CZ20004017A3 - Lidský BMP-7 promotor a způsob zjištění substancí ovlivňujících kost za použití tohoto promotoru - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení obsahuje způsob zjištění sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-7, za použití aktivity reporterového genu a regionu 5'-předcházejícího genu, který obsahuje BMP-7 promotor a dále za použití zvířecích buněk, do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor spojený s vhodným reportérovým genem. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností ajejich deriváty získané způsobem podle předkládaného řešení mají morfogenetickou aktivitu a inhibiční aktivitu pro kost a chrupavku, které je způsobena prostřednictvím exprese lidského BMP-7, a tyto sloučeniny jsou užitečné jako prolýlaktická nebo terapeutická činidla pro onemocnění kostí nebo chrupavek. Dále jsou sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností ajejich deriváty použitelné jako terapeutická činidla při onemocnění ledvin.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká DNA regionu 5'-předcházejíčího DNA lidského kostního morfogenetického proteinu (BMP, dále 7), který obsahuje promotor. Dále se předkládaný vynález týká způsobu pro výzkum sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-7 pomocí zvířecích nebo kvasinkových buněk, do kterých je vložen rekombinantní expresní vektor obsahující 5'-předcházející region DNA obsahující lidský BMP-4 promotor integrovaný do vhodného reporterového genu, a použití reportérové aktivity jako indikátoru.

Dosavadní stav techniky

V současnosti je kostní morfogenetická aktivita popisována pro kostní morfogenetický faktor, BMP, který náleží do TGF (transformující růstový faktor) β superrodiny (Science 150: 893-897, 1965; Science 242: 1528-1534, 1988). Známými druhy BMP jsou BMP-1 až BMP-14. Je známo, že BMP-2 až BMP-14 mají kostní morfogenetickou aktivitu. BMP-2 až BMP-14 jsou považovány za účinné pro terapeutickou a preventivní léčbu různých kostních dysfunkcí a onemocnění kostí, nicméně, za přirozených okolností se vyskytují ve velmi malých množstvích. Proto vyžadují velká množství BMP-2 až BMP-14 používaná pro tuto léčbu produkci rekombinantního proteinu. Produkce rekombinantního proteinu je obvykle velmi nákladná ve srovnání s produkcí sloučenin s nízkou molekulovou hmotností. Na druhou stranu, existuje mnoho omezení při jejich použití jako léčiv, která jsou určována jejich fyzikálními vlastnostmi a způsobem podáním, které jsou dány jejich proteinovým charakterem. Z těchto důvodů jsou organické sloučeniny s malou molekulou, které mají stejnou aktivitu jako uvedené BMP proteiny, velmi slibnými léčivy. Substance získaná za použití způsobu podle předkládaného vynálezu je aktivní v indukci exprese lidského BMP-7, kostního morfogenetického proteinu, a také má stejnou aktivitu jako lidský BMP-7, jehož použití je velmi užitečné. Naopak, v souvislosti s hyperplasií kosti a chrupavky může inhibice exprese lidského BMP-7 zabránit osteohyperplasii. Předkládaný vynález umožňuje detekci inhibice exprese lidského BMP-7 a poskytuje způsob pro výzkum substancí, které brání takové hyperplasií. Kromě toho je známo, že lidský BMP-7 má schopnost zvyšovat diferenciaci ledvinných buněk (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, svazek 93, str. 9021-9026, 1996). Proto může být pokusný systém podle předkládaného vynálezu použit pro výzkum činidel vhodných pro léčbu onemocnění ledvin.

Pro takový způsob výzkumu byl popsán pouze příklad využívající myšího BMP-2 promotoru (WO 97/15308); neexistuje příklad použití lidského BMP-7 promotoru. Kromě toho, protože materiály pro způsob výzkumu podle předkládaného vynálezu jsou všechny získány z lidských zdrojů, měly by mít substance získané v takovém výzkumu klinické využití.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje 5'-předcházející region DNA obsahující promotor lidského BMP-7. Pomocí použití 5'předcházejícího regionu genu obsahujícího lidský BMP-7 promotor a zvířecích buněk, do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor, který byl integrován s vhodným reportérovým genem, mohou být zkoumány sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují • ·

expresi lidského BMP-7, pomocí reportérové aktivity.

Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a jejich deriváty mají morfogenetickou aktivitu a inhibiční aktivitu pro kost a chrupavku způsobenou prostřednictvím exprese lidského BMP-7 a jsou užitečné jako preventivní nebo terapeutická činidla pro onemocnění kosti nebo chrupavky, jako léky při metastasách do kostí, nebo jako terapeutická nebo profylaktická činidla při nadměrné osteogenesi. Dále jsou tyto sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a jejich deriváty použitelné jako preventivní nebo terapeutická činidla pro onemocnění ledvin.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1- je exonová-intronová struktura 10,8 kb regionu 5'předcházejícího lidskému BMP-7 genu a mapa míst pro restrikční enzymy. Černě je vyznačen exonový region a prázdný čtverec označuje intronový region.

Obr. 2 je rekombinantní expresní vektor (pMSS115) obsahující 5'-předcházející region lidského BMP-7 genu. Region promotoru (4,4 kb) (baze č. 3813 až 8222 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekyencí, od Xbal místa do 3. Xbal od 5'-konce, jak je uvedeno na obr. 1) byl insertován do Nhel restrikčního místa pGL3basic vektoru.

