CZ20004032A3 - Zdokonalená produkce protilátek specifických pro FAP-alfa - Google Patents

Abstract

Rekombinantní protilátkové proteiny, které se specificky váží na fibroblastový aktivační protein alfa (FAPa) a obsahuje úpravy základní struktury, které vedou ke zlepšené produktivitě v hostitelských buňkách. Použití uvedených protilátek pro diagnostické a terapeutické účely a způsoby produkce uvedených protilátek

Description

Zdokonalená produkce protilátek specifických pro FAP-ct

Oblast techniky

Vynález popisuje protilátkové proteiny, které se specificky vážou na fibroblastový aktivační protein alfa (FAPct). Vynález se také týká použití uvedených protilátek pro diagnostické a terapeutické účely a metod produkce uvedených protilátek.

Dosavadní stav techniky

Invazivní růst zhoubného bujení epitelu je spojen s řadou charakteristik buněčných a molekulárních změn v podpůrné vazivové tkáni. Vysoce konzistentní molekulární znak reaktivní podpůrné tkáně mnoha typů zhoubného bujení epithelu je indukce fibroblastového aktivačního proteinu alfa (označeného jako FAP). Je to molekula na povrchu buňky, která reaguje s fibroblasty podpůrné vazivové tkáně, které se původně identifikovaly pomocí monoklonálních protilátek F19 (popisuje se v publikaci Garin-Chesa P., Old L. J. and Retting W. J. (1990) Cell surface dlycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epithelial cancers. Proč. Nati. Acad. Sci. 87: 7235). Vzhledem k tomu, že antigen FAP se selektivně exprimuje v podpůrné vazivové tkáni zhoubného bujení epithelu nezávisle na oblasti a histologíckém typu, vyvinula se koncepce cílení FAP, aby bylo možné zobrazit, diagnostikovat a léčit zhoubné bujení epitelu a jistých jiných poruch. Pro tyto účely se vyvinuly monoklonální protilátky, které se označily jako F19 a které specificky váží FAP. Popisují se v publikaci US patent 5,059,523 a WO

93/05804.

• · • · · • · · • · · ·

Když se u lidí při aplikaci in vivo použijí protilátky, které nejsou lidského původu, vyvolá se proti nim u člověka odezva, jenž snižuje u pacientů účinnost protilátek a přerušuje kontinuální aplikaci protilátek. Humanizace nelidských protilátek se běžně dosáhne jednou ze dvou cest: (1) konstrukcí nelidských/lidských chimérových protilátek, kde nelidské variabilní oblasti jsou spojené s lidskými konstantními oblastmi (popisuje se v publikaci Boulianne G. L., Hozumi N. and Shulman, M. J. (1984) Production of functional chimeric mouse/human antibody Nátuře 312: 643) nebo

2) zavedením oblastí, které určují komplementaritu (CDR) a pocházejí z variabilních oblastí, jenž nepochází z člověka, do lidských variabilních oblastí a spojení uvedených upravených lidských variabilních oblastí na lidské konstantní oblasti (Riechmann L., Clark M., Waldmann H. and Winter G. (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nátuře 332: 323) .

Chimérové protilátky, ačkoli jsou podstatně lepší než myší protilátky, mohou stále vyvolat u lidí odezvu proti myším protilátkám (popisuje se v publikaci LoBuglio A. F., Wheeler R. H., Trang J. , Haynes A., Rogers K. , Harvey E. B.

, Sun L.,

Ghrayeb J. and Khazaeli Μ. B. (1989) Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: Kinetics and immune response. Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 4220). Lidské protilátky, které obsahují zavedený CDR a jsou upraveny, obsahují malou nebo žádnou část proteinových sekvencí, které se odvodily z myších protilátek. Ačkoli protilátky humanizované zavedením CDR mohou být stále schopny vyvolat nějaké imunitní reakce, jako například anti-alotypovou nebo anti-idiotypovou odezvu, jak je možné vidět u přirozených lidských protilátek, protilátky se zavedeným CDR budou podstatně méně imunogenní ve srovnání s myšími protilátkami, což umožňuje prodloužit léčbu pacientů.

Jiné vážné omezení vztahující se na běžné použití protilátek při diagnostice, zobrazení a léčbě je jejich produkce ve velkém množství. V mnoha případech rekombinantní • · · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ······· ·· tt exprese přirozených, chimérových protilátek a/nebo protilátek, které máji zavedenu CDR v systémech buněčných kultur je chudá. Faktory, které přispívají k nízké produkci zahrnují volbu vedoucích sekvencí a hostitelských buněk vhodných pro produkci stejně jako nesprávné balení a omezené vylučování. Nesprávné balení může vést k nesprávnému uspořádání těžkého a lehkého řetězce transportní nekompetentní uspořádání, které nedovoluje vylučování jednoho nebo více řetězců. V obecném případě se přijímá, že L-řetězec uděluje schopnost vylučovat uspořádaný protein. V některých případech může vícenásobná nebo dokonce jediná substituce vést ke zvýšené produkci protilátek.

Vzhledem ke klinické důležitosti specifického imunologického cílení in vitro a in vivo specifických antigenů spojených s nemocí vhodných pro diagnostoikování a léčbu u lidí, existuje nutnost vyvinout protilátky, které kombinují rysy specifity antigenu, nízkou imunogenicitu a vysokou produkci.

Proto základním problémem vynálezu je získat protilátkové proteiny, které kombinují vlastnosti specifického navázání na FAP, nízkou imunogenicitu u lidí a vysokou produkci v rekombinantním systému.

Podstata vynálezu

Technický problém řeší provedení vynálezu, která se popisují v příkladech.

Vynález se týká nových protilátkových proteinů, které vykazují oblasti stanovující komplementaritu monoklonálních protilátek F19 (ATCC číslo uložení HB 8269), přičemž nové protilátkové proteiny se specificky váží na fibroblastový aktivační protein (FAP), který se charakterizuje tím, že se upravila základní struktura, což vede ke zdokonalené produkci • φ • · · · · v hostitelských buňkách, což se porovnává s chimérovými protilátkami, které vykazuji variabilní oblasti F19 a cizorodé konstantní oblasti.

Termín „protilátkový protein je protein vykazující vazebnou specifitu pro antigen monoklonálních protilátek.

Termín „oblasti monoklonálních protilátek určujících komplementaritu znamená ty aminokyselinové sekvence, které se podílejí na specifickém navázání antigenu, což se popisuje v publikaci Kabat E. A., Wu Τ. T., Perry Η. Μ. , Gottesman K. S. and Foeller C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5^th Ed. ) . NIH Publication č. 91-3242. US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) ve spojení s publikací Chotha and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917.

Termín „úpravy základní delece nebo přidání jediné struktury znamenají záměny, nebo více aminokyselin ve variabilních oblastech, které obklopují jednotlivé oblasti determinující komplementaritu. Úpravy základní struktury mohou mít vliv na imunogenitu, produkci nebo vazebnou specifitu protilátkového proteinu.

Termín „fibroblastový aktivační protein (FAP), který se také označuje jako fibroblastový aktivační protein alfa (FAPcc) je glykoprotein navázaný na membránu, který patří do rodiny genů serinových porteáz (WO 97/34927). Není známa sekretovaná forma FAP. FAP je možné charakterizovat jeho navázáním na monoklonální protilátky F19 (F19 je možné získat z buněčné linie hybrodomu s číslem uložení HB 8269 v ATCC).

Termín „specifické navázání fibroblastového aktivačního proteinu protilátkového proteinu se zde definuje jako schopnost specificky rozeznávat a vázat lidské buňky • · ·· ·· · exprimující FAP. Vazebná specifita proteinů podle vynálezu se může stanovit standardními postupy hodnocení vazebné specifity, jak se popisuje v příkladech 6, 8 a 12.

Termín „chimérové protilátky znamená protilátkový protein, který vykazuje variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce, jak se popisuje na obrázku č. 17 a 18 a cizorodé konstantní oblasti. Termín „cizorodá konstantní oblast se definuje jako konstantní oblast, která se liší od konstantních oblastí F19. Při porovnání protilátkového proteinu podle vynálezu s chimérovými protilátkami je patrné, že takové chimérové protilátky musí obsahovat stejné konstantní oblasti jako uvedený protilátkový protein. Za účelem demonstrace a porovnání samotných lidských konstantních těžkých a lehkých řetězců, jak se popisuje na obrázku č. 19 až 22, se používají způsobem , který se popisuje v příkladech.

Aby vznikly protilátkové proteiny podle vynálezu, sekvence nukleových kyselin genů těžkého a lehkého řetězce myších protilátek označených F19 se stanovily z RNA, která se extrahovala z buněk hybridomů F19 (ATCC číslo uložení HB 8260).

Jedno provedení vynálezu popisuje. protilátkové proteiny, které zahrnují oblasti stanovení komplementarity monoklonálních protilátek F19 (ATCC číslo uložení HB 8269) . Uvedené nové protilátkové proteiny se specificky váží na fibroblastový aktivační protein (FAP), charakterizovaný tím, že úprava struktury vede ke zlepšení produkce v hostitelských buňkách, což se porovnává s chimérovými protilátkami, které mají variabilní oblasti F19 a cizorodé konstantní oblasti, kde uvedený protilátkový protein se odvodil z myších protilátek označených F19 (ATCC číslo uložení HB 8269).

Aby vznikly humanizované protilátkové proteiny specifické pro FAP, zkonstruovaly se chimérové protilátky, které mají • · variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců F19 a lidské těžké a lehké konstantní oblasti. Konstrukce a produkce chimérových myších/lidských protilátek jsou dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Boulianne G. L., Hozumi N. and Shulman, M. J. (1984) Production of functional chimeric mouse/human antibody Nátuře 312: 643) a popisují se v příkladech 1 a 2.

Variabilní oblasti protilátkových proteinů podle vynálezu jsou v typickém případě spojeny s alespoň částí konstantní oblasti imunoglobulinu (F_c) . V typickém příkladu s konstantní částí lidského imunoglobulinu. Sekvence DNA lidských konstantních oblastí se mohou izolovat dobře známými postupy z různých lidských buněk, ale přednostně z imortalizovaných B buněk (popisuje se v publikaci Kabat E. A., Wu T. T., Perry H. M., Gottesman K. S. and Foeller C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5^th Ed.). NIH Publication č. 91-3242. US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Protože protilátkové proteiny podle vynálezu mohou obsahovat všechny nebo pouze část konstantní oblasti, pokud vykazují specifické navázání na antigen FAP. Volba typu a rozsahu konstantní oblasti závisí na skutečnosti, zda efektor funguje jako fixátor komplementu nebo je nutná buněčná toxicita závislá na protilátkách, a na požadovaných farmakologických vlastnostech protilátkového proteinu. Protilátkový protein podle vynálezu bude v typickém případě tetramér, který obsahuje dva páry lehkého a těžkého řetězce, ale může se také vyskytovat jako dimér, to znamená, že obsahuje jeden pár lehkého a těžkého řetězce. Je to například fragment Fab nebo Fv.

Proto další provedení vynálezu se vztahuje na protilátkové proteiny podle vynálezu charakterizované tím, že mají variabilní oblast lehkého a těžkého řetězce, přičemž každá je připojena k lidské konstantní oblasti. Zvláště variabilní oblast lehkého řetězce je spojena s konstantní oblastí kappa a variabilní oblast těžkého řetězce je spojena s lidskou konstantní oblastí gamma-1. V případě humanizace lehkého a těžkého řetězce jsou dostupné i jiné oblasti.

lidské konstantní

Proto v jednom určitém provedení vynálezu protilátkové proteiny podle vynálezu obsahují lidskou konstantní oblast kappa.

Jiné určité provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny podle vynálezu, které obsahují konstantní oblast gamma-1.

Zvláště protein „chimérových protilátek F19 obsahuje variabilní a konstantní oblasti lehkého a těžkého řetězce popsané na obrázku č. 17 až 22. cF19 demonstruje specifické navázání a vysokou aviditu vůči antigenu FAP. Jak se ukazuje v příkladu 2, exprese cF19 v buňkách COS (buňky se získaly z ledvin afrických zelených opic) je slabá a pohybuje se v rozmezí přibližně 10 až 60 ng/ml, které je alespoň desetkrát nižší než většina protilátek.

Za účelem zvýšit sílu exprese cF19, se změnila vedoucí sekvence oblasti F19 V_L substitucí prolinu leucinem v poloze 9. Tato jediná změna aminokyseliny ve vedoucí sekvenci vede alespoň ke zdvojení množství chimérových protilátek, které produkují buňky COS. V případě exprese těchto určitých chimérových protilátek v buňkách COS se použila následující mutovaná vedoucí sekvence lehkého řetězce MDSQAQVLMLLLLWVSGTCG a těžkého řetězce MGWSWVFLFLLSGTAGVLS.

Termín „zdokonalená produkce podle vynálezu znamená v hostitelských buňkách podstatné zlepšení síly exprese a/nebo výtěžek čištěných protilátek ve srovnání se sílou exprese

00 0

0 a/nebo výtěžku chimerových protilátek bez strukturových modifikací, jak se definuje shora v textu. Dva určité, ale nikoli omezující příklady ukazující zdokonalenou produkci v expresívním systému buněk COS (v příkladech 2 a 5) a v expresívním příkladu buněk CHO (v příkladu 10 a 11).

Zatímco mutace vedoucí sekvence vedou pouze ke zdvojení výtěžku exprese chimérových protilátek F19 podstatné zdokonalení, jak se definuje podle vynálezu, vede ke zlepšení síly exprese a/nebo výtěžku čištění alespoň o faktor 10.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují protilátkové proteiny charakterizované tím, že jejich síla exprese ve vzorcích surového média, jak se stanoví testem ELISA, a/nebo výtěžky čištěných překračují sílu exprese a/nebo výtěžek čištění chimérových protilátek bez modifikací základní struktury alespoň o faktor 10.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují protilátkové proteiny charakterizované tím, že jejich exprese ve vzorcích surového média, jak se stanoví testem ELISA, a/nebo výtěžky čištěných překračují sílu exprese a/nebo výtěžek čištění chimérových protilátek bez modifikací základní struktury alespoň o faktor 20.

Nejvíce preferované provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny charakterizované tím, že jejich exprese ve vzorcích surového média, jak se stanoví testem ELISA, a/nebo výtěžky čištěných překračují sílu exprese a/nebo výtěžek čištění chimérových protilátek bez modifikací základní struktury alespoň o faktor 100.

Zlepšená produkce rekombinantních protilátkových proteinů podle vynálezu může probíhat v eukaryontních buňkách, jak se ukazuje v eukaryontních buňkách COS a CHO (buňky získané z vaječníků čínských křečků) (popisuje se v příkladu 5 a 11).

• · • · ·· · • · · · ·

V jiném provedení vynálezu se popisují rekombinantní protilátkové proteiny charakterizoavné tím, že vykazují zlepšenou produkci v eukaryontních buňkách.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují protilátkové proteiny, kde uvedená eukaryontní buňka je buňka vaječníků čínského křečka (buňka CHO).

Neočekávaně se zjistilo, že jisté modifikace základní struktury variabilních oblastí lehkého řetězce znamenají zlepšenou produkci protilátkových proteinů podle vynálezu. Připravily se tři verze variabilních oblastí lehkého řetězce změněného tvaru. Tyto verze se označily A, B a C a jsou zobrazeny na obrázcích 1 až 6. Verze variabilních oblastí lehkého řetězce A, B a C ukazují podstatně zlepšenou produkci v buňkách CHO (popisuje se v příkladu 11) . Zatímco verze A a C variabilních oblastí lehkého řetězce se liší od verze B variabilní oblasti lehkého řetězce pouze dvěmi běžnými aminokyselinovými zbytky vykazují podstatné zlepšení produkce. Existuje alespoň další desetinásobný rozdíl v síle sekrece protilátek mezi lidskou verzí B lehkého řetězce F19, který má upravený tvar, a verzí A nebo C. Aminokyselinová sekvence verze A a B lidského lehkého řetězce F19 se. liší pouze dvěma zbytky v poloze 36 (Tyr se nahradil Phe) a 87 (Tyr se nahradil Asp) (názvosloví podle Kabata). Tento negativní účinek na schopnost vylučovat protilátky obsahující verzi B varibilní oblasti lehkého řetězce by mohl být nepřímý, jestliže dojde k náhradě Tyr za Asp a Ty za Phe. Ať se mutace provedou jednotlivě nebo zvlášť, způsobují nesprávné balení proteinu. Testy navázání antigenu ukazují, že imunoglobuliny obsahující verzi B lehkého řetězce fl9 mají podobnou aviditu vůči párování z verzí A nebo C lehkého řetězce F19, což naznačuje, že makroskopicky nesprávně zbaleny.

• ·

Zbytek 87 ve verzi B lidského lehkého řetězce F19 se změněným tvarem je zvláště odpovědný za omezení vylučování v porovnání s verzí A a C.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují protilátkové proteiny podle vynálezu, kde aminokyselina v poloze 87 podle Kabata oblasti lehkého řetězce není asparagin.

Více preferované provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny podle vynálezu, kde aminokyselina v poloze 87 podle Kabata oblasti lehkého řetězce se vybrala ze skupiny zahrnující aromatické nebo alifatické aminokyseliny.

Nejvíce preferované provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny podle vynálezu, kde aromatická aminokyselina v poloze 87 podle Kabata oblasti lehkého řetězce je tyrozin nebo fenylalanin.

V dalším provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny podle vynálezu, kde aminokyselina v poloze 36 podle Kabata oblasti lehkého řetězce se vybrala ze skupiny zahrnující aromatické aminokyseliny.

Další provedení vynálezu popisuje specifické proteinové protilátky, které se mohou připravit z jednotlivě popsaných variabilních oblastí upraveného tvaru lehkého a těžkého řetězce.

Zvláště verze A a C variabilní oblasti lehkého řetězce jsou zvláště vhodné pro zavedení vynálezu do praxe, vzhledem k jejich výjimečně vysoké produkci, zatímco si uchovávají plnou vazebnou specifitu vůči FAP a dosahují nízké imunogenicity. Tak se to jeví zvláště, když se porovnávají chimérové protilátky, které mají variabilní oblasti F19 a stejné konstantní oblasti, ale také, když se porovnávají s verzí B lehkého řetězce.

• 4 • · • · 44 ·

Jedno provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny, které obsahují variabilní oblast lehkého řetězce, jak se uvádí v SEQ ID NO: 2.

Další provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny charakterizované tím, že variabilní oblast lehkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1.

Jiné provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny, které obsahují variabilní oblast lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 6.

Další provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny charakterizované tím, že variabilní oblast lehkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 5.

Vynález také popisuje několik různých variabilních oblastí těžkého řetězce, které fungují zvláště dobře s variabilními oblastmi verzí A a C lehkého řetězce, co se týče zlepšené produkce.

