CZ20004110A3 - Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen - Google Patents

Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen Download PDF

Info

Publication number
CZ20004110A3
CZ20004110A3 CZ20004110A CZ20004110A CZ20004110A3 CZ 20004110 A3 CZ20004110 A3 CZ 20004110A3 CZ 20004110 A CZ20004110 A CZ 20004110A CZ 20004110 A CZ20004110 A CZ 20004110A CZ 20004110 A3 CZ20004110 A3 CZ 20004110A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
agent
camp
nep
fsd
fsad
Prior art date
Application number
CZ20004110A
Other languages
English (en)
Inventor
Graham Nigel Maw
Christopher Peter Wayman
Original Assignee
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9926437A external-priority patent/GB9926437D0/en
Priority claimed from GB0004021A external-priority patent/GB0004021D0/en
Priority claimed from GB0013001A external-priority patent/GB0013001D0/en
Priority claimed from GB0016563A external-priority patent/GB0016563D0/en
Priority claimed from GB0017141A external-priority patent/GB0017141D0/en
Application filed by Pfizer Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of CZ20004110A3 publication Critical patent/CZ20004110A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4402—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 2, e.g. pheniramine, bisacodyl
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/30—Oestrogens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká farmaceutika, které je užitečné při léčení sexuálních dysfunkcí u žen (FSD), zejména poruchy sexuální vzrušivosti u žen (FSAD).
Dále se vynález týká způsobu léčení FSD, zejména
FSAD.
Vynález se také týká zkoušek, kterými lze stanovit sloučeniny užitečné při léčení FSD, zejména FSAD.
Seznam zkratek, kterých se používá v následujícím textu je zařazen před patentovými nároky.
Dosavadní stav techniky
Fáze vzrušení při sexuální odpovědi u žen není od fáze touhy dobře odlišitelná, dokud nedojde k fyziologickým změnám ve vagíně a klitoris a také v jiných pohlavních orgánech. Sexuální vzrušení a rozkoš jsou doprovázeny kombinací vaskulárních a neuromuskulárních procesů, které vedou k překrvení klitoris, stydkých pysků a stěn vagíny, zvýšené lubrikaci vagíny a dilataci vaginálního lumen (Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiavi et al., 1995; Masters et al., 1996; Bergman et al., 1999).
Překrvení vagíny umožní, aby došlo k transsudaci, a tento proces je zodpovědný za zvýšenou lubrikaci vagíny. Transsudace umožní prostup plasmy skrz epitel na povrch vagíny. Hnací silou tohoto procesu je zvýšené prokrvení kapilárního lože vagíny během stavu vzrušení. Překrvení také
vede k prodloužení vagíny a zvětšení průměru jejího lumen, zejména v distálních 2/3 vaginálního kanálu. Dilatace vaginálního lumen je vyvolána kombinací relaxace hladkého svalstva stěny a relaxací kosterního svalstva pánevního dna. Má se za to, že některé sexuální bolestivé poruchy, jako je vaginismus, jsou alespoň zčásti vyvolány neadekvátní relaxací, která zabraňuje dilataci vagíny; ještě je nutno ověřit, zda jde v první řadě o problém hladkého nebo kosterního svalstva (Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin,
1991; Levin 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiavi et al., 1995; Master et al., 1996; Bergman et al., 1999).
Vaskulatura a mikrovaskulatura vagíny je inervována nervy obsahujícími neuropeptidy a jiné potenciální neurotransmitery. Jako jejich příklady je možno uvést peptid se vztahem ke kalcitoninovému genu (CGRP), neuropeptid Y (NPY), oxid dusnatý synthasu (NOS), látku P a vasoaktivní intestinální peptid (VIP) (Hoyle et al., 1996). Peptidy, které jsou přítomny v klitoris jsou diskutovány dále. Oxid dusnatý synthasa, která je často lokalizována spolu s VIP vykazuje vyšší expresi, imunologicky, v hlubokých tepnách a žilách, a nikoliv v cévách propria (Hoyle et al., 1996).
Sexuální dysfunkce u žen
Je známo, že někteří jedinci mohou trpět ženskými sexuálními dysfunkcemi (FSD).
FSD lze nejlépe definovat jako obtížné dosahování sexuálního uspokojení nebo neschopnost jeho dosažení. FSD je souhrnný pojem pro různé ženské sexuální poruchy (Leiblum, 1988, Berman et al., 1999). Žena může trpět nedostatkem libida, obtížným dosažením vzrušení nebo orgasmu, bolestí při styku nebo kombinací těchto problémů. FSD může vyvolávat několik typů chorob, léčiv, poranění nebo psychologických problémů.
Studie zabývající se sexuálními dysfunkcemi u dvojic ukázaly, že až 76 % žen si stěžuje na sexuální dysfunkce a 30 až 50 % žen v USA zažívá FSD.
Jako podtypy FSD lze uvést snížené libido, poruchu ženské sexuální vzrušivosti, poruchu orgasmu a porušené libido.
Vyvíjená léčení jsou zaměřena na léčení specifických podtypů FSD, převážně poruch libida a vzrušivosti.
Kategorie FSD lze nejlépe definovat jejich přiřazením k fázím normální ženské sexuální odpovědi: touze, vzrušení a orgasmu (Leiblum 1998). Touha či libido jsou pohonem pro sexuální chování a jeho projevy jsou často sexuální představy za přítomnosti zainteresovaného partnera nebo při vystavení jiným erotickým stimulům. Oproti tomu, sexuální vzrušení představuje vaskulární reakci na sexuální stimulaci, jejíž důležitou složkou je lubrikace a prodloužení vagíny. Sexuální vzrušení je tedy oproti sexuální touze spojena s genitálním prokrvením (například vagíny a klitoris), a nikoliv nezbytně se sensitivitou. Orgasmus představuje uvolnění sexuální tenze, která kulminuje během vzrušení. FSD se tedy obvykle vyskytuje u žen, které neadekvátně nebo neuspokojivě reagují ve kterékoliv z těchto fází, obvykle ve fázi touhy, vzrušení nebo orgasmu. Jako kategorie FSD je možno uvést snížené libido, poruchu sexuální vzrušivosti, orgastickou poruchu a bolestivé sexuální poruchy.
Nízké libido mají ženy, které po sexu netouží, nebo touží jen málo, a nemají nebo téměř nemají žádné sexuální představy či fantazie. Tento typ FSD může být vyvolán níz-
kými hladinami testosteronu, buď kvůli přirozené nebo chirurgicky navozené menopauze. Jako jiné příčiny lze uvést choroby, medikaci, únavu, depresi a úzkost.
Pro poruchu sexuální vzrušivosti u žen (FSAD) je charakteristická neadekvátní odpověď genitálií na sexuální stimulaci. Nedochází k překrvení genitálií (například vagíny a/nebo klitoris), které je příznačné pro normální sexuální vzrušení. Stěny vagíny jsou málo lubrikovány, takže styk je bolestivý. Dosažení orgasmu je ztíženo. Porucha vzrušivosti může být vyvolána sníženou hladinou estrogenu při menopauze nebo po porodu a během laktace, a také onemocněním, které také postihuje vaskulaturu, jako je diabetes a atherosklerosa. Jiné příčiny mohou být spojeny s léčením diuretiky, antihistaminiky, antidepresivy, například SSRI, nebo antihypertenzivními činidly. FSAD je podrobněji diskutována dále.
Bolestivé sexuální poruchy (které zahrnují dyspaurenii a vaginismus) jsou charakterizovány bolestí způsobenou penetrací a mohou být vyvolány medikaci, která snižuje lubrikaci, endometriosou, zánětlivou chorobou pánve, zánětlivou chorobou střev nebo problémy s močovým traktem.
Prevalenci FSD je obtížné odhadnout, jelikož tento pojem pokrývá několik typů problémů, z nichž některé jsou nesnadno měřitelné a jelikož zájem léčit FSD vznikl relativně nedávno. Mnoho sexuálních problémů u žen je spojeno buď přímo s procesem jejich stárnutí nebo s chronickým onemocněním, jako diabetes nebo hypertenzí.
Uváděné údaje o incidenci a prevalenci FSD silně kolísají; zčásti to lze vysvětlit použitím různých hodnotících kritérií, ale většina výzkumníků uvádí, že významný podíl jinak zdravých žen má symptomy jednoho nebo více podtypů FSD. Například studie porovnávající sexuální dysfunkci u párů ukázala, že 63 % žen trpí poruchou vzrušivosti nebo orgastickou poruchou oproti 40 % mužů, kteří jsou postiženi erektilní nebo ejakulační dysfunkcí (Frank et al., 1978).
Prevalence poruchy sexuální vzrušivosti u žen však pozoruhodně kolísá od průzkumu k průzkumu. Při nedávném průzkumu National Health and Sociál Life Survey 19 % žen uvádělo obtíže s lubrikaci, zatímco podobné obtíže s lubrikací uvádělo 14 % ambulantních pacientek gynekologické kliniky (Rosen et al., 1993).
Několik studií také uvádí dysfunkční sexuální vzrušivost, do níž spadá i snížená vaginální lubrikace, u diabetiček (až 47 %) (Wincze et al., 1993). Neexistuje žádné spojení mezi neuropathií a sexuální dysfunkcí.
Četné studie také ukázaly, že celkem u 11 až 48 % žen může být snížená sexuální touha spojena s věkem. Podobně 11 až 50 % žen uvádí problémy se vzrušivosti a lubrikaci, a tedy zážitek bolesti při styku. Vaginismus je mnohem méně častý; postihuje přibližně 1 % žen.
Studie u sexuálně zkušených žen podrobně uvádějí, že 5 až 10 % z nich trpí primární anorgasmií. Dalších 10 % má orgasmus zřídka a dalších 10 % jej prožívá nepravidelně (Spector et al., 1990).
Jelikož FSD tvoří několik podtypů, které odpovídají symptomům v oddělených fázích cyklu sexuální odpovědi, neexistuje jediná terapie. Současné způsoby léčení FSD jsou zaměřeny především na psychologické nebo vztahové problémy. Léčení FSD se postupně vyvíjí jako kliničtější a zkoumání tohoto problému jsou věnovány základní vědecké studie. Sexuální potíže u žen nejsou z hlediska patofyziologie vždy
psychologické, zejména u těch žen, na jejichž celkovém sexuálním problému se může podílet složka vaskulogenetické dysfunkce (například FSAD). V současnosti neexistují žádné povolené léky pro léčení FSD. Empirická léková terapie zahrnuje podávání estrogenu (topicky nebo jako hormonální substituci), androgenů nebo léčiv pozměňujících náladu, jako je buspiron nebo trazodon. Tyto léčebné možnosti jsou vzhledem k jejich nízké účinnosti nebo nepřijatelným vedlejším účinkům často neuspokojivé.
Jelikož zájem léčit FSD farmakologicky je relativně nedávný, terapie sestává z psychologického poradenství, volně prodejných sexuálních lubrikantů a dosud nevyzkoušených potenciálních léčiv, kterými mohou být léčiva schválená pro jiné stavy. Takovou medikaci mohou představovat hormonální činidla, testosteron nebo kombinace estrogenu a testosteronu, a nedávno vyvinutá vaskulární léčiva s ověřenou účinností na erektilní dysfunkci u mužů. Neprokázalo se, že by některé z těchto činidel bylo příliš účinné při léčení FSD.
Porucha sexuální vzrušivosti u žen
Sexuální vzrušení je tvořeno vasokongescí v pánvi, lubrikaci vagíny a zvětšením a zbytněním vnějších genitálií. Porucha vyvolává značný distres a/nebo interpersonální problémy. Studie zabývající se sexuálními dysfunkcemi u párů ukázaly, že existuje řada žen, které trpí poruchou sexuální vzrušivosti, která je jinak známa jako FSAD (female sexual arousal disorder).
Diagnostický a statistický manuál (DSM) IV Americké psychiatrické asociace definuje poruchu sexuální vzrušivosti u žen (FSAD) takto:
• ·
Trvalá nebo přechodná neschopnost dosáhnout adekvátní odezvy pohlavního vzrušení, která spočívá v lubrikaci a zbytnění, nebo neschopnost ji udržet až do konce sexuální aktivity. Porucha musí vyvolávat značný distres nebo interpersonální potíže.
FSAD je sexuální poruchou s vysokou prevalencí u pre-, peri a postmenopausálních (±HRT) žen. Je spojena s dalšími průvodními poruchami, jako jsou deprese, kardiovaskulární choroby, diabetes a UG poruchy.
Primárními následky FSAD jsou nedostatečné překrvení/ /zbytnění, nedostatečná lubrikace a nedostatek příjemného genitálního počitku. Druhotnými následky FSAD jsou snížené libido, bolest během styku a obtížné dosažení orgasmu.
Nedávno byla navržena hypotéza, že alespoň u části pacientů se symptomy FSAD má tato porucha vaskulární bázi (Goldstein et al., 1998), a tento názor byl podpořen údaji získanými na zvířatech (Park et al., 1997).
Léčivy, která přicházejí v úvahu pro léčení FSAD, jejichž účinnost se v současné době zkoumá, jsou primárně léčivy pro léčení mužské erektilní dysfunkce, která zvyšují prokrvení mužských genitálií. Takovou terapii tvoří dva typy formulací, perorální nebo sublinguální medikace (apomorfin, fentolamin, sildenafil), a prostaglandin (PGE-l alprostadil), který se mužům podává injekčně nebo transurethrálně, a ženám topicky na genitálie.
Úkolem vynálezu je vyvinout účinné prostředky pro léčení FSD, zejména FSAD.
V tomto textu se pojmu žena používá jako souhrnného pojmu pro označení pohlaví u člověka či jiného živočiφφφφ φ cha, pokud není uvedeno jinak. Do jeho rozsahu tedy spadá i pojem samice. Podobný vztah je také například mezi přívlastky ženský - samičí apod.
