CZ20003327A3

CZ20003327A3 - Virus promotion and multiplication environment and virus propagation and multiplication

Info

Publication number: CZ20003327A3
Application number: CZ20003327A
Authority: CZ
Inventors: Pierre Heimindinger
Original assignee: Aventis Pasteur
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 1999-03-15
Publication date: 2001-02-14

Abstract

Použití kultivačního prostředí, které je prosté lidských nebo zvířecích proteinů i proteinů rekombinantního původu, a které obsahuje rostlinné extrakty pro propagaci a multiplikaci virů v buněčných kulturách.The use of a culture medium that is free of human or animal proteins as well as proteins of recombinant origin, and that contains plant extracts for the propagation and multiplication of viruses in cell cultures.

Description

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká prostředí pro propagaci a multiplikaci virů a způsobu propagace a multiplikace virů na buňkách v kultuře, zejména k výrobě vakcin.The invention relates to an environment for propagation and multiplication of viruses and to a method for propagation and multiplication of viruses on cells in culture, in particular for the production of vaccines.

Dosavadnístav techn i kyTechnical background

Výroba virových vakcin, at jednoduše zeslabených, inaktivovaných, subjednotek nebo rekoabinantů, zahrnuje produkci virů ve velkém měřítku.Production of viral vaccines, whether simply attenuated, inactivated, subunits or recoabinants, involves the production of large-scale viruses.

Tato výroba se může provádět v závislosti na povaze viru na různých nosičích, které umožňují replikaci viru: tak například pro většinu běžně obchodně dostupných protichřipkových vakcin, se proliferace viru provádí na nasazených slepicích vejcích, zatímco pro některé vakciny proti japonské encefalitidě se tato operace provádí na myších mozcích.This production can be carried out depending on the nature of the virus on various carriers that allow virus replication: for example, for most commercially available influenza vaccines, virus proliferation is performed on seeded hen eggs, while for some Japanese encephalitis vaccines, this operation is performed on mouse brains.

Používání takových nosičů naráží na řadu problémů: dostupnost, reprodukovatelnost, avšak hlavně bezpečnost vlivem možných znečištění viry, myoplasmy nebo jakýmíkoli jinými nežádoucími elementy pocházejícími z nosiče. Vzrůstá tedy úsilí o opouštění takových nosičů a kdekoli je to možné, používá se buněčných kultur, které se infikují malým množstvím viru, který se má produkovat a který se pak udržuje v podmínkách, které podporují replikaci viru uvnitř infikovaných buněk jakož také propagaci infekce z jedné buňky na druhou. Vyprodukované viry se pak shromáždí buď z kultivačního prostředí, které je buněčnou lázní, když jde o intrace1ulárni viry, které buňku opustí (což má hlavně tu výhodu, že umožní provádět několik sklizní viru se stejnou kulturou buněk), nebo zpracováním buněk samot• · · · » · · · ► ♦ # · » · · » · · • · « • · · • · · » · · ných, když jde o intracelulární viry.The use of such carriers encounters a number of problems: availability, reproducibility, but mainly safety due to possible contamination by viruses, myoplasm or any other undesirable elements originating from the carrier. Thus, there is an increasing effort to abandon such carriers, and wherever possible, cell cultures are used which are infected with a small amount of the virus to be produced and which are then maintained under conditions that promote virus replication within infected cells as well as propagate infection from one. cells squared. The produced viruses are then collected either from the cell bath culture medium for intracellular viruses that leave the cell (which has the advantage of allowing several virus harvests with the same cell culture) or by processing the cells alone. When it is an intracellular virus, these are intracellular viruses.

Pro tyto způsoby jsou nutné buněčné kultury dobré kvality; četné dosavadní vývojové práce se tedy zabývají zlepšováním buněčných kultur a zejména použitých kultivačních prostředí.Good quality cell cultures are required for these methods; Numerous development work to date has been concerned with improving cell cultures and, in particular, the culture media used.

K omezení nebezpečí znečištění buněk layoplasmy, viry, činidly hovězí spongiósní encefalopat ie, nebo jakýmikoli jinými neobvyklými přenosnými činidly se navrhovalo použití kultivačních prostředí prostých séra a dokonce prostých proteinů (zveřejněná přihláška vynálezu číslo VÍO 96/15231). Je popsáno použití buněčného kultivačního prostředí prostého zvířecího séra, obsahujícího však rostlinné extrakty (francouzský patentový spis číslo FR 2 732347).To reduce the risk of contamination of cells with layoplasms, viruses, bovine spongiosis encephalopathy agents, or any other unusual transmissible agents, it has been proposed to use serum-free and even protein-free culture media (published patent application WO 96/15231). The use of an animal serum-free cell culture medium, but containing plant extracts, is described (French Patent FR 2 732347).

Při používání takových prostředí pro kultivaci buněk, vzrůstá bezpečnost produktů získaných za použití takto produkovaných buněk.When using such cell culture environments, the safety of the products obtained using the cells so produced increases.