Jiné provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny, které obsahují variabilní oblast těžkého řetězce uvedenou v libovolné ze sekvencí SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14.

Jiné provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny, které obsahují variabilní oblast těžkého řetězce uvedenou v libovolné ze sekvencí SEQ ID NO: 7, 9, 11 a 13.

Jiné provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny, které obsahují variabilní oblast lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 2 a variabilní oblast těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 12. Nejvíce se upřednostňuje, aby tato oblast obsahovala konstantní oblast lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 20 a konstantní oblast těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID

NO: 22.

• · · φ ♦

Φ· · ·· · · • · · · φ • ·φ ·φ φ · · ·· φφ • φ φ φ φ · · φ φ φ φ φ φ φ φ · obsahoval

Více se

Dále vynález popisuje protilátkový protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2. Preferuje se, aby takový protilátkový protein dále aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 12 upřednostňuje, aby aby uvedený protilátkový protein obsahoval aminokselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO: 22. Dále se popisuje protilátkový protein, jak se popisuje v tomto odstavci, který se spojil s radioizotopem, přičemž se upřednostňuje ¹³¹I. ¹²⁵I, ¹⁸⁶Re nebo ⁹⁰Y. Dále vynález popisuje molekulu DNA kódující protilátkový protein, jak se popisuje v tomto odstavci. Dále vynález popisuje hostitelskou buňku, která nese takovou molekulu DNA. Vynález dále popisuje způsob produkce protilátkového proteinu, jak se popisuje v tomto odstavci, přičemž uvedená metoda zahrnuje kultivaci takových hostitelských buněk za podmínek, kdy uvedený protilátkový protein se exprimuje v uvedené hostitelské buňce, a izolaci uvedeného proteinu. Vynález dále popisuje protilátkové proteiny charakterizované tím, že variabilní oblast lehkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1 a variabilní oblast těžkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 11.

Jiné provedení vynálezu popisuje protilátkové proteiny, které obsahují variabilní oblast lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 2 a variabilní oblast těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 8.

Dále vynález popisuj e protilátkové proteiny charakterizované tím, že variabilní oblast lehkého řetězce se kóduje nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1 a variabilní oblast těžkého řetězce se kóduje nukleotodovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 7.

Humanizace variabilní oblasti myších protilátek se může dosáhnout použitím metod známých v oboru. Dokument EP 0239400 • 0 • 0 00 • 0 • 0 •

0 000 popisuje zavedení CDR myší variabilní oblasti do základní struktury lidské variabilní oblasti. Dokument WO 90/ 07861 popisuje způsoby změny tvaru variabilní oblasti se zavedeným CDR, přičemž se zavedly další změny základní struktury. Dokument WO 92/11018 popisuje metody produkce humanizovaných Ig v kombinaci s donorovou CDR, přičemž základní struktira akceptoru vykazuje vysokou homologii s donorovou základní strukturou. Dokument WO 92/05274 popisuje přípravu protilátek s mutovaným rámcem, jejichž původem jsou myší protilátky. Předchozí dokumenty, které popisují humanizaci myších monoklonálních protilátek, jsou EP 0368684, EP 0438310, WO 92/07075 nebo WO 92/22653. Proto je možné produkovat protilátky podle vynálezu, které pocházejí z běžně dostupných myších monoklonálních protilátek F19 a mohou se použít metody, které jsou dobře známy v oboru. Popisují se například v dokumentu WO 92/05274. Molekuly DNA kódující protilátkové se mohou samozřejmě také získat chemickou proteiny podle vynálezu syntézou, například syntézou vhodných oligonukleotidů a následnou ligací a amplifikací (popisuje se v publikaci Frank et al., (1987) Methods Enzymol. 154 249) .

221Dále vynález popisuje molekuly nukleové kyseliny, které obsahují kódující informaci protilátkových proteinů podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu. Upřednostňuje se, aby molekula nukleové kyseliny podle vynálezu obsahovala nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 nebo 15.

Vynález dále popisuje rekombinantní vektor DNA obsahující nukleotidovou sekvenci libovolné shora v textu popsané nukleové kyseliny, zvláště pak v případě, že uvedená nukleotidová sekvence se operativně spojila se sekvencí řídící expresi, jako je tomu v expresívních vektorech. Preferuje se vektor rekombinantní DNA, přičemž uvedený vektor je expresívní vektor.

Dále vynález popisuje hostitelskou buňku nesoucí vektor, jak se popisuje shora v textu, zvláště expresívní vektor. Taková hostitelská buňka může být prokaryontní nebo eukaryontní buňka. Upřednostňuje se, aby takovou hostitelskou buňkou byla eukaryontní buňka, kvasinková buňka nebo savčí buňka. Více se upřednostňuje, aby uvedenou hostitelskou buňkou byla buňka CHO (buňka z vaječníků čínského křečka) nebo buňak COS.

Dále vynález popisuje způsob produkce proteinových protilátek podle vynálezu. Taková metoda zahrnuje

a) kultivaci hostitelské buňky, jak se popisuje shora v textu za podmínek, kdy uvedený protilátkový protein se exprimuje v uvedené hostitelské buňce a

b) izolaci uvedeného protilátkového proteinu.

Preferují se savčí hostitelské buňky, jako jsou buňky CHO nebo COS. Hostitelské buňky vhodné pro produkci protilátkových proteinů podle vynálezu se mohou transfekovat jediným vektorem, který obsahuje expresívní jednotky pro lehký i těžký řetězec (popisuje se například v dokumentu WO 94/11523) . Jedno provedení vynálezu popisuje způsob produkce protilátkových proteinů podle vynálezu v hostitelských buňkách, kde uvedené hostitelské buňky se ko-transfekovaly dvěma plazmidy, které nesou expresívní jednotky lehkého a těžkého řetězce (popisuje se například v dokumentu EP 0481790).

vynálezu jsou vysoce cílení specifických FAP. Proto vynález dále podle vynálezu, kde terapeutickým činidlem, ze skupiny zahrnující

Protilátkové proteiny podle specifický nástroj vhodný pro terapeutických činidel na antigen popisuje protilátkové proteiny protilátkový protein je spojen s Terapeutická činidla se vybrala • · ···· ··· · radioizotopy, toxiny, toxoidy, inflamatogenní činidla, enzymy, antisense molekuly, peptidy, cytokiny a chemoterapeutická činidla. Jako terapeutická činidla se mohou použít činidla emitující gama, beta a alfa záření. Jako terapeutické radioizotopy se preferují radioizotopy emitující beta záření. Prokázalo se, že ¹⁸⁶rhenium, ¹⁸⁸rhenium, ¹³¹jód a ⁹⁰ytrium jsou zvláště vhodné izotopy emitující beta záření, aby se dosáhlo lokalizovaného ozáření a poškození maligních nádorových buněk. Jako terapeutická činidla se zvláště preferují radioizotopy vybrané ze skupiny obsahující ¹⁸⁶rhenium, ¹⁸⁸rhenium, ¹³¹jód a ⁹⁰ytrium spojená s protilátkovými proteiny podle vynálezu. Například při rádiojodizaci protilátek podle vynálezu se použije metoda popsaná v publikaci WO 93/05804.

Vynález dále popisuje protilátkové proteiny podle vynálezu charakterizované tím, že jsou značené. Tak FAP-specificky značené protilátky umožňují lokalizaci a/nebo deleci antigenu FAP in vitro a /nebo in vivo. Značka se definuje jako markér, který se může detekovat přímo nebo nepřímo. Nepřímý markér se definuje jako markér, který nemůže být sám detekován, ale potřebuje další přímo detekovatelný markér specifický pro nepřímý markér. Preferované značky vhodné pro využití vynálezu jsou detekovatelné markéry. Detekovatelný markér se vybral ze skupiny obsahující enzymy, barviva, radioizotopy, digoxigeniny. Nejvíce se preferuje biotin.

Vynález dále popisuje protilátkové proteiny podle vynálezu charakterizované tím, že se spojují s činidlem, které je zobrazitelné. Je dostupné velké množství zobrazitelných činidel, zvláště radioizotopů. Nejvíce se preferují izotopy emitující gama záření. Nejvíce se preferuje ¹²⁵jód.

Vynález popisuje farmaceutické prostředky, které obsahují protilátkový protein podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu a farmaceuticky přijatelný nosič. Takové farmaceutické ··

4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • ·4·>44

4 4 4 4 4

4444444 44 44 prostředky je možné použít při léčbě nádorů, přičemž uvedené nádory jsou spojeny s aktivovanými fibroblasty podpůrné vazivové tkáně. Existují dva možné principy působení efektoru v případě antinádorové imunoterapie podpůrné vazivové tkáně, které mohou působit synergicky: a) neupravené (nespojené, „nahé) protilátky podle vynálezu mohou vyvolat imunitní poškození nebo zánětlivou reakci v podpůrné vazivové tkáni, zatímco b) použitím protilátky spojené s terapeutickým činidlem, jako je například radioizotop nebo jiná toxická látka, se může dosáhnout lokalizované záření a destrukce buněk maligních nádorů. Vynález dále popisuje použití protilátkového proteinu, jak se popisuje v případě výroby farmaceutického prostředku, zvláště vhodného pro léčbu nádorů.

V jiném provedení vynálezu se popisují farmaceutické prostředky obsahující protilátkový protein podle vynálezu spojený s terapeutickým činidlem, jak se popisuje shora v textu, a farmaceuticky přijatelným nosičem, který je použitelný při léčbě nádorů, kde uvedené nádory jsou spojeny s aktivovanými fibroblasty podpůrné vazivové tkáně. Vynález popisuje farmaceutické prostředky, které obsahují protilátkový protein podle vynálezu spojený s viditelným činidlem, jak se popisuje shora v textu, a farmaceuticky přijatelný nosič, který je vhodný pro prokázání přítomnosti aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně v hojících se ranách, v zánětlivé kůži nebo nádoru u lidských pacientů. Nejvíce preferovaným provedením vynálezu jsou farmaceutické prostředky, které se popisují shora v textu, kde uvedený nádor nebo nádory se vybraly ze skupiny zhoubného bujení, které zahrnuje kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom prsní žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné bujení mozku.

€····» 19 • ····««·» • · · « * · · · ···♦ · · ·····* • · · · · » · • · ·»· ···· «· ··

V těle zvířat nebo lidí je možné prokázat výhody aplikace farmaceutických prostředků prostřednictvím intravenózní nebo jiné cesty, například systémovou a lokální cestou nebo aplikací povrchově na tkáň nebo do orgánu, v závislosti na typu a původu onemocnění, které se léčí, jako je například systémové autoimunitní onemocnění nebo alergie nebo transplantace cizorodých orgánů nebo tkání nebo nádory, které jsou difúzní nebo se těžko lokalizují. Lokální aplikace se provede pouze v případě, kdy se očekává pouze lokální manifestace neoplastického nebo imunologického působení, jako jsou například lokální nádory.

Protilátkové proteiny podle vynálezu se mohou aplikovat různými způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Je možné zmínit tkáně.

intravenózní injekce nebo přímé injekce do cílové

V případě intravaskulární, systémové aplikace intrámuskulární se používáji intraarteriální, intraperitoneální, orální nebo intratekální způsoby. Lokální intrakutálně, intrakardiálně, aplikace se intrakardiálně, intraloburálně, mohou provést podkožně, intralobálně, do membrány, intrapulmorálně nebo přímo do tkáně nebo blízko tkáně, která se má léčit (konektivní tkáň, kostní tkáň, svalová tkáň, nervová tkáň, epiteliální tkáň). V závislosti na požadované době a účinnosti léčby, farmaceutické protilátkové prostředky se mohou aplikovat jednou nebo několikrát za den, po dobu několika dní, týdnů nebo měsíců a v různých dávkách.

Při přípravě vhodných protilátkových prostředků vhodných pro aplikaci, jak se popisuje shora v textu, je možné použít injektovatelné, fyziologicky přijatelné sterilní roztoky. Při přípravě roztoků pro parenterální injekci nebo infúzi vodných izotonických roztoků, jako jsou například fyziologický roztok nebo odpovídající roztoky plazmových proteinů, jsou snadno dostupné. Farmaceutické kompozice se mohou lyofylizovat nebo sušit, přičemž se mohou rekonstituovat se známými • ·

injektovatelnými roztoky, dříve než se použijí při sterilních podmínkách, například jako části sady. Konečná příprava protilátkových prostředků podle vynálezu se připravuje pro injekci, infúzi nebo perfúzi smícháním čištěných protilátek podle vynálezu se sterilním fyziologicky přijatelným roztokem, který se může doplnit známou sloučeninou nosiče nebo/a přísadami (například sérový albumin, dextróza, bisulfit sodný, EDTA).

Množství protilátek se aplikuje v závislosti na podstatě onemocnění. U pacientů se zhoubným bujení se aplikuje dávka, která se pohybuje v rozmezí 0,1 a 100 mg/m², upřednostňuje se dávka mezi 5 a 50 mg/m². V případě protilátek radioaktivně značených například jódem-131 je nutné stanovit maximální tolerovanou dávku (MTD), která by se při terapii neměla překročit. Aplikace radioaktivně značených protilátek by se měla opakovat (měsíčně nebo týdně) intravenozní infúzi dávky, která je nižší než MTD (popisuje se v publikaci Welt et al., (1994) J. Clin. Oncol. 12: 1193-1203).

Vynález dále popisuje použití protilátkových proteinů podle vynálezu vhodných pro zhoubné bujení. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje použití protilátkových proteinů podle vynálezu konjugovaných s terapeutickým činidlem, jak se popisuje shora v textu, které jsou vhodné pro léčbu zhoubného bujení. V jiném provedení vynálezu se popisují protilátkové proteiny podle vynálezu konjugované s činidlem, které je vhodné pro znázornění aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně. V jiném preferovaném provedení vynálezu se popisuje použití značených protilátkových proteinů podle vynálezu vhodných pro detekci přítomnosti aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně ve vzorku.

Vynález popisuje způsob léčby zhoubného bujení, kde nádor je spojený s aktivovanými fibroblasty podpůrné vazivové tkáně,

• · · • · ·

které jsou schopny specificky tvořit komplex s protilátkovými proteiny podle vynálezu, které jsou přítomny jako nahé/neupravené protilátky, upravené protilátkové proteiny, jako jsou například fúzní proteiny nebo protilátkové proteiny spojené s terapeutickým činidlem, které obsahují kontakt nádoru a účinným množství uvedené protilátky. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob léčby zhoubného bujení, jak se popisuje shora v textu, přičemž nádor obsahuje buňky zhoubného bujení vybrané ze skupiny zahrnující buňky kolorektálního karcinomu, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom prsní žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné bujení mozku.

Způsob léčby nádorů se může provést in vitro nebo in

Vynález dále popisuje způsob detekce přítomnosti aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně při hojení ran, zánětu nebo v nádorech, charakterizovaných tím, že

a) vzorek, který obsahuje aktivované fibroblasty podpůrné vazivové tkáně je v kontaktu s protilátkovým proteinem podle vynálezu za podmínek, které jsou vhodné pro tvorbu komplexu mezi uvedenými protilátkami a antigenem,

b) detekce přítomnosti uvedeného komplexu, přičemž se detekuje přítomnost aktivovaných fibroblastů v podpůrné vazivové tkáni při hojení ran, zánětu nebo nádoru.

Preferované provedení podle vynálezu popisuje způsob detekce přítomnosti aktivovaných fibroblastů v podpůrné vazivové tkáni nádoru, kde nádor obsahuje buňky zhoubného bujení vybrané ze skupiny obsahující buňky kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních • 4 • 4 4 4 4 ·· · · · 4 · · 4 · 4 4 4 4

4 44 4 · · · 4 44 4

4 4 · 4 4 4

4444444 44 44 buněk, karcinom prsní žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné-bujení mozku.

Nejvíce se preferují protilátkové proteiny podle vynálezu, které se značí způsobem, který se popisuje shora v textu.

Vynález dále popisuje způsob zobrazení přítomnosti aktivovaných fibroblastů v podpůrné vazivové tkáni při hojení ran, v zánětlivé tkáni (revmatoidní artritida a cirhóza jsou také pozitivní) nebo nádor u lidského pacienta charakterizovaného tím, že:

a) protilátkový protein podle vynálezu konjugovaný se značícím činidlem se aplikuje lidskému pacientovi za podmínek vhodných pro přípravu komplexu protilátkaantigen,

b) znázornění libovolného komplexu, který se vytvořil uvedeným způsobem,

c) znázornění přítomnosti aktivovaných fibroblastů v podpůrné vazivové tkáni u lidského pacienta.

Preferované provedení vynálezu popisuje způsob zobrazení přítomnosti aktivovaných fibroblastů v podpůrné vazivové tkáni nádorů, jak se popisuje v shora v textu, kde nádor obsahuje buňky vybrané ze skupiny zahrnující: buňky kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom prsní žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné bujení mozku.

Vynález dále popisuje způsob detekce podpůrné vazivové tkáně nádoru, která se charakterizovala tím, že

a) vhodný vzorek přišel do kontaktu s protilátkovým proteinem podle vynálezu za podmínek vhodných pro vytvoření komplexu protilátka-antigen, • · •·· · ······· «· ··

b) detekce přítomnosti libovolného vytvořeného komplexu

c) vztah uvedeného komplexu k přítomnosti detekce podpůrnou vazivovou tkáň nádoru.

Protilátkové proteiny vhodné pro zavedení vynálezu do praxe jsou značeny detekovatelným markérem.

Vynález popisuje způsob znázornění podpůrné vazivové tkáně nádoru u člověka, který popisuje

a) aplikaci pacientovi protilátek podle vynálezu, které se spojily se zobrazovacím činidlem, jak se popisuje shora v textu, za podmínek vhodných pro vytvoření komplexu protilátka-antigen,

b) zobrazení libovolného vytvořeného komplexu, čímž se také znázorní přítomnost podpůrné vazivové tkáně nádoru u člověka.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze A(hF19L_A)SEQ ID NO: 1.

Obrázek č. 2 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze A (hFl9L_A) SEQ ID NO: 2.

Obrázek č. 3 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze B(hF19L_B)SEQ ID NO: 3. Nukleotidy, které se liší od verze A jsou podtrženy a napsány tučně.

Obrázek č. 4 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze B(hF19L_B)SEQ ID NO: 4. Aminokyseliny, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

«

0 0 0 ·

Obrázek č. 5 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze

C(hF19L_c)SEQ ID NO: 5. Nukleotidy, které se liší od verze A jsou podtrženy a napsány tučně.

