil správně myší tyrosin odpovídající Tyr346 v lidském fVIII.

Myší a prasečí plazma může napravit nedostatečnou koagulaci plazmy člověka s hemofilií A, což je v souladu s mírou konzervativnosti sekvencí A a C domén u těchto biologických druhů. Prokoagulační aktivita prasečího faktoru VIII je vyšší než u lidského faktoru VIII (Lollar et al., J. Biol. Chem. 267: 23652-23657, 1992). Rekombinantní prasečí faktor VIII (s odstraněnou doménou B) exprimovaný a purifikovaný podle předkládaného vynálezu projevuje také vyšší specifickou koagulační aktivitu ve srovnání s lidským fVIII a je srovnatelná s aktivitou faktoru VIII izolovaného z prasečí plazmy. To může být způsobenou sníženou spontánní disociací A2 podjednotky z aktivního heterotrimeru A1/A2/A3C1-C2 faktoru VIII. Zda tyto rozdíly v prokoagulační aktivitě odrážejí evoluční změny funkce jako příklad adaptace druhů (Perutz, M.F., Adv. Protein. Chem., 1996) není dosud známo. Nyní, když je úplná sekvence cDNA prasečího faktoru VIII odpovídající translatovanému produktu známá, metoda homologní skenovací mutageneze (Cunningham B.C. et al., Science 243: 1330-1336, 1989) může být cestou jak identifikovat strukturní rozdíly mezi lidským a prasečím faktorem VIII, které jsou zodpovědné za vyšší aktivitu prasečího faktoru VIII.

Prasečí faktor VIII je typicky méně reaktivní s inhibičními protilátkami, které se tvoří u hemofiliků, kterým byla podána transfúze faktoru VIII nebo které se tvoří jako autoprotilátky v obecné populaci. To je základem pro užívání koncentrátu prasečího faktoru VIII při léčení pacientů s inhibičními protilátkami (Hay a Lozier, 1995, viz výše). Většina inhibičních protilátek je namířena proti epitopům lokalizovaným v doméně A2 nebo C2 (Fulcher C.A. et * ·

108 al.' Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732, 1985, Scandella, D. et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 61526156, 1988, Scandella, D. et al., Blood 74: 1618-1626, 1989). Navíc byl identifikován epitop neznámého významu, který se nalézá v doméně A3 nebo Cl (Scandella et al., 1989 viz výše, Scandella, D., Blood 82: 1767-1775, 1993, Nakai, H. et al., Blood 84: 224a, 1994). Epitop A2 byl mapováním lokalizován do úseku 484-508 homologní skenovací mutagenezí (Healey et al., 1995, viz výše). V tomto segmentu obsahujícím 25 aminokyselinových zbytků je relativně malý podíl identických sekvencí (16/25 neboli 64 %) . Je zajímavé, že tento úsek, který se zdá být funkčně důležitý na základě toho, že protilátky proti němu jsou inhibiční, byl zjevně vystaven rychlejšímu genetickému posunu. Srovnání prasečích domén A2 a A3 .ukazuje, že epitop A2 nesdílí žádnou detekovatelnou homologii s doménou A3.

Inhibitorový epitop C2 lidského fVIII byl lokalizován mezi zbytky 2248 až 2312 delečním mapováním (Scandella, D., Blood 86: 1811-1819, 1995). Lidský a prasečí faktor VIII jsou z 83 % identické v tomto segmentu obsahujícím 65 aminokyselinových zbytků. Avšak homologní skenovací mutageneze tohoto úseku vedla k charakterizaci C2 epitopu, jehož hlavní antigenní determinanta byla neočekávaně lokalizována do úseku odpovídajícího aminokyselinám 2181-2243 lidské sekvence (sekvence id. č. 2 a obr. 1H).

Byly připraveny proteiny hybridního lidského/prasečího faktoru VIII, kde různé části domény C2 byly nahrazeny odpovídající částí prasečího faktoru VIII užitím strategie popsané v předkládaném vynálezu (viz příklad 8) . Syntéza různých C2-hybridních faktorů VIII byla provedena tak, že byla zkonstruována hybridní kódující DNA, a sice užitím nukleotidové sekvence kódující prasečí úsek C2 uvedené zde

109 jako sekvence id.č. 37. každý hybrid byl exprimován v transfekovaných buňkách, takže hybridní faktor VIII mohl být částečně purifikován z růstového média. Aktivita, v nepřítomnosti jakéhokoliv inhibitoru, byla měřena jednostupňovým koagulační testem.

Panel pěti lidských inhibitorů byl užit k testování každého hybridního faktoru VIII. Bylo již dříve prokázáno, že plazma obsahující protilátku anti-faktor VIII je namířena proti lidské C2 doméně, neboť rekombinantní C2 doména neutralizuje inhibici. Ve všech testovaných plazmách titr inhibitoru byl neutralizován z více jak 79 % doménou C2 nebo lehkým řetězcem ale méně než z 10 % rekombinantní lidskou doménou A2. Kromě toho C2-hybridní faktory VIII byly testovány proti myší monoklonální protilátce, která se váže na doménu C2, a podobně jako lidské C2 inhibující protilátky, inhibuje vazbu faktoru VIII k fosfolipidům a k ven Willebrandovu faktoru.

Srovnáním titrů inhibičních protilátek proti C2hybridním faktorům VIII bylo ukázáno, že hlavní determinanta lidského C2 inhibitorového epitopu leží v úseku definovaném aminokyselinovým zbytky 2181-2243 (sekvence id. č. 2, viz také obr. 1K) . Protilátky anti-C2 namířené proti úseku COOH konce ke zbytku 2253 nebyl identifikovány u čtyřech z pěti sér pacientů. Při srovnání hybridy obsahující prasečí sekvenci odpovídající lidské sekvence aminokyselinových zbytků 2181-2199 a 2207-2243 se ukázalo, že oba tyto úseky přispívají k vazbě protilátky. Prasečí aminokyselinová sekvence odpovídající lidské sekvenci zbytků 2181-2243 je očíslována 1982-2044 v sekvenci id. č. 37. Sekvence prasečí DNA kódující prasečí aminokyseliny 1982-2004 představuje nukleotidy 5944-6132 v sekvenci id. č. 35.

• ·

110

S odkazem na obr. 1H, je vidět, že v úseku 2181-2243 je rozdíl v 16 aminokyselinách mezi lidskou a prasečí sekvencí. Rozdíly byly nalezeny v aminokyselinách 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 a 2243. Lze provést náhradu jedné nebo několika aminokyselin v těchto polohách a tím připravit modifikovaný faktor VIII, který je nereaktivní s inhibičními protilátkami proti lidské C2. Alaninová skenovací mutageneze poskytuje vhodnou metodu pro vytváření alaninových substitucí neutrálních zbytků, jak bylo již dříve popsáno. K nahrazování lze užít i jiné aminokyseliny než alanin, jak se popisuje v předkládaném vynálezu. Náhrada jednotlivých aminokyselin alaninem, a to zejména těch aminokyselin, které nejsou shodné v lidské a prasečí sekvenci nebo lidské a myší sekvenci nebo které s velkou pravděpodobností přispívají k vazbě protilátky, může poskytnout modifikovaný faktor VIII se sníženou s inhibičními protilátkami.

Kromě toho strategie vložení do

2181-2243 může poskytnout modifikovaný faktor VIII, který má sníženou imunogenicitu. Faktor VIII se sníženou imunogenicitou je vhodný jako náhražka faktoru VIII při léčení hemofilie u pacientů, která je výhodnější než faktor VIII s přirozenou sekvencí. U pacientů léčených faktorem VIII se sníženou imunogenicitou se s menší pravděpodobností vyvinou inhibiční protilátky a tudíž s menší pravděpodobností budou trpět sníženou ?eaktivitou aminokyselin s definovaného nižším úseku imunogenním potenciálem aminokyselinových zbytků účinností léčení po celou dobu života.

• · • »

111

Popis obrázků

Obrázky 1A až 1H společně ukazují srovnání přiřazených aminokyselinových sekvencí lidského, prasečího a myšího faktoru VIII. Obr. 1A srovnává úsek signálního peptidu (lidský sekvence id. č. 40, prasečí sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1-19, myší sekvence id. č. 6, aminokyseliny 1-19) . Aminokyselinové sekvence na obrázcích 1A až 1H jsou číslovány tak, že první alanin zralého proteinu má číslo 1 a aminokyseliny signálního peptidu jsou tedy číslovány zápornými čísly. Sekvence lidského faktoru VIII id. č. 2 také začíná prvním alaninem aminokyselinou číslo 1 faktoru VIII (sekvence id zralého proteinu jakožto V aminokyselinové sekvenci myšího sekvence id. č. 6) a prasečího faktoru VIII č. 37) první aminokyselina zralé sekvence (alanin) je aminokyselina očíslovaná 20. Obr. 1A až 1H ukazují přiřazení odpovídajících sekvencí lidského, myšího a prasečího faktoru VIII, takže sekvence s největší identitou aminokyselin jsou přiřazeny k sobě. Číslování aminokyselin na obr. 1A až 1H se vztahuje pouze k lidské sekvenci faktoru VIII. Obr. 1B ukazuje aminokyselinové sekvence lidské domény

1-372) a myší domény Al Obr. 1C ukazuje (sekvence id. č, aminokyselinové

Al (sekvence id. č. 2, aminokyseliny (sekvence id. č. 37, aminokyseliny 20-391)

6, aminokyseliny 20-391) sekvence lidské domény A2 faktoru VIII člověka (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 373-758), prasete (sekvence id. č. 37, aminokyseliny 392-759) a myši (sekvence id. č. 6, aminokyseliny 392-759). Obr. ID ukazuje aminokyselinovou sekvenci lidské domény B faktoru VIII člověka (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 741-1648), prasete (sekvence id. č. 37, aminokyseliny 760-1449) a myši (sekvence id. č. 6, aminokyseliny 760-1640). Obr. IE porovnává • · · • · · • · ·

112

1450-1490, sekvence id v uvedeném pořadí).

aminokyselinové sekvence lehkého řetězce aktivačního peptidu faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 1649-1689, sekvence id. č. 37, aminokyseliny č. 6, aminokyseliny 1641-1678, Obr. 1F poskytuje srovnání aminokyselinové sekvence domény A3 faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 1690-2019, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1491-1820, sekvence id. č. 6, aminokyseliny 1679-2006, v uvedeném pořadí). Obr. 1G poskytuje aminokyselinové sekvence domén Cl faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 2020-2172, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1821-1973, sekvence id. č. 6, aminokyseliny 2007-2159, v uvedeném pořadí) . A nakonec obr. 1H uvádí sekvenční data domén C2 faktoru VIII člověka, prasete a myši (sekvence id. č. 2, aminokyseliny 2173-2332, sekvence id. č. 37, aminokyseliny 1974-2133, sekvence id. č. 6, aminokyseliny 2160-2319, v uvedeném pořadí).

Kosočtverci jsou vyznačena místa sulfatace tyrosinu, tučné písmo označuje - potenciální glykosylační místa, navrhovaná vazebná místa pro faktor IXa, fosfolipid a protein C jsou dvojitě podtržena a úseky účastnící se vazby inhibičních protilátek anti-A2 a anti-C2 jsou zvýrazněny kurzívou. Hvězdičky označují konzervativní aminokyselinové sekvence. Viz také sekvence id. č. 36 (cDNA prasečího faktoru VIII) a sekvence id. č. 37 (dedukovaná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII). bylo použito stejného číslování lidské sekvence faktoru VIII jako v referenční práci (Wood et al., 1984, viz výše) . Domény Al, A2 a B jsou definovány pomocí štěpných míst pro trombin v polohách 372, 740 a místa pro neznámou proteázu v poloze 1648 jako segmenty zbytků 1-372, 373-740 a 741-1648 (Eatona, D,L. et al., • fc fcfc

113 • · fcfc

2332, v uvedeném pořadí Štěpná míst pro trombin

Biochemistry 25: 8343-8347, 1986) . Domény A3, Cl a C2 jsou definovány jako segmenty zbytků 1690-2019, 2020-2172 a 2173(vehar et al., 1984, viz výše). faktor Ha) , faktor IXa, faktor X a APC (Fay et al., 1991, viz výše, Eaton, D. et al.,

Biochemistry 25: 505-512, 1986, Lamphear, B.J. et al., Blood 80: 3120-3128, 1992) jsou znázorněna tak, že název enzymu je uveden nad příslušným reaktivním argininem. Kyselý peptid je odštěpen od lehkého řetězce faktoru VIII trombinem nebo faktorem Xa faktoru IXa v pozici 1689 ^Fay et al., J.

Předpokládaná vazebná místa Biol. Chem. 269: 20522-20527,

1994, Lenting, P.J. et al., J. Biol. Chem. 269

7150-7155,

1999-2004,

1994), fosfolipid (Foster, P.A. et al., Blood 75 1990) a protein C (Walker, F.J. et al., J. Biol. Chem. 265: 1484-1489, 1990) jsou dvojitě podtržena. Úseky účastnící se vazby inhibičních protilátek anti-A2 (Lubin et al., 1994., viz výše, Healey et al., 1995, viz výše) a dříve předpokládaných anti-C2 jsou uvedena kurzívou. Inhibitorový předkládaného vynálezu sekvenci) je znázorněn Tyrosinová sulfatační epitop C2 identifikovaný podle (aminokyseliny 2181-2243 v lidské jednoduchým podtržením na obr. 1H místa (Pittman et al., 1992, viz výše, Michnick et al., 1994, viz výše) jsou znázorněna symboly ♦. Rozpoznávací místa pro potenciální N-navázané glykosylace (NXS/T, kde X není prolin) jsou zvýrazněna tučně.

Nukleotidová sekvence kódující protein faktoru VIII postrádající doménu B je zde uvedena jako sekvence id. č. 38 a odpovídající predikovaná aminokyselinová sekvence jako sekvence id. č. 39.

* 0 • ·

114 ·· 0· ·0 · · 0 · 00 0

00 0 0 00 ·

0 00000 00 0 0 0 0 0 0 0 0

0 00 00 00

SEZNAM SEKVENCI (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 9009 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (F) TYP TKÁNĚ: Játra (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 5125..7053 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= struktura domény” /poznámka= odpovídající doméně A3-C1-C2 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..2277 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= struktura domény /poznámka= odpovídající doméně A1-A2 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..2277 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= doména /poznámka= cDNA kódující lidský faktor VIII (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

CAGTGGGTAA	GTTCCTTAAA	TGCTCTGCAA	AGAAATTGGG	ACTTTTCATT	AAATCAGAAA	60
TTTTACTTTT	TTCCCCTCCT	GGGAGCTAAA	GATATTTTAG	AGAAGAATTA	ACCTTTTGCT	120
TCTCCAGTTG	AACATTTGTA	GCAATAAGTC	ATGCAAATAG	AGCTCTCCAC	CTGCTTCTTT	180
CTGTGCCTTT	TGCGATTCTG	CTTTAGTGCC	ACCAGAAGAT	ACTACCTGGG	TGCAGTGGAA	240
CTGTCATGGG	ACTATATGCA	AAGTGATCTC	GGTGAGCTGC	CTGTGGACGC	AAGATTTCCT	300
CCTAGAGTGC	CAAAATCTTT	TCCATTCAAC	ACCTCAGTCG	TGTACAAAAA	GACTCTGTTT	360
GTAGAATTCA	CGGTTCACCT	TTTCAACATC	GCTAAGCCAA	GGCCACCCTG	GATGGGTCTG	420

«· μ ·· *· ·· ·· β · * · · · » · * · « · • · ·< »«·« · · · * • · · · · Β · ··· · · · « · «··· · · · · · · · ·« ·· ·· ·· ·· ··

115

CTAGGTCCTA	CCATCCAGGC	TGAGGTTTAT	GATACAGTGG	TCATTACACT	TAAGAACATG	480
GCTTCCCATC	CTGTCAGTCT	TCATGCTGTT	GGTGTATCCT	ACTGGAAAGC	TTCTGAGGGA	540
GCTGAATATG	ATGATCAGAC	CAGTCAAAGG	GAGAAAGAAG	ATGATAAAGT	CTTCCCTGGT	600
GGAAGCCATA	CATATGTCTG	GCAGGTCCTG	AAAGAGAATG	GTCCAATGGC	CTCTGACCCA	660
CTGTGCCTTA	CCTACTCATA	TCTTTCTCAT	GTGGACCTGG	TAAAAGACTT	GAATTCAGGC	720
CTCATTGGAG	CCCTACTAGT	ATGTAGAGAA	GGGAGTCTGG	CCAAGGAAAA	GACACAGACC	780
TTGCACAAAT	TTATACTACT	TTTTGCTGTA	TTTGATGAAG	GGAAAAGTTG	GCACTCAGAA	840
ACAAAGAACT	CCTTGATGCA	GGATAGGGAT	GCTGCATCTG	CTCGGGCCTG	GCCTAAAATG	900
CACACAGTCA	ATGGTTATGT	AAACAGGTCT	CTGCCAGGTC	TGATTGGATG	CCACAGGAAA	960
TCAGTCTATT	GGCATGTGAT	TGGAATGGGC	ACCACTCCTG	AAGTGCACTC	AATATTCCTC	1020
GAAGGTCACA	CATTTCTTGT	GAGGAACCAT	CGCCAGGCGT	CCTTGGAAAT	CTCGCCAATA	1080
ACTTTCCTTA	CTGCTCAAAC	ACTCTTGATG	GACCTTGGAC	AGTTTCTACT	GTTTTGTCAT	1140
ATCTCTTCCC	ACCAACATGA	TGGCATGGAA	GCTTATGTCA	AAGTAGACAG	CTGTCCAGAG	1200
GAACCCCAAC	TACGAATGAA	AAATAATGAA	GAAGCGGAAG	ACTATGATGA	TGATCTTACT	1260
GATTCTGAAA	TGGATGTGGT	CAGGTTTGAT	GATGACAACT	CTCCTTCCTT	TATCCAAATT	1320
CGCTCAGTTG	CCAAGAAGCA	TCCTAAAACT	TGGGTACATT	ACATTGCTGC	TGAAGAGGAG	1380
GACTGGGACT	ATGCTCCCTT	AGTCCTCGCC	CCCGATGACA	GAAGTTATAA	AAGTCAATAT	1440
TTGAACAATG	GCCCTCAGCG	GATTGGTAGG	AAGTACAAAA	AAGTCCGATT	TATGGCATAC	1500
ACAGATGAAA	CCTTTAAGAC	TCGTGAAGCT	ATTCAGCATG	AATCAGGAAT	CTTGGGACCT	1560
TTACTTTATG	GGGAAGTTGG	AGACACACTG	TTGATTATA.T	TTAAGAATCA	AGCAAGCAGA	1620
CCATATAACA	TCTACCCTCA	CGGAATCACT	GATGTCCGTC	CTTTGTATTC	AAGGAGATTA	1680
CCAAAAGGTG	TAAAACATTT	GAAGGATTTT	CCAATTCTGC	CAGGAGAAAT	ATTCAAATAT	1740
AAATGGACAG	TGACTGTAGA	AGATGGGCCA	ACTAAATCAG	ATCCTCGGTG	CCTGACCCGC	1800
TATTACTCTA	GTTTCGTTAA	TATGGAGAGA	GATCTAGCTT	CAGGACTCAT	TGGCCCTCTC	1860
CTCATCTGCT	ACAAAGAATC	TGTAGATCAA	AGAGGAAACC	AGATAATGTC	AGACAAGAGG	1920
AATGTCATCC	TGTTTTCTGT	ATTTGATGAG	AACCGAAGCT	GGTACCTCAC	AGAGAATATA	1980
CAACGCTTTC	TCCCCAATCC	AGCTGGAGTG	CAGCTTGAGG	ATCCAGAGTT	CCAAGCCTCC	2040
AACATCATGC	ACAGCATCAA	TGGCTATGTT	TTTGATAGTT	TGCAGTTGTC	AGTTTGTTTG	2100
CATGAGGTGG	CATACTGGTA	CATTCTAAGC	ATTGGAGCAC	AGACTGACTT	CCTTTCTGTC	2160

• ·

116

TTCTTCTCTG	GATATACCTT	CAAACACAAA	ATGGTCTATG	AAGACACACT	CACCCTATTC	2220
CCATTCTCAG	GAGAAACTGT	CTTCATGTCG	ATGGAAAACC	CAGGTCTATG	GATTCTGGGG	2280
TGCCACAACT	CAGACTTTCG	GAACAGAGGC	ATGACCGCCT	TACTGAAGGT	TTCTAGTTGT	2340
GACAAGAACA	CTGGTGATTA	TTACGAGGAC	AGTTATGAAG	ATATTTCAGC	ATACTTGCTG	2400
AGTAAAAACA	ATGCCATTGA	ACCAAGAAGC	TTCTCCCAGA	ATTCAAGACA	CCCTAGCACT	2460
AGGCAAAAGC	AATTTAATGC	CACCACAATT	CCAGAAAATG	ACATAGAGAA	GACTGACCCT	2520
TGGTTTGCAC	ACAGAACACC	TATGCCTAAA	ATACAAAATG	TCTCCTCTAG	TGATTTGTTG	2580
ATGCTCTTGC	GACAGAGTCC	TACTCCACAT	GGGCTATCCT	TATCTGATCT	CCAAGAAGCC	2640
AAATATGAGA	CTTTTTCTGA	TGATCCATCA	CCTGGAGCAA	TAGACAGTAA	TAACAGCCTG	2700
TCTGAAATGA	CACACTTCAG	GCCACAGCTC	CATCACAGTG	GGC-ACATGGT	ATTTACCCCT	2760
GAGTCAGGCC	TCCAATTAAG	ATTAAATGAG	AAACTGGGGA	CAACTGCAGC	AACAGAGTTG'	2820
AAGAAACTTG	ATTTCAAAGT	TTCTAGTACA	TCAAATAATC	TGATTTCAAC	AATTCCA.TCA	2880
GACAATTTGG	CAGCAGGTAC	TGATAATACA	AGTTCCTTAG	GACCCCCAAG	TATGCCAGTT	2940
CATTATGATA	GTCAATTAGA	TACCACTCTA	TTTGGCAAAA	AGTCATCTCC	CCTTACTGAG	3000
TCTGGTGGAC	CTCTGAGCTT	GAGTGAAGAA	AATAATGATT	CAAAGTTGTT	AGAATCAGGT	3060
TTAATGAATA	GCCAAGAAAG	TTCATGGGGA	AAAAATGTAT	CGTCAACAGA	GAGTGGTAGG	3120
TTATTTAAAG	GGAAAAGAGC	TCATGGACCT	GCTTTGTTGA	CTAAAGATAA	TGCCTTATTC	3180
AAAGTTAGCA	TCTCTTTGTT	AAAGACAAAC	AAAACTTCCA	ATAATTCAGC	aactaataga	3240
AAGACTCACA	TTGATGGCCC	ATCATTATTA	ATTGAGAATA	GTCCATCAGT	CTGGCAAAAT	3300
ATATTAGAAA	GTGACACTGA	GTTTAAAAAA	GTGACACCTT	TGATTCATGA	CAGAATGCTT	3360
ATGGACAAAA	ATGCTACAGC	TTTGAGGCTA	AATCATATGT	CAAATAAAAC	TACTTCATCA	3420
AAAAACATGG	AAATGGTCCA	ACAGAAAAAA	GAGGGCCCCA	TTCCACCAGA	TGCACAAAAT	3480
CCAGATATGT	CGTTCTTTAA	GATGCTATTC	TTGCCAGAAT	CAGCAAGGTG	GATACAAAGG	3540
ACTCATGGAA	AGAACTCTCT	GAACTCTGGG	CAAGGCCCCA	GTCCAAAGCA	ATTAGTATCC	3600
TTAGGACCAG	AAAAATCTGT	GGAAGGTCAG	AATTTCTTGT	CTGAGAAAAA	CAAAGTGGTA	3660
GTAGGAAAGG	GTGAATTTAC	AAAGGACGTA	GGACTCAAAG	AGATGGTTTT	TCCAAGCAGC	3720
AGAAACCTAT	TTCTTACTAA	CTTGGATAAT	TTACATGAAA	ATAATACACA	CAATCAAGAA	3780
AAAAAAATTC	AGGAAGAAAT	AGAAAAGAAG	GAAACATTAA	TCCAAGAGAA	TGTAGTTTTG	3840
CCTCAGATAC	ATACAGTGAC	TGGCACTAAG	AATTTCATGA	AGAACCTTTT	CTTACTGAGC	3900

