CZ20004016A3 - Lidský BMP-4 promotor a způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kosti za použití tohoto promotoru - Google Patents

Abstract

Způsob pro výzkum sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-4, který využívá aktivity reporterového genu a regionu 5'- předcházejícího genu, který obsahuje BMP-4 promotor a dále za použití zvířecích buněk, do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor spojený s vhodným reportérovým genem. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a jejich deriváty získané tímto způsobem mají morfogenetickou aktivitu a inhibiční aktivitu pro kost a chrupavku, které je způsobena prostřednictvím exprese lidského BMP-4, tyto sloučeniny jsou dále užitečné jako profylaktická nebo terapeutická činidla pro onemocnění kostí nebo chrupavek

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká regionu 5'-předcházejícího DNA lidského kostního morfogenetického proteinu (BMP, dále -4), který obsahuje promotor. Dále se předkládaný vynález týká způsobu pro výzkum sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-4 pomocí zvířecích nebo kvasinkových buněk, do kterých je vložen 5¹-předcházející region DNA obsahující lidský BMP-4 promotor a rekombinantní expresní vektor integrovaný do vhodného reporterového genu, a použití reportérové aktivity jako indikátoru.

Dosavadní stav techniky

V současnosti je kostní morfogenetická aktivita popisována pro kostní morfogenetický faktor, BMP, který náleží do TGF (transformující růstový faktor) β superrodiny (Science 150: 893-897, 1965; Science 242: 1528-1534, 1988). Známými druhy BMP jsou BMP-1 až BMP-14. Je známo, že BMP-2 až BMP-14 mají kostní morfogenetickou aktivitu. BMP-2 až BMP-14 jsou považovány za účinné pro terapeutickou a preventivní léčbu různých kostních dysfunkcí a onemocnění kostí, nicméně, za přirozených okolností se vyskytují ve velmi malých množstvích. Proto vyžadují velká množství BMP-2 až BMP-14 používaná pro tuto léčbu produkci rekombinantního proteinu. Produkce rekombinantního proteinu je obvykle velmi nákladná ve srovnání s produkcí sloučenin s nízkou molekulovou hmotností. Na druhou stranu, existuje mnoho omezení při jejich použití jako léčiv, která jsou určována jejich fyzikálními vlastnostmi a způsobem • » • · podáním, které jsou dány jejich proteinovým charakterem. Z těchto důvodů jsou organické sloučeniny s malou molekulou, které mají stejnou aktivitu jako uvedené BMP proteiny, velmi slibnými léčivy. Substance získaná za použití způsobu podle předkládaného vynálezu je aktivní v indukci exprese lidského BMP-4, kostního morfogenetického proteinu, a také má stejnou aktivitu jako lidský BMP-4, jehož použití je velmi užitečné. Naopak, existují zprávy (New Engl. J. Med., svazek 335, str. 555-561, 1996), které naznačují, že lidský BMP-4 způsobuje hyperplasii kosti a chrupavky. V tomto případě může inhibice exprese lidského BMP-4 zabránit osteohyperplasii. Předkládaný vynález umožňuje detekci inhibice exprese lidského BMP-4 a poskytuje způsob pro výzkum substancí, které brání takové hyperplasii.

Pro takový způsob výzkumu byl popsán pouze příklad využívající myšího BMP-2 promotoru (WO 97/15308); neexistuje příklad použití lidského BMP-4 promotoru. Region myšího BMP-4 promotoru byl již klonován (Biochem. Biophys. Acta, svazek 1218, str. 221-224, 1994), ale nebyla podrobně popsána sekvence lidského BMP-4 promotoru. Předkládaný vynález poprvé popisuje sekvenci lidského BMP-4 promotoru. Bylo zjištěno, že homologie celé sekvence 5'-předcházejícího regionu DNA mezi lidským a myším BMP-4 (J. Biol. Chem., svazek 270, str. 2836428373, 1995) je 52,2%. Materiály pro způsob výzkumu podle předkládaného vynálezu jsou všechny získány z lidských zdrojů, takže substance získané v takovém výzkumu budou mít klinické využití. Očekává se získání substance schopné přesnější regulace exprese lidského BMP-4, pomocí transfekce dvou promotorů (promotoru-1 a promotoru-2), samostatně nebo simultánně, v rekombinantním expresním vektoru, do hostitelských buněk.

