ES2319745T3 - Secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos que codifican polipeptidos de factor viii de alto nivel de expresion, y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 19, en el que dicho polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión.

Description

Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que codifican polipéptidos de factor VIII de alto nivel de expresión, y métodos de uso.

Investigación o desarrollo patrocinado federalmente

Este trabajo estaba financiado por la subvención RO1 HL40921 del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH).

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular recombinante, particularmente a un polipéptido de factor VIII modificado y a métodos de uso.

Antecedentes de la invención

El factor VIII es una glicoproteína grande (\sim300 kDa) que funciona como un componente integral de la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea. Contiene una serie de dominios denominados A1-A2-B-ap-A3-C1-C2. El dominio B del factor VIII no tiene función conocida y puede delecionarse sin pérdida de actividad de coagulación. Las mutaciones en el gen del factor VIII que dan como resultado una proteína factor VIII reducida o defectuosa dan origen a la enfermedad genética hemofilia A, que se caracteriza por episodios de sangrado recurrentes. El tratamiento de la hemofilia A requiere la infusión intravenosa de factor VIII recombinante o derivado de plasma.

Desde la introducción de factor VIII recombinante para el tratamiento de la hemofilia A, el suministro ha tenido problemas para atender la demanda debido a que el factor VIII se expresa y se recupera a bajos niveles en los sistemas de cultivo de células de mamífero heterólogos usados para la fabricación comercial (Garber et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1133). Además, los niveles de factor VIII durante los ensayos clínicos de terapia génica de la hemofilia A indican que los niveles de expresión serán una característica limitante (Roth, et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344: 1735-1742). La importancia de este problema ha dado como resultado esfuerzos de investigación significativos para superar la baja barrera de expresión del factor VIII. Se han identificado varios factores que limitan la expresión. incluyendo bajos niveles de ARNm (Lynch et al. (1993) Hum. Gene Ther. 4: 259-272; Hoeben et al. (1995) Blood 85: 2447-2454; Koeberl et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6: 469-479), interacción con chaperonas de proteínas y secreción ineficaz (Pipe et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 8537-8544; Tagliavacca et al. (2000) Biochemistry 39: 1973-1981; Kaufman et al. (1997) Blood Coagul Fibrinolysis 8 Supl. 2: S3-14) y rápida degradación en ausencia del factor de von Willebrand (Kaufman et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6352-6362 y Kaufman et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9: 1233-1242). Se ha demostrado que la deleción del dominio B aumenta la producción de proteína factor VIII en sistemas heterólogos (Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 5939-2942). Una forma con dominio B delecionado del factor VIII humano (Lind et al. (1995) Euro. J. Biochem. 232: 19-27) se ha autorizado para uso clínico.

El documento WO 00/71141 describe aminoácidos específicos del factor VIII humano que reaccionan con anticuerpos inhibidores de pacientes con hemofilia y un factor VIII modificado en el que estos aminoácidos se sustituyen en el dominio A2. El documento WO 01/68109 describe formas sin dominio B del factor VIII porcino.

A pesar de los nuevos conocimientos en la regulación del factor VIII, la expresión continúa siendo significativamente inferior que la de otras proteínas recombinantes en los sistemas heterólogos usados en la fabricación comercial (Kaufman et al. (1997) Blood Coagul. Fibrinolysis 8 Supl. 2: S3-14), así como en aplicaciones de terapia génica ex vivo (Roth, et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344: 1735-1742) e in vivo (Chuah et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6: 1363-1377). Son necesarios métodos y composiciones para una expresión aumentada del factor VIII.

Sumario de la invención

Se proporcionan métodos y composiciones que permiten un alto nivel de expresión de un polipéptido de factor VIII. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos y composiciones que comprenden secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que comprenden un factor VIII modificado, que dan como resultado un alto nivel de expresión del polipéptido. Los métodos y composiciones de la invención encuentran utilidad en el tratamiento de la deficiencia de factor VIII, incluyendo, por ejemplo, la hemofilia A.

En particular, una realización de la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en la que dicho polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión.

En otra realización de la invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 18; una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y que tiene al menos una identidad de secuencia del 95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que se caracteriza por un alto nivel de expresión. Se proporcionan adicionalmente casetes de expresión, vectores y células que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de la invención.

Se proporcionan métodos in vitro para la producción de un polipéptido. En una realización, el método in vitro comprende introducir en una célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 18; una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en la que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido caracterizado por un alto nivel de expresión; y cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos.

También se proporcionan métodos in vitro para aumentar el nivel de expresión del polipéptido de factor VIII. En una realización, el método in vitro comprende introducir en una célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 19; una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 97%, 98% ó 99% con la SEC ID Nº: 19, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido caracterizado por un alto nivel de expresión, y cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos.

También se proporciona el uso de un polipéptido o ácido nucleico de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una deficiencia de factor VIII en un sujeto.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1H tomadas en conjunto proporcionan una comparación de secuencias de aminoácidos alineadas de las secuencias polipeptídicas del factor VIII humano (SEC ID Nº: 6), porcino (SEC ID Nº: 2) y de ratón (SEC ID Nº: 8).

La Figura 2 proporciona un esquema de las construcciones de factor VIII humano, porcino e híbrido humano/porcino con el dominio B delecionado. La línea continua entre los dominios A2 y ap representa secuencias enlazadoras.

La Figura 3 proporciona datos gráficos que muestran la expresión heteróloga de una proteína factor VIII porcina con dominio B delecionado recombinante, denominada P/OL, una proteína factor VIII humano con dominio B delecionado recombinante y cinco proteínas factor VIII híbrido humano/porcino con dominio B delecionado recombinantes, denominadas HP1, HP30, HP44, HP46 y HP47. Se transfectaron células COS-7 (barras oscuras) y células obtenidas de riñón de cría de hámster, denominadas células BMK-M (barras sombreadas), con las construcciones de expresión de factor VIII individuales y ADN plasmídico de luciferasa y se cultivaron en medios sin suero durante 24 h. Los datos ilustran que se produce un aumento significativo en la expresión de P/OL, HP44, HP47 y HP46 en comparación con HSQ. Por el contrario, la expresión de HP1 y HP30 no se aumentó en comparación con HSQ.

La Figura 4 proporciona la secuencia de aminoácidos para el polipéptido de factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP44/OL (SEC ID Nº: 15).

Las Figuras 5A-5D proporcionan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 14) que codifica el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP44/OL.

La Figura 6 proporciona la secuencia de aminoácidos para el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP46/SQ (SEC ID Nº: 17).

Las Figuras 7A-7B proporcionan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº:16) que codifica el polipéptido factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP46/SQ.

La Figura 8 proporciona la secuencia de aminoácidos para el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP47/SQ (SEC ID Nº: 19).

Las Figuras 9A-9B proporcionan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 18) que codifica el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP47/SQ.

Las Figuras 10A-10B proporcionan la secuencia de aminoácidos para el polipéptido con dominio B delecionado del factor VIII humano (SEC ID Nº: 13).

Las Figuras 11A-11B proporcionan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 12) que codifica el polipéptido con dominio B delecionado del factor VIII humano.

La Figura 12 proporciona una representación esquemática de una posible variante del factor VIII_{SEP} de la presente invención. La variante, denominada HP63/OL, contiene el dominio A1 porcino y un dominio ap-A3 parcialmente humanizado que comprende los aminoácidos porcinos de aproximadamente 1690 a aproximadamente 1804 y de aproximadamente 1819 a aproximadamente 2019.

La Figura 13 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 21) que codifica el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP63/OL.

Las Figuras 14A-14B proporcionan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 20) que codifica el polipéptido del factor VIII_{SEP} denominado en este documento HP63/OL.

Descripción detallada de la invención Visión de conjunto

La presente invención proporciona métodos y composiciones que permiten un alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII. El polipéptido de factor VIII contiene dominios de proteínas de homología definida que tienen la siguiente nomenclatura: A1-A2-B-ap-A3-C1-C2. La presente invención ha identificado regiones dentro de los dominios de un polipéptido de factor VIII no humano que promueven un alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII. Más particularmente, se han identificado regiones del polipéptido de factor VIII porcino que comprenden las regiones A1 y ap-A3 y variantes y fragmentos de las mismas que confieren un alto nivel de expresión tanto al polipéptido de factor VIII porcino como humano. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos y composiciones que usan las secuencias del polipéptido de factor VIII no humano que confieren un alto nivel de expresión y variantes activas o fragmentos de estas secuencias para construir secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos que codifiquen un polipéptido de factor VIII modificado que dé como resultado un alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII codificado. Los polipéptidos de factor VIII modificados de la invención caracterizados por un alto nivel de expresión se denominan en este documento "factor VIII_{SEP}" (superexpresión).

Por "alto nivel de expresión" se pretende la producción de un polipéptido a niveles aumentados cuando se comparan con los niveles de expresión del polipéptido de factor VIII humano correspondiente expresado en las mismas condiciones. Un aumento en los niveles de polipéptido (es decir, un alto nivel de expresión) comprende al menos aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 veces o más expresión del polipéptido de factor VIII_{SEP} en comparación con los niveles de expresión del polipéptido de factor VIII humano correspondiente. Como alternativa, un "alto nivel de expresión" puede comprender un aumento en los niveles de expresión de polipéptido de al menos 1-25 veces, 1-5 veces, 5-10 veces, 10-15 veces, 15-20 veces, 20-25 veces o mayores niveles de expresión del factor VIII_{SEP} cuando se comparan con el polipéptido de factor VIII humano correspondiente. Los métodos para ensayar un "alto nivel de expresión" son rutinarios en la técnica y se describen en más detalle a continuación.