Avšak jde-li o výrobu virů tvořících součást vakci nových prostředků, postupy, které následují po této fázi kultivace buněk, by měly také samy vykazovat maximální stupeň bezpečnosti.However, when it comes to the production of viruses forming part of the vaccine of new agents, the procedures that follow this stage of cell culture should also exhibit a maximum degree of safety.

Obvykle (například americký patentový spis číslo 4 525349) když se používá buněk v kultivačním prostředí k produkci virů, jakmile se jednou provede kultivační fáze, odstraní se prostředí, kterého bylo použito ke kultivaci buněk a nahradí se novým prostředím, ve kterém se buňky určitou dobu koupou k promytí; toto nové prostředí se pak odstraní; tento proces promývání buněk se může popřípadě několikrát opakovat.Usually (for example, U.S. Pat. No. 4,525,549), when cells are used in a culture medium to produce viruses, once the culture phase is performed, the medium that was used to cultivate the cells is removed and replaced with a new medium in which the cells bath to wash; this new environment is then removed; this cell washing process can optionally be repeated several times.

Pak se do buněčné kultury zavede nové prostředí, které napřed umožní, aby buňky přežily a byly infikovány viry a za druhé je třeba mít k disposici prvky, které postačí jako nosiče k replikaci těchto virů. Avšak, jak je známo z literatury (Protein-free culture of Věro cells: A substráte for replica• 4A new environment is then introduced into the cell culture which first allows the cells to survive and be infected with viruses, and secondly, elements that are sufficient as carriers to replicate these viruses must be available. However, as is known in the literature (Protein-free culture of Vero cells: A substrate for replica • 4

• · *• · *

4 4 ·· • 4 444 4 ·· • 4 45

4 4 44 4 4

44 tíon of human pathogenic viruses Cell Biology International, sv. 17, č. 9, str. 885 až 895, 1993), i když se buňky kultivují v prostředí prostém proteinu, kultivační prostředí použité podle dosavadního stavu techniky v tomto stupni mul tipl ikace a propagace viru sprav idl a obsahuje sárodečné telecí sérum, nebo k omezení problémů se znečištěním, alespoň lidský albumin. Použití lidského albuminu v tomto stupni způsobu výroby virových vakcin se považuje sa prosté rizika pro kvalitu vakcíny. Avšak v 2ájmu úplného vyloučení všeho nebe2pečí, i teoretického, by bylo žádoucí mít prostředí, které je vhodné pro propagaci a multiplikaci virů na nosiči sestávajícím s buněčného kultivačního prostředí. které je prosté lidského nebo zvířecího proteinu i rekombinantního původu, ale které nicméně umožňuje produkční výsledky, které jsou kompatibilní s průmyslovými požadavky nesvyšovat náklady výroby vakcin obsahujících viry, pěstované na bunčných kulturách.44 thion of human pathogenic viruses Cell Biology International, Vol. 17, no. 9, pp. 885-895 (1993)), although the cells are cultured in a protein-free environment, the culture medium used according to the prior art at this stage of mulching and propagation of the pathogenic virus and contains salifying calf serum, or to reduce pollution problems, at least human albumin. The use of human albumin at this stage of the process for the production of viral vaccines is considered to be free from the risk for vaccine quality. However, in the interests of completely eliminating everything that is baking, even theoretical, it would be desirable to have an environment that is suitable for propagation and multiplication of viruses on a carrier consisting of a cell culture medium. which is free of human or animal protein and of recombinant origin, but which nevertheless allows production results that are compatible with industrial requirements not to increase the cost of producing virus-containing vaccines grown on cell cultures.

Úkolem vynálezu je zejména vyvinout takové prostředí. Ukoiem vynálezu je také vyvinout takovéto prostředí a způsob propagace a mul tipl ikace virů, který popřípadě umožni inaktivaci viru.In particular, it is an object of the invention to provide such an environment. It is also an object of the present invention to provide such an environment and method of virus propagation and mulching that optionally allows virus inactivation.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Prostředí pro propagaci a multiplikaci virů na buňkách v kultivačním prostředí spočívá podle vynálezu v tom, že je prosté lidského i sví řečí ho proteinu i rekombinantního původu a obsahuje extrakty s rostlin.The medium for propagation and multiplication of viruses on cells in the culture medium is according to the invention in that it is free of both human protein and recombinant origin and contains plant extracts.

Podle jednoho provedení vynálezu obsahuje prostředí k propagaci a multiplikaci virů proteiny nebo glykoproteiny extrahované s brambor a s okurek, mající aitogenní potenciál a molekulovou hmotnost 1000 až 200 000 daltonů.According to one embodiment of the invention, the virus propagation and multiplication environment comprises proteins or glycoproteins extracted from potato and cucumber having an aitogenic potential and a molecular weight of 1000 to 200,000 daltons.

Podle jiného provedení vynálezu obsahuje prostředí rošt99 99 99 99According to another embodiment of the invention, the environment comprises a grate 99 99 99 99

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

999 99 99 · • · 9 · · 9999 99 99 · 9 9

99 99 9999 99 99

1inné hydroiyzáty.1in hydrolysates.