• ·

117 • fc

ACTAGGCAAA	ATGTAGAAGG	TTCATATGAG	GGGGCATATG	CTCCAGTACT	TCAAGATTTT	3960
AGGTCATTAA	ATGATTCAAC	AAATAGAACA	AAGAAACACA	CAGCTCATTT	CTCAAAAAAA	4020
GGGGAGGAAG	AAAACTTGGA	AGGCTTGGGA	AATCAAACCA	AGCAAATTGT	AGAGAAATAT	4080
GCATGCACCA	CAAGGATATC	TCCTAATACA	AGCCAGCAGA	ATTTTGTCAC	GCAACGTAGT	4140
AAGAGAGCTT	TGAAACAATT	CAGACTCCCA	CTAGAAGAAA	CAGAACTTGA	AAAAAGGATA	4200
ATTGTGGATG	ACACCTCAAC	CCAGTGGTCC	AAAAACATGA	AACATTTGAC	CCCGAGCACC	4260
CTCACACAGA	TAGACTACAA	TGAGAAGGAG	AAAGGGGCCA	TTACTCAGTC	TCCCTTATCA	4320
GATTGCCTTA	CGAGGAGTCA	TAGCATCCCT	CAAGCAAATA	GATCTCCATT	ACCCATTGCA	4380
AAGGTATCAT	CATTTCCATC	TATTAGACCT	ATATATCTGA	CCAGGGTCCT	ATTCCAAGAC	4440
AACTCTTCTC	ATCTTCCAGC	AGCATCTTAT	AGAAAGAAAG	ATTCTGGGGT	CCAAGAAAGC	4500
AGTCATTTCT	TACAAGGAGC	CAAAAAAAAT	AACCTTTCTT	TAGCCATTCT	AACCTTGGAG	4560
ATGACTGGTG	ATCAAAGAGA	GGTTGGCTCC	CTGGGGACAA	GTGCCACAAA	TTCAGTCACA	4620
TACAAGAAAG	TTGAGAACAC	TGTTCTCCCG	AAACCAGACT	TGCCCAAAAC	ATCTGGC4AA	4680
GTTGAATTGC	TTCCAAAAGT	TCACATTTAT	CAGAAGGACC	TATTCCCTAC	GGAAACTAGC	4740
AATGGGTCTC	CTGGCCATCT	GGATCTCGTG	GAAGGGAGCC	TTCTTCAGGG	AACAGAGGGA	4800
GCGATTAAGT	GGAATGAAGC	AAACAGACCT	GGAAAAGTTC	CCTTTCTGAG	AGTAGCAACA	4860
GAAAGCTCTG	CAAAGACTCC	CTCCAAGCTA	TTGGATCCTC	TTGCTTGGGA	TAACCACTAT	4920
GGTACTCAGA	TACCAAAAGA	AGAGTGGAAA	TCCCAAGAGA	AGTCACCAGA	AAAAACAGCT	4980
TTTAAGAAAA	AGGATACCAT	TTTGTCCCTG	AACGCTTGTG	AAAGCAATCA	TGCAATAGCA	5040
GCAATAAATG	AGGGACAAAA	TAAGCCCGAA	ATAGAAGTCA	CCTGGGCAAA	GCAAGGTAGG	5100
ACTGAAAGGC	TGTGCTCTCA	AAACCCACCA	GTCTTGAAAC	GCCATCAACG	GGAAATAACT	5160
CGTACTACTC	TTCAGTCAGA	TCAAGAGGAA	ATTGACTATG	ATGATACCAT	ATCAGTTGAA	5220
ATGAAGAAGG	AAGATTTTGA	CATTTATGAT	GAGGATGAAA	ATCAGAGCCC	CCGCAGCTTT	5280
CAAAAGAAAA	CACGACACTA	TTTTATTGCT	GCAGTGGAGA	GGCTCTGGGA	TTATGGGATG	5340
AGTAGCTCCC	CACATGTTCT	AAGAAACAGG	GCTCAGAGTG	GCAGTGTCCC	TCAGTTCAAG	5400
AAAGTTGTTT	TCCAGGAATT	TACTGATGGC	TCCTTTACTC	AGCCCTTATA	CCGTGGAGAA	5460
CTAAATGAAC	ATTTGGGACT	CCTGGGGCCA	TATATAAGAG	CAGAAGTTGA	AGATAATATC	5520
ATGGTAACTT	TCAGAAATCA	GGCCTCTCGT	CCCTATTCCT	TCTATTCTAG	CCTTATTTCT	5580
TATGAGGAAG	ATCAGAGGCA	AGGAGCAGAA	CCTAGAAAAA	ACTTTGTCAA	GCCTAATGAA	5640

• · · · · · ···· · · · · ·

118 ···· · · · ···

ACCAAAACTT	ACTTTTGGAA	AGTGCAACAT	CATATGGCAC	CCACTAAAGA	TGAGTTTGAC	5700
TGCAAAGCCT	GGGCTTATTT	CTCTGATGTT	GACCTGGAAA	AAGATGTGCA	CTCAGGCCTG	5760
ATTGGACCCC	TTCTGGTCTG	CCACACTAAC	ACACTGAACC	CTGCTCATGG	GAGACAAGTG	5820
ACAGTACAGG	AATTTGCTCT	GTTTTTCACC	ATCTTTGATG	AGACCAAAAG	CTGGTACTTC	5880
ACTGAAAATA	TGGAAAGAAA	CTGCAGGGCT	CCCTGCAATA	TCCAGATGGA	AGATCCCACT	5940
TTTAAAGAGA	ATTATCGCTT	CCATGCAATC	AATGGCTACA	TAATGGATAC	ACTACCTGGC	6000
TTAGTAATGG	CTCAGGATCA	AAGGATTCGA	TGGTATCTGC	TCAGCATGGG	CAGCAATGAA	6060
AACATCCATT	CTATTCATTT	CAGTGGACAT	GTGTTCACTG	TACGAAAAAA	AGAGGAGTAT	6120
AAAATGGCAC	TGTACAATCT	CTATCCAGGT	GTTTTTGAGA	CAGTGGAAAT	GTTACCATCC	6180
AAAGCTGGAA	TTTGGCGGGT	GGAATGCCTT	ATTGGCGAGC	ATCTACATGC	TGGGATGAGC	6240
ACACTTTTTC	TGGTGTACAG	CAATAAGTGT	CAGACTCCCC	TGGGAATGGC	TTCTGGACAC	6300
ATTAGAGATT	TTCAGATTAC	AGCTTCAGGA	CAATATGGAC	AGTGGGCCCC	AAAGCTGGCC	6360
AGACTTCATT	ATTCCGGATC	AATCAATGCC	TGGAGCACCA	AGGAGCCCTT	TTCTTGGATC	6420
AAGGTGGATC	TGTTGGCACC	AATGATTATT	CACGGCATCA	AGACCCAGGG	TGCCCGTCAG	6480
AAGTTCTCCA	GCCTCTACAT	CTCTCAGTTT	ATCATCATGT	ATAGTCTTGA	TGGGAAGAAG	6540
TGGCAGACTT	ATCGAGGAAA	TTCCACTGGA	ACCTTAATGG	TCTTCTTTGG	CAATGTGGAT	6600
TCATCTGGGA	TAAAACACAA	TATTTTTAAC	CCTCCAATTA	TTGCTCGATA	CATCCGTTTG·	6660
CACCCAACTC	ATTATAGCAT	TCGCAGCACT	CTTCGCATGG	AGTTGATGGG	CTGTGATTTA	6720
AATAGTTGCA	GCATGCCATT	GGGAATGGAG	AGTAAAGCAA	TATCAGATGC	ACAGATTACT	6780
GCTTCATCCT	ACTTTACCAA	TATGTTTGCC	ACCTGGTCTC	CTTCAAAAGC	TCGACTTCAC	6840
CTCCAAGGGA	GGAGTAATGC	CTGGAGACCT	CAGGTGAATA	ATCCAAAA.GA	GTGGCTGCAA	6900
GTGGACTTCC	AGAAGACAAT	GAAAGTCACA	GGAGTAACTA	CTCAGGGAGT	AAAATCTCTG	6960
CTTACCAGCA	TGTATGTGAA	GGAGTTCCTC	ATCTCCAGCA	GTCAAGATGG	CCATCAGTGG	7020
ACTCTCTTTT	TTCAGAATGG	CAAAGTAAAG	GTTTTTCAGG	GAAATCAAGA	CTCCTTCACA	7080
CCTGTGGTGA	ACTCTCTAGA	CCCACCGTTA	CTGACTCGCT	ACCTTCGAAT	TCACCCCCAG	7140
AGTTGGGTGC	ACCAGATTGC	CCTGAGGATG	GAGGTTCTGG	GCTGCGAGGC	ACAGGACCTC	7200
TACTGAGGGT	GGCCACTGCA	GCACCTGCCA	CTGCCGTCAC	CTCTCCCTCC	TCAGCTCCAG	7260
GGCAGTGTCC	CTCCCTGGCT	TGCCTTCTAC	CTTTGTGCTA	AATCCTAGCA	GACACTGCCT	7320
TGAAGCCTCC	TGAATTAACT	ATCATCAGTC	CTGCATTTCT	TTGGTGGGGG	GCCAGGAGGG	7380

• ·

119

TGCATCCAAT	TTAACTTAAC	TCTTACCTAT	TTTCTGCAGC	TGCTCCCAGA	TTACTCCTTC	7440
CTTCCAATAT	AACTAGGCAA	AAAGAAGTGA	GGAGAAACCT	GCATGAAAGC	ATTCTTCCCT	7500
GAAAAGTTAG	GCCTCTCAGA	GTCACCACTT	CCTCTGTTGT	AGAAAAACTA	TGTGATGAAA	7560
CTTTGAAAAA	GATATTTATG	ATGTTAACAT	TTCAGGTTAA	GCCTCATACG	TTTAAAATAA	7620
AACTCTCAGT	TGTTTATTAT	CCTGATCAAG	CATGGAACAA	AGCATGTTTC	AGGATCAGAT	7680
CAATACAATC	TTGGAGTCAA	AAGGCAAATC	ATTTGGACAA	TCTGCAAAAT	GGAGAGAATA	7740
CAATAACTAC	TACAGTAAAG	TCTGTTTCTG	CTTCCTTACA	CATAGATATA	ATTATGTTAT	7800
TTAGTCATTA	TGAGGGGCAC	ATTCTTATCT	CCAAAACTAG	CATTCTTAAA	CTGAGAATTA	7860
TAGATGGGGT	TCAAGAATCC	CTAAGTCCCC	TGAAATTATA	TAAGGCATTC	TGTATAAATG	7920
CAAATGTGCA	TTTTTCTGAC	GAGTGTCCAT	AGATATAAAG	CCATTGGTCT	TAATTCTGAC	7980
CAATAAAAAA	ATAAGTCAGG	AGGATGCAAT	TGTTGAAAGC	TTTGAAATAA	AATAACATGT	8040
CTTCTTGAAA	TTTGTGATGG	CCAAGAAAGA	AAATGATGAT	GACATTAGGC	TTCTAAAGGA	8100
CATACATTTA	ATATTTCTGT	GGAAATATGA	GGAAAATCCA	TGGTTATCTG	AGATAGGAGA	8160
TACAAACTTT	GTAATTCTAA	TAATGCACTC	AGTTTACTCT	CTCCCTCTAC	TAATTTCCTG	8220
CTGAAAATAA	CACAACAAAA	ATGTAACAGG	GGAAATTATA	TACCGTGACT	GAAAACTAGA	8280
GTCCTACTTA	CATAGTTGAA	ATATCAAGGA	GGTCAGAAGA	AAATTGGACT	GGTGAAAACA	8340
GAAAAAACAC	TCCAGTCTGC	CATATCACCA	CACAATAGGA	TCCCCCTTCT	TGCCCTCCAC	8400
CCCCATAAGA	TTGTGAAGGG	TTTACTGCTC	CTTCCATCTG	CCTGCACCCC	TTCACTATGA	8460
CTACACAGAA	CTCTCCTGAT	AGTAAAGGGG	GCTGGAGGCA	AGGATAAGTT	ATAGAGCAGT	8520
TGGAGGAAGC	ATCCAAAGAC	TGCAACCCAG	GGCAAATGGA	AAACAGGAGA	TCCTAATATG	8580
AAAGAAAAAT	GGATCCCAAT	CTGAGAAAAG	GCAAAAGAAT	GGCTACTTTT	TTCTATGCTG	8640
GAGTATTTTC	TAATAATCCT	GCTTGACCCT	TATCTGACCT	CTTTGGAAAC	TATAACATAG	8700
CTGTCACAGT	ATAGTCACAA	TCCACAAATG	ATGCAGGTGC	AAATGGTTTA	TAGCCCTGTG	8760
AAGTTCTTAA	AGTTTAGAGG	CTAACTTACA	GAAATGAATA	AGTTGTTTTG	TTTTATAGCC	8820
CGGTAGAGGA	GTTAACCCCA	AAGGTGATAT	GGTTTTATTT	CCTGTTATGT	TTAACTTGAT	8880
AATCTTATTT	TGGCATTCTT	TTCCCATTGA	CTATATACAT	CTCTATTTCT	CAAATGTTCA	8940
TGGAACTAGC	TCTTTTATTT	TCCTGCTGGT	TTCTTCAGTA	ATGAGTTAAA	TAAAACATTG	9000

ACACATACA

9009 • · • · • · • · • ·

120 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 2332 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (F) TYP TKÁNĚ: Játra (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Ala 1

Thr

Arg

Tyr 5

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val 10

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp 15

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp 20

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro 25

Val

Asp

Ala

Arg

Phe 30

Pro

Arg

Val

Pro 35

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe 40

Asn

Thr

Ser

Val

Val 45

Tyr

Lys

Thr

Leu 50

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 55

Val

His

Leu

Phe

Asn 60

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg 65

Pro

Trp

Met

Gly 70

Leu

Gly

Pro

Thr 75

Ile

Gin

Ala

Glu

Val 80

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 85

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn 90

Met

Ala

Ser

His

Pro 95

Val

Ser

Leu

His

Ala 100

Val

Gly

Val

Ser

Tyr 105

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu 110

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp 115

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin 120

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp 125

Asp

Lys

Val

Phe

Pro 130

Gly

Ser

His

Thr 135

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 140

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 145

Pro

Met

Ala

Ser

Asp 150

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr 155

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 160

His

Val

Asp

Leu

Val 165

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 170

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 175

Leu

• · • · • · • ·

121 • · · · · ·· · · · · · ···· ···· ···· • · · ··· ······ · · · ···· · · · ···· • · ·· ·· ·· ·· ··

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin 180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys 195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala 210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val 225 230 235

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr 245 250

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser· Ile Phe 260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu 275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp 290 295 300

Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gin His Asp 305 310 315

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin 325 * 330

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu 340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro 355 360 365

Ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp 370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu 385 390 395

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn 405 410

Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala 420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu Ser 435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu 450 455 460

Thr Leu

Ser Trp

Ala Ser

Asn Arg 240

Trp His 255

Leu Glu

Glu Ile

Leu Gly

Gly Met 320

Leu Arg 335

Thr Asp

Ser Phe

Val His

Val Leu 400

Gly Pro 415

Tyr Thr

Gly Ile

Ile Ile

Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 • · ·

122

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin 580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605

Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620

Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 ” 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 740 745 750

Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 755 760 765

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gin Asn 770 775 780 • · • · ·· ·· ·· · · • · * · · · · · · · · · ···· ···· ···· • ·· ··· · ····· · · · ···· ·· · · · · · ·· ·· · · · · · · ··

123

Val 785

Ser

Asp

Leu 790

Leu

Met

Leu

Arg 795

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro 800

His

Gly

Leu

Ser

Leu 805

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu 810

Ala

L.ys

Tyr

Glu

Thr 815

Phe

Ser

Asp

Pro 820

Ser

Pro

Gly

Ala

Ile 825

Asp

Ser

Asn

Ser 830

Leu

Ser

Glu

Met

Thr 835

His

Phe

Arg

Pro

Gin 840

Leu

His

Ser

Gly 845

Asp

Met

Val

Phe

Thr 850

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu 855

Gin

Leu

Arg

Leu

Asn 860

Glu

Lys

Leu

Gly

Thr 865

Thr

Ala

Thr

Glu 870

Leu

Lys

Leu

Asp 875

Phe

Lys

Val

Ser

Ser 8 80

Thr

Ser

Asn

Leu 885

Ile

Ser

Thr

Ile

Pro 890

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala 895

Ala

Gly

Thr

Asp

Asn 900

Thr

Ser

Leu

Gly 905

Pro

Ser

Met

Pro 910

Val

His

Tyr

Asp

Ser 915

Gin

Leu

Asp

Thr

Thr 920

Leu

Phe

Gly

Lys

Lys 925

Ser

Pro

Leu

Thr 930

Glu

Ser

Gly

Pro 935

Leu

Ser

Leu

Ser

Glu 940

Glu

Asn

Asp

Ser 945

Lys

Leu

Glu

Ser 950

Gly

Leu

Met

Asn

Ser 955

Gin

Glu

Ser

Trp 960

Gly

Lys

Asn

Val

Ser 965

Ser

Thr

Glu

Ser

Gly 970

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly 975

Lys

Arg

Ala

His

Gly 980

Pro

Ala

Leu

Thr 935

Lys

Asp

Asn

Ala

Leu 990

Phe

Lys

Val

Ser

Ile 995

Ser

Leu

Lys

Thr 100C

Asn >

Lys

Thr

Ser

Asn 1005

Asn )

Ser

Ala

Thr

Asn Arg 1010

Lys

Thr

His

Ile Asp 1015

Gly

Pro

Ser

Leu Leu 1020

Ile

Glu

Asn

Ser Pro 1025

Ser

Val

Trp

Gin Asn 1030

Ile-

Leu

Glu

Ser Asp 1035

Thr

Glu

Phe

Lys 1040

Lys

Val

Thr

Pro

Leu Ile 1045

His

Asp

Arg

Met Leu 1050

Met

Asp

Lys

Asn 105Ξ

Ala

Thr

Ala

Leu

Arg

Leu

Asn

His

Met

Ser

Asn

Lys

Thr

Ser

Lys

1060 1065 1070

Asn Met Glu Met Val Gin Gin Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp 1075 1080 1085

124

Ala Gin Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1090 1095 1100

Ser Ala 1105

Arg

Trp

Ile

Gin Arg 1110

Thr

His

Gly

Lys Asn 1115

Ser

Leu

Asn

Ser 1120

Gly Gin

Gly

Pro

Ser 1125

Pro Lys

Gin

Leu

Val 1130

Ser Leu

Gly

Pro

Glu 1135

Lys 1

Ser Val

Glu

Gly 1140

Gin

Asn Phe

Leu

Ser 1145

Glu

Lys Asn

Lys

Val 115C

Val 1

Val

Gly Lys

Gly 1155

Glu

Phe

Thr Lys

Asp 1160

Val

Gly

Leu Lys

Glu 1165

Met

Val

Phe

Pro Ser 1170

Ser 1

Arg

Asn

Leu Phe 1175

Leu

Thr

Asn

Leu Asp 118C

Asn

Leu

His

Glu

Asn Asn 1185

Thr

His

Asn

Gin Glu 1190

Lys

Ile

Gin Glu 1195

Glu

Ile

Glu

Lys 1200

Lys Glu

Thr

Leu

Ile 1205

Gin Glu

Asn

Val

Val 121C

Leu Pro

Gin

Ile

His 1215

Thr 1

Val Thr

Gly

Thr 1220

Lys

Asn Phe

Met

Lys 1225

Asn 1

Leu Phe

Leu

Leu 123C

Ser 1

Thr

Arg Gin

Asn 1235

Val 1

Glu

Gly Ser

Tyr 124C

Glu 1

Giy

Ala Tyr

Ala 1245

Pro

Val

Leu

Gin Asp 125C

Phe 1

Arg

Ser

Leu Asn 1255

Asp 1

Ser

Thr

Asn Arg 126C

Thr 1

Lys

His

Thr Ala 1265

His

Phe

Ser

Lys Lys 1270

Gly

Glu

Glu Asn 1275

Leu

Glu

Gly

Leu 1280

Gly Asn

Gin

Thr

Lys 1285

Gin Ile

Val

Glu

Lys 1290

Tyr Ala 1

Cys

Thr

Thr 1295

Arg 1

Ile Ser

Pro

Asn 1300

Thr 1

Ser Gin

Gin

Asn 1305

Phe

Val Thr

Gin

Arg 131C

Ser 1

Lys

Arg Ala

Leu 1315

Lys

Gin

Phe Arg

Leu 132C

Pro

Leu

Glu Glu

Thr 1325

Glu

Leu

Glu

Lys Arg 133C

Ile 1

Ile

Val

Asp Asp 1335

Thr f

Ser

Thr

Gin Trp 134C

Ser 1

Lys

Asn

Met

Lys His 1345

Leu

Thr

Pro

Ser Thr 1350

Leu

Thr

Gin

Ile Asp 1355

Tyr

Asn

Glu

Lys 1360

Glu Lys

Gly

Ala

Ile

Thr Gin

Ser

Pro

Leu

Ser Asp

Cys

Leu

Thr

Arg

1365 1370 1375

Ser His Ser Ile Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1385 1390 ·· · · ·· ·· ·· ···· ···· ···· ···· ···· ···· • ·· · · · · ····· · · · ···· · · · · · · · • · · · ·· · · · · · ·

125

Val

Ser

Ser 1395

Phe

Pro

Ser

Ile

Arg 1400

Pro

Ile

Tyr

Leu

Thr Arg 1405

Val

Leu

Phe

Gin

Asp

Asn

Ser

His

Leu

Pro

Ala

Ser

Tyr Arg

Lys

1410

1415

1420

Asp

Ser

Gly

Val

Gin

Glu

Ser

His

Phe

Leu

Gin

Gly Ala

Lys

1425

1430

1435

1440

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr

Leu

Glu

Met

Thr Gly

Asp

Gin

1445

1450

1455

Arg

Glu

Val

Gly

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser

Ala

Thr

Asn

Ser Val

Thr

Tyr

1460

1465

1470

Lys

Val

Glu

Asn

Thr

Val

Leu

Pro

Lys

Pro

Asp

Leu Pro

Lys

Thr

147 5

1480

1485

Ser

Gly

Lys

Val

Glu

Leu

Pro

Lys

Val

His

Ile

Tyr Gin

Lys

Asp

1490

1495

1500

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Thr

Ser

Asn

Gly

Ser

Pro

Gly

His Leu

Asp

Leu

1505

1510

1515

1520

Val

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Gly

Thr

Glu

Gly

Ala

Ile Lys

Trp

Asn

1525

1530

1535

Glu

Ala

Asn

Arg

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Phe

Leu

Arg

Val Ala

Thr

Glu

1540

1545

1550

Ser

Ala

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Asp

Pro

Leu Ala

Trp

Asp

1555

1560

1565

Asn

His

Tyr

Gly

Thr

Gin

Ile

Pro

Lys

Glu

Trp

Lys Ser

Gin

Glu

1570

1575

1580

Lys

Ser

Pro

Glu

Lys

Thr

Ala

Phe

Lys

Asp

Thr Ile

Leu

Ser

1585

1590

1595

1600

Leu

Asn

Ala

Cys

Glu

Ser

Asn

His

Ala

Ile

Ala

Ile Asn

Glu

Gly

1605

1610

1615

Gin

Asn

Lys

Pro

Glu

Ile

Glu

Val

Thr

Trp

Ala

Lys

Gin Gly

Arg

Thr

1620

1625

1630

Glu

Arg

Leu

Cys

Ser

Gin

Asn

Pro

Val

Leu

Lys

Arg His

Gin

Arg

1635

1640

1645

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

Glu

Glu Ile

Asp

Tyr

1650

1655

1660

Asp

Thr

Ile

Ser

Val

Glu

Met

Lys

Glu

Asp

Phe Asp

Ile

Tyr

1665

1670

1675

1680

Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1685 1690 1695

4 > ·

44 » 4 4 4 » 4 · «

126

His

Tyr

Phe

Ile Ala 1700

Ala

Val

Glu

Arg 1705

Leu

Trp Asp

Tyr

Gly Met 1710

Ser

Pro

His Val

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala

Gin Ser

Gly

Ser Val

Pro

1715

1720

1725

Gin

Phe

Lys

Lys Val

Val

Phe

Gin

Glu

Phe

Thr Asp

Gly

Ser Phe

Thr

1730

1735

1740

Gin

Pro

Leu

Tyr Arg

Gly

Glu

Leu

Asn

Glu

His Leu

Gly

Leu Leu

Gly

1745

1750

1755

1760

Pro

Tyr

Ile

Arg Ala

Glu

Val

Glu

Asp

Asn'

Ile Met

Val

Thr Phe

Arg

1765

1770

1775

Asn

Gin

Ala

Ser Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser Ser

Leu

Ile Ser

Tyr

1780

1785

1790

Glu

Asp

Gin Arg

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro

Arg Lys

Asn

Phe Val

Lys

1795

1800

1805

Pro

Asn

Glu

Thr Lys

Thr

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val Gin

His

His Met

Ala

1810

1815

1820

Pro

Thr

Lys

Asp Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala

Trp Ala

Tyr

Phe Ser

Asp

1825

1830

1835

1840

Val

Asp

Leu

Glu Lys

Asp

Val

His

Ser

Gly

Leu Ile

Gly

Pro Leu

Leu

1845

1850

1855

Val

Cys

His

Thr Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Ala

His Gly

Arg

Gin Val

Thr

1860

1865

1870

Val

Gin

Glu

Ph*s A1 a

Leu

Phe

Thr

Ile

Phe Asp

Glu

Thr Lys

Ser

1875

1880

1885

Trp

Tyr

Phe

Thr Glu

Asn

Met

Glu

Arg

Asn

Cys Arg

Ala

Pro Cys

Asn

1890

1895

1900

Ile

Gin

Met

Glu Asp

Pro

Thr

Phe

Lys

Glu

Asn Tyr

Arg

Phe His

Ala

1905

1910

1915

1920

Ile

Asn

Gly

Tyr Ile

Met

Asp

Thr

Leu

Pro

Gly Leu

Val

Met Ala

Gin

192:

5

1930

1935

Asp

Gin

Arg

Ile Arg

Trp

Tyr

Leu

Ser

Met Gly

Ser

Asn Glu

Asn

1940

1945

1950

Ile

His

Ser

Ile His

Phe

Ser

Gly

His

Val

Phe Thr

Val

Arg Lys

Lys

1955

1960

1965

Glu

Tyr

Lys Met

Ala

Leu

Tyr

Asn

Leu

Tyr Pro

Gly Val Phe

Glu

1970

1975

1980

Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys 1985 1990 1995 2000 • · fc • fc fcfc • · · fc • · · · • fcfc fc fcfc · • fc fcfc

127

Leu

Ile

Gly

Glu

His 2005

Leu

His

Ala

Gly

Met 2010

Ser 1

Thr

Leu

Phe

Leu Val 2015

Tyr

Ser

Asn

Lys

Cys

Gin

Thr

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

His Ile

2020

2025

2030

Arg

Asp

Phe

Gin

Ile

Thr

Ala

Ser

Gly

Gin

Tyr

Gly

Gin

Trp

Ala Pro

2035

2040

2045

Lys

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Al 3

Trp

Ser Thr

2050

2055

2060

Lys

Glu

Pro

Phe

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met Ile

2065

2070

2075

2080

Ile

His

Gly

Ile

Lys

Thr

Gin

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Phe

Ser

Ser Leu

2085

2090

2095

Tyr

Ile

Ser

Gin

Phe

Ile

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

Lys

Lys Trp

2100

2105

2110

Gin

Thr

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Phe Gly

2115

2120

2125

Asn

Val

Asp

Ser

Gly

Ile

Lys

His

Asn,

Ile

Phe

Asn

Pro

Pro Ile

2130

2135

2140

Ile

A_la

A.rg

Tyr

Ile

A.rg

Leu

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

Ile

A.rg Ser

2145

2150

2155

2160

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser Met

2165

2170

2175

Pro

Leu

Gly

Met

Glu

Ser

Lys

Ala

Ile

Ser

Asp

Ala

Gin

Ile

Thr Ala

2180

2185

2190

Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn

Met

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Lys Ala

2195

2200

2205

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Ser

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Gin

Val Asn

2210

2215

2220

Asn

Pro

Lys

Glu

Trp

Leu

Gin

Val

Asp

Phe

Gin

Lys

Thr

Met

Lys Val

2225

2230 .