Podstata vynálezu
Vynález se opírá o zjištění, že ženy, které trpí FSD, přednostně FSAD, lze léčit za použití I:NEP.
V souvislosti s tímto vynálezem je I:NEP podle vynálezu označován jako činidlo podle vynálezu.
Činidla podle vynálezu je také možno použít v kombinaci s jedním nebo více přídavnými farmaceuticky účinnými činidly. Takové přídavné farmaceuticky účinné činidlo, pokud je přítomno nebo se ho používá spolu s činidlem podle vynálezu, může být označeno jako přídavné činidlo. Jedním nebo více přídavnými činidly může být jeden nebo více I:PDE, jiných I:NEP, I:NPY. Kombinace činidel jsou podrobněji diskutovány dále.
Pokud je přídavným činidlem podle vynálezu I:PDE, potom je podle některých provedení takovou fosfodiesterasou PDE hydrolyzující cAMP (a popřípadě hydrolyzující cGMP). Do pojmu hydrolyzující cAMP také spadá metabolizující a/nebo rozkládající cAMP. Pod pojmem hydrolyzující cAMP (a popřípadě cGMP) se rozumí, že přídavné činidlo může být schopné kromě cAMP hydrolyzovat i cGMP. Pod pojmem hydrolýza cGMP se také rozumí metabolizování a/nebo rozkládání cGMP.
U některých provedení tohoto vynálezu se předpokládá, že přídavné činidlo nemusí nezbytně být schopno hydrolyzovat cGMP.
Obecné odkazy na činidla lze vztáhnout na činidla přídavná i na činidla podle vynálezu.
Činidlo podle vynálezu působí na cíl, přednostně specificky na cíl. Tento cíl je někdy označován jako cíl podle vynálezu. Činidlo podle vynálezu může působit na jeden cíl či větší počet cílů. Tyto další cíle mohou být označovány jako přídavné cíle. Podobně, pokud se použije přídavného činidla, potom toto přídavné činidlo může být zacíleno na stejný cíl jako je cíl podle vynálezu a/nebo přídavný cíl (který nemusí být stejný jako přídavný cíl, na který působí činidlo podle vynálezu). Cíle jsou popsány v tomto textu. Obecný odkaz na cíle lze vztáhnout na cíle přídavné i cíle podle vynálezu.
Vynález se dále opírá o zjištění, že lze zvýšit prokrvení ženského genitálu (například vagíny nebo klitoris) za použití činidla podle vynálezu.
Při našich experimentech se zjistilo, že FSAD je spojena se sníženým prokrvením, zejména sníženým prokrvením vagíny a/nebo klitoris. Léčení žen s FSAD je tedy možno dosáhnout zvýšením prokrvení genitálií za použití vasoaktivních činidel. Naše zkoušky ukázaly, že cAMP je mediátorem vaginální a klitoriální vasorelaxace a že genitální (například vaginální a klitoriální) prokrvení je možno zvýšit/potencovat zvýšením hladiny cAMP. To představuje další základní poznatek.
V tomto ohledu nikdo dříve nenavrhl, že by FSAD bylo možno léčit takovým způsobem - tj. přímým nebo nepřímým zvýšením hladiny cAMP. Kromě toho, v dosavadním stavu techniky neexistují žádné informace, na základě kterých by bylo možno předpokládat, že FSAD je spojena se škodlivou modulací aktivity a/nebo hladiny cAMP nebo že cAMP je zodpovědný za zprostředkování vaginální nebo klitoriální vasorelaxace.
Toto představuje další překvapující zjištění.
• · · ·· ♦ ·· ·· • · ·· ·· ·· ···· • · ··· ··· ···· ··· ·· ··· ·· ····
Kromě toho jsme zjistili, že za použití činidel podle vynálezu je možné zvýšit genitální překrvení a léčit FSAD - například zvýšenou lubrikaci vagíny a zvýšenou citlivostí vagíny a klitoris.
V obecném vyjádření se tedy vynález týká použití potenciátoru cAMP pro léčení FSD, zejména FSAD.
Tento vynález je výhodný v tom, že poskytuje prostředky pro obnovení normální sexuální vzrušivosti, zejména zvýšeného prokrvení genitálií, které vede k překrvení vagíny, klitoris a labií. Toto překrvení vyústí ve zvýšenou lubrikaci vagíny transsudací plasmy, zvýšenou poddajnost vagíny a zvýšenou čitlivost genitálií (například vagíny a klitoris). Vynález tedy poskytuje prostředky jak obnovit nebo potencovat normální sexuální vzrušivost.
Podle jednoho aspektu je předmětem vynálezu farmaceutická kompozice pro použití (či když se používá) při léčení FSD, zejména FSAD; přičemž tato farmaceutická kompozice obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, zejména FSAD; a toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem; přičemž tímto činidlem je činidlo podle vynálezu definované v tomto popisu. Kompozice (stejně jako kterákoliv z ostatních kompozic uvedených v tomto textu) může být balena pro následné použití při léčení FSD, zejména FSAD.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu použití činidla pro výrobu léčiva (jako farmaceutické kompozice) pro léčení FSD, zejména FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, zejména FSAD; a tímto činidlem je činidlo podle vynálezu definované v tomto textu.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob léčení žen trpících FSD, zejména FSAD; jehož podstata spočívá v tom, že se ženě podává činidlo, které je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech, v množství, které vyvolává potenciaci cAMP v pohlavních orgánech ženy; přičemž toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem; a činidlem je činidlo podle vynálezu definované v tomto textu.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu zkušební postup pro identifikaci činidla, kterého je možno použít pro léčení FSD, zejména FSAD, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stanovení, zda činidlo může přímo nebo nepřímo potencovat cAMP; přičemž potenciace cAMP za přítomnosti činidla svědčí o tom, že činidlo může být užitečné při léčení FSD, zejména FSAD; a přičemž takovým činidlem je I:NEP.
Předmětem vynálezu je tedy například zkušební postup pro identifikaci činidla, které může přímo nebo nepřímo potencovat cAMP za účelem léčení FSD, zejména FSAD, jehož podstata spočívá v tom, že se při něm činidlo uvede do styku s entitou schopnou působit na aktivitu a/nebo hladinu cAMP; a změří se aktivita a/nebo hladina cAMP; přičemž potenciace cAMP za přítomnosti činidla svědčí o tom, že činidlo může být užitečné při léčení FSD, zejména FSAD; a přičemž takovým činidlem je I:NEP.
Předmětem vynálezu je tedy například dále zkušební postup pro identifikaci činidla, které může přímo nebo nepřímo potencovat cAMP za účelem léčení FSD, zejména FSAD, jehož podstata spočívá v tom, že se při něm činidlo uvede do styku s cAMP; a změří se aktivita cAMP; přičemž potenciace cAMP za přítomnosti činidla svědčí o tom, že činidlo může být užitečné při léčení FSD, zejména FSAD; a přičemž takovým činidlem je I:NEP.
·· · 99 9 99 «· * · ·· · · ·· · » » « • 9 9 9 9 9 9 9
9999 999 99 999 99 9999
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje (a) stupeň, v němž se provede zkouška podle vynálezu;
(b) stupeň, v němž se identifikuje jedno nebo více činidel, které mohou přímo nebo nepřímo potencovat aktivitu cAMP; a (c) připraví se množství jednoho nebo většího počtu identifikovaných činidel;
přičemž takovým činidlem je I:NEP.
V tomto ohledu je činidlo identifikované ve stupni (b) možno modifikovat tak, aby například maximalizovalo aktivitu, a stupeň je možno opakovat. Tyto stupně je možno opakovat, dokud se nedosáhne požadované aktivity nebo požadovaného farmakokinetického profilu.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje (al) stupeň, v němž se provede zkouška podle vynálezu;
(bl) stupeň, v němž se identifikuje jedno nebo více činidel, která mohou přímo nebo nepřímo potencovat aktivitu cAMP, (b2) stupeň, v němž se jedno nebo více identifikovaných činidel modifikuje;
(a2) stupeň, v němž se opakuje stupeň (al); a ·« * « · » 9 9
9999 (c) stupeň, v němž se připraví množství jednoho nebo více identifikovaných činidel, tj. která byla modifikována ;
přičemž činidlem je I:NEP.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob léčení FSD, zejména FSAD, in vivo potenciací cAMP činidlem, které je schopné přímo nebo nepřímo potencovat cAMP při zkoušce in vitro, přičemž zkouškou in vitro je zkušební postup podle vynálezu; a činidlem je I:NEP.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu použití činidla při výrobě farmaceutické kompozice pro léčení FSD, zejména FSAD, přičemž toto činidlo je schopné přímo nebo nepřímo potencovat cAMP při in vitro zkušebním postupu podle vynálezu; a činidlem je I:NEP.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu zvířecí model používaný pro identifikaci činidel schopných léčit FSD, zejména FSAD, který zahrnuje anestetizovanou samici zvířete a prostředky pro měření změn prokrvení vagíny a/nebo klitoris takového zvířete po stimulaci jeho pelvického nervu; přičemž takovým činidlem je I:NEP.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob identifikace činidla, které může přímo nebo nepřímo potencovat cAMP za účelem léčení FSAD, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje podání činidla zvířecímu modelu podle vynálezu; a měření jakékoliv potenciace cAMP a/nebo zvýšení prokrvení ve vagíně a/nebo klitoris tohoto zvířete; přičemž činidlem je I:NEP.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu diagnostická metoda, jejíž podstata spočívá v tom, že zahrnuje
99 ♦ · • • • 9 * • 9 9 · • 9 « 99 • • 9 *· 9 · 9
• 9 • •
• • 9 9 • 9 • •
···· ··· • 9 «9· *9 9*99
izolaci vzorku ze samice; stanovení, zda vzorek obsahuje danou entitu přítomnou v takovém množství, aby vyvolala FSD, přednostně FSAD; přičemž tato entita má přímý nebo nepřímý vliv na hladinu nebo aktivitu cAMP v pohlavních orgánech samice; a tuto entitu je možno modulovat za účelem dosažení kladného účinku za použití činidla, přičemž takovým činidlem je I:NEP.
Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu diagnostická kompozice nebo kit obsahující prostředky pro detekci entity v izolovaném vzorku ženského organismu; přičemž těchto prostředků je možno použít pro stanovení, zda vzorek obsahuje tuto entitu, a zda ji obsahuje v takovém množství, aby vyvolala FSD, přednostně FSAD, přičemž tato entita má přímý nebo nepřímý vliv na hladinu nebo aktivitu cAMP v ženských pohlavních orgánech; a tuto entitu je možno modulovat za účelem dosažení kladného účinku za použití činidla, přičemž takovým činidlem je I:NEP.
V následujícím textu jsou znovu rozebrány tyto a další aspekty vynálezu, které jsou pro snažší orientaci rozděleny do oddílů označených odpovídajícími nadpisy. Informace uvedené v jednom konkrétním oddílu se neomezují pouze tento jediný oddíl.
Přednostní aspekty
V přednostním provedení je činidlo podle vynálezu určeno pro léčení FSAD.
Činidlem podle vynálezu je přednostně mediátor vasorelaxace ženských genitálií (například vagíny nebo klitoris).
V jednom provedení je činidlo podle vynálezu určeno pro perorální podávání.
Podle dalšího provedení činidlo podle vynálezu může být určeno pro topické podávání.
Činidlem podle vynálezu je I:NEP (někdy označovaný jako NEPi).
Při některých aplikacích je přednostním činidlem selektivní I:NEP.
Při některých aplikacích je přednostním činidlem I:NEP, kde NEP představuje EC 3.4.24.11.
Při některých aplikacích je přednostním činidlem selektivní I:NEP, kde NEP představuje EC 3.4.24.11.
Přednostním činidlem podle vynálezu je inhibitor, tzn. že činidlo je schopno vykazovat inhibiční funkci.
Činidlo podle vynálezu má přednostně nepřímý potenciační účinek na cAMP. Vyjádřeno jinými slovy, při některých aplikacích činidlo přednostně nemá přímý potenciační účinek na cAMP. Činidlo může mít nepřímý potenciační účinek na cAMP prostřednictvím působení na přímo účinkující činidla, která se vyskytují přirozeně a jsou přirozeně umístěna, jako je přirozeně se vyskytující a umístěný VIP.
Při některých aplikacích je činidlo podle vynálezu možno podávat spolu s dalším farmaceuticky aktivním činidlem. Toto společné podávání nemusí nutně probíhat ve stejnou dobu, natož stejným způsobem. Jako příklad kompozice pro společné podávání je možno uvést kompozici, která obsahuje činidlo podle vynálezu a přídavné činidlo, přičemž přídavné
činidlo může mít přímý potenciační účinek na cAMP. Příklady kombinací jsou uvedeny dále.
Při některých aplikacích přídavné má činidlo přednostně nepřímý potenciační účinek na cAMP. Jako příklady přídavných činidel je možno uvést I:NEP a/nebo I:NPY. Jinými slovy, při některých aplikacích přídavné činidlo přednostně nemá přímý potenciační účinek na cAMP. Přídavné činidlo může mít nepřímý potenciační účinek na cAMP prostřednictvím působení na přímo účinkující činidla, která se vyskytují přirozeně a jsou přirozeně umístěna, jako je přirozeně se vyskytující a umístěný VIP.
Při některých aplikacích má přídavné činidlo přednostně přímý potenciační účinek na cAMP. Jako příklady takových přídavných činidel je možno uvést I:PDE.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem inhibitor, tzn. že činidlo je schopno vykazovat inhibiční funkci.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem antagonista.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně I:PDE (někdy také označovaný jako PDEi).
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně selektivní I:PDE.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně I:PDE1 nebo I:PDE2 (někdy označovaná jako I:PDEII nebo PDEIIi nebo PDE2Í) nebo I:PDE3 nebo I:PDE4 nebo I:PDE7 nebo I:PDE8, výhodněji l:PDE2.
Při některých aplikacích je přednostním přídavným činidlem selektivní I:PDEII (někdy označované jako PDE2).