Por polipéptido de factor VIII "correspondiente" se pretende un polipéptido de factor VIII que comprende una secuencia de aminoácidos equivalente. Por ejemplo, cuando se ensaya un polipéptido de factor VIII modificado que comprende los dominios A1-A2-ap-A3-C1-C2 para un alto nivel de expresión, se usará un polipéptido de factor VIII humano o porcino que contenga los dominios correspondientes (es decir, A1-A2-ap-A3-C1-C2). Cuando se ensaya un fragmento de un polipéptido de factor VIII modificado para un alto nivel de expresión (es decir, A1-A2-ap-A3), se ensayará un polipéptido de factor VIII humano o porcino que tenga los dominios correspondientes (es decir, A1-A2-ap-A3).

Composiciones

Las composiciones de la invención incluyen las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican polipéptidos de factor VIII caracterizados por un alto nivel de expresión. Como se describe en más detalle a continuación, el dominio A1 del factor VIII porcino (restos aminoacídicos 20-391 de la SEC ID Nº: 19) y el dominio ap-A3 del factor VIII porcino (aminoácidos 1450-1820 de la SEC ID Nº: 19) permiten un alto nivel de expresión del factor VIII. Se describen en este documento métodos y composiciones que comprenden polipéptidos de factor VIII_{SEP} y variantes activa y fragmentos activos de polipéptidos de factor VIII_{SEP} caracterizados por un alto nivel de expresión.

En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos, que tienen una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 19, en las que dicho polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEC ID Nº: 18. Se describen adicionalmente polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico como se expone en la SEC ID Nº: 19.

La tabla 1 proporciona un resumen de la estructura de las secuencias que se proporcionan en las SEC ID Nº: 14-19, donde el subíndice "P" designa un dominio del factor VIII porcino y el subíndice "H" designa un dominio del factor VIII humano.

TABLA 1 Resumen de la estructura de secuencia

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La invención incluye composiciones de ácido nucleico o proteína aisladas o sustancialmente purificadas. Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o una porción biológicamente activa de las mismas, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente secuencias codificantes de proteínas) que flanquean de forma natural al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se obtiene el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural a la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se obtiene el ácido nucleico. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, preferiblemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de los precursores químicos o químicos que no sean proteína de interés.

También se describen fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos de factor VIII_{SEP} descritas y proteínas codificadas por las mismas. Por "fragmento" se pretende una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, una proteína codificada por la misma. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos proteicos que conserven la actividad biológica de los polipéptidos expuestos en la SEC ID Nº: 19 y, por lo tanto, se caracterizan por un alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII. Por lo tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos aproximadamente 10, de aproximadamente 20 nucleótidos, de aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 1000 nucleótidos, de aproximadamente 2000 nucleótidos, de aproximadamente 3000 nucleótidos, de aproximadamente 4000 nucleótidos, de aproximadamente 5000 nucleótidos, de aproximadamente 6000 nucleótidos, de aproximadamente 7000 nucleótidos, de aproximadamente 8000 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica el polipéptido de factor VIII de la invención de aproximadamente 9000 nucleótidos.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos descrita en este documento que codifique una porción biológicamente activa de una proteína factor VIII_{SEP} que codificará al menos 12, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína factor VIII de longitud completa de la invención (por ejemplo, 1467 aminoácidos para la SEC ID Nº: 19) y permitirá un alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII.

Por "variante" se pretenden secuencias sustancialmente similares. Para secuencias de nucleótidos, las variantes conservativas incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la invención. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente tales como las generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida, pero que todavía codificarán una proteína factor VIII_{SEP} caracterizada por un alto nivel de expresión. Las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97% y, más preferiblemente, de aproximadamente el 98%, 99% o más con esa secuencia de nucleótidos particular, como se determina mediante programas de alineamiento de secuencias que se describen en otra parte en este documento.

Por proteína "variante" se pretende una proteína derivada del polipéptido de la SEC ID Nº: 19 por deleción (denominada truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína. Las proteínas variantes son biológicamente activas, es decir continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la SEC ID Nº: 19, por lo tanto, continuarán permitiendo el alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de un polipéptido tendrán una identidad secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 19, como se determina mediante programas de alineamiento de secuencias que se describen en otra parte en este documento usando parámetros por defecto. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de esa proteína en tan pocos como 1-100, 1-50, 1-25, 1-15 restos aminoacídicos, tan pocos como 1-10, tales como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2 o incluso 1 resto aminoacídico.

La actividad biológica de los polipéptidos de factor VII_{SEP} puede ensayarse por cualquier método conocido en la técnica. Como se ha analizado anteriormente, los polipéptidos de factor VIII_{SEP} de la invención se caracterizan por un alto nivel de expresión. Se conocen en la técnica ensayos para medir un alto nivel de expresión. Por ejemplo, el nivel de expresión del polipéptido de factor VIII_{SEP} puede medirse por análisis de transferencia de Western o ELISA. Otros métodos incluyen, por ejemplo, marcaje de líneas celulares que expresen el polipéptido de factor VIII con ^{35}S-metionina, seguido de inmunoprecipitación de moléculas de factor VIII radiomarcadas. Como alternativa, el nivel de expresión del polipéptido de factor VIII_{SEP} puede ensayarse por medición de la actividad del polipéptido de factor VIII. Por ejemplo, podría ensayarse una expresión de factor VIII aumentada por medición de la actividad del factor VIII usando ensayos convencionales conocidos en la técnica, incluyendo un ensayo de coagulación de una fase o un ensayo de actividad de dos fases. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.458.561 y la sección Experimental a continuación.

En resumen, los ensayos de coagulación se basan en la capacidad del factor VIII de acortar el tiempo de coagulación de plasma obtenido de un paciente con hemofilia A. Por ejemplo, en el ensayo de una fase, se incuban 0,1 ml de plasma con hemofilia A (George King Biomedical, Inc.) con 0,1 ml de reactivo de tromboplatina parcial activada (APTT) (Organon Teknika) y 0,01 ml de muestra o patrón, que consiste en plasma humano normal tratado con citrato y diluido durante 5 min a 37ºC en un baño de agua. La incubación se sigue de la adición de 0,1 ml de CaCl_{2} 20 mM y el tiempo para el desarrollo de un coágulo de fibrina se determina por inspección visual. Una unidad de factor VIII se define como la cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal tratado con citrato.

El ensayo de una fase depende de la activación endógena del factor VIII por activadores formados en el plasma con hemofilia A, mientras que el ensayo de dos fases mide la actividad procoagulante de factor VIII preactivado. En el ensayo de dos fases, se añaden muestras que contienen factor VIII que se hacen reaccionar con trombina a una mezcla de tromboplastina parcial activada y plasma humano con hemofilia A, que se preincuba durante 5 min a 37ºC. Los tiempos de coagulación resultantes se convierten en unidades/ml en base a la misma curva patrón humana descrita anteriormente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.376.463.

Los polipéptidos de factor VIII_{SEP} de la invención pueden alterarse de diversas formas incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Se conocen en general en la técnica métodos para dichas manipulaciones. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos de las proteínas factor VIII_{SEP} por mutaciones en el ADN. Se conocen bien en la técnica métodos para mutagénesis y modificaciones de la secuencia de nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; Patente de Estados Unidos Nº 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en los mismos. Pueden encontrarse orientaciones en lo que respecta a sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afecten a la actividad biológica (es decir, alto nivel de expresión) del factor VIII_{SEP} en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.), incorporado en este documento como referencia. Pueden preferirse sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares. Como alternativa, se conocen en la técnica métodos para minimizar el número de aminoácidos porcinos en los dominios A_{1} y ap-A_{3} del factor VIII_{SEP} y aún continuar conservando el alto nivel de expresión del factor VIII_{SEP} e incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida establecida tal como mediante corte y empalme por extensión de solapamiento, como se describe en otra parte en este documento. Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica la variante no deben situar la secuencia fuera de la fase de lectura y, preferiblemente, no generarán regiones complementarias que producirían una estructura de ARNm secundaria. Véase, la Publicación de Solicitud de Patente EP Nº 75.444.

Cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de realizarla, un especialista en la técnica apreciará que el efecto se evaluará mediante ensayos de exploración de rutina. Es decir, la actividad puede evaluarse por un alto nivel de expresión del polipéptido de factor VIII, como se analiza en detalle en otra parte en este documento.