Obrázek č. 6 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze B(hF19L_B)SEQ ID NO: 6. Aminokyseliny, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 7 lidského těžkého

A(hF19L_A) SEQ ID NO: 7.

znázorňuj e řetězce sekvenci DNA variabilní oblasti F19 s upraveným tvarem verze

Obrázek č. 8 lidského těžkého znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblastí řetězce F19 s upraveným tvarem verze

A(hF19L_A)SEQ ID NO: 8.

Obrázek č. 9 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze B(hF19L_B)SEQ ID NO: 9. Nukleotidy, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 10 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze B(hF19L_B)SEQ ID NO: 10. Aminokyseliny, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 11 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze C(hF19L_c)SEQ ID NO: 11. Nukleotidy, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 12 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným • · tvarem verze C(hF19L_c)SEQ ID NO: 12. Aminokyseliny, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

• · · · t · · · • · · · ·· ··

Obrázek č. 13 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze D(hF19L_D)SEQ ID NO: 13. Nukleotidy, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 14 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze D(hFl9L_D)SEQ ID NO: 14. Aminokyseliny, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 15 znázorňuje sekvenci DNA variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze E(hF19L_E)SEQ ID NO: 15. Nukleotidy, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 16 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze E(hF19L_E)SEQ ID NO: 16. Aminokyseliny, které se liší od verze A jsou podtrženy a zvýrazněny tučným písmem.

Obrázek č. 17 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti chimérového lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem(chF19LC)SEQ ID NO: 17.

Obrázek č. 18 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti chimérového těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem(chFl9HC)SEQ ID NO: 18.

Obrázek č. 19 znázorňuje sekvenci DNA konstantního lidského lehkého řetězce kappa SEQ ID NO: 19.

Obrázek č. 20 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci konstantního lidského lehkého řetězce kappa SEQ ID NO: 20.

• ♦ a · a « a «aaa a a · · a « · a · · a ” a a a a a · · a a a · · • a a I a a a a aaa···· ·· ··

Obrázek č. 21 znázorňuje sekvenci DNA konstantního lidského těžkého řetězce kappa SEQ ID NO: 21.

Obrázek č. 22 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci konstantního lidského těžkého řetězce kappa SEQ ID NO: 22

Obrázek č. 23 znázorňuje Expresívní vektory savčích buněk používané při produkci chimérových lidských protilátek, které mají upravený tvar, a s lidskými lehkými řetězci kappa a lidskými těžkými řetězci gamma-1.

A. expresívní vektor lehkého řetězce: pKNlOO

B. expresívní vektor těžkého řetězce: pGlD105

Obrázek č. 24 znázorňuje sekvenci DNA a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti myšího lehkého řetězce F19, který se upravil pro použití při konstrukci chimérového lehkého řetězce F19. Restrikění místa jsou označeny tučným písmem. Kozáková sekvence CDR 1 až 3 a donorové místo sestřihu je podtrženo.

Obrázek č. 25 znázorňuje sekvenci DNA a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti myšího těžkého řetězce F19, který se upravil pro použití při konstrukci chimérového lehkého řetězce F19. Restrikění místa jsou označeny tučným písmem. Kozáková sekvence CDR 1 až 3 a donorové místo sestřihu je podtrženo.

Obrázek č. 26 znázorňuje sekvenci DNA chimérových protilátek F19, která se klonovala do expresívního vektoru savce pKNlOO. Restrikční místa jsou označeny tučným písmem a jsou podtrženy. CDR 1 až 3 a donorové místo sestřihu je podtrženo. Jde o sekvenci DNA myšího lehkého řetězce F19 uvnitř eukaryontního expresívního vektoru pKNlOO. Tento vektor má cDNA verzi lidského genu konstantní oblasti kappa (aleotyp Km(3)) ukončený silnou umělou terminační oblastí. Navíc selekční gen Neo je také zakončen touto umělou sekvencí a má

♦ « » · * · 9 také stejnou orientaci jako expresívní kazeta lehkého řetězce kappa.

Podstatné komponenty eukaryontního expresívního vektoru pKNlOO jsou:

- 6 = restrikční místo EcoRI 7 - 1571 = promotor/zesilovač HCMVi 583 - 587 = TATAA box

610 = počátek transkripce

728 - 736 = donorové místo sestřihu

731 = začátek intronu

1557 = konec intronu

1544 - 1558 akceptorové místo sestřihu 1590 - 1598 = Kozáková sekvence 1599 - 1658 = vedoucí sekvence peptidu 1659 - 1997 = myší lehký řetězec F19 1996 - 2004 = donorové místo sestřihu

2011 - 2657 = kopie cDNA lidského genu konstantní oblasti Kappa (Km(3))

2664 - 2880 = umělá terminační sekvence spaC2

2887 - 7845 = fragment DNA vektoru pSV2neo obsahující gen nesoucí rezistenci na Amp (v opačné orientaci), počátek replikace ColEl a SV40 a gen nesoucí rezistenci na Neo (ve stejné orientaci, jako kazeta HCMVi-KCT)

7852 - 8068 = umělý terminační signál spaC2

Tato sekvence končí proti směru expre bezprostředně od restrikčního místa EcoRI (poloha 1 až 6) na začátku sekvence. Stejně jako vektor, tato sekvence bude kruhová.

Obrázek č. 27 znázorňuje sekvenci DNA chimérových protilátek F19 klonovaných do savčího expresívního vektoru pgldl05. Restrikční místa se označila tlustým písmem a jsou podtrženy. Jde o sekvenci DNA eukaryontního expresívního vektoru pGlD105, který obsahuje variabilní oblast myšího těžkého řetězce F19. Tento vektor obsahuje verzi cDNA lidské ·· ·· konstantní oblasti gamma-1 (alotyp Glm(ani a, z -x), která je také známa jako Gml(17)alotyp).

Podstatné komponenty konstrukce jsou:

- 2501 = pBR322 základní sekvence zahrnující gen rezistenci na ampicilin a požátek ColEl plus počátek SV40 a degradovaný časný promotor SV40.

2502 - 3226 = gen dhfr

3233 - 4073 = sekvence póly 1 SV40 atd.

4074 - 4079 = ligovaná restrikční místa BamHI a BglII (BstYl)

4080 - 4302 = místo SPA plus terminační signál C2

4303 - 5867 = promotor HCMVi

5879 - 5885 = jediné restrikční místo HindlII vhodné pro klonování variabilních genů imunoglobulinu

5886 - 5894 = Kozáková sekvence

5895 - 5951 = signální peptid

5952 - 6323 = myší těžký řetězec F19

6323 - 6330 = donorové místo sestřihu

6331 - 6336 = jediné restrikční místo BamHI vhodné pro klonování variabilních genů imunoglobukinu

6337 - 7388 = kopie cDNA lidských konstantních oblastí gamma-1, kterým předchází intron o velikosti 62 bp

7389 - 7709 = Arnieho terminační sekvence

Lidská konstantní oblast gamma-1 užívaná při této konstrukci má Glm (ani a, z, -x) , která je také známa jako alotyp Gml(17), který se definuje jako zbytek kyseliny glutamové (E) v poloze 356 (odpovídá číslování Eu) , zbytek methioninu (M) v poloze 358 (podle číslování Eu) a zbytek lyzinu (K) v poloze 214 ) podle číslování Eu) . Tyto tři zbytky jsou ve shora uvedené sekvenci podtrženy.

Obrázek č. 28 znázorňuje způsob konstrukce lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem. Tento obrázek znázorňuje • · 1 • · • ···· • fe fefe schéma strategie konstrukce. Tečkované linie označuji komplementární sekvenci alespoň 21 baží mezi primery.

Obrázek č. 29 znázorňuje nukleotidové a dedukované aminokyselinové sekvence variabilních oblastí lidského lehkého řetězce F19 verze A, B a C. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence se uspořádaly a porovnávaly se se sekvencí verze A. Čárky označují shodu nukleotidu, tečky označují shodu aminokyselinové sekvence s touto sekvencí. Aminokyseliny se číslují způsobem, který se popisuje v publikaci Kabat E. A., Wu T. T., Perry Η. M., Gottesman K. S. and Foeller C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5^th Ed.) . NIH Publication č. 91-3242. US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Lokalizace CDR jsou označeny v rámečcích.

Obrázek č. 30 znázorňuje sekvenci DNA F19L_A (lidský lehký řetězec s upraveným tvarem verze A) klonovanou do savčího expresívního vektoru pKNIOO. Restrikční místa se označila tučnými písmeny a jsou podtrženy. CDR 1 až 3 a donorové místo sestřihu je podtrženo. Jde o sekvenci DNA lehkého řetězce F19 verze A klonovaného do eukaryontního expresívního vektoru pKNIOO. Tento vektor má cDNA verzi lidského genu konstantní oblasti kappa (alotyp Km(3)) zakončeného silnou umělou terminační sekvencí. Navíc selekční gen Neo se také zakončil uvedenou umělou sekvencí a vykazuje také stejnou orientaci jako expresívní kazeta lehkého řetězce kappa.

Komponenty vektoru jsou:

- 1571 = promotor/zesilovač HCMVi

583 - 587 = TATAA box

610 = počátek transkripce

728 - 736 = donorové místo sestřihu

731 = začátek intronu • · · ·· ·· ·· »· · · · ♦ · ···· ··· · · 9 9··

999999 9 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9

999 9 999 9999 99 99

1557 = konec intronu

1544 - 1558 = akceptorové místo sestřihu

1590 - 1598 = Kozáková sekvence

1599 - 1658 = vedoucí sekvence peptidu

1659 - 1997 = lehký řetězec F19 verze A s upraveným tvarem 1996 - 2004 = donorové místo sestřihu

2011 - 2657 = kopie cDNA lidského genu konstantní oblasti kappa (Km(3))

2664 - 2880 = umělá terminační sekvence spaC2

2887 - 7845 = fragment vektoru DNA pSV2neo obsahující gen rezistence na ampicilin (v opačné orientaci), počátky replikace ColEl a SV40 a gen rezistence na Neo (ve stejné orientaci jako je kazeta HCMVi-KCT).

7852 - 8068 = umělý terminační signál spaC2

Tato sekvence končí bezprostředně proti směru exprese od restrikčního místa EcoRI (poloha 1 až 6) na začátku sekvence dále v textu. Stejně jako vektor tato sekvence DNA je kruhová.

Obrázek č. 31 je způsob založený na PCR vhodný ke konstrukci lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem. Tento obrázek znázorňuje schéma strategie konstrukce. Tečkované čáry označují komplementární sekvenci alespoň 21 baží mezi primery.

Obrázek č. 32 znázorňují nukleotidové a dedukované aminokyselinové sekvence variabilních oblastí lidského těžkého řetězce F19 verze a až e. Nukleotidová a dedukovaná aminokyselinová sekvence se uspořádaly a porovnávaly se se sekvencí verze A. Čárky označují shodu nukleotidu, tečky aminokyselinové sekvence označují shodu Aminokyseliny se číslují způsobem, který v publikaci Kabat E. A., Wu T. T., Perry Η. M S. and Foeller C. (1991) s touto sekvencí, se popisuje

Sequences of

Gottesman K.

Proteins of

Immunological Interest (5 th

Ed.

NIH Publication č. 91-3242.

« · • · · · · • ·· »· ·· • · · · · · Φ · • · 1**1 • ··«··· « · · · · · ······· · ♦ ··

US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Lokalizace CDR jsou označeny v rámečcích.

Obrázek č. 33 znázorňuje sekvenci DNA F19Ha (lidský těžký řetězec s upraveným tvarem verze A) klonovanou do savčího expresívního vektoru pgldl05. Restrikční místa se označila tučnými písmeny a jsou podtrženy. CDR 1 až 3 a donorové místo sestřihu je podtrženo. Jde o sekvenci DNA těžkého řetězce F19 verze A klonovaného do eukaryontního expresívního vektoru pGlD105. Tento vektor má cDNA verzi lidského genu konstantní oblasti gamma-1 (alotyp Glm(ani a, z, -χ) , která je známa jako alotyp Gml(17)).

Podstatné komponenty vektoru jsou:

- 2501 = sekvence založená na vektoru pBR322 zahrnující gen rezistence na ampicilin a počátek ColEl plus počátek SV40 a degradovaný časný promotor SV40

2502 - 3226 = gen dhfr

3233 - 4073 = sekvence póly A SV40 atd.

4080 - 4302 = místo SPA plus terminační signál C2

4303 -5867 = promotor/zesilovač HCMVi

5879 - 5885 = jediné restrikční místo pro klonování variabilních genů imunoglobulinu

5886	- 5894 =	Kozáková	sekvence
5895	- 5951 =	signální	peptid
5952	- 6323 =	donorové	místo sestřihu
6331	- 6336	= jediné	restrikční místo BamHI vhodné pro

klonování variabilních genů imunoglobulinu

6337 - 7388 = kopie cDNA lidských konstantních oblastí gamma-1, kterým předchází intron o veliksoti 62 bp 7389 - 7709 = Arnieho terminační sekvence

Lidská konstantní oblast gamma-1 užívaná při této konstrukci má Glm (ani a, z, -χ) , která je také známa jako

·

0

0

0 alotyp Gml(17), který se definuje jako zbytek kyseliny glutamové (E) v poloze 356 (odpovídá číslování Eu), zbytek methioninu (M) v poloze 358 (podle číslování Eu) a zbytek lyzinu (K) v poloze 214 ) podle číslování Eu). Tyto tři zbytky jsou ve shora uvedené sekvenci podtrženy.

Obrázek č. 34 znázorňuje sestřih RNA těžkého (panel A) a lehkého (panel B) řetězce během exprese protilátek F19 v savčích buňkách - schéma:

A. sestřih RNA těžkého řetězce

B. sestřih RNA lehkého řetězce ··

0000

I

Obrázek č. 35 znázorňuje závislost na koncentraci supernatantu L_AH_C vázajícího se na CD8-FAP.

Obrázek č. 36 znázorňující navázání biotinovaného L_AH_C na lidský FAP.

Obrázek č. 37 znázorňující CD8-FAP nesoucí epitop F19, který se detekoval s cF19.

Příklady provedení vynálezu:

Příklad 1: Konstrukce myších-lidských chimerových genů

Chimerové protilátky Fl9(cF19) se navrhly tak, že jejich myší oblasti F19V_L a V_H jsou spojené s konstantními oblastmi kappa a gamma-1. Primery PCR se použily pro modifikaci 5'- a 3'- sekvencí, které lemují sekvence cDNA kódující oblasti myšího F19V_L a V_H (tabulka č. 1) . Tyto adaptované variabilní oblasti myších F19 se pak klonovaly do savčích buněčných expresívních vektorů, které obsahují konstantní oblasti kappa (vektor pKNlOO) nebo gamma-1 (vektor pGlD105) (obrázek č. 23) . Tyto vektory se použily promotor/zesilovač lidského cytomegaloviru (HMCV), aby se účinně přepsal lehký a těžký řetězec. Vektory také obsahují počátek replikace SV40, aby « · : .· ::

došlo k účinné replikaci DNA a následné expresi proteinu v buňkách COS. Expresívní vektory se navrhly tak, aby zahrnovaly variabilní oblasti začleněné jako DNA fragmenty HindiII-BamHI. Primery PCR se navrhly tak, že do nich zavedly tyto restrikční místa na 5'-(HindlII) a 3'-(BamHI) konce cDNA kódující V oblasti. Navíc primery PCR se navrhly tak, že se do nich zavedla Kozáková sekvence (GCCGCCACC) na 5'konec cDNA lehkého a těžkého řetězce, aby se umožnila účinná translace (Kozák M. : At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. (1987) J. Mol. Biol. 196: 947) a zavedly se donorová místa sestřihu na 3'konec cDNA lehkého a těžkého řetězce, aby se mohly sestřihnout do formy konstantních oblastí. Primery PCR, které se používali při konstrukci chimerového lehkého a těžkého řetězce F19, jsou uvedeny v tabulce 1. Sekvence DNA a aminokyselinové sekvence myších oblastí V_L a V_H F19 adaptované pro použití v konstrukci myšího chimerového lehkého a těžkého řetězce F19 jsou zobrazeny na obrázku č. 24 a 25. Sekvence DNA myšího lehkého a těžkého řetězce F19 klonované do eukaryontních expresívních vektorů pKNlOO a pGlD105 jsou zobrazeny na obrázku č. 26 a 27.

Tabulka č. 1: Primery PCR vhodné pro konstrukci chimerových protilátek F19.

A. Variabilní oblast lehkého řetězce

1. Primer vhodný pro konstrukci 5'-konce (37-mer) 5'GAGA AAGCTT GCCGCCACC ATG GAT TCA CAG GCC CAG 3'

HindlII Kozáková s. M D S Q A Q

2. Primer vhodný pro konstrukci 3'-konce (35-mer) 5'CCGA GGATCC ACTCACGTTT CAG CTC CAG CTT GGT 3'

BamHI donor. místo sestřihu

B. Variabilní oblast těžkého řetězce • · · ·· 44 44

4 4 β · » · · · · « • 44 4 4 | 4 4 4 ······ 4 4 · 9 4 4 4 • 4 · 4 4444

44» ♦ 444 ·444 44 44

1. Primer vhodný pro konstrukci 5'-konce (37-mer)

5'CAGA AAGCTT GCCGCCACC ATG GGA TGG AGC TGG GTC 3'

HindlII Kozáková s. M G W S W V

2. Primer vhodný pro konstrukci 3'-konce (35-mer)

5'CCGA GGATCC ACTCACC TGA GGA GAC GGT GAC TGA 3'

BamHi donor. místo sestřihu

Příklad 2: Exprese a vazebná aktivita chimérových protilátek F19

Dvě plazmidové DNA kódující chimerový lehký a těžký řetězec F19 ( popisuje se v příkladu 1) se ko-transfekovaly do buněk COS, aby se dosáhlo dočasné exprese chimérových protilátek F19, jak se popisuje dále v textu. Po inkubaci 72 hodin se shromáždilo kultivační médium, provedla se centrifugace, aby se odstranily zbytky buněk a supernatant se testoval testem ELISA za účelem zjištění produkce lidských protilátek podobných IgGl. V supernatantu buněk COS obsahující chimerové protilátky F19 se zjišťovala schopnost vázat buňky HT 1080 (popisuje v příkladu 13), které exprimují na svém povrchu antigen FAP.