Obr. 3 ukazuje výsledky měření aktivity lidského BMP-7 promotoru (přechodně exprimovaného).

Předkládaný vynález se týká DNA, jejíž nukleotidová sekvence je representována bázemi 1 až 10877 SEQ ID NO: 1 v

Seznamu sekvencí, která kóduje promotorový region lidského kostního morfogenetického proteinu 7, nebo jejího fragmentu.

SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí ukazuje sekvenci 5'předcházejícího regionu lidského BMP-7 genu.

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy DNA podle SEQ ID NO: 1, který obsahuje následující kroky:

(1) trávení lidské placentární genomové DNA restrikčním enzymem HindlII;

(2) izolace elektroforesou na agarosovém gelu;

(3) klonování izolovaného DNA fragmentu tráveného HindlII do lambda fágového vektoru ÁDASH II zpracovaného stejným enzymem;

(4) zabalení uvedeného vektoru do fágu;

(5) vytvoření knihovny genomové DNA pomocí infekce Escherichia coli fágem;

(6) vyšetřování PCR; a (7) subklonování do plasmidového vektoru.

Použitý plasmidový vektor není přesně určen a může být použit jeden z komerčně dostupných vektorů. Výhodným příkladem je pUC18 vektor.

Předkládaný vynález se týká rekombinantního expresního vektor charakterizovaného integrací úplné nebo částečné DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 do reporterového genu. Přesněji, rekombinantní expresní vektor je připraven umístěním vhodného regionu z regionu 5¹-předcházejícího lidskému BMP-7 genu, jak je uveden v SEQ ID NO: 1, před reporterový gen. Reporterový gen, jako je gen pro luciferasu nebo β-galaktosidasu, ukazuje stav exprese na svém původním produktu. Původní vektor pro rekombinantní expresní vektor není přesně určen a může být použit komerční plasmidový vektor. Výhodným vektorem pro použití v předkládaném vynálezu je pGL3-basic. Při použití pGL3-basic se získá pMSS115 (9,2 kb), což je rekombinantní expresní vektor obsahující lidský BMP-7 promotor a

9» ·· • « • · * « · · • 9 · ♦ » · • · 9 9 luciferasový reporterový gen. Předkládaný vynález označuje tento vektor jako rekombinantní expresní vektor. Je nutné vkládat rekombinantní expresní vektor do savčích buněk, výhodně lidských osteoblastových buněk, jako jsou SaOS-2 buňky, s liposomy. Zvířecí buňky stabilně transfektované rekombinantními expresními vektory jsou selektovány pomocí markérů resistence.

Předkládaný vynález se týká způsobu pro výzkum substancí ovlivňujících, při kterém je využito rekombinantního expresního vektor charakterizovaného integrací úplné nebo částečné DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí do reporterového genu. Dále se týká způsobu pro výzkum substancí ovlivňujících kost, ve kterém je uvedenou substancí ovlivňující kost substance indukující osteogenesi nebo substance inhibující osteogenesi. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, které indukují nebo inhibují expresi lidského BMP-4, mohou být získány izolací promotoru, který reguluje expresi genu, jeho navázáním na vhodný reporterový gen a vložením genové struktury do vhodných savčích buněk, za zisku testovacího systému. Substance, které regulují expresi lidského BMP-7 v testovacím systému, působí na promotor a zvyšují nebo snižují expresi reporterového genu. Tak umožňuje jednoduché a snadné měření aktivity reporterového genu vyšetřování uvedených substancí.

Zvířecí buňky transfektované uvedeným vektorem mohou být použity pro testování knihovny chemických sloučenin pomocí vysocevýkoného vyhledávání (Nátuře, svazek 384, Suppl., str. 14-16, 1996) a pro testování aktivních substancí z přirozených substancí. Substance zvyšující nebo snižující aktivitu je vybrána pomocí působení této substance na buňky po určitou dobu a potom pomocí měření aktivity reporterového genu. Takto * ·· · · fefe ·· ·· · fefe · · · · · » ···· · · · · · » • · · · · »····· • i · fe · ···· ··· ·· fefefe fefefe « ·· získaná substance může regulovat expresi buď tak, že působí přímo na transkripční faktor, nebo nepřímo na lidský BMP-7 promotor prostřednictvím regulace systému přenosu signálu. Proto jsou tyto sloučeniny účinné jako terapeutická činidla pro onemocnění kostí a chrupavek, nádorové metastasy do kostí nebo osteohyperplasii.

Dále jsou tyto sloučeniny použitelné jako terapeutická činidla pro onemocnění ledvin.

Substance získaná způsobem podle předkládaného vynálezu má morfogenetickou aktivitu na chrupavku či kost a je účinná jako terapeutické nebo profylaktické činidlo v oboru ortopedické chirurgie (při onemocněních jako jsou fraktury, osteoarthritida, jako je kloubní osteoartritida a osteoartritida kyčelního kloubu, arthrosteitis, poškození chrupavek, jako je poškození menisku, regenerace kosti a deficit chrupavek způsobený poraněním nebo dissekcí nádoru, kostní rekonstrukce jako je spinální fúze a zvětšení páteřního kanálu, a vrozená onemocnění kostí a chrupavek, jako je dysosteogenesa a achondroplasie), nebo v oboru zubního lékařství (při rekonstrukcích kosti jako je například palatoschisa, rekonstrukce mandibuly a konstrukce reziduálního oblouku) a v oblasti léčby osteoporosy. Dále mohou být substance podle předkládaného vynálezu použity při kostních štěpech v plastické chirurgii. Tyto substance jsou také účinné při terapii v oblasti veterinárního lékařství. Na druhou stranu, předkládaný vynález může poskytnout substance, které inhibují morfogenesi kosti nebo chrupavky. V tomto případě jsou takové substance použity jako činidla pro prevenci nebo terapii hyperplasie kosti nebo chrupavky.