Por "identidad de secuencia" se entiende que los mismos nucleótidos o restos aminoacídicos se encuentran dentro de la secuencia variante y una secuencia de referencia cuando un segmento contiguo especificado de la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de la variante se alinea y se compara con la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de la secuencia de referencia. Se conocen bien en la técnica métodos para el alineamiento de secuencias y para determinar la identidad entre secuencias. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York); y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) in Atlas of Polypeptide Sequence and Structure 5: Supl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Con respecto al alineamiento óptimo de dos secuencias de nucleótidos, el segmento contiguo de la secuencia de nucleótidos variante puede tener nucleótidos adicionales o nucleótidos delecionados con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia. Así mismo, con el fin de un alineamiento óptimo de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener restos aminoacídicos adicionales o restos aminoacídicos delecionados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo usado para comparación con la secuencia de nucleótidos de referencia o secuencia de aminoácidos de referencia comprenderá al menos 20 nucleótidos contiguos, o restos aminoacídicos, y puede ser de 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos o restos aminoacídicos. Pueden realizarse correcciones para una identidad de secuencia aumentada asociadas con la inclusión de huecos en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos de la variante por asignación de penalizaciones por huecos. Se conocen bien en la técnica métodos de alineamiento de
secuencias.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se consigue usando un algoritmo matemático. En concreto, para los fines de la presente invención, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos se determina usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de 6 huecos afines con una penalización por apertura de huecos de 12 y una penalización por extensión de huecos de 2, matriz BLOSUM 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se muestra en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2: 482-489, incorporado en este documento como referencia. Como alternativa, para los fines de la presente invención, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos se determina usando el algoritmo de búsqueda homología de Smith-Waterman usando una penalización por apertura de huecos de 25 y una penalización por extensión de huecos de 5. Dicha determinación de la identidad de secuencia puede realizarse usando, por ejemplo, el DeCypher Hardware Accelerator de TimeLogic.

Se reconoce además que cuando se considera el porcentaje de identidad de aminoácidos, algunas posiciones de aminoácidos pueden diferir como resultado de sustituciones de aminoácidos conservativas, que no afectan a las propiedades de función del polinucleótido. En estos casos, el porcentaje de identidad de secuencia debe ajustarse hacia arriba para tener en cuenta la similitud en aminoácidos sustituidos de forma conservativa. Dichos ajustes se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Meyers et al. (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17.

Se reconoce que variantes de secuencias de la invención pueden codificar polipéptidos de factor VIII_{SEP} que contengan solamente los restos aminoacídicos de los dominios A1_{P} y ap-A3_{P}, que confieren el alto nivel de expresión al polipéptido de factor VIII. Por consiguiente, los dominios A1_{P} y A3_{P} pueden humanizarse progresivamente de modo que sólo los restos necesarios para conservar el alto nivel de expresión se conserven en el polipéptido de factor VIII_{SEP}. Los especialistas en la técnica conocen dichos métodos y también se analizan en más detalle a continuación. Véase también, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.376.463; 6.48.563; 5.744.466; 5.888.974; 5.663.060; 5.364.771; 5.859.204; y 6.180.371; incorporándose todas ellas en este documento como referencia. Además, se reconoce que puede usarse un modelo tridimensional de los dominios A1-A2-A3 del factor VIII humano para identificar regiones lejos de la interfaz del dominio. Un especialista será capaz de usar este modelo para identificar restos aminoacídicos diana para la humanización.

Se reconoce que el factor VIII_{SEP} variante o fragmentos del mismo pueden construirse (1) por sustitución de las subunidades humanas o subunidades animales correspondientes por subunidades animales o subunidades humanas aisladas derivadas de plasma (cadenas pesadas o ligeras); (2) por sustitución de los dominios animales o dominios humanos correspondientes por dominios humanos o dominios animales (A1, A2, A3, B, C1 y C2); (3) por sustitución de partes de dominios animales o dominios humanos por partes de dominios humanos o dominios animales; (4) por sustitución del aminoácido o aminoácidos animales o humanos correspondientes por al menos una secuencia específica que incluya uno o más aminoácidos humanos o animales únicos; o (5) por sustitución de al menos una secuencia que incluye uno o más restos aminoacídicos específicos en el factor VIII humano, animal o variante o fragmentos del mismo por una secuencia de aminoácidos que no tenga una identidad de secuencia conocida con el factor VIII. Pueden obtenerse reemplazos de aminoácidos individuales por mutagénesis dirigida del ADN codificante del segmento correspondiente.

En una molécula de factor VIII, un "dominio", como se usa en este documento, es una secuencia continua de aminoácidos que se define por una identidad de secuencia de aminoácidos interna y sitios de escisión proteolítica por trombina. A menos que se especifique otra cosa, los dominios del factor VIII incluyen los siguientes restos aminoacídicos, cuando las secuencias se alinean con la secuencia aminoácidos humana (SEC ID Nº: 6): A1, restos Ala1-Arg372; A2, restos Ser373-Arg740; B, restos Ser741-Arg1648; A3, restos Ser1690-Ile2032; C1, restos Arg2033-Asn2172; C2, restos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los restos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, los restos Glu1649-Arg1689, se denomina habitualmente el péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII. El factor VIII se activa proteolíticamente por trombina o factor Xa, que lo disocia del factor de von Willebrand, formando el factor VIII, que tiene función procoagulante. La función biológica del factor VIIIa es aumentar la eficacia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El factor activado por trombina VIIIa es un heterotrímero A1/A2/A3/-C1-C2 de 160 kDa que forma un complejo con el factor IXa y el factor X en la superficie de plaquetas o monocitos. Un "dominio parcial", como se usa en este documento, es una secuencia continua de aminoácidos que forman parte de un dominio. Las "subunidades" de factor VIII humano animal (es decir, ratón, cerdo, perro, etc.), como se usan en este documento, son las cadenas pesada y ligera de la proteína. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2 y B. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, A3, C1 y C2. Un resto aminoacídico o secuencia "única", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia o resto aminoacídico en la molécula de factor VIII de una especie que es diferente del resto o secuencia homóloga en la molécula de factor VIII de otra especie. Como se usa en este documento, la expresión "factor VIII de mamífero" incluye un factor VIII con una secuencia de aminoácidos procedente de cualquier mamífero no humano a menos que se especifique otra cosa. El término "animal", como se usa en este documento, se refiere a un cerdo y otros mamíferos no humanos.

Puesto que la actual información indica que el domino B no tiene ningún epítopo inhibidor y no tiene ningún efecto conocido sobre la función del factor VIII, las variantes del factor VIII_{SEP} pueden tener un dominio B o una porción del mismo. Además, las variantes del factor VIII_{SEP} también pueden tener el dominio B del factor VIII con el domino B del factor V porcino o humano. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.004.803. Un factor VIII_{SEP} variante "sin dominio B" o fragmento del mismo, como se usa en este documento, se refiere a una cualquiera de las construcciones de factor VIII_{SEP} variante descritas en este documento que carecen del domino B o de una porción del mismo.

Un especialista en la técnica estará enterado de las técnicas que permiten que subunidades individuales, dominios o partes continuas de dominios de ADNc de factor VIII animal o humano se clonen y sustituyan las subunidades, dominios o partes de dominios humanos o porcinos correspondientes por técnicas de mutagénesis establecidas y, por lo tanto, generen un factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, Lubin et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (12): 8639-8641 describe técnicas para sustituir el dominio humano por el dominio A2 porcino usando sitios de restricción convenientes. Otros métodos para sustituir el ADNc del factor VIII de otra especie por una región del ADNc del factor VIII de una especie incluyen corte y empalme por extensión de solapamiento ("SOE"), como se describe por Horton et al. (1993) Meth. Enzymol 217: 270-279.

Construcciones de ADN y vectores

La secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos de factor VIII_{SEP} o variantes activas o fragmentos de los mismos puede estar contenida en una construcción de ADN. La construcción de ADN puede incluir una diversidad de potenciadores/promotores de fuentes tanto virales como de mamíferos, que dirijan la expresión del polipéptido de factor VIII_{SEP} en el tipo celular deseado. La construcción de ADN puede contener además secuencias reguladoras 3' y secuencias de ácido nucleico que faciliten la subclonación y recuperación del ADN.

El promotor de la transcripción y, si se desea, el elemento potenciador de la transcripción, están unidos operativamente a la secuencia de ácido nucleico del polipéptido de factor VIII. Un "promotor" se define como una secuencia de ADN mínima que es suficiente para dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico. Un "elemento potenciador de la transcripción" se refiere a una secuencia de ADN reguladora que estimula la transcripción del gen adyacente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de factor VIII está unida operativamente a la secuencia promotora. Véase, por ejemplo, Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA).

Por "unida operativamente" se pretende un enlace funcional entre el promotor regulador y la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de factor VIII. El enlace funcional permite la expresión génica del factor VIII cuando están presentes las proteínas activadoras de la transcripción apropiadas.

Por lo tanto, la construcción de ADN puede incluir un promotor que puede ser nativo o extraño. Por "extraño" se entiende una secuencia que no se encuentra en el organismo nativo. Además, los elementos reguladores de la transcripción pueden ser heterólogos a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor VIII. Por "heterólogo" se pretende cualquier secuencia de nucleótidos que no se encuentre de forma natural cadena arriba de la secuencia que codifica el polipéptido de factor VIII. El promotor puede ser una secuencia natural o una secuencia sintética. Además, el promotor puede ser activo constitutivamente, específico de tejido o inducible. Un promotor específico de tejido se activa preferentemente en un tejido dado y da como resultado la expresión de un producto génico en el tejido donde se activa.

Para el uso en células de mamífero, los promotores pueden obtenerse de un virus. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente proceden de polioma, virus de los simios 40 (SV40) y adenovirus 2. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son tan útiles como el promotor tardío principal de adenovirus. Además, también es posible, y con frecuencia deseable, utilizar secuencias promotoras o de control asociadas normalmente con la secuencia génica deseada, con tal de que dichas secuencias de control sean compatibles con el sistema de célula hospeda-
dora.

