CZ20003327A3 - Prostředí pro propagaci a multiplikaci virů a způsob propagace a multiplikace virů - Google Patents

Abstract

Použití kultivačního prostředí, které je prosté lidských nebo zvířecích proteinů i proteinů rekombinantního původu, a které obsahuje rostlinné extrakty pro propagaci a multiplikaci virů v buněčných kulturách.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká prostředí pro propagaci a multiplikaci virů a způsobu propagace a multiplikace virů na buňkách v kultuře, zejména k výrobě vakcin.

Dosavadnístav techn i ky

Výroba virových vakcin, at jednoduše zeslabených, inaktivovaných, subjednotek nebo rekoabinantů, zahrnuje produkci virů ve velkém měřítku.

Tato výroba se může provádět v závislosti na povaze viru na různých nosičích, které umožňují replikaci viru: tak například pro většinu běžně obchodně dostupných protichřipkových vakcin, se proliferace viru provádí na nasazených slepicích vejcích, zatímco pro některé vakciny proti japonské encefalitidě se tato operace provádí na myších mozcích.

Používání takových nosičů naráží na řadu problémů: dostupnost, reprodukovatelnost, avšak hlavně bezpečnost vlivem možných znečištění viry, myoplasmy nebo jakýmíkoli jinými nežádoucími elementy pocházejícími z nosiče. Vzrůstá tedy úsilí o opouštění takových nosičů a kdekoli je to možné, používá se buněčných kultur, které se infikují malým množstvím viru, který se má produkovat a který se pak udržuje v podmínkách, které podporují replikaci viru uvnitř infikovaných buněk jakož také propagaci infekce z jedné buňky na druhou. Vyprodukované viry se pak shromáždí buď z kultivačního prostředí, které je buněčnou lázní, když jde o intrace1ulárni viry, které buňku opustí (což má hlavně tu výhodu, že umožní provádět několik sklizní viru se stejnou kulturou buněk), nebo zpracováním buněk samot• · · · » · · · ► ♦ # · » · · » · · • · « • · · • · · » · · ných, když jde o intracelulární viry.

Pro tyto způsoby jsou nutné buněčné kultury dobré kvality; četné dosavadní vývojové práce se tedy zabývají zlepšováním buněčných kultur a zejména použitých kultivačních prostředí.

K omezení nebezpečí znečištění buněk layoplasmy, viry, činidly hovězí spongiósní encefalopat ie, nebo jakýmikoli jinými neobvyklými přenosnými činidly se navrhovalo použití kultivačních prostředí prostých séra a dokonce prostých proteinů (zveřejněná přihláška vynálezu číslo VÍO 96/15231). Je popsáno použití buněčného kultivačního prostředí prostého zvířecího séra, obsahujícího však rostlinné extrakty (francouzský patentový spis číslo FR 2 732347).

Při používání takových prostředí pro kultivaci buněk, vzrůstá bezpečnost produktů získaných za použití takto produkovaných buněk.

Avšak jde-li o výrobu virů tvořících součást vakci nových prostředků, postupy, které následují po této fázi kultivace buněk, by měly také samy vykazovat maximální stupeň bezpečnosti.

Obvykle (například americký patentový spis číslo 4 525349) když se používá buněk v kultivačním prostředí k produkci virů, jakmile se jednou provede kultivační fáze, odstraní se prostředí, kterého bylo použito ke kultivaci buněk a nahradí se novým prostředím, ve kterém se buňky určitou dobu koupou k promytí; toto nové prostředí se pak odstraní; tento proces promývání buněk se může popřípadě několikrát opakovat.