• ·

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje 5'-předcházející region DNA obsahující promotor lidského BMP-4. Pomocí použití 5'předcházejícího regionu genu obsahujícího lidský BMP-4 promotor a zvířecích buněk, do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor, který byl integrován s vhodným reportérovým genem, mohou být zkoumány sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-4, pomocí reportérové aktivity.

Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a jejich deriváty mají morfogenetickou aktivitu a inhibiční aktivitu pro kost a chrupavku způsobenou prostřednictvím exprese lidského BMP-4 a jsou užitečné jako preventivní nebo terapeutická činidla pro onemocnění kosti nebo chrupavky, jako léky při metastasách do kostí, nebo jako terapeutická nebo profylaktické činidla při osteohyperplasii.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je exonová-intronová struktura 6,7 kb regionu 5'předcházejícího lidskému BMP-4 genu a mapa míst pro restrikční enzymy.

Obr. 2 je rekombinantní expresní vektor (pMSS116) obsahující promotor 1 5'-předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu. Region promotoru 1 (baze č. 1 až 3361 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, od 5' konce do Xhol uvedenému na obr. 1) byl insertován do Nhel a Xhol restrikčních míst pGL3-basic vektoru.

Obr. 3 je rekombinantní expresní vektor (pMSS118) obsahující promotor 2 5¹-předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu.

Region promotoru 2 (2,3 kb) (baze č. 3361 až 5645 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, od Xhol do BglII exonu 2, jak je uvedeno na obr. 1) byl insertován do Xhol a BglII restrikčních míst pGL3-basic vektoru.

Obr. 4 je rekombinantní expresní vektor (pMSS119) obsahující promotor 1 a promotor 2 5'-předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu. Promotor 1 a promotor 2 (baze č. 1 až 5645 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, od 5’ konce do BglII místa exonu 2, jak je uvedeno na obr. 1) byly insertovány do Nhel a BglII restrikčních míst pGL3-basic vektoru.

Obr. 5 ukazuje výsledky měření aktivity lidského BMP-4 promotoru (přechodné exprese).

Předkládaný vynález se týká DNA, jejíž nukleotidová sekvence je representována bázemi 1 až 6774 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, která kóduje promotorový region lidského kostního morfogenetického proteinu 4, nebo jejího fragmentu. SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí ukazuje sekvenci 5’předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu.

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy DNA podle SEQ ID NO: 1 pomocí následujících kroků:

(1) trávení lidské placentám! genomové DNA restrikčním enzymem EcoRI;

(2) izolace elektroforesou na agarosovém gelu;

(3) klonování izolovaného DNA fragmentu tráveného EcoRI do lambda fágového vektoru ÁDASH II zpracovaného stejným enzymem;

(4) zabalení uvedeného vektoru do fágu;

(5) vytvoření knihovny genomové DNA pomocí infekce Escherichia coli fágem;

* *

(6) vyšetřování PCR; a (7) subklonování do plasmidového vektoru.

Použitý plasmidový vektor není přesně určen a může být použit jeden z komerčně dostupných vektorů. Výhodným příkladem je pUC18 vektor.

Předkládaný vynález se týká rekombinantního expresního vektor charakterizovaného integrací úplné nebo částečné DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 do reporterového genu. Přesněji, rekombinantní expresní vektor je připraven umístěním vhodného regionu z regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genu, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 1, před reporterový gen. Reporterový gen, jako je gen pro luciferasu nebo β-galaktosidasu, ukazuje stav exprese na svém původním produktu. Původní vektor pro rekombinantní expresní vektor není přesně určen a může být použit komerční plasmidový vektor. Výhodným původním vektorem pro použití v předkládaném vynálezu je pGL3. Při použití pGL3 se získá pMSS116 (8,2 kb), pMSS118 (7,1 kb) a pMSS119 (10,5 kb), což jsou rekombinantní expresní vektory obsahující lidský BMP-4i promotor a luciferasový reporterový gen.Předkládaný vynález je označuje jako rekombinantní expresní vektory. Je nutné vkládat rekombinantní expresní vektor do savčích buněk, výhodně lidských osteoblastových buněk, jako jsou SaOS-2 buňky, s liposomy. Zvířecí buňky stabilně transfektované rekombinantními expresními vektory jsou selektovány pomocí markérů resistence.