En ciertas realizaciones, la introducción de la secuencia de nucleótidos que codifica el factor VIII en una célula puede identificarse in vitro o in vivo por inclusión de un marcador en la construcción de ADN. El marcador dará como resultado un cambio identificable en la célula transformada genéticamente. Los marcadores de selección de fármacos incluyen, por ejemplo, neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol. Como alternativa, pueden usarse enzimas tales como la timidina quinasa del virus herpes simple (TK) o marcadores inmunológicos. Se conocen bien en la técnica ejemplos adicionales de marcadores de selección.

Se reconoce que pueden preverse múltiples modificaciones para el diseño de la construcción de ADN usada en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la construcción puede diseñarse para la inserción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de factor VIII_{SEP} usando sistemas de recombinación homóloga o específica de sitio (es decir, sistemas de recombinación Cre o FLP).

La construcción de ADN también puede contener al menos un gen adicional que se va a cointroducir en las células hospedadoras.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden estar contenidas en un vector de expresión. Un "vector de expresión" es un elemento de ADN, con frecuencia de estructura circular, que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma en una células hospedadora deseada o de integrarse en un genoma de célula hospedadora, y que además posee ciertas características bien conocidas que, por ejemplo, permiten la expresión de un ADN codificante insertado en la secuencia del vector en el sitio apropiado y en la orientación apropiada. Dichas características pueden incluir, pero sin limitación, una o más secuencias promotoras para dirigir el inicio de la transcripción del ADN codificante y otros elementos de ADN tales como potenciadores, sitios de poliadenilación y similares, todos igual de bien conocidos en la técnica.

Otros vectores, incluyendo vectores tanto plasmídicos como virales de eucariotas, pueden usarse para expresar una construcción génica recombinante en células eucariotas dependiendo de la preferencia y del criterio del médico especialista (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Capítulo 16). Por ejemplo, se conocen en la técnica muchos vectores virales incluyendo, por ejemplo, retrovirus, virus adenoasociados y adenovirus. Otros virus útiles para la introducción de un gen en una célula incluyen, pero sin limitación, virus herpes, virus de las paperas, poliovirus, virus Sindbis, virus vaccinia tales como el virus de la viruela del canario. Los métodos para producir partículas virales de replicación deficiente y para manipular los genomas virales se conocen bien. Véase, por ejemplo, Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434, Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.882.877 (adenovirus); Patente de Estados Unidos Nº 5.139.941 (virus adenoasociado); Patente de Estados Unidos Nº 4.861.719, Patente de Estados Unidos Nº 5.681.746 y Miller et al. (1993) Methods in Enzymology 217: 581 (retrovirus), incorporándose todas como referencia en este documento. Por lo tanto, dados los conocimientos en la técnica, pueden construirse fácilmente vectores virales para el uso en la introducción de las secuencias del factor VIII en una célula. Pueden usarse otros vectores y sistemas de expresión, incluyendo sistemas de células bacterianas, de levadura e insecto, pero no se prefieren debido a diferencias en o a ausencia de glicosilación.

Los polipéptidos de factor VIII de la invención pueden expresarse en una diversidad de células usadas comúnmente para cultivo y expresión de proteína de mamífero recombinante. En particular, se ha descubierto que varias líneas celulares de roedores son hospedadores especialmente útiles para la expresión de proteínas grandes. Las líneas celulares preferidas, disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md., incluyen, pero sin limitación, células de riñón de cría de hámster y células de ovario de hámster chino (CHO), que se cultivan usando procedimientos y medios de rutina. Las células de interés adicionales pueden incluir células de vertebrados tales como VERO, células HeLa, W138, COS-7 y líneas celulares MDCK. Para otros sistemas de expresión adecuados véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Véase, Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA).

Métodos de expresión y aislamiento

La construcción de ADN de la presente invención puede introducirse en una célula (procariota o eucariota) por métodos convencionales. Como se usan en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una diversidad de procedimientos reconocidos en la técnica para introducir un ADN en una célula hospedadora. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, transfección incluyendo, pero sin limitación, liposoma-polibreno, transfección mediada por DEAE dextrano, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección o microproyectiles dirigidos de alta velocidad ("biolística"). Dichas técnicas son bien conocidas por un especialista en la técnica. Véase, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed. Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, NY). Como alternativa, se podría usar un sistema que suministre la construcción de ADN en un vehículo de administración génica. El vehículo de administración génica puede ser viral o químico. Pueden usarse diversos vehículos de administración génica virales con la presente invención. En general, los vectores virales están compuestos por partículas virales procedentes de virus de origen natural. Los virus de origen natural se han modificado genéticamente para ser de replicación deficiente y no generar virus infecciosos adicionales. El vector viral también contiene una construcción de ADN capaz de expresar la proteína factor VIII.

La construcción de ADN que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido factor VIII_{SEP} también puede administrarse a una célula mediante un vehículo de administración de genes no viral. Dichos vehículos de administración de genes químicos incluyen, por ejemplo, una formulación de complejo de ADN o ARN-liposoma o un ADN desnudo. Véase, por ejemplo, Wang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7851, Patente de Estados Unidos Nº 5.844.107, Patente de Estados Unidos Nº 5.108.921 y Wagner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 4255-4259, incorporándose todas en este documento como referencia.

Se reconoce que el método de introducción del polipéptido factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo en una célula puede dar como resultado una integración estable en el genoma celular o una expresión episomal transito-
ria.

Como se define en este documento, el "producto de expresión" de un ADN que codifica un polipéptido factor VIII_{SEP} o un fragmento o variante del mismo es el producto obtenido a partir de la expresión del ADN citado en una célula hospedadora adecuada, incluyendo dichas características de modificación pre o post-traduccional de la proteína codificada por el ADN citado, incluyendo pero sin limitación, glicosilación, escisión proteolítica y similares. Se sabe en la técnica que dichas modificaciones pueden aparecer y pueden diferir algo dependiendo del tipo de célula hospedadora y de otros factores, y pueden dar como resultado isoformas moleculares del producto, con conservación de la actividad procoagulante. Véase, por ejemplo, Lind et al, (1995) Eur. J. Biochem. 232: 1927, incorporado en este documento como referencia.

En una realización, se inserta ADNc que codifica factor VIII_{SEP} o una variante o fragmento del mismo en un vector de expresión de mamífero tal como ReNeo. Se consigue una caracterización preliminar del factor VIII_{SEP} por expresión transitoria en el vector de expresión ReNeo que contiene la construcción de factor VIII_{SEP} en células COS-7. Después, puede realizarse una determinación de si se expresa una proteína factor VIII_{SEP} activa. La construcción de vector de expresión se usa adicionalmente para transfectar de forma estable células en cultivo, tales como células de riñón de cría de hámster, usando métodos que son rutinarios en la técnica, tales como transfección mediada por liposomas (Lipofectin.TM., Life Tecyhnologies, Inc.). La expresión de la proteína factor VIII_{SEP} puede confirmarse, por ejemplo, por secuenciación, transferencia de Northern y Western o reacción en cadena a la polimerasa (PCR).

Los polipéptidos de factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes de los mismos en los medios de cultivo en los que se mantienen las células transfectadas que expresan de forma estable la proteína pueden precipitarse, sedimentarse, lavarse y resuspenderse en un tampón apropiado y la proteína factor VIII_{SEP} o variante o fragmento de la misma se purifica por técnicas convencionales, incluyendo cromatografía de inmunoafinidad usando, por ejemplo, un monoclonal anti-A2-Sepharose^{TM}.

Una "proteína de fusión" o "factor VIII_{SEP} de fusión o fragmento del mismo", como se usa en este documento, es el producto de un gen híbrido en el que la secuencia codificante para una proteína está considerablemente modificada, por ejemplo, por fusión de parte de la misma con la secuencia codificante de una segunda proteína de un gen diferente para producir un gen híbrido que codifique la proteína de fusión.

En una realización adicional, el factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo se expresa como una proteína de fusión de una molécula recombinante en la que la secuencia que codifica un proteína o péptido que aumenta, por ejemplo, la estabilidad, secreción, detección, aislamiento o similar se inserta en un lugar adyacente a la secuencia que codifica el factor VIII. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.965.199 que describe un método de ADN recombinante para producir factor VIII en células hospedadoras de mamífero y purificación del factor VIII humano. Se ha descrito la expresión de factor VIII humano en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñón de cría de hámster). Se conocen y se usan rutinariamente en la técnica protocolos establecidos para el uso de secuencias de control de la expresión de especies homólogas o heterólogas incluyendo, por ejemplo, promotores, operadores y reguladores en la preparación de proteínas de fusión. Véase, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N. Y., incorporado en este documento como referencia. Se señala adicionalmente que la expresión se aumenta por inclusión de porciones del dominio B. En particular, la inclusión de esas partes del dominio B denominadas "SQ" (Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 1927, incorporado en este documento como referencia) da como resultado una expresión favorable. Las construcciones de "SQ" carecen de todo el dominio B humano excepto por 5 aminoácidos del extremo N-terminal del dominio B y 9 aminoácidos del extremo C-terminal del domino B.