Ί • · · · ··· «** · · · · · ·

Dále může předkládaný vynález poskytnout substance se schopností zvyšovat diferenciaci buněk ledvin a tyto substance mohou být použity pro léčbu a prevenci onemocnění ledvin.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález bude nyní dokreslen v následujících příkladech. Tyto příklady jsou ve všech ohledech pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklad 1: Izolace regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-7 genu

Lidská placentární genomová DNA (CloneTech) byla trávena různými restrikčními enzymy (BamHI, BglII, EcoRI, HindlII, Pstl, Sací, Sáli, Smál, SPhl a Xbal), byla separována elektroforesou na agarosovém gelu, přenesena na nylonovou membránu a zpracována southernovou hybridizací za standardních podmínek za použití BMP-7 cDNA (EMBO J., 9: 2085-2093, 1990) jako sondy. Bylo zjištěno, že trávení restrikčním enzymem EcoRI spolu s dalšími restrikčnními enzymy vedlo k zisku DNA fragmentu velikosti přibližně 11 kb, který obsahoval nejdelší lidský BMP-7 gen. Potom byla lidská placentární genomová DNA trávena restrikčním enzymem HindlII a byla separována elektroforesou na agarosovém gelu pro extrakci DNA fragmentu velikosti přibližně 11 kb z agarosového gelu. Získaný DNA fragment byl klonován do lambda fágového vektoru ÁDASH II (Stratagene Ltd.) tráveného restrikčním enzymem HindlII.

Vektor byl in vitro zpracován Gigapack III XL extraktem (Stratagene Ltd.), byl použit pro infekci Escherichia coli

XLl-Blue MRA (Stratagene Ltd.), za vzniku knihovny genomové

DNA. Knihovna byla rozdělena do několika souborů. Každý soubor byl amplifikován skríningem (Nucleic Acids Research 21: 2627• ·

99

2631, 1993) za použití PCR; přesněji, PCR využívající PCR primery (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 3 Seznamu sekvencí) odpovídající translačnímu regionu pro selekci požadovaného souboru, za zisku regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-7 genu (10,8 kb). Potom byl 5'-předcházející 10,8 kb fragment subklonován do pUC18 vektoru (Amersham Pharmacia Biotech.). Vektor byl označen E. coli pKOT 314. E. coli pKOT 314 byl uložen v National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566 Japan, 30.3.1998, pod přírůstkovým číslem FERM P-16737 a byl přenesen do International Depository Authority podle Budapešťské smlouvy 17.2.1-998 (přírůstkové č. FERM BP-6651) .

Příklad 2: Stanovení DNA sekvence regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-7 genu

Sekvence získaného regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP7 genu byla stanovena pomocí ALF DNA sekvenátoru (Amersham Pharmacia Biotech), způsobem podle Sanger et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). Takto analyzovaná sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí. Baze č. 5557 až 10780 SEQ ID NO: 1 již byly popsány dříve (EMBO J., 9: 2085-2093, 1990). Nicméně, existuje mnoho odlišností od sekvence podle předkládaného vynálezu.

Příklad 3: Konstrukce rekombinantního expresního vektoru obsahujícího lidský BMP-7 promotor a luciferasový reporterový gen

Jak je uvedeno na obr. 1, promotor lidského BMP-7 se vyskytuje před exonem 1. Region 4,4 kb obsahující promotor • · «ί.* ΐ Σ * ί J ί ί ··· ·· ··· ♦·· «Α ·φ lokalizovaný od druhého Xbal do třetího Xbal od 5'-konce, jak je popsán na obr. 1 byl - pro sestavení do pozice před reportérovým genem - insertován do Nhel restrikčního místa luciferasového reporterového vektoru pGL3-basic (Pro Mega Ltd.), za zisku rekombinantního expresního vektoru pMSS115 (9,2 kb). Tento vektor je uveden na obr. 2.

Příklad 4: Měření aktivity lidského BMP-7 promotoru (vložení rekombinantního expresního vektoru do lidských buněk a přechodná exprese)

Pro přechodnou expresi lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru byl uvedený rekombinantní expresní vektor (pMSSl-15) smísen s vektorem pRL-SV40 (Pro Mega Co.) obsahujícím gen pro luciferasu z mořské macešky, který byl použit jako vnitřní kontrola pro měření účinnosti vložení genu, při stejném použitém množství. Potom byl s uvedeným DNA roztokem smísen kationtový liposom lipofektamin (Lifetech Oriental Co.) a pro transfekci byla tato směs přidána k lidským osteoosarkomovým buňkám HOS, MG63 a SaOS-2. Aktivita světluškové luciferasy a aktivita luciferasy z mořských macešek byly měřeny Pikka Gene Duál Křtem (Toyo Ink. Co.). Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Aktivita promotoru byla vyjádřena jako poměr aktivity světluškové luciferasy a aktivity luciferasy z mořských macešek. Z výsledků je zřejmé, že DNA SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí má promotorovou aktivitu

Příklad 5: Vložení rekombinantního expresního vektoru do lidských buněk a stabilní exprese

Pro stabilní expresi lidského BMP-7 rekombinantního expresního vektoru byly výše uvedené vektory smíseny v poměru

10:1 s vektorem pPUR (CloneTech Ltd.) obsahujícím gen pro resistenci na puromycin a dále byly smíseny s kationtovým liposomem lipofektaminem (Lifetech Oriental Co.) pro transfekci lidských osteosarkomových buněk HOS. Buňky, do kterých byl vložen vybraný gen, byly selektovány na kultivačním mediu obsahujícím puromycin (Sigma, Ltd.).