2235

2240

Thr

Gly

Val

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Met Tyr

2245

2250

2255

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

Ile

Ser

Gin

Asp

Gly

His

Gin

Trp Thr

2260

2265

2270

Leu

Phe

Gin

Asn

Gly

Lys

Val

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin Asp

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg 2290 2295 2300

2275 2280 2285 »to ·· «<f ·· » » « t · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · ·

99 ··

128

Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp Val His Gin Ile Ala Leu Arg 2305 2310 2315 2320

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 2325 2330 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 1130 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Prase (F) TYP TKÁNĚ: krev (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..1130 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt= oblast /poznámka= cDNA kódující doménu A2 prasečího faktoru VIII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

TAAGCACCCT AAGACGTGGG TGCACTACAT CTCTGCAGAG GAGGAGGACT GGGACTACGC 60

CCCCGCGGTC CCCAGCCCCA GTGACAGAAG TTATAAAAGT CTCTACTTGA ACAGTGGTCC 120

TCAGCGAATT GGTAGGAAAT ACAAAAAAGC TCGATTCGTC GCTTACACGG ATGTAACATT 180

TAAGACTCGT AAAGCTATTC CGTATGAATC AGGAATCCTG GGACCTTTAC TTTATGGAGA 240

AGTTGGAGAC ACACTTTTGA TTATATTTAA GAATAAAGCG AGCCGACCAT ATAACATCTA 300

CCCTCATGGA ATCACTGATG TCAGCGCTTT GCACCCAGGG AGACTTCTAA AAGGTTGGAA 360

ACATTTGAAA. GACATGCCAA TTCTGCCAGG AGAGACTTTC AAGTATAAAT GGACAGTGAC 420

TGTGGAAGAT GGGCCAACCA AGTCCGATCC TCGGTGCCTG ACCCGCTACT ACTCGAGCTC 480

CATTAATCTA GAGAAAGATC TGGCTTCGGG ACTCATTGGC CCTCTCCTCA TCTGCTACAA 540

AGAATCTGTA GACCAAAGAG GAAACCAGAT GATGTCAGAC AAGAGAAACG TCATCCTGTT 600

TTCTGTATTC GATGAGAATC AAAGCTGGTA CCTCGCAGÁG AATATTCAGC GCTTCCTCCC 660 • · • » • ·

	129	• •	• · · · · · • · · · · •« · · · ·	• · · · · • · • ·
CAATCCGGAT	GGATTACAGC	CCCAGGATCC	AGAGTTCCAA	GCTTCTAACA	TCATGCACAG	720
CATCAATGGC	TATGTTTTTG	ATAGCTTGCA	GCTGTCGGTT	TGTTTGCACG	AGGTGGCATA.	780
CTGGTACATT	CTAAGTGTTG	GAGCACAGAC	GGACTTCCTC	TCCGTCTTCT	TCTCTGGCTA	840
CACCTTCAAA	CACAAAATGG	TCTATGAAGA	CACACTCACC	CTGTTCCCCT	TCTCAGGAGA	900
AACGGTCTTC	ATGTCAATGG	AAAACCCAGG	TCTCTGGGTC	CTAGGGTGCC	ACAACTCAGA	960
CTTGCGGAAC	AGAGGGATGA	CAGCCTTACT	GAAGGTGTAT	AGTTGTGACA	GGGACATTGG	1020
TGATTATTAT	GACAACACTT	ATGAAGATAT	TCCAGGCTTC	TTGCTGAGTG	GAAAGAATGT	1080
CATTGAACCC	AGAAGCTTTG	CCCAGAATTC	AAGACCCCCT	AGTGCGAGCA		1130

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 368 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY:	protein
(iii)	HYPOTETICKÁ:	ano
(iv)	OPAČNÁ ORIENTACE: ne
(v)	TYP FRAGMENTU	: N-koncový
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ

(A) ORGANISMUS: Prase (F) TYP TKÁNĚ: slezina (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: Protein (B) POZICE: 1..368 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= predikovaná aminokyselinová sekvence domény A2 prasečího faktoru VIII, definovaná jako zbytky homologní k lidskému faktoru VIII, aminokyseliny 373-740. Zbytky 1-4 jsou ze známé prasečí aminokyselinové sekvence.

(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE	; S	IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
Ser 1	Val Ala Lys Lys 5	His Pro	Lys	Thr Trp Val His Tyr Ile Ser Ala 10 15
Glu	Glu Glu Asp Trp 20	Asp Tyr	Ala	Pro Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp 25 30
Arg	Ser Tyr Lys Ser 35	Leu Tyr	Leu 40	Asn Ser Gly Pro Gin Arg Ile Gly 45

• · • · • · · · * · · · * ·· · » ··· · · * · • · · · · · · ··· • · · · · · · ·· · 3 · · · ·

130

Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe 50 55 60

Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu

70 75 80

Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys

90 95

Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Ser 100 105 110

Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys Gly Trp Lys His Leu Lys Asp 115 120 125

Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr 130 135 140

Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr

145 150 155 160

Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile

165 170 175

Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn 180 185 190

Gin Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp 195 200 205

Glu Asn Gin Ser Trp Tyr Leu Ala Glu Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro 210 215 220

Asn Pro Asp Gly Leu Gin Pro Gin Asp Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn

225 230 235 240

Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser

245 250 255

Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala 260 265 270

Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His 275 280 285

Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu 290 295 ' 300

Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys

305 310 315 320

His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val

325 330 335

Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu 340 345 350 • · • · · · • · · · • · • · • · · · • · · · • · · · • · · · • · · *

131

Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg 355 360 365 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 7493 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: repetice (B) POZICE: 1. .407 (D) DALŠÍ INFORMACE: /typ repetice= koncová /poznámka= 5' UTR (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 7471..7476 (D) DALŠÍ INFORMACE: /funkce= signál polyA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: repetice (B) POZICE: 7368..7493 (D) DALŠÍ INFORMACE: / typ repetice = koncová /poznámka= 3' UTR (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 408..7367 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt- koagulační faktor VIII (X) INFORMACE K PUBLIKACI:

(A) AUTOŘI: Elder, F.

Lakich, D.

Gitschier, J.

(B) TITUL: Sequence of the murine Factor VIII cDNA (C) ČASOPIS: Genomics (D) DÍL: 16 (F) STRÁNKY: 374-379 (G) DATUM: 1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

TCTAGAGTTT CTTTGCTACA GGTACCAAGG AACAGTCTTT TAGAATAGGC TAGGAATTTA « · · · · · · * · ···· · · · · · • ·

	132	• · · · · · • · · · · ·	• · • ·
AATACACCTG	AACGCCCCTC	CTCAGTATTC	TGTTCCTTTT	CTTAAGGATT	CAAACTTGTT	120
AGGATGCACC	CAGCAGGAAA	TGGGTTAAGC	CTTAGCTCAG	CCACTCTTCC	TATTCCAGTT	180
TTCCTGTGCC	TGCTTCCTAC	TACCCAAAAG	GAAGTAATCC	TTCAGATCTG	TTTTGTGCTA	240
ATGCTACTTT	CACTCACAGT	AGATAAACTT	CCAGAAAATC	CTCTGCAAAA	TATTTAGGAC	300
TTTTTACTAA	ATCATTACAT	TTCTTTTTGT	TCTTAAAAGC	TAAAGTTATT	TTAGAGAAGA	360
GTTAAATTTT	CATTTCTTTA	GTTGAACATT	TTCTAGTAAT	AAAAGCCATG	CAAATAGCAC	420
TCTTCGCTTG	CTTCTTTCTG	AGCCTTTTCA	ATTTCTGCTC	TAGTGCCATC	AGAAGATACT	480
ACCTTGGTGC	AGTGGAATTG	TCCTGGAACT	ATATTCAGAG	TGATCTGCTC	AGTGTGCTGC	540
ATACAGACTC	AAGATTTCTT	CCTAGAATGT	CAACATCTTT	TCCATTCAAC	ACCTCCATCA	600
TGTATAAAAA	GACTGTGTTT	GTAGAGTACA	AGGACCAGCT	TTTCAACATT	GCCAAGCCCA	660
GGCCACCCTG	GATGGGTTTG	CTAGGTCCTA	CCATTTGGAC	TGAGGTTCAT	GACACAGTGG	720
TCATTACACT	TAAAAACATG	GCTTCTCATC	CTGTCAGTCT	TCA.TGCTGTT	GGTGTGTCCT	780
ACTGGAAAGC	TTCTGAGGGA	GATGAATATG	AAGATCAGAC	AAGCCAAATG	GAGAAGGAAG	840
ATGATAAAGT	TTTCCCTGGT	GAAAGTCATA	CTTATGTTTG	GCAAGTCCTG	AAAGAGAATG	900
GTCCAATGGC	CTCTGACCCT	CCATGTCTCA	CTTACTCATA	TATGTCTCAT	GTGGATCTGG	960
TGAAAGATTT	GAATTCAGGC	CTCATTGGAG	CTCTGCTAGT	ATGTAAAGAA	GGCAGTCTCT	1020
CCAAAGAAAG	AACACAGATG	TTGTACCAAT	TTGTACTGCT	TTTTGCTGTA	TTTGATGAAG	1080
GGAAGAGCTG	GCACTCAGAA	ACAAACGACT	CTTATACACA	GTCTATGGAT	TCTGCATCTG	1140
CTAGAGACTG	GCCTAAAATG	CACACAGTCA	ATGGCTATGT	AAACAGGTCT	CTTCCAGGTC	1200
TGATTGGATG	CCATAGGAAA	TCAGTCTACT	GGCACGTGAT	TGGAATGGGC	ACCACTCCTG	1260
AAATACACTC	AATATTCCTC	GAAGGTCACA	CATTTTTTGT	GAGGAACCAC	CGTCAAGCTT	1320
CATTGGAGAT	ATCACCAATA	ACTTTCCTTA	CTGCTCAAAC	ACTCTTGATA	GATCTTGGGC	1380
AGTTCCTACT	ATTTTGTCAT	ATCTCTTCCC	ATAAACATGA	TGGCATGGAA	GCTTATGTCA	1440
AAGTAGATAG	CTGCCCTGAG	GAATCCCAAT	GGCAAAAGAA	AAATAATAAT	GAGGAAATGG	1500
AAGATTATGA	TGATGATCTT	TATTCAGAAA	TGGATATGTT	CACATTGGAT	TATGACAGCT	1560
CTCCTTTTAT	CCAAATTCGC	TCGGTTGCTA	AAAAGTACCC	TAAAACTTGG	ATACATTATA	1620
TTTCTGCTGA	GGAGGAAGAC	TGGGACTATG	CACCTTCAGT	TCCTACCTCG	GATAATGGAA	1680
gttataaaag	CCAGTATCTG	AGCAATGGTC	CTCATCGGAT	TGGTAGGAAA	TATAAAAAAG	1740
TCAGATTTAT	AGCATACACA	GATGAAACCT	TTAAGACTCG	TGAAACTATT	CAGCATGAAT	1800

• · • · • ·

	133	• • •	• · · · · 4 · · · * · • · · · · « · · · · ·	• 0 · • · · · e • · • ·
CAGGACTCTT	GGGACCTTTA	CTTTATGGAG	AAGTTGGAGA	CACACTGTTG	ATTATTTTTA	1860
AGAATCAAGC	AAGCCGACCA	TATAACATTT	ACCCTCATGG	AATCACTGAT	GTCAGTCCTC	1920
TACATGCAAG	GAGATTGCCA	AGAGGTATAA	AGCACGTGAA-	GGATTTGCCA	ATTCATCCAG	1980
GAGAGATATT	CAAGTACAAG	TGGACAGTTA	CAGTAGAAGA	TGGACCAACT	AAATCAGATC	2040
CACGGTGCCT	GACCCGCTAT	TATTCAAGTT	TCATTAACCC	TGAGAGAGAT	CTAGCTTCAG	2100
GACTGATTGG	CCCTCTTCTC	ATCTGCTACA	AAGAATCTGT	AGATCAAAGG	GGAAACCAGA	2160
TGATGTCAGA	CAAAAGAAAT	GTCATCCTGT	TTTCTATATT	TGATGAGAAC	CAAAGCTGGT	2220
ACATCACAGA	GAACATGCAA	CGCTTCCTCC	CCAATGCAGC	TAAAACACAG	CCCCAGGACC	2280
CTGGGTTCCA	GGCCTCCAAC	ATCATGCACA	GCATCAATGG	CTATGTTTTT	GATAGCTTGG	2340
AGTTGACAGT	TTGTTTGCAT	GAGGTGGCAT	ACTGGCACAT	TCTCAGTGTT	GGAGCACAGA	2400
CAGACTTCTT	ATCTATCTTC	TTCTCTGGAT	ATACTTTCAA	ACACAAAATG	GTCTATGAAG	2460
ATACACTTAC	CCTGTTCCCA	TTCTCAGGAG	AAACTGTCTT	TATGTCGATG	GAAAACCCAG	2520
GTCTATGGGT	CTTGGGGTGT	CATAATTCAG	ACTTTCGGAA	GAGAGGTATG	ACAGCATTGC	2580
TGAAAGTTTC	TAGTTGTGAC	AAGAGCACTA	gtgattatta	TGAA.GAAATA	TATGAA.GATA	2640
TTCCAACACA	GTTGGTGAAT	GAGAACAATG	TCATTGATCC	CAGAAGCTTC	TTCCAGAATA	2700
CAAATCATCC	TAATACTAGG	AAAAAGAAAT	TCAAAGATTC	CACAATTCCA	AAAAATGATA	2760
TGGAGAAGAT	TGAGCCTCAG	TTTGAAGAGA	TAGCAGAGAT	GCTTAAAGTA	CAGAGTGTCT	2820
CAGTTAGTGA	CATGTTGATG	CTCTTGGGAC	AGAGTCATCC	TACTCCACAT	GGCTTATTTT	2880
TATCAGATGG	CCAAGAAGCC	ATCTATGAGG	CTATTCATGA	TGATCATTCA	CCAAATGCAA	2940
TAGACAGCAA	TGAAGGCCCA	TCTAAAGTGA	CCCAACTCAG	GCCAGAATCC	CATCACAGTG	3000
AGAAAATAGT	ATTTACTCCT	CAGCCCGGCC	TCCAGTTAAG	ATCCAATAAA	AGTTTGGAGA	3060
CAACTATAGA	AGTAAAGTGG	AAGAAACTTG	GTTTGCAAGT	TTCTAGTTTG	CCAAGTAATC	3120
TAATGACTAC	AACAATTCTG	TCAGACAATT	TGAAAGCAAC	TTTTGAAAAG	ACAGATTCTT	3180
CAGGATTTCC	AGATATGCCA	GTTCACTCTA	GTAGTAAATT	AAGTACTACT	GCATTTGGTA	3240
AGAAAGCATA	TTCCCTTGTT	GGGTCTCATG	TACCTTTAAA	CGCGAGTGAA	GAAAATAGTG	3300
ATTCCAACAT	ATTGGATTCA	ACTTTAATGT	ATAGTCAAGA	AAGTTTACCA	AGAGATAATA	3360
TATTATCAAT	AGAGAATGAT	AGATTACTCA	GAGAGAAGAG	GTTTCATGGA	ATTGCTTTAT	3420
TGACCAAAGA	TAATACTTTA	TTCAAAGACA	ATGTCTCCTT	AATGAAAACA	AACAAAACAT	3480
ATAATCATTC	AACAACTAAT	GAAAAACTAC	ACACTGAGAG	CCCAACATCA	ATTGAGAATA	3540

• · ·· · · «· • ·· * · · · · • ·· ··· · ····· ·· · • · · · · · · · · · ·

134

GTACAACAGA	CTTGCAAGAT	GCCATATTAA	AGGTCAATAG	TGAGATTCAA	GAAGTAACAG	3600
CTTTGATTCA	TGATGGAACA	CTTTTAGGCA	AAAATTCTAC	ATATTTGAGA	CTAAACCATA	3660
TGCTAAATAG	AA.CTACCTCA	ACAAAAAATA	AAGACATATT	TCATAGAAAA	GATGAAGATC	3720
CTATTCCACA	AGATGAAGAG	AATACAATCA	TGCCATTTTC	CAAGATGTTG	TTCTTGTCAG	3780
AATCTTCAAA	TTGGTTTAAA	AAGACCAATG	GAAATAATTC	CTTGAACTCT	GAGCAAGAAC	3840
ATAGTCCAAA	GCAATTAGTA	TATTTAATGT	TTAAAAAATA	TGTAAAAAAT	CAAAGTTTCT	3900
TGTCAGAGAA	AAATAAAGTC	ACAGTAGAAC	AGGATGGATT	TACAAAGAAC	ATAGGACTTA	3960
AAGACATGGC	TTTTCCACAT	AATATGAGCA	TATTTCTTAC	CACTTTGTCT	AACGTACATG	4020
AAAATGGTAG	GCACAATCAA	GAAAAAAATA	TTCAGGAAGA	GATAGAGAAG	GAAGCACTAA	4080
TTGAAGAGAA	AGTAGTTTTG	CCCCAGGTGC	ACGAAGCAAC	TGGCTCTAAG	AATTTCTTGA	4140
AAGACATATT	GATACTAGGC	ACTAGGCAAA	ATATAAGTTT	ATATGAAGTA	CATGTACCAG	4200
TACTTCAAAA	CATCACATCA	ATAAACAATT	CAACAAATAC	AGTACAGATT	CACATGGAGC	4260
ATTTCTTTAA	AAGAAGGAAG	GACAAGGAAA	CAAATTCAGA	AGGCTTGGTA	AATAAAACCA	4320
GAGAAATGGT	AAAAAACTAT	CCAAGCCAGA	AGAATATTAC	TACTCAACGT	AGTAAACGGG	4380
CTTTGGGACA	ATTCAGACTG	TCAACTCAAT	GGCTTAAAAC	CATAAACTGT	TCAACACAGT	4440
GTATCATTAA	ACAGATAGAC	CACAGCAAGG	AAATGAAAAA	GTTCATTACT	AAATCTTCCT	4500
TATCAGATTC	TTCTGTGATT	AAAAGCACCA	CTCA.GACAAA	TAGTTCTGAC	TCACACATTG	4560
TAAAAACATC	AGCATTTCCA	CCAATAGATC	TCAAAAGGAG	TCCATTCCAA	AACAAATTTT	4620
CTCATGTTCA	AGCATCATCC	TACATTTATG	ACTTTAAGAC	AAAAAGTTCA	AGAATTCAAG	4680
AAAGCAATAA	TTTCTTAAAA	GAAACCAAAA	TAAATAACCC	TTCTTTAGCC	ATTCTACCAT	4740
GGAATATGTT	CATAGATCAA	GGAAAATTTA	CCTCCCCAGG	GAAAAGTAAC	ACAAACTCAG	4800
TCACATATAA	GAAACGTGAG	AACATTATTT	TCTTGAAACC	AACTTTGCCT	GAAGAATCTG	4860
GCAAAATTGA	ATTGCTTCCT	CAAGTTTCCA	TTCAAGAGGA	AGAAATTTTA	CCTACAGAAA	4920
CTAGCCATGG	ATCTCCTGGA	CACTTGAATC	TCATGAAAGA	GGTCTTTCTT	CAGAAAATAC	4980
AGGGGCCTAC	TAAATGGAAT	AAAGCAAAGA	GGCATGGAGA	AAGTATAAAA	GGTAAAACAG	5040
AGAGCTCTAA	AAATACTCGC	TCAAAACTGC	TAAATCATCA	TGCTTGGGAT	TATCATTATG	5100
CTGCACAGAT	ACCAAAAGAT	ATGTGGAAAT	CCAAAGAGAA	GTCACCAGAA	ATTATATCCA	5160
TTAAGCAAGA	GGACACCATT	TTGTCTCTGA	GGCCTCATGG	AAACAGTCAT	TCAATAGGGG	5220
CAAATGAGAA	ACAAAATTGG	CCTCAAAGAG	AAACCACTTG	GGTAAAGCAA	GGCCAAACTC	5280

• · · · · • « • · · · · · · · · · · «· · · ·· «· ·· · ·

135

AAAGGACATG	CTCTCAAATC	CCACCAGTGT	TGAAACGACA	TCAAAGGGAA	CTTAGTGCTT	5340
TTCAATCAGA	ACAAGAAGCA	ACTGACTATG	ATGATGCCAT	CACCATTGAA	ACAATCGAGG	5400
ATTTTGACAT	TTACAGTGAG	GACATAAAGC	AAGGTCCCCG	CAGCTTTCAA	CAGAAAACAA	5460
GGCACTATTT	TATTGCAGCT	GTGGAACGAC	TCTGGGACTA	TGGGATGAGT	ACATCTCATG	5520
TTCTACGAAA	TAGGTATCAA	AGTGACAATG	TACCTCAGTT	CAAGAAAGTA	GTTTTCCAGG	5580
AATTTACTGA	TGGCTCCTTT	AGTCAGCCCT	TATATCGTGG	AGAATTAAAT	GAACACCTGG	5640
GGTTGTTGGG	CCCATATATA	AGAGCAGAAG	TTGAAGACAA	CATTATGGTA	ACTTTCAAAA	5700
ACCAGGCCTC	CCGTCCCTAC	TCCTTCTATT	CTAGCCTCAT	TTCTTATAAA	GAAGATCAGA	5760
GAGGAGAAGA	ACCTAGAAGA	AACTTTGTCA	AGCCTAATGA	AACCAAAATT	TATTTTTGGA	5820
AAGTACAACA	TCATATGGCA	CCCACAGAAG	ATGAGTTTGA	CTGCAAGGCC	TGGGCTTATT	5880
TCTCTGATGT	TGATCTTGAA	AGAGATATGC	ACTCGGGATT	AATTGGACCC	CTTCTGATTT	5940
GCCACGCGAA	CACACTGAAT	CCTGCTCATG	GGAGACAAGT	GTCAGTACAG	GAATTTGCTC	6000
TGCTTTTCAC	TATCTTTGAT	GAGACCAAGA	GCTGGTACTT'	CACTGAAAAC	GTGAAAAGGA	6060
ACTGCAAGAC	ACCCTGCAAT	TTCCAGATGG	AAGACCCCAC	TTTGAAAGAG	aattatcgct	6120
TCCATGCAAT	CAATGGTTAT	GTAATGGATA	CCCTACCAGG	CTTAGTAATG	GCTCAAGATC	6180
AAAGGATTCG	ATGGTATCTT	CTCAGCATGG	GCAACAATGA	GAACATCCAA	TCTATTCATT	6240
TCAGTGGACA	TGTTTTCACT	GTACGGAAAA	AAGAGGAGTA	TAAAATGGCA	GTGTACAACC	6300
TCTACCCAGG	TGTTTTTGAG	ACTCTGGAAA	TGATACCATC	CAGAGCTGGA	ATATGGCGAG	6360
TAGAATGCCT	TATTGGCGAG	CACTTACAGG	CTGGGATGAG	CACTCTTTTT	CTGGTGTACA	6420
GCAAGCAGTG	TCAGATTCCT	CTTGGAATGG	CTTCTGGAAG	GATCCGTGAT	TTCCAGATTA	6480
CAGCTTCAGG	ACATTATGGA	CAGTGGGCCC	CAAACCTGGC	AAGACTTCAT	TATTCCGGAT	6540
CAATCAATGC	CTGGAGTACC	AAGGAGCCCT	TTTCTTGGAT	CAAGGTAGAT	CTGTTGGCAC	6600
CAATGATTGT	TCATGGCATC	AAGACTCAGG	GTGCTCGTCA	GAAATTTTCC	AGCCTTTATA	6660
TCTCTCAATT	TATCATCATG	TATAGCCTGG	ATGGGAAGAA	GTGGCTGAGT	TATCAAGGAA	6720
ATTCCACTGG	AACCTTAATG	GTTTTCTTTG	GCAATGTGGA	CTCATCTGGG	ATTAAGCATA	6780
ATAGTTTTAA	TCCTCCAATT	ATTGCTCGAT	ATATCCGTTT	GCACCCCACT	CATTCTAGCA	6840
TCCGTAGTAC	TCTTCGCATG	GAGTTGATGG	GCTGTGATTT	AAACAGTTGC	AGCATACCAT	6900
TGGGAATGGA	AAGTAAAGTA	ATATCAGATA	CACAAATCAC	TGCCTCATCC	TACTTCACCA	6960
ACATGTTTGC	TACTTGGTCT	CCTTCACAAG	CTCGACTTCA	CCTCCAGGGA	AGGACTAATG	7020

• · · · « · ·

136

CCTGGCGACC	TCAGGTGAAT	GATCCAAAAC	AATGGTTGCA	AGTGGACTTA	CAAAAGACAA	7080
TGAAAGTCAC	TGGAATAATA	ACCCAGGGAG	TGAAATCTCT	CTTTACCAGC	ATGTTTGTGA	7140
AAGAGTTCCT	TATTTCCAGC	AGTCAAGATG	GCCATCACTG	GACTCAAATT	TTATACARTG	7200
GCAAGGTAAA	GGTTTTTCAG	GGGAATCAGG	ACTCATCCAC	ACCTATGATG	AATTCTCTAG	7260
ACCCACCATT	ACTCACTCGC	TATCTTCGAA	TTCACCCCCA	GATCTGGGAG	CACCAAATTG	7320
CTCTGAGGCT	TGAGATTCTA	GGATGTGAGG	CCCAGCAGCA	ATACTGAGGT	AGCCTCTGCA	7380
TCACCTGCTT	ATTCCCCTTC	CTCAGCTCAA	AGATTGTCTT	AATGTTTTAT	TGCTGTGAAG	7440
AGACACTATG	ACCATGGCAA	CTCTTTATAA	AATAAAGCAT	TTAATCAGGG	CTT	7493

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 2319 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (X) INFORMACE K PUBLIKACI:

(A) AUTOŘI: Elder, F.