Předkládaný vynález se týká způsobu pro výzkum substancí ovlivňujících kosti, při kterém je využito rekombinantního expresního vektor charakterizovaného integrací úplné nebo částečné DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí do reporterového genu. Dále se týká způsobu pro výzkum substancí • fc ovlivňujících kosti, ve kterém je uvedenou substancí ovlivňující kosti substance indukující osteogenesi nebo substance inhibující osteogenesi. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, které indukují nebo inhibují expresi lidského BMP-4, mohou být získány izolací promotoru, který reguluje expresi genu, jeho navázáním s vhodným reportérovým genem a vložením genové struktury do vhodných savčích buněk, za zisku testovacího systému. Substance, které regulují expresi lidského BMP-4 v testovacím systému působí na promotor a zvyšují nebo snižují expresi reporterového genu. Tak umožňuje jednoduché a snadné měření aktivity reporterového genu vyšetřování uvedených substancí.

Zvířecí buňky transfektované uvedenými vektory mohou být použity pro testování knihovny chemických sloučenin pomocí vysocevýkoného vyhledávání (Nátuře, svazek 384, Suppl., str. 14-16, 1996) a pro testování aktivních substancí z přirozených substancí. Substance zvyšující nebo snižující aktivitu je vybrána pomocí působení této substance na buňky po určitou dobu a potom pomocí měření aktivity reporterového genu. Takto získaná substance může regulovat expresi buď tak, že působí přímo na transkripční faktor, nebo nepřímo na lidský BMP-4 promotor prostřednictvím regulace systému přenosu signálu. Proto jsou tyto sloučeniny účinné jako terapeutická činidla pro onemocnění kostí a chrupavek, nádorové metastasy do kostí nebo osteohyperplasii.

Substance získaná způsobem podle předkládaného vynálezu má morfogenetickou aktivitu na chrupavku či kost a je účinná jako terapeutické nebo profylaktické činidlo v oboru ortopedické chirurgie (při onemocněních jako jsou fraktury, osteoarthritida, jako je kloubní osteoartritida a osteoartritida kyčelního kloubu, arthrosteitis, poškození

Ί

chrupavek, jako je poškození menisku, regenerace kosti a deficit chrupavek způsobený poraněním nebo dissekcí nádoru, kostní rekonstrukce jako je spinální fúze a zvětšení páteřního kanálu, a vrozená onemocnění kostí a chrupavek, jako je dysosteogenesa a achondroplasie), nebo v oboru zubního lékařství (při rekonstrukcích kosti jako je například palatoschisa, rekonstrukce mandibuly a konstrukce reziduálního oblouku) a v oblasti léčby osteoporosy. Dále mohou být substance podle předkládaného vynálezu použity při kostních štěpech v plastické chirurgii. Tyto substance jsou také účinné při terapii v oblasti veterinárního lékařství. Na druhou stranu, předkládaný vynález může poskytnout substance, které inhibují morfogenesi kosti nebo chrupavky. V tomto případě jsou takové substance použity jako činidla pro prevenci nebo terapii hyperplasie kosti nebo chrupavky.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález bude nyní dokreslen v následujících příkladech. Tyto příklady jsou ve všech ohledech pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsa předkládaného vynálezu.

Příklad 1: Izolace regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genu

Lidská placentární genomová DNA (CloneTech) byla trávena různými restrikčními enzymy (BamHI, BglII, EcoRI, HindlII, Pstl, Sací, Sáli, Smál, SPhl a Xbal), byla separována elektroforesou na agarosovém gelu, přenesena na nylonovou membránu a zpracována southernovou hybridizací za standardních podmínek za použití BMP-4 cDNA (Science 242: 1528-1534) jako sondy. Bylo zjištěno, že trávení restrikčním enzymem EcoRI spolu s dalšími restrikčními enzymy vedlo k zisku DNA * · fragmentu velikosti přibližně 7 kb, který obsahoval nejdelši lidský BMP-4 gen. Potom byla lidská placentám! genomová DNA trávena restrikčnim enzymem EcoRI a byla separována elektroforesou na agarosovém gelu pro extrakci DNA fragmentu velikosti přibližně 7 kb z agarosového gelu. Získaný DNA fragment byl klonován do lambda fágového vektoru ÁDASH II (Stratagene Ltd.) tráveného restrikčnim enzymem EcoRI. Vektor byl in vitro zpracován Gigapack III XL extraktem (Stratagene Ltd.), byl použit pro infekci Escherichia coli XLl-Blue MRA (Stratagene Ltd.) za vzniku knihovny genomové DNA. Knihovna byla rozdělena do několika souborů. Každý soubor byl amplifikován skríningem (Nucleic Acids Research 21: 2627-2631, 1993) za použití PCR; přesněji, PCR využívající PCR primery (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 3 Seznamu sekvencí) odpovídající regionu exonu 1 pro selekci požadovaného souboru, za zisku regionu (6,8 kb) 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genu. Potom byl 5'-předcházející 6,8 kb fragment subklonován do pUC18 vektoru (Amersham Pharmacia Biotech.). Vektor byl označen E. coli pKOT 312. E. coli pKOT 312 byl uložen v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 1-3, Hígashi 1-chome, Tsukuba-shi Ibarakiken 305-8566 Japan, 30.3.1998, pod přírůstkovým číslem FERM P16736 a byl přenesen do International Depository Authority podle Budapešťské smlouvy 17.2.1998 (přírůstkové č. FERM BP6650) .