Při některých aplikacích je přednostním přídavným činidlem I:NEP (někdy označovaný jako NEPi).
Při některých aplikacích je přednostním přídavným činidlem selektivní I:NEP.
Při některých aplikacích je přednostním přídavným činidlem I:NEP, kde NEP představuje EC 3.4.24.11.
Při některých aplikacích je přednostním přídavným činidlem selektivní I:NEP, kde NEP představuje EC 3.4.24.11.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně I:NPY (někdy označovaný jako NPYi).
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně I:NPY Yl nebo I:NPY Y2 nebo I:NPY Y5, výhodněji I:NPY Yl.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně selektivní I:NPY.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně I:NPY Yl.
Při některých aplikacích je přídavným činidlem přednostně selektivní I:NPY Yl.
Při některých aplikacích činidlo nevyvolává - nebo je podáváno takovým způsobem, aby nevyvolávalo - dlouhotrvající pokles krevního tlaku (například po dobu asi 5 minut nebo déle). V tomto provedení, pokud se má činidlo • · · · · · · · · · • ··· · · · · ♦ · · * ·· ··· · · · • · · · · · · · · · • · · · · ··· ···· ··· ·· *·· ·· ···· podávat topicky, činidlo může mít schopnost vyvolávat pokles krevního tlaku (který by vyvolalo při intravenosním podání), přičemž však při topickém podání do krevního řečiště přechází minimální hladina činidla. Při perorálním podávání přednostně činidlo nevyvolává dlouhotrvající pokles krevního tlaku. Činidlo podle vynálezu nevyvolává, nebo je podáváno tak, aby nevyvolávalo, velké změny srdeční frekvence
Léčení
Ve všech případech, kdy je v textu uveden pojem léčení, rozumí se pod ním alespoň jeden typ zvolený ze souboru sestávajícího z kurativního, paliativního a profylaktického ošetřování. V přednostním provedení tento pojem zahrnuje alespoň kurativní ošetřování a/nebo paliativní ošetřování.
Ženské genitálie
Pojmu ženské genitálie se používá v souladu s jejich definicí v Grayově anatomii, C. D. elemente, 13. americké vydání:
Genitální orgány jsou tvořeny orgány vnitřními a vnějšími. Vnitřní orgány jsou umístěny v pánvi a tvoří je vaječníky, vejcovody, děloha a vagína. Vnější orgány jsou jsou povrchové vzhledem k urogenitálnímu diafragmatu a nacházejí se pod pánevním obloukem. Tvoří je hrma, velké stydké pysky a malé stydké pysky, klitoris, vestibulum, bulbus vestibuli a velké vestibulární žlázy.
Endogenní cAMP
Ve velmi přednostním provedení činidlo podle vynálezu potencuje endogenní cAMP - jako například potencuje hladinu endogenního cAMP.
• · · · · ·
Pod pojmem endogenní cAMP se rozumí cAMP, který vzniká sexuální stimulací (při sexuálním vzrušení). Tento pojem se tedy nevztahuje k hladinám cAMP, které budou zvýšené nezávisle na sexuálním vzrušení.
Podle vynálezu se tedy léčení FSAD provádí přímým nebo nepřímým potencováním endogenní-cAMP signalizace, která dále zvýši vaginální prokrvení/lubrikaci a/nebo prokrvení klitoris, tedy posílením přirozené reakce sexuálního vzrušení. Způsobem léčení podle vynálezu se tedy obnoví nebo potencuje normální reakce sexuálního vzrušení.
Při způsobu léčení podle vynálezu je tohoto výsledku možno dosáhnout za použití inhibitoru NEP (EC 3.4.24.11).
Předmětem vynálezu je také zvířecí model. Tento zvířecí zkušební model je možno použít pro stanovení zvýšení prokrvení genitálií, jako výsledku potenciace cAMP. U tohoto zvířecího modelu je stimulován pelvický nerv, což přivodí efekt, který napodobuje fyziologii sexuálního vzrušení/reakce Při těchto zkouškách činidla podle vynálezu po stimulaci nervu vyvolávají zvýšení prokrvení, které je vyšší než zvýšení kontrolní. Při absenci stimulace činidla nemají žádný (nebo mají jen zanedbatelný) účinek na zvýšení prokrvení. Nerv je obvykle při těchto zkouškách stimulován, aby se získala základní linie prokrvení. Potom se zvířeti systemicky nebo místně, jako intravenosně, topicky nebo perorálně, podá potenciální (nebo skutečné) činidlo. Přírůstek prokrvení ve srovnání s kontrolními přírůstky svědčí o tom, že jde o činidlo podle vynálezu.
Sexuální stimulace
Předmětem vynálezu je také podávání činidla podle • · · · · • · ··· ··· ···· ··· ·· ··· ·· ···· vynálezu před sexuální stimulací a/nebo během ní. Pojem sexuální stimulace může být synonymem sexuálního vzrušování či sexuálního vzrušení. Tento aspekt vynálezu je výhodný, jelikož poskytuje systemickou selektivitu. Přirozená kaskáda může proběhnout pouze v genitáliích, a nikoliv na jiných místech, například v srdci atd. Je tedy možné dosáhnout selektivního účinku na genitálie.
Z hlediska některých aspektů tohoto vynálezu je vysoce žádoucí, aby došlo ke stupni sexuální stimulace. Zjistili jsme, že tento stupeň může poskytnout systemickou selektivitu. Pod pojmem sexuální stimulace se rozumí alespoň jedna ze stimulací vizuálních, fyzikálních, sluchových nebo myšlenkových.
Činidla podle vynálezu se tedy podávají přednostně před sexuální stimulací nebo během ní, zejména pokud jsou podávána perorálně.
Předmětem vynálezu je tedy přednostně použití činidla podle vynálezu při výrobě léčiva pro léčení FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v genitáliích ženy trpící FSAD; přičemž tato žena je sexuálně stimulována před podáním léčiva nebo během jeho podávání.
Předmětem vynálezu je přednostně použití činidla podle vynálezu při výrobě léčiva pro léčení FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v genitáliích ženy trpící FSAD; přičemž tato žena je sexuálně stimulována před podáním nebo během podávání léčiva, které je jí podáváno perorálně.
Dále je předmětem vynálezu přednostní způsob léčení žen trpících FSAD, jehož podstata spočívá v tom, že se takové ženě podává činidlo podle vynálezu, které je schopné • · • «·· · ·· · • · · · · ·
potencovat cAMP v genitáliích, přičemž toto činidlo je v takovém množství, aby vyvolalo potenciací cAMP v genitáliích ženy, a je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem; a přičemž žena je sexuálně stimulována před podáním nebo během podávání tohoto činidla.
Dále je předmětem vynálezu přednostní způsob léčení žen trpících FSAD, jehož podstata spočívá v tom, že se takové ženě podává činidlo podle vynálezu, které je schopné potencovat cAMP v genitáliích, přičemž toto činidlo je v takovém množství, aby vyvolalo potenciací cAMP v genitáliích ženy, a je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem; a přičemž žena je sexuálně stimulována před podáním nebo během podávání tohoto činidla; a činidlo se ženě podává perorálně.
Potenciace cAMP
V souvislosti s cAMP se pod pojmem potenciace rozumí jeden nebo větší počet z následujících jevů: zvýšení účinnosti cAMP, zvýšení hladiny cAMP, zvýšení aktivity cAMP, snížení hladiny degradace cAMP a snížení hladiny inhibice cAMP.
Potenciační účinek může být přímý. Jako příklad přímého účinku lze uvést pozitivní regulaci hladiny cAMP činidlem, které zvyšuje jeho expresi.
Potenciační účinek také může být nepřímý. Příkladem takového účinku může být působení na látku, která by jinak inhibovala a/nebo snižovala hladinu a/nebo aktivitu cAMP. Jako další příklad takového účinku lze uvést zvýšení účinku látky, která zvyšuje účinnost cAMP, zvyšuje aktivitu cAMP, snižuje hladinu degradace cAMP nebo snižuje hladinu inhibice cAMP.
• ·
Jako příklad přídavného činidla, které může účinkovat jako PcAMP je možno uvést I:PDE, jako I:PDEII.
cAMP mimetika
Pro některé aspekty tohoto vynálezu může přídavné činidlo působit jako cAMP mimetikum.
Pod pojmem cAMP mimetikum se rozumí činidlo, které může působit podobným způsobem (například může mít podobný biologický profil a účinek) jako cAMP v ženských genitáliích, přičemž dochází k jednomu nebo většímu počtu z následujících jevů: zvýšení účinnosti entit podobných cAMP, zvýšení hladiny entit podobných cAMP, zvýšení aktivity entit podobných cAMP, snížení hladiny degradace entit podobných cAMP a snížení hladiny inhibice entit podobných cAMP.
Jako příklad cAMP mimetika je možno uvést forskolin. Bylo zjištěno, že forskolin zvyšuje prokrvení vagíny a klitoris, a může tedy působit také jako vaginální relaxant.
V přednostním provedení se cAMP mimetikum podává perorálně.
Aktivátor cAMP
Pod pojmem aktivátor cAMP se rozumí látka, která kontroluje nebo uvolňuje cAMP v genitáliích ženy. Kontrola může být přímá (například nad cAMP samotnou) nebo nepřímá (například aktivací cAMP). Pro zjednodušení tyto látky označujeme jako AcAMp.
> 4 «44 444 • 444 444 ♦· ··» 4· 4444
Cíl
Pod pojmem cíl se rozumí jakákoliv látka, která je cAMP, AcAMp, IcAMp nebo AMcAMp. Jinak vyjádřeno, cíl podle vynálezu může být označován jako Pc^p cíl.
Cílem podle vynálezu a/nebo přídavným cílem může být aminokyselinová sekvence a/nebo nukleotidová sekvence, která ji kóduje a/nebo expresní jednotka zodpovědná za její expresi a/nebo její modulátor.
Činidlo
Činidlem podle vynálezu může být jakékoliv činidlo, které působí jako Pc^p·
Činidlo (tj. činidlo podle vynálezu a/nebo přídavné činidlo) může být aminokyselinovou sekvencí nebo jejím chemickým derivátem. Látkou může být dokonce organická sloučenina nebo jiná chemická sloučenina. Činidlem může být i nukleotidová sekvence, která může být pozitivní i negativní. Činidlem může být také protilátka.
Jako neomezující příklad pojmu činidlo lze uvést sloučeninu, kterou lze získat nebo vyrobit z jakéhokoliv vhodného zdroje, at již přírodního či nikoliv.
Činidlo je možno zkonstruovat nebo získat z knihovny sloučenin, které mohou zahrnovat peptidy, jakož i jiné sloučeniny, jako malé organické molekuly, jako jsou sloučeniny olova.
Činidlem mohou například být přírodní látka, biologická makromolekula nebo extrakt vyrobený z biologických materiálů, jako bakteriálních, fungálních nebo živočišných
• · · · · · <· ··· · · · ··· (zejména savčích) buněk nebo tkání, organická nebo anorganická molekula, syntetické činidlo, semisyntetické činidlo, strukturní nebo funkční mimetikum, peptid, peptidomimenikum, derivatizované činidlo, peptid vyštěpený z úplného proteinu nebo peptid získaný synteticky (jako například za použití syntetizátoru peptidů nebo postupů genového inženýrství nebo jejich kombinací), rekombinantní činidlo, protilátka, přírodní nebo nepřirodní činidlo, fúzní protein nebo jeho ekvivalent a jejich mutanty, deriváty nebo jejich kombinace.
Činidlem může být jediná entita nebo kombinace činidel.
Pokud je činidlem organická sloučenina, potom při některých aplikacích, jako když je činidlem I:NEP, tato organická sloučenina obvykle může obsahovat amidovou skupinu (tj. -N(H)-C(O)~ či -C(O)-N(H)-) a jednu nebo více hydrokarbylskupin. Pod pojmem hydrokarbylskupina se rozumí skupina obsahující alespoň uhlík a vodík, která popřípadě může obsahovat jeden či více jiných vhodných substituentů. Jako příklady takových substituentů je možno uvést halogen, alkoxyskupinu, nitroskupinu, alkylskupinu, cyklickou skupinu atd. Kromě možnosti, že substituetem bude cyklická skupina, mohou cyklickou skupinu tvořit kombinace substituentů. Pokud hydrokarbylskupina obsahuje více než jeden uhlík, potom tyto uhlíky nemusí být nutně vzájemně spojeny. Alespoň dva atomy uhlíku mohou být například spojeny přes vhodný prvek nebo vhodnou skupinu. Hydrokarbylskupina tedy může obsahovat heteroatomy. Vhodnými heteroatomy, které budou odborníku v tomto oboru zřejmé, jsou například síra, dusík a kyslík. Při některých aplikacích činidlo přednostně obsahuje alespoň jednu cyklickou skupinu. Při některých aplikacích činidlo přednostně obsahuje alespoň jednu cyklickou skupinu vázanou k další hydrokarbylové skupině amidovou vazbou. Příklady takových sloučenin jsou uvedeny v příkladech provedení.
Pokud je činidlem organická sloučenina, potom při některých aplikacích, jako když je činidlem I:PDE, tato organická sloučenina obvykle může obsahovat dvě nebo více vázaných hydrokarbylových skupin. Při některých aplikacích činidlo přednostně obsahuje alespoň dvě cyklické skupiny, přičemž jedna z nich může být anelovanou cyklickou kruhovou strukturou. Při některých aplikacích je přednostně alespoň jedna z cyklických skupin heterocyklická. Při některých aplikacích heterocyklická skupina přednostně obsahuje v kruhu alespoň jeden dusík. Příklady takových sloučenin jsou uvedeny v příkladech provedení.