Příklad 6: Vyhledávání aktivních sloučenin s nízkou molekulovou hmotností

Selektované buňky byly naočkovány do 96-jamkové plotny, byly ošetřeny různými chemickými sloučeninami z knihoven během 1-3 dnů, byly rozpuštěny v cytolytickém činidle (Pro Mega Ltd.) -a enzymatická aktivita byla měřena za použití luciferasového testovacího kitu (Pro Mega Ltd.). Tímto způsobem mohly být testovány různé substance indukující nebo inhibující expresi lidského BMP-7.

Seznam sekvencí <110> Hoechst Marion Roussel, Ltd.

<120> Lidský BMP-7 promotor a způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost za použití tohoto promotoru <130> JH98K005 PCT sekvence v angličtině <14 0>

<141>

<150> 10-120174 <151> 1998-04-30 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 10877 <212> DNA <213> Lidská <220>

<221> různé charakteristiky <222> (1)....(10877) <223> 5'předcházející genová sekvence lidského BMP-7 včetně regionů exonu 1 <400><l aagcttggac atcagatagc tgtgtcattc atgctaactc ttattagttg ttgcatcata 60 tgtaagatga gctcaaatct gttaatcttc ccatacgatc ttttcacatg agttgggact 120 aacctgttat atttagagta atggtttacc aatggggagg gaataaagat aaaactcgaa 180 gtaaaagaaa gaatacaatt ttttaaatga ggagaaacac agtgaaggag aggagagaag 240 gaagaaaaca acagagatgg agagaagcac gacgtggggt ggtgaggagt tcccaggact 300 ctgggagcga ggagcccagt ctaatccctg attcactgta agactttggg cccagcagtt 360 tctctttggg tgtcaatttc tctatcttca agatgaagga attgaaccac gcttctgcag 420

			• *· fl · *· ♦ ·« ·« 17 · · · · * · ··· ·· «·· ··	»» ·♦ • · ♦ · » · · · • · · · . • · · · • « · · ·
gacttttgtt	gtaactgact	ggaaactccg	tacacaatgg	cttaaactga	acagtcctgg	480
gtggggctgg	cttcagggat	agtgggctcc	aggggctcac	tgatgctgtc	agtctcctgc	540
cttttcttgt	tttactgtct	tgtggcttct	ctcacagggc	aggctctccc	tgaagggagg	600
gaagatgaca	cccagcagca	gcccctgacc	tagcaacccc	agtgggagga	gagacccctt	660
taccggtagt	tctagcaaaa	gttctaaaag	ttgaatctca	ctggcctgga	ttaggtcaca	720
tgactgtcac	tgaacccatc	gcatgggcat	ctctggttga	ccaggctggg	tcatgtgccc	780
agtctgaatt	ttagagaaga	ggatagttca	acctgaaata	cagggactga	tggtgaagaa	840
ggggcatttc	tactgaggaa	aacagaggaa	atcttggcca	ggcacagtgg	cttatgcctg	900
taatcccagc	actttgagag	gccaagatgg	atggattgtt	tgaggcccgg	agttcaagac	960
cagtctggcc	agcgtggtgt	aaccctgtct	tctactaaaa	atacaaaaat	tagccaggca	1020
tggtggtgca	cacctgtaat	tccagctact	cgggggggct	gaggagggag	aattgcttga	1080
aaccgggagg	cagaggttac	agtgagctga	gattgtgcca	ttgcactcca	gcctgggtga	1140
cagagggaga	ctctgtctaa	aaaaaaaaag	aaaagaaaag	aaaacagagg	aaatatttgc	1200
agaagaagga	aaaaaggcag	gggtctcaaa	ttaggtgagc	ttccaaagtg	ttttctgtgg	1260
aaccctggga	ccagagaaaa	tggtagtgaa	aagaaacagg	cctggggact	ctgggcccct	1320
gctgggatca	cctgataaca	ggcagggtgt	ccagtccgat	ttgaacttca	gataaacaac	1380
gagtaaattt	cagtatgagt	atatataata	catatactcc	aatataatgg	gatatagtca	1440
tactaaaatt	cattcattgt	ttatctgaaa	ttcaaattga	actggacacc	tatttttttt	1500
tttgcaaaat	gtggtaaccc	tagtccctcc	cctgctctat	gtaaccaaag	aagctctgtt	1560
tctgttttct	gtgtcgagca	tgtgtgaaaa	actccttgac	caaaagtttt	agcgctgcac	1620
aaaagagaag	gcctgtatcc	ttttaactga	catgattgcc	atgccctctc	cagctcccca	1680
gtgctgtatc	cagcagggct	tctggctgca	ggcaacagaa	accagcttgg	gcaggctggt	1740
gcggaaaagg	agaccactag	aggatcttgg	gggctcacag	aacccctggg	aaggccagag	1800
aaccaggctt	cggggctctc	tagttgggac	acggccccag	atcactctgc	agaatagtct	1860
gggcctgcac	tgatagcttc	tggggtgggt	gcctctgact	ggctgaaact	tggtcacctg	1920
tcagggctct	ggctgcaaag	caggctagac	agtgcctctc	tggatattca	ccagatgggg	1980
catcctcaac	cataagagag	ggctcagatc	tagctgggag	gagggagatg	ctgaaaagca	2040
ggagcaatga	acactcactc	ctgctcttgc	agatggaatt	ctggtttttg	atgtttctcg	2100
ggagaggggg	agtttatcag	atcagtcacc	agggccaaac	agcagagttt	tgctgggaag	2160'
ggactctggg	gaaggttagg	gtcagatttt	gcctaaaggg	gcagacagtt	ccagcctttt	2220
caaccactgg	ctcagtagcc	ctcgaatcat	gaattcaatg	gagctgtctt	gaaatgcacc	2280
atccttggtg	gtcctttggt	ttgggtgatg	ggttggggga	ggctgggcac	afccctccaga	2340
cacagcagag	ccctttatga	ggccaggggc	aaaccagatt	catcgaatct	gactggtaga	2400
tgtgtcttct	ttggtctaat	aaccaaaacg	agttgaatta	gttgccaaca	gataaacatt	2460
gagagatgtc	acattcaaac	tcaagtttct	agcttctttg	gaaaatcaga	actttctggt	2520
gatgttggaa	tcaaatttct	ggatggcatc	acccatgggc	atgtggtttc	cagttcaccc	2580
cagtctgcac	cctccttatt	tatccaggcc	agtgtctcct	gccacctgtc	accatgtctg	2640
tgctcatgat	tgccttccat	taaattaaga	ggaagagaaa	tattccttga	gcttcatgtt	2700