Příklad 2: Stanovení DNA sekvence regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genu

Sekvence získaného regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP4 genu byla stanovena pomocí ALF DNA sekvenátoru (Amersham Pharmacia Biotech), způsobem podle Sanger et al. (Proč. Nati.

• 4 • ·

Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). Takto analyzovaná sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí.

Příklad 3: Konstrukce rekombinantního expresního vektoru obsahujícího lidský BMP-4 promotor a luciferasový reporterový gen

Jak je uvedeno na obr. 4, má lidský BMP-4 dva promotory před exonem 1 (promotor-1) a po exonu 2 (promotor-2), což je podobné jako struktura promotorů v myším BMP-4. Region obsahující promotor-1 (od 5'-konce do Xbal místa, jak je uvedeno na obr. 1) byl insertován do předních míst pro restrikční enzymy, Nhel a Xhol, reporterového genu luciferasového reporterového vektoru pGL3-basic (Pro Mega Ltd.) za použití Xbal restrikčního místa odvozeného z pUC18 vektoru přítomného na 5'-konci, za zisku rekombinantního expresního vektoru pMSS116 (8,2 kb). Tento vektor je uveden na obr. 2. Rekombinantní expresní vektor pMSS118 (7,1 kb) byl získán insercí regionu (od Xhol do BglII v exonu 2, jak je popsáno na obr. 1) obsahujícího promotor-2 do Xhol a BglII restrikčních míst vektoru pGL3-basic. Tento vektor je uveden na obr. 3. Dále byl region (od 5'-konce do BglII v exonu 2, jak je popsáno na obr. 1) obsahujícího jak promotor-1, tak promotor-2, insertován do nhel a BglII restrikčních míst vektoru pGL3-basic za použití Xbal místa odvozeného od pUCl8 vektoru, stejně jako v případě pMSSH6, za zisku rekombinantního expresního vektoru pMSS119 (10,5 kb). Tento vektor je uveden na obr. 4.

Příklad 4: Měření aktivity lidského BMP-4 promotoru (vložení rekombinantního expresního vektoru do lidských buněk a přechodná exprese) .

Pro přechodnou expresi lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru byly výše uvedené rekombinantní expresní vektory (pMSS116, pMSS118, pMSS119) smíseny s vektorem pRLSV40 (Pro Mega Co.) obsahujícím gen pro luciferasu mořské macešky, který byl použit jako vnitřní kontrola pro měření účinnosti vložení genu při stejném použitém množství. Potom byl s uvedeným DNA roztokem smísen kationtový liposom lipofektamin (Lifetech Oriental Co.) a pro transfekci byla tato směs přidána k lidským osteoosarkomovým buňkám HOS, MG63 a SaOS-2. Aktivita světluškové luiciferasy a luciferasovy z mořské macešky byly měřeny Pikka Gene Duál Křtem (Toyo Ink. Co.). Výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Aktivita promotoru byla vyjádřena jako poměr aktivity světluškové luciferasy k aktivitě luciferasy z mořské macešky. Z výsledků je zřejmé, že DNA SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí má promotorovou aktivitu.

Příklad 5: Vložení lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru do lidských buněk a stabilní exprese

Pro stabilní expresi lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru byly výše uvedené vektory smíseny v poměru 10:1 s vektorem pPUR (CloneTech Ltd.) obsahujícím gen pro resistenci na puromycin a dále byly smíseny s kationtovým liposomem lipofektaminem (Lifetech Oriental Co.) pro transfekci lidských osteosarkomových buněk HOS. Buňky, do kterých byl vložen vybraný gen, byly selektovány na kultivačním mediu obsahujícím puromycin (Sigma, Ltd.).

