JPH1149701A - 抗癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍血管の新生を抑制することによって間接
的に腫瘍の増殖を阻害するという新しい作用機作に基づ
く癌の化学療法を提供する。 【解決手段】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト及びｂ
ＦＧＦアンタゴニストを有効成分とする抗癌剤。ＶＥＧ
Ｆ／ＶＰＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノ
クローナル抗体、特にＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列
の一部である配列 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ、２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲ
Ｐ、又は、３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲと反応するモ
ノクローナル抗体であることが好ましい。ｂＦＧＦアン
タゴニストは抗ｂＦＧＦ抗体であることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
(vascular endothelial growth factor:血管内皮細胞増
殖因子／vascular permeability factor:血管透過性因
子)アンタゴニスト及びｂＦＧＦ(basic fibroblast gro
wth factor:塩基性線維芽細胞成長因子)アンタゴニスト
を有効成分とする抗癌剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に、癌細胞は正常細胞から悪性転化
した初期の段階では、その増殖は非常にゆっくりしたも
のである。しかし、癌細胞が発生するとそれに向かって
周囲の血管から新たに分岐した新生血管が癌細胞に向か
って遊走することが観察される。そして、ひとたびこの
病変部位に血管が到達すると、癌細胞に無尽蔵な栄養と
酸素が供給され、爆発的に増殖を開始するだけでなく、
その血管を介して遠隔転移なども起こすことになる。こ
のことから血管新生、あるいは血管の構成細胞である血
管内皮細胞の増殖は、腫瘍の進行及び転移と密接な関係
があると言われている。

【０００３】癌細胞は、かかる血管新生及び血管内皮細
胞の増殖を誘起させる癌血管新生因子(Tumor Angiogene
sis Factor)を出しているものと考えられており、かか
る因子として、aFGF、bFGF、EGF 、 PD-ECGF、VEGF/VP
F、 TGF-b、Angiogeninなど多くの物質が報告されてい
る(R. Bicknell and A. L. Harris, Eur. J. Cancer 2
7, 6, 781, 1991)。

【０００４】VEGF/VPFについては、ある種の抗VEGF/VPF
中和抗体を用いることにより、癌細胞の成長及び転移を
抑制できることが報告されている(M. Asano等、CANCER
RESEARCH 55, 5296-5301, November 15, 1995)。同様
に、bFGFについても、抗bFGF中和抗体を用いることによ
り、腫瘍の成長を抑制できることが報告されている(A.H
ori等、CANCER RESEARCH 51, 6180-6184, November 15,
1991)。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】かかる抗体の拮抗作用
を利用した癌の治療方法は、腫瘍そのものを標的とする
現在の一般的な治療方法と異なり、腫瘍血管の新生を抑
制することによって間接的に腫瘍の増殖を阻害するとい
う新しい作用機作に基づくものであり、副作用が極めて
軽微であり、他の薬剤との併用が有効に行える効果的な
癌の化学療法として期待されている。

【０００６】本発明者は、上記癌血管新生因子の相互の
関係については未だ検討されていないことに鑑み、かか
る癌血管新生因子に対する拮抗作用に基づいて更に有効
な癌の治療方法を提供することを目的として、複数の癌
血管新生因子の夫々の作用を夫々の中和抗体で同時に抑
制した系に着目して鋭意研究した結果、本発明を完成す
るに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト及びｂＦＧＦアンタゴニ
ストを有効成分とする抗癌剤に関するものである。本発
明によれば、かかる２種のアンタゴニストを併用するこ
とにより、単独で用いた場合よりも有意に腫瘍の増殖を
抑制できる。

【０００８】ＶＥＧＦ／ＶＰＦは、直接的に血管内皮細
胞に作用し、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増
殖、移動および組織への浸潤という現象を誘発し、胎児
の生長、創傷治癒、癌細胞の増殖などの生理または病理
的現象において重要な作用を果たしている。ＶＥＧＦ／
ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモット、ウシ及びヒト
の正常又は腫瘍細胞株で分泌されており、また組織別で
は脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが明らかにさ
れている[Ferrara, N.等、Endocrine Reviews 13: 18(1
992)]。

【０００９】ヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦ遺伝子についてはそ
のcDNAがすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ
酸配列も推定されている。この遺伝子からアミノ酸残基
数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数１２１個、１
６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作られ、それ
らの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの（ＶＥＧＦ
₁₂₁）と１６５個のアミノ酸残基数のもの（ＶＥＧ
Ｆ₁₆₅）が成熟蛋白であると言われている[Ferrara, N.
等、Endocrine Reviews 13: 18(1992)]。ＶＥＧＦ₁₂₁は
ＶＥＧＦ₁₆₅のカルボキシル末端側の４４個のアミノ酸
が欠失したものであるが、ＶＥＧＦ₁₂₁とＶＥＧＦ₁₆₅の
間に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうか
については明らかにされていない。