* 4 ·» «

1

gcatctctgt atttatgtta cctggttggt gcccgttggc ttttgagtgt atgacttctg 2760
caataaagga	ggaattgaag	aagggctcag	aggtatgttc	ctcaaacact	gatagggcat	2320
ctactgtgtg	caaggcctcc	atgggtactg	ggaggtccct	acaggactaa	gacaaaccct	2880
gtgttttggt	gtacctcaat	gtttaaggac	ttaagtcctg	gaacaagata	gccggcgtca	2940
gaattctgat	tttaccattc	actcaccatt	ggtgtggctt	tgggcaggtt	ccctcaagta	3000
tttgagcctc	aatttcctca	tctgtaaaat	ggggataata	ataataaaaa	tcatacaagg	3060
tagttgggag	aattaatgag	ttaattttaa	aagacacctg	gaatcataga	tattgaagtt	3120
ttaatttgaa	gccccaattt	gtcagctata	acttcagaaa	tctagagcct	cgatcgtcaa	3180
catacagcct	gaagacgaca	gcctccgagc	cccccaggag	ctagttagaa	gtgcagaatc	3240
tcagctcact	cagactgact	gtgggaatct	átgttctaac	agacccccag	gggattcaca	3300
cgcacagttg	ggttggagaa	gtgttgcttt	aggttaaagc	aaggaaggaa	ggggctgctc	3360
ccaggtcact	gaacgtgcac	tgatgcttaa	aggcctgggc	tgtgtagaca	gatgtggctt	3420
tggatcctgg	ctccattaca	gattagattg	gctgtctgac	tctggacaag	gtgctctcgg	3480
gatgttggtc	ctcctctgca	atctgaggag	cagaactagc	ctctccatgc	agtggggagt	3540
tgcgggtgat	gtgggcttgg	gccgtgcagg	cctagcaggt	gcccagcaga	agcaagtgct	3600
cccaacaggt	gacaggtcgg	ccgctcccct	gtcacgtttt	ggaaggagga	aagggctacc	3660
tctagtgctg	aaccgaggat	agttagtgct	caaaaccata	ccagatttcc	tccaatcaag	3720
gaagaaataa	cagccctgat	aataataaac	aaaaccactg	cttcccccta	gctggcttcc	3780
agatcctaga	aatcctgcat	ggtatcagct	tctctagagt	gtgtgtgtcg	tctgtatttt	3840
ccatttggaa	ctgtggccac	tgccatgtgt	acttaagact	gatggaagac	gtttaatctc	3900
ttattctgct	gcttttaaag	ttgtgcaaag	aaaatctcag	agtgggcaag	cgtgaggagt	3960
ccaagcctcc	cgtgcaatga	gagatctgcg	tgggaaacaa	aatttcacca	caggtgtgct	4020
ct-aataattt	cctctgcagg	gtccacctct	gcacacaacg	attttcaagc	ctgtgcagga	4080
ggcagctctt	ggccctctat	tccttgttgg	ggttggaggt	ccaggtcatc	tggcctttgc	4140
caggtggtgt	ggacagagag	agagcagccc	actggcttcc	ttggctgtgc	tccccaggga	4200
gcttccaggc	cagctgagcc	tcctctaggg	cagatggatg	aagatgaggt	ccccacctcg	4260
ctgaacaatg	tgtgtgtcag	cagaattctt	ttcttctttt	tactgcctta	gagagacatg	4320
ctgacttggt	caaaatcact	tcagcaagat	gtgactgatg	atgtaggaaa	tgaaaactcc	4380
tggcccagca	ctgggaggcc	agcaggcgag	gggcgcggac	actgggaccg	ggccacccga	444θ
cacaataaca	ccccttacaa	ttccaggccg	tctttcatcc	aggcaaaggc	ggccccaggt	4500
gtggagcaga	ctggggcaga	tcagattacg	gtcctggagc	ccagtgctgg	gtgccctggc	4560
caggggaacc	acaactgggg	gtgtgtgggt	tgggggctag	ctgctgggga	aatgagatag	4620
gacccaggga	agtccctggg	ccccagctgg	cctgcagggg	gcctaggcac	aatgtgagga	4680
ttggaatgca	gtgatgacct	tttcatctct	catgttccct	tccacttcac	tctctctttt	4740
gctctggtac	ttttgctctt	gctctcagag	tcaggataca	tctgcttttc	tctgcttggc	4800
aaaaagcaga	ccatcatgaa	aagttttgtt	gtaatttgaa	actcaggagg	ctttcctgtt	4860
accatatttt	ccttttcatc	cagatggtaa	cacaataaca	tttatcaagg	gttttctctg	4920
tgttccaggc	actgtgcaaa	gccctttcca	tgaattaagt	tctgcaacct	cacagcgatc	4980