Transfekce buněk COS za použití elektroporace

Savčí expresívní vektory pgldl05 a pKNlOO obsahující chimerové verze lidského těžkého nebo lehkého řetězce nebo jejich verze s upraveným tvarem se testovaly v buňkách COS, aby se dosáhlo dočasné exprese protilátek F19. Buňky COS7 se rutině pasážovaly do kultivačního média DMEM (Gibco BRL kat. # 41966), které obsahuje penicilín (50 IU/ml), streptomycin (50 μς/πιΐ), L-glutamin a 10 % teplem deaktivované fetální telecí sérum bez gammaglobulinu (FCS, Harlan Sera-Lab. kat. #D0001). DNA se zavedla do buněk COS elektroporací za použití zařízení Gene Pulsar (BioRad). DNA (10 μς každého vektoru) se přidalo k • ···· ί * · • · · · • 9 9 «

0,8 ml alikvótu s lxlO⁷ buněk/ml ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS, bez vápenatých a horečnatých jontů). Charakteristika pulzu je 1 900 V, kapacita 25 pF. Po 10 minutách při teplotě okolí se k buňkám po elektroforéze přidalo 8 ml kultivačního média DMEM, které obsahuje 5 % FCS. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin, se kultivační médium sebralo a provedla se centrifugace, aby se odstranil buněčný odpad a supernatant se skladoval za sterilních podmínek při teplotě 4 °C po krátký časový úsek nebo při teplotě -20 °C po delší dobu.

Test ELISA vhodný pro měření koncentrace protilátek IgGl/kappa v supernatantech buněk COS

Vzorky protilátek produkované v transfekovaných buňkách COS se analyzovaly testem ELISA, aby se stanovilo množství produkovaných chimérových lidských protilátek nebo lidských protilátek s upraveným tvarem. V případě detekce protilátek se destičky potáhly kozími antí-lídskými IgG protilátkami (jsou specifické pro fragment Fc/) (Jackson ImmunoResearch Laboratories lne., #109-005-098). Vzorky z buněk COS se ředily sériově a přidaly se do každé prohlubně. Po inkubaci po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C a promytí se přidal kozí anti-lidský lehký řetězec kappa konjugovaný s křenovou peroxidázou (Sigma, A-7164) . Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě 37 °C a promytí se přidal K-modrý substrát (směs 3, 3', 5, 5'tetramethylbenzidin a peroxid vodíku, Bionostics, Limited, #KB175) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Reakce se zastavila za použití roztoku „Red Stop (Bionostics Limited, #RS20) a optická hustota se odečítala na čtecím zařízení pro mikrodestičky při vlnové délce 650 nm. Čištěné protilátky IgGl/kappa (Sigma, 1-3889) známé koncentrace se použily jako standard.

9 9 99 9-9

9 · · * · · ♦ · » • « · 9 9 9 9 9 9

9999 9 · «·*·«>

7/1 ♦ · ····*» ·«· · 999 9999 99 99

Exprese chimérových protilátek F19 v buňkách COS byla slabá (tabulka č. 2). Pohybovala se mezi 10 a 60 ng/ml, což je alespoň desetkrát méně než je tomu u většiny protilátek.

Za účelem zvýšit silu exprese chimérových protilátek F19, vedoucí sekvence oblasti F19 V_L se změnila substitucí leucinu za prolin v poloze -9. Tato jediná změna aminokyseliny ve vedoucí sekvenci vedla alespoň ve zdvojení množství chimérových protilátek produkovaných v buňkách COS.

Výsledky navázání buněk ukazují, že chimerové protilátky F19 se váží specificky a s očekávanou aviditou na cíl FAP.

Tabulka 2: Koncentrace chimérových protilátek F19 v supetnatantu CÓS (výsledky tří nezávislých transfekcí)

Komponenty transfekovaných protilátek	lidské yl/K
těžký řetězec	lehký řetězec kappa	(Hg/ml)
cF19	cF19 (vedoucí sekvence F19)	0, 060
cF19	cF19 (mutovaná vedoucí sekvence F19)	0,212
cF19	cF19 (vedoucí sekvence F19)	0,056
cF19	cF19 (mutovaná vedoucí sekvence F19)	0,108
CF19	cF19 (vedoucí sekvence F19)	0,011
cF19	cF19 (mutovaná vedoucí sekvence F19)	0,087

• φ

9·· ·

Příklad 3: Konstrukce verze A až C lidského lehkého řetězce

F19 s upraveným tvarem (L_A - L_B)

Konstrukce první verze lidské oblasti F19 V_L s upraveným tvarem (L_A) se provedla za použití přesahujících fragmentů PCR způsobem, který je podobný způsobu popsanému v publikaci Daugherty B. L., DeMartino J. A., Law M. F. , Kawka D. W. , Singer I. I. and Mark G. E. (1991) Polymerase chain reaction (PCR) facilitates the cloning, CDR-grafting and rapid expression of a murine monoclonal antobody directed against the CD18 component of leukocyte integrins. Nucl. Acids Res. 19: 2471). Syntetizovalo se deset oligonukleotidů, které obsahují pět párů primerů APCRl-vlal, vla2-vla3, vla4-vla5, vla6-vla7 a vla8-APCR4 (tabulka č. 3 a obrázek č. 28). Byly to přesahující sekvence, které obsahují mezi sousedícími páry alespoň 21 baží (obrázek č. 28). APCR1 a APCR4 se hybridizovaly s lemujícími sekvencemi vektoru pUC19. Mutagenní primery se navrhly tak, že jejich 5'konec ihned následuje po doplňkové poloze kodonu. Tato strategie se použila k paralýze adice jednoho nukleotidu na 3'konec komplementárního řetězce s mutagenním primerem DNA polymerázou během PCR (popisuje se v publikaci Sharrocks A. D. and Shaw Ρ. E. (1992) Improved primer design for PCR-based, site-directed mutagenesis. Nucl. Acids Res. 20: 1147) . Vhodné páry primerů (0,2 μΜ každého primeru) se kombinovaly s 10 ng verze B cDNA lidské oblasti L25V_l s upraveným tvarem a 1 jednotka AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) DNA polymerázy v 50 μΐ PCR pufru, který obsahuje 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kel, 200 μΜ dNTP a 1,5 mM MgCl₂. Směs se přelila minerálním olejem a provedlo se PCR při 25 cyklech, přičemž každý cyklus zahrnuje denaturační krok při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, navázání primeru při teplotě 55 °C po dobu 1 minuty a prodlužovací krok při teplotě 72 °C po dobu 2 minut. Pak následuje jediný cyklus, který zahrnuje další prodlužující krok při teplotě 72 °C po dobu 10 minut. Pak * · • * · 99 • 9 · 9· 9 · • · · · · • 9 9 99 9 · ·

9 9 9 • 99 · ··· 9999

9 9 9

99 následuje chlazení při teplotě 4 °C. Přechodová doba mezi navázáním primeru a extenzí je 2,5 minut. Produkty PCR pěti reakcí (A, B, C, D a E) se pak čistily gelovou elektroforézou. Pak následovala eluce za použití Wizard PCR (Promega). Produkty PCR A, B, C D a E se uspořádaly podle své komplementarity. Ve druhé sadě reakcí PCR se do reakcí PCR o objemu 50 μΐ přidaly produkty PCR B a C a D a E (50 ng každého produktu). Každá reakční směs obsahovala 1 jednotku DNA polymerázy AmpliTaq (PerkinElmer Cetus). Reakce procházely 20 cykly, jak se popisuje shora v textu s výjimkou toho, že teplota teplotní hybridizace se zvýšila na teplotu 60 °C. Ve třetí sadě reakcí PCR se produkty PCR F a G amplif ikovaly pomocí PCR za použití 1 μΐ každého produktu a vhodného páru primerů PCR (vla2-vla5 nebo vla6-APCR4). Reakce PCR obsahovaly 1 jednotku DNA polymerázy AmpliTaq v 50 μΐ reakce PCR (jak se popisuje shora v textu) a amplifikovaly se při 25 cyklech, jako první stádium. Ve čtvrté sadě reakcí PCR se produkt PCR H amplifikoval za použití 1 μΐ obsahu každé reakce PCR a páru PCR primerů vla2-APCR4. Nakonec se PCR produkty A a H uspořádaly na základě své vlastní komplementarity ve dvou stupňové reakci PCR, která je podobná reakci popsané shora v textu za použití RSP a UP, jako terminálních primerů. Zcela uspořádaný fragment reprezentující celou lidskou oblast F19V_L zahrnující vedoucí sekvenci se štěpil restrikčními enzymy HindlII a BamHI a klonoval se do vektoru pUC19 za účelem sekvenování. Klon, který má správnou sekvenci DNA se označil jako reshF19La (obrázek č. 29) a subklonoval se do eukaryontního vektoru pKNIOO. Sekvence DNA reshFl9La, která se klonovala do pKNIOO, je zobrazena na obrázku č. 30.

Druhá verze lidské oblasti F19V_L (L_B) se zkonstruovala za použití stejného schématu, jako je to popsané pro La, ale kde primery vla4 a vla7 se substituovaly vlb4 a vlb7 (tabulka č.

3). Sekvence DNA L_B je zobrazena na obrázku č. 29.

00 • 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 «

00

Třetí verze lidské oblasti F19V_L (L_c) s upraveným tvarem se zkonstruovala za použití sady pro místně řízenou mutagenezi QuikChange™ od firmy Stratagen. Způsob místně řízené mutageneze QuickChange se uskutečnil podle instrukcí výrobce za použití dvouřetězcové templátové DNA reshF19La ve vektoru pKNIOO. Mutagenní oligonukleotidové primery F19Lc-sense a F19Lc-antisense (tabulka 3), které jsou vhodné při použití v tomto protokolu se navrhly podle instrukcí výrobce. Oba mutagenní primery obsahovaly požadovanou bodovou mutaci (kodon TTT v poloze 49 zbytku podle Kabata (Phe) se změnil na TAT, který kóduje Tyr) a navázaly se ne stejnou sekvenci na opačném řetězci L_A ve vektoru pKNIOO. Bodová mutace se ověřila sekvenováním DNA celé oblasti V_L. Sekvence DNA L_c se zobrazila na obrázku č. 29. Aby se eliminovala možnost, že se objeví náhodné mutace v pKNIOO během reakce PCR, oblast V_L se odštěpila od vektoru pKNIOO, jako fragment HindlII/BamHI a znovu se subklonovala do neupraveného vektoru pKNIOO, který se štěpil stejnými restrikčními enzymy.

Tabulka č. 3: PCR primery vhodné pro konstrukci variabilních oblastí lidského lehkého řetězce F19 s upraveným tvarem.

1. Primery vhodné pro syntézu verze „A

Fl9vlal (36-mer)

5'GTCATCACAATGTCTCCGGAGGAACCTGGAACCCAG 3'

F19vla2(29-mer)

5'CTCCGGAGACATTGTGATGACCCAATCTC 3'

F19vla3(45-mer):

5'GAATATAAAAGGCTCTGACTGGACTTGCAGTTGATGGTGGCCCTC 3 ' f19vla4(72-mer):

• ·

5' CAGTCAGAGCCTTTTATATTCTAGAAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTATCAGCAGAA

ACCAGGACAGCC 3'

F19vla5(44-mer)

F19vla6 (67-mer)

F19vla7 (53-mer)

F19vla8(33-mer)

2. Primery vhodné pro syntézu verze „B

F19vlb4 (72-mer)

F19vlb7(57-mer)

3. Primery vhodné pro syntézu verze ,,C

Fl9Lc-sense (34-mer):

F19Lc-antisense (34-mer) • · • · · · ·

4. Primery hybridi zující s lemujícími sekvencemi vektoru PUC19

APCR1 (17-mer, sense primer 5'TACGCAAACCGCCTCTC 3'

APCR4 (18-mer, anti-sense primer) 5'GAGTGCACCATATGCGGT 3'

RSP (-24) (16-mer, sense primr) 5 'AACAGCTATGACCATG 3' (JP (-40) (17-mer, antisense primer): 5'GTTTTCCCAGTCACGAC 3'

Příklad 4: Konstrukce lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem verze A až E (H_A-H_E)

Verze „A lidských oblastí F19V_H (H_A) s upraveným tvarem se zkonstruovala za použití stejných metod PCR, jak se popisuje v případě konstrukce verze „A lidské oblasti F19V_L (L_A) s upraveným tvarem (obrázek č. 31). Templátová DNA je verze „A lidské oblasti 226V_H s upraveným tvarem (Léger 0. J.

P., Yednock T. A., Tenner L., Horner H. C., Hines D. K. , Keen S., Saldanha J. , Jones T., Fritz L. C. and Bending Μ. M. (1997). Humanizace myších protilátek proti lidskému integrinu alfa-4: potencionální lék pro léčbu roztroušené sklerózy (popisuje se v publikaci Hum. Antibod. 8: 3). Navrhlo se a syntetizovalo se 6 primerů PCR vhodných pro konstrukci verze „A lidské oblasti F19V_H s upraveným tvarem (tabulka č. 4). Produkty PCR A, B, C a D se získaly za použití PCR primerů APCRl-Vhal, Vha2-Vha3, Vha4-Vha5 a Vha6-APCR4. Podmínky PCR byly v podstatě stejné jako se popisují při konstrukci lidské oblasti F19V_l s upraveným tvarem. Klon, který má správnou sekvenci DNA, se označil reshF19Ha (obrázek č. 32) a pak se subklonoval do eukaryontního expresívního vektoru pGlD105. Sekvence DNA reshF19Ha se klonovala do pGlD105, jak se zobrazilo na obrázku č. 33.

Třetí verze lidské oblasti F19V_L (H_c) s upraveným tvarem se zkonstruoval za použití stejného schématu, jak se popisuje v případě H_A, ale kde primer Vha4 se nahradil Vhc4 (tabulka č.

4). Sekvence DNA H_c je zobrazena na obrázku č. 32. Druhá (H_B) a fe fe • fefefe ·· fefe fefe fe fefefefe • fefefefe fe fefe fefe fe fe · • fe čtvrtá (H_d) verze lidské oblasti F19V_H s upraveným tvarem se zkonstruovala na základě způsobu PCR mutageneze popsaného v publikaci Kamman M., Laufs J. , Schell J. , and Gronenborn B. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR) . Nucl. Acids Res. 17: 5404) . V případě H_B a H_d se použil při reakcích PCR mutagenní primer F19Vhbd6( Tyr91 až Phe. 91, tabulka č. 4) v páru s APCR4, kde se jako templátová DNA použila H_A a H_c. Produkty PCR VHb a Vhd se štěpily restrikčními enzymy Pstl a BamHI a subklonovaly se do reshFl9Ha a reshFl9Hc, které se štěpily stejnými dvěma restrikčními enzymy. Sekvence DNA H_B a H_D jsou zobrazeny na obrázku č. 32.

Verze „E lidské oblasti F19V_H (H_E) s upraveným tvarem se zkonstruovala na základě způsobu PCR mutageneze popsaného v publikaci publikaci Kamman M., Laufs J. , Schell J., and Gronenborn B. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR). Nucl. Acids Res. 17: 5404.

V případě reshF19He se použil mutagenní primer F19MsclHe (tabulka č. 5) v páru s primerem F19V_HHindIII (tabulka č. 5) v reakcích PCR se jako templátová DNA použila H_c klonovaný do savčího expresívního vektoru pgldl05. Vhodné páry primerů (0,2 μΜ každého primeru) se kombinovaly s 10 ng cDNA verze „A lidské oblasti 226 V_H s upraveným tvarem ve 100 μΐ PCR pufru, který obsahuje 10 nM, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH8,8) , 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100 a 200 μΜ dNTP. reakční směsi se přelily minerálnímolejem a udržovaly se při teplotě 94 °C po dobu 5 minut. Pak se přidala 1 jednotka Deep Vent DNA polymerázy (new England Biolabs) (provedla se PCR s „horkým startem, popisuje se v publikaci Chou Q. , Russell M., Birch

D., Raymond J. and Bloch W. (1992) Prevention od pre-PCR mispriming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucl. Acids Res. 20: 1717) a PCR se provedlo ve 25 cyklech na zařízení TRIO-Thermoblock Thermal Cycler • · ·· « · • · · « 1111 1 • ····

11 • * · · • 1 · · • · 11 ·

11 · ·· ·· (Biometra, Gottingen, Germany). Každý cyklus zahrnuje krok denaturace při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, hybridizaci primerů při teplotě 70 °C po dobu 1 minuty a prodlužování při teplotě 72 °C po dobu 2 minut. Pak následuje jediný cyklus zahrnující prodloužení při teplotě 72 °C po dobu 10 minut, pak následuje ochlazení na teplotu 4°C. Produkty PCR se pak extrahovaly a čistily z 1,4 % standardního agarového gelu v pufru TAE za použití sady pro extrakci z gelu QIAquick™ podle doporučení výrobce (Qiagen Ltd. UK) . Produkt PCR V_H se pak štěpil restrikčními enzymy MscI a HindlII a ligoval se do reshF19Hc klonovaného do pgldl05, který se před tím štěpil stejnými dvěma restrikčními enzymy. Restrikční místo, které rozeznává restrikční enzym Mscl je jediné ve všech verzích lidské oblasti F19V_H s upraveným tvarem a nevyskytuje se v expresívním vektoru pgldl05. Místo rozeznávané restrikčním enzymem HindlII je jediným místem v pgldl05 za účelem klonování genů imunoglobulinu V_H. Buňky mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue vhodné pro elektroporézu se transformovaly 1 μΐ ligované DNA a nanesly se na plotny s agarem, který obsahuje ampicilin. U kolonií se pak testovala přítomnost přítomnost a správná velikost inzertů přímou metodou PCR na koloniích (Gussow D. and Clackson T. (1989) Direct cloně characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res. 17: 4000) s primery HCMi a

Hucyl hybridizaci s s lemujícími sekvencemi vektoru pgldl05 (tabulka č. 5). Za použití sady Plasmid Midi se z positivních kolonií připravila DNA podle protokolo doporučeného výrobcem (Qiagen Ltd., UK). Sekvenace DNA se uskutečnila způsobem dideoxy zakončením řetězce (popisuje se v publikaci Sanger F., Nicklen S. and Coulson A. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463) přímo z kruhových vektorů DNA za použití běžné denaturace teplem (Andersen A., Pettersson A. and Kieldsen T. (1992) A fast and simple technique for sequencing plasmid DNA with

4 • 4 • 444 4 • <·

4 4 • 4

4

4

444 4444

44

4 4

4 4

4 4

4 4 ·

44 sequenase using heat denaturatin. Biotechniques 13: 678) a sekvenázy 2.0 (USB, Cleveland, OH). Sekvence DNA reshF19He je zobrazena na obrázku č. 32.