【００１０】本発明において、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタ
ゴニストとは、上記のＶＥＧＦ／ＶＰＦの作用を阻害す
る機能を有するものをさし、その機能を有するものであ
れば如何なる形態のものでもよく、最も一般的には、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦに作用する抗体、またはその一部分が挙
げられるが、それらに限定されることなく、例えば、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦの作用を阻害する不活性なＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦ、またはその一部分、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの受容体の
機能を損なう、例えば、血管透過性因子受容体に対する
抗体、またはその一部分、さらには、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
の産生そのものを抑制する薬剤等を挙げることができ
る。

【００１１】ＶＥＧＦ／ＶＰＦに作用する抗体は、アミ
ノ酸残基数１２１個、１６５個、１８９個又は２０６個
の４種類のＶＥＧＦ／ＶＰＦサブタイプの何れに対する
抗体であってもよい。

【００１２】代表的なＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト
としては、抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体が挙
げられ、特に、該抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗
体が、ＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部である下
記配列１〜３：

【００１３】１．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ

【００１４】の少なくとも１つと反応する抗体がである
ことが好ましい。

【００１５】ｂＦＧＦは、大脳や脳下垂体抽出液中に見
いだされるタンパク質で、培養線維芽細胞の他、血管内
皮細胞を含む多くの中胚葉由来の培養細胞の増殖を低濃
度（数ｐｇ〜数ｎｇ／ml）で促進し[Gospodarowicz等、
J. Cell Physiol., Supplement 5, 15-26(1987)]、イン
・ビボにおける作用としては、胚における外胚葉から中
胚葉への分化作用、神経細胞の生存促進や分化作用等が
知られているが、特に血管新生作用が注目されている。

【００１６】本発明において、ｂＦＧＦアンタゴニスト
とは、上記のようなｂＦＧＦの作用、特に血管新生作用
を阻害する機能を有するものをさし、その機能を有する
ものであれば如何なる形態のものでもよく、最も一般的
には、ｂＦＧＦに作用する抗体、またはその一部分が挙
げられるが、それらに限定されることなく、例えば、ｂ
ＦＧＦの作用を阻害する不活性なｂＦＧＦ、またはその
一部分、ｂＦＧＦの受容体の機能を損なう、例えば、ｂ
ＦＧＦ受容体に対する抗体、またはその一部分、さらに
は、ｂＦＧＦの産生そのものを抑制する薬剤等を挙げる
ことができる。

【００１７】代表的なｂＦＧＦアンタゴニストとして
は、抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体を挙げることがで
き、具体的には、特開平３−１０３１８９号公報に記載
された抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体ｂＦＭ−１及びｂ
ＦＭ−２、並びに、A. Hori等、CANCER RESEARCH 51, 6
180-6184, November 15, 1991に記載の抗ｂＦＧＦモノ
クローナル抗体３Ｈ３等が挙げられる。

【００１８】上記の抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体又は抗ｂＦ
ＧＦ抗体としては、マウス抗体等もあげられるが、ヒト
への投与において副作用を軽減するための処理を行った
ものも使用することができる。例えば、マウスモノクロ
ーナル抗体をポリエチレングリコールのような物質で化
学修飾を行い、抗原性を軽減させたもの、また、マウス
モノクローナル抗体の可変領域を残して他の部分をヒト
の抗体に変換させたマウス・ヒトキメラ抗体や、マウス
モノクローナル抗体の抗原との結合領域であるＣＤＲ領
域を残して他の領域をヒト抗体に抗原との結合力を保持
させたまま置き換えたヒト化抗体も使用することができ
る。さらに、これらを酵素的に切断して低分子化した抗
体も使用することができる。該キメラ抗体またはヒト化
抗体としては、ＩｇＧタイプ又はＩｇＡタイプ等があげ
られ、該ＩｇＧのイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、
ＩｇＧ３又はＩｇＧ４があげられる。

【００１９】本発明の抗癌剤を投与する場合、投与する
対象は特に限定されない。例えば、個々の癌種の予防或
いは治療を特異目的として局所投与することができる。
投与する方法は非経口とする。

【００２０】非経口投与には注射例えば皮下、筋肉、血
管内、腹腔内又は胸腔内などへの注射、点滴、座剤等を
含む。又、その投与量および有効成分の割合は動物か人
間かによって、又年齢、投与経路、投与回数により異な
り、広範囲に変えることができる。この場合ＶＥＧＦ／
ＶＰＦアンタゴニスト及びｂＦＧＦアンタゴニストの有
効量と適切な希釈剤および薬学的に使用し得る担体の組
成物として投与される有効量は０.１〜１００mg/kg体重
/日であり１日１回から数回に分けて毎日又は数日に１
回又は１〜２週間に１回投与される。ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
アンタゴニストとｂＦＧＦアンタゴニストは、任意の割
合で併用することができ、両者は混合した状態で、又
は、別々の状態で併用することも可能である。