• » »· 99

999

9 9

9

9 ·

9 9

ccagaagaca	ggcgctatca	gtccccccat	··· tttacagatg	·· ♦·» » ggggaactga	ggtgtagácja	5040
ggttaagtcc	cttgcccatg	gtgcacagct	ggaagagaca	gagctggagt	gtgaatgcgg	5100
ctgggcaggc	tccagtgccc	aggctacctc	ctccacacaa	gacttgccct	cggcaatctc	5160
aaagcctttt	ctggtggtgg	gctcagctcc	caaactggca	tcggatgcac	tcccagccag	5220
atatttcttg	cttgccggtt	ttcattcatt	cattcattca	ttcattcatt	cattcattcg	5280
gcattcactg	agggcctggt	gcagtcttgg	ggatgcctct	cggggaggaa	acagggaaaa	5340
gaaagacccc	cccaccaagc	atggatcaca	gaaaagataa	ggctaaatgg	gggtttgtgg	5400
gacttcagag	gaaaccttat	ctcttgaggt	cttggatatg	aagagcatgt	tgtctcttcc	5460
tcttgcatga	gaaaagatgg	cgtctcagag	gaagggttgc	tggggtgagg	gatctgggag	5520
átgccttagc	ttggcgcctg	cacagtcagc	čctcagtcaa	ccggtctctt	taggttttgg	5580
ctgtgcttat	tactattcat	tcaacaggta	ctaattgagc	acctgctgtg	tgccaggctc	5640
agaataggct	caggtgagat	gcacaaagaa	gggtaaacta	gaatccttgc	ttagacactg	5700
acggatcagt	tgtttcatat	gtaaattgta	gcaccaagac	ctgctgcccc	tgcccccagc	5760
ctcacctgct	tgtgaagatc	cctccaaaag	atttgagagt	agataaaaag	cagagactac	5820
tactgaagaa	cagggctgct	ttggctcctt	attatttcag	actttggaag	aaaatgacct	5880
cctttttctc	tactggcact	ggaggtggca	tagctgtccc	tagcaagcca	gcgctggagg	5940
gcgtgtgcag	ggctggggac	cgagcctggt	ttctgttccc	tgctctgcag	gctcaagcac	6000
ttgctgttcc	tccacctggg	atgcctttcc	ctggaaaagc	ctgtctcttt	cttgtctttc	6060
aggactcagg	tcagtggcat	ctcctccaaa	aactcccctt	cccaccctcc	atcacctcac	6120
cctgtttatc	tgcgcccccg	cccccactgc	ctgtcactta	ttgcaggctg	aagtgaccca	6180
ggctctccag	ttgtacactc	tcagatggac	cctggacgac	tgtggcactc	ctgcaatttc	6240
cccagtctcc	ctggggtagg	attcctgctt	gccaggatgc	ccacctttcc	ttctccctcc	6300
tgcatgtcct	cctctgcctg	gčttctgaat	tgttcccaga	gagagtgata	gacaagatct	6360
gcctctcctt	cagtccctga	atcttattta	aggctcttgc	tttgcttccc	tggcctggag	6420
gcggctcctt	gatggagtct	gccatgtggg	ttcgctcatg	gccatgtctt	cctgcccagc	6480
aťggtgcttg	gccctgggac	tggccacata	atatctgggc	caggtgcaaa	attagtacgg	6540
ggcagggggt	actttgttca	taggtgattc	agaaccacat	atggtgacct	cagagtagga	6600
aaccaagtgt	ggggccctta	agagctgggg	ggccctgtac	gactgtccag	gttgcaggcc	6660
ccacagctcg	cctcctgata	tcctgtgctc	catgcttgtc	tgttgaagga	aggagtgaat	6720
ggatgaagag	caggtggtgg	gggtggtttg	agggccttgc	tggtgggtgg	gtagaggccc	6780
ctccctggca	tggggctcaa	gacctgttcc	atcccacagc	ctggagcctg	tgtgtaaatg	6840
gccaggacct	gcaggctggc	atttttctgc	tccttgcctg	cctctggcct	cccctttctc	6900
cacccatgtg	gcccctcagg	ttgccatcta	gtccaaaagt	ccccaaggga	gacccagagg	6960
gccacttggc	caaactactt	ctgctccaga	aaactgtaga	agaccataat	tctcttcccc	7020
agctctcctg	ctccaggaag	gacagcccca	aagtgaggct	tagccagagc	ccctcccaga	7080
caagcgcccc	cgcttcccca	acctcagccc	ttcccagttc	atcccaaagg	ccctctgggg	7140
acccactctc	tcacccagcc	ccaggagggg	aaggagacag	gatgaacttt	tacčccgctg	7200
ccctcactgc	cactctgggt	gcagtaattc	ccttgagatc	ccacaccggc	agagggaccg	7260