Lakich, D.

Gitschier, J.

(B) TITUL: Sequence of the Murine Factor VIII cDNA (C) ČASOPIS: Genomics (D) DÍL: 16 (F) STRÁNKY: 374-379 (G) DATUM: 1993 (K) RELEVANTNÍ ZBYTKY V SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6: OD 1 DO 2319 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

Met Gin Ile Ala Leu Phe Ala Cys Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn Phe 1 5 10 15

Leu Gly Ala Val Glu 30

Cys Ser Ser, Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr 20 25

Leu Ser £ · · · · · · • · · · · · 4 • · · · ·· ··

137

Trp Asn Tyr Ile Gin Ser Asp Leu Leu Ser Val Leu His Thr Asp Ser 35 40 45

Arg Phe Leu Pro Arg Met Ser Thr Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Ile 50 55 60

Met Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Tyr Lys Asp Gin Leu Phe Asn

70 75 80

Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile

90 95

Trp Thr Glu Val His Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala 100 105 110

Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala 115 120 125

Ser Glu Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Gin Thr Ser Gin Met Glu Lys Glu 130 135 140

Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Glu Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val

145 150 155 ’ 160

Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr

165 170 175

Ser Tyr Met Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190

Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Lys Glu Gly Ser Leu Ser Lys Glu Arg 195 200 205

Thr Gin Met Leu Tyr Gin Phe Val Leu Leu Phe Ma Val Phe Asp Glu 210 215 220

Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Asn Asp Ser Tyr Thr Gin Ser Met

225 230 235 240

Asp Ser Ala Ser Ala Arg Asp Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly

245 250 255

Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser 260 265 270

Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Ile His Ser 275 280 285

Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Phe Val Arg Asn His Arg Gin Ala 290 295 300

Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu

305 310 315 320

Ile Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Lys

325 . 330 335 «· ·· · · ·· · · ·· »··· · · · · · · · · • ··· · · · · · · · · • · · · · · · ····· ·· · ···· ·· · · · · · • · · · · · ·· ·· · ·

138

His Asp Gly Met Glu Ala 340

Ser Gin Trp Gin Lys Lys 355

Asp Asp Leu Tyr Ser Glu 370

Ser Pro Phe Ile Gin Ile 385 390

Trp Ile His Tyr Ile Ser 405

Ser Val Pro Thr Ser Asp 420

Asn Gly Pro His Arg Ile 435

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr 450

Ser Gly Leu Leu Gly Pro 465 470

Leu Ile Ile Phe Lys Asn 485

His Gly Ile Thr Asp Val 500

Gly Ile Lys His Val Lys 515

Lys Tyr Lys Trp Thr Val 530

Pro Arg Cys Leu Thr Arg 545 550

Asp Leu Ala Ser Gly Leu 565

Ser Val Asp Gin Arg Gly 580

Ile Leu Phe Ser Ile Phe 595

Asn Met Gin Arg Phe Leu 610

Pro Gly Phe Gin Ala Ser 625 630

Tyr Val Lys Val Asp Ser 345

Asn Asn Asn Glu Glu Met 360

Met Asp Met Phe Thr Leu 375 380

Arg Ser Val Ala Lys Lys 395

Ala Glu Glu Glu Asp Trp 410

Asn Gly Ser Tyr Lys Ser 425

Gly Arg Lys Tyr Lys Lys 440

Phe Lys Thr Arg Glu Thr 455 460

Leu Leu Tyr Gly Glu Val 475

Gin Ala Ser Arg Pro Tyr 490

Ser Pro Leu His Ala Arg 505

Asp Leu Pro Ile His Pro 520

Thr Val Glu Asp Gly Pro 535 540

Tyr Tyr Ser Ser Phe Ile 555

Ile Gly Pro Leu Leu Ile 570

Asn Gin Met Met Ser Asp 585

Asp Glu Asn Gin Ser Trp 600

Pro Asn Ala Ala Lys Thr 615 620

Asn Ile Met His Ser Ile 635

Cys Pro Glu Glu 350

Glu Asp Tyr Asp 365

Asp Tyr Asp Ser

Tyr Pro Lys Thr 400

Asp Tyr Ala Pro 415

Gin Tyr Leu Ser 430

Val Arg Phe Ile 445

Ile Gin His Glu

Gly Asp Thr Leu 480

Asn Ile Tyr Pro 495

Arg Leu Pro Arg 510

Gly Glu Ile Phe 525

Thr Lys Ser Asp

Asn Pro Glu Arg 560

Cys Tyr Lys Glu 575

Lys Arg Asn Val 590

Tyr Ile Thr Glu 605

Gin Pro Gin Asp

Asn Gly Tyr Val 640 • · • · • ·· · · · · · · ·· · • · · · · ·« · · ·· · • · 0 · « · · ····· ·· · • · · · ·· · · · · · • · · · ·· ·· · < ··

139

Phe Asp Ser Leu Glu Leu Thr Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655

His Ile Leu Ser Val Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Ile Phe Phe 660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 630 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700

Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Ser Thr Ser Asp

725 730 . 735

Tyr Tyr Glu Glu Ile Tyr Glu Asp Ile Pro Thr Gin Leu Val Asn Glu 740 745 750

Asn Asn Val Ile Asp Pro Arg Ser Phe Phe Gin Asn Thr Asn His Pro 755 760 765

Asn Thr Arg Lys Lys Lys Phe Lys Asp Ser Thr Ile Pro Lys Asn Asp 770 775 780

Met Glu Lys Ile Glu Pro Gin Phe Glu Glu Ile Ala Glu Met Leu Lys

785 790 795 800

Val Gin Ser Val Ser Val Ser Asp Met Leu Met Leu Leu Gly Gin Ser

805 810 815

His Pro Thr Pro His Gly Leu Phe Leu Ser Asp Gly Gin Glu Ala Ile 820 825 830

Tyr Glu Ala Ile His Asp Asp His Ser Pro Asn Ala Ile Asp Ser Asn 835 840 845

Glu Gly Pro Ser Lys Val Thr Gin Leu Arg Pro Glu Ser His His Ser 850 855 860

Glu Lys Ile Val Phe Thr Pro Gin Pro Gly Leu Gin Leu Arg Ser Asn

865 870 875 880

Lys Ser Leu Glu Thr Thr Ile Glu Val Lys Trp Lys Lys Leu Gly Leu

885 ' 890 * 895

Gin Val Ser Ser Leu Pro Ser Asn Leu Met Thr Thr Thr Ile Leu Ser 900 905 910

Asp Asn Leu Lys Ala Thr Phe Glu Lys Thr Asp Ser Ser Gly Phe Pro 915 920 925

Asp Met Pro Val His Ser Ser Ser Lys Leu Ser Thr Thr Ala Phe Gly 930 935 940 • · • · ···· · · · · ··«· ···· · · · · ···· • · · · · · · ·«··· ·· · ···· · · · ···· • » ·· ·· · · ·· · ·

140

Lys 945

Lys

Ala

Tyr

Ser

Leu 950

Val

Gly

Ser

His

Val 955

Pro

Leu

Asn

Ala

Ser 960

Glu

Asn

Ser

Asp 965

Ser

Asn

Ile

Leu

Asp 970

Ser

Thr

Leu

Met

Tyr 975

Ser

Gin

Glu

Ser

Leu 980

Pro

Arg

Asp

Asn

Ile 985

Leu

Ser

Ile

Glu

Asn 990

Asp

Arg

Leu

Arg 995

Glu

Lys

Arg

Phe

His 100C

Gly 1

Ile

Ala

Leu

Leu 1005

Thr I

Lys

Asp

Asn

Thr Leu 1010

Phe

Lys

Asp

Asn Val 1015

Ser

Leu

Met

Lys 102C

Thr 1

Asn

Lys

Thr

Tyr 1025

Asn 1

His

Ser

Thr

Thr 103C

Asn )

Glu

Lys

Leu

His 1035

Thr 1

Glu

Ser

Pro

Thr 1040

Ser

Ile

Glu

Asn

Ser 1045

Thr 1

Thr

Asp

Leu

Gin 105C

Asp )

Ala

Ile

Leu

Lys 1055

Val 1

Asn

Ser

Glu

Ile Gin 1060

Glu

Val

Thr

Ala 1065

Leu >

Ile

His

Asp

Gly Thr 1070

Leu

Gly

Lys 1075

Asn

Ser

Thr

Tyr

Leu 108C

Arg I

Leu

Asn

His

Met 1085

Leu >

Asn

Arg

Thr

Thr Ser 1090

Thr

Lys

Asn

Lys Asp 1095

Ile

Phe

His

Arg 110C

Lys 1

Asp

Glu

Asp

Pro 1105

Ile

Pro

Gin

Asp

Glu Glu 1110

Asn

Thr

Ile

Met 1115

Pro 1

Phe

Ser

Lys

Met 1120

Leu

Phe

Leu

Ser

Glu 1125

Ser I

Ser

Asn

Trp

Phe 113C

Lys l

Lys

Thr

Asn

Gly 1135

Asn 1

Asn

Ser

Leu

Asn 114C

Ser 1

Glu

Gin

Glu

His 1145

Ser

Pro

Lys

Gin

Leu 115C

Val 1

Tyr

Leu

Met

Phe 1155

Lys 1

Lys

Tyr

Val

Lys 1160

Asn

Gin

Ser

Phe

Leu 1165

Ser

Glu

Lys

Asn

Lys Val 1170

Thr

Val

Glu

Gin Asp 1175

Gly

Phe

Thr

Lys 118C

Asn

Ile

Gly

Leu

Lys 1185

Asp >

Met

Ala

Phe

Pro 119C

His )

Asn

Met

Ser

Ile 1195

Phe

Leu

Thr

Leu 1200

Ser

Asn

Val

His

Glu 1205

Asn 1

Gly

Arg

His

Asn 1210

Gin 1

Glu

Lys

Asn

Ile 1215

Gin

Glu

Ile

Glu

Lys

Glu

Ala

Leu

Ile

Glu

Lys

Val

Leu

Pro

1220 1225 1230

Gin Val His Glu Ala Thr Gly Ser Lys Asn Phe Leu Lys Asp Ile Leu 1235 1240 1245 « · ·· · · ·· · · ·· ···· ···· · · · · • · · · · · · · ···· • · · · · · · ··· · · · · · ···· ·· · ···· • · ·· ·· ·· « · ··

141

Ile

Leu 1250

Gly

Thr

Arg

Gin Asn 1255

Ile

Ser

Leu

Tyr Glu Val 1260

His

Val

Pro

Val 1265

Leu

Gin

Asn

Ile

Thr Ser 1270

Ile

Asn

Ser Thr Asn 1275

Thr

Val

Gin 1280

Ile

His

Met

Glu

His 1285

Phe Phe 1

Lys

Arg

Arg 129C

Lys Asp Lys 1

Glu

Thr 1295

Asn 1

Ser

Glu

Gly

Leu 130C

Val l

Asn Lys

Thr

Arg 1305

Glu )

Met Val Lys

Asn 131C

Tyr 1

Pro

Ser

Gin

Lys 1315

Asn

Ile

Thr Thr

Gin 132C

Arg )

Ser

Lys Arg Ala 1325

Leu )

Gly

Gin

Phe

Arg 1330

Leu

Ser

Thr

Gin Trp 1335

Leu

Lys

Thr

Ile Asn Cys 1340

Ser

Thr

Gin

Cys 1345

Ile 1

Ile

Lys

Gin

Ile Asp 1350

His

Ser

Lys

Glu Met Lys 1355

Lys

Phe

Ile 1360

Thr

Lys

Ser

Leu 1365

Ser Asp

Ser

Val 1370

Ile Lys Ser 1

Thr

Thr 1375

Gin 1

Thr

Asn

Ser

Ser Asp 1380

Ser His

Ile

Val 1385

Lys

Thr Ser Ma

Phe 139C

Pro 1

Pro

Ile

Asp

Leu 1395

Lys 1

Arg

Ser Pro

Phe 140C

Gin 1

Asn

Lys Phe Ser 1405

His 1

Val

C-ln

Ala

Ser 141C

Ser 1

Tyr

Ile

Tyr Asp 1415

Phe

Lys

Thr

Lys Ser Ser 1420

Arg

Ile

Gin

Glu 1425

Ser 1

Asn

Phe

Leu Lys 1430

Glu

Thr

Lys

Ile Asn Asn 1435

Pro

Ser

Leu 1440

Ala

Ile

Leu

Pro

Trp 1445

Asn Met

Phe

Ile

Asp 1450

Gin Gly Lys

Phe

Thr 1455

Ser

Pro

Gly

Lys

Ser 146C

Asn )

Thr Asn

Ser

Val 1465

Thr 1

Tyr Lys Lys

Arg 147C

Glu 1

Asn

Ile

Phe 1475

Leu 1

Lys

Pro Thr

Leu 148C

Pro )

Glu

Glu Ser Gly 1485

Lys 1

Ile

Glu

Leu

Leu 149C

Pro 1

Gin

Val

Ser Ile 1495

Gin

Glu

Glu Ile Leu 1500

Pro

Thr

Glu

Thr 1505

Ser

His

Gly

Ser

Pro Gly 1510

His

Leu

Asn

Leu Met Lys 1515

Glu

Val

Phe 1520

Leu

Gin

Lys

Ile

Gin

Gly Pro

Thr

Lys

Trp

Asn Lys Ala

Lys

Arg

His

1525 1530 1535

Gly Glu Ser Ile Lys Gly Lys Thr Glu Ser Ser Lys Asn Thr Arg Ser 1540 1545 1550

• ·

142

Lys	Leu Leu Asn 1555	His	His	Ala Trp Asp 1560	Tyr	His	Tyr Ala Ala 1565	Gin	Ile
Pro	Lys Asp Met 1570	Trp	Lys	Ser Lys Glu 1575	Lys	Ser	Pro Glu Ile 1580	Ile	Ser
Ile 1585	Lys Gin Glu 1	Asp	Thr 159C	Ile Leu Ser )	Leu	Arg 1595	Pro His Gly 1	Asn	Ser 1600
His	Ser Ile Gly	Ala 1605	Asn 1	Glu Lys Gin	Asn Trp 1610	Pro Gin Arg	Glu Thr 1615
Thr	Trp Val Lys Gin 1620	Gly	Gin Thr Gin Arg 1625	Thr	Cys Ser Gin 163C	Ile )	Pro
Pro	Val Leu Lys 1635	Arg	His	Gin Arg Glu 1640	Leu	Ser	Ala Phe Gin 1645	Ser	Glu
Gin	Glu Ala Thr 1650	Asp	Tyr	Asp Asp Ala 1655	Ile	Thr	Ile Glu Thr 1660	Ile	Glu
Asp 1665	Phe Asp Ile 1	Tyr	Ser 167C	Glu Asp Ile )	Lys	Gin 1675	Gly Pro Arg	Ser	Phe 1680
Gin	Gin Lys Thr	Arg 1685	His 1	Tyr Phe Ile	Ala 169C	Ala )	Val Glu Arg	Leu 1695	Trp
As ρ	Tyr Gly Met Ser 1700	Thr	Ser His Val 1705	Leu	Arg	Asn Arg Tyr 171C	Gin 1	Ser
Asp	Asn Val Pro 1715	Gin	Phe	Lys Lys Val 1720	Val	Phe	Gin Glu Phe 1725	Thr	Asp
Gly	Ser Phe Ser 1730	Gin	Pro	Leu Tyr Arg 1735	Gly	Glu	Leu Asn Glu 1740	His	Leu
Gly 1745	Leu Leu Gly	Pro	Tyr 1750	Ile Arg Ala	Glu	Val 1755	Glu Asp Asn	Ile	Met 1760
Val	Thr Phe Lys	Asn 1765	Gin	Ala Ser Arg	Pro 177C	Tyr 1	Ser Phe Tyr	Ser 1775	Ser 1
Leu	Ile Ser Tyr 178C	Lys )	Glu	Asp Gin Arg 1785	Gly t	Glu	Glu Pro Arg 1790	Arg	Asn
Phe	Val Lys Pro 1795	Asn	Glu	Thr Lys Ile 1800	Tyr	Phe	Trp Lys Val 1805	Gin	His
His	Met Ala Pro 1810	Thr	Glu	Asp Glu Phe 1815	Asp	Cys	Lys Ala Trp 1820	Ala	Tyr
Phe 1825	Ser Asp Val	Asp	Leu 1830	Glu Arg Asp 1	Met	His 1835	Ser Gly Leu	Ile	Gly 1840

Pro Leu Leu Ile Cys His Ala Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg 1845 1850 1855 • · • · • · ···· · · · · ···· ···· ···· ···· • ·· · · · · ····· ·· · ···· · · · · · · · • · ·· ·· · · ·· ··

143

Gin

Val

Ser

Val 1860

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu 1865

Leu

Phe

Thr

Ile

Phe Asp 1870

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Val

Lys

Arg

Asn

Cys Lys

Thr

1875

1880

1885

Pro

Cys

Asn

Phe

Gin

Met

Glu

Asp

Pro

Thr

Leu

Lys

Glu

Asn Tyr

Arg

1890

1895

1900

Phe

His

Ala

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Asp

Thr

Leu

Pro

Gly Leu

Val

1905

1910

1915

1920

Met

Ala

Gin

Asp

Gin

Arg

Ile

Arg

Trp

Tyr

Leu

Ser

Met Gly

Asn

1925

1930

1935

Asn

Glu

Asn

Ile

Gin

Ser

Ile

His

Phe

Ser

Gly

His

Val

Phe Thr

Val

1940

1945

1950

Arg

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Val

Tyr

Asn

Leu

Tyr Pro

Gly

1955

1960

1965

Val

Phe

Glu

Thr

Leu

Glu

Met

Ile

Pro

Ser

Arg

Ala

Gly

Ile Trp

Arg

1970

1975

1980

Val

Glu

Cys

Leu

Ile

Gly

Glu

His

Leu

Gin

Ala

Gly

Met

Ser Thr

Leu

1985

1990

1995

2000

Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Lys

Gin

Cys

Gin

Ile

Pro

Leu

Gly

Met Ala

Ser

2005

2010

2015

Gly

Ser

Ile

Arg

Asp

Phe

Gin

Ile

Thr

Ala

Ser

Gly

His

Tyr Gly

Gin

2020

2025

2030

Trp

Ala

Pro

Asn

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile Asn

Ala

2035

2040

2045

Trp

Ser

Thr

Lys

Glu

Pro

Phe

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

Asp

Leu Leu

Ala

2050

2055

2060

Pro

Met

Ile

Val

His

Gly

Ile

Lys

Thr

Gin

Gly

Al a

Arg

Gin Lys

Phe

2065

2070

2075

2080

Ser

Leu

Tyr

Ile

Ser

Gin

Phe

Ile

Met

Tyr

Ser

Leu Asp

Gly

2085

2090

2095

Lys

Trp

Leu

Ser

Tyr

Gin

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Leu Met

Val

2100

2105

2110

Phe

Gly

Asn

Val

Asp

Ser

Gly

Ile

Lys

His

Asn

Ser Phe

Asn

2115

2120

2125

Pro

Ile

Ala

Arg

Tyr

Ile

Arg

Leu

His

Pro

Thr

His Ser

Ser

Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser 2145 2150 2155 2160

2130 2135 2140 • · • · ···· · · · · ···· ···· · · · · ··«· • ·· · · · · ····· · · · ···· · · · ···· •· ·· ·· ·· ·· ··

144

Cys Ser

Ile

Pro

Leu 2165

Gly

Met

Glu

Ser

Lys 217C

Val 1

Ile

Ser

Asp

Thr 2175

Gin 1

Ile Thr

Ala

Ser 2180

Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn 2185

Met 1

Phe

Ala

Thr

Trp 219C

Ser 1

Pro

Ser Gin

Ala 2195

Arg 1

Leu

His

Leu

Gin 2200

Gly 1

Arg

Thr

Asn

Ala 2205

Trp 1

Arg

Pro

Gin Val Asn 2'210

Asp

Pro

Lys

Gin 2215

Trp ř

Leu

Gin

Val

Asp 222C

Leu 1

Gin

Lys

Thr

Met Lys 2225

Val

Thr

Gly

Ile 223C

Ile 1

Thr

Gin

Gly

Val 2235

Lys

Ser

Leu

Phe

Thr 2240

Ser Met

Phe

Val

Lys 2245

Glu 1

Phe

Leu

Ile

Ser 225C

Ser 1

Ser

Gin

Asp

Gly 2255

His

His Trp

Thr

Gin 2260

Ile 1

Leu

Tyr

Asn

Gly 2265

Lys 1

Val

Lys

Val

Phe 2270

Gin 1

Gly

Asn Gin

Asp 2275

Ser

Thr

Pro

Met 2280

Met

Asn

Ser

Leu

Asp 2285

Pro 1

Pro

Leu

Leu Thr Arg 2290

Tyr

Leu

Arg

Ile 2295

His 1

Pro

Gin

Ile

Trp 230C

Glu 1

His

Gin

Ile

Ala Leu

Arg

Leu

Glu

Ile

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

Tyr

2305 2310 2315 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

CCTTCCTTTA TCCAAATACG TAGATCAAGA GGAAATTGAC 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

145 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 29 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

GTAGCGTTGC CAAGAAGCAC CCTAAGACG 29 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A.) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

GAAGAGTAGT ACGAGTTATT TCTCTGGGTT CAATGAC 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne

146 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

CCTTTATCCA AATACGTAGC GTTTGCCAAG AAG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..19 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= R je A nebo G a N je A, T, G nebo C.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

AARCAYCCNA ARACNTGGG 19 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

GCTCGCACTA GGGGGTCTTG AATTC

• · · · • · · • · · · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

147 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: obě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (A) DESCRIPTION: /desc = oligonukleotidový primer, dvouvláknový od nukleotidů 37-44, 3' konec krátkého vlákna blokován aminoskupinou.