Pak se do buněčné kultury zavede nové prostředí, které napřed umožní, aby buňky přežily a byly infikovány viry a za druhé je třeba mít k disposici prvky, které postačí jako nosiče k replikaci těchto virů. Avšak, jak je známo z literatury (Protein-free culture of Věro cells: A substráte for replica• 4

• · *

4 4 ·· • 4 44

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

44 tíon of human pathogenic viruses Cell Biology International, sv. 17, č. 9, str. 885 až 895, 1993), i když se buňky kultivují v prostředí prostém proteinu, kultivační prostředí použité podle dosavadního stavu techniky v tomto stupni mul tipl ikace a propagace viru sprav idl a obsahuje sárodečné telecí sérum, nebo k omezení problémů se znečištěním, alespoň lidský albumin. Použití lidského albuminu v tomto stupni způsobu výroby virových vakcin se považuje sa prosté rizika pro kvalitu vakcíny. Avšak v 2ájmu úplného vyloučení všeho nebe2pečí, i teoretického, by bylo žádoucí mít prostředí, které je vhodné pro propagaci a multiplikaci virů na nosiči sestávajícím s buněčného kultivačního prostředí. které je prosté lidského nebo zvířecího proteinu i rekombinantního původu, ale které nicméně umožňuje produkční výsledky, které jsou kompatibilní s průmyslovými požadavky nesvyšovat náklady výroby vakcin obsahujících viry, pěstované na bunčných kulturách.

Úkolem vynálezu je zejména vyvinout takové prostředí. Ukoiem vynálezu je také vyvinout takovéto prostředí a způsob propagace a mul tipl ikace virů, který popřípadě umožni inaktivaci viru.

Podstata vynálezu

Prostředí pro propagaci a multiplikaci virů na buňkách v kultivačním prostředí spočívá podle vynálezu v tom, že je prosté lidského i sví řečí ho proteinu i rekombinantního původu a obsahuje extrakty s rostlin.

Podle jednoho provedení vynálezu obsahuje prostředí k propagaci a multiplikaci virů proteiny nebo glykoproteiny extrahované s brambor a s okurek, mající aitogenní potenciál a molekulovou hmotnost 1000 až 200 000 daltonů.

Podle jiného provedení vynálezu obsahuje prostředí rošt99 99 99 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 · • · 9 · · 9

99 99 99

1inné hydroiyzáty.

Podle ještě jiného provedení vynálezu jsou proteiny nebo g1ykoproteiny extrahovány 2 brambor.

Vynález se také týká proteinů a glykoproteinu získaných tak, že se

- rostliny promývají a melou,

- produkt se ředí ve vodném prostředí,

- získaná směs se tepelně koaguluje a

- produkt se čistí chromatografií.

Podle vynálezu se rostlinné hydrolysáty získají chemickou a/nebo enzymatickou hydrolýzou surových materiálů, jako je baví nik, sojové boby, pšenice nebo rýže. Obzvlášť dobrých výsledků se dosahuje s produkty řady HyPep™ (obchodní produkty společnosti Quest International), zejména s produkty obsahujícími vysoký podíl peptidu s molekulovou hmotností nižší než 1000 daltonů.

Podle vynálezu je prostředí pro propagaci a multiplikaci virů obzvlášť vhodné k multiplikaci virů na buňkách Věro.

Vynález se také týká prostředí pro propagaci a multiplíkaci virů obzvláště vhodného pro multiplikaci virů japonské encefalitidy, virů dětské obrny a vztekliny.

Způsob výroby virových vakcin, při kterém se viry produkují v buněčné kultuře, spočívá podle vynálezu v tom, že se fáze propagace a multiplikace viru provádí v přítomnosti prostředí, které je prosté lidského a zvířecího proteinu i rekombinantního původu a které obsahuje rostlinné extrakty.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis.

• 4

4 4 4

Prostředí neboli medium a způsob podle vynálezu se hodí k produkci všech virů, které jsou schopny replikace v buněčném kultivačním prostředí. Mohou to být zejména viry patřící do následujících rodin: orthorayxovirus, para myxovirus, reovírus, picornavirus, flavívirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus a adenoviry. Mohou to být také rekombinantní viry. Vynález se zejména hodí k produkci virů, které mohou tvořit část vakcinových prostředků a zejména vakcín pro lidi, u nichž jsou bezpečnostní požadavky maximální. Mohou to být obzvláště viry dětské obrny, vztekliny, japonské encefalitidy, žluté zimnice, zarděnek, příušnic, Dengovy horečky nebo spalniček, viry různých forem žloutenky, AIDS nebo planých neštovic, skupina virů způsobujících opary, viry chorob způsobených respíračnim syncytiálním virem, cytomegalovorusvirus, EBV, rotaviry nebo virus chřipky.