【００２１】本発明の抗癌剤を非経口投与する場合には
安定剤・緩衝剤・保存剤・膨張化剤等の添加剤を含有し
通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容器又はチュ
ーブの状態で提供される。上記の組成物は使用する際に
適当な担体たとえば発熱物質不含の滅菌された溶解剤で
再溶解させる粉体であっても良い。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好ましい具体例に
ついて、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとして抗ＶＥ
ＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体を用い、且つ、ｂＦＧ
Ｆアンタゴニストとして抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体
を用いて詳細に説明する。

【００２３】モノクローナル抗体の製造 各モノクローナル抗体は動物をＶＥＧＦ／ＶＰＦ又はｂ
ＦＧＦで免疫し、その脾細胞を取り出しこれをミエロー
マ細胞と融合して得たハイブリドーマ細胞を培養するこ
とにより製造することができる。このハイブリドーマの
製造は例えばKohlerとMilsteinの方法[Nature,256:495
(1975)]等により行うことができる。

【００２４】(1)抗体産生細胞の調製 免疫用動物にはマウス、ラット、ウサギ等の齧歯類が用
いられる。ミエローマ細胞としてはマウスまたはラット
由来の細胞が用いられる。そして免疫動物１匹に対して
ＶＥＧＦ／ＶＰＦ１０〜１００μｇの量を抗原として２
〜４週間の間隔で少なくとも計２〜３回の免疫を行う。
動物の飼育及び脾細胞の採取は常法に従って行われる。
尚、免疫の際には抗原に例えばグルタチオン-Ｓ-トラン
スフェラーゼ等を融合させて得られた蛋白質又はキーホ
ールリンペットヘモシアニン等を結合させて得られた複
合蛋白質を抗原として用いることもできる。

【００２５】(2)ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としてはマウスミエローマSp2/O-Ag14(S
p2)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3×63-Ag.8.U・1(P3U1)等
が挙げられる。これらの細胞の継代培養は常法に従って
行われる。

【００２６】(3)細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜１０：１の割合で
混合してポリエチレングリコールと混合するか電気パル
ス処理することにより細胞融合を行うことができる。

【００２７】(4)ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択はヒポキサンチン
(１０^-3〜１０^-5Ｍ)、アミノプテリン(１０^-6〜１０^-7
Ｍ)、チミジン(１０^-5〜１０^-6Ｍ)を含む培地を用いて
培養して生育してくる細胞をハイブリドーマとすること
により行われる。

【００２８】(5)ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法により少なく
とも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の動物
細胞と同様にして培養すれば培地中に本発明のモノクロ
ーナル抗体が産生される。又、ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に移植して増殖させることにより腹水中に本
発明のモノクローナル抗体を蓄積させることもできる。

【００２９】(6)モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロテインＡやプロテインＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる。

【００３０】モノクローナル抗体の選別には酵素免疫測
定法、ウエスタンブロッティング法等が用いられる。
又、モノクローナル抗体のアイソタイプの決定はモノク
ローナル抗体の酵素免疫測定法又はオクタロニー法等に
よって行うことができる。

【００３１】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００３２】参考例１（抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクロー
ナル抗体ＭＶ833の調製） （１）抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの作製 単離したヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦのcＤＮＡにて形質転換
した酵母の培養液よりヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦを精製し
(特開平７−３１４９６号参照)、キーホールリンペット
ヘモシアニン(ＫＬＨ)とグルタルアルデヒドを用いて複
合体を作製し、得られた蛋白を抗原として常法に従って
マウスモノクローナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-
ＶＥＧＦ／ＶＰＦで免疫したマウスの脾細胞とマウスミ
エローマ細胞(Ｓp2)をポリエチレングリコール存在下で
細胞融合させた。得られたハイブリドーマは限界希釈法
によりクローニングした。ＶＥＧＦ／ＶＰＦとクローン
化したハイブリドーマの培養上清の反応性を酵素免疫測
定法により調べ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦと反応するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。又、
このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をＭ
Ｖ833と命名した。

【００３３】（２）抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル
抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製）を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。

【００３４】又、下記の方法で測定したＶＥＧＦ₁₂₁及
びＶＥＧＦ₁₆₅に対する解離定数は以下の通りであり本
発明のモノクローナル抗体はＶＥＧＦ／ＶＰＦに対して
強い親和性を有することがわかる。

【００３５】○ ５.７０×１０^-11Ｍ±０.３５×１０
^-11Ｍ（ＶＥＧＦ₁₂₁) ○ １.１０×１０^-10Ｍ±０.１１×１０^-10Ｍ（ＶＥＧ
Ｆ₁₆₅)

【００３６】解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し、取り
外し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で
一晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢ
Ｓを３００μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１
％ＢＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
で調製したＶＥＧＦと¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦ(¹²⁵Ｉ標識Ｖ
ＥＧＦ₁₂₁はＶＥＧＦ₁₂₁をクロラミンＴ法により標識、
¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦ₁₆₅はアマシャム社より購入)反応混
液を穴あたり２００μl添加して一晩放置する。この反
応混液中のＶＥＧＦ濃度はＶＥＧＦ₁₂₁が０〜１ng/穴，
ＶＥＧＦ₁₆₅が０〜１０ng/穴、¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦが１
×１０⁴cpm/穴(¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦ₁₂₁; ６６.７pg/穴、
^{1 25}Ｉ標識ＶＥＧＦ₁₆₅；１１６pg/穴)とする。穴から反
応混液を取り除き０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した
後、穴を１個ずつ切り離して分析用チューブに入れガン
マーカウンターにてカウントし、その結果より作成した
散布図から解離定数を求める。