Pokud je činidlem organická sloučenina, potom při některých aplikacích, jako když je činidlem I:NPY, tato organická sloučenina obvykle může obsahovat dvě nebo více vázaných hydrokarbylových skupin. Při některých aplikacích činidlo přednostně obsahuje alespoň dvě cyklické skupiny, přičemž popřípadě jedna z nich může být anelovanou cyklickou kruhovou strukturou. Při některých aplikacích je přednostně alespoň jedna z cyklických skupin heterocyklická. Při některých aplikacích heterocyklická skupina přednostně obsahuje alespoň jeden dusík v kruhu. Příklady takových sloučenin jsou uvedeny v příkladech provedení.
Činidlo může obsahovat halogenskupiny. Pod pojmem halogen se rozumí fluor, chlor, brom nebo jod.
Činidlo může obsahovat jednu nebo více z alkyl-, alkoxy-, alkenyl-, alkylen- a alkenylenskupin, které mohou mít řetězec nerozvětvený nebo rozvětvený.
Činidlo může mít formu farmaceuticky vhodné soli, jako adiční soli s kyselinou nebo soli s bází, nebo formu jejich solvátu, včetně hydrátu. Přehled vhodných solí viz Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1 až 19.
Vhodné adiční soli s kyselinami vznikají s kyselinami, které tvoří netoxické soli. Jako příklady takových solí je možno uvést hydrochloridové, hydrobromidové, hydrojodidové, sulfátové, hydrogensulfátové, nitrátové, fosfátové, hydrogenfosfátové, acetátové, maleátové, fumarátové, laktátové, tartrátové, citrátové, glukonátové, sukcinátové, sacharátové, benzoátové, methansulfonátové, ethansulfonátové, benzensulfonátové, p-toluensulfonátové a pamoátové soli.
Vhodné soli s bázemi vznikají s bázemi, které tvoří netoxické soli. Jako příklady takových solí je možno uvést soli sodné, draselné, hlinité, vápenaté, hořečnaté, zinečnaté a diethanolaminové.
Farmaceuticky vhodné soli činidel podle vynálezu je možno snadno připravovat tak, že se smísí roztok činidla a roztok příslušné kyseliny nebo báze. Sůl je možno z roztoku vysrážet a shromáždit filtrací nebo ji lze izolovat odpařením rozpouštědla.
Činidlo může být v polymorfní formě.
Činidlo může obsahovat jeden nebo větší počet asymetrických atomů uhlíku, a může se tedy vyskytovat ve dvou či více stereoisomerních formách. Činidlo, které obsahuje alkenylskupinu nebo alkenylenskupinu, může také tvořit (E) a (Z) isomery. Předmětem vynálezu jsou jednotlivé stereoisomery činidla, a v případě, že je to možné i tautomery, a jejich směsi.
Separaci diastereomerů nebo cis a trans isomerů je možno provádět za použití obvyklých postupů, například frakční krystalizací, chromatografíí nebo vysoceúčinnou kapalinovou chromatografíí stereoisomerní směsi činidla nebo • ·
999 jeho vhodné soli nebo derivátu. Individuální enantiomer činidla je také možno připravit z odpovídajícího opticky čistého meziproduktu nebo štěpením, jako vysoceúčinnou kapalinovou chromatografii odpovídajícího racemátu za použití vhodného chirálního nosiče nebo frakční krystalizací diastereomerních solí vytvořených reakcí odpovídajícího racemátu s vhodnou opticky aktivní kyselinou nebo bází.
Do rozsahu vynálezu také spadají isotopové varianty činidel nebo jejich farmaceuticky vhodných solí. Isotopová varianta činidla podle vynálezu nebo jeho farmaceuticky vhodné soli je definována jako činidlo nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl, v nichž je alespoň jeden atom nahrazen atomem se stejným atomovým číslem, ale s atomovou hmotností odlišnou od atomové hmotnosti s jakou se obvykle nachází v přírodě. Jako příklady isotopů, které je možno začlenit do činidel a jejich farmaceuticky vhodných solí, je možno uvést isotopy vodíku, uhlíku, dusíku, kyslíku, fosforu, fluoru a chloru, jako je 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 170, 31P, 32P, 35s, 18F a 36C1. Určité isotopově značené varianty činidel a jejich farmaceuticky vhodných solí, například značené radioaktivními isotopy, jako 3H nebo 14C, jsou užitečné při zkouškách distribuce léčiva nebo substrátu v tkáních. Zvláštní přednost se dává tritiovaným isotopům tj. H, a C isotopům, jelikož je lze snadno připravovat a detekovat. Nahrazením těžšími isotopy, jako deuteriem, tj.
O
H, je možno dosáhnout určitých terapeutických výhod vyplývajících z vyšší metabolické stability, například prodloužení poločasu in vivo nebo snížení potřebných dávek, čemuž se za určitých okolností dává přednost. Isotopové varianty činidel a jejich farmaceuticky vhodný solí lze připravovat obvyklými způsoby za použití vhodných isotopových variant vhodných reagentů.
Odborníkům v tomto oboru bude zřejmé, že činidlo může být odvozeno od proléčiva. Jako příklady proléčiv je možno uvést entity, které obsahují některou chráněnou skupinu nebo některé chráněné skupiny a které nemusí vykazovat farmakologickou aktivitu jako takové, ale v některých případech mohou být podávány (jako perorálně nebo parenterálně), a poté v organismu metabolizovány za vzniku činidla, které je farmakologicky aktivní.
Na vhodné funkční skupiny činidel lze zavést určité zbytky, známé jako pro-zbytky, které jsou například popsány v publikaci Desing of Prodrugs, H. Bundgaard, Elsevier,
1985 (která je zde citována náhradou za přenesení celého jejího obsahu do tohoto textu). Taková proléčiva taktéž spadají do rozsahu tohoto vynálezu.
pcAMP může vyhazovat kteroukoliv nebo kterékoliv z následujících aktivit: přímé nebo nepřímé zvyšování účinnosti cAMP, přímé nebo nepřímé zvyšování hladiny cAMP, přímé nebo nepřímé zvyšování aktivity cAMP, přímé nebo nepřímé snižování hladiny degradace cAMP, a přímé nebo nepřímé snižování hladiny inhibice cAMP.
V přednostním provedení činidlo podle vynálezu přímo nebo nepřímo zvyšuje hladinu cAMP v genitáliích ženy trpící FSAD.
Činidlo podle vynálezu výhodněji přímo nebo nepřímo selektivně zvyšuje hladinu cAMP v genitáliích ženy trpící FSAD.
Výhodněji činidlo podle vynálezu přímo nebo nepřímo selektivně zvyšuje hladinu cAMP, přičemž cAMP je cAMP indukovaný sexuálním vzrušením.
• · » «· · »· ·· • · ·· · · »· ··»* • « *·· » · · • « ··· ··· ««·· ··· *a ««· ·· ·.··
Ve vysoce přednostním provedení tohoto vynálezu činidlo podle vynálezu zvyšuje relativní množství cAMP indukovaného sexuálním vzrušením.
Při některých aplikacích činidlo podle vynálezu selektivně léčí FSAD.
Podle jednoho aspektu činidlo může inhibovat nebo antagonizovat vhodný cíl, přičemž potencuje hladinu cAMP v genitáliích ženy. V tomto textu se pod pojmem inhibitor rozumí inhibitor a/nebo angatonista.
Podle dalšího aspektu činidlo může aktivovat nebo agonizovat vhodný cíl, přičemž potencuje hladinu cAMP v genitáliích ženy. V tomto textu se pod pojmy aktivátor a pozitivní regulátor rozumí aktivátor a/nebo pozitivní regulátor a/nebo agonista.
Činidlo tedy může agonizovat, antagonizovat, pozitivně regulovat nebo inhibovat vhodný cíl.
Činidlo podle vynálezu může být jedinou entitou, která je schopna vykazovat dvě nebo více z těchto vlastností. Alternativně, či navíc, může činidlo podle vynálezu představovat kombinaci činidel, které jsou schopné vykazovat jednu nebo více z těchto vlastností.
Činidlo přednostně může selektivně agonizovat, selektivně antagonizovat, selektivně pozitivně regulovat nebo selektivně inhibovat vhodný cíl.
V přednostním provedení činidlo může selektivně agonizovat, selektivně antagonizovat, selektivně pozitivně regulovat nebo selektivně inhibovat selektivní vhodný cíl.
»« t I ·· · • 0*0 «0*0 0 0 0
0000 0000 0 0 00· 000
0000 000 00 0«0 ·♦ *0
Činidlo také může být schopno vykazovat jednu nebo více z dalších kladných funkčních vlastností. Činidlo podle vynálezu například může potencovat cAMP a také potencovat cGMP.
Při některých aplikacích (jako při topickém podávání) může činidlo také vykazovat inhibiční účinek na ACE (angiotensin konvertující enzym). Zkouška na ACE je uvedena v příkladech provedení. Při některých aplikacích (zejména u některých typů pacientů) taková činidla (tj. činidla, která vykazují inhibiční účinek na ACE) nemusí být vhodná pro perorální podávání.
Při některých aplikacích může činidlo vykazovat inhibiční účinek na EDE (endothelin konvertující enzym). Zkoušky na ECE jsou v tomto oboru dobře známy.
Farmaceutické kombinace
Činidlo podle vynálezu lze použít v kombinaci s jedním činidlem nebo větším počtem činidel, jako je Pcqj4p (jako inhibitor fosfodiesterasy typu 5, například sildenafil nebo donor oxidu dusnatého nebo prekursor oxidu oxidu dusnatého, například L-arginin nebo inhibitory arginasy) a/nebo centrálně působící farmaceutika (například agonista receptoru dopaminu, jako apomorfin nebo selektivní agonista receptoru dopaminu D2, jako PNU-95666 nebo agonista receptoru melanokortinu, jako melanotan II). Použití apomorfinu jako farmaceutika je možno nalézt v US-A-5945117. Podle tohoto dokumentu je apomorfin podáván sublinguálně. Navíc, nebo alternativně, je činidla možno použít v kombinaci s jednou nebo větším počtem látek, kterými jsou: inhibitor PDE5 (například sildenafil, vardenafil (Bayer BA 38-9456) a IC351 (Cialis, Icos Lilly), jeden nebo více donorů oxidu dusnatého (například NMI-921), jeden nebo více agonistů
receptoru dopaminu (například apomorfin, Uprima, Ixsen), jeden nebo více heterocyklických aminů, jako jsou heterocyklické aminy genericky a specificky popsané ve WO 00/40226, konkrétně v příkladech č. 7, 8 a 9, jeden nebo více agonistů receptoru melanokortinu (například Melanotan II nebo PT14), jeden nebo více otevíračů draslíkového kanálu (například otevírač kanálu KATp (například minoxidil, nikorandil) a/nebo vápníkem aktivovaný otevírač draslíkového kanálu (například BMS-204352), nebo jeden nebo více antagonistů αΐ-adrenoceptoru (například fentolamin, Vasofem, Vasomax), jeden nebo více agonistů receptorů VIP nebo analogů VIP (například Ro-125-1553) nebo fragmentů VIP, jeden nebo více antagonistů α-adrenoceptoru v kombinaci s VIP (například Invicorp, Aviptadil), jeden nebo více antagonistů a2-adrenoceptoru (například yohimbin), jedno nebo více činidel pro terapeutickou substituci hormonu estrogenu, estrogenu a medroxyprogesteronu nebo medroxyprogesteronacetátu (MPA) nebo estrogenu a methyltestosteronu (například HRT, zejména Premarin, Cenestin, Oestrofeminal, Equin, Estrace, Estrofem, Elleste Solo, Estring, Eastraderm, Eastraderm TTS, Eastraderm Matrix, Dermestril, Premphase, Prempro, Prempak, Premique, Estratest, Estratest HS, Tibolone), jedno nebo více činidel pro substituci testosteronu (jako DHEA (dehydroandrostendion), testosteron (Tostrelle) nebo testosteronový implantát (Organon)), jedno nebo více testosteronových/estradiolových činidel, jeden nebo více agonistů estrogenu, například Lasofoxiden, jeden nebo více agonistů nebo antagonistů receptoru serotoninu (například agonistů a antagonistů receptoru 5HT1A, 5HT2C, 5HT2A a 5HT3, jak jsou popsány ve W02000/28993), jeden nebo více agonistů receptoru prostanoidu (například Muse, alprostadil, misoprostol), jeden nebo více agonistů purinergického receptoru (zejména P2Y2 a P2Y4), jedno nebo více antidepresivních činidel (například bupropion (Willbutrin), mirrtazapin, nefazodon).
• · • · ·· · ··· · · · ·
-32- .* ! ' S ! ! * ! ! .' ···· ··· ·· ··· ·· ····
Struktura IC351 odpovídá následujícímu vzorci
IC351 (Icos Lilly)
Pokud je podávána kombinace aktivních činidel, lze tato činidla podávat simultánně, odděleně nebo posloupně.
Kombinace s VIP
Činidlem podle tohoto vynálezu není VIP (nebo přednostně jeho analog nebo fragment). Podle některých provedeních však činidlo podle vynálezu může být podáváno spolu s VIP nebo jeho analogem nebo fragmentem.
Ve vysoce přednostním aspektu VIP nebo jeho analog nebo jeho fragment není podáván. Důvodem je informace, že infuze VIP vedou ke značným kardiovaskulárním škodlivým účinkům, jako je zvýšení srdeční frekvence a snížení diastolického arteriálního tlaku (Ottesen 1983, 1987, 1995).
Kromě toho, i když Ottesen a spolupracovníci demonstrovali, že VIP u zdravých dobrovolníků indukuje zvýšení vaginálního prokrvení a lubrikaci, mechanismus jakým VIP dosahuje těchto účinků není jasný. V literatuře je uvedena řada příkladů VIP signalizace přes různé systémy druhých poslů, jako je například cGMP/guanylát cyklasa (Ashur-Fabian, 1999); oxid uhelnatý (CO)/hem oxygenasa (Fan et al., 1998) a cAMP/adenylát cyklasa (Foda, 1995; Shoeffter, 1985; Gu, 1992). To je doloženo příklady uvedenými v nedávné zprávě,
která popisuje jak lze vysvětlit vasorelaxační účinky VIP v děložní artérii uvolňováním oxidu dusnatého (Jovanovic, 1998). Existuje tedy důkaz pro VIP modulaci oxidu dusnatého (NO)/cGMP při urogenitálních funkcích samců (Kim, 1994).