Vynález se obzvlášť dobře hodí k produkci virů, které jsou původci dětské obrny, vztekliny, japonské encefalitidy, zarděnek, planých neštovice, žloutenky typu A, chřipky, Dengovy horečky, spalniček nebo příušnic.

Buňkami, kterých je možno použít k výrobě virů podle vynálezu jsou všechny buňky, které se mohou mul tiplikovat v kultivačním prostředí a které jsou přístupné pro virus, který se má produkovat. Mohou to být buňky Věro, CV-1, LLC-MK2, MDCK, MDBK, WI-38, MRC5 (lidské fibroblasty) nebo buňky BHK.21 . Obzvláště dobrých výsledků se dosahujw s kulturami buněk Věro nebo MRC5.

Buněčná kultivace se může provádět různými způsoby; použitím kultivátoru buněk, válcových lahví, Rouxových baněk, zařízení Mul t i trays™ a Ce 1 1 -Cubes™ . Pro průmyslové účely se dává přednost pěstování buněk v buněčných kultivátorech za použití mikronosičů, jimiž jsou například kuličky Cytodex™.

9· 99 99

99 9 9 99 9

99 9 9 99 9

9 99999 99 9

9 9 9 9 9 9

99 99 99

Kultivaci buněk lze provádět za různých podmínek, zejména s ohledem na použité prostředí; podle vynálezu je způsob možný i když použité kultivační prostředí pro růstovou fázi buněk obsahuje sérum nebo alespoň ; lidské nebo zvířecí proteiny; v tom případě je ovšem nutné pečlivé promývání buněk před jejich infikováním, aby nepřišla na zmar výhoda způsobu podle vynálezu, kterou je vyloučení nebezpečí znečištění. Přednost se však dává použití kultur získaných z kultivačního prostředí, které je prosté proteinů lidského nebo zvířecího původu.

V závislosti mají produkovat, se viru očkovací látkou še uprostřed nebo ke se skutečně, že za zvláště uspokojivé.

na použitých buňkách a na virech, které se může lišit nejvýhodnější okamžik infekce viru. Obecně se tato operace provádí spíkonci exponenciální růstové fáze; ukázalo těchto podmínek jsou získané výsledky obPodie vynálezu je kultivační prostředí, použité pro propagaci a multiplikaci viru prosté lidských a zvířecích nebo rekombinantních proteinů, obsahuje však proteiny nebo glykoproteiny extrahované z brambor nebo z okurek, majících mitogenní potenciál a molekulovou hmotnost 1000 až 200 000 dal tonů a/nebo hydrolyzáty rostlinných extraktů. Toto prostředí je mediem, které může obsahovat všechny nebo část prvků běsně používaných k rozmnožování virů, jako je medium HAM F 12, které je však doplněno rostlinnými extrakty získanými například tak, že se

- redukuje rostlinná dřeň,

- získaná dřeň se zpracovává rozpouštědlem,

- rozpouštědlo se odpaří,

- získaný extrakt se čistí chromatografii.

Mytogenní potenciál proteinů nebo glykoproteinů, které se hodí k účelům podle vynálezu, lze vyhodnotit obzvláště použitím testů k analyse růstu buněk a mitogenní aktivity, jako je ·· ·« ·· ·· ·· «· · · · · ♦ * · · • ···· «·«· • · · · ·*· · · ·· · • ·· «···* vybarvovací Lest Μ.T.T.

Rostlinné extrakty, vhodné podle vynálezu, jsou zejména extrakty popsané ve francouzském patentovém spise číslo FR 2 732347. Použít lze také obchodních produktů GCR1003, TCR1005 nebo BCR100S (společnost Biomedia) samotných nebo v kombinaci, nebo produktu Prolifix (téže společnosti), který obsahuje všechny živné prvky běžného kultivačního prostředí HAM F 12 doplněného vhodnými rostlinnými extrakty.