Se reconoce adicionalmente que el polipéptido factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo de la invención puede prepararse mediante métodos de reconstitución. En esta realización, el factor VIII_{SEP}, variantes o fragmentos del mismo se preparan por aislamiento de subunidades, dominios o partes continuas de dominios de factor VIII derivado de plasma, seguido de reconstitución y purificación para producir un polipéptido de factor VIII_{SEP} de la invención. Como alternativa, el factor VIII_{SEP}, variante o fragmento del mismo puede prepararse por métodos de ADN recombinante, seguidos de reconstitución y purificación.

Más particularmente, el método de preparación de un factor VIII_{SEP} por métodos de reconstitución puede realizarse mediante una modificación de los procedimientos descritos por Fay et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6197; y Lollar et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10451, que implica el aislamiento de subunidades (cadenas pesada y ligera) del factor VIII humano y animal seguido de recombinación de la cadena pesada humana y la cadena ligera animal o por recombinación de la cadena ligera humana y la cadena pesada animal.

El aislamiento de las subunidades individuales tanto humanas como animales implica la disociación del dímero de cadena ligera/cadena pesada. Esto se consigue, por ejemplo, por quelación de calcio con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) seguido de HPLC monoS^{TM} (Pharmacia-LKB, Piscataway, N. J.). Las moléculas de factor VIII híbrido humano/animal se reconstituyen a partir de subunidades aisladas en presencia de calcio. El factor VIII híbrido de cadena ligera humana/cadena pesada animal o cadena ligera animal/cadena pesada humana se aísla a partir de las cadenas pesadas sin reaccionar por HPLC monoS^{TM} mediante procedimientos para el aislamiento del factor VIII porcino, tales como los descritos por Lollar et al. (1988) Blood 71: 137-143 y en la Patente de Estados Unidos Nº 6.376.463, incorporándose ambas en este documento como referencia.

Ensayos de diagnóstico

Como se usan en este documento, los "ensayos de diagnóstico" incluyen ensayos que en cierta forma utilizan la interacción antígeno-anticuerpo para detectar y/o cuantificar la cantidad de un anticuerpo particular que esté presente en una muestra de ensayo para ayudar a la selección de terapias médicas. Existen muchos de dichos ensayos conocidos por los especialistas en la técnica. Como se usa en este documento, sin embargo, el ADN del factor VIII_{SEP} o una variante o fragmento del mismo y la proteína expresada a partir del mismo, en su totalidad o en parte, pueden sustituir a los reactivos correspondientes en los ensayos conocidos de otra forma, por lo que los ensayos modificados pueden usarse para detectar y/o cuantificar anticuerpos contra factor VIII. Es el uso de estos reactivos, el ADN del factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo o la proteína expresada a partir del mismo, el que permite la modificación de ensayos conocidos para la detección de anticuerpos contra factor VIII humano o animal o contra factor VIII híbrido humano/animal. Como se usa en este documento, el factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo, que incluyen al menos un epítopo de la proteína, puede usarse como el reactivo de diagnóstico.

La secuencia de ADN o aminoácidos del factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo puede usarse en ensayos como reactivos de diagnóstico para la detección de anticuerpos inhibidores contra factor VIII humano o animal, incluyendo, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de pacientes humanos con deficiencia de factor VIII. Estos ensayos de anticuerpos incluyen ensayos tales como ensayos de ELISA, inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ensayos de inmunodifusión y ensayo de actividad biológica de factor VIII (por ejemplo, por ensayo de coagulación). Los ejemplos de otros ensayos en los que puede usarse factor VIII_{SEP} o una variante o fragmento del mismo incluyen el ensayo de Bethesda y ensayos de anticoagulación. Las técnicas para preparar estos reactivos y métodos para el uso de los mismos se conocen por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, un inmunoensayo para la detección de anticuerpos inhibidores en una muestra de suero de paciente puede incluir hacer reaccionar la muestra de ensayo con una cantidad suficiente del factor VIII_{SEP} que contiene al menos uno sitio antigénico, donde la cantidad es suficiente para formar un complejo detectable con los anticuerpos inhibidores en la muestra.

Pueden prepararse sondas de ácidos nucleicos y aminoácidos basadas en la secuencia del ADN de factor VIII_{SEP} o de la molécula proteica o fragmentos o variantes de la misma. En algunas realizaciones, éstas pueden marcarse usando colorantes o marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivos que estén disponibles en el mercado. Las sondas de aminoácidos pueden usarse, por ejemplo, para explorar sueros u otros fluidos corporales en los que se sospeche la presencia de inhibidores para factor VIII humano, animal o híbrido humano/animal. Los niveles de inhibidores pueden cuantificarse en pacientes y compararse con controles sanos y pueden usarse, por ejemplo, para determinar si un paciente con una deficiencia de factor VIII puede tratarse con un factor VIII_{SEP} o fragmento activo o variante del mismo. Pueden usarse las sondas de ADNc, por ejemplo, con fines de investigación en la exploración de genotecas de ADN.

Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos que codifican el factor VIII_{SEP} de alto nivel de expresión de la presente invención o variantes o fragmentos del mismo. Dichas composiciones pueden comprender ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en solitario o en combinación con compuestos de estabilización farmacéutica apropiados, vehículos de administración y/o vehículos excipientes, que se preparan de acuerdo con métodos conocidos, como se describe en Martin et al. Remington's Pharmaceutical Sciences, incorporado en este documento como referencia.

En una realización, los excipientes o vehículos de administración preferidos para infusión intravenosa son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.

En otra realización, los compuestos de estabilización adecuados, vehículos de administración y vehículos excipientes incluyen, pero sin limitación, otras proteínas humanas o animales tales como albúmina.

También pueden usarse en vesículas de fosfolípidos o suspensiones liposomales como excipientes o vehículos de administración farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los especialistas en la técnica y pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina-fosfatidilcolina u otras composiciones de fosfolípidos o detergentes que juntos confieran una carga negativa a la superficie, puesto que el factor VIII se une a membranas de fosfolípidos cargadas negativamente. Pueden prepararse liposomas por disolución de un lípido o lípidos apropiados (tal como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidilcolina, araquidoil fosfatidilcolina y colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora, dejando tras de sí una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Después, se introduce una solución acuosa del factor VIII_{SEP} de la presente invención en el recipiente. Después, el recipiente se agita a mano para liberar el material lipídico de los laterales del recipiente y para dispersar los agregados de lípidos, formando de este modo la suspensión liposomal.

Las moléculas de factor VIII_{SEP} de la invención pueden combinarse con otros compuestos de estabilización adecuados, vehículos de administración y/o vehículos excipientes incluyendo factores de coagulación dependientes de vitamina K, factor tisular y factor de von Willebrand (vWf) o un fragmento de wVf que contenga el sitio de unión a factor VIII y polisacáridos tales como sacarosa.

Las moléculas de factor VIII_{SEP} de la invención también pueden administrarse por terapia génica usando medios de administración tales como vectores retrovirales. Este método consiste en la incorporación de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido factor VIII_{SEP} deseado de la invención en células humanas que se transplantan directamente en un paciente deficiente en factor VIII_{SEP} o que se colocan en un dispositivo implantable, permeable a las moléculas de factor VIII pero impermeable a células, que después se transplantan.

En una realización, el método será de transferencia génica mediada por retrovirus. En este método, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de factor VIII de la invención se clona en el genoma de un retrovirus modificado. El gen se inserta en el genoma de la célula hospedadora mediante la maquinaria viral, donde se expresará por la célula. El vector retroviral se modifica de modo que no producirá virus, evitando la infección vírica del hospedador. Los principios generales para este tipo de terapia se conocen por los especialistas en la técnica y se han revisado en la bibliografía (Kohn et al. (1989) Transfusion 29: 812-820).

El polipéptido de factor VIII_{SEP} de la invención puede almacenarse unido a vWf para aumentar la vida media y la vida útil de la molécula polipeptídica. Además, la liofilización del factor VIII_{SEP} puede mejorar los rendimientos de moléculas activas en presencia de vWf. Los métodos actuales para almacenamiento de factor VIII humano y animal usados por proveedores comerciales pueden emplearse para almacenamiento del factor VIII recombinante. Estos métodos incluyen: (1) liofilización de factor VIII_{SEP} en un estado parcialmente purificado (como un factor VIII "concentrado" que se infunde sin una purificación adicional); (2) purificación por inmunoafinidad de factor VIII_{SEP} por el método de Zimmerman y liofilización en presencia de albúmina, que estabiliza el factor VIII; (3) liofilización del factor VIII_{SEP} recombinante en presencia de albúmina.

Además, los polipéptidos de factor VIII pueden almacenarse a 4ºC en NaCl 0,6 M, MES 20 mM y CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0. Los polipéptidos también pueden almacenarse congelados en estos tampones y descongelarse con una pérdida mínima de actividad.

Métodos de tratamiento

Puede usarse factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes del mismo para tratar el sangrado incontrolado debido a deficiencia de factor VIII (por ejemplo, hemorragia intraarticular, intracraneal o gastrointestinal) en hemofílicos con y sin anticuerpos inhibidores y en pacientes con deficiencia de factor VIII adquirida debido al desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los materiales activos se administran preferiblemente por vía intravenosa.

La "deficiencia de factor VIII", como se usa en este documento, incluye la deficiencia en la actividad de coagulación causada por producción de factor VIII deficiente, por producción inadecuada o no producción de factor VIII, o por inhibición parcial o total del factor VIII por inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII que es el resultado de una deficiencia en un gen ligado al cromosoma X y la ausencia o deficiencia de la proteína factor VIII que codifica.