V literatuře se dále uvádí, že VIP neovlivňuje hladinu cAMP v kulturách buněk hladkého svalu vagíny (viz Traish, A., Moreland, R. B., Huang, Y. , et al., 1999, Development of human and rabbit vaginal smooth muscle cell cultures: Effects of vasoactive agents on intracellular levels of cyclic nucleotides, Mol. Cell. Biol. Res. Comm., 2, 131 až 137).
Ottesen a spolupracovníci v následných studiích (viz Palle, Bredkjaer, Ottesen a Fahrenkrug, 1990 Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, sv. 17, 61 - 68) uvádějí, že účinek VIP na vaginální prokrvení je bez ohledu na způsob podávání součást systemického vasodilatačního účinku, a nikoliv místní odpověď. Kromě toho uvádějí řadu vaskulárních vedlejších účinků spojených s VIP - viz flush, hypotenze a tachykardie.
Hodnoty K^
Pro některé aplikace má činidlo podle vynálezu (a popřípadě případné přídavné činidlo) přednostně hodnotu K^ méně než asi lOOnM, výhodněji méně než asi 75nM, výhodněji méně než asi 50nM, výhodněji než asi 25nM, výhodněji než asi 20nM, výhodněji než asi 15nM, výhodněji než asi lOnM a ještě výhodněji méně než asi 5nM.
Hodnoty Kb
Pro některé aplikace má činidlo podle vynálezu (a popřípadě případné přídavné činidlo) přednostně hodnotu Kb
méně než asi lOOnM, výhodněji méně než asi 75nM, výhodněji méně než asi 50nM, výhodněji než asi 25nM, výhodněji než asi 20nM, výhodněji než asi 15nM, výhodněji než asi lOnM a ještě výhodněji méně než asi 5nM.
Hodnoty Ka
Pro některé aplikace má činidlo podle vynálezu (a popřípadě případné přídavné činidlo) přednostně hodnotu Ka méně než asi lOOnM, výhodněji méně než asi 75nM, výhodněji méně než asi 50nM, výhodněji než asi 25nM, výhodněji než asi 20nM, výhodněji než asi 15nM, výhodněji než asi lOnM a ještě výhodněji méně než asi 5nM.
Farmakokinetika
Při některých provedeních činidla podle tohoto vynálezu (a popřípadě případná přídavná činidla) mají přednostně log D -2 až +4, výhodněji -1 až +2. Hodnotu log D je možno stanovit standardními postupy, které jsou v tomto oboru známy, které jsou například popsány v J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42, 144.
Navíc, nebo alternativně, při některých provedeních činidla podle tohoto vynálezu (a popřípadě případná přídavná činidla) přednostně vykazují caco-2 flux vyšší než 2 χ 10-6 cm.s-1, výhodněji vyšší než 5 χ 10-6 cm.s-1. Hodnotu caco-2 flux je možno stanovit standardními postupy známými v tomto oboru, jako je postup uvedený v J. Pharm. Sci. 79, 7, str.
595 až 600 (1990) a Pharm. Res. sv. 14, č. 6 (1997).
Selektivita
Při některých aplikacích činidlo podle vynálezu (a popřípadě případné přídavné činidlo) vykazuje alespoň sto- 35 násobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň stopadesátinásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň dvousetnásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň dvěstěpadesátinásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň třistanásobnou selektivitu na požadovaný cíl, a přednostně alespoň třistapadesátinásobnou selektivitu na požadovaný cíl.
Při některých aplikacích činidlo podle vynálezu (a popřípadě případné přídavné činidlo) vykazuje alespoň čtyřistanásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň pětisetnásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň šestisetnásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň sedmisetnásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň osmisetnásobnou selektivitu na požadovaný cíl, přednostně alespoň devídisetnásobnou selektivitu, a přednostně alespoň tisícinásobou selektivitu na požadovaný cíl.
Způsoby chemické syntézy
Činidlo se obvykle bude připravovat chemickou syntézou.
Činidlo nebo cíl nebo jejich varianty, homology, deriváty, fragmenty nebo mimetika je možno připravovat za použití plně nebo částečně chemických způsobů. Například peptidy je možno syntetizovat postupy v pevné fázi, vyštěpením z pryskyřice a přečištěním preparativní vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií (například Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY, USA). Složení syntetických peptidů je možno potvrdit analýzou aminokyselin nebo sekvenováním (například Edmanův degradační postup; Creighton viz výše).
Činidla nebo jeho varianty, homology, deriváty, fragmenty nebo mimetika je možno přímo syntetizovat za použití různých postupů v pevné fázi (Roberge JY et al., 1995, Science 269: 202 až 204) a automatizovanou syntézu lze provádět například za použití syntetizátoru peptidů ABI 43 1A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) v souladu s instrukcemi poskytovanými výrobcem. Kromě toho lze za účelem výroby varianty činidla nebo cíle, jako je například varianta NEP, aminokyselinové sekvence zahrnující činidlo nebo kteroukoliv jeho část během přímé syntézy chemicky modifikovat a/nebo kombinovat za použití sekvence z jiných podjednotek nebo kterékoliv jejich části.
V alternativním provedení je kódující sekvenci činidla, cíle nebo jejich variant, homologů, derivátů, fragmentů nebo mimetik zcela nebo zčásti syntetizovat za použití chemických způsobů známých v tomto oboru (viz Caruthers Μ. H. et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 215 až 223, Horn T., et al., (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225 až 232).
Mimetikum
Pod pojmem mimetikum se v tomto textu rozumí kterákoliv chemická látka, jejímiž neomezujícími příklady jsou peptidy, polypeptidy, protilátky nebo jiné organické chemické látky, které vzhledem k cíli vykazují stejnou kvalitativní aktivitu nebo účinek jako uvedené činidlo.
Chemický derivát
Pojem derivát nebo derivatizovaný se vztahuje k chemické modifikaci činidla. Jako ilustrativní příklady takových chemických modifikací je možno uvést nahrazení
3Ί
atomu vodíku atomem halogenu, alkylskupinou, acylskupinou nebo aminoskupinou.
Chemické modifikace
Podle jednoho provedení tohoto vynálezu činidlo může být chemicky modifikovaným činidlem.
Chemická modifikace činidla může bud’ posílit nebo zeslabit vodíkové vazebné interakce, iontové interakce, hydrofobní interakce, Van Der Waalsovy interakce nebo dipólové reakce mezi činidlem a cílem.
Podle jednoho aspektu identifikované činidlo může účinkovat jako model (například templát) pro vývoj jiných sloučenin.
Rekombinantní postupy
Cíl pro použití při zkouškách podle vynálezu je obvykle možno připravit postupy genového inženýrství.
Potenciace cGMP
Pod pojmem potenciace se ve vztahu k cGMP rozumí jeden nebo větší počet z následujících jevů: zvýšení účinnosti cGMP, zvýšení hladiny cGMP, zvýšení aktivity cGMP, snížení hladiny degradace cGMP a snížení hladiny inhibice cGMP.
Potenciační účinek může být přímý. Alternativně tento účinek může být účinkem sekundárním a/nebo účinkem ve směru toku (downstream effect).
V přednostním provedení činidlo, které potencuje cGMP působí na IcGmp a/nebo AMcGMp, přičemž modulátor cGMP má negativní účinek na cGMP, takže činidlo snižuje a/nebo eliminuje a/nebo překrývá (maskuje) a/nebo odvrací nežádoucí účinek Icqmp a/nebo AMcGMp na cGMP.
Předmětem vynálezu je tedy kombinace jednoho nebo více I:ICA]y[p a jednoho nebo více I:IcGMp. V jednom provedení I:IcGMP Íe I:PDEcGMP· TCAMP a/nebo AMcAMp
Ukázali jsme, že cAMP zprostředkovává prokrvení genitálií (například vagíny nebo klitoris) a posílením cAMP signalizace můžeme zvýšit prokrvení genitálií (například vagíny nebo klitoris) u zvířecího modelu. Činidlo, které pozitivně reguluje/posiluje vasorelaxaci zprostředkovanou cAMP tedy bude účinné při léčení FSAD. Látky ICA]v[p a AMcAMp mají negativní účinek na hladinu nebo aktivitu cAMP. Pro zjednodušení tyto látky označujeme jako Ισ^Ρ a/nebo AMcAMp.
Vzhledem k výše uvedenému, činidlem může být I·icAMP a/nebo I:ΑΜθ^Μρ·
Činidlo může být jedinou entitou, která je schopna vykazovat dvě nebo více z těchto vlastností. Alternativně, či navíc, může činidlo podle vynálezu představovat kombinaci činidel, které jsou schopné vykazovat jednu nebo více z těchto vlastností.
Jako příklady Ις^ρ a AMcAMp je možno uvést NEP a jednu nebo více PDE nebo jakoukoliv složku, která je s nimi sdružena. Touto sdruženou složkou může například být receptor a/nebo kofaktor.
Činidlo podle vynálezu je tedy možno používat spolu s jednou nebo více látkami zvolenými ze souboru sestávajícího z I:PDEcAMp, I:NPY (někdy označován jako NPYi) a I:NPY Yn (někdy označován jako NPY YnI).
V tomto případě podobně platí, že činidlo může být jedinou entitou, která je schopna vykazovat dvě nebo více z těchto vlastností. Alternativně, či navíc, může činidlo podle vynálezu představovat kombinaci činidel, které jsou schopné vykazovat jednu nebo více z těchto vlastností.
I:IcAMP a/nebo I:AMcAMP
V souvislosti s tímto vynálezem se zjistilo, že FSAD je možno léčit nebo ji lze předcházet za použití činidla, které snižuje a/nebo eliminuje a/nebo překrývá a/nebo odvrací nežádoucí účinek IcA^P a/nebo AMcAMp na cAMP. Činidlo může dokonce obnovit hladinu cAMP, která byla snížena působením IcamP a/nebo AMcAMp. Pro zjednodušení tyto látky označujeme jako I: IcA]v[p a/nebo I:AMQAMp.
Podle jednoho přednostního aspektu je činidlem I:IcAMP a/nebo I:AMCAMP' kde ^cAMP negativní účinek na AMcAMP· AcAMP
V souvislosti s tímto vynálezem jsme zjistili, že jednou z důležitých příčin FSAD je nízká hladina nebo nízká aktivita cAMP v genitáliích ženy.
Činidlem tedy může být U:AcAMp.
Činidlo podle vynálezu tedy přednostně může být schopno působit jako jedna nebo více látek zvolených z A:AC, · 44 4 44 44
444 4 444 4 44 4
4 444 444
4444 444 44 444 44 4444
A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr nebo I:I:VIPn a/nebo je činidlo podle vynálezu možno použít spolu s jednou nebo větším počtem výše uvedených látek.
Činidlo může být jedinou entitou, která je schopna vykazovat dvě nebo více z těchto vlastností. Alternativně, či navíc, může činidlo podle vynálezu představovat kombinaci činidel, které jsou schopné vykazovat jednu nebo více z těchto vlastností.
U:AcAMP
V jiném provedení přídavným cílem může být složka, která zvyšuje hladinu cAMP. Činidlo tedy také může působit jako U:AC.
Činidlo podle vynálezu může také být schopno působit například jako kterékoliv jedno činidlo nebo více činidel, přičemž tímto činidlem může být kterákoliv jedna látka zvolená z U:AcAMp, A:AC, A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr nebo I:I:VIPn a/nebo je činidlo podle vynálezu možno použít spolu s jedním takovým činidlem nebo větším počtem takových činidel.
Cílem může například být cAMP samotný nebo AC nebo VIP (nebo jejich kombinace).
Kombinace I:IcAMP a/nebo I:McAMp a/nebo U:AcAMp
Podle dalšího aspektu je činidlo podle vynálezu možno použít s kombinací potenciátorů cAMP. Činidlo podle vynálezu je tedy například možno použít v kombinaci s jednou látkou nebo více látkami zvolenými z
I:PDEcAMp I:PDEncAMp I:NPY I:NPY Yn
I:NEP U:AcAMP A:AC
A:VIPr
A:VIPn
I:I:VIPr
I:I:VIPn a cAMP mimetik.
Inhibitor
Pod pojmem inhibitor, jak se ho používá v tomto textu v souvislosti s činidlem podle vynálezu, se rozumí činidlo, které snižuje a/nebo eliminuje a/nebo zakrývá a/nebo zabraňuje negativnímu působení IcAMP a/nebo negativnímu působení McAMp na cAMP.
Aktivátor
Pod pojmem aktivátor, jak se ho používá v tomto textu v souvislosti s činidlem podle vynálezu, se rozumí činidlo, které zvyšuje a/nebo produkuje a/nebo odkrývá a/nebo zvětšuje a/nebo zajištuje působení cAMP a/nebo AcAMp. Aktivátor může působit jako agonista.
Jiné aktivní složky
Podle dalšího aspektu může činidlo podle vynálezu dokonce být v kombinaci s jednou nebo více jinými aktivními složkami, jako je jedno nebo více činidel schopných potencovat cGMP.
• 0 ··
Aminokyselinová sekvence
Pojem aminokyselinová sekvence, jak se ho používá v tomto textu, je synonymní s pojmem polypeptid a/nebo pojmem protein. V některých případech je pojem aminokyselinová sekvence synonymem pojmu peptid. V některých případech je pojem aminokyselinová sekvence synonymem pojmu protein.
Aminokyselinovou sekvenci je možno připravit izolací s vhodného zdroje, nebo ji lze vyrobit synteticky nebo za použití postupů genového inženýrství.