Podle ještě jiného provedení vynálezu jsou proteiny nebo g1ykoproteiny extrahovány 2 brambor.According to yet another embodiment of the invention, the proteins or glycoproteins are extracted with 2 potatoes.

Vynález se také týká proteinů a glykoproteinu získaných tak, že seThe invention also relates to proteins and glycoproteins obtained by the method of the invention

- rostliny promývají a melou,- the plants are washed and ground,

- produkt se ředí ve vodném prostředí,- the product is diluted in an aqueous medium,

- získaná směs se tepelně koaguluje athe mixture obtained is thermally coagulated, and

- produkt se čistí chromatografií.- the product is purified by chromatography.

Podle vynálezu se rostlinné hydrolysáty získají chemickou a/nebo enzymatickou hydrolýzou surových materiálů, jako je baví nik, sojové boby, pšenice nebo rýže. Obzvlášť dobrých výsledků se dosahuje s produkty řady HyPep™ (obchodní produkty společnosti Quest International), zejména s produkty obsahujícími vysoký podíl peptidu s molekulovou hmotností nižší než 1000 daltonů.According to the invention, plant hydrolysates are obtained by chemical and / or enzymatic hydrolysis of raw materials such as nickel, soybeans, wheat or rice. Particularly good results are obtained with HyPep ™ (Quest International) products, particularly those containing a high proportion of peptides with a molecular weight of less than 1000 daltons.

Podle vynálezu je prostředí pro propagaci a multiplikaci virů obzvlášť vhodné k multiplikaci virů na buňkách Věro.According to the invention, the virus propagation and multiplication environment is particularly suitable for multiplying viruses on Vero cells.

Vynález se také týká prostředí pro propagaci a multiplíkaci virů obzvláště vhodného pro multiplikaci virů japonské encefalitidy, virů dětské obrny a vztekliny.The invention also relates to an environment for propagation and multiplication of viruses particularly suitable for multiplying Japanese encephalitis viruses, polio and rabies viruses.

Způsob výroby virových vakcin, při kterém se viry produkují v buněčné kultuře, spočívá podle vynálezu v tom, že se fáze propagace a multiplikace viru provádí v přítomnosti prostředí, které je prosté lidského a zvířecího proteinu i rekombinantního původu a které obsahuje rostlinné extrakty.According to the invention, a process for the production of viral vaccines in which the viruses are produced in a cell culture consists in carrying out the virus propagation and multiplication phase in the presence of an environment which is free of human and animal protein and of recombinant origin and which contains plant extracts.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis.The following detailed description illustrates the invention.

• 4• 4

4 4 44 4 4

Prostředí neboli medium a způsob podle vynálezu se hodí k produkci všech virů, které jsou schopny replikace v buněčném kultivačním prostředí. Mohou to být zejména viry patřící do následujících rodin: orthorayxovirus, para myxovirus, reovírus, picornavirus, flavívirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus a adenoviry. Mohou to být také rekombinantní viry. Vynález se zejména hodí k produkci virů, které mohou tvořit část vakcinových prostředků a zejména vakcín pro lidi, u nichž jsou bezpečnostní požadavky maximální. Mohou to být obzvláště viry dětské obrny, vztekliny, japonské encefalitidy, žluté zimnice, zarděnek, příušnic, Dengovy horečky nebo spalniček, viry různých forem žloutenky, AIDS nebo planých neštovic, skupina virů způsobujících opary, viry chorob způsobených respíračnim syncytiálním virem, cytomegalovorusvirus, EBV, rotaviry nebo virus chřipky.The medium or medium and the method of the invention are suitable for the production of all viruses capable of replication in a cell culture medium. In particular, they may be viruses belonging to the following families: orthorayxovirus, para myxovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus and adenoviruses. They may also be recombinant viruses. The invention is particularly suited for the production of viruses which may form part of vaccine compositions and, in particular, vaccines for humans in which safety requirements are maximized. These may be in particular polio, rabies, Japanese encephalitis, yellow fever, rubella, mumps, Deng fever or measles, various forms of jaundice, AIDS or chickenpox, a group of herpes-causing viruses, respiratory syncytial virus diseases, cytomegalovorusvirus, EBV , rotavirus or influenza virus.

Vynález se obzvlášť dobře hodí k produkci virů, které jsou původci dětské obrny, vztekliny, japonské encefalitidy, zarděnek, planých neštovice, žloutenky typu A, chřipky, Dengovy horečky, spalniček nebo příušnic.The invention is particularly well suited for producing polio, rabies, Japanese encephalitis, rubella, varicella, hepatitis A, influenza, Deng fever, measles or mumps viruses.