【００３７】又、下記の方法で測定した本発明のモノク
ローナル抗体の等電点はpＩ＝５.２〜５.５であった。
現時点で報告のある他のＩgＧ1タイプの抗ＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦモノクローナル抗体の等電点は我々の報告している
ＭＶ101がpＩ＝７.０〜７.５でありジェネンテック社の
Ａ４.６.１がpＩ＝４.２〜５.２[Kim,K.J. et.al. Grow
th Factors,7:53(1992)]であり本発明の物質はいずれの
物質とも異なる物質である。

【００３８】等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。

【００３９】（３）ＶＥＧＦ／ＶＰＦ中のモノクローナ
ル抗体の反応部位の同定 (3-1)ＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当
するペプチドの作製 ヒトＶＥＧＦ₁₂₁のアミノ配列の連続した１２個のアミ
ノ酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種の
ペプチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合
成法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。

【００４０】まず９６穴アッセイプレート用ピンブロッ
クのピンの先端に導入された9-フルオレニルメトキシカ
ルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジンによりＦm
oc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジイミドとヒ
ドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を
縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗浄後、再び
ジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシベンゾトリ
アゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合させ、この操作
を繰り返すことにより目的のペプチドを合成した。縮合
反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行い、さらにトリ
フルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。ピン上で合成し
たペプチドはピンを中性溶液中に浸すことにより切り出
した。合成したペプチドの定量はオルトフタルアルデヒ
ドを用いてアミノ基を定量することにより行った。合成
した６７種のペプチドのアミノ酸配列を表１に示した。
数字はペプチド識別番号を示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】(3-2)ＭＶ833抗体と反応するペプチドの同
定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＥ
ＧＦ₁₂₁の全領域に対応するものである。したがって６
７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べること
によりＭＶ833抗体がＶＥＧＦ／ＶＰＦのどの部位に反
応しているかを明らかにすることができる。そこで酵素
免疫測定法により６７種のペプチドとＭＶ833抗体との
反応性を調べた。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社
製)に６７種の２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時
間放置した。０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３
回洗浄した後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間
放置した。２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１
％ＢＳＡ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。
０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標
識したヒツジ抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１
％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニ
レンジアミン２塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含
む０.２Ｍトリス−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて
発色させた。反応は２規定硫酸を加えて停止させた後、
吸光度(ＯＤ４９０／６５０)を測定した。なお、反応性
の測定には、上記のような酵素免疫測定法の他、オクタ
ロニー法、ウエスタンブロッティング法等を用いてもよ
い。

【００４３】ＭＶ833抗体は６７種類のペプチドの中で
ペプチド識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つ
のペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３
３のペプチドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通
に含まれていることより、この領域ではＭＶ833抗体は
ＫＰＳＣＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応して
いると考えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＥＧ
Ｆ／ＶＰＦのＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列とＳＦＬＱＨＮＫ
ＣＥＣＲＰ配列とＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列とに反
応していることが予想される。抗体はタンパク質の表面
に露出している部分を認識すると考えられるため、この
２種類のアミノ酸配列部分はＶＥＧＦ／ＶＰＦの表面に
露出している部分であると言える。又、モノクローナル
抗体は抗原決定基が単一であると言われているが、高次
構造をとっている蛋白質などの高分子物質が抗原の場合
は抗体が立体的に抗原を認識し、蛋白質の一次構造レベ
ルで抗体の反応性を調べた時に二箇所以上の不連続なア
ミノ酸配列に反応することがある。ＭＶ833抗体がＶＥ
ＧＦ／ＶＰＦ中の二箇所のアミノ酸配列部分に反応した
ことより、本抗体は二箇所のアミノ酸配列部分を立体的
に同時に認識していると考えられる。

【００４４】微量タンパク質やウイルスの研究を行う場
合現在ではその遺伝子のクローニングを行い、その塩基
配列よりタンパク質のアミノ酸配列が予想できる。この
アミノ酸配列をもとにして親水性の高い部位を探索し、
その部位の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体を作製して免疫学的解析に用いてい
る。親水性の高い部位の探索にはHoop＆Woodsらの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824(1981)]などを用
いて解析しているが、あらゆるタンパク質にあてはまる
とは限らない。したがって本発明によりＶＥＧＦ／ＶＰ
Ｆの表面に露出している部位の中で血管新生等の阻害に
重要である部分が明らかにされたことにより強い抗癌活
性を有したＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体を容易に作製できるよ
うになり、また、本発明に採用された方法は蛋白質の表
面に露出している部位を明らかにする方法としても適用
できる。