(iii! HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 37..44 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= dvouvláknový v oblasti od nukleotidů 37-44, 3' konec je blokován aminoskupinou pro redukci nespecifického nasedání primerů.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT 44 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

• · ·· » · · ( » · · · • · • · • · • ·

148 (A) DÉLKA:. 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

CCATTGACAT GAAGACCGTT TCTC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE ':

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano ·· ·» ·· • · · · · · · · « · · · ·»·« • « ····· · · · • · · · · · » ·· »· · · ··

149 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

GGGTGCAAAG CGCTGACATC AGTG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

CCTCTCGAGC CACCATGTCG AGCCACCATG CAGCTAGAGC TCTCCACCTG 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 31 párů baží (S) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE': ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

CGCGCGGCCG CGCATCTGGC AAAGCTGAGT T 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • · ·· « 4 • 4 «· ·· *4 • 4 4 4 4 4 · · 4

44 4 9 44 4

4 4 · 44444 · 4 4

44 4 4444 • 4 *4 4 4 44

150

(ii)	TYP MOLEKULY: ostatní	nukleová kyselina
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	OPAČNÁ ORIENTACE: ano
(ix)	ZNAKY: (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: (B) POZICE: 25..27 (D) DALŠÍ INFORMACE:	různé znaky /poznámka= V pozici 25,	R j e A nebo G.
(Xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM	20:
GAAATAAGCC CAGGCTTTGC AGTCRAA		27

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ.: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 21..22 (D) DALŠÍ INFORMACE:/poznámka=V pozici 22, N je A,G,C nebo T.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

AGGAAATTCC ACTGGAACCT TN 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne ···· · · » · • · · · · ·· * • · ····· · · · • · · · · · · ·· ·· ·· · ·

151 • · (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..25 (D) DALŠÍ INFORMACE:/poznámka=V pozici 25, N je A,G,C nebo T.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

CTGGGGGTGA ATTCGAAGGT AGCGN 25 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

GAGTTCATCG GGAAGACCTG TTG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (x.i) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

ACAGCCCATC AACTCCATGC GAAG • · • · • · • ·

152 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) . TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

TCAGGGCAAT CAGGACTCC 19 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

CCGTGGTGAA CGCTCTGGAC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne

• · • · · • · »· • · · • fc · ti · · • · · · • · · · fc · · · · · • · · • · « ·

153 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

GTAGAGGTCC TGTGCCTCGC AGCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé znaky (B) POZICE: 1..27 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= S je G nebo C, K je G nebo T, R je A nebo G, a Y je C nebo T.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

GTAGAGSTSC TGKGCCTCRC AKCCYAG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

CTTCGCATGG AGTTGATGGG CTGT • · • · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

154 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

AATCAGGACT CCTCCACCCC CG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

GGATCCACCC CACGAGCTGG 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne • · • · • · · · t • · · 4

155 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32

CGCCCTGAGG CTCGAGGTTC TAGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 22 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

AATCAGGACT CCTCCACCCC CG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

CCTTGCAGGA ATTCGATTCA 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • · • · · · ····· · · • · · · · · ·

156 (ii) TYP MOLEKULY: ostatní nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

CCGTGGTGAA CGCTCTGGAC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 6402 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Prase (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..6402 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

ATG Met 1

CAG Gin

CTA Leu

GAG Glu

CTC Leu 5

TCC Ser

ACC Thr

TGT Cys

GTC Val

TTT Phe 10

CTG Leu

TGT Cys

CTC Leu

TTG Leu

CCA Pro 15

CTC Leu

48

GGC

TTT

AGT

GCC

ATC

AGG

AGA

TAC

CTG

GGC

GCA

GTG

GAA

CTG

TCC

96

Gly

Phe

Ser

Ala

Ile

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

TGG

GAC

TAC

CGG

CAA

AGT

GAA

CTC

CGT

GAG

CTG

CAC

GTG

GAC

ACC

144

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

AGA

TTT

CCT

GCT

ACA

GCG

CCA

GGA

GCT

CTT

CCG

TTG

GGC

CCG

TCA

GTC

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

CTG

TAC

AAA

AAG

ACT

GTG

TTC

GTA

GAG

TTC

ACG

GAT

CAA

CTT

TTC

AGC

240

Leu

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

157

GTT Val

GCC AGG Ala Arg

CCC Pro

AGG Arg 85

CCA Pro

TGG Trp

ATG Met

GGT Gly 90

CTG Leu

GGT Gly

CCT Pro

ACC Thr 95

ATC Ile

288

CAG

GCT

GAG

GTT

TAC

GAC

ACG

GTG

GTC

GTT

ACC

CTG

AAG

AAC

ATG

GCT

336

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

TCT

CAT

CCC

GTT

AGT

CTT

CAC

GCT

GTC

GGC

GTC

TCC

TTC

TGG

AAA

TCT

384

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

TCC

GAA

GGC

GCT

GAA

TAT

GAG

GAT

CAC

ACC

AGC

CAA

AGG

GAG

AAG

GAA

432

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

GAC

GAT

AAA

-GTC

CTT

CCC

GGT

AAA

AGC

CAA

ACC

TAC

GTC

TGG

CAG

GTC

480

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

CTG

AAA

GAA

AAT

GGT

CCA

ACA

GCC

TCT

GAC

CCA

TGT

CTC

ACC

TAC

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

TCA

TAC

CTG

TCT

CAC

GTG

GAC

CTG

GTG

AAA

GAC

CTG

AAT

TCG

GGC

CTC

57 6

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

ATT

GGA

GCC

CTG

GTT

TGT

AGA

GAA

GGG

AGT

CTG

ACC

AGA

GAA

AGG

624

Ile

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

ACC

CAG

AAC

CTG

CAC

GAA

TTT

GTA

CTA

CTT

TTT

GCT

GTC

TTT

GAT

GAA

672

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

GGG

AAA

AGT

TGG

CAC

TCA

GCA

AGA

AAT

GAC

TCC

TGG

ACA

CGG

GCC

ATG

720

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

GAT

CCC

GCA

CCT

GCC

AGG

GCC

CAG

CCT

GCA

ATG

CAC

ACA

GTC

AAT

GGC

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

TAT

GTC

AAC

AGG

TCT

CTG

CCA

GGT

CTG

ATC

GGA

TGT

CAT

AAG

AAA

TCA

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

' Lys

Lys

Ser

260

265

270

GTC

TAC

TGG

CAC

GTG

ATT

GGA

ATG

GGC

ACC

AGC

CCG

GAA

GTG

CAC

TCC

864

Val

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

ATT

TTT

CTT

GAA

GGC

CAC

ACG

TTT

CTC

GTG

AGG

CAC

CAT

CGC

CAG

GCT

912

Ile

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

158

TCC Ser 305

TTG Leu

GAG Glu

ATC Ile

TCG Ser

CCA Pro 310

CTA Leu

ACT Thr

TTC Phe

CTC Leu

ACT Thr 315

GCT Ala

CAG ACA TTC

CTG Leu 320

960

Gin

Thr

Phe

ATG

GAC

CTT

GGC

CAG

TTC

CTA

CTG

TTT

TGT

CAT

ATC

TCT

TCC

CAC

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin 325

Phe

Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

His 335

His

CAT

GGT

GGC

ATG

GAG

GCT

CAC

GTC

AGA

GTA

GAA

AGC

TGC

GCC

GAG

1056

His

Gly

Met 340

Glu

Ala

His

Val

Arg 345

Val

Glu

Ser

Cys

Ala 350

Glu

CCC

CAG

CTG

CGG

AGG

AAA

GCT

GAT

GAA

GAG

GAA

GAT

TAT

GAT

GAC

AAT

1104

Pro

Gin

Leu 355

Arg

Lys

Ala

Asp 360

Glu

Asp

Tyr 365

Asp

Asn

TTG

TAC

GAC

TCG

GAC

ATG

GAC

GTG

GTC

CGG

CTC

GAT

GGT

GAC

GTG

1152

Leu

Tyr 370

Asp

Ser

Asp

Met

Asp 375

Val

Arg

Leu

Asp 380

Gly

Asp

Val

TCT

CCC

TTT

ATC

CAA

ATC

CGC

TCG

GTT

GCC

AAG

CAT

CCC

AAA

ACC

1200

Ser 385

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile 390

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

Thr 400

TGG

GTG

CAC

TAC

ATC

TCT

GCA

GAG

GAC

TGG

GAC

TAC

GCC

CCC

1248

Trp

Val

His

Tyr

Ile 405

Ser

Ala

Glu

Glu 410

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

Pro

GCG

GTC

CCC

AGC

CCC

AGT

GAC

AGA

AGT

TAT

AAA

AGT

CTC

TAC

TTG

AAC

1296

Ala

Val

Pro

Ser 420

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr 430

Leu

Asn

AGT

GGT

CCT

CAG

CGA

ATT

GGT

AGG

AAA

TAC

AAA

GCT

CGA

TTC

GTC

1344

Ser

Gly

Pro 435

Gin

Arg

Ile

Gly

Arg 440

Lys

Tyr

Lys

Ala 445

Arg

Phe

Val

GCT

TAC

ACG

GAT

GTA

ACA

TTT

AAG

ACT

CGT

AAA

GCT

ATT

CGG

TAT

GAA

1392

Ala

Tyr 450

Thr

Asp

Val

Thr

Phe 455

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala 460

Ile

Pro

Tyr

Glu

TCA

GGA

ATC

CTG

GGA

CCT

TTA

CTT

TAT

GGA

GAA

GTT

GGA

GAC

ACA

CTT

1440

Ser 465

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro 470

Leu

Tyr

Gly

Glu 475

Val

Gly

Asp

Thr

Leu 480

TTG

ATT

ATA

TTT

AAG

AAT

AAA

GCG

AGC

CGA

CCA

TAT

AAC

ATC

TAC

CCT

1488

Leu

Ile

Phe

Lys 485

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg 490

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr 495

Pro

CAT

GGA

ATC

ACT

GAT

GTC

AGC

GCT

TTG

CAC

CCA

GGG

AGA

CTT

CTA

AAA

1536

His

Gly

Ile

Thr 500

Asp

Val

Ser

Ala

Leu 505

His

Pro

Gly

Arg

Leu 510

Leu

Lys

GGT

TGG

AAA

CAT

TTG

AAA

GAC

ATG

CCA

ATT

CTG

CCA

GGA

GAG

ACT

TTC

1584

Gly

Trp

Lys 515

His

Leu

Lys

Asp

Met 520

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly 525

Glu

Thr

Phe

• · · · • ·

159

AAG	TAT	AAA	TGG	ACA	GTG	ACT	GTG	GAA	GAT
Lys	Tyr 530	Lys	Trp	Thr	Val	Thr 535	Val	Glu	Asp
CCT	CGG	TGC	CTG	ACC	CGC	TAC	TAC	TCG	AGC
Pro 545	Arg	Cys	Leu	Thr	Arg 550	Tyr	Tyr	Ser	Ser
GAT	CTG	GCT	TCG	GGA	CTC	ATT	GGC	CCT	CTC
Asp	Leu	Ala	Ser	Gly 565	Leu	Ile	Gly	Pro	Leu 570
TCT	GTA	GAC	CAA	AGA	GGA	AAC	CAG	ATG	ATG
Ser	Val	Asp	Gin 580	Arg	Gly	Asn	Gin	Met 585	Met
ATC	CTG	TTT	TCT	GTA	TTC	GAT	GAG	AAT	CAA
Ile	Leu	Phe 595	Ser	Val	Phe	Asp	Glu 600	Asn	Gin
AAT	ATT	CAG	CGC	TTC	CTC	CCC	AAT	CCG	GAT
Asn	Ile 610	Gin	Arg	Phe	Leu	Pro 615	Asn	Pro	Asp
CCA	GAG	TTC	CAA	GCT	TCT	AAC	ATC	ATG	CAC
Pro 625	Glu	Phe	Gin	Ala	Ser 630	Asn	Ile	Met	His
TTT	GAT	AGC	TTG	CAG	CTG	TCG	GTT	TGT	TTG
Phe	Asp	Ser	Leu	Gin 645	Leu	Ser	Val	Cys	Leu 650
TAC	ATT	CTA	AGT	GTT	GGA	GCA	CAG	ACG	GAC
Tyr	Ile	Leu	Ser 660	Val	Gly	Ala	Gin	Thr 665	Asp
TCT	GGC	TAC	ACC	TTC	AAA	CAC	AAA	ATG	GTC
Ser	Gly	Tyr 675	Thr	Phe	Lys	His	Lys 680	Met	Val
CTG	TTC	CCC	TTC	TCA	GGA	GAA	ACG	GTC	TTC
Leu	Phe 690	Pro	Phe	Ser	Gly	Glu 695	Thr	Val	Phe
GGT	CTC	TGG	GTC	CTA	GGG	TGC	CAC	AAC	TCA
Gly 705	Leu	Trp	Val	Leu	Gly 710	Cys	His	Asn	Ser
ATG	ACA	GCC	TTA	CTG	AAG	GTG	TAT	AGT	TGT
Met	Thr	Ala	Leu	Leu 725	Lys	Val	Tyr	Ser	Cys 730
TAT	TAT	GAC	AAC	ACT	TAT	GAA	GAT	ATT	CCA
Tyr	Tyr	Asp	Asn 740	Thr	Tyr	Glu	Asp	Ile 745	Pro

GGG Gly	CCA Pro 540	ACC Thr	AAG Lys	TCC Ser	GAT Asp	1632
TCC	ATT	AAT	CTA	GAG	AAA	1680
Ser 555	Ile	Asn	Leu	Glu	Lys 560
CTC	ATC	TGC	TAC	AAA	GAA	1728
Leu	Ile	Cys	Tyr	Lys 575	Glu
TCA	GAC	AAG	AGA	AAC	GTC	1776
Ser	Asp	Lys	Arg 590	Asn	Val
AGC	TGG	TAC	CTC	GCA	GAG	1824
Ser	Trp	Tyr 605	Leu	Al a	Glu
GGA	TTA	CAG	CCC	CAG	GAT	1872
Gly	Leu 620	Gin	Pro	Gin	Asp
AGC	ATC	AAT	GGC	TAT	GTT	1920
Ser 635	Ile	Asn	Gly	Tyr	Val 640
CAC	GAG	GTG	GCA	TAC	TGG	1968
His	Glu	Val	Ala	Tyr 655	Trp
TTC	CTC	TCC	GTC	TTC	TTC	2016
Phe	Leu	Ser	Val 670	Phe	Phe
TAT	GAA	GAC	ACA	CTC	ACC	2064
Tyr	Glu	Asp 685	Thr	Leu	Thr
ATG	TCA	ATG	GAA	AAC	CCA	2112
Met	Ser 700	Met	Glu	Asn	Pro
GAC	TTG	CGG	AAC	AGA	GGG	2160
Asp 715	Leu	Arg	Asn	Arg	Gly 720
GAC	AGG	GAC	ATT	GGT	GAT	2208
Asp	Arg	Asp	Ile	Gly 735	Asp
GGC	TTC	TTG	CTG	AGT	GGA	2256
Gly	Phe	Leu	Leu	Ser	Gly

750

160

AAG Lys

AAT Asn

GTC Val 755

ATT Ile

GAA Glu

CCC AGA

AGC Ser 760

TTT Phe

GCC Ala

CAG Gin

AAT Asn

TCA Ser 765

AGA Arg

CCC Pro

CCT Pro

2304

Pro

Arg

AGT

GCG

AGC

CAA

AAG

CAA

TTC

CAA

ACC

ATC

ACA

AGT

CCA

GAA

GAT

GAC

2352

Ser

Ala 770

Ser

Gin

Lys

Gin

Phe 775

Gin

Thr

Ile

Thr

Ser 780

Pro

Glu

Asp

GTG

GAG

CTT

GAC

CCG

CAG

TCT

GGA

GAG

AGA

ACC

CAA

GCA

CTG

GAA

2400

Val 785

Glu

Leu

Asp

Pro

Gin 790

Ser

Gly

Glu

Arg

Thr 795

Gin

Ala

Leu

Glu

Glu 800

CTA

AGT

GTC

CCC

TCT

GGT

GAT

GGG

TCG

ATG

CTC

TTG

GGA

CAG

AAT

CCT

2448

Leu

Ser

Val

Pro

Ser 805

Gly

Asp

Gly

Ser

Met 810

Leu

Gly

Gin

Asn 815

Pro

GCT

CCA

CAT

GGC

TCA

TCC

TCA

TCT

GAT

CTT

CAA

GAA

GCC

AGG

AAT

GAG

2496

Ala

Pro

His

Gly 820

Ser

Asp 825

Leu

Gin

Glu

Ala

Arg 830

Asn

Glu

GCT

GAT

TAT

TTA

CCT

GGA

GCA

AGA

GAA

AGA

AAC

ACG

GCC

CCA

TCC

2544

Ala

Asp

Asp 835

Tyr

Leu

Pro

Gly

Ala 840

Arg

Glu

Arg

Asn

Thr 845

Ala

Pro

Ser

GCA

GCG

GCA

CGT

CTC

AGA

CCA

GAG

CTG

CAT

CAC

AGT

GCC

GAA

AGA

GTA

2592

Ala

Ala 850

Ala

Arg

Leu

Arg

Pro 855

Glu

Leu

His

Ser 860

Ala

Glu

Arg

Val

CTT

ACT

CCT

GAG

CCA

GAG

AAA

GAG

TTG

AAG

AAA

CTT

GAT

TCA

AAA

ATG

2640

Leu 865

Thr

Pro

Glu

Pro

Glu 870

Lys

Glu

Leu

Lys

Lys 875

Leu

Asp

Ser

Lys

Met 880

TCT

AGT

TCA

GAC

CTT

CTA

AAG

ACT

TCG

CCA

ACA

ATT

CCA

TCA

GAC

2688

Ser

Asp 885

Leu

Lys

Thr

Ser 890

Pro

Thr

Ile

Pro

Ser 895

Asp

ACG

TTG

TCA

GCG

GAG

ACT

GAA

AGG

ACA

CAT

TCC

TTA

GGC

CCC

CCA

CAC

2736

Thr

Leu

Ser

Ala 900

Glu

Thr

Glu

Arg

Thr 905

His

Ser

Leu

Gly

Pro 910

Pro

His

CCG

CAG

GTT

AAT

TTC

AGG

AGT

CAA

TTA

GGT

GCC

ATT

GTA

CTT

GGC

AAA

2784

Pro

Gin

Val 915

Asn

Phe

Arg

Ser

Gin 920

Leu

Gly

Ala

Ile

Val 925

Leu

Gly

Lys

AAT

TCA

TCT

CAC

TTT

ATT

GGG

GCT

GGT

GTC

CCT

TTG

GGC

TCG

ACT

GAG

2832

Asn

Ser 930

Ser

His

Phe

Ile

Gly 935

Ala

Gly

Val

Pro

Leu 940

Gly

Ser

Thr

Glu

GAG

GAT

CAT

GAA

AGC

TCC

CTG

GGA

GAA

AAT

GTA

TCA

CCA

GTG

GAG

AGT

2880

Glu 945

Asp

His

Glu

Ser

Ser 950

Leu

Gly

Glu

Asn

Val 955

Ser

Pro

Val

Glu

Ser 960

GAC

GGG

ATA

TTT

GAA

AAG

GAA

AGA

GCT

CAT

GGA

CCT

GCT

TCA

CTG

ACC

2928

Asp

Gly

Ile

Phe

Glu 965

Lys

Glu

Arg

Ala

His 970

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu 975

Thr

• · · · · · • · · · · · ····· ·· · • · · · · • · · · «·

161 • · · · · • · · · toto

AAA

GAC

GAT

GTT

TTA

TTT

AAA

GTT

AAT

ATC

TCT

TTG

GTA

AAG

ACA

AAC

Lys

Asp

Val 980

Leu

Phe

Lys

Val

Asn 985

Ile

Ser

Leu

Val

Lys 990

Thr

Asn

AAG

GCA

CGA

GTT

TAC

TTA

AAA

ACT

AAT

AGA

AAG

ATT

CAC

ATT

GAT

GAC

Lys

Ala

Arg 995

Val

Tyr

Leu

Lys

Thr Asn 1000

Arg

Lys

Ile

His Ile 1005

Asp

GCA

GCT

TTA

ACT

GAG

AAT

AGG

GCA

TCT

GCA

ACG

TTT

ATG

GAC

AAA

Ala

Ala Leu 1010

Leu

Thr

Glu

Asn Arg 1015

Ala

Ser

Ala

Thr Phe 1020

Met

Asp

Lys

AAT

ACT

ACA

GCT

TCG

GGA

TTA

AAT

CAT

GTG

TCA

AAT

TGG

ATA

AAA

GGG

Asn Thr 1025

Thr

Ala

Ser

Gly Leu 1030

Asn

His

Val

Ser 1035

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly 1040

CCC

CTT

GGC

AAG

AAC

CCC

CTA

AGC

TCG

GAG

CGA

GGC

CCC

AGT

CCA

GAG

Pro

Leu

Gly

Lys

Asn 1045

Pro

Leu

Ser

Glu Arg 1050

Gly

Pro

Ser

Pro Glu 1055

CTT

CTG

ACA

TCT

TCA

GGA

TCA

GGA

AAA

TCT

GTG

AAA

GGT

CAG

AGT

TCT

Leu

Thr

Ser Ser 1060

Gly

Ser

Gly

Lys Ser 1065

Val

Lys

Gly

Gin Ser 1070

Ser

GGG

CAG

GGG

AGA

ATA

CGG

GTG

GCA

GTG

GAA

GAG

GAA

CTG

AGC

AAA

Gly

Gin

Gly Arg 1075

Ile

Arg

Val

Ala Val 1080

Glu

Glu Leu 1085

Ser

Lys

GGC

AAA

GAG

ATG

CTT

CCC

AAC

AGC

GAG

CTC

ACC

TTT

CTC

ACT

AAC

Gly

Lys Glu 1090

Met

Leu

Pro Asn 1095

Ser

Glu

Leu

Thr noc

Phe )

Leu

Thr

Asn

TCG

GCT

GAT

GTC

CAA

GGA

AAC

GAT

ACA

CAC

AGT

CAA

GGA

AAA

AAG

TCT

Ser Ala 1105

Asp

Val

Gin

Gly Asn 1110

Asp

Thr

His

Ser 1115

Gin

Gly

Lys

Ser 1120

CGG

GAA

GAG

ATG

GAA

AGG

AGA

GAA

AAA

TTA

GTC

CAA

GAA

AAA

GTC

GAC

Arg

Glu

Met

Glu Arg 1125

Arg

Glu

Lys

Leu 113C

Val )

Gin

Glu

Lys

Val Asp 1135

TTG

CCT

CAG

GTG

TAT

ACA

GCG

ACT

GGA

ACT

AAG

AAT

TTC

CTG

AGA

AAC

Leu

Pro

Gin

Val Tyr 1140

Thr

Ala

Thr

Gly Thr 1145

Lys

Asn

Phe

Leu Arg 1150

Asn

ATT

TTT

CAC

CAA

AGC

ACT

GAG

CCC

AGT

GTA

GAA

GGG

TTT

GAT

GGG

Ile

Phe

His Gin 1155

Ser

Thr

Glu

Pro Ser 1160

Val

Glu

Gly

Phe Asp 1165

Gly

TCA

CAT

GCG

CCG

GTG

CCT

CAA

GAC

AGC

AGG

TCA

TTA

AAT

GAT

TCG

GCA

Ser

His Ala 1170

Pro

Val

Pro

Gin Asp 1175

Ser

Arg

Ser

Leu 118 C

Asn )

Asp

Ser

Ala

GAG

AGA

GCA

GAG

ACT

CAC

ATA

GCC

CAT

TTC

TCA

GCA

ATT

AGG

GAA

GAG

Glu Arg Ala 1185

Glu

Thr

His Ile 1190

Ala

His

Phe

Ser Ala 1195

Ile

Arg

Glu

Glu 1200

2976

3024

3072

3120

3168

3216

3264

3312

3360

3408

3456

3504

3552

3600 • · • · · · · · · • · · · · ♦ · · · • · · · · ·

162

GCA Ala

CCC Pro

TTG Leu

GAA Glu

GCC Ala 1205

CCG Pro 1

GGA Gly

AAT Asn

CGA Arg

ACA GGT Thr Gly 1210

CCA Pro

GGT Gly

CCG Pro

AGG AGT Arg Ser 1215

3648

GCG

GTT

CCC

CGC

GTT

AAG

CAG

AGC

TTG AAA

CAG

ATC

AGA

CTC CCG

3696

Ala

Val

Pro

Arg 122C

Arg )