Buňkami, kterých je možno použít k výrobě virů podle vynálezu jsou všechny buňky, které se mohou mul tiplikovat v kultivačním prostředí a které jsou přístupné pro virus, který se má produkovat. Mohou to být buňky Věro, CV-1, LLC-MK2, MDCK, MDBK, WI-38, MRC5 (lidské fibroblasty) nebo buňky BHK.21 . Obzvláště dobrých výsledků se dosahujw s kulturami buněk Věro nebo MRC5.The cells which can be used for the production of the viruses according to the invention are all cells which can be tipped in the culture medium and which are accessible to the virus to be produced. These may be Vero, CV-1, LLC-MK2, MDCK, MDBK, WI-38, MRC5 (human fibroblasts) or BHK.21 cells. Particularly good results are obtained with Vero or MRC5 cell cultures.

Buněčná kultivace se může provádět různými způsoby; použitím kultivátoru buněk, válcových lahví, Rouxových baněk, zařízení Mul t i trays™ a Ce 1 1 -Cubes™ . Pro průmyslové účely se dává přednost pěstování buněk v buněčných kultivátorech za použití mikronosičů, jimiž jsou například kuličky Cytodex™.Cell culture can be performed in various ways; using a cell cultivator, roller flasks, Roux flasks, Mul t Trays ™, and Ce11 -Cubes ™. For industrial purposes, it is preferred to cultivate the cells in cell cultivators using microcarriers such as Cytodex ™ beads.

9· 99 999 99 99

99 9 9 99 999 9 9

9 99999 99 99 99998 99 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

99 99 9999 99 99

Kultivaci buněk lze provádět za různých podmínek, zejména s ohledem na použité prostředí; podle vynálezu je způsob možný i když použité kultivační prostředí pro růstovou fázi buněk obsahuje sérum nebo alespoň ; lidské nebo zvířecí proteiny; v tom případě je ovšem nutné pečlivé promývání buněk před jejich infikováním, aby nepřišla na zmar výhoda způsobu podle vynálezu, kterou je vyloučení nebezpečí znečištění. Přednost se však dává použití kultur získaných z kultivačního prostředí, které je prosté proteinů lidského nebo zvířecího původu.The cultivation of the cells can be carried out under various conditions, in particular with regard to the medium used; according to the invention, the method is possible even if the cell growth medium used comprises serum or at least; human or animal proteins; in this case, however, careful washing of the cells prior to their infection is necessary in order not to frustrate the advantage of the method according to the invention, which is to eliminate the risk of contamination. However, it is preferred to use cultures obtained from a culture medium which is free of proteins of human or animal origin.

V závislosti mají produkovat, se viru očkovací látkou še uprostřed nebo ke se skutečně, že za zvláště uspokojivé.Depending on the produce, the virus vaccine is in the middle or ke actually be considered particularly satisfactory.

na použitých buňkách a na virech, které se může lišit nejvýhodnější okamžik infekce viru. Obecně se tato operace provádí spíkonci exponenciální růstové fáze; ukázalo těchto podmínek jsou získané výsledky obPodie vynálezu je kultivační prostředí, použité pro propagaci a multiplikaci viru prosté lidských a zvířecích nebo rekombinantních proteinů, obsahuje však proteiny nebo glykoproteiny extrahované z brambor nebo z okurek, majících mitogenní potenciál a molekulovou hmotnost 1000 až 200 000 dal tonů a/nebo hydrolyzáty rostlinných extraktů. Toto prostředí je mediem, které může obsahovat všechny nebo část prvků běsně používaných k rozmnožování virů, jako je medium HAM F 12, které je však doplněno rostlinnými extrakty získanými například tak, že seon the cells used and on viruses which may differ at the most advantageous moment of virus infection. Generally, this operation is performed at the end of the exponential growth phase; The present invention is a culture medium used to propagate and multiply virus free from human and animal or recombinant proteins, but contains proteins or glycoproteins extracted from potatoes or cucumbers having a mitogenic potential and a molecular weight of 1000 to 200,000 daltons and / or hydrolyzates of plant extracts. This medium is a medium that may contain all or part of the elements commonly used for virus propagation, such as HAM F 12 medium, but which is supplemented by plant extracts obtained, for example, by

- redukuje rostlinná dřeň,- reduces the pulp,

- získaná dřeň se zpracovává rozpouštědlem,- the pulp obtained is treated with a solvent,

- rozpouštědlo se odpaří,- the solvent is evaporated,

- získaný extrakt se čistí chromatografii.- the extract obtained is purified by chromatography.