【００４５】参考例２（抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体
ｂＦＭ−１の調製） 抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体ｂＦＭ−１は、以下のプ
ロトコールにしたがって調製することができる。

【００４６】（１）免疫原の精製 免疫原としてのｂＦＧＦは、例えば、ウシの脳や脳下垂
体から、公知の方法で分離、精製することができる。

【００４７】具体的には以下のとおりにして免疫原を精
製できる。すなわち、硫酸アンモニウム沈殿、ＣＭ−セ
ファデックスクロマトグラフィ及びヘパリン−セファロ
ースクロマトフラフィを含むGospodarowicz等の方法[Go
spodarowicz等、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 81, 6963-
6967(1984)]によってウシの脳からｂＦＧＦを精製す
る。カラムから溶離され、DNA合成刺激活性[ニシカワ
等、Methods Enzymol. 146, 11-22(1987); ヨシタケ
等、Cell Struct. Funct. 7, 229-243(1982)参照]を有
する１本のタンパク質ピークを与えるフラクションを集
める。この精製されたｂＦＧＦの還元化試料は、19.5％
SDS-PAGE上で、分子量18,000を有する単独バンドのタン
パク質を与える。

【００４８】（２）免疫処理 精製したｂＦＧＦ免疫原溶液を用いて、イン・ビボ免疫
法により、マウスを免疫する[ニシカワ等、Methods Enz
ymol. 146, 11-22(1987); ヨシタケ等、Arch.Biochem.
Biophys. 263, 437-446(1988)参照]。

【００４９】具体的には以下のとおりにして免疫処理を
実施できる。すなわち、精製したｂＦＧＦ免疫原溶液を
等量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュ
バントと乳化するまで混合する。このｂＦＧＦ１０μｇ
を含む混合液を、６週令のメスのBALB/cマウスの皮下に
投与することにより免疫を行なう（第１回免疫）。以
後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行ない、計５回免
疫する。マウス血清の抗体力価の定量は、Massoglia
等、J. Cell Physiol. 132, 531-537(1987)に記載のELI
SA法によって行なうことができる。

【００５０】最終免疫から４日経過後、脾臓を無菌的に
マウスから取出し以下の細胞融合工程に使用する。

【００５１】（３）ハイブリドーマの作成 具体的には以下の様にしてハイブリドーマの作成を行
う。DME培地に、上記（２）の脾臓を入れ、ステンレス
メッシュ上で押し潰して脾臓細胞懸濁液を得る。こうし
て得た細胞をDME培地で遠心法によって洗浄し、生きて
いる脾臓細胞数を測定する。

【００５２】一方、予め培養しておいたマウスミエロー
マ細胞（骨髄種細胞）P3-×63-Ag8-U1(P3U1)(Dr. Gordo
n H. Sato, W. Alton Jones Cell Science Center, In
c.より入手）約5×10⁷個に上記脾臓細胞１×10⁸個を加
え、DME培地中でよく混合し、遠心分離を行なう（500×
ｇ、１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解
きほぐし、５０％（w/v）ポリエチレングリコール4000
のDME溶液（３７℃に保温）0.5mlを滴下し、遠心チュー
ブを手で１分間穏やかに回転することによってポリエチ
レングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させる。次
に、３７℃に保温しておいたDME培地２４mlを小量づつ
加えて、チューブを穏やかに回転させた後、遠心分離
（500×ｇ、１０分間）を行なう。細胞ペレットを、１
０％ウシ胎児血清を含むPRMI培地で遠心洗浄した後、細
胞を、１０％ウシ胎児血清を含むHAT培地（RPMI培地に
アミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン1.6×１０
^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍを添加したもの）４
０mlに懸濁する。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養
プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃
で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始す
る。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００
μｌ除き、新たに上記のHAT培地１００μｌを加えるこ
とによりHAT培地中で増殖するハイブリドーマを選択す
る。８日目から１０％ウシ胎児血清を含むHT培地（DME
培地にチミジン1.6×１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１
０^-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリ
ドーマの増殖を観察するとともに、１０日目に、下記の
ELISA法により、ｂＦＧＦ抗体産生ハイブリドーマをス
クリーニングする。

【００５３】（４）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はELISA法
により測定できる。すなわち、９６ウエルELISA用プレ
ート（Falcon社）の各ウエルに、２μｇ／mlの前記ｂＦ
ＧＦ免疫原溶液を５０μｌずつ分注し、室温で４時間放
置する。上清を除去した後、１％BSA-PBSを分注してブ
ロッキングする。次に、0.1％Tween20-PBSで４回洗浄し
た後、各ウエルの培養上清５０μｌを加え、室温で４時
間反応させる。その後、上清を除去し0.1％Tween20-PBS
で４回洗浄する。