Adicionalmente, el factor VIII_{SEP} o fragmentos y variantes del mismo pueden administrarse por transplante de células modificadas por ingeniería genética para producir el factor VIII_{SEP} o por implantación de un dispositivo que contenga dichas células, como se ha descrito anteriormente.

En una realización, las composiciones farmacéuticas de factor VIII_{SEP} o fragmentos y variantes del mismo en solitario o en combinación con estabilizantes, vehículos de administración y/o excipientes se infunden en pacientes por vía intravenosa de acuerdo con el mismo procedimiento que se usa para la infusión de factor VIII_{SEP}.

Las dosificaciones de tratamiento de la composición de factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo que deben administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia de factor VIII. En general, el nivel de dosificación se ajusta en frecuencia, duración y unidades de acuerdo con la gravedad y duración de cada episodio de sangrado del paciente. Por consiguiente, el factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo se incluyen en el excipiente, vehículo de administración o estabilizante farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del híbrido para detener el sangrado, como se mide por ensayos de coagulación convencionales.

La "actividad específica", como se usa en este documento, se refiere a la actividad que corregirá la deficiencia de coagulación de plasma deficiente en factor VIII humano. La actividad específica se mide en unidades de actividad de coagulación por miligramo de proteína de factor VIII total en un ensayo convencional en el que el tiempo de coagulación del plasma deficiente en factor VIII humano se compara con el de plasma humano normal. Una unidad de actividad de factor VIII es la actividad presente en un mililitro de plasma humano normal. En el ensayo, cuanto más corto el tiempo para la formación del coágulo, mayor la actividad del factor VIII que ese está ensayando. La actividad específica de los polipéptidos de factor VIII, variantes o fragmentos de los mismos puede ser menor que, igual a o superior a la del factor VIII humano derivado de plasma o recombinante.

El factor VIII se define clásicamente como esa sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige la deficiencia de coagulación en plasma procedente de individuos con hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de formas purificadas y parcialmente purificadas de factor VIII_{SEP} se usa para calcular la dosis del factor VIII para infusiones en pacientes humanos y es un indicador fiable de la actividad recuperada del plasma del paciente y de corrección de la deficiencia de sangrado in vivo. No existen discrepancias descritas entre el ensayo convencional de nuevas moléculas de factor VIII in vitro y su comportamiento en el modelo de infusión de perro o en pacientes humanos, de acuerdo con Lusher et al. New Engl. J. Med. 328: 453-459; Pittman et al. (1992) Blood 79: 389-397; y Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8752-8755.

El aumento de factor VIII_{SEP} en el plasma será suficiente para producir un efecto terapéutico. Un "efecto terapéutico" se define como un aumento en la actividad de coagulación sanguínea en el plasma de pacientes que es superior a la actividad de coagulación observada en el sujeto antes de la administración de la molécula de factor VIII_{SEP}. En un ensayo de coagulación sanguínea convencional, cuanto más corto el tiempo para la formación del coágulo mayor la actividad del factor VIII que se está ensayando. Un aumento en la actividad del factor VIII en el plasma deficiente en factor VIII de al menos el 1% o superior será terapéuticamente beneficioso.

Habitualmente, el nivel de factor VIII en plasma deseado para conseguir en el paciente a través de la administración del factor VIII_{SEP} o variante o fragmento del mismo está en el intervalo del 30-100% del normal. En un modo de administración del factor VIII_{SEP} o un fragmento o variante del mismo, la composición se administra por vía intravenosa a una dosificación preferida en el intervalo de aproximadamente 5 a 50 unidades/kg de peso corporal, más preferiblemente en un intervalo de 10-50 unidades/kg peso corporal y, más preferiblemente, a una dosificación de 20-40 unidades/kg peso corporal; la frecuencia del intervalo está en el intervalo de aproximadamente 8 a 24 horas (en hemofílicos gravemente afectados); y la duración del tratamiento en días está en el intervalo de 1 a 10 días o hasta que se resuelva el episodio de sangrado. Véase, por ejemplo Roberts et al. (1990) Hematology, Williams et al. ed. Cap. 153, 1453-1474, incorporado en este documento como referencia. Los pacientes con inhibidores puede requerir más factor VIII_{SEP} o variantes o fragmentos del mismo, o los pacientes pueden requerir menos factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes del mismo. Como en el tratamiento con factor VIII humano o porcino, la cantidad de factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes infundidas está desacreditada por el ensayo de coagulación de factor VIII de una fase y, en casos seleccionados, la recuperación in vivo se determina por medición del factor VIII en el plasma del paciente después de la infusión. Debe entenderse que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos en este documento son ejemplares solamente y no pretenden limitar al alcance o la práctica en la composición que se reivindica.

El tratamiento puede adoptar la forma de una única administración intravenosa de la composición o la administración periódica o continua a lo largo de un período de tiempo prolongado, según sea necesario. Como alternativa, el factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes del mismo pueden administrarse por vía subcutánea u oral con liposomas en una o varias dosis a intervalos de tiempo variables.

El factor VIII_{SEP} o fragmentos o variantes del mismo también pueden usarse para tratar un sangrado incontrolado debido a deficiencia de factor VIII en hemofílicos que han desarrollado anticuerpos contra el factor VIII humano.

Experimental

Ejemplo 1

Caracterización de secuencia de Factor VIII

Se aísla factor VIII tanto porcino como humano de plasma como una proteína de dos subunidades. Las subunidades, conocidas como la cadena pesada y la cadena ligera, se mantienen juntas mediante un enlace no covalente que requiere calcio u otros iones metálicos divalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2 y B que están unidos covalentemetne. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, denominados A3, C1 y C2. El dominio B no tiene función biológica conocida y puede eliminarse o eliminarse parcialmente de la molécula proteolíticamente o por métodos de tecnología de ADN recombinante sin una alteración significativa en ningún parámetro medible del factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene una estructura y función similares al factor VIII derivado de plasma aunque no está glicosilado a menos que se exprese en células de mamífero. El factor VIII activado tanto humano como porcino ("factor VIIIa") tiene tres subunidades debido a la escisión de la cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura se denomina A1/A2/A3-C1-C2.

La secuencia de ADNc del factor VIII porcino que se corresponde con la región codificante del péptido señal, los dominios A1, B, la región peptídica de actividad de cadena ligera A3, C1 y C2 se proporcionan en la SEC ID Nº: 1. La traducción del ADNc porcino se proporciona en la SEC ID Nº: 2.

El alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha del factor VIII porcino de longitud completa (SEC ID Nº: 2) con las secuencias humana (Wood et al. (1984) Nature 312: 330-337) (SEQ ID Nº: 6) y murina (Elder et al. (1993) anteriormente) (SEQ ID Nº: 8) publicadas se muestra en las figuras 1A-1H junto con sitios para modificación postraduccional, escisión proteolítica y reconocimiento por otras macromoléculas.

Pueden observarse sitios de glicosilación ligados a N potenciales (NXS/T donde X no es prolina) en las figuras 1A-1H. Existen ochos sitios de glicosilación ligados a N conservados: uno en el domino A1, uno en el dominio A2, cuatro en el dominio B, uno en el dominio A3 y uno en el dominio C1. Las 19 cisteínas de los dominios A y C están conservadas mientras que existe una divergencia en las cisteínas del domino B. Seis de los siete puente disulfuro en el factor VIII se encuentran en sitios homólogos en el factor V y ceruloplasmina y ambos enlaces disulfuro del dominio C se encuentran en el factor V (McMullen et al. (1995) Protein Sci. 4: 740-746). El factor VIII humano contiene tirosinas sulfatadas en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 (Pittman et al. (1992) Biochemistry 31: 3315-3325; Michnick et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20095-20102). Estos restos están conservados en el factor VIII de ratón y en el factor VIII porcino (Figura 1), aunque el programa CLUSTALW no consiguió alinear la tirosina de ratón correspondiente a la Tyr346 en el factor VIII humano. Se representan en la Figura 1 epítopos de los diversos dominios del polipéptido factor VIII.

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Ejemplo 2

Resumen

Los niveles de expresión de factor VIII humano son significativamente inferiores a los niveles de otras proteínas de coagulación in vivo y en sistemas de expresión heterólogos in vitro. El bajo nivel de expresión del factor VIII humano recombinante ha limitado el tratamiento de la hemofilia A usando infusión de proteína recombinante y protocolos de terapia génica. Sin embargo, se expresa factor VIII porcino con dominio B delecionado recombinante a niveles 10-14 veces superiores que el factor VIII humano con dominio B delecionado recombinante in vitro. Para identificar las secuencias del factor VIII porcino necesarias para esta propiedad, se produjeron ADNc de factor VIII híbrido humano/porcino con dominio B delecionado que contenían una sustitución de secuencias humanas con las secuencias porcinas correspondientes. Estos ADNc se transfectaron de forma transitoria en células COS-7 o se transfectaron de forma estable en células derivadas de BHK y se midió la expresión de factor VIII en los medios extracelulares mediante un ensayo de coagulación de una fase. Los ADNc de factor VIII híbrido humano/porcino que contenían 1) los dominios A1, A2 y A3 del factor VIII porcino y los dominios C1 y C2 del factor VIII humano o 2) los dominios A1 y A3 del factor VIII porcino y los dominios A2, C1 y C2 del factor VIII humano, demostraron niveles de expresión de factor VIII comparables a las del factor VIII porcino. Una molécula de factor VIII híbrido humano/porcino que demuestre un alto nivel de expresión puede ser valiosa para mejorar la producción de factor VIII para infusión intravenosa o para terapia génica de células somáticas de la hemofilia A.