Tabulka č. 4: PCR primery vhodné pro konstrukci verze A až D variabilních oblastí lidského těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem

1. Primery vhodné pro syntézu verze „A F19vhal (47-mer):

Fl9vha2 (53-mer):

Fl9vha3 (71-mer):

F19vha4 (71-mer):

F19vha5

63-mer):

F19vha6 (48-mer):

2. Primery vhodné pro syntézu verze „C F19vhc4 (71-mer):

• · ·· · • · · • ···· · • · ··· 9 ·· • · ·· • · • ····

9 9

9 9

9 ·

9 9

99

3/Primery vhodné pro syntézu verze „B a ,,D

F19vhbd6 (27-mer):

4. Primery hybridizující s lemujícími sekvencemi vektoru PUC19 APCR1 (17-mer, sense primer): 5'TACGCAAACCGCCTCTC 3'

APCR (18-mer, anti-sense primer): 5^zGAGTGCACCATATGCGGT 3'

Tabulka č. 5: PCR primer vhodný pro konstrukci verze E variabilních oblastí těžkého řetězce F19 s upraveným tvarem

1. Primery vhodné pro syntézu verze „E

F19MscIHe (65-mer, anti-sense):

2. Primery hubridizující s lemující sekvencemi savčího expresívního vektoru pgldl05

HCMi (28-mer, sense): 5'GTCACCGTCCTTGACACGCGTCTCGGGA 3'

Hucy (17-mer, anti-sense): 5'TTGGAGGAGGGTGCCAG 3'

Příklad 5: Koncentrace lidských protilátek F19 s upraveným tvarem v supernatantech buněk COS

Buňky COS se transformovaly jedním párem serie konstrukcí lidských protilátek F19 s upraveným tvarem a koncentrace lidských protilátek se měřila za použití testu IgGl/Kappa ELISA, jak se popisuje v příkladu 2.

Tabulka 6: Koncentrace lidských protilátek F19 s upraveným tvarem v supernatantech buněk COS

Transfekované protilátkové komponenty

lidský γί/K

těžký řetězec	lehký řetězec kappa	koncentrace (pg/ml)
	La	2,50
Ha	Lb	0,18
hb	La	1,25
Hb	Lb	0,10
hd	La	1, 15
hd	lb	0,18
Ha	La	1,50
Ha	Lc	1,56
Hc	La	1,47
Hc	Lc	1, 97
cF19	La	1, 54
cF19	Lb	0,07
cF19	Lc	2,14

Tabulka č. 7: Koncentrace lidských protilátek F19 s upraveným tvarem v supernatantech buněk COS

Transfekované protilátkové komponenty	lidský yl/K
těžký řetězec	lehký řetězec kappa	koncentrace ^g/ml)
Ha	La	2,00
Ha	Lc	2,50
Hc	La	2,90
Hc	Lc	3,00
he	La	2,80
he	Lc	3,50

Sestřih RNA nutný pro expresi genů imunoglobulinu v savčích buňkách

Savčí expresívní vektory pKNIOO a pgldl05 obsahují intron mezi variabilní a konstantní oblastí, který se odstraní během procesu exprese genu za vzniku mediátorové RNA. Sestřih zahrnující rekombinaci DNA mezi donorovými místy těžkého a • · • 0 lehkého řetězce sestřihu a akceptorovým místem sestřihu imunoglobulinu se popisuje na obrázku č. 34.

Příklad 6: Průtoková cytometrická analýza navázání cF19 a lidských buněk, které exprimují L_AH_C až FAP

Testovala se schopnost L_AH_C vázat rekombinantně a endogenně exprimovaný FAP na povrchu buněk.

Příklad popisuje stanovení navázání L_AH_C na buněčný FAP. Lidské nádorové buňky přirozeně exprimující FAP MF-SP (popisuje se v publikaci Shirasuma, K. et al., Cancer 1985, 55:2521-32) a buněčné linie lidského nádoru transfekované FAP se použily jako buněčné cíle. L_AH_C se studoval cytofluorometrickým testem a hodnotilo se přímé navázání na cílové buňky, stejně jako inhibiční účinek na navázání myších protilátek F19 nebo chimérových cF19 anti-FAP protilátek.

Používané protilátky a buněčné linie byly F19 (myší monoklonální anti-lidské protilátky FAP, podtřída IgGl), mlG (myší imunoglobulin, třída IgG), cF19 (chimerové monoklonální anti-lidské protilátky F19, podtřída IgGl), L_AH_C (monoklonální anti-lidské protilátky FAP s upraveným tvarem, podtřída IgGl), hlgGl (lidský imunoglobulin, podtřída IgGl), MF-SH (linie lidských maligních vláknitých buněk histiocytomu), HT-1080 (buněčná linie lidského fibrosarkomu), HT-1080FAP klon 35 (buněčná linie HT-1080 transfekovaná cDNA kódující lidský FAP) . Protilátky se se značily biotinem způsobem, který se popisuje v příkladu 8 a 12.

Přímé navázání L_AH_C na FAP na povrchu buněčných linií lidského nádoru

5xl0⁵ buněk zkoumané linie nádorových buněk se inkubovalo se stanovenou koncentrací testovaných a kontrolních protilátek v celkovém objemu 0,2 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem (PBS) doplněného 1% bovinního sérového albuminu • · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · ····· · · ·· ·· · • · · · · · · • ······· · · ·· (BSA) po dobu 30 minut na ledu. Následně se buňky promyly dvakrát 2 ml PBS, resuspendovaly se v 0,2 ml PBS doplněném 1% BSA, pak se přidaly myší anti-lidské IgG značené FITC (Dianova) v ředění 1:20, jako sekundární činidlo a vše se inkubovalo na ledu po dobu 30 minut.

V jiném případě 5xl0⁵ buněk zkoumané buněčné linie nádoru se inkubovalo s označenou koncentrací cF19 značených biotinem v celkovém objemu 0,2 ml PBS doplněném 1% BSA na ledu po dobu 30 minut. Buňky se následně promyly dvakrát 2 ml PBS, resuspendovaly se v 0,2 ml PBS doplněném 1% BSA a inkubovaly se na ledu dalších 30 minut, kde se jako sekundární činidlo použil streptavidin značený s FITC (Dianova) v ředění 1:40.

Buňky se opět promyly dvakrát 2 ml PBS, resuspendovaly se v celkovém objemu 0,5 ml PBS doplněném 1% paraformaldehydu (PFA) a držely se na ledu. Fluorescence jedné buňky se stanovila cytofluorometricky analýzou buněčné zelené fluorescence při vlnové délce 488 nm v zařízení vhodném pro měření fluorescence aktivované v buňkách EPICS XL (Coulter).

Kompetice L_AH_C při navázání biotinem značených cF19 na buněčný povrchový FAP v lidské buněčné linii exprimující FAP

5xl0⁵ buněk zkoumané nádorové buněčné linie se inkubovalo s označeným množstvím neznačených testovaných a kontrolních protilátek, které se přidaly spolu s protilátkami cF19 značenými biotinem v koncentraci 1 μg/ml. Následně se buňky dvakrát promyly 2 ml PBS, resuspendovaly se v 0,2 ml PBS doplněném 1% BSA a jako sekundární činidlo se použil streptavidin značený FITC (Dianova) v ředění 1:40. Směs se inkubovala na ledu po dobu 30 minut.

Buňky se pak dvakrát promyly 2 ml PBS, resuspendovaly se v 0,5 ml PBS a doplnily se 1% PFA a držely se na ledu. Fluorescence jediné buňky se stanovila cytofluorometricky • · • · · · analýzou buněčné zelené fluorescence při vlnové délce 488 nm na zařízení pro stanovení fluorescence aktovované v buňkách

EPICS XL (Coulter).

Protilátky cF19 a L_AH_C se váží způsobem závislým na koncentraci specificky vůči lidským nádorovým buňkám HT1080FAP klon 33 transfekovaných FAP (tabulka č. 8). Nedetekovalo se žádné navázání na buňky HT-1080, které nevykazují přítomnost FAP (tabulka č. 9). cF19 a L_AH_C se vázaly způsobem závislým na koncentraci na buňky MF-SH, které endogenně exprimují FAP (tabulka č. 10).

Biotinem značené protilátky cF19 se vázaly na lidské buňky HT-1080FAP klon 33 (tabulka č. 11) způsobem závislým na koncentraci. Žádné navázání se nedetekovalo v případě buněk HT-1080, které nevykazují expresi FAP (tabulka č. 12).

Navázání biotinem značených protilátek cF19 na HT-1080FAP klon 33 se ínhibuje jak neznačenými cF19 tak i neznačenými L_AH_C (tabulka č. 13).

Chímerové anti-lidské FAP monoklonální protilátky cF19 stejně jako lidské anti-lidské FAP monoklonální protilátky L_AH_C s upraveným tvarem (příklad 10) se vyznažují tím, že se váží přímo na FAP exporimovaný na lidské buněčné linii buď endogenně nebo transfekovaných s cDNA, která kóduje uvedený protein. Toto navázání je závislé na koncentraci. Navázání biotinem značených cF19 se může inhibovat neznačenými protilátkami cF19 a L_AH_C.

Za použití cytofluorometrické technologie přímé navázání stejně jako inhibice specifický se vázajícího činidla vykazuje specifitu chimerových cF19 a L_AH_C lidských monoklonálních protilátek s upraveným tvarem na FAP exprimovaným na buněčném povrchu.

Tabulka č. 8: Navázání anti-FAP protilátek na buňky HT-1080FAP klon 33 • ·

koncentrace	průměrní intenzita fluorescence
protilátek
(ng/ml)	hlgGl	cF19	lahc
500	0,12	6, 65	2,76
100	0,12	1,63	0,66
20	0, 12	0,43	0,22
4,0	0, 12	0, 17	0,15
CO o	0,12	0,14	0,13

Tabulka č. 9: Navázání anti-FAP protilátek na netransfekované buňky HT-1080

koncentrace	průměrní intenzita fluorescence
protilátek
(ng/ml)	hlgGl	cF19	lahc
500	0, 11	0,11	0,12
100	0, 11	0,11	0,11
20	0, 11	0, 11	0,12
4,0	0,11	0,11	0,12
0,8	0, 11	0,11	0,11

Tabulka č. 10: Navázání protilátek anti-FAP na buňky MF-SH

koncentrace	průměrní intenzita fluorescence
protilátek
(ng/ml)	hlgGl	cF19	lahc
4 000	0, 6	3,6	2,8
2 000	n.d.	3,3	2,5
1 000	n.d.	2,4	1, 9
500	n.d.	1,8	1,3

n.d. znamená nebylo provedeno

Tabulka č. 11: Navázání biotinem značených protilátek cF19 na buňky HT-1080FAP klon 33

koncentrace protilátek	průměrná intenzita fluorescence
(ng/ml)	biotinem značené hlgGl	biotinem značené cF19
5 000	0,2	36, 5
1 000	0,2	18,1
200	0,2	4,5
40,0	0,2	1,3
8,0	0,2	0,5
1,6	0,3	0,3

Tabulka č. 12: Navázání protilátek cF19 značených biotinem na netranfekované buňky HT-1080

koncentrace protilátek	průměrná intenzita fluorescence
(ng/ml)	biotinem značené hlgGl	biotinem značené cF19
5 000	0,1	0,1
1 000	0,1	0,1
200	0,1	0,1
40,0	0,1	0,1
8,0	0,1	0,1
1,6	i—1 o	0,1

Tabulka č. 13: Kompetice anti-FAP protilátek s navázáním biotinem značených protilátek cF19 na buňky HT1080FAP klon 33

	Koncentrace soutěžících protilátek	průměrná koncentrace fluorescence
soutěžící protilátky	(gg/ml)
žádné	0,00	11,2

hlgGl	1,00	9, 0
hlgGl	3,16	11,3
hlgGl	10,00	00 στ
hlgGl	31, 66	10,3
cFl9	1,00	7,5
cF19	3, 16	00 -M1
CF19	10,00	1,3
cF19	31, 66	1,2
LaHq	1,00	8,00
lahc	3, 16	5,5
lahc	10,00	2,9
LaHc	31, 66	1,7

Biotinem značené cF19 se použily ve všech testech v koncentraci 1 pg/ml.

Příklad 7: In vitro imunitní efektorové funkce monoklonálních protilátek L_AH_C

Tento experiment se provedl za účelem stanovení potencionálu monoklonálních protilátek (mAB) L_AH_C se specifitou pro fibroblastový aktivační antigen (FAP) lyžovat cíle exprimující FAP v přítomnosti lidského komplementu nebo lidských leukocytů s jedním jádrem.

Zvláště se studovala schopnost protilátek L_AH_C zprostředkovat cytotoxické účinky proti buňkám HT-1080FAP klon 33, které exprimují lidský FAP na svém povrchu. Cytotoxicita se stanovila in vitro za použití následujícího přístupu: cílové buňky značené ⁵¹Cr se inkubovaly v přítomnosti L_AH_C s lidským sérem jako zdrojem komplementu nebo lidského MNC (buňky periferní krve s jedním jádrem), který slouží jako efektor. Uvolnění ⁵¹Cr se stanovilo jako míra lyže cílové buňky.

• · • 9 9 · 9

• 9 · • 9 ·

9 9

Používané protilátky a buněčné linie byly L_AH_C (lidské anti-lidské FAP IgGl protilátky se změněným tvarem), hlGl (kontrolní protilátky izotyp lidské IgGl), 3S193 (myší monoklonální anti-Lewis^y IgG3 protilátky), mlgG (myší kontrolní protilátky IgG), HT-1080 (lidského fibrosarkomu), HT-1080FAP klon 33, (HT1080 transfekované cDNA kódující lidský FAP), MCF7 (buněčná linie adenokarcinomu lidké prsní žlázy).

Lyže cílových buněk pomocí L_AH_C zprostředkovaná komplementem RPMI 1640 s 100 μϋί ⁵¹Cr(NEN) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Následně se buňky promyly dvakrát médiem bez ⁵¹Cr a resuspendovaly se v koncentraci 2xl0⁵ buněk na mililitr.

Lidské sérum jako zdroj komplementu se čerstvě připravilo z krve různých dárců. Krev se odebrala z žíly v paži a ponechala se při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny, aby se vysrážela a držela se přes noc při teplotě · 4 °C. Sérum se separovalo centrifugaci a oddělilo se od sedimentu.

Studované protilátky se naředily ze zásobního roztoku a připravila se vhodná koncentrace buněk v kultivačním médiu RPMI1640.

Nádorové buňky značené radioaktivně v množství lxlO⁵ označené buněčné linie se inkubovaly po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v inkubátoru (v atmosféře 95% vzduchu a 5 % CO₂) v přítomnosti různých koncentrací testovaných a kontrolních protilátek a 25 % (objem.) lidského séra, jako zdroje lidského komplementu. Inkubace se provedly na plotnách s 96 prohlubněmi ve tvaru U v celkovém objemu 200 μΐ kultivačního média RPMI 1640 a stanovení se provedlo ve třech sadách. Po inkubační době se plotny centrifugovaly a odebralo se 100 μί supernatantu a stanovila se intenzita radioaktivity na počítači gamma. Celkové množství začleněné radioaktivity se stanovilo měřením cílových buněk v množství 10⁴. Samovolné uvolnění se definovalo • φ φφφφ · • · · φ φ · • φφφφ φ · φ φ φ φ • · φ φ φφφφ φφφ φ φφφ φφφφ φφ φφ jako aktivita uvolněná z cílových buněk v nepřítomnosti protilátek a komplementu během popsané doby inkubace.

Specifická lyže se vypočítala následujícím způsobem:

(aktivita vzorku)-(aktivita spontánního uvolnění) specifická lyže (%)=------------------------------------------------------------------x 100 (maximální aktivita)-(aktivita spontánního uvolnění)

Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (ADCC) L_AH_C

Radioaktivně značené protilátky se inkubovaly v kultivačním médiu RPMI 1640 se 100 μϋί ⁵¹Cr při teplotě 37 C po dobu jedné hodiny. Buňky se následně dvakrát promyly kultivačním médiem bez přítomnosti ⁵¹Cr a resuspendovaly se v koncentraci 2xl0⁵ buněk v jednom mililitru.

MNC (jednojaderné buňky periferní krve) se připravily z periferní krve odebrané z paže lidských dobrovolníků. Sražení krve se předešlo přidáním 20 % citrátového pufru. MNC ze 4 ml této připravené krve se čistilo centrifugací (30 minut při 400xg a teplotě místnosti) na 3 ml média vhodného pro lymfocyty (Boehringer Mannheim, Germany). MNC (jednojaderné buňky periferní krve) se separovaly gradientem, promyly se třikrát a ředily se kultivačním médiem RPMI 1640 na vhodnou koncentraci. Buňky K aktivované lymfocyty (LAK) se získaly z MNC (jednojaderné buňky periferní krve) inkubací po dobu 5 dní při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře 95 % vzduchu a 5 % CO₂ při počátečním množství buněk l,3xl0⁶ buněk v jednom mililitru v přítomnosti 100 U rekombinantního lidského interleukinu-2 (IL-2). Studované rpotilátky se ředily ze zásobního roztoku na vhodnou koncentraci kultivačním médiem RPMI 1640.

Radioaktivně značené nádorové buňky v množství lxlO⁴ určené buněčné linie se inkubovaly po dobu 5 hodin při teplotě °C v atmosféře 5 % CO₂ v přítomnosti různých koncentrací testovaných a kontrolních protilátek a MNC. MNC se přidalo

v takovém množství, aby se dosáhlo určeného poměru efektoru:cílovým buňkám. Inkubace se uskutečnila na plotnách s prohlubněmi ve tvaru U v celkovém objemu 200 μΐ kultivačního média RPMI1640 a experiment se provedl ve dvou kopiích.

Po době inkubace se plotny centrifugovaly a odebralo se 100 μΐ supernatantu a stanovila se síla radioaktivity v počítači gamma. Celkové množství začleněné radioaktivity se stanovilo měřením 10⁴ cílových buněk. Spontální uvolnění se definovalo jako aktivita uvolněná z cílových buněk v nepřítomnosti protilátek a efektorových buněk během popsané doby inkubace.

Specifická lyže se vypočítala následujícím způsobem:

(aktivita vzorku)-(aktivita spontánního uvolnění) specifická lyže (%)=-------------------------------------------------------------------x 100 (maximální aktivita)-(aktivita spontánního uvolnění)

Lyže komplementu nádorových buněk zprostředkovaná protilátkami

V buňkách HT-1080FAP klon 33 ošetřených L_AH_C v koncentracích až 50 μρ/ιηΐ (tabulka č. 14, tabulka č. 15a) se nepozorovala žádná lyže specifická pro L_AH_C zprostředkovaná komplementem.

Lytická aktivita lidského séra, které se používá jako zdroj komplementu, se projevila lyží buněk lidského karcinomu prsní žlázy MCF-7 v přítomnosti 12,5 μg/ml 3S193, což jsou myší monoklonální anti-Lewis^Y protilátky se známou schopností aktivovat komplement (tabulka č. 15b) .

Buněčná lyže nádorových buněk zprostředkovaná protilátkami

V přítomnosti L_AH_C v koncentraci až 10 μρ/ιηΐ se nedetekovala žádná ADCC (buněčná toxicita závislá na protilátkách) zprostředkovaná lidskými MNC (tabulka č. 16) nebo lidskými buňkami LAK (buňka K aktivovaná lymfokiny, tabulka č. 17) L_AH_C na buňkách HT-1080FAP klon 33, což souhlasí • · · · ·

s výsledky dosaženými s izotypovou kontrolou při poměru efektor: cílová buňka 50:1.