Alternativně je možno použít běžného kultivačního prostředí a HAM F 12 doplněného rostlinnými hydrolyzáty, jako jsou produkty HyPep™, v množství 5 g/1 .

Také je možno použít kutivačního prostředí obsahujícího jak proteiny nebo glykoproteiny, získané tepelnou koagulací rostlinné dřeně, tak rostlinných, shora uvedených hydrolyzátů.

Kromě toho je možno přidat do tohoto prostředí, kterýkoli jiný prvek, který může zlepšit nebo usnadnit jednu z následujících operací vedoucích k produkci vakciny, pokud je možná mírná modifikace tohoto prostředí bez změn jeho vlastností.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba vakcin proti japonské encefalitidě

K výrobě virů, které jsou příčinou japonské encefalitidy, se použije buněk Věro. Použité buňky jsou odvozeny od kmene, jehož distribucí se zabývá organizace ATCC (American Type Cul ture Collection) pod číslem ATCC-CCL 81-VĚRO F 1415, který je

I ·« ·· ·· ·· • · · ♦ » ···« • «·«· «««* » * · · «·· · · ·· · «· *« ve 124 pasáši a byl převeden obvyklým způsobem do pasáže 137. Žádaným produktem je vir kmene P3 v 88. pasáši dodávané NVSI.

Nádrž buněčného kultivátoru o objemu 15 litrů se naplní mediem Iscove, doplněným telecím sérem obsahujícím ciikronosiče Cytodex 1™ v množství 3,5 g/ 1 . Medium se naočkuje očkovací látkou buněk Věro v množství 200 000 buněk na 1 ml.

Kultura se zesílí a subkultivuje dvakrát týdně každý 4. a 5. den. Koncentrace lískaných buněk je 2xl0⁶ až 3x10^ na 1 ml. Získaná buněčná suspense se pak prapláchne mediem pro propagaci viru k maximálnímu odstranění zbylého telecího séra.

K vyzkoušení media podle vynálezu v porovnání s mediem podle stavu techniky se provádí paralelní proces v několika stejných buněčných kultivátorech se dvěma různými médi i ^:

- medium podle vynálezu sestávající z media HAM F 12 (Life Technologies Gibco) doplněného mediem Prolifix XI (Biomedia) v desetinásobné koncentraci oproti jejich katalogu z roku 1996 v poměrech 1 objem 10-násobně zkoncentrovaného Prolifixu II na 10 objemů HAM F 12.

- medium podle stavu techniky sestávající z media Iscive (Life Technologies Gibco) doplněného lidským albuminem k dosažení konečné 0,3% koncentrace albuminu v mediu.

Po propláchnutí se do každého buněčného kultivátoru zavede virová očkovací látka v množství odpovídajícím Μ0Ι ( Mul tipl icity Of Infection) 1/6000.

Obsahy buněčných kultivátorů se pak nechají míchat 3 dny při teplotě 37 C, načeš se provede 1. sklizeň za zpětného získání media pro propagaci viru, které se stalo virovou suspensí, která se vrátí do každého buněčného kultivátoru se stejným množstvím čerstvého media stejné povahy; každých 24 hodin se sklízí až do získání 5 sklizní. Každá sklizeň se «φ • · « ♦ · · · · ♦ · • · 9 · *···>·· * · · • 9 9 9 9 9 9 9 ·

Ρι·Φ ♦··· ·* ·* ·· *· zfiltruje přes filtr s nejnišší hodnotou 0,22 μιη a uloží se o

při teplotě +5 C až do smísení se 4 dalšími sklizněmi ze stejného buněčného kultivátoru.

Po provedení 5 sklizní se sklizně spolu smísí a tato směs se zkoncentruje filtrací 100-násobně. Směs sestávající z pěti sklizní ze stejného buněčného kultivátoru tvoří šarži.