Příklad 6: Vyhledávání aktivních sloučenin s nízkou molekulovou hmotností

Selektované buňky byly naočkovány do 96-jamkové plotny, byly ošetřeny různými chemickými sloučeninami z knihoven během

1-3 dnů, byly rozpuštěny v cytolytickém činidle (Pro Mega Ltd.) a enzymatická aktivita byla měřena za použití luciferasového testovacího křtu (Pro Mega Ltd.). Tímto způsobem mohly být testovány různé substance indukující nebo inhibující expresi lidského BMP-4.

Seznam sekvencí <110> Hoechst Marion Roussel, Ltd.

<120> Lidský BMP-4 promotor a způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kosti za použití tohoto promotoru <130> JH98K004 PCT sekvence v angličtině <140>

<141>

<150> 10-120173 <151> 1998-04-30 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6774 <212> DNA <213> Lidská <220>

<221> různé charakteristiky <222> (1)....(6774) <223> 5'předcházející genová sekvence lidského BMP-4 včetně regionů exonu 1 až exonu 3 <400> 1 gaattccttc cgtagcttca ccagacacct aattggccaa gaaggtttga agacctgatg 60 tggttcttaa ttggggatgg ggaattaagg gctactgtat ctataggatt atcttttcac 120 ttgcatagac ctatttggtg tgttcagggc atagtgatac tataattgcc atatttaaca 180 gtttataaag ttcaagccca gcatattctt tgcctgttta atgatgtctt ggtatcagcc 240 ttttaatggt acttatcagc atagaaaatg gaaacaaaat aacttttaaa acagtagctc 300 tcaagcttta gtgtgctcag aatgaccaga gaaccttgtg aaatatacag atttctgggt 360 ccagatctgg ggcaggacca ggaagtctgc atttcatctg cacccccacc ctactctgag 420 • 9