【００５４】次に、Tween 20-PBSで2,000倍に希釈した
ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（ダコ社、デ
ンマーク）５０μｌを各ウエルに加える。反応終了後、
0.1％Tween20-PBSで各ウエルを４回洗浄し、0.1Ｍクエ
ン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）と0.4％o-フェニレンジア
ミンと0.005％過酸化水素とを含む溶液５０μｌを各ウ
エルに加え、室温で１５分間反応させ、各ウエルの４９
２ｎｍにおける吸光度を測定する。その結果抗体産生が
認められるウエルについて、再度ELISA法によって抗ｂ
ＦＧＦ抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によ
り数回クローニングすることによってハイブリドーマｂ
ＦＭ−１を樹立することができる。

【００５５】（５）モノクローナル抗体の製造：イン・
ビボ法 プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）
0.5mlを７週令のBALB/c系マウスの腹腔内に投与し、７
日経過した後のマウス腹腔内に、インビトロで増殖させ
たハイブリドーマｂＦＭ−１をマウス一匹当たり１×１
０⁷細胞となるように接種する。

【００５６】ハイブリドーマについて、通常、一匹のマ
ウスから約５〜１０mlの腹水が得られる。その抗体濃度
は、１〜３mg/mlである。腹水中のモノクローナル抗体
の精製は、以下のようにして行なうことができる。ガー
ゼで濾過した腹水を遠心分離（20,000×ｇ，１０分）し
た後、固形の硫酸アンモニウムを３０％飽和濃度になる
ように加える。遠心分離（20,000×ｇ，１０分）した
後、上清に更に硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度にな
るように加え、遠心分離により沈殿を得る。沈殿を小量
の5mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）に溶解し、１００倍量
の前記緩衝液に対して３回透析する。得られた透析物
を、前記緩衝液で平衡化したDE-50セルロースのカラム
にかけて、前記緩衝液で洗浄する。吸着したモノクロー
ナル抗体は、前記緩衝液とそれに0.15Ｍ NaClを加えた
溶液とにより、濃度勾配法によって溶出させる。得られ
たモノクローナル抗体が均一な純度を持つことは、SDS-
電気泳動法によって確認する。

【００５７】（６）モノクローナル抗体ｂＦＭ−１の性
質 (6-1)免疫グロブリンクラスの同定 抗ｂＦＧＦ特異モノクローナル抗体ｂＦＭ−１の免疫グ
ロブリンクラス及びサブクラスは、マウスモノクローナ
ル抗体アイソタイピングキット（アマーシャム社製）に
よって、ＩｇＧ１／κであることが同定されている。

【００５８】(6-2)モノクローナル抗体の交差反応性 (6-2-1)ウシ脳下垂体ｂＦＧＦ(1-146)[Esch等、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 82, 6507-6511(1985)]の天然形の
アミノ酸14-16個及び追加のTyrの配列を有する３種類の
ペプチドを、全自動Biolynx4170 Peptide Synthesizer
(Pharmacia LKB Biotechnology,スエーデン）又は全自
動Applied Biosystems 430 A Peptide Synthesizer (Ap
plied Biophysics Inc.、米国）中で、固相法によって
合成する[マツオ等、In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 4
77-480(1988)]。その内２種は、Tyr¹⁶-bFGF(1-15)及びT
yr¹³²-bFGF(133-146)であり、これらはそれぞれ天然分
子のアミノ末端配列及びカルボキシル末端配列に相当す
る。もう１種は、Tyr⁵¹-bFGF(36-50)であり、これは全
配列の親水性分析によって同定したbFGFの親水性配列の
主要部分を含む。

【００５９】モノクローナル抗体ｂＦＭ−１に関するbF
GF上のエピトープを決定するために、bFGF分子の３種の
線状フラグメントとモノクローナル抗体ｂＦＭ−１との
交差反応性を、下記ラジオイムノアッセイ法(RIA)に基
づく競合結合アッセイ法で調べた。その結果、これら３
種のペプチドフラグメントとモノクローナル抗体ｂＦＭ
−１とは１００μｇ／ml（この濃度は、明確な交差反応
を示す天然のｂＦＧＦのモル基準濃度の１００−１００
０倍である）においてさえ交差反応を示さなかった。こ
のことから、これらの配列、すなわちアミノ末端、カル
ボキシル末端及び主要な親水性領域が連続エピトープと
してモノクローナル抗体ｂＦＭ−１によっては認識され
ないことが確認されている。

【００６０】(6-2-2)ｂＦＧＦの生物活性は熱不安定性
及び酸不安定性である。したがって、ｂＦＧＦ分子（こ
れはジスルフィド結合によって維持されていない）のコ
ンフォメーションは、その生物活性に必須のものと考え
られる[Gospodarowicz等、J. Cell Physiol. 128, 475-
484(1986)]。モノクローナル抗体ｂＦＭ−１がｂＦＧＦ
のコンフォメーションを認識したかどうかを決定するた
めには、ｂＦＧＦ溶液を沸騰水浴中で５分間インキュベ
イションすればよい。なお、熱不活性化ｂＦＧＦの生物
活性（BALB/c3T3-3K細胞中でのDNA合成の促進活性によ
って測定した）は、熱処理前のｂＦＧＦの生物活性の0.
2％である。