Mytogenní potenciál proteinů nebo glykoproteinů, které se hodí k účelům podle vynálezu, lze vyhodnotit obzvláště použitím testů k analyse růstu buněk a mitogenní aktivity, jako je ·· ·« ·· ·· ·· «· · · · · ♦ * · · • ···· «·«· • · · · ·*· · · ·· · • ·· «···* vybarvovací Lest Μ.T.T.The myogenic potential of proteins or glycoproteins suitable for the purposes of the invention can be evaluated, in particular, using assays to analyze cell growth and mitogenic activity, such as: ···· · · · · · · · · · · · · ··· · Coloring Lest T.TT

Rostlinné extrakty, vhodné podle vynálezu, jsou zejména extrakty popsané ve francouzském patentovém spise číslo FR 2 732347. Použít lze také obchodních produktů GCR1003, TCR1005 nebo BCR100S (společnost Biomedia) samotných nebo v kombinaci, nebo produktu Prolifix (téže společnosti), který obsahuje všechny živné prvky běžného kultivačního prostředí HAM F 12 doplněného vhodnými rostlinnými extrakty.The plant extracts suitable according to the invention are, in particular, those described in French patent specification FR 2,732347. Commercial products GCR1003, TCR1005 or BCR100S (Biomedia) alone or in combination, or Prolifix (the same company) containing all nutrient elements of conventional culture medium HAM F 12 supplemented with suitable plant extracts.

Alternativně je možno použít běžného kultivačního prostředí a HAM F 12 doplněného rostlinnými hydrolyzáty, jako jsou produkty HyPep™, v množství 5 g/1 .Alternatively, a conventional culture medium and HAM F 12 supplemented with plant hydrolysates such as HyPep ™ products may be used in an amount of 5 g / L.

Také je možno použít kutivačního prostředí obsahujícího jak proteiny nebo glykoproteiny, získané tepelnou koagulací rostlinné dřeně, tak rostlinných, shora uvedených hydrolyzátů.It is also possible to use a culture medium containing both proteins or glycoproteins obtained by thermal coagulation of the plant pulp as well as the plant hydrolysates mentioned above.

Kromě toho je možno přidat do tohoto prostředí, kterýkoli jiný prvek, který může zlepšit nebo usnadnit jednu z následujících operací vedoucích k produkci vakciny, pokud je možná mírná modifikace tohoto prostředí bez změn jeho vlastností.In addition, any other element that can improve or facilitate one of the following operations to produce the vaccine may be added to the environment, provided that a slight modification of the environment is possible without altering its properties.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.The invention is illustrated by the following examples.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Výroba vakcin proti japonské encefalitiděProduction of vaccines against Japanese encephalitis

K výrobě virů, které jsou příčinou japonské encefalitidy, se použije buněk Věro. Použité buňky jsou odvozeny od kmene, jehož distribucí se zabývá organizace ATCC (American Type Cul ture Collection) pod číslem ATCC-CCL 81-VĚRO F 1415, který jeVěro cells are used to produce viruses that cause Japanese encephalitis. The cells used are derived from an ATCC (American Type Culure Collection) strain, ATCC-CCL 81-VERO F 1415, which is

I ·« ·· ·· ·· • · · ♦ » ···« • «·«· «««* » * · · «·· · · ·· · «· *« ve 124 pasáši a byl převeden obvyklým způsobem do pasáže 137. Žádaným produktem je vir kmene P3 v 88. pasáši dodávané NVSI.I «· · · · · · · · ve ve 124 124 ve 124 124 124 124 ve 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 The desired product is the strain P3 virus in passage 88 supplied by NVSI.

Nádrž buněčného kultivátoru o objemu 15 litrů se naplní mediem Iscove, doplněným telecím sérem obsahujícím ciikronosiče Cytodex 1™ v množství 3,5 g/ 1 . Medium se naočkuje očkovací látkou buněk Věro v množství 200 000 buněk na 1 ml.The 15-liter cell cultivator tank is filled with Iscove medium supplemented with calf serum containing Cytodex 1 ™ cicotransmitters at 3.5 g / L. The medium is inoculated with a Vero cell inoculum of 200,000 cells per ml.

Kultura se zesílí a subkultivuje dvakrát týdně každý 4. a 5. den. Koncentrace lískaných buněk je 2xl0⁶ až 3x10^ na 1 ml. Získaná buněčná suspense se pak prapláchne mediem pro propagaci viru k maximálnímu odstranění zbylého telecího séra.The culture is amplified and subcultured twice a week every 4 and 5 days. The concentration of the lysed cells is ² x 10 ⁶ to 3 x 10 ⁶ per ml. The cell suspension obtained is then rinsed with virus propagation medium to maximize removal of the remaining calf serum.

K vyzkoušení media podle vynálezu v porovnání s mediem podle stavu techniky se provádí paralelní proces v několika stejných buněčných kultivátorech se dvěma různými médi i ^: To test the medium according to the invention in comparison with the medium according to the prior art, a parallel process is carried out in several identical cell cultivators with two different mediums ^:

- medium podle vynálezu sestávající z media HAM F 12 (Life Technologies Gibco) doplněného mediem Prolifix XI (Biomedia) v desetinásobné koncentraci oproti jejich katalogu z roku 1996 v poměrech 1 objem 10-násobně zkoncentrovaného Prolifixu II na 10 objemů HAM F 12.- a medium according to the invention consisting of HAM F 12 medium (Life Technologies Gibco) supplemented with Prolifix XI medium (Biomedia) at ten times the concentration of their 1996 catalog in ratios of 1 volume 10 times concentrated Prolifix II per 10 volumes HAM F 12.