	13	9 · · · * • 9 · · * • 9 · * • 9 · 9 · · ·	* » · · • · · • · · · · ·	• · 9 · • ·
gcttatagtc	ctgagaacat	gctttgaaaa	aggctgtccc	aagggctcgc	agacaggcta	480
ttgaccagct	actctttctt	gatgttctcc	aggaaaaccc	aacaaaggaa	tgcctttcat	540
tgagtagtag	cagcatagga	gcaatagttg	ctcctgaatt	atgggtgggt	ttccctcttc	600
atcaatgtgc	tttaagggta	cagtttcatt	tggtctatct	accatgttct	ataaaaacat	660
gaaaattcac	aggtaagttt	gagatacaga	aaataactaa	actgattctt	ctcacgaact	720
ctgatcacta	ggctgtggtt	gatttagctc	tctaaccaac	aagtaatttg	ttctttggca	780
tgagtaaggg	gggaaaagga	ggagtgggta	aaagcagctg	ataacagatg	gcttgcgccc	840
atctaaaatg	tggggagaga	aataaagctg	tcccaagaga	actaaagctg	agttctctcg	900
tcatatatct	gaagattcat	atcaggggtc	taaacatggt	atgtcgggta	gcttaattgg	960
aaactcctgg	actgtgagtg	tcacagactc	atggatgggc	caatcagtgg	ccactttagt	1020
gtctgggctg	cagcaaaatg	agacaatagc	tgtcattcaa	aaacctttgg	aattaaaaaa	1080
accccgaaat	gacattggtg	ctttaaagta	aaataaagtc	ctgcctttaa	gtccagcata	1140
tcactgttgt	ttctgagttt	aaatattaag	aaccacattt	cgttaatgat	taaaacaaca	1200
gtgattgatt	taggggctca	gtgagcattt	aatctgtcct	gacttcaggt	accatgctaa	1260
aggagcacaa	tgcctgatgc	tgcaggagaa	acattaggta	actatttaat	ggagttttaa	1320
ttttctgtta	ttatttttaa	taattaattg	tgattttgac	tatttggaag	ctacaggtat	1380
attttgtcct	ccttttgggg	tggtgttatt	gccctgccct	gttttaatca	gtggttctta	1440
gagaaagtga	actcaggagt	gacttaaaat	gaaggaagac	ggactttggc	taaaattaca	1500
attaaataat	caaatcattt	tcaaatataa	agggagcatg	cagatgatct	ggcccaatcc	1560
tttcattctg	cagatgagaa	aactgaggct	cataggaatg	aaaagacttg	cccaaagcca	1620
tacagcttgt	ttctgttgtt	tggtgcatta	ggccaaaaga'	cctaggccta	atagatggaa	1680
aatatggcag	gatgtcttgg	ccttgctctg	acagttgctt	ctctgatctc	agatatttcc	1740
caccctttgt	aaattctgtg	ttccacacag	gaagtagttc	ttgtttttta	aatatcgaag	1800
gtgtataaac	gtaaagtttt	tatagatgag	ccacccaggg	ccaatatctg	tttaagtaaa	1860
gacctaaatg	ctttgcagag	acagtaaagt	gtcatgtctg	tcccagggaa	agaaatccag	1920
gacaggaaat	gctcagtctt	ccagcactcc	tctggctacc	tggagctcag	gctatgagcc	1980
tcaacccctc	cctgaagcat	tagctctgga	gcagaggctg	tgatttactt	cagagatctg	2040
ggcaagtccc	tttaacctgg	tagtccttcc	tttccttgtt	tgtaaaacag	agagatgagg	2100
ctgatagctc	cctcacagct	ccatcagagg	cagtgtgtgá	aattagttcc	tgtttgggaa	2160
ggtttaaaag	ccaccacatt	ccacctccct	gctaatatga	ttactaaaat	gtttttatat	2220
gaaagggcca	attcctcatc	tcccctcttc	ctttaaaaac	agaccaaggg	gcatcttttc	2280
ttgtctccct	gtggcctaaa	aggttactgc	ttctgtggtt	atctccttgg	aaagacagag	2340
tgtcaggact	cttaggtaca	ccaaaaatga	acaaaaaaat	caacaacaac	cataacacca	2400
acaaaaataa	ctgctgtgtc	ggttcttaag	acggcttctg	agctagaaac	agatttttct	2460
aactgtaaaa	aacgtggccc	cagcctgtct	gcaggccacc	tctgtcttta	ggccttgggg	2520
ggaggaggga	agtgagctca	tttactgggt	ctacctcagg	gtcatcacca	aggtgttcta	2580
caaaacgcac	tttaagaatg	ttttggaagg	aaattcacct	tttaacagcc	caagaggtat	2640
ctctctctgg	cacacagttc	tgcacacagc	ctgtttctca	acgtttggaa	atcttttaac	2700