【００６１】上記6-2-1項と同様の方法で、モノクロー
ナル抗体ｂＦＭ−１の熱不活性化ｂＦＧＦとの交差反応
性について調べたところ、交差反応性は認められなかっ
た。このことは、モノクローナル抗体ｂＦＭ−１が、ｂ
ＦＧＦの生物活性に必要なｂＦＧＦ分子のコンフォメー
ションを認識していることを示すものである。

【００６２】(6-2-3)様々な種から誘導されたｂＦＧＦ
及びウシ−ａＦＧＦとモノクローナル抗体ｂＦＭ−１と
の反応性を、ラジオイムノアッセイ法(RIA)によって決
定した結果を表２に示す。モノクローナル抗体ｂＦＭ−
１は、マウス−ｂＦＧＦ、ヒト−ｂＦＧＦ及びウシ−ｂ
ＦＧＦとは交差反応を示したが、ウシ−ａＦＧＦとは交
差反応を示さなかった。

【００６３】

【表２】

【００６４】ラジオイムノアッセイ法(RAI)の実験条件
は、上記6-2-1項及び6-2-2項と同様に、下記6-2-4項の
方法で行なった。表２の数値の計算は、ラジオイムノア
ッセイ法(RIA)によって推定したＦＧＦ濃度を、ＦＧＦ
のDNA合成刺激活性から推定したＦＧＦ濃度で割って行
なった。いずれのアッセイにおいても、純粋なウシｂＦ
ＧＦを標準として用いた。ウシｂＦＧＦの値を１００％
とした。

【００６５】(6-2-4)ｂＦＧＦのラジオイムノアッセイ
法 精製したウシｂＦＧＦを、クロラミン−Ｔ法[Kan等、J.
Biol. Chem. 263, 11306-11313(1988)に記載]によって
¹²⁵Ｉでラベルし、ヘパリン−Sepharoseアフィニティク
ロマトグラフィ[Neufeld等、J. Biol. Chem. 260, 1386
0-13868(1985)に記載]を若干修正した方法で精製した。
簡単に説明すれば、クロラミン−Ｔ180μｇ／mlを含有
する反応混合物110μｌ中で室温下で２分間、ウシｂＦ
ＧＦ2.8μｇと¹²⁵Ｉ 700μCi(25.9MBq)とを0.02％CHAPS
の存在下でインキュベーションした[マツオ等、In Vitr
o Cell. Dev. Biol. 24, 477-480(1988)]。0.02Ｍジチ
オスレイトール100μｌを加えることにより、反応を停
止した。次に、0.1％CHAPSを含有する塩溶液を用いて、
ヘパリン−Sepharoseカラム上で遊離の¹²⁵Ｉから^{12 5}Ｉ
ラベル付きｂＦＧＦを分離した。¹²⁵Ｉラベル付きｂＦ
ＧＦの比活性は5.5×１０⁴cpm/ngであった。ラベルされ
たｂＦＧＦとラベルされていないｂＦＧＦは、前記と同
様のDNA合成促進活性から判断して、ほとんど同じ生物
活性を示した。RIA用反応混合物（５ml）は、0.1Ｍリン
酸緩衝液（pH7.4）／0.02％NaN₃0.35ml、PBS/0.1%BSA/
0.02%NaN₃(PBS-B-A)中の４ng/ml¹²⁵Ｉ-bFGF(8000-15000
cpm)0.05ml、PBS-B-A中の適当な濃度のラベルされてい
ないbFGF0.05ml及びPBS-B-A中の各々精製されたモノク
ローナル抗体（0.12-1.5μｇ／ml）0.05mlからなり、こ
れを試験管（栄研）内で４℃で一晩インキュベートし
た。PBS／0.02%NaN₃中の１％正常マウス血清0.1mlとPBS
/0.02%NaN₃中の0.77mg/mlヤギ−抗−マウス免疫グロブ
リン（ダコ社）0.1mlとを加えた後で、試験管をさらに
４℃で４時間インキュベートした。抗体に結合した放射
能を、0.2％ポリエチレングリコール6000の１mlを加え
そして遠心することによって沈殿させ、続いてAloka自
動−ウエルガンマシステム(ARC-300)中で計数した。

【００６６】(6-3)上記のような特性を有するモノクロ
ーナル抗体ｂＦＭ−１は、外因性ｂＦＧＦの存在下だけ
でなく非存在下でもウシ毛細血管内皮細胞の増殖をイン
・ビトロにおいて阻害する。

【００６７】実施例１ 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体ＭＶ８３３及び
抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−１の併用による腫瘍抑制試験１

【００６８】常法により培養したヒト大腸癌細胞（RPMI
4788）を用いて細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液
をBALB/cヌードマウス（雄、６週令、ｎ＝４又は５）に
１０⁶個づつ、常法により、背部皮下の４カ所に移植し
たところ、腫瘍塊１６〜２０個の増殖を観察した。