Ke zjištění množství prodkovaných virů se provede test infekční aktivity každé vyrobené šarže. Test se provádí dvěma různými způsoby buď infekční aktivitou naměřenou na buněčné vrstvě, nebo infekční aktivitou naměřenou v myších intracerebrální inokulací myší, pozorováním zvířat 14 dní a vypočtením LD50.

Výsledky se vyjadřují jako log 10 infekčních částic na litr buněčného kultivátoru. Střední hodnota, získaná titrací pro různé vyprodukované šarže s použitím media podle vynálezu, je 8,84, zatímco střední hodnota, získaná Ze šarží vyprodukovaných za použití media podle dosavadního stavu techniky, je 7,85. Střední hodnoty výsledků získaných titrací v případě myší pro šarže podle vynálezu je tentokrát 9,22, zatímco střední hodnota ze šarží, vyprodukovaných pomocí media podle stavu techniky, je 9,30. Dospělo se tedy k neočekávanému poznatku, že výsledky, získané s mediem podle vynálezu, jsou rovnocenné s výsledky získanými s mediem podle stavu techniky, přičemž by se dalo čekat, že deficit albuminu, což je protein, považovaný za výzmný pro transport elementů živin uvnitř buňky, povede ke značnému poklesu množství produkovaných virů.

Získané šarže se pak inaktivují formaldehydovým roztokem v množství odpovídajícím konečné koncentraci ve směsi 1/4000 a ponecháním při teplotě místnosti 14 dní za stálého míchání. 0věření inaktivace pomocí kontrol protokolu doporučeného WHO (Technical Bulletin 771 z roku 1988) ukázala, že vyrobené šar10 •

• ···· «· » · • · • · · • · ··

9 • ·

S · ··· • r

9· • · • · • · • · »· • · • · • » • · *· že splňují doporučení WHO.

Tyto inaktivované šarže se čistí iontovou výměnnou chromatografií a filtrací gelu k odstranění všech obsažených virových proteinů a zbylých nečistot, které jsou ve vakcínách nežádoucí . Získaná směs se formuluje k produkci vakcinových dávek, Dobrá jakost vyrobených vakcín se ověřuje testem imunogenicity v myších podle doporučení WHO pro vakciny proti japonské encefalitidě, který je založen na určení množství neutralizujících protilátek, produkovaných v imunizovaných nyšíďn. Jelikož aktivita vakcin, vyrobených způsobem podle vynálezu, není nižší než vakcin podle stavu techniky, je potvrzena možnost použití způsobu podle vynálezu pro produkci virové vakciny za podmínek zvýšené bezpečnosti s vynecháním albuminu.

Příklad 2

Porovnání různých prostředí podle vynálezu

K porovnávacímu vyzkoušení různých prostředí se použije

150 cm³ baněk naplněných 50 ml media Iscove, doplněného 4 Z telecího séra. Toto prostředí se naočkouje buňkami Věro ve množství 250 000 ouněk/cm³. Baňky se nechají stát 4 až 5 dní při teplotě 37 C, multiplikaci virů.

načež se pokropí mediem pro propagaci a

Použitými medii jsou:

- prostředí A, které je mediem podle stavu techniky, sestávajícím z media Iscove (Life Technologies Gibco), doplněným lidským albuminem na konečnou koncentraci albuminu 0,3 %,

- prostředí B, sestávající z media HAM F 12, doplněného následujícími mitogenními molekulami:

x BCR 1008 v množství 10³ g/1, x TCR 1005 v množství 10~⁴ g/1, x GCR 1003 v množství 10‘⁴ g/1,

- prostředí C, sestávající z uvedeného media (HAM F 12, dopl- 11 • · ttt • ·

něného BCR 1008, TCR 1005 a GCR 1003), avšak obsahující také 1 g/1 produktu HyPep 4602, který sestává z glutenového hydrolyzátu (produkt společností Questel International),

- prostředí C , které je totožné s prostředím C, avšak s obsahem HyPep 4602 5 g/1,

- prostředí D, sestávající z media HAM P 12, doplněného HyPep 4602 v množství 1 g/1, avšak bez mitogenních molekul BCR 1008, TCR 1005 nebo GCR 1003,

- prostředí DS , které je totožné s prostředím D, avšak s obsahem HyPep 4602 5 g/1.