			i5 ·	» ♦ *· »·» »	♦ »9 · 9 9 9 *·
gtgggttctg	agtggtctgg	ggactccctg	tgacagcg.tg	catggctcgg	tattgattga	7320
gggatgaatg	gatgaggaga	gacaggagag	gaggccgatg	gggaggtctc	aggcacagac	7380
ccttggaggg	gaagaggatg	tgaagaccag	cggctggctc	cccaggcact	gccacgagga	7440
gggctgatgg	gaagccctag	tggtggggct	gggctgtctg	gtctcaggct	gaggggtggc	7500
tggaaagata	cagggccccg	aagaggagga	ggtgggaaga	acccccccag	ctcacacgca	7560
gttcacttat	tcactcaaca	aatcgtgact	gcgcacgtac	agtggctacc	aggcgctggg	7620
ttcaaggcac	tgcgggtacc	agaggtgcgg	agaagatcgc	tgatccgggc	cccagtgctc	7680
tgggtgtcta	gcgggggtaa	gaaggcaata	aagaaggcac	ggagtaactc	aaacagcaat	7740
tccagacagc	aagagaaact	acaggaaaga	aaacaaacgt	gcgaggggcg	aggcgaggaa	7800
acaacctcag	cttggcaggt	cttggaggtc	tctgggagga	gaaagcagcg	tctgatgggg	7860
gcgggaggtg	gtgagtgggg	agaggtccag	gcggagggaa	tggcgagcgc	agagacaggc	7920
tggcaacggc	ttcagggagg	cgcggagggg	tcagcgtggc	tggcttaaaa	ggatacatgg	7980
gactgagggg	caagaccggc	tcaagggtca	ccgcttccag	gaagccttct	atttccgcgc	8040
caacctcggc	gctcccccaa	cttttcccac	cgcggtccgc	agcccacccg	tcctgctcgg	8100
gccgccttcc	tggtccggac	cgcgagtgcc	gagagggcag	ggccggctcc	aattcctcca	8160
gccgcatccc	cgcgacgtcc	cgccaggctc	taggcacccc	gtgggcactc	agtaaacatt	8220
tgtcgagcgc	tctagaggga	atgaatgaac	ccactgggca	cagctggggg	gagggcgggg	8280
ccgagggcag	gtgggaggcc	gccggcgcgg	gaggggcčcc	tcgaagcccg	tcctcctcct	8340
cctcctcctc	cgcccaggcc	ccagcgcgta	ccactctggc	gctcccgagg	cggcctcttg	8400
tgcgatccag	ggcgcacaag	gctgggagag	cgccccgggg	ccčctgctat	ccgcgccgga	8460
gttggaagag	ggtgggttgc	cgccgcccga	gggcgagagc	gccagaggag	cgggaagaag	8520
gagcgctcgc	ccgcccgcct	gcctcctcgc	tgcctccccg	gcgttggctc	tctggactcc	8580
taggcttgct	ggctgctcct	cccacccgca	cccgcctcct	cactcgcctt	ttcgttcgcc	8640
ggggctgctt	tccaagccct	gcggtgcgcc	cgggcgagtg	cggggcgagg	ggcccggggc	8700
cagcaccgag	cagggggcgg	gggtccgggc	agagcgcggc	cggccgggga	ggggccatgt	8760
ctggcgcggg	cgcagcgggg	cccgtctgca	gcaagtgacc	gacggccggg	acggccgcct	8820
gccccctctg	ccacctgggg	cggtgcgggc	ccggagcccg	gagcccgggt	agcgcgtaga	8880
gccggcgcga	tgcacgtgcg	ctcactgcga	gctgcggcgc	cgcacagctt	cgtggcgctc	8940
tgggcacccc	tgttcctgct	gcgctccgcc	ctggccgact	tcagcctgga	caacgaggtg	9000'
cactcgagct	tcatccaccg	gcgcctccgc	agccaggagc	ggcgggagat	gcagcgcgag	9060
atcctctcca	ttttgggctt	gccccaccgc	ccgcgcccgc	acctccaggg	caagcacaac	9120
tcggcaccca	tgttcatgct	ggacctgtac	aacgccatgg	cggtggagga	gggcggcggg	9180
cccggcggcc	agggcttctc	ctacccctac	aaggccgtct	tcagtaccca	gggcccccct	9240
ctggccagcc	tgcaagatag	ccatttcctc	accgacgccg	acatggtcat	gagcttcgtc	9300
aacctcggtg	agtaagggca	ggcgagggta	cgcgtctcct	ttcgggggca	ctttgagact	9360
gggagggagg	gagccgcttc	ttctatgcag	cccgcccagc	tttccgctcc	tggctgaaat	9420
cgcagtgcct	gcccgagggt	ctcccaccca	cagccctatg	actcccaagc	tgtgtgcgcc	9480
cccaggtcgg	gcgcgctggg	ttcggtgagc	ctgtaggggt	tactgggaag	gagggatcct	9540