Podle jednoho aspektu je předmětem vynálezu aminokyselinová sekvence, která je schopna působit jako cíl při zkouškách v rámci identifikace jednoho nebo většího počtu činidel a/nebo jejich derivátů, které jsou schopny ovlivnit aminokyselinovou sekvenci za účelem potenciace cAMP pro léčení FSAD.
Nukleotidová sekvence
Pojem nukleotidová sekvence, jak se ho používá v tomto textu, je synonymní s pojmem polynukleotid.
Nukleotidovou sekvencí může být DNA nebo RNA genomová nebo syntetická nebo rekombinantního původu. Nukleotidová sekvence může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová, která může představovat negativní nebo pozitivní řetězec nebo jejich kombinace.
Při některých aplikacích je nukleotidovou sekvencí přednostně DNA.
a · • • • • · • • a ·« 9 9 9
• • • • • · • a • • •
• * • • • • • 9
··· • · ··♦ • · 99 99
Při některých aplikacích se nukleotidová sekvence připraví za použití postupů rekombinace DNA (např. rekombinantní DNA) .
Při některých aplikacích je nukleotidovou sekvencí přednostně cDNA.
Při některých aplikacích se dává přednost nukleotidové sekvenci, která v tomto ohledu může být shodná se sekvencí, která se vyskytuje v přírodě.
Podle jednoho aspektu je předmětem vynálezu nukleotidová sekvence kódující látku schopnou působit jako cíl při při zkoušce (jako jako kvasinkové dvou hybridové zkoušce, kterou se identifikuje jedno činidlo nebo větší počet činidel a/nebo jejich derivátů, které jsou schopné ovlivnit látku, aby potencovala cAMP při léčení FSAD.
Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že cíle může kódovat řada různých nukleotidových sekvencí, což je následek degenerace genetického kódu. Lze předpokládat, že odborník v tomto oboru je za použití rutinních postupů schopen provést substituce nukleotidů, které v podstatě neovlivní aktivitu kódovanou nukleotidovou sekvencí podle vynálezu, aby se projevilo využití kodonů jakéhokoliv konkrétního hostitelského organismu, v němž má být cíl exprimován. Pojem varianta, homolog nebo derivát uvedený v souvislosti s nukleotidovou sekvencí uvedenou v připojeném sekvenčním protokolu zahrnuje jakoukoliv substituci, variaci, modifikaci, nahrazení, deleci nebo adici jedné nukleové kyseliny nebo více nukleových kyselin z nebo do sekvence za vzniku výsledné nukleotidové sekvence, která kóduje funkční cíl podle vynálezu (nebo dokonce činidlo podle vynálezu, pokud toto činidlo zahrnuje nukleotidovou sekvenci nebo aminokyselinovou sekvenci).
• • 4 4 • 4 • · 44 4» • 4 44 4 4
• 4 4 • 4 4 4
• • 44 44 444 44 4444
Jak je naznačeno výše, co se týče homologie sekvencí, dává se přednost alespoň 75%, výhodněji alespoň 85%, ještě výhodněji alespoň 90% homologii vzhledem k sekvencím uvedeným v sekvenčním protokolu. Výhodnější je alespoň 95% a ještě výhodnější je alespoň 98 % homologie. Porovnání nukleotidové homologie lze provádět výše popsaným postupem. Přednostním programem pro porovnávání sekvencí je program GCG Wisconsin Bestfit popsaný výše. Implicitní bodovací matice přiřazuje hodnotu 10 každé shodě dvou stejných nukleotidů a hodnotu -9 každé neshodě. Implicitní penalizace vytvoření mezery je -50 a implicitní penalizace prodloužení mezery je -3 za každý nukleotid.
Předmětem vynálezu je také nukleotidová sekvence, která je schopna selektivní hybridizace se zde uvedenými sekvencemi, nebo jakoukoliv jejich variantou, fragmentem nebo derivátem, nebo jakýmkoliv jejich komplementem. Nukleotidové sekvence mají délku přednostně alespoň 15 nukleotidů, výhodněji alespoň 20, 30, 40 nebo 50 nukleotidů. Těchto sekvencí je také možno používat jako sond, například v diagnostických kitech.
Varianty/homology/deriváty
Kromě uvedených konkrétních aminokyselinových sekvencí a nukleotidových sekvencí je předmětem vynálezu také použití jejich variant, homologů a derivátů. Pojem homologie lze také vyjádřit jako shodu.
V tomto kontextu je za homologickou sekvenci brána aminokyselinová sekvence, která vykazuje alespoň 75%, 85% nebo 90% shodu, přednostně alespoň 95 nebo 98% shodu. Homologie by se měla obvykle měla brát v úvahu u těch oblastí sekvence, o nichž je známo, že jsou podstatné pro aktivitu. Ačkoliv homologie může být také chápána jako podobnost (například u aminokyselinových zbytků s podobnými chemickými vlastnostmi nebo funkcemi), v kontextu tohoto vynálezu jí přednostně rozumí homologie ve smyslu shody sekvence.
Porovnávání sekvencí s hlediska homologie je možno provádět odhadem, nebo obvykleji za použití snadno dostupných programů pro porovnávání sekvencí. Tyto počítačové programy dostupné na trhu jsou schopny vypočítat procento homologie mezi dvěma či více sekvencemi.
Procento homologie je možno vypočítat přes juxtaponované sekvence, tj. jedna sekvence se vyrovná s druhou sekvencí a každá aminokyselina v jedné sekvenci se porovná přímo s odpovídající aminokyselinou v druhé sekvenci, jeden zbytek ve stejnou dobu. Tento postup je označován jako seřazení sekvencí bez mezer (ungapped alignment). Obvykle se takové seřazení bez mezer provádí pouze u malého počtu zbytků.
Tento velmi jednoduchý a logický postup však selhává, má-li například brát v úvahu, že v jinak identickém páru sekvencí jedna inserce nebo delece vyvolá vyřazení následujících sekvencí z alignmentu. To v případě provádění celkového alignmentu potenciálně vede k velkému snížení procenta homologie.
Většina způsobů porovnávání sekvencí je tedy navržena tak, aby se dosáhlo optimálních alignmentů, které berou v úvahu možné inserce a delece, aniž by bylo přílišně penalizováno skóre homologie. Toho se dosáhne zaváděním mezer do sekvenčního alignmentu, čímž se zkouší maximalizovat místní homologie.
Tyto složitější postupy však přidělují mezerové penále každé mezeře, která se v alignmentu vyskytuje tak, že pro stejný počet identických aminokyselin, sekvenční alignment s co možná nejmenším počtem mezer - při reflexi vyšší příbuznosti dvou porovnávaných sekvencí - dosáhne vyššího skóre než alignment s řadou mezer. Obvykle se používá afinních hodnot mezery, které přiřazují relativně vysokou hodnotu existenci mezery a nižší penále každému následnému zbytku v mezeře. To je nejčastěji vypoužívaný systém vyhodnocování mezer. Vysoká penalizace mezer samozřejmě povede k optimalizovaným alignmentům s menším počtem mezer. Většina alignmentových programů umožňuje mezerové penále modifikovat. Avšak pokud se využívá takového software pro porovnávání sekvence, dává se přednost implicitním hodnotám. Například když se použije balíčku GCG Wisconsin Bestfit (viz dále) implicitní mezerové penále pro aminokyselinovou sekvenci je -12 za mezeru a -4 za každé prodloužení.
Výpočet maxima procentní homologie tedy nejprve vyžaduje přípravu optimálního alignmentu (seřazení), přičemž se berou v úvahu mezerové penalizace. Vhodným programem pro tento výpočet je balíček GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Jako neomezující příklady jiných software, které jsou schopny porovnávat sekvence, lze uvést balíček BLAST (viz Ausubel et al., 1999, tamtéž - kapitola 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403 až 410) a soupravu porovnávacích nástrojů GENENWORKS. Jak BLAST, tak i FASTA jsou rešeršovatelné offline i online (viz Ausubel et al., 1999, tamtéž, str. 7-58 až 7-60). Přednost se však dává programu GCG Bestfit. Pro porovnávání proteinu a nukleotidové sekvence je také dostupný nový nástroj,
BLAST 2 Sequences (viz FEMS Microbiol. Lett., 1999, 174(2):
247 až 250; FEMS Microbiol. Lett., 1999, 177(1): 187 až 188 a tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Ačkoliv konečné procento homologie je možno měřit jako shodu, proces alignmentu (seřazování) samotný obvykle není založen na párovém porovnání všechno nebo nic.
Namísto toho se obvykle používá vyvážené matice skóre podobnosti, která přiřazuje skóre každému párovému porovnání na základě chemické podobnosti nebo evoluční vzdálenosti. Jako příklad takové obvykle používané matice je možno uvést matici BLOSUM62 - implicitní matici pro programovou soupravu BLAST. Programy GCG Winconsin obvykle využívají buď obecných implicitních hodnot nebo tabulky zákaznických symbolů, pokud je dodána (další podrobnosti viz uživatelský manuál). U balíčku GCG se dává přednost použití obecných implicitních hodnot, nebo v případě jiného software implicitní matici, jako je BLOSUM62.
Jakmile software poskytne optimální seřazení, je možno vypočítat procento homologie, přednostně procento shody sekvence, což software obvykle provádí jako součást porovnání sekvencí a generuje číselný výsledek.
Sekvence také mohou obsahovat delece, inserce nebo substituce aminokyselinových zbytků, které vedou k tichým změnám, a funkčně ekvivalentní látce. Úmyslné substituce aminokyselin je možno provádět na základě podobnosti polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobicity, hydrofility a/nebo amfipatického charakteru zbytku, pokud zůstane zachována sekundární vazebná aktivita látky. Například jako negativně nabité aminokyseliny je možno uvést kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou; jako pozitivně nabité aminokyseliny lze jmenovat lysin a arginin; a aminokyselinami s nenabitými polárními hlavními skupinami s podobnými hodnotami hydrofobicity jsou například leucin, isoleucin, • ·
valin, glycin, alanin, asparagin, glutamin, serin, threonin, fenylalanin a tyrosin.
Konzervativní substituce je možno provádět například podle tabulky uvedené dále. Vzájemně se mohou nahrazovat aminokyseliny uvedené ve stejném okénku ve druhém sloupci a přednostně ve stejné řádce ve třetím sloupci.
Alifatické Nepolární GAP
I L V
Polární - nenabité C S T M
N Q
Polární - nabité D E
K R
Aromatické H F W Y
Do rozsahu vynálezu také spadají homologické substituce (jak pojmu substituce, tak pojmu nahrazení se používá pro označení výměny existujícího aminokyselinového zbytku za zbytek alternativní), k nimž může dojít, tj. substituce podobného zbytku za podobný, jako bázického za bázický, kyselého za kyselý, polárního za polární apod. Rovněž může dojít k nehomologické substituci, tj. náhradě zbytku z jedné třídy za zbytek z třídy jiné, nebo alternativně tato substituce zahrnovat začlenění nepřirozených aminokyselin, jako ornithinu (který je zde označován jako Z), diaminomáselné kyseliny ornithinu (označován jako B), norleucinu ornithinu (označován jako O), pyriylalaninu, thienylalaninu, naftylalaninu a fenylglycinu.
Pro nahrazení je také možno použít nepřirozených aminokyselin, jako alfa* a alfa-disubstituovaných* aminokyselin, N-alkylaminokyselin*, kyseliny mléčné*, halogenidových derivátů přirozených aminokyselin, jako trifluortyrosinu*, p-Cl-fenylalaninu*, p-Br-fenylalaninu*, p-I-fenylalaninu*, L-allylglycinu*, L-epsílon-aminokaproové kyseliny#, 7-aminoheptanové kyseliny*, L-methioninsulfonu*#, L-norleucinu*, L-norvalinu*, p-nitro-L-fenylalaninu* , L-hydroxyprolinu#, L-thioprolinu*, methylových derivátů fenylalaninu (Phe), jako je 4-methyl-Phe , pentamethyl-Phe , L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (methyl)*, L-Phe (4-isopropyl)*, L-Tic (1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylové kyselíny) , L-diaminopropionové kyselinyff a L-Phe (4-benzyl) .
s * a
Označeni bylo použito pro ucely předcházející diskuse (týkající se homologických nebo nehomologických substitucí), přičemž * označuje hydrofobní charakter derivátu, zatímco # označuje hydrofilní charakter derivátu, kombinace těchto znamínek (*#) označuje amfipatické vlastnosti.
Variantní aminokyselinové sekvence mohou obsahovat vhodné mezerníkové skupiny, které lze vložit mezi dva aminokyselinové zbytky sekvence. Takovými mezerníky mohou kromě aminokyselinových mezerníků, jako zbytků glycinu nebo β-ala- ninu, být alkylskupiny, jako methyl-, ethyl- nebo propylskupina. V další variantě je přítomen jeden aminokyselinový zbytek nebo větší počet aminokyselinových zbytků v peptoidní formě. Tento výraz bude sice odborníkům v tomto oboru dobře znám, ale z důvodů přehlednosti uvádíme jeho definici: pojmu peptoidní forma se používá pro označení variantních aminokyselinových zbytků, v nichž je substituent α-uhlíku vázán k dusíkovému atomu tohoto zbytku, a nikoliv k α-uhlíku. Způsob výroby peptidů v peptoidní formě je o sobě známý a lze ho nalézt například v Simon, R. J. et al., PNAS (1992) 89(20), 9362 až 9371 a Horwell, D.
C., Trends Biotechnol. (1995), 13(4), 132 až 134.
φ φ φ · φφ · · • φφφ · φφφ φ « · i φφ φφφ φ φ ·
-50- · Φ®#»®·##· > · φφ· φ · φ ···· φφφ φφ φφ· φφ φφφφ
Hybridizace
Předmětem vynálezu je dále použití sekvencí, které se mohou hybridizovat s cílovými sekvencemi uvedenými v tomto textu, jako v případě, že činidlo je pozitivní sekvence.