Ve vhodných testech in vitro s lidským komplementem nebo s lidským MNC, který se použije jako efektor, lidské anti-FAP monoklonální protilátky L_AH_C nevykazují žádné detekovatelné cytotoxické účinky shora v textu uvedených izotypových kontrol na nádorové buněčné linii HT-1080FAP klon 33 exprimující FAP.

Tabulka č. 14: Specifická lyže komplementu nádorových buněčných cílů HT-1080FAP klon 33 zprostředkovaná L_AH_C vyjádřená v (%)

Zdroj lidského séra	HT-1080 klon 33
koncentrace protilátek	kontrola izotypu hlgGl	lahc
A 50 μρ/ιηΐ	5	4
A 10 μς/πιΐ	5	3
B 50 μς/ιηΐ	7	5
B 10 μς/ιηΐ	6	5
0 μς/πιΐ	0	0

Inkubace se provedla po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti 25 % séra získaného z lidských dobrovolníků A nebo B, které slouží jako zdroj komplementu

Tabulka č.

Specifická lyže	komplementu	nádorových
buněčných cílů	HT-1080FAP	klon 33
zprostředkovaná	lidskými	anti-FAP
monoklonálními protilátkami LAHC	vyj ádřená
v (%)

Zdroj lidského séra	HT-1080 klon 33
koncentrace	hlgGl	lahc

• 4 • 4 ·

4 ·

4 4 • · · 4 · 4

protilátek
A 10 μ5/πι1	2	1
A 2,50 μ9/πι1	2	2
A 0,60 μg/ml	1	1
A 0,00 μς/ιηΐ	2	2
B 10 μg/ml	2	2
B 2,50 μg/ml	2	2
B 0,60 μg/ml	2	2
B 0,15μg/ml	2	2
B 0,00 μg/ml	2	2
C 10 μς/ιηΐ	2	2
C 2,50 μg/ml	1	1
C 0,60 μg/ml	1	1
C 0,15μg/ml	2	1
C 0,00 μg/ml	3	3

Inkubace se provedla po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti 25 % séra získaného z lidských dobrovolníků A, B nebo C, které slouží jako zdroj komplementu.

Tabulka 15b: Specifická lyže komplementu nádorových buněčných cílů MCF-7 zprostředkovaná myšímianti-Lewis^Y monoklonálními protilátkami 3S193 vyjádřená v (%)

Zdroj lidského séra	MCF-7
koncentrace protilátek	mlgG	3S193
A 10 μg/ml	0	21
A 2,50 μς/πιΐ	1	21
A 0,60 μς/ιηΐ	0	21
A 0,15 μg/ml	1	18
A 0,00 μg/ml	0	0

4· 44 • 4 4 ·

4 4 4

4 4 4

4 4 4

44

4

4444 9

999 9 • 4 · 4 9 4 4

B 10 μς/ιπΐ	1	13
B 2,50 μς/ιηΐ	0	17
B 0,60 μ9/πι1	1	18
B 0,15μ9/ιη1	1	15
B 0,00 μς/ml	0	0
C 10 μς/ml	1	22
C 2,50 μ9/ιη1	0	23
C 0,60 μς/ml	1	26
C 0,15μρ/πι1	1	20
C 0,00 μρ/ιηΐ	1	1

Inkubace se provedla po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti 25 % séra získaného z lidských dobrovolníků A, B nebo C, které slouží jako zdroj komplementu.

Tabulka č. 16: ADCC (buněčná toxicita závislá na protilátkách) (specifická lyže vyjádřená v %) cílových buněk HT-1080FAP klon 33 lidskými MNC (jednojaderné buňky periferní krve) zprostředkovaná L_AH_C.

HT-1080FAP klon 33

koncentrace protilátek	HT-1080 klon 33
(μς/ιηΐ)	hlgGl		LaHc
10 μς/πιΐ	2		1
2,50 μρ/ml	2		2
0,625 μς/ιηΐ	2		2
0,156	3		3
0,00 μ9/ιη1	3		3
Inkubace se proved)	.a po dobu 5	hodin při teplotě 37°C

v přítomnosti 10⁴ cílových buněk a při poměru efektor:cílovým buňkám 50:1.

♦ 9

9 9 9 · · ·

9 9

9 · • · 9 9 9 9 9 • ·♦····· 99 99

Příklad 8: Imunohistochemická analýza navázání monoklonálních protilátek L_AH_C na normální a neoplastickou lidskou tkáň

Tento experiment se uskutečnil za účelem stanovení vazebných charakteristik humanizovaných monoklonálních protilátek L_AH_C na normální a neoplastickou lidskou tkáň.

Použily se následující protilátky: L_AH_C, cF19 a negativní kontrola hlgGl se přímo značily biotinem podle popsaných způsobů a použily se v koncentraci 2,5 až 0,25 mg/ml v 2% BSA/PBS (bovinní sérový albumin ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem). Myší monoklonální protilátky F19 se použily jako supernatant tkáňových kultur hybridomu F19 v ředění 1:5 až 1:10 v 2% BSA/PBS.

V následujících imunochemických testech se použily následující činidla: komplex streptavidin-peroxidáza (Vector Labs, Burlingame, CA, USA), komplex avidin-biotin-peroxidáza (Vector Labs.), biotinem značené koňské anti-myší (VectorLabs.), DAB (diaminobenzidin, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA), Harrisův hematoxylin.

Čerstvé mražené testované tkáňové vzorky zahrnují: normální střevo, prsní žlázu, plíce, žaludek, pankreas, kůže, laryng, močový měchýř, hladké a kosterní svalstvo. Mezi testovanými nádory jsou karcinomy prsní žlázy, střeva, plic, jícnu, dělohy, vaječníků, pankreasu, žaludku a hlavy a krku.

Nepřímá aminoperoxidázová metoda se provedla podle publikovaných metod (Garin-Chesa P, Old L.J., Rettig WJ: Cell surface glykoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epithelial cancers. Proč.

Nati. Acad. Sci USA (1990) 87: 7235-7239) na čerstvých • •99 ·

999 999·

9 99 • · 9 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9

99 mražených sekcích o tloušťce 5 mikrometrů. Jako substrát konečné reakční produkty se použil DAB. Sekce se obarvila

Harrisovým hematoxylinem a testovala se exprese antigenu.

Exprese L_AH_C v normálních lidských tkáních

Normální testované tkáně byly negativní v případě exprese L_aH_c s výjimkou normální tkáně pankreasu, kde se v Langerhansových ostrůvcích stanovily pozitivní endokrinní buňky (A buňky) pomocí protilátek L_AH_C, cF19 a F19 (tabulka č. 18). Žádná imunoreaktivita se nepozorovala v případě hlgGl (podtřída lidského imunoglobulinu IgGl), které slouží jako negativní kontrola.

Exprese L_AH_C v nádorech

Ve vzorcích nádoru protilátky L_AH_C, cF19 a F19 vykazují neodlišitelný patern exprese v nádorových fibroblastech podpůrné vazivové tkáně. Silná homogenní exprese se zjistila u většiny testovaných případů, zvláště ve vzorcích zhoubného buj.ení získaného z prsní žlázy, střeva, plic, pankreasu a dlaždicových buněk karcinomů (SQCC) hlavy a krku (tabulka č. 10) . Žádná imunologická reaktivita se nepozorovala v případě, když se jako negativní kontrola použily hlgGl.

Protilátky L_AH_C, cF19 a F19 vykazují imunologickou reaktivitu s fibroblasty podpůrné vazivové tkáně nádorů. Žádnou L_aH_c nebo F19 imunologickou reaktivitu je možné spatřit v případě použití fibrocytů mesenchymu normálních orgánů nebo parenchymálních buněk normálních orgánů dospělého člověka. Imunologická reaktivita proti FAP se pozorovala pouze v sadě endokrinních buněk v ostrůvkách pankreasu, zvláště v buňkách A, které produkují glukagon a u čtyřech z devíti testovaných vzorků dělohy, které reprezentují sadu fíbroblastů podpůrné vazivové tkáně v těchto tkáních.

·

0

0

0 0 0 lidské tkáni a

FAP vykazují cF19 a myší •

0

0 0 0 · 0

0

Imunohystochemická analýza L_AH_C v lidských karcinomech, které nerozlišitelné paterny navázání monoklonální protilátky F19.

v normální exprimuj i na L_aH_c,

Tabulka č.

18: Imunologická reaktivita protilátek L_AH_C, cF19 a lidskou tkání monoklonálních F19 s normální

typ tkáně	č.	BIBH1	cF19	F19
mléčná žláza -buňky epitelu cév/vývodu žlázy	4	-		—
-myoepiteliální buňky		-	-	-
-pojivová tkáň		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
tlusté střevo -Lieberkuhn. krypty	6	—	—	—
-pojivová tkáň		-	-	-
-lymfoidní tkáň		-	-	-
-hladké svalstvo		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
-myenterický plexus		-	-	-
plíce průdušky -průduškový epitel	4
-hyalinní chrupavka	-	-	-	-
-pojivová tkáň	-	-	-	-
-mukózní žlázy	-	-	-	-
alveolus -pneumocyty (typ I/II)		—	—	—
-alveolární fagocyty	-	-	-	-
-alveolární kapiláry	-	-	-	-
j ícen -povrchový epitel	1		-
-pojivová tkáň	-	-	-	-

• · ·» φφ ·· • · · · · φφφφ ·· · » · · · φ ···· · φ φφφφφφ • · φ · · · · • φφφφφφφ ·· φφ

Tenké střevo -epitel vláken a krypt -pojivová tkáň -hladké svalstvo -krevní cévy -lymfoidní tkáň	1	-	-	-
močový měchýř -urotelium	2
-pojivová tkáň		-	-	-
-hladké svalstvo		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
pankreas -epitel cév	3		—
-acinární epitel		-	-	-
-Langerhanovy ostrůvky:		-	-	-
-B-buňky		-	-	-
-A-buňky		+ (*)	+ (*)	+ (*)
-D-buňky		-	-	-
-pojivová tkáň		-		-
-krevní cévy		-	-	-
-nervy		-	-	-
hrtan -dlaždicový epitel	1
-mukózní žlázy		-	-	-
-pojivová tkáň		-	-	-
-hyalinní chrupavka		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
-kosterní svalstvo		-	-	-
lymfatické uzliny -lymfoidní buňky	1	—
-lymfatická tkáň		-	-	-
-pojivová tkáň		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
slezina	1

• · ···· » •4 ·· 99 • 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 99

-červená a bílá dřeň		-	-	-
-sinusy		-	-	-
-pojivová tkáň		-	-	-
j átra	1
-hepatocyty		-	-	-
-žlučovod		-	-	-
-portálový trias		-	-	-
tyroidní žlázy -folikulární epitel	2	—
-parafolikulární buňky		-	-	-
-pojivová tkáň		-	-	-
prostatické žlázy	1
-glandurální epitel		-	-	-
-podpůrná vazivová tkáň		-	-	-
varle	1
-semenotvorný tubulus		-	-	-
-podpůrná vazivová tkáň		-	-	-
vaj ečníky	3
-folikuly		-	-	-
-podpůrná vazivová tkáň		-	-	-
děložní čípek -epitel	1		—	—
-podpůrná vazivová tkáň		-	-	-
děloha	9
-endometrium:
žlázy		-	-	-
podpůrná vazivová tkáň		+#	+#	+#
krevní cévy		-	-	-
-myometrium
mozková kůra	1
-neurony		-	-	-
-neurogliální buňky		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
malý mozek	1

• 0 • 0 0 · 0

0

-molekulární vrstva		-	-	-
-granulární buněčná vrstva		-	-	-
-Purkyňova buňka		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-
kůže	3
-dlaždicový epitel		-	-	-
-melanocyty		-	-	-
-kožní orgány		-	-	-
-pojivová tkáň		-	-	-
-krevní cévy		-	-	-

Zmrazené sekce fixované acetonem se testovaly imunoperoxidázovým postupem s komplexem avidin-biotin.

č. je počet vzorků tkáně získaných z různých testovaných jedinců * označení buněk A ria základě morfologie a polohy v ostrůvkách # pozitivní imunologická reaktivita ve podpůrné vazivové tkáni ve čtyřech až devíti testovaných vzorcích. Pozitivní vzorky reprezentují časnou (x2) a střední (x2) fázi proliferativního endometria.

Příklad 9: Druhy specifity navázání L_AH_C v tkáňových sekcích

Tento experiment se provedl za účelem zjištění reaktivity

L_AH_C s tkáněmi z myší, krys, králíků a opic pomocí imunohistochemických metod.

Jako negativní kontroly v těchto testech slouží monklonální protilátky cF19 a lidské IgGl (hlgGl). Činidla použitá pro imunologickou histochemii byly strepatavidin peroxidázový komplex (Vector Labs., Burlingame, CA, USA), DAB (Sigma Chemical Co., St. hematoxylin.

Louis, MO, USA)

Harrisonův

Testovaly se následující čerstvé mražené tkáňové vzorky z myší, krys, králíků a opic cynomoigus: mozek, játra, plíce, ledviny, žaludek, pankreas, střevo, brzlík, kůže, svaly, « · • fefefe · • fefe fefe fefe • fe · · · fefe fe • · fefefefe • ·····« • · fefe fefefefe «·· fe fefefe fefefefe fefe fefe srdce, slezina, vaječníky, děloha a varlata. Jako pozitivní kontrola se do každého testu zahrnuly vzorky ze sekcí normálního lidského pankreasu a zhoubného bujení prsní žlázy.

Imunohistologické chemické metody

V nepřímý imunoperoxidázový způsob se provedl, jak se popisuje ve stavu techniky (popisuje se v publikaci GarinChesa P., Old LJ, Rettig WJ: Cell surface glycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potentional antibody target in human epithelial cancers. Proč. Nati. Acad. Sci USA (1990) 87: 7235-7239), na čerstvých zmražených sekcích o tloušce pět mikrometrů. Protilátky L_AH_C, cF19 a hlgGl (v koncentraci 1 μρ/ιηΐ) se značily biotinem způsobem, který se popisuje ve stavu techniky a detekovaly se streptavidin peroxidázovým komplexem. DAB se použil jako substrát v případě konečného reakčního produktu. Sekce se barvily Harrisovým hematoxylinem a testovaly se za účelem zjištění exprese antigenů.

Normální testované tkáně nereagují v experimentech ani s L_aH_c ani s cF19 (tabulka č. 19) .

Normální lidský pankreas se použil jako pozitivní kontrola, která ukazuje, že protilátky L_AH_C a cF19 se vážou na sadu endokrinních buněk v Langerhanových ostrůvcích, jak se uvádí v publikacích v případě F19. Navíc navázání protilátek L_aH_c a cF19 je možné vidět u fibroblastů podpůrné vazivové tkáně ve vzorku zhoubného bujení prsní žlázy.

Imunohistochemická analýza normálních tkání z myši, krysi, králíka a opice cynomolgus v uskutečněných experimentech nedetekovala ani navázání protilátek L_AH_C ani F19.

	64	• 9 9 99 99 9 99 9 9 9 · 9 9 9 9 9999 99 99 9 9 9 9 •>9 9 9«· 9999	99 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99
Tabulka č.	20: Navázání	protilátek	LaHc na sekce	tkání
	nelidského	druhu,	které se stanovilo

imunohistochemickým procesem

orgán/typ tkáně	myš	krysa	králík	cynomolgus
mozek -mozková kůra	__
-malý mozek	-	-	-	-
j átra -hepatocyty	—	—.
-portální triáda	-	-	-	-
plíce -průdušky
-alveolus	-	-	-	-
ledviny -glomeruli	—
-tubulární epitel	-	-	-	-
žaludek -glandulární epitel	—
-hladké svalstvo	-	-	-	-
pankreas -exokrinní lalůčky	—	—
-endokrinní ostrůvky	-	-	-	-
střevo -glandurální epitel	—	—
-hladké svaly	-	-	-	-
brzlík -lymfocyty	-	-	-	-
kůže -keratinocyty	—	—
-potní žlázy	-	-	-	-
-vlasový folikul	-	-	-	-
kosterní svaly	-	-	-	-
srdce	-	-	-	-

·· ·· ·· β · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · ♦ «··· ·« *· • · ···· • ·

slezina -lymfocyty	-	-	-	-
vaj ečníky -folikulární epitel				_
-podpůrná vazivová tkáň	-	-	-	-
děloha -myometrium	-	-		—
-děložní čípek	-	-	-	-
varle tubulární epitel	nt	nt	nt	-
pojivová tkáň	-	-		-

nt znamená netestovalo se

Příklad 10: Konstrukce buněčných linií, které produkují chimerové anti-FAP monoklonální protilátky a anti-FAP monoklonální protilátky s upraveným tvarem

Vynález demonstruje stabilní buněčnou linii podle vynálezu, které exprimují v buňkách CHO DG44 protilátky L_AH_C, L_AH_A, L_bH_b, L_bH_d, L_bH_d a cF19. Vznikly stabilní buněčné linie transfekované humanizovanými nebo chimerovými protilátkami F19 a jejich identita se potvrdila PCR amplifikací variabilních oblastí těžkého řetězce za použití genomové DNA získané z každého transfektantu, který se použil jako templát.

Buňky CHO DG44 se udržovaly při podmínkách bez séra v kultivačním médiu SFM-II. Kultivační médium bez lipofektinu a SFM-II se získalo od firmy Gibco/BRL. Geneticin a všechny restrikční enzymy se získaly od firmy Boehringer Mannheim. Polymeráza Pfu se získala od firmy Stratagene.

DNA vhodná pro transfekce se čistila z buněk mikroorganizmu E. coli za použití sady „QiaFilter Maxi

Cartridges od firmy Qaigen podle doporučení výrobce. Všechny připravené DNA se testovaly štěpením restrikčními enzymy.

• 9

Sekvence variabilních oblastí L_AH_C v jejich vektoru se potvrdily za použití sekvenátoru ABI PRISM 310 (Perkin-Elmer).

Další informace o použitých vektorech a sekvencích DNA jsou dostupné v dalších příkladech.