	• 16 •	99 9 ♦ 9· 999 9 9 9 9 · 9 9 9 9 99 999	• ** • · · * « • · · · * · · · · • » · » ♦ ·· ··	»9 • 9 • 9 » 9
ccgaagtccc	ctccatgtta	cgccgccggc	cgcatctctg	gggctggagg	caagggccgt	9600
tcaaagcgcg	gggctcggtc	atgtgagctg	tcccgggccg	gcgcggctcg	cgtaacctgg	9660
atgtaaaggg	cccttcccgg	cgaggctgcc	ttgccgccct	tcctgggccc	ctctcagccc	9720
tgcctggccc	tggcatcgcg	gccgtcgcac	ccccttaccc	tccctgtcaa	gccctacctg	9780
tcccctcgtg	gtgcgcccgc	cttagcgtac	cgcgcgctcc	gagcgcttgg	ggcccctctc	9840
cgggccgccg	gatgccccat	tctctcttgg	ctggagctgg	ggaagaaacg	gtgccattgc	9900
taattttctt	tgttttcttt	ctttgtttat	tttttttctt	ttttcttttt	ttttcttttc	9960
ttttcttttc	tttttttttt	ttttttgaga	cggagttcac	tcttgtcgcc	cagtctggag	10020
tgcaatggcg	cgatctctgc	tcaccgcaac	ctctgcctcc	cgggttcaag	cgattctcgt	10080
gcctcagcct	cccgagtagc	tgggattaca	gcatgcgcca	ccatgcctgg	ctaattttgt	10140
atttttagta	gagacagggt	ttctccatgt	taggcaggct	ggtctcgaac	tcccgatctc	10200
aggtgatcct	cccgcctcag	cctcccaaag	tggtgctggg	attacaggcg	tgagccactg	10260
tgccctgccg	ctagtcttct	attttaagta	tttagtggta	ggtcccgggc	cggcagaatc	10320
tattttcagc	atttaccacg	tgtggcgcgc	aaaccacagg	ttttggcgat	tgggttgcgc	10380
gggatctcag	actgacacgc	gggggcggct	gggggtcccg	gtttccgact	ggagccgcga	104 40
cgaccccggc	gacgcgagcc	tggggctgca	gcgagggccg	gggagctccc	cctccatatg	10500
tgcgcgcaca	ttctccagac	ttgctcaaac	taaccccccg	cggcgccagc	gcgctgcggg	10560
actgatgatc	aaatatttgg	tttccgagat	aacacacccc	gatagcgctg	tttcctgagc	10620
cgctttcatt	ctacttgtgt	aacttgctgc	gaaaacccga	accaagtcaa	gacagcaaac	10680
tcaccccacg	ggcgctgtgt	caacatggaa	átaatgatac	tgaagcccca	cgctgggcac	10740
ctggggcgtg	gactgggggc	gcgggggaag	cgcagatccg	ccttcatgct	tcccccctcc	10800
tgataaggtc	cctggagttc	ccgggaggcc	attgtctgta	cttaataata	actaaatcca	10860
actagtgaac	caagctt					10877

<210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Lidská <220>

<221> různé charakteristiky <222> (1)....(30) <223> Primer (ve směru kódující sekvence) pro klonování 5'předcházející genové sekvence lidského BMP-7 odpovídající regionu exonu 1 <400> 2 gggcgcagcg gggcccgtct gcagcaagtg <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Lidská <220>

<221> různé charakteristiky <222> komplement((1) .... (30) ) <223> Reversní primer pro klonování 5'předcházející genové sekvence lidského BMP-7 odpovídající regionu exonu 1 <400> 3 agaggatctc gcgctgcatc tcccgccgct *· *· · ·· ♦· · » · • ··· · · 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 9

4 4 4 4 4 4 4

444 44 494 444 44

Claims (7)

Patentové nároky
1. (1) trávení lidské placentární genomové DNA restrikčním enzymem HindlII;

   1. DNA, jejíž nukleotidová sekvence je tvořena bázemi č. 1 až 10877 v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí, která kóduje promotorový region lidského kostního morfogenetického proteinu 7, nebo její fragment.
2. (2) izolaci elektroforesou na agarosovém gelu;

   2. Způsob přípravy DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
3. 3. Rekombinantní expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje v reporterovém genu integrovanou úplnou nebo částečnou DNA uvedenou v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí.

   (3) klonování izolovaného DNA fragmentu tráveného HindlII do lambda fágového vektoru ÁDASH II zpracovaného stejným enzymem;
4. 4. Způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost vyznačující se tím, že využívá rekombinantní expresní vektor podle nároku 3.

   (4) zabalení uvedeného vektoru do fágu;
5. 5. Způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost podle nároku 4vyznačující se tím, že substance ovlivňující kost je substance indukující osteogenesi.

   • · •· φ φφ * φφφφ φ • φφφ φ

   10 · · · ·

   17 ··· ·♦ φφφ*

   (5) vytvoření knihovny genomové DNA pomocí infekce Escherichia coli fágem;
6. 6. Způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kost podle nároku 4vyznačující se tím, že substance ovlivňující kost je substance inhibující osteogenesi.

   (6) vyšetřování PCR; a (7) subklonování do plasmidového vektoru.
7. 7. Způsob pro výzkum substancí účinných při léčbě onemocnění ledvin vyznačující se tím, že využívá rekombinantního expresního vektoru podle nároku 3.