Pod pojmem hybridizace se rozumí způsob, jímž se řetězec nukleové kyseliny spojuje s komplementárním řetězcem prostřednictvím párování bází, jakož i způsob amplifikace, která se provádí PCR postupy (polymerasou katalyzované reakce).
Nukleotidové sekvence podle vynálezu, které jsou schopny selektivní hybridizace s nukleotidovými sekvencemi popsanými v tomto textu, nebo jejich komplementem, budou obvykle vykazovat alespoň 75%, přednostně alespoň 85% nebo 90%, a výhodněji alespoň 95% nebo 98% homologií s odpovídající komplementární nukleotidovou sekvencí uvedenou v tomto textu v oblasti o délce alespoň 20, přednostně alespoň 25 nebo 30, například alespoň 40, 60 nebo 100 nebo více sousedících nukleotidů. Přednostní nukleotidová sekvence podle vynálezu zahrnuje oblasti homologické s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 sekvenčního protokolu podle vynálezu, přednostně homologické z 80 nebo 90 %, výhodněji alespoň z 95 %, s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 v sekvenčním protokolu tohoto vynálezu.
Pojmem selektivně hybridizovatelná se rozumí, že nukleotidová sekvence, pokud se jí používá jako sondy, se používá za podmínek, o nichž bylo zjištěno, že umožňují hybridizaci cílové nukleotidové sekvence se sondou v úrovni významně vyšší, než je úroveň pozadí. K hybridizaci pozadí může dojít vzhledem k přítomnosti jiných nukleotidových sekvencí, například v knihovně cDNA nebo genomové DNA, která
je prohledávána. V tomto případě pozadí znamená hladinu signálu generovaného interakcí mezi sondou a nespecifickým DNA členem knihovny, který je méně než desetinásobně, přednostně méně než stonásobně intenzivnější než specifická interakce s cílovou DNA. Intenzitu interakce je možno například měřit radioaktivním značením sondy, například pomoci P.
Hybridizační podmínky jsou založeny na teplotě tání (Tt) vazebného komplexu nukleové kyseliny (viz Berger a Kimmel, 1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, sv. 152, Academie Press, San Diego, CA, USA) a propůjčují definovanou stringenci, jak je vysvětleno dále.
Maximální stringence se obvykle dosahuje při teplotě přibližně Tt-5°C (tj. při teplotě o 5’C nižší, než je teplota tání sondy); vysoké stringence při teplotě o asi 5 až 10°C nižší než Tt; střední stringence při teplotě o asi 10 až 20°C nižší než Tt; a nízké stringence při teplotě o asi 20 až 25°C nižší než Tt. Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že hybridizace za maximální strigence se bude používat pro identifikaci nebo detekci identických nukleotidových sekvencí, zatímco hybridizace za střední (nebo nízké) stringence je možno použít pro identifikaci nebo detekci podobných nebo příbuzných polynukleotidových sekvencí.
V přednostním aspektu do rozsahu vynálezu spadají nukleotidové sekvence, které se mohou hybridizovat s nukleotidovými sekvencemi podle vynálezu za stringentních podmínek (například 65°C a O,1XSSC (1XSSC = 0,15M chlorid sodný, 0,015M citran sodný, pH 7,0). V případě, že je nukleotidová sekvence podle vynálezu dvouřetězcová, do rozsahu vynálezu spadají oba řetězce duplexu, bud’ jednotlivě nebo v kombinaci. Pokud je nukleotidová sekvence jednoře0 · 0 0 · 0 0 0 ·· · • · · 9 « «9 ·
9 · · · 0 0«
999 9 «00 ·· ·0« ·9 0000 tězcová, do rozsahu vynálezu spadá také její komplementární sekvence.
Nukleotidové sekvence, které nejsou ze 100 % homologické se sekvencemi podle vynálezu, ale do rozsahu vynálezu spadají, je možno získat řadou způsobů. Jiné varianty zde popsaných sekvencí je možno získat například sondováním DNA knihoven z různých zdrojů. Kromě toho je možno získat jiné virové/bakteriální, nebo buněčné homology, zejména buněčné homology, které se nacházejí v savčích buňkách (například buňkách potkanů, myší, hovězího dobytka a primátů), a takové homology a jejich fragmenty jsou obvykle schopné selektivní hybridizace se sekvencemi uvedenými v připojeném sekvenčním protokolu. Takové sekvence lze získat sondováním cDNA knihoven nebo knihoven genomové DNA jiných druhů živočichů, a sondováním takových knihoven sondami, které obsahují celou nukleotidovou sekvenci popsanou v tomto textu nebo její část za podmínek střední až vysoké stringence. Výše uvedené lze podobně vztáhnout na získání druhových homologů a alelických variant aminokyselinových a/nebo nukleotidových sekvencí podle vynálezu.
Varianty a kmenové/druhové homology lze také získat za použití degenerované PCR, při níž se používá primerů vytvořených pro výběr sekvencí v rámci variant a homologů kódujících konzervované aminokyselinové sekvence v sekvencích podle tohoto vynálezu. Konzervované sekvence je například možno předvídat seřazením aminokyselinových sekvencí z několika variant/homologů. Sekvenční alignmenty je možno provádět za použití počítačového software, který je v tomto oboru znám. Takovým programem je například rozšířený program GCG Wisconsin PileUp. Primery, kterých se používá při degenerované PCR, obsahují jednu či více degenerovaných poloh a používají se za méně stringentních podmínek, než jsou
podmínky klonování sekvencí za použití jednosekvenčních primerů proti známým sekvencím.
Alternativně je nukleotidové sekvence možno získat místně cílenou mutagenezí charakterizovaných sekvencí, jako je nukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2 v přiloženém sekvenčním protokolu. To může být například užitečné v případě, že z důvodů optimalizace kodonových preferencí pro konkrétní hostitelskou buňku, v níž má být nukleotidová sekvence exprimována, jsou potřebné tiché změny kodonů. Jiné sekvenční změny mohou být žádoucí za účelem zavedení rozpoznávacích míst restrikčních enzymů nebo za účelem změny aktivity proteinu kódovaného nukleotidovou sekvencí.
Nukleotidové sekvence podle vynálezu je možno používat při produkci primeru, například PCR primeru, primeru pro alternativní amplifikační reakci, sondy, například sondy obvyklými postupy značené indikačními radioaktivními nebo neradioaktivními značkami, nebo je nukleotidové sekvence možno klonovat do vektorů. Takové primery, sondy a jiné fragmenty budou mít délku alespoň 15, přednostně alespoň 20, například alespoň 25, 30 nebo 40 nukleotidů, a rovněž spadají do rozsahu pojmu nukleotidová sekvence podle tohoto vynálezu, jak je definován v tomto textu.
Nukleotidové sekvence, jako DNA polynukleotidy a sondy podle vynálezu, je možno získat postupy genového inženýrství, synteticky nebo jakýmimikoliv způsoby, které jdou odborníkům v tomto oboru dostupné. Také je lze klonovat za použití standardních postupů.
Primery se obvykle získávají syntetickými postupy, což zahrnuje stupeň odborné výroby požadované nukleotidové sekvence po jednom nukleotidu. Tuto výrobu lze provádět za
0 00 0 00 00 • 000 0 0 0 0 0 00 0
000 »0 0
0 000 000 0000 000 00 000 00 0000 použití automatizovaných postupů, které jsou v tomto oboru snadno dostupné.
Delší nukleotidové sekvence se obvykle připravují za použití postupů genového inženýrství, například za použití PCR klonovacích technik. Při takovém postupu se nejprve připraví pár primerů (například o asi 15 až 30 nukleotidech) lemující oblast sekvence, která se má klonovat, primery se uvedou do styku s mRNA nebo cDNA získanou ze živočišných nebo lidských buněk, provede se polymerasová řetězová reakce (PCR) za podmínek, které vyvolávají amplifikaci požadované oblasti, amplifikovaný fragment se izoluje (například tak, že se reakční směs přečistí na agarosovém gelu) a izoluje se amplifikovaná DNA. Primery mohou být sestaveny tak, aby obsahovaly vhodná rozpoznávací místa pro restrikční enzymy, takže se amplikovaná DNA může klonovat do vhodného klonovacího vektoru.
Vzhledem k inherentní degeneraci genetického kódu je pro klonování a exprimování cílových sekvencí možno použít i jiných DNA sekvencí, které kódují v podstatě stejné nebo funkčně ekvivalentní aminokyselinové sekvence. Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že pro některé expresní systémy může být výhodné získat cílové sekvence s nepřirozenými kodony. Kodony preferované konkrétním prokaryontním nebo eukaryontním hostitelem (Murray E. et al., 1989, Nuc. Acids Res. 17: 477 až 508) mohou být například zvoleny tak, aby zvyšovaly cílovou expresi nebo produkovaly transkripty rekombinantní RNA, které oproti přirozené sekvenci vykazují požadované vlastnosti, jako delší poločas.
Expresní vektory
Nukleotidové sekvence pro použití jako cíl nebo pro expresi cíle je možno začlenit do rekombinantního replikova·· · ·· · ·· ·· • · · · » ♦ · · · · · · • · · · · · ♦ * « · · · · · · · · · • · ··· ·>· ···· ··· ·· ··· ·· ···· telného vektoru. Vektoru je možno použít pro replikaci a expresi nukleodidové sekvence v kompatibilní hostitelské buňce a/nebo z kompatibilní hostitelské buňky. Expresi je možno regulovat za použití regulačních sekvencí, které obsahují promotory/zesilovače a jiné expresní regulační signály. Je možno použít prokaryontních promotorů a promotorů, které působí v eukaryontních buňkách. Lze použít tkáňové specifických nebo stimulačně specifických promotorů. Také je možno použít chimérických promotorů, které obsahují části sekvencí ze dvou či více různých promotorů popsaných výše.
Protein produkovaný hostitelskou rekombinantní buňkou prostřednictvím exprese nukleotidové sekvence může být vyloučen nebo může zůstat obsažen uvnitř buňky v závislosti na použité sekvenci a/nebo použitém vektoru. Kódující sekvence je možno sestavit se signálními sekvencemi, které vedou sekreci látky kódující sekvence přes membránu konkrétní prokaryontní nebo eukaryontní buňky.
Fúzní proteiny
Cílovou aminokyselinovou sekvenci je možno získat jako fúzní protein, například pro usnadnění extrakce a purifikace. Jako příklady fúzních proteinových protějšků je možno uvést glutathion-S-transferasu (GST), 6xHis, GAL4 (DNA vazebné a/nebo transkripční aktivační domény) a β-galaktosidasu. Také může být účelné mezi fúzní proteinový protějšek a proteinovou sekvenci, která je předmětem zájmu, zavést místa pro proteolytické štěpení, což umožní odstranění sekvencí fúzního proteinu. V přednostním provedení fúzní protein nebrání aktivitě cíle.
Fúzní protein může obsahovat antigen nebo antigenní determinantu fúzovanou k látce podle vynálezu. V tomto pro56
vedení fúzní protein může být nepřirozeným fúzním proteinem, které obsahuje látku, která může působit jako adjuvans v tom smyslu, že může poskytovat generalizovanou stimulaci imunitního systému. Antigen nebo antigenní determinanta může být připojena k aminovému nebo karboxylovému konci látky.
V jiném provedení tohoto vynálezu může být aminokyselinová sekvence ligována k heterologní sekvenci, aby kódovala fúzní protein. Například při screeningu peptidových knihoven na činidla schopná ovlivnit aktivitu látky může být užitečné kódovat chimérickou látku exprimující heterologní epitop, který je rozpoznáván protilátkou dostupnou na trhu.
Protilátky
Podle jednoho provedení tohoto vynálezu činidlo může být protilátkou. Navíc, nebo alternativně, protilátka může být cílem. Navíc, nebo alternativně, protilátka může být prostředkem pro detekci cíle.
Protilátky je možno získat za použití standardních postupů, jako imunizací za použití látky podle vynálezu nebo postupem vystavení na fágu.
Pro účely tohoto vynálezu je jako neomezující příklady pojmu protilátka možno uvést polyklonální protilátku, monoklonální protilátku, chimérickou protilátku, jednořetězcovou protilátku, Fab fragmenty, fragmenty produkované Fab expresní knihovnou, jakož i jejich mimetika. Takovými fragmenty mohou být fragmenty úplných protilátek, u nichž je zachována vazebná aktivita pro cílovou látku, Fv, F(ab') a F(ab')2 fragmenty, a také jednořetězcové protilátky (scFv), fúzní proteiny a jiné syntetické proteiny, které obsahují vazebné místo pro antigen protilátek. Neutralizujícím protilátkám, tj. protilátkám, které inhibují • · · ♦· • · 44 ♦ 4 · • 4 4 4 »4 4
4 9 • · · · ·
44 4 · · · · · ··· *44 ·· 4444 biologickou aktivitu polypeptidů, se dává zvláštní přednost při diagnostických a terapeutických aplikacích.
Pokud jsou požadovány polyklonální protilátky, zvolený savec (například myš, králík, koza, kůň atd.) je imunizován imunogenním polypeptidem nesoucím epitop(y), který lze získat z identifikovaného činidla a/nebo látky podle vynálezu.
V závislosti na druhu hostitele je za účelem zvýšení imunologické odpovědi možno použít různých adjuvans. Jako neomezující příklady takových adjuvans je možno uvést Freundovo adjuvans, minerální gely, jako hydroxid hlinitý, a povrchově aktivní látky, jako lysolecithin, polyoly pluronic, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyanin z přílipky Diodora aspera a dinitrofenol. BCG {Bacilli Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum jsou potenciálně užitečnými lidskými adjuvans, kterých je možno použít, je-li purifikovaný polypeptid podáván imunologicky oslabeným jedincům za účelem stimulace systemické obrany.