agtttatgga aggccacctt ttaaaccgat ccaacagctc ctttctccat accctgattt 2760
tagaggtgtt	tcattatctc	taattactca	gggtaaatgg	tgattactca	gtgttttaat	2820
catcagtttg	ggcagcagtt	acactaaact	cagggaagcc	cagactccca	tgggtatttt	2880
tggaaggtac	ggcgactagt	cggtgcatgc	tttctagtac	ctccgcacgt	ggtccccagg	2940
tgagccccag	ccgcttccca	gagctggagg	cagcggcgtc	ccagctccga	cggcagctgc	3000
ggactcggcg	ctgcctgggc	ttccgggacc	cgggcctgct	aggcgaggtc	gggcggctgg	3060
aggggaggat	gtgggcgggg	ctcccatccc	cagaaaggga	ggcgagcgag	ggaggaggga	3120
aggagggagg	ggccgccggg	gaagaggagg	aggaaggaaa	gaaagaaagc	gagggaggga	3180
aagaggagga	aggaagatgc	gagaaggcag	aggaggaggg	agggagggaa	ggagcgcgga	3240
gcccggcccg	gaagctaggt	gagtgtggca	tccgagctga	gggacgcgag	cctgagacgc	3300
cgctgctgct	ccggctgagt	atctagcttg	tctccccgat	gggattcccg	tccaagctat	3360
ctcgagcctg	cagcgccaca	gtccccggcc	ctcgcccagg	ttcactgcaa	ccgttcagag	3420
gtccccagga	gctgctgctg	gcgagcccgc	tactgcaggg	acctatggtg	agcaaggcta	3480
cctggtgagg	ggagacaggc	agagggggtc	taggagcctc	cttgggggga	agaagctggt	3540
cacaggctgt	gaccgaggca	aaaggtggcc	taattatttt	ccaatagtgg	tgctggaggt	3600
ggggatgctg	gcgctgaaag	acctttaaat	atcggctact	gccctgccca	ggccttctct	3660
gtccagcagt	ccctgggaga	gťctcacctt	tgggaagtgc	ggggcaggag	agcagaaaca	3720
agagaagccc	ttggtagggg	ggtcgttggg	aaaaactgtg	gggtcttggg	ctgaacgcgt	3780
tgcccacggg	ctggaggttg	cgatccccgg	acggaaagcg	cgggaggagg	aaggagagaa	3840
ccggctctga	ggtccagaga	gagtgagggg	gcagagcgac	ggcgagatgg	ggagagaaca	3900
cctagctgga	gcaggttctg	cggtagagag	cgcagtcctg	ctggcctctg	gagagtgcgc	3960
gccgctccgg	aggctgcgtc	gaggggagtg	tcacccaatc	tgggccccag	ctggcggggc	4020
gcctgagagc	ttgcgaactg	cagttgcagg	acgcgccttc	tccacgagct	attttcgtcg	4080
actťgcggaa	cccaaggaac	ctcgcctcta	tcatttcacg	gtgtagggtc	cctagagacg	4140
acagccaaga	tcccaggggc	tcccaggacg	cttgttcctg	cggtgtcgtg	tcctatgggg	4200
agttcctggc	gggacgaaag	gcggacgcgc	ggctcttcct	ggccctccag	gcccggaacc	4260
gacgggaaag	gttcccgtga	ttcccgagtc	cctgcaggct	tcttccagcg	ggagttggtc	4320
cgggggcctt	agacgcctcc	aagcactgct	ttggaggatg	gtttccaagg	atcgcggttt	4380
gtgagttgaa	ggctttgtga	gaggttaaac	ccccaaaaga	tacatacttg	gtaaactgag	4440
gctacctgta	aacacatttc	ggcattagga	gaagattcga	gtagggaagt	gaaggacaac	4500
caccccgagt	tacattcctt	tcccccaata	aaaagctctg	gggatgaaag	ttcttttggc	4560
ttttatcttt	tcgatttaaa	aatttgagaa	gaaaatgtga	ctagagatga	atcctggtga	4620
átccgaaatt	gaaacacaac	tcccccttcc	ccttcctatc	ctctcggttt	tagaaccgcg	4680
ctctcccgcc	ccaggagatt	ccttggggcc	gagggttttc	cggggaaccg	ggcgcccgcc	4740
ccttctactg	tccctttgcc	ccgcgggcac	agcttgcctc	cgtctgcttt	ctctacttct	4800
ggacctctcc	tcggcgggct	ttttaaaggg	cfctctgcgtc	tcaaaacaaa	acaaaaaaac	4860
cctttgctct	tcccaaccct	ttcgcagccc	gccccagcgt	ggcgcgggac	cagcaaaggc	4920
gaaagcgccg	cggctcttgc	cgggcgcgga	cggtcgcgca	ggggcgcccg	cggcctccgc	4980

• · • · • · • ·

15.