Po propláchnutí se do každé baňky zavede očkovací látka viru japonské encefalitidy, totožná s očkovací látkou z předchozího příkladu, v množství odpovídajícím Μ0Ι 1/6000.

o

Obsahy baněk se pak nechají stát 3 dny při teplotě 37 C před provedením první sklizně. Další sklizně se provádějí stejně jako podle předchozího příkladu.

Testy ke stanovení infekčního titru se provádějí na buňkách BHK21 s následujícími výsledky vyjádřenými jako TCIDso/ml (log 10);

prostředí A 4,6 prostředí B 5,1 prostředí C 5,0 prostředí C 5,6 prostředí D 5,4 prostředí D 6,3.

Tyto výsledky potvrzují, že prostředí podle vynálezu umožňuje získat výtěžky, které jsou stejně dobré, ne-li lepší, než prostředí podle dosavadního stavu techniky, obsahující albumin.

Příklad 3

Výroba vakciny proti vzteklině

V kultivátoru o obsahu dva litry se připraví kultura buněk Věro v konvenčním prostředí a po promytí se buňky infikují virem vztekliny s MOI 1/1000 a udržují se v prostředí, které je totožné s prostředím popsaným v příkladu 1 (tedy medium ΗΆΜ F 12 doplněné Profilixea™ II); tentýž pokus se provede úplně stejným způsoben v jiném kultivátoru téhož objemu, s jediným rozdílem, že medium pro propagaci a multiplikaci virů je podle dosavadního stavu techniky a obsahuje lidský albumin. Sklizně se konají postupně 4., 5., 6. a 7. den po infikování, Součty, provedené u sklizní získaných s použitím prostředí podle vynálezu. umožňují získat porovnatelné výsledky pro obě prostředí; infekční titry získaných virů jsou podobně totožné.

Tyto výsledky tak dokazují proti vzteklině na buňkách.

možnost pěstování vakciny

Př i k iad 4

Výroba vakciny proti dětské obrně

Provedou se testy výroby víru polyomyelitis typu 1 na kultuře buněk Věro. Infekční titry virů. získané za použití prostředí pro propagaci a multiplikaci virů podle vynálezu, majícího složení podle příkladu 1, jsou reovnocenné s průměrem infekčních titrů získaných u sklizní provedených s prostředím použitým k výrobě běžně obchodně dostupných vakcin.

Průmyslová využitelnost

Výroba vakciny proti různým virům za použití prostředí bez přísady lidského albuminu.

Claims (7)

1. NOVE PATENTOVÉ NÁROKY (vypracované podle předběžného mezinárodního průzkumu)

   1. Použití kultivačního prostředí, které je prosté lidského nebo zvířecího proteinu- i rekombinantního původu, a které obsahuje rostlinné extrakty pro propagaci a multiplikací virů v buněčné kultuře.
2. 2. Použití podle nároku 1 prostředí obsahujícího mitogenní proteiny nebo glykoproteiny extrahované z brambor nebo okurek.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2 rostlinných extraktů získaných tak, že se

   - rostliny promývají a melou,

   - produkt se ředí ve vodném prostředí,

   - získaná směs se tepelně koaguluje a

   - produkt se čistí chromatografií.
4. 4. Použití podle nároku 1 až 3 kultivačního prostředí obsahujícího hydrolyzáty rostlinných výtažků.
5. 5. Použití podle nároku 1 až 4 jako nosičů pro propagaci a multiplikaci virů buněk Věro.
6. 6. Použití podle nároku i až 5 pro produkci virů japonské encefalitidy, vztekliny, dětské obrny, žloutenky typu A, chřipky, Dengovy horečky, příušnic, planých neštovic a zarděnek .
7. 7. Použití podle nároku 1 až 6 pro produkci virů japonské encefalitidy pro vakcíny pro lidi.