Transfekce buněk CHO DG44

Buňky ve v logaritmické fázi růstu se nanesly na plotny s 6 prohlubněmi, které obsahují 1 ml čerstvého kultivačního média SFM-II. Plazmidy kódující těžké a lehké řetězce humanizovaných a chimérových verzí F19 se ko-transfekovaly do buněk CHO DG44 za použití liposomální transfekce. Liposomy se připravily za použití 6 μί činidla lipofektin a 0,5 pg každého vektoru (jeden vektor je vhodný pro požadovaný těžký řetězec a druhý pro lehký řetězec), jak se popisuje v případě lipofektaminové transfekce s výjimkou, že kultivační médium SFM-II se použilo při ředění všech činidel. O 24 hodin později se buňky zředily v poměru 1:10 v kultivačním médiu SFM-II, které obsahuje 300 pg/ml geneticinu. Po počáteční fázi (10 až 14 dní) skončilo odumírání buněk a koncentrace geneticinu se snížila na koncentraci 200 mg/ml a přidal se methotrexát tak, aby konečná koncentrace byla 5 nM. Koncentrace methotrexátu se zvýšila po 10-14 dnech na konečnou koncentraci 20 nM.

Amplifikace DNA vhodné pro transfekci pomocí PCR

10⁷ buněk CHO DG44 se centrif ugovalo při plné rychlosti krátce v mikrozkumavkách Eppendorf vhodných pro centrifugaci, promylo se jednou v PBS a centrifugace se provedla ještě jednou. Genomová DNA se připravila srážením etanolem po lyži pomocí SDS a buněčný pelet se ošetřil proteinázou K.

Směs obsahující jeden z následujících párů primerů, dNTP, pufr a polymerázu Pfu se použila pro amplifikaci variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce za použití genomové DNA jako templátu. Výsledné produkty PCR se štěpily vhodným restrikčním • · · · · enzymem a analyzovaly se elektroforézou na agarózovém gelu, aby se potvrdila jejich shoda.

Sada primerů pro lehký řetězec:

5'-GAG ACA TTG TGA CCC AAT CTC C-3 5'-GAC AGT CAT AAA CTG CCA CAT CTT

PKN 1690

C-3' PKN.1930.R

Sada primerů pro těžký řetězec:

5'-TTG ACA CGC GTC TCG GGAAGC TT-3' PG 5863

5'-GGC GCA GAG GAT CCA CTC ACC T-3' PG 6332.R

Neštěpený produkt PCR amplifikace těžkého řetězce má předpovězenou velikost 469 bp, zatímco produkt PCR amplifikace lehkého řetězce má předpovězenou velikost 286 bp. Ověření identity se provedlo štěpením restrikčním enzymem BstEII (těžký řetězec) nebo NlalV (lehký řetězec).

Buněčná linie CHO se transfekovala DNA protilátek L_AH_C, L_aH_a, L_bH_b, L_bH_b, L_bH_d a cF19. Získaly se buňky rezistentní na geneticin. Tyto buňky se dále separovaly na základě rezistence na methotrexát. Pomocí amplifikace PCR a štěpením restrikčními enzymy DNA lehkého a těžkého řetězce vznikly očekávané pruhy a potvrdila se shoda tranfektantů L_aH_c, L_aH_a, L_bH_b, L_bH_b, L_bH_d.

Popsané buňky se udržují v podmínkách bez séra a neošetřují se produkty získanými ze zvířat, jako je trypsin.

Vznikly produkční buněčné linie transfekované exprimujícími se protilátkami L_aH_c, L_aH_a, L_bH_b, L_bH_b, L_bH_d a cF19. Jejich shoda se potvrdila za použití amplifikace PCR a štěpení restrikčními enzymy výsledného produktu PCR jejich variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce.

Příklad 11: Exprese protilátkových proteinů v buňkách DG44 vaječníků čínských křečků a jejich čištění • · · • · φ • · φ • · · » · ·

Tento experiment se provedl proto, aby se exprimovaly a čistily monoklonální protilátky L_AH_C, L_AH_A, L_BH_B, L_BH_B, L_BH_D a provedla se jejich charakterizace. Jiné úkoly zahrnovaly provedení testu kvantitativní ELISA, aby se stanovily koncentrace protilátek ve vzorcích surového kultivačního média stejně jako ve vzorcích čistého Ig a dále se stanovila relativní exprese různých humanizovaných konstrukcí F19 za použití uvedeného testu.

Buňky CHO DG44 bez séra a metatroxát splňující stupeň čistoty USP se získal od firmy Biotechnical Production Unit, Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach, Germany. Oba produkty jsou běžně dostupné. Buňky se udržovaly po celou dobu v podmínkách nepřítomnosti séra. Kultivační médium SFM-II bez séra se získalo od firmy Gibco/BRL. Protein A agaróza se získala od firmy Pierce Chemical (Indianapolis, lidských protilátek IgGl (katal.

nitrofenylfosfátové tablety (A 2640), bovinní sérový albumin (BSA) (A7906) a kozí anti-lidské protilátky specifické pro řetězec kappa konjugované s alkalickou fosfatázou (A 3813) se získaly od firmy Sigma Chemical (St protilátky specifické s alkalickou fosfatázou

Jackson Immunoresearch Laboratories Fyziologický roztok pufrovaný Tris (TBS) obsahoval 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH7,5.

IN,

č.

USA). Standardy I 3889), p— anti-lidské konj ugované

Louis, MO, USA) pro řetězec se získaly od

Kozí kappa f i rmy (Stratech Scientific)

Podmínky kultivace buněk vhodné pro expresi protilátek

Buňky se kultivovaly a udržovaly v lahvích T-175 v kultivačním médiu SFM-II bez séra, aniž se míchaly.

Kultivační médium obsahuje geneticin v koncentraci 200 μ9/ω1 a nM methotrexát bez antibiotik. Buňky se pasážovaly ředěním, nepřisedávaji a rostou v malých shlucích. Když buňky dosáhly stacionární fáze růstu, kultivační médium se shromáždilo a centrifugovalo se, aby se odstranily buňky, a udržovalo se zmražené při teplotě -20 °C.

stejným obejmem TBS s proteinem A při

Čištění protilátek L_AH_C

Všechny kroky čištění se provedly při teplotě 4 °C. Kolona C10/10 (Pharmacia Fine Chemicals) se naplnila protein A agarózou (objem 3 ml) . Kolona se promyla s TBS a předem se eluovala 0,1 M citrátem sodným pH 3,0, aby se zajistilo, že volně vázaný materiál zůstane v koloně. Kolona se ihned uvedla do rovnováhy pomocí TBS a uložila se při teplotě 4 °C.

Supernatanty kultur se rozmrazily a centrifugovaly při 10 OOOxg po dobu 30 minut a pak se nanesly na chromatograf ickou kolonu s proteinem A, aby se odstranily zbytky a naředily se Tento materiál se nanesl na kolonu koncentraci 0,5 ml/min za použití peristaltického čerpadla P-l (Pharmacia) a promývala se TBS až do okamžiku, kdy absorbance při vlnové délce 280 nm nebyla detekovatelná. Eluce protilátek se odstartovala 0,1 M citrátem sodným pH 3,0 při přibližné rychlosti 0,2 ml/min. Eluce se monitorovala při vlnové délce 280 nm a jeden mililitr frakcí eluovaného materiálu se shromáždil do zkumavek, které obsahují dostatek Tris báze pH9, aby se neutralizoval citrátový pufr. Frakce obsahující protein se slily a zakoncentrovaly se za použití filtračního zařízení Amicon s filtrem YM-30 a dialyzovaly se pomocí PBS. Kolona se bezprostředně regenerovala pomocí TBS. Test vázající proteinová barviva se provedl za použití sady pro stanovení proteinu BioRad (Hercules, California), podle instrukcí výrobce za použití bovinního sérového albuminu, jako standardu.

Test ELISA s lidským IgG (gammaimunoglobulin)

Destičky vhodné pro test ELISA se potáhly přes noc 100 μΐ konjugátu kozích anti-lidských protilátek specifických pro gama-řetězec s alkalickou fosfatázou při koncentraci 0,4 mg/ml

v potahovacím pufru při teplotě 4 °C. Potahovací protilátky se odstranily a destičky se blokovaly 2 % BSA v PBS po dobu 2 hodin. Všechny následné kroky proběhly při teplotě 37 °C. Blokační pufr se nahradil vzorky protilátek nebo lidským standardem IgGl ředěným v sériovém ředění v ředícím pufru o objemu 200 ml. Vše se inkubovalo po dobu 1 hodiny. Negativní kontroly zahrnovaly ředící pufr a/nebo kultivační médium netransfekovaných buněk. Prohlubně se promyly a přidalo se 100 μΐ kozích anti-lidských protilátek specifických pro řetězec kappa konjugovaných s alkalickou fosfatázou ředěných v poměru 1: 5 000. Vše se inkubovalo po dobu 1 hodiny. Prohlubně se promyly a přidalo se 100 μΐ reakčního pufru a vše se inkubovalo po dobu 30 minut. Reakce se zastavila přidáním 1 M NaOH a absorbance se odečítala při vlnové délce 405 nm na čtecím zařízení určeném pro destičky vhodné pro test ELISA. Výsledky se analyzovaly iterační křivkou, která vyhovuje čtyřem parametrům.

Analýza aminokyselin se provedla způsoby popsanými v dosavadním stavu techniky.

Produkovaly se monoklonální protilátky L_AH_C a čistily se až do dosažení homogenity za použití protein A afinitní chromatografie. Testy ELISA, kde se používají lidské IgGl, jako standardy, prokázaly 70 % výtěžek protilátek L_AH_C. Pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu se odhadlo, že čistota materiálu je vyšší než 90 %. Reprezentativní data exprese a typický výtěžek čištění je zobrazen v tabulce č. 21.

Tabulka č. 21: Expresívní data a výtěžek čištění protilátkových proteinů FAP v buňkách CHO

protilátky

síla exprese ve vzorcích surového média

výtěžek čištěných protilátek

zlepšení výtěžku (čištěné

• · • · · · ·

	(ELISA)		protilátky)
lahc	7-10 mg/1	« 5-7 mg/1	500-700
laha	5-7 mg/1	w 3-4 mg/1	300-400
lbhb	0,5-1 mg/1	« 0,2-0,5 mg/1	20-50
lbhb	0,8-1,5 mg/1	« 0,3-0,8 mg/1	30-60
chimér. F19	« 0,02 mg/1	< 0,01 mg/1	1

Reprezentativní data exprese pro každou z anti-FAP protilátek, které vznikly při této studii. Výtěžek po afinitní chromatografií s proteinem A je založen na měření navázání proteinového barviva čištěného Ig za použití BSA, jako standardu.

Příklad 12: Navázání monoklonálních protilátek L_AH_C izolované rekombinantní lidské FAP

Předmět studie je charakterizace navázání L_AH_C izolovaný lidský FAP.

na na

ELISA CD8-FAP

Destičky ELISA se potáhly přes noc 100 μΐ myších antikrysích protilátek (Sigma Chemical R0761) při ředění 1:2 000 v potahovacím pufru při teplotě 4 °C. Potahovací protilátky se odstranily a destičky se blokovaly 2% BSA v PBS po dobu jedné hodiny. Všechny následné kroky se provedly při teplotě místnosti. Blokační pufr se nahradil 100 ml krysích anti-CD8 protilátek v koncentraci 1 μς/ιηΐ (Pharmingen 01041D) a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny. Destičky se promyly a přidalo se 100 μΐ supernatantu kultury CD8-FAP (popisuje se v příkladu 14) (ředěno v poměru 1:2 v PBS), nechaly se vázat po dobu jedné hodiny. Destičky se promyly a přidalo se 100 μΐ vzorků protilátek (ve dvounásobném ředění) a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny. Negativní kontroly zahrnují lidské IgG a/nebo kultivační médium netransfekovaných buněk. Prohlubně se promyly a přidalo se 100 μΐ myších anti-lidských IgGl

9 9 9 · konjugovaných s křenovou peroxidázou (HRP) (Zymed 05-3320) ředěnou v ředícím pufru v poměru 1:500 a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny. Prohlubně se promyly a přidalo se 100 μΐ substrátu HRP ( (azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina, Sigma Chemical A9941) a směs se inkubovala po dobu 60 minut. Reakce se zastavila přidáním 1M NaOH a absorbance se odečítala při vlnové délce 405/490 nm na čtecím zařízení vhodném pro destičky ELISA. Výsledky se analyzovaly pomocí iterační křivky se čtyřmi parametry.

V jiném případě se destičky potáhly přímo cF19. FAP (rekombinantní lidský FAP, popisuje se v příkladu 13) se nechal navázat na tyto destičky , jak se popisuje shora v textu, a přidaly se biotinem značené protilátky L_AH_C (v koncentraci přibližně 1 pg/ml). Navázání protilátek se detekovalo konjugátem HRP-streptavidin, jak se popisuje shora v textu.

Rozpustnost lidského FAP vázaného na membránu

Buňky 293FAP 1/2 exprimující FAP nebo kontrolní buňky 293 se promyly PBS a lyžovaly se 1 % Tritonem X-114 ve fyziologickém rozotoku pufrovaném Tris. Jádra a zbytky buněk se separovaly centrifugaci při 10 000 x g. Supernatant fázově segregoval (popisuje se v publikaci Estreicher A, Wohlend A, Bělin D, Scheuning WD, Vasalli JD. Characterization of the cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activator. (1989) J. Biol. Chem 264:1180-1189), aby se získaly membránové proteiny. Sebrala se detergenová fáze a naředila se v pufru, který obsahuje 1% přípravku empigen BB (Calbiochem), aby se zabránilo opětné agregaci triton X-114. Tento materiál prošel chromatografií na agarózovém gelu s konkanavalinem A (popisuje se v publikaci Rettig WJ, Garin-Chesa P., Healey JH, Su SL, Ožer HL, Schwab, M, Albino AP, Old LJ. Regulation and heteromeric structure of the fibroblast activation protein in • fe

• fefe • · · normál and transformed cells of mesenchymal and neuroectodermal origin. (1993) Cancer Res. 53: 3327-3335).

Značení protilátek L_AH_C biotinem

Protilátky L_AH_C (1-2 mg) se dialyzovaly proti 50 mM hydrogenuhličitanovému pufru a značily se biotinemv přítomnosti desetinásobného molárního přebytku sulfosukcinimidyl-6-biotinamidohexanoátu (NHS-LC biotin, Pierce Chemical, Rockford, Illinois, USA) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Nezreagovaný produkt se odstranil opakovanou mirkodialýzou v zařízení mikrokoncentrátor.

Dočasná transfekce

Buňky COS-7 (American Type Tissue Culture Collection, referenční číslo CRL 1651) se kotransfekovaly elektroporací vektory těžkého a lehkého řetězce, které kódují L_AH_C.

Anti-CD8 monoklonální protilátky se imobílizovaly na mikrotitračních destičkách. CD8-FAP z kultivačního média hmyzích buněk infikovaných bakuloviry CD8-FAP se nechaly navázat na tyto destičky. Použité kultivační médium z kultury buněk COS-7 dočasně transfekované dvěma separovanými vektory, které kódují protilátky L_AH_C, se sériově ředilo a přidalo se do prohlubní, které obsahují imobilizovaný CD8-FAP. Protilátky L_aH_c se vázaly na imobilizovaný protein CD8-FAP (obrázek č. 35). Supernatanty kultur z buněk COS-7 slepě transfekovaných nevykazují navázání.

Rekombinantní na membráně vázaný FAP z detergentových extraktů buněk 293FAP 1/2 nebo kontrolní extrakty se sériově ředily a imobilizovaly prostřednictvím monoklonálních protilátek F19 vázaných na mikrotitračních destičkách. Biotinem značené protilátky L_AH_C se váží na rekombinantní lidský FAP imobilizovaný s cF19 (obrázek č. 36) způsobem závislým na koncentraci.

• 4 4 4 4

Protilátky L_AH_C rozeznávají izolovaný imobilizovaný rekombinantní lidský FAP, který nese epitop vhodný pro myší

F19. Protilátky L_AH_C se váží na CD8-FAP produkovaný hmyzími buňkami, stejně jako na protřen FAP produkovaný buňkami 293FAP

1/2 .

Tři dni po transfekci se shromáždily supernatanty kultury z buněk COS7 transfekovaných vektory těžkého nebo lehkého řetězce, které kódují protilátky L_AH_C nebo bez DNA (kontrola). CD8-FAP se imobilizovaly prostřednictvím anti-CD8 protilátek, jak se popisuje v textu. Sériová ředění supernatantů buněk COS7 se enchaly vázat na imobilizovaný CD8-FAP a následně se detekovaly antilidskými protilátkami IgGl protilátkami konjugovanými s HRP.

Detergentové extrakty buněk 293FAP 1/2 exprimující FAP nebo kontrolních buněk 293 se sériově naředily a přidaly se na mikrotitrační destičky potažené cF19. Přidaly se protilátky L_AH_C značené biotinem a navázání biotinem značených protilátek L_aH_c se detekovalo streptavidinem konjugovaným s HRP.

Příklad 13: Charakterizace buněk fibrosarkomu HT-1080 a lidských embryonálních ledvinových buněk 293 transfekovaných cDNA lidského FAP.

Fibroblastový aktivační protein (FAP) je buněčný povrchový protein vázaný na membráně, který nese epitop F19 a exprimuje se na povrchu fibroblastů podpůrné vazovové tkáně nádoru. Za účelem charakterizace anti-FAP monoklonálních protilátek se vytvořily buněčné linie exprimující rekombinatní protein FAP a odpovídající kontroly, které nevykazují FAP.

Používané buňky HT-1080 (referenční číslo CCL 121) a lidské embryonální ledvinové buňky 293 (referenční číslo CRL 1573) se získaly z instituce American Type Culture Collection (Maryland, USA). Transfektam se získal od firmy Promega • · · · · · • · · · 1 · • · · · · (Madison, WI). Geneticin a restrikční enzymy se získaly od firmy Boehringer Mannheim. DNA vhodná pro transfekci se čistila z buněk E. coli za použití QiaFilter Maxi Cartridges (Qiagen) podle doporučení výrobce. Všechny připravené DNA se testovaly štěpením restrikčními enzymy. Vektorové sekvence se potvrdily za použití sekvenátoru ABI PRISM 310.

Další informace o použitých vektorech a sekvencích DNA se popisují v publikaci Scanlan MJ, Raj BK, Calvo B, Garin-Chesa P, Sanz-Moncasi MP, Healey JH, Old LJ, Rettig WJ, Molecular cloning of fibroblast activation protein alpha, a member of the serine protease family selectively expressed in stromal fibroblasts of epithelial cancers. (1992) Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 89: 10832-10836. Sekvence v GenBank (číslo uložení HS09287).

cDNA FAP se uložila

Buněčná kultura a imunologické testy

Buňky HT-1080 se transfekovaly přípravku transfektam mg DNA za použití doporučení výrobce. Lidské podle embryonální ledvinové buňky 293 se transfekovaly metodou transfekce fosforečnanem vápenatým (popisuje se v publikaci Brann MR, Buckley NJ, Jones SVP, Bonner TI, Expression od cloned muscarinic receptor in A9 L cells. (1987) Mol. Pharmacol 32: 450-455) s 10 mg DNA. 0 24 hodin později se buňky ředily 1:10 čerstvým médiem, které obsahuje 200 mg/ml geneticinu. Izolovaly se kolonie a testovaly se imunofluorescencí za účelem exprese FAP, jak se popisuje v publikaci Rettig WJ, Garin-Chesa P, Bersford HR, Oettgen HF, Melamed MR, Old LJ, Cell-surface glycoproteins of human sarcomas: differential expression in normál and malignant tissues and cultured cells (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114) .