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Materiales

Se adquirió solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, suero fetal bovino (FBS), penicilina, estreptomicina, DMEM:F12, medio de cultivo AIM V sin suero, lipofectina, lipofectamina 2000 y geneticina de Invitrogen. Se obtuvieron células derivadas de riñón de cría de hámster denominadas células BHK-M (Funk et al. (1990) Biochemistry 29: 1654-1660), por cortesía del Dr. Ross. Macgillivray, University of British Columbia. Las transfecciones transitorias se controlaron para eficacia de transfección usando el vector RL-CMV y un kit de ensayo dual de luciferasa (Promega, Madison, WI). Se adquirieron plasma deficiente en factor VIII tratado con citrato y plasma humano normal tratado con citrato combinado (FACT) en George King Biomedical (Overland Park, KA). Se adquirió reactivo de tromboplastina parcial activada (aPTT) en Organon Teknika (Durham, NC). Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos por Life Technologies. Se adquirieron ADN polimerasa Pfu y células E. coli XL-1 Blue de Stratagen (La Jolla, CA).

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Construcción de vectores de expresión de Factor VIII

Todos los vectores de expresión de factor VIII en este estudio estaban contenidos en el plásmido de expresión de mamíferos ReNeo (Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 19-27). Los insertos de ADNc de factor VIII carecen de la secuencia 5'-UTR del factor VIII endógeno y contienen los primeros 749 de los 1805 nt de la 3'-UTR del factor VIII humano.

Se generó un ADNc de factor VIII con domino B delecionado humano denominado HSQ (Figura 2) por clonación del ADNc del factor VIII humano en el vector de expresión de mamíferos ReNeo como se ha descrito anteriormente (Doerin et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 38345-38349). El ADNc de HSQ codifica una secuencia enlazadora SFSQNPPVLKRHQR (SEC ID Nº: 9) entre los dominios A2 y ap. Este enlazador incluye la secuencia de reconocimiento RHQR (SEC ID Nº: 10) para el procesamiento proteolítico intracelular por PACE/furina (Seidah et al. (1997) Current Opinion in Biotechnology 8: 602-607). Este acontecimiento de escisión convierte el factor VIII de cadena sencilla en un heterodímero (Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 19-27). El factor VIII heterodimérico se considera la forma fisiológica del factor VIII (Fass et al. (1982) Blood 59: 594-600).

Una forma con dominio B delecionado del ADNc del factor VIII porcino se ligó en ReNeo como se ha descrito anteriormente (Doering et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 38345-38349). El ADNc denominado P/OL (Figura 2) codifica una secuencia enlazadora derivada de porcino SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº: 11) entre los dominios A2 y ap para el reconocimiento de PACE/furina.

Una molécula de factor VIII híbrido humano/porcino sin dominio B denominada HP1, que contiene el domino A2 porcino y los dominios A1, ap-A3, C1 y C2 humanos, se preparó como se ha descrito anteriormente (Lubin et al. (1994) J. biol. Chem. 269: 8639-8641). El ADNc que codifica la secuencia enlazadora obtenida de humano SFSQNPPVLKRHQR (SEC ID Nº: 9) se insertó entre los dominios A2 y ap de HP1 por mutagénesis de corte y empalme por extensión de solapamiento (SOE) (Horton et al. (1993) Methods Enzymol. 217: 270-279) produciendo HP1/SQ (Figura 2).

El HP30, que contiene el dominio ap-A3 porcino y los dominios A1, A2, C1 y C2 humanos se preparó como se ha descrito anteriormente (Barrow et al. (2000) Blood 95: 557-561). El ADNc que codifica la secuencia enlazadora obtenida de porcino SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº: 11) se insertó entre los dominios A2 y ap de HP30 por mutagénesis de SOE produciendo HP30/OL (Figura 2).

El HP44/OL, que contiene los dominios A1, A2, ap-A3 porcinos, la secuencia enlazadora obtenida de porcino SFAQNSRPPSASAPKPPVLREHQR (SEC ID Nº: 11) y los dominios C1 y C2 humanos (Figura 2) se preparó de la forma siguiente. Se digirió P/OL ReNeo con AvrII y el fragmento que contenía la secuencia A1, A2 y ReNeo se purificó en gel. El HP30/OL se digirió con AvrII y el fragmento que contenía las secuencias ap-A3 porcina y C1 y C2 humanas se purificó en gel. La ligación de los productos, transformación de células E.coli XL-1 y purificación plasmídica se realizaron como se ha descrito anteriormente (Healey et al. (1998) Blood 92: 3701-3709).

El HP46/SQ, que contiene el domino A1 porcino y los dominios A2, ap-A3, C1 y C2 humanos y la secuencia enlazadora SFSQNPPVLKRHQR (SEC ID Nº:11) humana (Figura 2), se preparó mediante mutagénesis de SOE. Se usaron P/OL en ReNeo y HSQ en ReNeo como moldes en las reacciones de SOE de la primera vuelta. El cebador 5' en la reacción de P/OL era complementario a la secuencia 5' de ReNeo para el ADNc del factor VIII. El cebador 3' flanqueaba el dominio A1 porcino. El cebador 5' en la reacción de HSQ era parcialmente complementario al cebador 3' usado en la primera reacción. El cebador 3' era complementario a la secuencia A2 humana. Después de la purificación en gel de los productos de las reacciones de la primera vuelta, se realizó la segunda reacción de SOE, obteniéndose un producto que contiene la secuencia 5' de ReNeo para el inserto de ADNc del factor VIII, el dominio A1 porcino y parte del dominio A2 humano. Este producto se digirió con XhoI, en la unión de ReNeo y el inserto del factor VIII y con MluI en el dominio A2 humano y se ligó en HSQ/ReNeo digerido con XhoI/MluI. El plásmido resultante se amplificó por transformación en células E. coli XL-1 Blue como se ha descrito anteriormente.

El HP47/OL que contiene los dominios A1, ap-A3 porcinos, secuencia enlazadora obtenida de porcino SFAQNSR
PPSASAPKPPVLRRHQR (SEC ID Nº:11) y dominios A2, C1 y C2 humanos (Figura 2) se preparó de la forma siguiente. El HP46/SQ en ReNeo se digirió con AvrII que escinde el plásmido en la secuencia 5 de ReNeo para el inserto del factor VIII y en la unión A2-ap. El fragmento que contiene los dominios A1 y A2 se ligó purificado en gel a un fragmento de HP30/OL en ReNeo producido por digestión con AvrII.

Las secuencias producidas por mutagénesis de SOE se confirmaron mediante secuenciación de ADN didesoxi.

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Expresión transitoria de Factor VIII a partir de células COS-7

Se cultivaron células COS-7 hasta una confluencia del 70-80% en pocillos de 2 cm^{2} que contenían 1 ml de DMEM:F12 suplementado con FBS al 10%, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 \mug/ml. Las células se transfectaron con una proporción en masa de 2000:1 de plásmido de factor VIII:ADN plasmídico de luciferasa usando Lipofectamina 2000. Veinticuatro horas después de la transfección las células se aclararon dos veces con 1 ml de PBS y se añadieron a cada pocillo 0,5 ml de medio AIM V sin suero. Las células se cultivaron 24 h antes de que se recogieran los medios acondicionados y se midiera la actividad de factor VIII como se describe a continuación.

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Expresión estable de Factor VIII a partir de células procedentes de riñón de cría de hámster (BHK-M)

Las células BHK-M se transfectaron usando Lipofectina junto con un plásmido ReNeo que contenía ADNc de factor VIII y se cultivaron en presencia de DMEM:F12 que contenía FBS al 10%, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y geneticina 500 \mug/ml durante 10 días. El vector ReNeo contiene el gen de neomicina fosfotransferasa para resistencia al antibiótico geniticina. Veinticuatro a 72 clones resistentes a geniticina se exploraron para determinar la producción de factor VIII. El clon de cada construcción de ADNc que presentaba el mayor nivel de actividad de factor VIII se transfirió en un matraz de 75 cm^{2}, se cultivó hasta una confluencia del 90-95% y después se cambió a 25 ml de medio AIM V sin suero. Después de 24 h, los medios acondicionados se reemplazaron con 25 ml de medio sin suero recién preparado AIM V y se cultivaron durante 24 h adicionales. Los medios recogidos de cada punto de tiempo se ensayaron para determinar la actividad de factor VIII como se describe a continua-
ción.

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Ensayo de Factor VIII

Se midió la actividad de factor VIII mediante un ensayo de coagulación de una fase usando un instrumento de coagulación ST art (Diagnostics Stago, Asnieres, Francia). Se añadieron cinco \mul de muestra o patrón a 50 \mul de plasma deficiente en factor VIII seguido de adición de 50 \mul de reactivo aPTT e incubación durante 3 min a 37ºC. Se añadieron cincuenta microlitros de CaCl_{2} 20 mM para iniciar la reacción y el tiempo necesario para desarrollar un coágulo de fibrina se midió viscosimétricamente. Se generaron curvas patrón usando varias diluciones de plasma humano normal combinado y se sometieron a un análisis de regresión lineal del tiempo de coagulación frente al logaritmo de la dilución plasmática recíproca. Para determinación de la actividad de factor VIII, las muestras se diluyeron en solución salina tamponada con HEPES a una concentración dentro del intervalo de la curva patrón.