acccggacct gaggtgttgg tcgactccgg gcatccacgg tcgggaggga gggctgagct 5040
gttcgatcct	ttacttttct	tcctcaaagt	ctacctgcca	•atgcccctaa	gaagaaaacc	5100
aagtatgtgc	gtggagagtg	gggcggcagg	caacccgagt	tcttgagctc	cggagcgacc	5160
caaagcagca	actgggaaca	gcctcaggaa	agggaggtcg	ggtggagtgg	gctttggggc	5220
aggagtcatg	gggcccgggc	cccggggacg	acctggcgct	cccggccctg	ctgaacgctg	5280
agttgcgcct	agtcgggttt	tcgaagaggc	ccttgcgcag	agcgacccac	gcgcgcggca	5340
gcatcttcga	ttagtcagga	catcccagta	actgcttgaa	ctgtaggtag	gtaaaattct	5400
tgaaggagta	tttgctgcgt	gcgactctgc	tgctggtgca	acggaggaag	ggggtggggg	5460
aaggaagtgg	cgggggaagg	actgtggtgg	tggtttaaaa	aataagggaa	gccgaggcga	5520
gagagacgca	gacgcagagg	tcgagcgcag	gccgaaagct	gttcaccgtt	ttctcgactc	5580
cggggaacat	ggtgggattt	cctttctgcg	ccgggtcggg	agttgtaaaa	cctcggccac	5640
attaagatct	gaaaactgtg	atgcgtcctt	tctgcagcga	cgcctctttc	tgaatctgcc	5700
cggagcttcg	agccccggcg	tctgtccctc	agcctggcat	ggcttcttcg	ggggtctgct	5760
ttgcatgggg	agaggggcca	cgcagcggcg	gactaggttt	ggggattctc	ggtaatggac	5820
ccggagcaat	gactaacagc	cgctccctct	cactttccca	cagcgatcac	cctctaacac	5880
cctccctccc	attcccggcc	ccgcgcgtga	caaggtcggc	tgctttcagc	cgggagctag	5940
atcggtggcc	cggctcttcg	gaccttagcg	agcgttcgcc	aaggggtgac	tggctgtcat	6000
tgggagcaat	atttggcctt	gaggagaccc	tggggaggaa	gtggcgggga	gctcgtgttt	6060
gcttgtgtgt	gtgtgggggg	gtagtgtgtg	taacacgcgc	gtgggcaggg	tccctctgcg	6120
ctttcctttt	taagtgcctc	tcggtggtga	ggctttgggc	gggtgagact	ttcccgacct	6180
cgctcccggc	cccacttaag	ccgggttcga	gctgggagac	gcagtccctt	cagtgcgccc	6240
caaatcctct	ggcttcaggt	ggcccggcgc	gggggcccag	cacgacgcac	cgcgccgaga	6300
accgggttct	ccggtgcgtg	cgccagtagc	cctgggagcg	cggcggccgc	ggggcaccgg	6360
ccgaggctct	gccgagcgcc	gccgggagct	cctcccggac	cgctgaggct	cgggcggcgg	6420
acgcggaggt	tggcctcgcc	tggaggggcg	ggcccgcgag	gggcgggggg	ctgtggagga	6480
ggggagggcg	cgcaggccct	ttcgccgcct	gccgcgggag	gggcctcggc	gctcacgtga	6540
ctccgagggg	ctggaagaaa	aacagagcct	gtctgcggtg	gagtctcatt	atattcaaat	6600
attcctttta	ggagccattc	cgtagtgcca	tcccgagcaa	cgcactgctg	cagcttccct	6660
gagcctttcc	agcaagtttg	ttcaagattg	gctgtcaaga	atcatggact	gttattatat	6720
gccttgtttt	ctgtcagtga	gtagacacct	cttccttccc	cctccccgga	attc	6774

<210> 2 <211> 30 • · • · · · • * 9 · • · · · *

9 9 9 « ♦ · <212> DNA <213> Lidská <220>

<221> různé charakteristiky <222> (1) .... (30) <223> Primer (ve směru kódující sekvence) pro klonování 5’předcházející genové sekvence lidského BMP-4 odpovídající regionu exonu 1 <400> 2 ggcagaggag gagggaggga gggaaggagc <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Lidská <220>

<221> různé charakteristiky <222> komplement((1)....(30)) <223> Reversní primer pro klonování 5'předcházející genové sekvence lidského BMP-4 odpovídající regionu exonu 1 <400> 3 gggacctctg aacggttgca gtgaacctgg · fl/ y>do- 76

Claims (6)

Patentové nároky
1. (1) trávení lidské placentární genomové DNA restrikčním enzymem EcoRI;

   1. DNA, jejíž nukleotidová sekvence je tvořena bázemi č. 1 až

   6774 v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí, která kóduje promotorový region lidského kostního morfogenetického proteinu 4, nebo její fragment.
2. (2) izolaci elektroforesou na agarosovém gelu;

   2. Způsob přípravy DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
3. 3. Rekombinantní expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje v reporterovém genu integrovanou úplnou nebo částečnou DNA uvedenou v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí.

   (3) klonováni izolovaného DNA fragmentu tráveného EcoRI do lambda fágového vektoru ÁDASH II zpracovaného stejným enzymem;
4. 4. Způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost vyznačující se tím, že využívá rekombinantní expresní vektor podle nároku 3.

   (4) zabalení uvedeného vektoru do fágu;
5. 5. Způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost podle nároku 4vyznačující se tím, že substance ovlivňující kost je substance indukující osteogenesi.

   (5) vytvoření knihovny genomové DNA pomocí infekce Escherichia coli fágem;

   (6) vyšetřování PCR; a (7) sgbklonování do plasmidového vektoru.
6. 6. Způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost podle nároku 4vyznačující se tím, že substance ovlivňující kost je substance inhibující osteogenesi.