Imunoprecipitace s protilátkou cF19 se uskutečnila s metabolicky značenými buňkami, jak se popisuje v publikaci • 9 « ·

9· ·· • · · « • · · · • · · · * • · · · ·· «·

Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su SL, Ožer HL, Schwab, M, Albino AP, Old LJ. Regulation and heteromeric structure of the fibroblast activation protein in normál and transformed cells of mesenchymal and neuroectodermal origin. (1993) Cancer Res. 53: 3327-3335.

Buňky HT-1080 a 293 se testovaly za účelem zjištění exprese antigenu FAP v imunofluorescenčních testech s protilátkami anti-FAP a zjistilo se, že nevykazují antigen. Transfekce uvedených buněk vektorem FAP.38 vedly k vytvoření kolonií rezistentních na geneticin. Izolované kolonie se testovaly imunofluorescencí za účelem zjištění exprese FAP. Identifikovaly se dva klony buněk. Ty se označily jako HT1080FAP klon 33 a 293FAP 1/2, které exprimují na buněčném povrchu protein FAP, což rozpoznávají protilátky cF19. Barvení nepermeabilizovaných buněk HT-1080FAP klon 33 a 293FAP 1/2 protilátkami cF19 potvrdilo lokalizaci proteinu FAP na buněčném povrchu.

Imunoprecipitace radioaktivně značeného proteinu FAP s protilátkami cF19 z extraktů buněk HT-1080FAP klon 33 nebo 293FAP 1/2 značených ³⁵S-metioninem vedlo po provedení autoradigrafie k objevení pruhu o molekulové hmotnosti 93 000. Tento pruh se nedetekoval imunosraženinami extraktů rodičovských buněk HT-1080 nebo 293.

Dvě stabilně transfekované buněčné linie HT-1080FAP klon 33 a 293FAP 1/2 exprimují FAP na povrchu buněk, jak se stanovilo imunologickými testy anti-FAP monoklonálními protilátkami. Ani rodičovské buňky HT-1080 ani rodičovské buňky 293 neexprimují detekovatelné množství FAP.

Příklad 14: Vytvoření a charakterizace fúzního proteinu CD8FAP • · • ·

Rozpustná forma lidského FAP (fibroblastový aktivační protein) ve formě fúzního proteinu FAP se produkovala v hmyzích buňkách za účelem charakterizace protilátek L_aH_c, které obsahují vazebné místo pro anti-FAP monoklonální protilátky. Vybraly se myší protilátky CD8, aby umožnily vylučování proteinu a poskytly další epitop tag.

cDNA kódující extrabuněčnou doménu CD8, která obsahuje prvních 189 aminokyselin myších CD8a (Genbank M12825) se spojila s cDNA extrabuněčné domény FAP (aminokyseliny 27 až 760), v podstatě jak se popisuje v publikaci Lané P., Brocker T, Hubele S, Padovan E, Lazavecchia A, McConnell. Soluble CD40 ligand can replace the normál T cell-derived CD40 ligand signál to B cells in T cell-dependent activation (1993) J. Exp. Med. 177: 1209-1213) za použití standardního protokolu PCR. Autentičnost všech klonů se ověřila sekvenováním DNA. Výsledná DNA se začlenila do vektoru pVL1393 (Invitrogen) a provedla se transfekce buněk Sf9 (Invitrogen) s tímto vektorem a amplifikace výsledného rekombinantního bakuloviru způsobem, který se popisuje v publikaci Baculovirus Expression Vecotres. A Laboratory Manual. 0'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, (Eds.), Oxford University Press: New York, 1994). Použité kultivační médium buněk High Five™ (Invitrogen) infikovaných rekombinantním bakulovirem CD8-FAP po dobu čtyř dní se sebralo a čistilo ultracentrifugací.

Test ELISA CD8-FAP se popisuje shora v textu v příkladu .

Kultury hmyzích buněk infikovaných virem CD8-FAP vylučovaly fúzní protein do kultivačního média. Tento fúzní protein nese epitop F19 a je rozeznáván anti-FAP protilátkami (obrázek č. 1). Ani samotné buněčné kultivační médium ani médium z hmyzích buněk infikovaných fúzním proteinem CD8-CD40L neváže anti-FAP protilátky.

Rozpustný protein CD8-FAP nesoucí epitop F19 se vylučoval do kultivačního média kultur infikovaných hmyzích buněk.

Supernatant kultur z buněk infikovaných kontrolní konstrukcí neobsahuje antigen nesoucí epitop F19.

Rozpustná forma FAP, CD8-FAP se produkovala ve hmyzích buňkách a ukázalo se, že CD8-FAP nese epitop rozeznávaný cF19.

Čtyři dni po infekci se shromáždily supernatanty získané z hmyzích buněk infikované rekombinantním bakulovirem, který kóduje buď fúzní protein CD8-FAP nebo CD8-CD40L. Buněčné kultivační médium bez buněk se použilo jako další kontrola (médium). Sériové ředění těchto materiálů se přidalo do mikrotítračních destiček potažených anti-CD8 protilátkami a nechaly se navázat. Následně se přidaly protilátky cF19 (1 mg/ml) a nechaly se navázat. Navázané protilátky cF19 se detekovaly anti-lidskými protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protilátkový protein, který má komplementárně determinační oblasti monoklonálních protilátek F19 (ATCC číslo uložení HB 8269), přičemž uvedený protilátkový protein se specificky váže na fibroblastový aktivační protein, charakterizovaný tím, že vykazuje modifikace základní struktury, které vedou ke zlepšení produkce v hostitelských buňkách, ve srovnání s chimerovými protilátkami, které mají variabilní oblasti F19 a cizorodé konstantní oblasti.
2. 2. Protilátkový protein charakterizovaný tím, že vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce a těžkého řetězce podle nároku 1, přičemž každá oblast je připojena k lidské konstantní oblasti.
3. 3. Protilátkový protein podle nároku 2, kde uvedená lidská konstantní oblast lehkého řetězce je lidská konstantní oblast kappa.
4. 4. Protilátkový protein podle nároku 2, kde uvedená lidská konstantní oblast těžkého řetězce je lidská konstantní oblast gamma-1.
5. 5. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 4 charakterizovaný tím, že síla exprese ve vzorcích surového média, jak se stanovilo testem ELISA, a/nebo výtěžek čištěných protilátek převyšuje sílu exprese a/nebo výtěžek čištěni chimerových protilátek bez úprav základní strukutry alespoň o faktor 10.
6. 6. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 4 charakterizovaný tím, že síla exprese ve vzorcích surového média, jak se stanoví testem ELISA, a/nebo výtěžek čištěných protilátek převyšuje výtěžek čištění chimerových protilátek bez úprav základní strukutry alespoň o faktor 20.

   • · ·
7. 7. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 4 charakterizovaný tím, že jeho síla exprese ve vzorcích surového média, jak se stanoví testem ELISA, a/nebo výtěžek čištěných protilátek převyšuje výtěžek čištění chimérových

   152 »«··

   protilátek bez úprav základní struktury alespoň o faktor 100. 8. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 7 charakterizovaný tím, že v eukaryontních buňkách vykazuj e zlepšenou produkci. 9. Protilátkový protein podle nároku 8, kde uvedená

   eukaryontní buňka je buňka vaječníků čínského křečka (buňka CHO) .

   10. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 9, kde aminokyselina v poloze 87 podle Kabata oblasti lehkého řetězce není asparagin.

   11. Protilátkový protein podle nároku 10, kde aminokyselina v poloze 87 podle Kabata oblasti lehkého řetězce se vybrala z aromatických nebo alifatických aminokyselin.

   12. Protilátkový protein podle nároku 11, kde uvedená aromatická aminokyselina v poloze 87 podle Kabata oblasti lehkého řetězce je tyrosin nebo fenylalanin.

   13. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 12, kde aminokyselina v poloze 36 podle Kabata oblasti lehkého řetězce se vybral z aromatických aminokyselin.

   14. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 13, který obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce, jak se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 2.

   15. Protilátkový protein podle nároku 14 charakterizovaný tím, že variabilní oblast lehkých řetězců je kódována nukleotidovou sekvencí, jak se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 1.·

   16. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 13, který obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce, jak se uvádí v SEQ I NO: 6.

   153

   17. Protilátkový protein podle nároku 16 charakterizovaný tím, že variabilní oblast lehkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí, jak se uvádí v sekvenci SEQ ID NO:

   5.

   18. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 17, který obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce, jak se uvádí v libovolné ze sekvencí SEQ ID NO:
8. 8, 10, 12, 14.

   19. Protilátkový protein podle nároku 18 charakterizovaný tím, že variabilní oblast těžkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí, jak se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13.

   20. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 14, který obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce, jak se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 2, a variabilní oblast těžkého řetězce, jak se uvádí v SEQ ID NO: 12.

   21. Protilátkový protein podle nároku 20 charakterizovaný tím, že variabilní oblast lehkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1 a variabilní oblast těžkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 11.

   22. Protilátkový protein podle nároku 20 nebo 21, který obsahuje konstantní oblast lehkého řetězce uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 20 a konstantní oblast těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 22.

   23. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 13, 18 nebo 19, který obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 a variabilní oblast těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 8.

   24. Protilátkový protein podle nároku 23 charakterizovaný tím, že variabilní oblast lehkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí, která se uvádí v SEQ ID NO: 1 a variabilní oblast těžkého řetězce je kódována nukleotidovou sekvencí, jak se uvádí v SEQ ID NO: 7.

   154 • · ·· 9

   25. Nukleotidová sekvence kódující protiltákový protein podle libovolného z nároků 1 až 24.

   26. Rekombinanntí vektor DNA, který obsahuje nukleotidovou sekvenci podle nároku 25.

   27. Rekombinantní vektor DNA podle nároku 26, kterým je expresívní vektor.

   Hostitelská buňka nesoucí vektor podle nároků 26 nebo 27.

   29. Hostitelská buňka podle nároku 28, kterou je eukaryontní buňka.

   30. Hostitelská buňka podle nároku 29, kterou je savčí buňka.

   31. Hostitelská buňka podle nároku 30, kterou je buňka CHO nebo COS.

   32. Způsob produkce protilátkových proteinů podle libovolného z nároků 1 až 24, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

   a) kultivaci hostitelské buňky podle libovolného z nároků 28 až 31 za podmínek, kdy uvedený protilátkový protein je exprimován uvedenou hostitelskou buňkou a

   b) izolaci uvedeného protilátkového proteinu.

   33. Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že uvedená hostitelská buňka je savčí buňka, přičemž se upřednostňuje buňka CHO nebo COS.

   34. Způsob podle nároku 32 nebo 33, vyznačuj ící ž e uvedená hostitelská buňka je kodvěma plazmidy, které nesou expresívní jednotky lehkého respektive těžkého řetězce.

   35. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 24, který je konjugován s terapeutickým činidlem.

   36. Protilátkový protein podle nároku 35, kde uvedené terapeutické činidlo se vybralo ze skupiny zahrnující radioizotopy, toxiny, toxoidy, zánětlivá činidla a chemoterapeutická činidla.

   37. Protilátkový protein podle nároku 36, kde uvedený izotop je radioizotop emitující beta záření.

   se tím, transfekována

   38. Protilátkový protein podle nároku 37, kde uvedený

   155 ·· ·* • · · 1 • « · 1 • · 11 1 • 1 · «

   19 1 · radioizotop se vybral ze skupiny zahrnující

   186 rhenium, ¹³¹ jód a ⁹⁰ytrium.

   39. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 24 značkou je charakterizovaný tím, že je značen.

   40. Protilátkový protein podle nároku 39, kde detekovatelný markér.

   41. Protilátkový protein podle nároku 40, kde detekovatelný markér se vybral ze skupiny zahrnující enzymy, barviva, radioizotopy, digoxygenin a biotin.

   42. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 24 konjugovaný se zobrazitelným činidlem.

   43. Protilátkový protein podle nároku 42, kde zobrazitelným činidlem je radioizotop.

   44. Protilátkový protein podle nároku 43, radioizotop emituje gama záření.

   45. Protilátkový protein podle nároku 44, kde uvedený kde uvedeným

   125radioizotopem je 46. Farmaceutický se tím, že prostředek, vyznačuj ící obsahuje protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 24 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   47. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje protilátkový protein podle libovolného z nároků 35 až 38 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   48. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje protilátkový protein podle libovolného z nároků 42 až 45 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   49. Farmaceutický prostředek podle nároků 46 až 48, vyznačující se tím, že je vhodný pro použití při léčbě a zobrazení nádorů, kde uvedené nádory jsou spojené s aktivovanými fibroblasty podpůrné vazivové

   156 • 9 «· 9« • * · 9 9 9
9. 9 9 9 C 9

   9 · · 9 9 9

   9 9 9 9 9

   9 999 9 9· 99 tkáně, přičemž se preferuje, aby se uvedené nádory vybraly ze skupiny zhoubného bujení, která zahrnuje kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom mléčné žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné bujení mozku.

   50. Použití protilátkového proteinu podle libovolného z nároků 1 až 24 při léčbě zhoubného bujení.

   51. Použití protilátkového proteinu podle libovolného z nároků 35 až 38 při léčbě zhoubného bujení.

   52. Použití protilátkového proteinu podle libovolného z nároků 42 až 45 při zobrazení aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně.

   53. Použití protilátkového proteinu podle libovolného z nároků 39 až 41 při detekci přítomnosti aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně ve vzorku.

   54. Způsob léčby nádorů, vyznačuj ící se tím, že nádor je spojován s aktivovanými fibroblasty podpůrné vazivové tkáně schopnými specificky tvořit komplex s protilátkovými proteiny podle libovolného z nároků 1 až 24 nebo 35 až 38, přičemž způsob zahrnuje kontakt nádoru s množstvím uvedených protilátkových proteinů, které jsou účinné při léčbě nádoru.

   55. Způsob podle nároku 54, vyznačuj ící se tím, že nádor obsahuje buňky zhoubného bujení, které se vybraly ze skupiny zhoubného bujení, jenž zahrnuje zahrnuje kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom mléčné žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné bujení mozku.

   56. Způsob podle nároku 54, vyznačuj ící se tím, že kontakt se provede in vitro.

   • · · • · · • · · • · · · ·

   157

   57. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že kontakt se provede in vivo.

   58. Způsob detekce přítomnosti aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně při hojení ran, zánětu nebo zhoubném bujení, vyznačující se tím, že

   a) vzorek, který pravděpodobně obsahuje aktivované fibroblasty podpůrné vazivové tkáně, je v kontaktu s protilátkovým proteinem podle libovolného z nároků 1 až 24 nebo 39 až 41 za podmínek vhodných pro vytvoření komplexu mezi uvedenou protilátkou a antigenem,

   b) detekci přítomnosti uvedeného komplexu, čímž se detekuje přítomnost aktivovaných fibroblastů v podpůrné vazivové tkáni při hojení ran, zánětu nebo nádoru.

   59. Způsob podle nároku 58, v y z n a č u jící se ti m, že nádor obsahuje buňky zhoubného buj ení vybrané ze skupiny zahrnující kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom mléčné žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné buj ení mozku. 60. Způsob ] podle nároku 58 nebo 59 h vyznaču jící se ti m, že protilátkový protein je protein podle

   libovolného z nároků 39 až 41.

   61. Způsob zobrazení přítomnosti aktivovaných fibroblastů podpůrné vazivové tkáně při hojení ran, zánětlivé kůže nebo nádoru u lidského pacienta, vyznačuj ící se tím, že

   a) protilátkový protein podle libovolného z nároků 1 až 24 konjugovaný se zobrazitelným činidlem se aplikuje lidskému pacientovi za podmínek vhodných pro vytvoření komplexu protilátka-antigen,

   b) zobrazení libovolného komplexu vytvořeného tímto způsobem.

   • ·

   62. Způsob podle nároku 61 vyznačuj ící

   158 •·· ··· se tím, že nádor obsahuje buňky zhoubného bujení vybrané ze skupiny zahrnující kolorektální karcinom, karcinom odlišný od karcinomu z malých plicních buněk, karcinom mléčné žlázy, zhoubné bujení hlavy a krku, karcinom vaječníků, karcinom plic, karcinom močového měchýře, karcinom pankreasu a metastázující zhoubné bujení mozku.

   63. .Způsob detekující podpůrnou vazivovou tkáň nádoru, vyznačující se tím, že

   a) vhodný vzorek je v kontaktu s protilátkovým proteinem podle libovolného z nároků 1 až 24 za podmínek vhodných pro vytvoření komplexu protilátka-antigen,

   b) detekuje přítomnost libovolného takto vytvořeného komplexu,

   c) spojuje přítomnost uvedeného komplexu s přítomností vazivové podpůrné tkáně nádoru.

   64. Způsob podle nároku 62, vyznačující se tím, že uvedené protilátky se značí detekovatelným markérem.

   65. Způsob zobrazení vazivové podpůrné tkáně nádoru u lidského pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje

   a) aplikaci pacientovi protilátkového proteinu podle libovolného z nároků 42 až 45 za podmínek vhodných pro vytvoření komplexu protilátka-antigen,

   b) zobrazení libovolného takto vytvořeného komplexu, čímž se zobrazí u lidského pacienta přítomnost podpůrné vazivové tkáně.

   66. Protilátkový protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.

   67. Protilátkový protein podle nároku 66, který dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 12.

   68. Protilátkový protein podle nároku 66 nebo 67, který dále obsahuje aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO: 22.

   159 • ·

   69. Kódová molekula DNA pro bílkovinnou protilátku podle některého z nároků 66 až 68.

   70. Hostitelská buňka, obsahující uloženou

   DNA podle nároku 69.

   71. Způsob produkce protilátkového proteinu podle libovolného z nároků 66 až 68, vyznačující se tím, že zahrnuj e

   a) kultivaci hostitelské buňky podle nároku 70 za podmínek, kdy se uvedený protilátkový protein exprimuje v uvedené hostitelské buňce a

   b) izolaci uvedeného proteinu.

   72. Protilátkový protein podle libovolného z nároků 66 až 68, který se spojuje s radioizotopem, přičemž se upřednostňuje ¹³¹I, 125_Iř 186_Re, 188_{Re nebQ} 90_y.

   73. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje protilátkový protein podle libovolného z nároků 66 až 68 nebo 72 a farmaceuticky přijatelný nosič.