- medium podle stavu techniky sestávající z media Iscive (Life Technologies Gibco) doplněného lidským albuminem k dosažení konečné 0,3% koncentrace albuminu v mediu.a prior art medium consisting of Iscive medium (Life Technologies Gibco) supplemented with human albumin to achieve a final 0.3% albumin concentration in the medium.

Po propláchnutí se do každého buněčného kultivátoru zavede virová očkovací látka v množství odpovídajícím Μ0Ι ( Mul tipl icity Of Infection) 1/6000.After rinsing, a virus vaccine of zaved0Ι (Mul tipality of Infection) 1/6000 is introduced into each cell cultivator.

Obsahy buněčných kultivátorů se pak nechají míchat 3 dny při teplotě 37 C, načeš se provede 1. sklizeň za zpětného získání media pro propagaci viru, které se stalo virovou suspensí, která se vrátí do každého buněčného kultivátoru se stejným množstvím čerstvého media stejné povahy; každých 24 hodin se sklízí až do získání 5 sklizní. Každá sklizeň se «φ • · « ♦ · · · · ♦ · • · 9 · *···>·· * · · • 9 9 9 9 9 9 9 ·The contents of the cell cultivators are then allowed to stir for 3 days at 37 ° C, after which 1. harvesting is performed to recover the virus propagation medium which has become a viral suspension which is returned to each cell cultivator with the same amount of fresh medium of the same nature; they are harvested every 24 hours until 5 harvests are obtained. Each harvest with 9 * 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Ρι·Φ ♦··· ·* ·* ·· *· zfiltruje přes filtr s nejnišší hodnotou 0,22 μιη a uloží se oPřesι · Φ ♦ ··· · * · * ·· * · filters through a filter with the lowest value of 0.22 μιη and is stored by

při teplotě +5 C až do smísení se 4 dalšími sklizněmi ze stejného buněčného kultivátoru.at + 5 ° C until mixed with 4 additional harvests from the same cell cultivator.

Po provedení 5 sklizní se sklizně spolu smísí a tato směs se zkoncentruje filtrací 100-násobně. Směs sestávající z pěti sklizní ze stejného buněčného kultivátoru tvoří šarži.After 5 harvests, the harvests were mixed together and the mixture was concentrated by filtration 100-fold. The mixture consisting of five harvests from the same cell cultivator forms a batch.

Ke zjištění množství prodkovaných virů se provede test infekční aktivity každé vyrobené šarže. Test se provádí dvěma různými způsoby buď infekční aktivitou naměřenou na buněčné vrstvě, nebo infekční aktivitou naměřenou v myších intracerebrální inokulací myší, pozorováním zvířat 14 dní a vypočtením LD50.To detect the amount of virus being marketed, a test for the infectious activity of each batch produced is performed. The assay is performed in two different ways, either by cell-layer infectious activity or by infectious activity measured in mice by intracerebral inoculation of mice, observation of animals for 14 days and calculation of LD50.

Výsledky se vyjadřují jako log 10 infekčních částic na litr buněčného kultivátoru. Střední hodnota, získaná titrací pro různé vyprodukované šarže s použitím media podle vynálezu, je 8,84, zatímco střední hodnota, získaná Ze šarží vyprodukovaných za použití media podle dosavadního stavu techniky, je 7,85. Střední hodnoty výsledků získaných titrací v případě myší pro šarže podle vynálezu je tentokrát 9,22, zatímco střední hodnota ze šarží, vyprodukovaných pomocí media podle stavu techniky, je 9,30. Dospělo se tedy k neočekávanému poznatku, že výsledky, získané s mediem podle vynálezu, jsou rovnocenné s výsledky získanými s mediem podle stavu techniky, přičemž by se dalo čekat, že deficit albuminu, což je protein, považovaný za výzmný pro transport elementů živin uvnitř buňky, povede ke značnému poklesu množství produkovaných virů.Results are expressed as log 10 infectious particles per liter of cell cultivator. The mean value obtained by titration for the different batches produced using the medium of the invention is 8.84, while the mean value obtained from the batches produced using the prior art medium is 7.85. The mean values of the titration results for mice for the batches of the invention are 9.22 this time, while the mean of the batches produced using the prior art medium is 9.30. Thus, it has been unexpectedly found that the results obtained with the medium of the invention are equivalent to those obtained with the prior art medium, and one would expect that albumin deficiency, a protein considered to be important for the transport of nutrient elements within the cell will result in a significant decrease in the amount of virus produced.

Získané šarže se pak inaktivují formaldehydovým roztokem v množství odpovídajícím konečné koncentraci ve směsi 1/4000 a ponecháním při teplotě místnosti 14 dní za stálého míchání. 0věření inaktivace pomocí kontrol protokolu doporučeného WHO (Technical Bulletin 771 z roku 1988) ukázala, že vyrobené šar10 •The batches obtained are then inactivated with formaldehyde solution in an amount corresponding to the final concentration in the mixture of 1/4000 and left at room temperature for 14 days with stirring. Verification of inactivation using protocol inspections recommended by WHO (Technical Bulletin 771 of 1988) showed that the batch produced10 •

• ···· «· » · • · • · · • · ··• ···· «·» · · · · ·

9 • ·9 • ·

S · ··· • rS · ··· r

9· • · • · • · • · »· • · • · • » • · *· že splňují doporučení WHO.9 comply with WHO recommendations.