Val

Lys

Gin

Ser 1225

Leu Lys

Gin

Ile

Arg Leu Pro 1230

CTA

GAA

ATA

AAG

CCT

GAA

AGG

GGG

GTG GTT

CTG

AAT

GCC

ACC TCA

3744

Leu

Glu

Glu 1235

Ile

Lys

Pro

Glu

Arg Gly 1240

Val Val

Leu

Asn 1245

Ala

Thr Ser

ACC

CGG

TGG

TCT

GAA

AGC

AGT

CCT

ATC

TTA CAA

GGA

GCC

AAA

AGA AAT

3792

Thr

Arg Trp 1250

Ser

Glu

Ser

Ser 1255

Pro

Ile

Leu Gin

Gly Ala 1260

Lys

Arg Asn

AAC

CTT

TCT

TTA

CCT

TTC

CTG

ACC

TTG

GAA ATG

GCC

GGA

GGT

CAA GGA

3840

Asn Leu 1265

Ser

Leu

Pro

Phe Leu 1270

Thr

Leu

Glu Met 1275

Ala

Gly

Gin Gly 1280

AAG

ATC

AGC

GCC

CTG

GGG

AAA

AGT

GCC

GCA GGC

CCG

CTG

GCG

TCC GGG

3888

Lys

Ile

Ser

Ala

Leu 1285

Gly

Lys

Ser

Ala

Ala Gly 1290

Pro

Leu

Ala

Ser Gly 1295

AAG

CTG

GAG

AAG

GCT

GTT

CTC

TCT

TCA

GCA GGC

TTG

TCT

GAA

GCA TCT

3936

Lys

Leu

Glu

Lys Ala 1300

Val

Leu

Ser

Ser 1305

Ala Gly

Leu

Ser

Glu Ala Ser 1310

GGC

AAA

GCT

GAG

TTT

CTT

CCT

AAA

GTT

CGA GTT

CAT

CGG

GAA

GAC CTG

3984

Gly

Lys

Ala Glu 1315

Phe

Leu

Pro

Lys Val 1320

Arg Val

His

Arg 1325

Glu

Asp Leu

TTG

CCT

CAA

AAA

ACC

AGC

AAT

GTT

TCT

TGC GCA

CAC

GGG

GAT

CTC GGC

4032

Leu

Pro Gin 1330

Lys

Thr

Ser

Asn Val 1335

Ser

Cys Ala

His Gly 1340

Asp

Leu Gly

CAG

GAG

ATC

TTC

CTG

CAG

AAA

ACA

CGG

GGA CCT

GTT

AAC

CTG

AAC AAA

4080

Gin Glu 1345

Ile

Phe

Leu

Gin Lys 1350

Thr

Arg

Gly Pro 1355

Val

Asn

Leu

Asn Lys 1360

GTA

AAT

AGA

CCT

GGA

AGG

ACT

CCC

TCC

AAG CTT

CTG

GGT

CCC

CCG ATG

4128

Val

Asn

Arg

Pro

Gly 1365

Arg

Thr

Pro

Ser

Lys Leu 1370

Leu

Gly

Pro

Pro Met 1375

CCC

AAA

GAG

TGG

GAA

TCC

CTA

GAG

AAG

TCA CCA

AAA

AGC

ACA

GCT CTC

4176

Pro

Lys

Glu

Trp Glu 1380

Ser

Leu

Glu

Lys Ser Pro 1385

Lys

Ser

Thr Ala Leu 1390

AGG

ACG

AAA

GAC

ATC

AGT

TTA

CCC

CTG GAC

CGT

CAC

GAA

AGC AAT

4224

Arg

Thr

Lys Asp 1395

Ile

Ser

Leu Pro 1400

Leu Asp

Arg

His 1405

Glu

Ser Asn

CAT

TCA

ATA

GCA

AAA

AAT

GAA

GGA

CAA GCC

GAG

ACC

CAA

AGA GAA

4272

His

Ser Ile 1410

Ala

Lys

Asn Glu 1415

Gly

Gin Ala

Glu Thr 1420

Gin

Arg Glu

163

GCC Ala 1425

GCC Ala 1

TGG Trp

ACG Thr

AAG Lys

CAG GGA Gin Gly 1430

GGG Gly

CCT Pro

GGA Gly

AGG CTG Arg Leu 1435

TGC Cys

GCT Ala

CCA Pro

AAG Lys 1440

4320

CCT

CCG

GTC

CTG

CGA

CGG CAT

CAG

AGG

GAC

ATA AGC

CTT

CCT

ACT

TTT

4368

Pro

Val

Leu

Arg 1445

Arg His 1

Gin

Arg

Asp Ile Ser 1450

Leu

Pro

Thr Phe 1455

CAG

CCG

GAG

GAA

GAC

AAA ATG

GAC

TAT

GAT

GAT ATC

TTC

TCA

ACT

GAA

4416

Gin

Pro

Glu

Glu Asp 1460

Lys Met

Asp

Tyr 1465

Asp

Asp Ile

Phe

Ser 147C

Thr )

Glu

ACG

AAG

GGA

GAA

GAT

TTT GAC

ATT

TAC

GGT

GAG GAT

GAA

AAT

CAG

GAC

4464

Thr

Lys

Gly 1478

Glu

Asp

Phe Asp

Ile Tyr 1480

Gly

Glu Asp

Glu Asn 1485

Gin

Asp

CCT

CGC

AGC

TTT

CAG

AAG AGA

ACC

CGA

CAC

TAT TTC

ATT

GCT

GCG

GTG

4512

Pro

Arg Ser 1490

Phe

Gin

Lys Arg Thr 1495

Arg

His

Tyr Phe Ile 1500

Ala

Val

GAG

CAG

CTC

TGG

GAT

TAC GGG

ATG

AGC

GAA

TCC CCC

CGG

GCG

CTA

AGA

4560

Glu Gin 1505

Leu

Trp

Asp

Tyr Gly 1510

Met

Ser

Glu

Ser Pro 1515

Arg

Ala

Leu

Arg 1520

AAC

AGG

GCT

CAG

AAC

GGA GAG

GTG

CCT

CGG

TTC AAG

AAG

GTG

GTC

TTC

4608

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn 1525

Gly Glu

Val

Pro

Arg Phe Lys 1530

Lys

Val

Val Phe 1535

CGG

GAA

TTT

GCT

GAC

GGC TCC

TTC

ACG

CAG

CCG TCG

TAC

CGC

GGG

GAA

4656

Arg

Glu

Phe

Ala Asp 1540

Gly Ser

Phe

Thr Gin 1545

Pro Ser

Tyr

Arg 155C

Gly 1

Glu

CTC

AAC

AAA

CAC

TTG

GGG CTC

TTG

GGA

CCC

TAC ATC

AGA

GCG

GAA

GTT

4704

Leu

Asn

Lys His 1555

Leu

Gly Leu

Leu Gly 1560

Pro

Tyr Ile

Arg Ala 1565

Glu

Val

GAA

GAC

AAC

ATC

ATG

GTA ACT

TTC

AAA

AAC

CAG GCG

TCT

CGT

CCC

TAT

4752

Glu

Asp Asn 1570

Ile

Met

Val Thr Phe 1575

Lys

Asn

Gin Ala Ser 1580

Arg

Pro

Tyr

TCC

TTC

TAC

TCG

AGC

CTT ATT

TCT

TAT

CCG

GAT GAT

CAG

GAG

CAA

GGG

4800

Ser Phe 1585

Tyr

Ser

Leu Ile 1590

Ser

Tyr

Pro

Asp Asp 1595

Gin

Glu

Gin

Gly 1600

GCA

GAA

CCT

CGA

CAC

AAC TTC

GTC

CAG

CCA

AAT GAA

ACC

AGA

ACT

TAC

4848

Ala

Glu

Pro

Arg

His Asn Phe 1605

Val

Gin

Pro Asn Glu 1610

Thr

Arg

Thr Tyr 1615.

TTT

TGG

AAA

GTG

CAG

CAT CAC

ATG

GCA

CCC

ACA GAA

GAC

GAG

TTT

GAC

4896

Phe

Trp

Lys

Val Gin 1620

His His

Met

Ala Pro 1625

Thr Glu

Asp

Glu 163C

Phe )

Asp

TGC

AAA

GCC

TGG

GCC

TAC TTT

TCT

GAT

GTT

GAC CTG

GAA

AAA

GAT

GTG

4944

Cys

Lys

Ala Trp 1635

Ala

Tyr Phe

Ser Asp 1640

Val

Asp Leu

Glu Lys 1645

Asp

Val

• · · ♦ • · · » • · · · • · • ·

164

CAC His

TCA GGC Ser Gly 1650

TTG Leu

ATC Ile

GGC Gly

CCC Pro 1655

CTT Leu l

CTG Leu

ATC Ile

TGC Cys

CGC GCC Arg Ala 1660

AAC Asn

ACC Thr

CTG Leu

4992

AAC

GCT GCT

CAC

GGT

AGA

CAA

GTG

ACC

GTG

CAA

GAA TTT

GCT

CTG

TTT

5040

Asn Ala Ala 1665

His

Gly

Arg 167C

Gin )

Val

Thr

Val

Gin 1675

Glu Phe i

Ala

Leu

Phe 1680

TTC

ACT ATT

TTT

GAT

GAG

ACA

AAG

AGC

TGG

TAC

TTC ACT

GAA

AAT

GTG

5088

Phe

Thr Ile

Phe

Asp 1685

Glu i

Thr

Lys

Ser

Trp Tyr 1690

Phe Thr

Glu

Asn Val 1695

GAA

AGG AAC

TGC

CGG

GCC

CCC

TGC

CAC

CTG

CAG

ATG GAG

GAC

CCC

ACT

5136

Glu

Arg Asn

Cys Arg 1700

Ala

Pro

Cys

His Leu 1705

Gin

Met Glu

Asp Pro 1710

Thr

CTG

AAA GAA

AAC

TAT

CGC

TTC

CAT

GCA

ATC

AAT

GGC TAT

GTG

ATG

GAT

5184

Leu

Lys Glu Asn 1715

Tyr

Arg

Phe

His Ala 1720

Ile

Asn

Gly Tyr Val 1725

Met

Asp

ACÁ

CTC CCT

GGC

TTA

GTA

ATG

GCT

CAG

AAT

CAA

AGG ATC

CGA

TGG

TAT

5232

Thr

Leu Pro 1730

Gly

Leu

Val

Met 1735

Ala

Gin

Asn

Gin

Arg Ile 1740

Arg

Trp

Tyr

CTG

CTC AGC

ATG

GGC

AGC

AAT

GAA

AAT

ATC

CAT

TCG ATT

CAT

TTT

AGC

5280

Leu Leu Ser 1745

Met

Gly

Ser Asn 1750

Glu

Asn

Ile

His 1755

Ser Ile

His

Phe

Ser 1760

GGA

CAC GTG

TTC

AGT

GTA

CGG

AAA

AAG

GAG

TAT AAA

ATG

GCC

GTG

5328

Gly

His Val

Phe

Ser 1765

Val

Arg

Lys

Glu Glu 1770

Tyr Lys

Met

Ala 1775

Val

TAC

AAT CTC

TAT

CCG

GGT

GTC

TTT

GAG

ACA

GTG

GAA ATG

CTA

CCG

TCC

5376

Tyr

Asn Leu

Tyr Pro 1780

Gly

Val

Phe

Glu Thr 1785

Val'

Glu Met

Leu Pro 1790

Ser

AAA

GTT GGA

ATT

TGG

CGA

ATA

GAA

TGC

CTG

ATT

GGC GAG

CAC

CTG

CAA

5424

Lys

Val Gly Ile 1795

Trp

Arg

Ile

Glu Cys 1800

Leu

Ile

Gly Glu His 1805

Leu

Gin

GCT

GGG ATG

AGC

ACG

ACT

TTC

CTG

GTG

TAC

AGC

AAG GAG

TGT

CAG

GCT

5472

Ala

Gly Met 1810

Ser

Thr

Phe 1815

Leu

Val

Tyr

Ser

Lys Glu 1820

Cys

Gin

Ala

CCA

CTG GGA

ATG

GCT

TCT

GGA

CGC

ATT

AGA

GAT

TTT CAG

ATC

ACA

GCT

5520

Pro Leu Gly 1825

Met

Ala

Ser Gly 1830

Arg

Ile

Arg

Asp 1835

Phe Gin

Ile

Thr

Ala 1840

TCA

GGA CAG

TAT

GGA

CAG

TGG

GCC

CCA

AAG

CTG

GCC AGA

CTT

CAT

TAT

5568

Ser

Gly Gin

Tyr

Gly Gin 1845

Trp

Ala

Pro

Lys Leu 1850

Ala Arg

Leu

His 1855

Tyr

TCC

GGA TCA

ATC

AAT

GCC

TGG

AGC

ACC

AAG

GAT

CCC CAC

TCC

TGG

ATC

5616

Ser

Gly Ser

Ile

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro His

Ser

Trp

Ile

1860 1865 1870 • · • · • ·

165

AAG Lys

GTG Val

GAT Asp 1875

CTG Leu

TTG Leu

GCA Ala

CCA Pro

ATG ATC Met Ile 1880

ATT Ile

CAC His

GGC Gly

ATC ATG Ile Met 1885

ACC Thr

CAG Gin

5664

GGT

GCC

CGT

CAG

AAG

TTT

TCC

AGC CTC

TAC

ATC

TCC

CAG TTT

ATC

5712

Gly

Ala Arg 1890

Gin

Lys

Phe

Ser 1895

Ser Leu

Tyr

Ile

Ser 190C

Gin Phe )

Ile

ATG

TAC

AGT

CTT

GAC

GGG

AGG

AAC TGG

CAG

AGT

TAC

CGA GGG

AAT

TCC

5760

Met 1905

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly 191C

Arg )

Asn Trp

Gin

Ser 1915

Tyr

Arg Gly

Asn

Ser 1920

ACG

GGC

ACC

TTA

ATG

GTC

TTC

TTT GGC

AAT

GTG

GAC

GCA TCT

GGG

ATT

5808

Thr

Gly

Thr

Leu

Met Val 1925

Phe

Phe Gly

Asn 193C

Val )

Asp

Al a Ser

Gly Ile 1935

AAA

CAC

AAT

ATT

TTT

AAC

CCT

CCG ATT

GTG

GCT

CGG

TAC ATC

CGT

TTG

5856

Lys

His

Asn

Ile Phe 1940

Asn

Pro

Pro Ile Val 1945

Ala

Arg

Tyr Ile Arg 1950

Leu

CAC

CCA

ACA

CAT

TAC

AGC

ATC

CGC AGC

ACT

CTT

CGC

ATG GAG

TTG

ATG

5904

His

Pro

Thr 1955

His

Tyr

Ser

Ile

Arg Ser 1960

Thr

Leu

Arg

Met Glu 1965

Leu

Met

GGC

TGT

GAT

TTA

AAC

AGT

TGC

AGC ATG

CCC

CTG

GGA

ATG CAG

AAT

AAA

5952

Gly

Cys Asp 1970

Leu

Asn

Ser

Cys Ser Met 1975

Pro

Leu

Gly 198C

Met Gin )

Asn

Lys

GCG

ATA

TCA

GAC

TCA

CAG

ATC

ACG GCC

TCC

CAC

CTA AGC

AAT

ATA

6000

Al a Ile 1985

Ser

Asp

Ser

Gin Ile 1990

Thr Ala

Ser

Ser 1995

His

Leu Ser

Asn

Ile 2000

TTT

GCC

ACC

TGG

TCT

CCT

TCA

CAA GCC

CGA

CTT

CAC

CTC CAG

GGG

CGG

6048

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser Pro 2005

Ser

Gin A_La

Arg 201C

Leu )

His

Leu Gin

Gly 2015

Arg

ACG

AAT

GCC

TGG

CGA

CCC

CGG

GTG AGC

AGC

GCA

GAG

GAG TGG

CTG

CAG

6096

Thr

Asn

Ala

Trp Arg 2020

Pro

Arg

Val Ser Ser 2025

Ala

Glu

Glu Trp Leu 2030

Gin

GTG

GAC

CTG

CAG

AAG

ACG

GTG

AAG GTC

ACA

GGC

ATC

ACC ACC

CAG

GGC

6144

Val

Asp

Leu 2035

Gin

Lys

Thr

Val

Lys Val 2040

Thr

Gly

Ile

Thr Thr 2045

Gin

Gly

GTG

AAG

TCC

CTG

CTC

AGC

ATG TAT

GTG

AAG

GAG

TTC.CTC

GTG

TCC

6192

Val

Lys Ser 2050

Leu

Ser

Ser 2055

Met Tyr

Val

Lys

Glu 206C

Phe Leu I

Val

Ser

AGT

CAG

GAC

GGC

CGC

TGG ACC

CTG

TTT

CTT

CAG GAC

GGC

CAC

6240

Ser Ser 2065

Gin

Asp

Gly

Arg Arg 2070

Trp Thr

Leu

Phe 2075

Leu 1

Gin Asp

Gly

His 2080

ACG

AAG

GTT

TTT

CAG

GGC

AAT

CAG GAC

TCC

ACC

CCC GTG

GTG

AAC

6288

Thr

Lys

Val

Phe

Gin Gly Asn 2085

Gin Asp

Ser 209C

Ser )

Thr

Pro Val

Val 2095

Asn

• · · 4 • · ·♦ • · · <

• · · 4 • · · · ·· ·· ·· · * • ·· · · · · · • · · · · ·· · ·· · · · · · · · ·

166

GCT CTG GAC CCC CCG CTG TTC ACG CGC TAC CTG AGG ATC CAC CCC ACG Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Thr

2100 2105 2110

6336

AGC TGG GCG CAG CAC ATC GCC CTG AGG CTC GAG GTT CTA GGA TGT GAG Ser Trp Ala Gin His Ile Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu

2115 2120 2125

6384

GCA CAG GAT CTC TAC TGA Ala Gin Asp Leu Tyr *

2130

6402 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 2134 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

Met Gin Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 15 10 15

Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30

Trp Asp Tyr Arg Gin Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr 35 .40 45

Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val 50 55 60

Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gin Leu Phe Ser 65 70 75 80

Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile 85 90 95

Gin Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala 100 105 110

Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser 115 120 125

Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu 130 135 140

Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gin Thr Tyr Val Trp Gin Val 145 150 155 160

Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Prg Cys Leu Thr Tyr 165 170 175 • · · · · · ·· ···· ··«· • · · · · ·· · • ·· · · · · ··· • · · · · · · • · ·· · 9 9 9

9 ·9

9 4 4 • · · <

167

Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190

Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205

Thr Gin Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu 210 215 220

Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met

225 230 235 240

Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gin Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly

245 250 255

Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser .260 265 270

Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser 275 280 285

Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val .Arg His His Arg Gin Ala 290 295 300

Ser Leu Glu Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Phe Leu

305 310 315 320

Met Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His

325 330 335

His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu 340 345 350

Pro Gin Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn 355 360 365

Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val 370 375 380

Ser Pro Phe Ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn 420 425 430

Ser Gly Pro Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val 435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu 450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 ·· ·· ·» ·· ·· ·· • · · · *··· ···· ···· ..·· ...» • ·· ··· ······ ·· · ···· ·· · ····

168

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg 485 490

His Gly Ile Thr Asp Val Ser Ala Leu His 500 505

Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro Ile 515 520

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp 530 535

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser 545 550

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu 565 570

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Met Met 580 585

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gin 595 600

Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp 610 615

Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His 625 630

Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu 645 650

Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gin Thr Asp 660 665

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val 675 680

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe 690 695

Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser 705 710

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys 725 730

Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro 740 745

Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ala 755 760

Ser Ala Ser Gin Lys Gin Phe Gin Thr Ile 770 775

Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 495

Pro Gly Arg Leu Leu Lys 510

Leu Pro Gly Glu Thr Phe 525

Gly Pro Thr Lys Ser Asp 540

Ser Ile Asn Leu Glu Lys 555 560

Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 575

Ser Asp Lys Arg Asn Val 590

Ser Trp Tyr Leu Ala Glu 605

Gly Leu Gin Pro Gin Asp 620

Ser Ile Asn Gly Tyr Val 635 640

His Glu Val Ala Tyr Trp 655

Phe Leu Ser Val Phe Phe 670

Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 685

Met Ser Met Glu Asn Pro 700

Asp Leu Arg Asn Arg Gly 715 720

Asp Arg Asp Ile Gly Asp 735

Gly Phe Leu Leu Ser Gly 750

Gin Asn Ser Arg Pro Pro 765

Thr Ser Pro Glu Asp Asp 780 • ♦ · · · · • · · · · · · • · · · · « · · · · ·· ··· · ····· ·· Λ Λ · ·· · ···

169

Val 785

Glu

Leu

Asp

Pro

Gin 790

Ser

Gly

Glu

Arg

Thr 795

Gin

Ala

Leu

Glu

Glu 800

Leu

Ser

Val

Pro

Ser 805

Gly

Asp

Gly

Ser

Met 810

Leu

Gly

Gin

Asn 815

Pro

Ala

Pro

His

Gly 820

Ser

Asp 825

Leu

Gin

Glu

Ala

Arg 830

Asn

Glu

Ala

Asp

Asp 835

Tyr

Leu

Pro

Gly

Ala 840

Arg

Glu

Arg

Asn

Thr 845

Ala

Pro

Ser

Ala

Ala 850

Ala

Arg

Leu

Arg

Pro 855

Glu

Leu

His

Ser 860

Ala

Glu

Arg

Val

Leu 865

Thr

Pro

Glu

Pro

Glu 870

Lys

Glu

Leu

Lys

Lys 875

Leu

Asp

Ser

Lys

Met 880

Ser

Asp 885

Leu

Lys

Thr

Ser 890

Pro

Thr

Ile

Pro

Ser 895

Asp

Thr

Leu

Ser

Ala 900

Glu

Thr

Glu

Arg

Thr 905

His

Ser

Leu

Gly

Pro 910

Pro

His

Pro

Gin

Val 915

Asn

Phe

Arg

Ser

Gin 920

Leu

Gly

Ala

Ile

Val 925

Leu

Gly

Lys

Asn

Ser 930

Ser

His

Phe

Ile

Gly 935

Ala

Gly

Val

Pro

Leu 940

Gly

Ser

Thr

Glu

Glu 945

Asp

His

Glu

Ser

Ser 950

Leu

Gl-y

Glu

Asn

Val 955

Ser

Pro

Val

Glu

Ser 960

Asp

Gly

Ile

Phe

Glu 965

Lys

Glu

Arg

Ala

His 970

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu 975

Thr

Lys

Asp

Val 980

Leu

Phe

Lys

Val

Asn 985

Ile

Ser

Leu

Val

Lys 990

Thr

Asn

Lys

Ala

Arg 995

Val

Tyr

Leu

Lys

Thr Asn 1000

Arg

Lys

Ile

His Ile 1005

Asp

Ala

Ala Leu 1010

Leu

Thr

Glu

Asn Arg 1015

Ala

Ser

Ala

Thr Phe 1020

Met

Asp

Lys

Asn Thr 1025

Thr

Ala

Ser

Gly Leu 1030

Asn

His

Val

Ser Asn 1035

Trp

Ile

Lys

Gly 1040

Pro

Leu

Gly

Lys

Asn Pro 1045

Leu

Ser

Glu Arg 1050

Gly

Pro

Ser

Pro Glu 1055

Leu

Thr

Ser

Gly

Ser

Gly

Lys

Ser

Val

Lys

Gly

Gin

Ser

1060 1065 1070

Gly Gin Gly Arg Ile Arg Val Ala Val Glu Glu Glu Glu Leu Ser Lys 1075 1080 1085 • · ·· · · · 0 · 0 · · 0 • « · · ·· · 0 ·· · ·· · · · · · · 0 · · * · · ··· ·· 0 ····

170

Gly

Lys 1090

Glu

Met

Leu

Pro 1095

Asn 1

Ser

Glu

Leu

Thr 1100

Phe 1

Leu

Thr

Asn

Ser 1105

Ala

Asp

Val

Gin

Gly 1110

Asn

Asp

Thr

His

Ser 1115

Gin

Gly

Lys

Ser 1120

Arg

Glu

Met

Glu 1125

Arg

Glu

Lys

Leu 1130

Val

Gin

Glu

Lys

Val 1135

Asp 1

Leu

Pro

Gin

Val 114C

Tyr )

Thr

Ala

Thr

Gly 1145

Thr >

Lys

Asn

Phe

Leu 115C

Arg )

Asn

Ile

Phe

His 1155

Gin

Ser

Thr

Glu

Pro 116C

Ser 1

Val

Glu

Gly

Phe 1165

Asp

Gly

Ser

His 117C

Ala 1

Pro

Val

Pro

Gin 1175

Asp )

Ser

Arg

Ser

Leu 118C

Asn 1

Asp

Ser

Ala

Glu 1185

Arg >

Ala

Glu

Thr

His 119C

Ile l

Ala

His

Phe

Ser 1195

Ala 1

Ile

Arg

Glu

Glu 1200

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala 1205

Pro 1

Gly

Asn

Arg

Thr 1210

Gly 1

Pro

Gly

Pro

Arg 1215

Ser 1

Ala

Val

Pro

Arg Arg 1220

Val

Lys

Gin

Ser 1225

Leu

Lys

Gin

Ile

Arg 123C

Leu )