【００６９】移植から１、３、６、９、１２、１５及び
１９日目に、下記６群の抗体を夫々0.2ml腹腔内投与し
た。

【００７０】ＭＶ群：MV833(200μg/M)投与、ｎ＝４ １ＦＭＶ群：MV833(200μg/M)＋bFM-1(200μg/M)投与、
ｎ＝５ １Ｆ群：bFM-1(200μg/M)投与、ｎ＝４ ４Ｆ群：bFM-1(800μg/M)投与、ｎ＝５ ＨＡ群：HA(anti hEGF McAb)(800μg/M)投与、ｎ＝４ ＰＢＳ群：PBS(0.2ml/M)投与、ｎ＝４

【００７１】各群の経時的な腫瘍増殖を図１に示した。
また、２３日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を図２に示し
た。図２では、Mann-Whitney法に従い、２群間に有意差
があったところを表示した。

【００７２】図１及び図２から、腫瘍増殖は、抗VEGF/V
PF抗体（ＭＶ群）によって非常に良く抑制されることが
判るとともに、抗VEFG/VPF抗体と抗bFGF抗体とを同時に
投与した群（１ＦＭＶ群）によって抗bFGF抗体単独の群
（４Ｆ群）よりも有意に抑制されることが判る。したが
って、抗VEGF/VPF抗体と抗bFGF抗体との併用は固形腫瘍
形成阻害に有効であることが示された。

【００７３】実施例２ 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体ＭＶ８３３及び
抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−１の併用による腫瘍抑制試験２

【００７４】常法により培養したヒト扁平上皮癌細胞
（A431）を用いて細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液
をBALB/cヌードマウス（雄、８又は１１週令、ｎ＝４又
は５）に１０⁶個づつ、常法により、背部皮下の４カ所
に移植したところ、腫瘍塊１６〜２０個の増殖を観察し
た。

【００７５】該癌細胞（A431）は腫瘍の増殖が速いの
で、移植から１、３、５、７、９及び１１日目に、下記
６群の抗体を夫々0.2ml腹腔内投与した。

【００７６】ＭＶ群：MV833(200μg/M)投与、ｎ＝５ ４ＦＭＶ群：MV833(200μg/M)＋bFM-1(800μg/M)投与、
ｎ＝５ １Ｆ群：bFM-1(200μg/M)投与、ｎ＝４ ４Ｆ群：bFM-1(800μg/M)投与、ｎ＝５ ＨＡ群：HA(anti hEGF McAb)(1000μg/M)投与、ｎ＝５ ＰＢＳ群：PBS(0.2ml/M)投与、ｎ＝４

【００７７】各群の経時的な腫瘍増殖を図３に示した。
また、１４日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を図４に示し
た。図４では、Mann-Whitney法に従い、２群間に有意差
があったところを表示した。なお、ＰＢＳ群には異常な
一匹がいたので、それを除いた群をＰＢＳ′群として図
４に示した。

【００７８】図３及び図４から、腫瘍増殖は、抗bFGF抗
体（１Ｆ群及び４Ｆ群）によってはあまり抑制されず、
抗VEGF/VPF抗体単独の群（ＭＶ群）によって良く抑制さ
れることが判るとともに、更に抗VEGF/VPF抗体と抗bFGF
抗体とを同時に投与した群（４ＦＭＶ群）では抗VEGF/V
PF抗体単独の群（ＭＶ群）より有意に抑制されることが
判る。したがって、抗VEGF/VPF抗体と抗bFGF抗体との併
用は、固形腫瘍形成阻害に極めて有効であることが示さ
れた。

【００７９】

【発明の効果】本発明によれば、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアン
タゴニスト及びｂＦＧＦアンタゴニストを併用すること
により、腫瘍の増殖を有効に抑制することができる。し
たがって、本発明は、各種の癌の治療に有効に利用され
るものである。

【００８０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：

【図面の簡単な説明】

【図１】各抗体投与群におけるヒト大腸癌細胞の増殖に
対する阻害効果を経時的に示す図である。

【図２】図１の２３日目の腫瘍重量を各抗体投与群毎に
示す図である。

【図３】各抗体投与群におけるヒト扁平上皮癌細胞の増
殖に対する阻害効果を経時的に示す図である。

【図４】図３の１４日目の腫瘍重量を各抗体投与群毎に
測定して示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大澤 満 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 浅野 誠 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 幸田 綾子 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 鈴木 日出夫 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト及び
   ｂＦＧＦアンタゴニストを有効成分とする抗癌剤。
2. 【請求項２】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストが抗
   ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体であることを特徴
   とする請求項１の抗癌剤。
3. 【請求項３】 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗
   体がＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部である下記
   配列１〜３の少なくとも１つと反応する抗体であること
   を特徴とする請求項２の抗癌剤。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ
4. 【請求項４】 ｂＦＧＦアンタゴニストが抗ｂＦＧＦ抗
   体である請求項１に記載の抗癌剤。