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Resultados

Para identificar regiones en el factor VIII porcino que confieran alto nivel de expresión, se construyeron las moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino que se muestran en la Figura 2 y se midieron sus niveles de expresión en células COS-7 y BHK-M. Después de la transfección de células COS-7, el plásmido expresión no se integra en el ADN genómico pero se presenta de forma transitoria como un ADN episomal. Los niveles de expresión de células COS-7 representan una media de la población celular. La Figura 3 muestra los resultados de pocillos de COS-7 transfectadas por cuadriplicado. Existe un aumento significativo en la expresión de P/OL, HP44, HP47 y HP46 en comparación con HSQ. Por el contrario, la expresión de HP1 y HP30 no se aumentó en comparación con HSQ.

La expresión de factor VIII a partir de células BHK-M concordaba con los resultados en células COS-7. Después de la transfección de células BHK-M, los clones que contenían ADN plasmídico que se incorporaba de forma estable en el genoma se seleccionaron usando el antibiótico geneticina. Las células que no contienen el gen de la neomicina fosfotransferasa contenido en el plásmido no sobreviven a la presencia de geniticina. Aproximadamente el 50% de los clones resultantes de la transfección de células BHK-M con las construcciones que se muestran en la Figura 2 no expresaban niveles detectables de factor VIII (no se muestran los datos). Esto concuerda con los resultados anteriores con HSQ y P/OL (Doering et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 38345-38349) y se espera porque la expresión del propio factor VIII no se selecciona durante la selección con geneticina. Los niveles de expresión medios para clones que producían factor VIII eran significativamente superiores para las construcciones P/OL, HP44, HP47 y HP46 pero no para la HP1 y HP30 en comparación con HSQ (no se muestran los datos). Cada construcción de ADNc de factor VIII, el clon que producía los niveles más altos de factor VIII se expandió y se cambió a medio AIM V sin suero. De acuerdo con los resultados anteriores, los niveles de factor VIII para HP44, HP47 y HP46 pero no para HP1 y HP30 eran comparables a P/OL (Figura 3).

La Figura 3 muestra la expresión heteróloga de factor VIII porcino recombinante OL y factor VIII humano recombinante SQ. Las células COS-7 (barras oscuras) se transfectaron con las construcciones de expresión de factor VIII individuales y ADN plasmídico de luciferasa y se cultivaron en medios sin suero durante 24 h como se describe en los Procedimientos experimentales. Los medios acondicionados se ensayaron para determinar la actividad de factor VIII mediante un ensayo de coagulación de una fase. Después de la recogida de medios, las células se lisaron y se ensayaron para determinar la actividad luciferasa. Los datos se presentan como la proporción de actividad de factor VIII:actividad de luciferasa (media +/- desviación típica de cuatro pocillos de células transfectadas por cada muestra) normalizada para el nivel medio de HSQ. Los datos que se muestran son representativos de experimentos que implican tres cultivos separados de células COS-7. Las células BHK-M (barras rayadas) se transfectaron con las construcciones de expresión de factor VIII individuales y se seleccionaron para integración estable del transgén. El clon más productor para cada construcción se dividió en un matraz de 75 cm^{2}, se cultivó hasta una confluencia superior al 90%, se aclaró dos veces con PBS y se cultivó 24 h en medio sin suero. Después de 24 h, los medios se recogieron y se ensayaron para determinar la actividad de factor VIII. Los datos se expresan con respecto a la expresión de HSQ, que era de 2,8 unidades/10^{6} células/24 h en células BHK-M.

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Discusión

El factor VIII porcino con dominio B delecionado recombinante se expresa a niveles de hasta 14 veces superiores que el factor VIII humano recombinante (Doering et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 38345-38349). Los niveles son sustancialmente superiores que en informes previamente publicados de expresión de factor VIII (Tabla II). El mecanismo para el fenómeno de alta expresión no se ha establecido. Sin embargo, el alta nivel de expresión se debe a una diferencia entre el factor VIII con domino B delecionado humano y porcino en la secuencia traducida porque los casetes de expresión P/OL y HSQ no contienen la secuencia 5'-UTR del factor VIII endógeno, mientras que ambos poseen los primeros 749 nt (de 1805 nt) de la 3'UTR del factor VIII humano. Además, el efecto se produce a nivel postranscripcional porque no existen diferencias en los niveles de ARNm de P/OL y HSQ en células BHK-M (Doering et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 38345-38349).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA II Informes previos de expresión de FACTOR VIII

2

3

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Ejemplo 3

Pueden generarse variantes de las secuencias de factor VIII_{SEP} de la invención. Por ejemplo, puede generarse el factor VIII_{SEP} HP63/OL. Véanse las Figuras 12-14.

Se han identificado dos epítopos de factor VIII humano principales que son reconocidos por anticuerpos inhibidores: en el dominio A2 en un segmento unido por los restos 484-508 (Healey et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 14505-14509) y en el dominio C2 en un segmento unido por los restos 2181-2252 (Healey et al. (1998) Blood 92: 3701-3709 y Barrow et al. (2001) Blood 97:169-174, incorporándose todos como referencia en este documento). La numeración de secuencia se refiere al factor VIII humano maduro de longitud completa de acuerdo con la convención de la norma (Vehar et al. (1984) Nature 312: 337-342). También se han identificado anticuerpos que reconocen el péptido de activación de cadena ligera, ap, (Barrow et al. (2000) Blood 95: 557-561) y el dominio A3 en una región unida por los restos 1804-1819 (Zhong et al. (1998) Blood 92: 136-142), pero son menos comunes (Prescott et al. (1997) Blood 89:3663-3671). Se han identificado ocasionalmente otros epítopos pero se consideran poco habituales.

Puede generarse una variante de una molécula de factor VIII_{SEP} que contenga los dominios A2, ap y C2 humanos, la secuencia humana 1804-1819 y el dominio A1 porcino y las secuencias A3 porcinas de aproximadamente 1690 a 1803 y de aproximadamente 1820 a 2019. Esta variante de factor VIII_{SEP} se representa en la Figura 12 como HP63. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos se proporcionan en la SEC ID Nº:20 y 21. Dicha molécula se predice que es una molécula de superexpresión que tiene las características antigénicas del factor VIII humano. Se describen en otra parte en este documento ensayos para medir la actividad de alto nivel de expresión de la variante
HP63.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III Listado de ID de secuencia

4

5

La presente invención se ha descrito anteriormente con respecto a los dibujos adjuntos en los que se muestran algunas pero no todas las realizaciones de la invención. De hecho, estas invenciones pueden incluirse en realizaciones de muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitadas a las realizaciones expuestas en este documento; en su lugar, estas realizaciones se proporcionan de modo que esta descripción cumpla los requerimientos legales aplicables. Los números similares se refieren a elementos similares a lo largo de toda la misma.

Muchas modificaciones y otras realizaciones de las invenciones expuestas en este documento vendrán a la mente de un especialista en la técnica a la que pertenecen estas invenciones, teniendo el beneficio de los contenidos presentados en las descripciones anteriores y en los dibujos asociados. Por lo tanto, debe entenderse que las invenciones no se limitan a las realizaciones específicas descritas y que esas modificaciones y otras realizaciones pretenden incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se emplean en este documento términos específicos, se usan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no con fines de limitación.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en la técnica a la que pertenece esta invención.

<110> Lollar, John S.

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<120> Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que codifican polipéptidos de Factor VIII de alto nivel de expresión y métodos de uso

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<130> 07157/254319

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<150> 60/327.388

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<151> 05-10-2001

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<160> 11

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 6402

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<212> ADN

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<213> Sus scrofa

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<220>

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<221> gen

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<222> (1)...(6399)

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<223> Factor VIII - - Longitud completa

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<221> CDS

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<222> (1)...(6399)

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<400> 1

6

7

8

9

10

11

12

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

15

16

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(4401)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Factor VIII - - Dominio B delecionado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(4401)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

20

21

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1467

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9009

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Factor VIII- Longitud completa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (208)...(7203)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

40

41

42

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6996

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Factor VIII- Secuencia codificante de longitud completa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

45

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2319

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

48

49

50

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia enlazadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia enlazadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

54

Claims (14)

1. Un polipéptido de factor VIII aislado que comprende los dominios A1 y A3 porcinos y los dominios A2, C1 y C2 humanos y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 19, en el que dicho polipéptido se caracteriza por un alto nivel de expresión.

2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:19.

3. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº:18; y

b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:19.

6. Una construcción de ADN que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5.

7. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5.

8. Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5.

9. Una célula aislada que comprende el vector de la reivindicación 7.

10. Un método in vitro de producir un polipéptido que comprende:

a) introducir en una célula la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4;

b) cultivar dicha célula en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia de nucleótidos.

11. El método de la reivindicación 10, en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:19.

b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº:18.

12. Un método in vitro para aumentar el nivel de expresión de un polipéptido de factor VIII en una célula que comprende:

a) introducir en dicha célula una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5; y

b) cultivar dicha célula en condiciones que permitan la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.

13. El método de la reivindicación 10, 11 ó 12, que comprende además aislar dicho polipéptido.

14. Uso de un polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una deficiencia de Factor VIII en un sujeto.