Tyto inaktivované šarže se čistí iontovou výměnnou chromatografií a filtrací gelu k odstranění všech obsažených virových proteinů a zbylých nečistot, které jsou ve vakcínách nežádoucí . Získaná směs se formuluje k produkci vakcinových dávek, Dobrá jakost vyrobených vakcín se ověřuje testem imunogenicity v myších podle doporučení WHO pro vakciny proti japonské encefalitidě, který je založen na určení množství neutralizujících protilátek, produkovaných v imunizovaných nyšíďn. Jelikož aktivita vakcin, vyrobených způsobem podle vynálezu, není nižší než vakcin podle stavu techniky, je potvrzena možnost použití způsobu podle vynálezu pro produkci virové vakciny za podmínek zvýšené bezpečnosti s vynecháním albuminu.These inactivated lots are purified by ion exchange chromatography and gel filtration to remove any contained viral proteins and residual impurities that are undesirable in the vaccines. The resulting mixture is formulated to produce vaccine doses. The good quality of the vaccines produced is verified by an immunogenicity test in mice according to the WHO recommendations for Japanese encephalitis vaccines, which is based on the determination of the amount of neutralizing antibodies produced in immunized mice. Since the activity of the vaccines produced by the method of the invention is not lower than that of the prior art, the possibility of using the method of the invention for producing a viral vaccine under conditions of increased safety with albumin omission is confirmed.

Příklad 2Example 2

Porovnání různých prostředí podle vynálezuComparison of different media according to the invention

K porovnávacímu vyzkoušení různých prostředí se použijeIt is used for comparative testing of different environments

150 cm³ baněk naplněných 50 ml media Iscove, doplněného 4 Z telecího séra. Toto prostředí se naočkouje buňkami Věro ve množství 250 000 ouněk/cm³. Baňky se nechají stát 4 až 5 dní při teplotě 37 C, multiplikaci virů.150 cm ³ flasks filled with 50 ml Iscove medium supplemented with 4 calf serum. This medium is inoculated with Vera cells at 250,000 um / cm ³ . The flasks are allowed to stand for 4 to 5 days at 37 ° C, multiplying the viruses.

načež se pokropí mediem pro propagaci athen sprinkled with propagation medium and

Použitými medii jsou:The media used are:

- prostředí A, které je mediem podle stavu techniky, sestávajícím z media Iscove (Life Technologies Gibco), doplněným lidským albuminem na konečnou koncentraci albuminu 0,3 %,- medium A which is a prior art medium consisting of Iscove (Life Technologies Gibco) medium supplemented with human albumin to a final albumin concentration of 0,3%,

- prostředí B, sestávající z media HAM F 12, doplněného následujícími mitogenními molekulami:- medium B, consisting of HAM F 12 medium supplemented with the following mitogenic molecules:

x BCR 1008 v množství 10³ g/1, x TCR 1005 v množství 10~⁴ g/1, x GCR 1003 v množství 10‘⁴ g/1,x BCR 1008 at 10 ³ g / L, x TCR 1005 at 10 ^-4 g / L, x GCR 1003 at 10 ^-4 g / L,

- prostředí C, sestávající z uvedeného media (HAM F 12, dopl- 11 • · ttt • ·- environment C, consisting of the specified medium (HAM F 12, suppl. 11)

něného BCR 1008, TCR 1005 a GCR 1003), avšak obsahující také 1 g/1 produktu HyPep 4602, který sestává z glutenového hydrolyzátu (produkt společností Questel International),BCR 1008, TCR 1005 and GCR 1003), but also containing 1 g / l of HyPep 4602, which consists of gluten hydrolyzate (product of Questel International),

- prostředí C , které je totožné s prostředím C, avšak s obsahem HyPep 4602 5 g/1,- medium C which is identical to medium C but with a HyPep 4602 content of 5 g / l,

- prostředí D, sestávající z media HAM P 12, doplněného HyPep 4602 v množství 1 g/1, avšak bez mitogenních molekul BCR 1008, TCR 1005 nebo GCR 1003,- medium D, consisting of HAM P 12 medium supplemented with 1 g / l HyPep 4602 but without the BCR 1008, TCR 1005 or GCR 1003 mitogenic molecules,

- prostředí DS , které je totožné s prostředím D, avšak s obsahem HyPep 4602 5 g/1.- DS medium which is identical to medium D, but with a HyPep 4602 content of 5 g / l.