Pro

Leu

Glu

Glu Ile 1235

Lys

Pro

Glu

Arg 124C

Gly 1

Val

Leu

Asn 1245

Ala

Thr

Ser

Thr

Arg Trp 1250

Ser

Glu

Ser

Ser 1255

Pro

Ile

Leu

Gin

Gly 126C

Tkla 1

Lys

Arg

Asn

Asn 1265

Leu

Ser

Leu

Pro

Phe 127C

Leu 1

Thr

Leu

Glu

Met 1275

Ala

Gly

Gin

Gly 1280

Lys

Ile

Ser

Ala

Leu 1285

Gly )

Lys

Ser

Ala

Ala 129C

Gly 1

Pro

Leu

Ala

Ser 1295

Gly 1

Lys

Leu

Glu

Lys Ala 1300

Val

Leu

Ser

Ser 1305

Ala

Gly

Leu

Ser

Glu 131C

Ala 1

Ser

Gly

Lys

Ala Glu 1315

Phe

Leu

Pro

Lys 132C

Val 1

Arg

Val

His

Arg 1325

Glu

Asp

Leu

Pro Gin 1330

Lys

Thr

Ser

Asn 1335

Val

Ser

Cys

Ala

His 134C

Gly 1

Asp

Leu

Gly

Gin 1345

Glu

Ile

Phe

Leu

Gin 135C

Lys )

Thr

Arg

Gly

Pro 1355

Val 1

Asn

Leu

Asn

Lys 1360

Val

Asn

Arg

Pro

Gly

Arg

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Gly

Pro

Met

1365 1370 1375

Pro Lys Glu Trp Glu Ser Leu Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr Ala Leu 1380 1385 1390 • φ φ φ • * · φ φφ φφ • φφ φ φ φφ · β · · φ φ ·· · • φ φφφφφ φφ · • ••Φ φφ φ φφφφ

171

Arg

Thr

Lys 1395

Asp

Ile

Ser

Leu 1400

Pro

Leu

Asp

Arg

His 1405

Glu 1

Ser

Asn

His

Ser 1410

Ile

Ala

Lys

Asn 1415

Glu

Gly

Gin

Ala

Glu 1420

Thr 1

Gin

Arg

Glu

Ala 1425

Ala

Trp

Thr

Lys

Gin 1430

Gly

Pro

Gly

Arg 1435

Leu

Cys

Ala

Pro

Lys 1440

Pro

Val

Leu

Arg 1445

Arg 1

His

Gin

Arg

Asp 145C

Ile )

Ser

Leu

Pro

Thr 1455

Phe 1

Gin

Pro

Glu

Glu Asp 1460

Lys

Met

Asp

Tyr 1465

Asp )

Asp

Ile

Phe

Ser 147C

Thr 1

Glu

Thr

Lys

Gly 1475

Glu I

Asp

Phe

Asp

Ile 148C

Tyr 1

Gly

Glu

Asp

Glu 1485

Asn 1

Gin

Asp

Pro

Arg 149C

Ser 1

Phe

Gin

Lys

Arg 1495

Thr 1

Arg

His

Tyr

Phe 150C

Ile 1

Ala

Val

Glu 1505

Gin )

Leu

Trp

Asp

Tyr 151C

Gly 1

Met

Ser

Glu

Ser 1515

Pro t

Arg

Ala

Leu

Arg 1520

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn 1525

Gly

Glu

Val

Pro

Arg Phe 1530

Lys

Val

Val 1535

Phe

Arg

Glu

Phe

Ala Asp 1540

Gly

Ser

Phe

Thr 1545

Gin

Pro

Ser

Tyr

Arg 155C

Gly l

Glu

Leu

Asn

Lys 1555

His

Leu

Gly

Leu

Leu 156C

Gly 1

Pro

Tyr

Ile

Arg 1565

Ala

Glu

Val

Glu

Asp 157C

Asn )

Ile

Met

Val

Thr 1575

Phe 1

Lys

Asn

Gin

Ala 158C

Ser 1

Arg

Pro

Tyr

Ser 1585

Phe

Tyr

Ser

Leu 159C

Ile l

Ser

Tyr

Pro

Asp 1595

Asp 1

Gin

Glu

Gin

Gly 1600

Ala

Glu

Pro

Arg

His 1605

Asn 1

Phe

Val

Gin

Pro Asn 1610

Glu

Thr

Arg

Thr 1615

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val Gin 1620

His

Met

Ala 1625

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu 163C

Phe )

Asp

Cys

Lys

Ala Trp 1635

Ala

Tyr

Phe

Ser 164C

Asp 1

Val

Asp

Leu

Glu 1645

Lys

Asp

Val

His

Ser Gly 1650

Leu

Ile

Gly

Pro 1655

Leu

Ile

Cys

Arg 166C

Ala )

Asn

Thr

Leu

Asn Ala 1665

Ala

His

Gly

Arg 167C

Gin )

Val

Thr

Val

Gin 1675

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe 1680

Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val 1685 1690 1695

172

Glu	Arg	Asn	Cys Arg Ala 1700	Pro	Cys	His Leu 1705	Gin	Met	Glu	Asp Pro 1710	Thr
Leu	Lys	Glu	Asn Tyr Arg	Phe	His	Ala Ile	Asn	Gly	Tyr	Val Met	Asp
		1715		1720			1725
Thr	Leu	Pro	Gly Leu Val	Met	Ala	Gin Asn	Gin	Arg	Ile	Arg Trp	Tyr
	1730		1735			1740
Leu	Leu	Ser	Met Gly Ser	Asn	Glu	Asn Ile	His	Ser	Ile	His Phe	Ser
1745		1750			1755			1760
Gly	His	Val	Phe Ser Val	Arg	Lys	Lys Glu	Glu	Tyr	Lys	Met Ala	Val
			1765			1770			1775
Tyr	Asn	Leu	Tyr Pro Gly	Val	Phe	Glu Thr	Val	Glu	Met	Leu Pro	Ser
			1780			1785				1790
Lys	Val	Gly	Ile Trp Arg	Ile	Glu	Cys Leu	Ile	Gly	Glu	His Leu	Gin
		1795		1800			1805
Ala	Gly	Met	Ser Thr Thr	Phe	Leu	Val Tyr	Ser	Lys	Glu	Cys Gin	Ala
	1810		1815			1820
Pro	Leu	Gly	Met Ala Ser	Gly	Arg	Ile Arg	Asp	Phe	Gin	Ile Thr	Ala
1825		1830			1835			1840
Ser	Gly	Gin	Tyr Gly Gin	Trp	Ala	Pro Lys	Leu	Ala	Arg	Leu His	Tyr
			1845			1850			1855
Ser	Gly	Ser	Ile Asn Ala	Trp	Ser	Thr Lys	Asp	Pro	His	Ser Trp	Ile
			1860			1865				1870
Lys	Val	Asp	Leu Leu Ala	Pro	Met	Ile Ile	His	Gly	Ile	Met Thr	Gin
		1875		1880			1885
Gly	Ala	Arg	Gin Lys Phe	Ser	Ser	Leu Tyr	Ile	Ser	Gin	Phe Ile	Ile
	1890		1895			1900
Met	Tyr	Ser	Leu Asp Gly	Arg	Asn	Trp Gin	Ser	Tyr	Arg	Gly Asn	Ser
1905		1910			1915			1920
Thr	Gly	Thr	Leu Met Val	Phe	Phe	Gly Asn	Val	Asp	Ala	Ser Gly	Ile
			1925			1930			1935
Lys	His	Asn	Ile Phe Asn	Pro	Pro	Ile Val	Ala	Arg	Tyr	Ile Arg	Leu
			1940			1945				1950
His	Pro	Thr	His Tyr Ser	Ile	Arg	Ser Thr	Leu	Arg	Met	Glu Leu	Met
		1955			1960			1965
Gly	Cys	Asp	Leu Asn Ser	Cys	Ser	Met Pro	Leu	Gly	Met	Gin Asn	Lys
	1970		1975			1980
Tkla	Ile	Ser	Asp Ser Gin	Ile	Thr	Ala Ser	Ser	His	Leu	Ser Asn	Ile
1985		1990				1995			2000

fc· fcfc ·· ·· • · · · fcfc * · • · fcfc fcfcfcfc • fcfc fcfcfc fcfcfcfc • fcfcfc fc · · fcfc fcfc ·· *· • fc fcfc • fcfc · • * · fc • fcfc » • fcfc · • fc fcfc

173

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser 2005

Pro

Ser

Gin

Ala

Arg 2010

Leu

His

Leu

Gin

Gly Arg 2015

Thr

Asn

Ala

Trp 2020

Arg 1

Pro

Arg

Val

Ser 2025

Ser 1

Ala

Glu

Trp 2030

Leu

Gin

Val

Asp

Leu 2035

Gin I

Lys

Thr

Val

Lys Val 2040

Thr

Gly

Ile

Thr Thr 2045

Gin

Gly

Val

Lys Ser 2050

Leu

Ser

Ser 2055

Met )

Tyr

Val

Lys

Glu 2060

Phe 1

Leu

Val

Ser

Ser Ser 2065

Gin

Asp

Gly

Arg Arg 2070

Trp

Thr

Leu

Phe 2075

Leu

Gin

Asp

Gly

His 2080

Thr

Lys

Val

Phe

Gin 2085

Gly 1

Asn

Gin

Asp

Ser 2090

Ser

Thr

Pro

Val

Val 2095

Asn

Ala

Leu

Asp

Pro 210C

Pro 1

Leu

Phe

Thr

Arg 2105

Tyr 1

Leu

Arg

Ile

His 211C

Pro 1

Thr

Ser

Trp

Ala

Gin

His

Ile

Ala

Leu

Arg

Leu

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

2115 2120 2125

Ala Gin Asp Leu Tyr * 2130 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 4334 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: Faktor VIII postrádající doménu B (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 3..4334 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

GA ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TGT GTC TTT CTG TGT CTC TTG CCA 47

Met Gin Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro

5 10 15 ' • · ·

174

CTC Leu

GGC Gly

TTT AGT

GCC ATC AGG AGA TAC

TAC Tyr 25

CTG Leu

GGC Gly

GCA Ala

GTG Val

GAA Glu 30

CTG Leu

95

Phe

Ser

Ala 20

Ile

Arg

Tyr

TCC

TGG

GAC

TAC

CGG

CAA

AGT

GAA

CTC

CGT

GAG

CTG

CAC

GTG

GAC

143

Ser

Trp

Asp

Tyr 35

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu 40

Leu

Arg

Glu

Leu

His 45

Val

Asp

ACC

AGA

TTT

CCT

GCT

ACA

GCG

CCA

GGA

GCT

CTT

CCG

TTG

GGC

CCG

TCA

191

Thr

Arg

Phe 50

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro 55

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu 60

Gly

Pro

Ser

GTC

CTG

TAC

AAA

AAG

ACT

GTG

TTC

GTA

GAG

TTC

ACG

GAT

CAA

CTT

TTC

239

Val

Leu 65

Tyr

Lys

Thr

Val 70

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 75

Asp

Gin

Leu

Phe

AGC

GTT

GCC

AGG

CCC

AGG

CCA

TGG

ATG

GGT

CTG

GGT

CCT

ACC

287

Ser 80

Val

Ala

Arg

Pro

Arg 85

Pro

Trp

Met

Gly 90

Leu

Gly

Pro

Thr 95

ATC

CAG

GCT

GAG

GTT

TAC

GAC

ACG

GTG

GTC

GTT

ACC

CTG

AAG

AAC

ATG

335

Ile

Gin

Ala

Glu

Val 100

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 105

Val

Thr

Leu

Lys

Asn 110

Met

GCT

TCT

CAT

CCC

GTT

AGT

CTT

CAC

GCT

GTC

GGC

GTC

TCC

TTC

TGG

AAA

383

Ala

Ser

Kis

Pro 115

Val

Ser

Leu

His

Ala 120

Val

Gly

Val

Ser

Phe 125

Trp

Lys

TCT

TCC

GAA

GGC

GCT

GAA

TAT

GAG

GAT

CAC

ACC

AGC

CAA

AGG

GAG

AAG

431

Ser

Glu 130

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu 135

Asp

His

Thr

Ser

Gin 140

Arg

Glu

Lys

GAA

GAC

GAT

AAA

GTC

CTT

CCC

GGT

AAA

AGC

CAA

ACC

TAC

GTC

TGG

CAG

479

Glu

Asp 145

Asp

Lys

Val

Leu

Pro 150

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr 155

Tyr

Val

Trp

Gin

GTC

CTG

AAA

GAA

AAT

GGT

CCA

ACA

GCC

TCT

GAC

CCA

TGT

CTC

ACC

527

Val 160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 165

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp 170

Pro

Cys

Leu

Thr 175

TAC

TCA

TAC

CTG

TCT

CAC

GTG

GAC

CTG

GTG

AAA

GAC

CTG

AAT

TCG

GGC

575

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 180

His

Val

Asp

Leu

Val 185

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 190

Gly

CTC

ATT

GGA

GCC

CTG

GTT

TGT

AGA

GAA

GGG

AGT

CTG

ACC

AGA

GAA

623

Leu

Ile

Gly

Ala 195

Leu

Val

Cys

Arg 200

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr 205

Arg

Glu

AGG

ACC

CAG

AAC

CTG

CAC

GAA

TTT

GTA

CTA

CTT

TTT

GCT

GTC

TTT

GAT

671

Arg

Thr

Gin 210

Asn

Leu

His

Glu

Phe 215

Val

Leu

Phe

Ala 220

Val

Phe

Asp

GAA

GGG

AAA

AGT

TGG

CAC

TCA

GCA

AGA

AAT

GAC

TCC

TGG

ACA

CGG

GCC

719

Glu

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

Ser 230

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser 235

Trp

Thr

Arg

Ala

• · ·

• · • · • ·

175

ATG Met 240

GAT Asp

CCC Pro

GCA Ala

CCT Pro

GCC AGG

GCC Ala

CAG Gin

CCT Pro

GCA Ala 250

ATG Met

CAC ACA GTC

AAT Asn 255

767

Ala 245

Arg

His

Thr

Val

GGC

TAT

GTC

AAC

AGG

TCT

CTG

CCA

GGT

CTG

ATC

GGA

TGT

CAT

AAG

AAA

815

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg 260

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 265

Ile

Gly

Cys

His

Lys 270

Lys

TCA

GTC

TAC

TGG

CAC

GTG

ATT

GGA

ATG

GGC

ACC

AGC

CCG

GAA

GTG

CAC

863

Ser

Val

Tyr

Trp 275

His

Val

Ile

Gly

Met 280

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu 285

Val

His

TCC

ATT

TTT

CTT

GAA

GGC

CAC

ACG

TTT

CTC

GTG

AGG

CAC

CAT

CGC

CAG

911

Ser

Ile

Phe 290

Leu

Glu

Gly

His

Thr 295

Phe

Leu

Val

Arg

His 300

His

Arg

Gin

GCT

TCC

TTG

GAG

ATC

TCG

CCA

CTA

ACT

TTC

CTC

ACT

GCT

CAG

ACA

TTC

959

Ala

Ser 305

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro 310

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr 315

Ala

Gin

Thr

Phe

CTG

ATG

GAC

CTT

GGC

CAG

TTC

CTA

CTG

TTT

TGT

CAT

ATC

TCT

TCC

CAC

1007

Leu 320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin 325

Phe

Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

His 335

CAC

CAT

GGT

GGC

ATG

GAG

GCT

CAC

GTC

AGA

GTA

GAA

AGC

TGC

GCC

GAG

1055

His

Gly

Met 340

Glu

Ala

His

Val

Arg 345

Val

Glu

Ser

Cys

Ala 350

Glu

GAG

CCC

CAG

CTG

CGG

AGG

AAA

GCT

GAT

GAA

GAG

GAA

GAT

TAT

GAT

GAC

1103

Glu

Pro

Gin

Leu 355

Arg

Lys

Ala

Asp 360

Glu

Asp

Tyr 365

Asp

AAT

TTG

TAC

GAC

TCG

GAC

ATG

GAC

GTG

GTC

CGG

CTC

GAT

GGT

GAC

1151

Asn

Leu

Tyr 370

Asp

Ser

Asp

Met

Asp 375

Val

Arg

Leu

Asp 380

Gly

Asp

GTG

TCT

CCC

TTT

ATC

CAA

ATC

CGC

TCG

GTT

GCC

AAG

CAT

CCC

AAA

1199

Val

Ser 385

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile 390

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

ACC

TGG

GTG

CAC

TAC

ATC

TCT

GCA

GAG

GAC

TGG

GAC

TAC

GCC

1247

Thr 400

Trp

Val

His

Tyr

Ile 405

Ser

Ala

Glu

Glu 410

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

CCC

GCG

GTC

CCC

AGC

CCC

AGT

GAC

AGA

AGT

TAT

AAA

AGT

CTC

TAC

TTG

1295

Pro

Ala

Val

Pro

Ser 420

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr 430

Leu

AAC

AGT

GGT

CCT

CAG

CGA

ATT

GGT

AGG

AAA

TAC

AAA

GCT

CGA

TTC

1343

Asn

Ser

Gly

Pro 435

Gin

Arg

Ile

Gly

Arg 440

Lys

Tyr

Lys

Ala 445

Arg

Phe

GTC

GCT

TAC

ACG

GAT

GTA

ACA

TTT

AAG

ACT

CGT

AAA

GCT

ATT

CCG

TAT

1391

Val

Ala

Tyr 450

Thr

Asp

Val

Thr

Phe 455

Lys

Thr

Arg

Lys

Tkla 460

Ile

Pro

Tyr

• · • · • · • · • · · · ·

176

GAA TCA

GGA ATC

CTG Leu

GGA CCT

TTA CTT

TAT Tyr

GGA GAA GTT

GGA Gly

GAC Asp

ACA Thr

1439

Glu

Ser 465

Gly

Ile

Gly

Pro 470

Leu

Gly

Glu 475

Val

CTT

TTG

ATT

ATA

TTT

AAG

AAT

AAA

GCG

AGC

CGA

CCA

TAT

AAC

ATC

TAC

1487

Leu

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

480

485

490

495

CCT

CAT

GGA

ATC

ACT

GAT

GTC

AGC

GCT

TTG

CAC

CCA

GGG

AGA

CTT

CTA

1535

Pro

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

500

505

510

AAA

GGT

TGG

AAA

CAT

TTG

AAA

GAC

ATG

CCA

ATT

CTG

CCA

GGA

GAG

ACT

1583

Lys

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

515

520

525

TTC

AAG

TAT

AAA

TGG

ACA

GTG

ACT

GTG

GAA

GAT

GGG

CCA

ACC

AAG

TCC

1631

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

530

535

540

GAT

CCT

CGG

TGC

CTG

ACC

CGC

TAC

TCG

AGC

TCC

ATT

AAT

CTA

GAG

1679

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

545

550

555

AAA

GAT

CTG

GCT

TCG

GGA

CTC

ATT

GGC

CCT

CTC

ATC

TGC

TAC

AAA

1727

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

560

565

570

575

GAA

TCT

GTA

GAC

CAA

AGA

GGA

AAC

CAG

ATG

TCA

GAC

AAG

AGA

AAC

1775

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

580

585

590

GTC

ATC

CTG

TTT

TCT

GTA

TTC

GAT

GAG

AAT

CAA

AGC

TGG

TAC

CTC

GCA

1823

Val

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

595

600

605

GAG

AAT

ATT

CAG

CGC

TTC

CTC

CCC

AAT

CCG

GAT

GGA

TTA

CAG

CCC

CAG

1371

Glu

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

610

615

620

GAT

CCA

GAG

TTC

CAA

GCT

TCT

AAC

ATC

ATG

CAC

AGC

ATC

AAT

GGC

TAT

1919

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Tkla

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

625

630

635

GTT

TTT

GAT

AGC

TTG

CAG

CTG

TCG

GTT

TGT

TTG

CAC

GAG

GTG

GCA

TAC

1967

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

640

645

650

655

TGG

TAC

ATT

CTA

AGT

GTT

GGA

GCA

CAG

ACG

GAC

TTC

CTC

TCC

GTC

TTC

2015

Trp

Tyr

Ile

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

TTC TCT GGC TAC ACC TTC AAA CAC AAA ATG GTC TAT GAA GAC ACA CTC Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu

675 680 685

2063

177

ACC Thr

CTG TTC

ccc Pro

TTC Phe

TCA Ser

GGA GAA ACG

GTC Val

TTC ATG

TCA Ser 700

ATG Met

GAA Glu

AAC Asn

2111

Leu

Phe 690

Gly

Glu 695

Thr

Phe

Met

CCA

GGT

CTC

TGG

GTC

CTA

GGG

TGC

CAC

AAC

TCA

GAC

TTG

CGG

AAC

AGA

2159

Pro

Gly 705

Leu

Trp

Val

Leu

Gly 710

Cys

His

Asn

Ser

Asp 715

Leu

Arg

Asn

Arg

GGG

ATG

ACA

GCC

TTA

CTG

AAG

GTG

TAT

AGT

TGT

GAC

AGG

GAC

ATT

GGT

2207

Gly 720

Met

Thr

Ala

Leu

Leu 725

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys 730

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly 735

GAT

TAT

GAC

AAC

ACT

TAT

GAA

GAT

ATT

CCA

GGC

TTC

TTG

CTG

AGT

2255

Asp

Tyr

Asp

Asn 740

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile 745

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu 750

Ser

GGA

AAG

AAT

GTC

ATT

GAA

CCC

AGA

GAC

ATA

AGC

CTT

CCT

ACT

TTT

CAG

2303

Gly

Lys

Asn

Val 755

Ile

Glu

Pro

Arg

Asp 760

Ile

Ser

Leu

Pro

Thr 765

Phe

Gin

CCG

GAG

GAA

GAC

AAA

ATG

GAC

TAT

GAT

ATC

TTC

TCA

ACT

GAA

ACG'

2351

Pro

Glu

Glu 770

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr 775

Asp

Ile

Phe

Ser 780

Thr

Glu

Thr

AAG

GGA

GAA

GAT

TTT

GAC

ATT

TAC

GGT

GAG

GAT

GAA

AAT

CAG

GAC

CCT

2399

Lys

Gly 785

Glu

Asp

Phe

Asp

Ile 790

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu 795

Asn

Gin

Asp

Pro

CGC

AGC

TTT

CAG

AAG

AGA

ACC

CGA

CAC

TAT

TTC

ATT

GCT

GCG

GTG

GAG

2447

Arg 800

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg 805

Thr

Arg

His

Tyr

Phe 810

Ile

Ala

Val

Glu 815

CAG

CTC

TGG

GAT

TAC

GGG

ATG

AGC

GAA

TCC

CCC

CGG

GCG

CTA

AGA

AAC

2495

Gin

Leu

Trp

Asp

Tyr 820

Gly

Met

Ser

Glu

Ser 825

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg 830

Asn

AGG

GCT

CAG

AAC

GGA

GAG

GTG

CCT

CGG

TTC

AAG

GTG

GTC

TTC

CGG

2543

Arg

Ala

Gin

Asn 835

Gly

Glu

Val

Pro

Arg 840

Phe

Lys

Val

Val 845

Phe

Arg

GAA.

TTT

GCT

GAC

GGC

TCC

TTC

ACG

CAG

CCG

TCG

TAC

CGC

GGG

GAA

CTC

2591

Glu

Phe

Ala 850

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr 855

Gin

Pro

Ser

Tyr

Arg 860

Gly

Glu

Leu

AAC

AAA

CAC

TTG

GGG

CTC

TTG

GGA

CCC

TAC

ATC

AGA

GCG

GAA

GTT

GAA

2639

Asn

Lys 865

His

Leu

Gly

Leu

Leu 870

Gly

Pro

Tyr

Ile

Arg 875

Ala

Glu

Val

Glu

GAC

AAC

ATC

ATG-

GTA

ACT

TTC

AAA

AAC

CAG

GCG

TCT

CGT

CCC

TAT

TCC

2687

Asp 880

Asn

Ile

Met

Val

Thr 885

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala 890

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser 895

TTC

TAC

TCG

AGC

CTT

ATT

TCT

TAT

CCG

GAT

CAG

GAG

CAA

GGG

GCA

2735

Phe

Tyr

Ser

Leu 900

Ile

Ser

Tyr

Pro

Asp 905

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly 910

Ala

• · • · • · • · · · • · · • · · ·

178

GAA	CCT	CGA	CAC	AAC	TTC	GTC	CAG	CCA	AAT
Glu	Pro	Arg	His 915	Asn	Phe	Val	Gin	Pro 920	Asn
TGG	AAA	GTG	CAG	CAT	CAC	ATG	GCA	CCC	ACA
Trp	Lys	Val 930	Gin	His	His	Met	Ala 935	Pro	Thr
AAA	GCC	TGG	GCC	TAC	TTT	TCT	GAT	GTT	GAC
Lys	Ala 945	Trp	Ala	Tyr	Phe	Ser 950	Asp	Val	Asp
TCA	GGC	TTG	ATC	GGC	CCC	CTT	CTG	ATC	TGC
Ser 960	Gly	Leu	Ile	Gly	Pro 965	Leu	Leu	Ile	Cys
GCT	GCT	CAC	GGT	AGA	CAA	GTG	ACC	GTG	CAA
Ala	Ala	His	Gly	Arg 980	Gin	Val	Thr	Val	Gin 985
ACT	ATT	TTT	GAT	GAG	ACA	AAG	AGC	TGG	TAC
Thr	Ile	Phe	Asp 995	Glu	Thr	Lys	Ser	Trp Tyr 1000
AGG	AAC	TGC	CGG	GCC	CCC	TGC	CAC	CTG	CAG
Arg	Asn	Cys Arg 1010	Ala	Pro	Cys	His Leu 1015	Gin
AAA	GAA	AAC	TAT	CGC	TTC	CAT	GCA	ATC	AAT
Lys	Glu Asn 1025	Tyr	Arg	Phe	His Ala 1030	Ile	Asn
CTC	CCT	GGC	TTA	GTA	ATG	GCT	CAG	AAT	CAA
Leu Pro 1040	Gly	Leu	Val	Met Ala 1045	Gin	Asn	Gin
CTC	AGC	ATG	GGC	AGC	AAT	GAA	AAT	ATC	CAT
Leu	Ser	Met	Gly	Ser Asn 1060	Glu	Asn	Ile	His 1065
CAC	GTG	TTC	AGT	GTA	CGG	AAA	AAG	GAG	GAG
His	Val	Phe	Ser Val 1075	Arg	Lys	Lys	Glu Glu 1080
AAT	CTC	TAT	CCG	GGT	GTC	TTT	GAG	ACA	GTG
Asn	Leu	Tyr Pro 1090	Gly	Val	Phe	Glu Thr 1095	Val
GTT	GGA	ATT	TGG	CGA.	ATA	GAA	TGC	CTG	ATT
Val	Gly Ile 1105	Trp	Arg	Ile	Glu Cys 1110	Leu	Ile
GGG	ATG	AGC	ACG	ACT	TTC	CTG	GTG	TAC	AGC
Gly	Met	Ser	Thr	Thr	Phe	Leu	Val	Tyr	Ser

1120 1125

GAA Glu	ACC Thr	AGA Arg,	ACT Thr 925	TAC Tyr	TTT Phe	2783
GAA	GAC	GAG	TTT	GAC	TGC	2831
Glu	Asp	Glu 94 0	Phe	Asp	Cys
CTG	GAA	AAA	GAT	GTG	CAC	2879
Leu	Glu 955	Lys	Asp	Val	His
CGC	GCC	AAC	ACC	CTG	AAC	2927
Arg 970	Ala	Asn	Thr	Leu	Asn 975
GAA	TTT	GCT	CTG	TTT	TTC	2975
Glu	Phe	Ala	Leu	Phe 990	Phe
TTC	ACT	GAA	AAT	GTG	GAA	3023
Phe	Thr	Glu	Asn	Val	Glu

1005

ATG Met	GAG Glu	GAC Asp 102C	CCC Pro )	ACT Thr	CTG Leu	3071
GGC	TAT	GTG	ATG	GAT	ACA	3119
Gly	Tyr 1035	Val	Met	Asp	Thr
AGG	ATC	CGA	TGG	TAT	CTG	3167
Arg 105C	Ile )	Arg	Trp	Tyr	Leu 1055
TCG	ATT	CAT	TTT	AGC	GGA	3215
Ser	Ile	His	Phe	Ser	Gly

1070

TAT Tyr	AAA Lys	ATG Met	GCC Ala 1085	GTG Val	TAC Tyr	3263
GAA	ATG	CTA	CCG	TCC	AAA	3311
Glu	Met	Leu	Pro	Ser	Lys

1100

GGC	GAG	CAC	CTG	CAA	GCT	3359
Gly	Glu	His	Leu	Gin	Ala

1115

AAG GAG	TGT	CAG	GCT	CCA	3407
Lys Glu	Cys	Gin	Ala	Pro
1130				1135

• · • ·

	179	• · • ·	• · • ·	• · • ·	• · • · · «
CTG GGA ATG GCT TCT GGA CGC ATT	AGA GAT TTT CAG ATC	ACA	GCT	TCA	3455
Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg Ile	Arg Asp Phe Gin Ile	Thr	Ala	Ser
1140	1145		1150
GGA CAG TAT GGA CAG TGG GCC CCA	AAG CTG GCC AGA CTT	CAT	TAT	TCC	3503
Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro	Lys Leu Ala Arg Leu	His	Tyr	Ser
1155	1160	1165
GGA TCA ATC AAT GCC TGG AGC ACC	AAG GAT CCC CAC TCC	TGG	ATC	AAG	3551
Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr	Lys Asp Pro His Ser	Trp	Ile	Lys
1170 1175 1180
GTG GAT CTG TTG GCA CCA ATG ATC	ATT CAC GGC ATC ATG	ACC	CAG	GGT	3599
Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile	Ile His Gly Ile Met	Thr	Gin	Gly
1185 1190	1195
GCC CGT CAG AAG TTT TCC AGC CTC	TAC ATC TCC CAG TTT	ATC	ATC	ATG	3647
Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu	Tyr Ile Ser Gin Phe	Ile	Ile	Met
1200 1205	1210			1215
TAC AGT CTT GAC GGG AGG AAC TGG	CAG AGT TAC CGA GGG	AAT	TCC	ACG	3695
Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp	Gin Ser Tyr Arg Gly	Asn	Ser	Thr
1220	1225		1230
GGC ACC TTA ATG GTC TTC TTT GGC	AAT GTG GAC GCA TCT	GGG	ATT	AAA	3743
Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly	Asn Val Asp Ala Ser	G1 y	Ile	Lys
1235	1240	1245
CAC AAT ATT TTT AAC CCT CCG ATT	GTG GCT CGG TAC ATC	CGT	TTG	CAC	3791
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile	Val Ala Arg Tyr Ile	Arg	Leu	His
1250 1255 1260
CCA ACA CAT TAC AGC ATC CGC AGC	ACT CTT CGC ATG GAG	TTG	ATG	GGC	3839
Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser	Thr Leu Arg Met Glu	Leu	Met	Gly
1265 1270	1275
TGT GAT TTA AAC AGT TGC AGC ATG	CCC CTG GGA ATG CAG	AAT	AAA	GCG	3887
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met	Pro Leu Gly Met Gin	Asn	Lys	Ala
1280 1285	1290			1295
ATA TCA GAC TCA CAG ATC ACG GCC	TCC TCC CAC CTA AGC	AAT	ATA	TTT	3935
Ile Ser Asp Ser Gin Ile Thr Ala	Ser Ser His Leu Ser	Asn	Ile	Phe
1300	1305		1310
GCC ACC TGG TCT CCT TCA CAA GCC	CGA CTT CAC CTC CAG	GGG	CGG	ACG	3983
Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gin Ala	Arg Leu His Leu Gin	Gly	Arg	Thr
1315	1320	1325
AAT GCC TGG CGA CCC CGG GTG AGC	AGC GCA GAG GAG TGG	CTG	CAG	GTG	4031
Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser	Ser Ala Glu Glu Trp	Leu	Gin	Val
1330 1335 1340
GAC CTG CAG AAG ACG GTG AAG GTC	ACA GGC ATC ACC ACC	CAG	GGC	GTG	4079
Asp Leu Gin Lys Thr Val Lys Val	Thr Gly Ile Thr Thr	Gin	Gly	Val
1345 1350	1355

···« · · * · ♦ · · · ···· ···· ···· • ·· ··· ······ · · · ···· ·· · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ··

180

AAG Lys 1360

TCC Ser 1

CTG Leu

CTC Leu

AGC Ser

AGC ATG Ser Met 1365

TAT Tyr

GTG Val

AAG Lys

GAG Glu 137C

TTC Phe 1

CTC Leu

GTG Val

TCC Ser

AGT Ser 1375

4127

AGT

CAG

GAC

GGC

CGC

CGC TGG

ACC

CTG

TTT

CTT

CAG

GAC

GGC

CAC

ACG

4175

Ser

Gin

Asp

Gly

Arg

Arg Trp

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

His

Thr

1380

1385

1390

AAG

GTT

TTT

CAG

GGC

AAT CAG

GAC

TCC

ACC

CCC

GTG

AAC

GCT

4223

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn Gin

Asp

Ser

Thr

Pro

Val

Asn

Ala

1395

1400

1405

CTG

GAC

CCC

CCG

CTG

TTC ACG

CGC

TAC

CTG

AGG

ATC

CAC

CCC

ACG

AGC

4271

Leu

Asp

Pro

Leu

Phe Thr

Arg

Tyr

Leu

Arg

Ile

His

Pro

Thr

Ser

1410

1415

1420

TGG

GCG

CAG

CAC

ATC

GCC CTG

AGG

CTC

GAG

GTT

CTA

GGA

TGT

GAG

GCA

4319

Trp

Al a

Gin

His

Ile

Ala Leu

Arg

Leu

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

1425

1430

1435

CAG

GAT

CTC

TAC

TGA

4334

Gin

Asp

Leu

Tyr

★

1440

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 1444 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

Met Gin Leu Glu Leu Ser Thr Cys 1 5

Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr 20

Trp Asp Tyr Arg Gin Ser Glu Leu 35 40

Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly 50 55

Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val 65 70

Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp 85

Gin Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val 100

Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 10 15

Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 25 30Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr 45

Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val 60

Glu Phe Thr Asp Gin Leu Phe Ser 75 80

Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile 90 95

Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala 105 110 ···· · · · · ···· ···· ···· ···· • · « · · · · · · · · · · · · • · · · ·· · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ··

181

Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser 115 120 125

Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu 130 135 140

Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gin Thr Tyr Val Trp Gin Val

145 150 155 160

Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190

Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205

Thr Gin Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val'Phe Asp Glu 210 215 220

Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met

225 230 * 235 240

A.sp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gin Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly

245 250 255

Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser 260 265 270

Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser 275 280 285

Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gin Ala 290 295 300

Ser Leu Glu Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Phe Leu

305 310 315 320

Met Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His

325 330 335

His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu 340 345 350

Pro Gin Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn 355 360 365

Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val 370 375 380

Ser Pro Phe Ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415

182

Ala Val Pro Ser Pro 420

Ser Gly Pro Gin Arg 435

Ala Tyr Thr Asp Val 450

Ser Gly Ile Leu Gly 4 65

Leu Ile Ile Phe Lys 485

His Gly Ile Thr Asp 500

Gly Trp Lys His Leu 515

Lys Tyr Lys Trp Thr 530

Pro Arg Cys Leu Thr 545

Asp Leu Ala Ser Gly 565

Ser Val Asp Gin Arg 580

Ile Leu Phe Ser Val 595

Asn Ile Gin Arg Phe 610

Pro Glu Phe Gin Ala 625

Phe Asp Ser Leu Gin 645

Tyr Ile Leu Ser Val 660

Ser Gly Tyr Thr Phe 675

Leu Phe Pro Phe Ser 690

Gly Leu Trp Val Leu 705

Ser Asp Arg Ser Tyr 425

Ile Gly Arg Lys Tyr 440

Thr Phe Lys Thr Arg 455

Pro Leu Leu Tyr Gly 470

Asn Lys Ala Ser Arg 490

Val Ser Ala Leu His 505

Lys Asp Met Pro Ile 520

Val Thr Val Glu Asp 535

Arg Tyr Tyr Ser Ser 550

Leu Ile Gly Pro Leu 570

Gly Asn Gin Met Met 585

Phe Asp Glu Asn Gin 600

Leu Pro Asn Pro Asp 615

Ser Asn Ile Met His 630

Leu Ser Val Cys Leu 650

Gly Ala Gin Thr Asp 665

Lys His Lys Met Val 680

Gly Glu Thr Val Phe 695

Gly Cys His Asn Ser 710

Lys Ser Leu Tyr Leu Asn

430

Lys Lys Ala Arg Phe Val 445

Lys Ala Ile Pro Tyr Glu 460

Glu Val Gly Asp Thr Leu 475 480

Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 495

Pro Gly Arg Leu Leu Lys 510

Leu Pro Gly Glu Thr Phe 525

Gly Pro Thr Lys Ser Asp 540

Ser Ile Asn Leu Glu Lys 555 560

Leu Ile Cys Tyr Lys 'Glu 575

Ser Asp Lys Arg Asn Val 590

Ser Trp Tyr Leu Ala Glu 605

Gly Leu Gin Pro Gin Asp 620

Ser Ile Asn Gly Tyr Val 635 640

His Glu Val Ala Tyr Trp 655

Phe Leu Ser Val Phe Phe 670

Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 685

Met Ser Met Glu Asn Pro 700

Asp Leu Arg Asn Arg Gly 715 720 • · · · • · • · · · · · · · · · · ··· · ·· · · ·· · a · ··· · ····· · · · ··· ·· · ···· ·· · · ·· ·· · ·

183

Met

Thr Ala

Leu

Leu 725

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys 730

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly 735

Asp

Tyr

Tyr Asp

Asn 740

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile 745

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu 750

Ser

Gly

Lys

Asn Val 755

Ile

Glu

Pro

Arg

Asp 760

Ile

Ser

Leu

Pro

Thr 765

Phe

Gin

Pro

Glu

Glu Asp 770

Lys

Met

Asp

Tyr 775

Asp

Ile

Phe

Ser 780

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly 785

Glu Asp

Phe

Asp

Ile 790

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu 795

Asn

Gin

Asp

Pro

Arg 800

Ser

Phe Gin

Lys

Arg 805

Thr

Arg

His

Tyr

Phe 810

Ile

Ala

Val

Glu 815

Gin

Leu

Trp Asp

Tyr 820

Gly

Met

Ser

Glu

Ser 825

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg 830

Asn

Arg

Ala

Gin Asn 835

Gly

Glu

Val

Pro

Arg 840

Phe

Lys

Val

Val 845

Phe

Arg

Glu

Phe

Ala Asp 850

Gly

Ser

Phe

Thr 855

Gin

Pro

Ser

Tyr

Arg 860

Gly

Glu

Leu

Asn

Lys 865

His Leu

Cl ΤΓ

Leu

Leu 870

Gly

Pro

Tyr

Ile

Arg 875

Ala

Glu

Val

Glu

Asp 880

Asn

Ile Met

Val

Thr 885

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala 890

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser 895

Phe

Tyr

Ser Ser

Leu 900

Ile

Ser

Tyr

Pro

Asp 905

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly 910

Ala

Glu

Pro

Arg His 915

Asn

Phe

Val

Gin

Pro 920

Asn

Glu

Thr

Arg

Thr 925

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val Gin 930

His

Met

Ala 935

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu 940

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala 945

Trp Ala

Tyr

Phe

Ser 950

Asp

Val

Asp

Leu

Glu 955

Lys

Asp

Val

His

Ser 960

Gly

Leu Ile

Gly

Pro 965

Leu

Ile

Cys

Arg 970

Ala

Asn

Thr

Leu

Asn 975

Ala

His Gly

Arg 980

Gin

Val

Thr

Val

Gin 985

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe 990

Phe

Thr

Ile

Phe Asp 995

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp Tyr 1000

Phe

Thr

Glu

Asn Val 1005

Glu

Arg

Asn

Cys Arg 1010

Ala

Pro

Cys

His Leu 1015

Gin

Met

Glu

Asp Pro 1020

Thr

Leu

Lys

• · · · · · · · · • ·· · · · · ····· ···· · · · · • · ·· ·· · ·

184

Glu 1025

Asn

Tyr

Arg

Phe

His Ala 1030

Ile

Asn

Gly

Tyr Val 1035

Met

Asp

Thr

Leu 1040

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala Gin

Asn

Gin

Arg

Ile Arg

Trp

Tyr

Leu

1045

1050

1055

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu Asn

Ile

His

Ser

Ile His

Phe

Ser

Gly

His

1060

1065

1070

Val

Phe

Ser

Val

Arg

Lys Lys

Glu

Tyr

Lys Met

Ala

Val

Tyr

Asn

1075

1080

1085

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe Glu

Thr

Val

Glu

Met Leu

Pro

Ser

Lys

Val

1090

1095

1100

Gly

Ile

Trp

Arg

Ile

Glu Cys

Leu

Ile

Gly

Glu His

Leu

Gin

Ala

Gly

1105

1110

1115

1120

Met

Ser

Thr

Phe

Leu Val

Tyr

Ser

Lys

Glu Cys

Gin

Ala

Pro

Leu

1125

1130

1135

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

Arg Ile

Arg

Asp

Phe

Gin Ile

Thr

Ala

Ser

GL y

1140

1145

1150

Gin

Tyr

Gly

Gin

Trp

Ala Pro

Lys

Leu

Ala

Arg Leu

His

Tyr

Ser

Gly

1155

1160

1165

Ser

Ile

Asn

Ala

Trp

Ser Thr

Lys

Asp

Pro

His Ser

Trp

Ile

Lys

Val

1170

1175

1180

Asp

Leu

Ala

Pro

Met Ile

Ile

His

Gly

Ile Met

Thr

Gin

Gly

Ala

1185

1190

1195

1200

Arg

Gin

Lys

Ptis

Ser

Ser Leu

Tyr

Ile

Ser

Gin Phe

Ile

Met

Tyr

1205

1210

1215

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Asn Trp

Gin

Ser

Tyr

Arg Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

1220

1225

1230

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Phe Gly

Asn

Val

Asp

Ala Ser

Gly

Ile

Lys

His

1235

1240

1245

Asn

Ile

Phe

Asn

Pro

Pro Ile

Val

Ala

Arg

Tyr Ile

Arg

Leu

His

Pro

1250

1255

1260

Thr

His

Tyr

Ser

Ile

Arg Ser

Thr

Leu

Arg

Met Glu

Leu

Met

Gly

Cys

1265

1270

1275

1280

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser Met

Pro

Leu

Gly

Met Gin

Asn

Lys

Ala

Ile

1285

1290

1295

Ser

Asp

Ser

Gin

Ile

Thr Ala

Ser

His

Leu Ser

Asn

Ile

Phe

Ala

1300 1305 1310

Thr Trp Ser Pro Ser Gin Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Thr Asn 1315 1320 1325 • · • ·· · · · · · · ·· · · ·· · • · ····· · · · • · · · · · · • · ·· · · · ·

185

Ala

Trp Arg 1330

Pro

Arg Val

Ser 1335

Ser

Ala

Glu

Trp 1340

Leu

Gin

Val

Asp

Leu

Gin Lys

Thr

Val Lys

Val

Thr

Gly

Ile

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

1345

1350

1355

1360

Ser

Leu Leu

Ser

Ser Met

Tyr

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

1365

1370

1375

Gin

Asp Gly

Arg

Arg Trp

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

His

Thr

Lys

1380

1385

1390

Val

Phe Gin

Gly

Asn Gin

Asp

Ser

Thr

Pro

Val

Asn

Ala

Leu

1395

1400

1405

Asp

Pro Pro

Leu

Phe Thr

Arg

Tyr

Leu

Arg

Ile

His

Pro

Thr

Ser

Trp

1410

1415

1420

Ala

Gin His

Ile

Ala Leu

Arg

Leu

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

1425

1430

1435

1440

Asp

Leu Tyr

★

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE :

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: není relevantní

(ii)	TYP MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: ano
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: Homo	sapiens
(ix)	ZNAKY: (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: (B) POZICE: 1..19	Peptid

(D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka= Signální peptid lidského faktoru VIII.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 15 10 15

Cys Phe Ser

186

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci prasečího faktoru VIII uvedenou jako sekvence id. č. 37.
2. DNA podle nároku 1, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 36.
3. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu Al prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 20 až 391 v sekvenci id. č. 37.

DNA podie naroKU 3, Která uvedenou jako sekvence id.

obsanuje huKlectidovou sekvenci č. 36 od pozice 58 do 1173.
5. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu A3 prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 1491 až 1820 v sekvenci id. č. 37.
6. DNA podle nároku 5, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 36 od pozice 4471 do 5460.
7. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu Cl prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 1821 až 1973 v sekvenci id.

č. 37.

• · • ·

187
8. DNA podle nároku 7, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 36 od pozice 5461 do 5919.
9. Izolovaná a purifikovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující doménu C2 prasečího faktoru VIII uvedenou jako aminokyseliny 1974 až 2133 v sekvenci id. č. 37.
10.DNA podle nároku 9, která uvedenou jako sekvence id.

obsahuje nukleotidovou sekvenci č. 36 od pozice 5920 do 6399.
11.DNA podle nároku 1, kde aminokyselinovou sekvenci nukleotidové sekvence kóduje uvedenou jako sekvence id.

č. 39.

DNA podle nároku 11, která uvedenou jako sekvence id.

obsahuje nukleotidovou sekvenci č. 38 .
13.DNA kódující hybridní lidský/prasečí faktor VIII obsahující substituce kódující sekvencí prasečího faktoru VIII, kde nukleotidová sekvence lidského faktoru VIII kódující aminokyseliny číslo 2181 až 2243 je nahrazena nukleotidovou sekvencí kódující aminokyseliny č. 1982 až 2004 v sekvenci id. č. 37.
14.DNA podle nároku 13, kde kódující DNA prasečího faktoru VIII je sekvence nukleotidů 5944 až 6132 v sekvenci id. č. 36.
15.DNA kódující prasečí faktor VIII obsahující kodony kódující aminokyseliny 20 až 2133 v sekvenci id. č. 37.

188
16. DNA podle nároku 15, která má nukleotidovou sekvenci nukleotidů 58 až 6399 sekvence id. č. 36.
17. DNA kódující prasečí faktor VIII bez domény B, která obsahuje kodony kódující aminokyseliny 20 až 1443 v sekvenci id. č. 39.
18. DNA podle nároku 17, která má nukleotidovou sekvenci

nukleotidů 60 až 4331 sekvence id’. č. 38 . 19.Izolovaný a purifikovaný protein, který je produktem exprese DNA podle nároku 17. 20.Izolovaný a purifikovaný protein, který je produktem

exprese DNA podle nároku 18.
21. Modifikovaný lidský faktor VIII, který obsahuje substituce aminokyselin v jedné nebo několika pozicích 2181 až 2243 podle sekvence id. č. 2, kde tyto substituce jsou vložením aminokyseliny redukující imunoreaktivitu na místo přirozeně se vyskytující aminokyseliny, přičemž modifikovaný faktor VIII má prokoagulační aktivitu.
22. Modifikovaný faktor VIII podle nároku 21, kde substituce jsou provedeny v jedné nebo více pozicích 2181, 2182,

2195, 2196, 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224, 2225, 2226, 2227, 2228, 2234, 2238 a 2243 podle sekvence id.

č. 2 .
23. Modifikovaný faktor VIII podle nároku 21, kde substituce jsou provedeny v jedné nebo více pozicích 2181, 2195,

189

2196, 2207, 2226, 2227, 2228 a 2234 podle sekvence id.

Č. 2 .
24.Způsob modifikace faktoru VIII, takže jeho reaktivita s inhibičními protilátkami je nižší a přitom prokoagulační aktivita je zachována, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje krok, kdy se nahradí přirozeně se vyskytující aminokyselina alespoň v jedné pozici č. 2181 až 2243 podle sekvence id. č. 2 aminokyselinou snižující imunoreaktivitu.
25.Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že substituce aminokyseliny v pozici č. 2181 až 2243 podle sekvence id. č. 2 je provedena pomocí exprese DNA kódující modifikovaný faktor VIII, přičemž tato DNA má alespoň jeden koaon moaifikovany tax, ze .v úseku aminokyselin č. 2181 až 2243 kóduje substituovanou aminokyselinu.
26. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že aminokyselina snižující imunoreaktivitu je slanin, methionin, leucin, serin nebo glycin.
27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že aminokyselina snižující imunoreaktivitu je alanin.

2182, 2195, 2196,

2225, 2226, 2227,
28.Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že substituce aminokyselinou snižující imunoreaktivitu je provedena alespoň v jedné pozici 2181,

2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224,

2228, 2234, 2238 a 2243 podle sekvence id. č. 2 « ·* ·· ·· ·· ··· · ···· ···· • ··· « ·· · · ·· · • · · ·*· · · · · · 9 · · · ···· ·· · · · · ·

190
29. Způsob přípravy prasečího faktoru VIII vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy je exprimována DNA kódující aminokyselinovou sekvenci id. č. 37 obsahující alespoň aminokyseliny 20 až 2133 ve vhodné savčí hostitelské buňce v kultivačním médiu a protein faktoru VIII se purifikuje z hostitelských buněk nebo z kultivačního média.
30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci v podstatě jako sekvence id. č. 36 obsahující přinejmenším nukleotidy 58 až 6399.
31. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že DNA kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 37.
32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 36.
33. Způsob přípravy prasečího faktoru VIII bez domény B vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy je exprimována DNA kódující aminokyselinovou sekvenci id. č. 36 obsahující alespoň aminokyseliny 20 až 1443 ve vhodné savčí hostitelské buňce v kultivačním médiu a protein faktoru VIII se purifikuje z hostitelských buněk nebo z kultivačního média.
34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci v podstatě jako sekvence id. č. 38 obsahující přinejmenším nukleotidy 60 až 4331.

• « • · r · · ·· · · · · · • ··· · · · · · * · · • · · · · · · ····· ·· · • · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · ·

191
35. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že DNA kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 39.
36. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že DNA má nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 38 od nukleotidu č. 3 do nukleotidu