Po propláchnutí se do každé baňky zavede očkovací látka viru japonské encefalitidy, totožná s očkovací látkou z předchozího příkladu, v množství odpovídajícím Μ0Ι 1/6000.After washing, the Japanese encephalitis virus vaccine, identical to the vaccine of the previous example, is introduced into each flask in an amount corresponding to Μ0Ι 1/6000.

oO

Obsahy baněk se pak nechají stát 3 dny při teplotě 37 C před provedením první sklizně. Další sklizně se provádějí stejně jako podle předchozího příkladu.The contents of the flasks are then allowed to stand for 3 days at 37 ° C before the first harvest. Further harvests are carried out as in the previous example.

Testy ke stanovení infekčního titru se provádějí na buňkách BHK21 s následujícími výsledky vyjádřenými jako TCIDso/ml (log 10);Assays for determination of infectious titer are performed on BHK21 cells with the following results expressed as TCID 50 / ml (log 10);

prostředí A 4,6 prostředí B 5,1 prostředí C 5,0 prostředí C 5,6 prostředí D 5,4 prostředí D 6,3.environment A 4.6 environment B 5.1 environment C 5.0 environment C 5.6 environment D 5.4 environment D 6.3.

Tyto výsledky potvrzují, že prostředí podle vynálezu umožňuje získat výtěžky, které jsou stejně dobré, ne-li lepší, než prostředí podle dosavadního stavu techniky, obsahující albumin.These results confirm that the media of the invention makes it possible to obtain yields that are as good, if not better than, those of the prior art containing albumin.

Příklad 3Example 3

Výroba vakciny proti vztekliněProduction of rabies vaccine

V kultivátoru o obsahu dva litry se připraví kultura buněk Věro v konvenčním prostředí a po promytí se buňky infikují virem vztekliny s MOI 1/1000 a udržují se v prostředí, které je totožné s prostředím popsaným v příkladu 1 (tedy medium ΗΆΜ F 12 doplněné Profilixea™ II); tentýž pokus se provede úplně stejným způsoben v jiném kultivátoru téhož objemu, s jediným rozdílem, že medium pro propagaci a multiplikaci virů je podle dosavadního stavu techniky a obsahuje lidský albumin. Sklizně se konají postupně 4., 5., 6. a 7. den po infikování, Součty, provedené u sklizní získaných s použitím prostředí podle vynálezu. umožňují získat porovnatelné výsledky pro obě prostředí; infekční titry získaných virů jsou podobně totožné.In a two-liter cultivator, a Vera cell culture is prepared in a conventional environment and after washing, the cells are infected with rabies virus with an MOI of 1/1000 and maintained in an environment identical to that described in Example 1 (ie medium ΗΆΜ F 12 supplemented with Profilixea). ™ II); the same experiment was performed in exactly the same manner in another cultivator of the same volume, with the only difference that the virus propagation and multiplication medium is according to the prior art and contains human albumin. Harvesting takes place sequentially on the 4th, 5th, 6th and 7th day after infection, Sums made for harvests obtained using the medium of the invention. make it possible to obtain comparable results for both environments; infectious titers of the obtained viruses are similarly identical.

Tyto výsledky tak dokazují proti vzteklině na buňkách.These results thus demonstrate against rabies on cells.

možnost pěstování vakcinypossibility of growing the vaccine

Př i k iad 4Example 4

Výroba vakciny proti dětské obrněProduction of polio vaccine

Provedou se testy výroby víru polyomyelitis typu 1 na kultuře buněk Věro. Infekční titry virů. získané za použití prostředí pro propagaci a multiplikaci virů podle vynálezu, majícího složení podle příkladu 1, jsou reovnocenné s průměrem infekčních titrů získaných u sklizní provedených s prostředím použitým k výrobě běžně obchodně dostupných vakcin.Tests for the production of type 1 polyomyelitis virus on Vero cell culture were performed. Infectious virus titers. obtained using the virus propagation and multiplication environment of the invention, having the composition of Example 1, are equivalent to the average of the infectious titers obtained from the harvests performed with the medium used to produce commercially available vaccines.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Výroba vakciny proti různým virům za použití prostředí bez přísady lidského albuminu.Production of a vaccine against various viruses using human albumin-free media.

Claims

NEW PATENT CLAIMS (based on preliminary international survey)

Use of a culture medium which is free of human or animal protein, even of recombinant origin, and which contains plant extracts for propagation and multiplication of viruses in cell culture.

The use according to claim 1 containing media containing mitogenic proteins or glycoproteins extracted from potatoes or cucumbers.

Use according to claim 1 or 2 of plant extracts obtained by:

- the plants are washed and ground,

- the product is diluted in an aqueous medium,

the mixture obtained is thermally coagulated, and

- the product is purified by chromatography.

Use according to claims 1 to 3 of a culture medium containing hydrolyzates of plant extracts.

Use according to claims 1 to 4 as carriers for propagation and multiplication of Vero cell viruses.

Use according to claims 1 to 5 for the production of Japanese encephalitis, rabies, polio, type A jaundice, influenza, Deng's fever, mumps, varicella and rubella.

Use according to claims 1 to 6 for the production of Japanese encephalitis viruses for human vaccines.