Sérum imunizovaného živočicha se shromáždí a zpracuje známými postupy. Pokud sérum obsahující polyklonální protilátky pro epitopy, které lze získat z identifikovaného činidla, a/nebo látka podle vynálezu obsahuje protilátky proti jiným antigenům, je polyklonální protilátky možno purifikovat imunoafinitní chromatografií. Způsoby výroby a zpracování polyklonálních antisér jsou o sobě známé. Podle uspořádání v jakém lze protilátky připravit, jsou předmětem vynálezu polypeptidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty heptenizované k dalšímu polypeptidů pro použití jako imunogeny u zvířat nebo lidí.
Monoklonální protilátky zaměřené proti epitopům, které lze získat z identifikovaného činidla a/nebo látky
ΦΦ · φφ φ φφ φφ φφφφ φ φφφ φφφφ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφ φφφφ podle vynálezu bude odborník v tomto oboru schopen snadno připravit. Obvyklá metodologie přípravy monoklonálních protilátek pomocí hybridomů je dobře známa. Nesmrtelné buněčné linie produkující protilátky je možno získat buněčnou fúzí a také jinými postupy, jako přímou transformací B lymfocytů onkogenní DNA nebo transfekci virem Epstein-Barrové. Panely monoklonálních protilátek produkovaných proti orbitovým epitotům je možno prohledávat na různé vlastnosti, tj . na isotyp a afinitu epitopu.
Monoklonální protilátky proti látce a/nebo identifikovanému činidlu je možno připravovat za použití postupů, jimiž se dosahuje produkce molekul protilátky v kultuře nesmrtelných buněk. Jako jejich neomezující příklady je možno uvést hybridomový postup, který byl původně popsán v Koehler a Milstein (1975, Nátuře 256: 495 až 497), postup s hybridomem lidských B-buněk (Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72, Cote et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 2026 až 2030) a postup s EBV-hybridomem (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss lne., str. 77 až 96). Kromě toho je možno použít postupů, které byly vyvinuty pro výrobu chimérických protilátek, sestřihu myších genů pro protilátky na lidské geny pro protilátky, čímž se získá molekula s vhodnou antigenní specificitou a biologickou aktivitou (Morrison et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 6851 až 6855; Neuberger et al., 1984, Nátuře 312: 604 až 608; Takeda et al., 1985, Nátuře 314: 452 až 454). Alternativně je za účelem produkce látky, látkově specifických jednořetězcových protilátek, možno adaptovat postupy popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (US patent č. 4 946 779).
Protilátky, jak monoklonální, tak polyklonální, které jsou zaměřeny proti epitopům, které lze získat z identifikovaného činidla a/nebo látky, jsou zvláště užitečné
·· • · ♦ « 9 9 9 99 9 9 9 9 • • · • ·· 99 9 9 9
• • 9 9
• 9 9 9 • 9 9 9
• ·· · 99 9 99 99 · 99 9999
v diagnostice, a protilátky, které jsou neutralizovány jsou užitečné při pasivní imunizaci. Zejména monoklonálních protilátek je možno použít pro zvýšení anti-idiotypových protilátek. Anti-idiotypové protilátky jsou imunoglobuliny, které nesou vnitřní obraz látky a/nebo činidla, proti kterým je žádoucí ochrana. Postupy pro zvyšování anti-idiotypových protilátek jsou o sobě známé. Tyto anti-idiotypové protilátky mohou být rovněž užitečné při léčení.
Protilátky je také možno vyrábět in vivo indukcí produkce v populaci lymfocytů nebo screeningem knihovém rekombinantních imunoglobulinů nebo panelů vysoce specifických vazebných reagentů - viz Orlandi et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 3833 až 3837 a Winter, G. a Milstein C, 1991, Nátuře 349: 293 až 299).
Je také možno připravit fragmenty protilátek, které obsahují specifická vazebná místa pro látku. Jako neomezující příklady takových fragmentů je možno uvést fragmenty F(ab')2' které lze získat štěpením molekuly protilátky pepsinem, a Fab fragmenty, které lze získat redukcí disulfidových můstků F(ab')2 fragmentů. Alternativně lze identifikaci monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specificitou urychlit a usnadnit sestavením Fab expresních knihoven (Huse W. D. et al., 1989, Science 256: 1275 až 1281).
Reportéry
Při zkušebních postupech (jakož i screeningu) podle tohoto vynálezu je možno používat různých reportérů, přičemž přednost se dává reportérům, které účelně poskytují detekovatelné signály (například spektroskopicky). Reporterový gen může například kódovat enzym, který katalyzuje reakci, která mění charakteristiky absorpce světla.
Φ· φ φφ φ φφ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ ·Φ φφφ φφ φφφφ
Jako neomezující příklady reportérových molekul je možno uvést β-galaktosidasu, invertasu, zeleně fluoreskující protein, luciferasu, chloramfenikol, acetyltransferasu, β-glukuronidasu, exo-glukanasu a glukoamylasu. Alternativně je do nascentních transkriptů možno zavést radioaktivně značené nukleotidy nebo nukleotidy značené fluorescenčními značkami, a tyto značené látky se poté identifikují po vazbě k oligonukleotidovým sondám.
V jednom přednostním provedení se produkce molekuly reportéru měří enzymatickou aktivitou produktu reporterového genu, jako je β-galaktosidasa.
V tomto oboru jsou známy různé protokoly pro detekci a měření exprese cíle, jako je použití polyklonálních nebo monoklonálních protilátek specifických pro protein.
Jako příklady je možno uvést enzymově spřažené imunochemické stanovení na pevném povrchu (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), radioimunostanovení (RIA) a třídění fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS). Přednost se dává dvoumístnému imunostanovení na monoklonální bázi, které využívá monoklonálních protilátek, které jsou reaktivní ke dvěma neinterferujícím epitopům na polypeptidech. Je však také možno použít kompetitivního vazebného stanovení. Tato a jiná stanovení jsou popsána mj. v Hampton, R. et al.,
1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minesota, USA a Maddox, D. E. et al., 1983, J.
Exp. Med. 15, 8: 121.
Odborníku v tomto oboru bude známa řada různých značek a konjugačních technik, kterých je možno použít při různých stanoveních nukleových kyselin a aminokyselin. Jako prostředky pro produkci značené hybridizace nebo PCR prób pro detekci cílové polynukleotidové sekvence je možno uvést oligoznačení, posun jednořetězcového zlomu, koncové značení
nebo PCR amplifikaci za použití značeného nukleotidu. Alternativně je kódující sekvenci nebo jakoukoliv její část možno klonovat do vektoru za účelem produkce mRNA sondy. Takové vektory jsou v tomto oboru známy a jsou dostupné na trhu. Lze jich použít při syntéze RNA sond in vitro přidáním vhodné RNA polymerasy, jako T7, Z3 nebo SP6 a značených nukleotidů.
Pro tyto postupy řada společností, jako Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA), Promega (Madison, WI, USA) a US Biochemical Corp. (Cleveland, OH, USA), dodává komerční kity a protokoly. Jako vhodné reportérové molekuly nebo značky je možno uvést radionuklidy, enzymy, fluorescenční, chemiluminiscenční nebo chromogenní činidla, jakož i substráty, kofaktory, inhibitory, magentické částice apod. Použití takových značek je například popsáno v patentech US-A-3 817 738, US-A-3 850 752, US-A-3 939 350, US-A-3 996 345, US-A-4 277 437, US-A-4 275 149 a US-A-4 366 241. Rekombinantní imunoglobuliny je možno připravovat způsobem popsaným v US-A-4 816 567.
Další postupy kvantifikace exprese konkrétní molekuly zahrnují radioznačení (Melby, P. C. et al., 1993,
J. Immunol. Methods 159: 235 až 244) nebo biotinylaci (Duplaa, C. et al., 1993 Anal. Biochem. 229 až 236) nukleotidů, koamplifikaci kontrolní nukleové kyseliny, a standardní křivky, na nichž se interpolují experimentální výsledky. Kvantifikaci většího počtu vzorku je možno urychlit tak, že se stanovení provádí ve formátu ELISA, přičemž oligomer, který je předmětem zájmu, je přítomen v různých zředěních a spektrofotometrická nebo kalorimetrická odpověď poskytuje rychlou kvantifikaci.
Ačkoliv přítomnost/nepřítomnost exprese markerového genu napovídá, že gen, který je předmětem zájmu, je také
přítomen, měla by přítomnost a exprese být potvrzena. Například, pokud je nukleotidové sekvence insertována do sekvence markerového genu, rekombinantní buňky, které ji obsahují, je možno identifikovat na základě absence funkce markerového genu. Alternativně je markerový gen možno umístit v tandemu s cílovou kódující sekvencí pod kontrolu jediného promotoru. Exprese markerového genu při odpovědi na indukci nebo selekci obvykle také indikuje expresi cíle.
Alternativně je možno různými o sobě známými postupy identifikovat hostitelské buňky, které obsahují kódující sekvenci pro cíl a exprimují cílové kódující oblasti. Jako neomezující příklady takových postupů je možno uvést hybridizaci DNA-DNA nebo DNA-RNA a proteinová biostanovení nebo imunostanovení, kterými mohou být postupy prováděné za použití membrán, roztoků nebo čipů, pro detekci a/nebo kvantifikaci nukleové kyseliny nebo proteinu.
Obecná stanovení akvitity/hladiny cAMP
Schopnost zkoušeného činidla potencovat cAMP je možno stanovit měřením relevantního zvýšení nebo snížení hladiny cíle. Navíc, nebo alternativně, je schopnost zkoušeného činidla potencovat cAMP možno stanovit měřením relevantního zvýšení hladiny cAMP. Například je možno přizpůsobit postupy popsané v Smith et al., 1993 (Appl. Biochem. Biotechnol. 41: 189 až 218). Na trhu jsou také dostupné kity pro imunostanovení určené pro měření cAMP (například Amersham International, Arlington Heights, IL,
USA a DuPont, Boston, MA, USA). Vhodné cAMP stanovení je podrobněji popsáno v příkladech provedení.
Screening
Pro identifikaci PcAMP je možno použít jakýkoliv • 0 00
0 0 • 0
0
0·
0
000 0 jeden nebo větší počet z vhodných cílů, jako aminokyselinových sekvencí a/nebo nukleotidových sekvencí, při jakékoliv technice z řady technik pro screening léčiv. Cíl používaný při takové zkoušce může být volně v roztoku, připojen k pevnému nosiči, nesený na buněčném povrchu nebo umístěn intracelulárně. Cíl může dokonce být ve zvířecím modelu, kde tímto cílem může být exogenní cíl nebo zavedený cíl. Zvířecím modelem je nehumánní živočišný model. Odstranění aktivity cíle nebo tvorbu vazebných komplexů mezi cílem a zkoušeným činidlem je možno měřit.
Postupy pro screening léčiv jsou založeny na způsobu popsaném v Geysen, Evropské patentové přihlášce 84/03564, zveřejněné 13. září 1984. Tyto postupy lze stručně popsat takto: Velké množství různých malopeptidových zkoušených sloučenin se syntetizuje na pevném substrátu, jako plastových výstupcích (pinech) nebo jiném povrchu. Peptidové zkoušené sloučeniny se nechají reagovat s vhodným cílem nebo jeho fragmentem a promyjí. Navázané látky se poté detekují, například za použití vhodně přizpůsobených o sobě známých postupů. Purifikovaný cíl je také možno nanést přímo na desky pro použití při screeningu léčiv. Alternativně je pro zachycení peptidu a jeho imobilizaci na pevném nosiči možno použít ne-neutralizujících protilátek.
Do rozsahu vynálezu spadá také použití kompetitivních screeningových zkoušek léčiv, při nichž neutralizační protilátky schopné vázat cíl specificky soutěží se zkoušenou sloučeninou o vazbu k cíli.
Další screeningový postup představuje vysoce výkonný screening (HTS) činidel s vhodnou vazebnou afinitou k látkám, který je založen na způsobu podrobně popsaném ve W084/03564.
*· « • 4 * »·
• · ·· • · ·· • » « «
• · • · » • · ·
···· «·· »· ♦·· A* «4··
Má se za to, že zkušební postupy podle vynálezu budou vhodné jak pro screening zkoušených sloučenin v malém i velkém měřítku, jakož i při kvantitativních stanoveních.
Předmětem vynálezu je tedy způsob identifikace činidel, která potencují cAMP, přičemž tento postup spočívá v tom, že se vhodný cíl uvede do styku s činidlem a poté se měří hladina aktivita a/nebo hladina cAMP.
Dále je předmětem vynálezu způsob identifikace činidel, která selektivně potencují cAMP v ženských genitáliích, přičemž tento postup spočívá v tom, že se při němž uvede do styku vhodný cíl z ženských genitálií a poté se měří aktivita a/nebo hladina cAMP.
Dále je předmětem vynálezu způsob identifikace činidlel, která potencují cAMP, jehož podstata spočívá v tom, že se vhodný cíl uvede do styku s činidlem a poté se měří aktivita a/nebo hladina cíle.
Předmětem vynálezu je také způsob identifikace činidel, která selektivně potencují cAMP v ženských genitáliích, jehož podstata spočívá v tom, že se uvede do styku vhodný cíl z ženských genitálií a poté se měří aktivita a/nebo hladina cíle.
Podle přednostního aspektu screening podle vynálezu zahrnuje alespoň jeden z následujících stupňů (které nemusí být ve stejném pořadí, v jakém jsou uvedeny): (a) provedení in vitro screeningu za účelem stanovení, zda potenciální činidlo vykazuje relevantní aktivitu (jako modulaci NEP, jako NEP z ledvin psa); (b) provedení alespoň jednoho selektivního screeningu za účelem stanovení selektivity potenciálního činidla (například, aby se zjistilo, zda toto činidlo je také inhibitorem ACE - jako za použití zde popsa65
·· • 44 • 44 *4
• 44 • • 44 • · 4 9
• • • • 4 4 4
• • 4 • 4 • 9 •
444 4·· 44 4·· 44 • 444
ného zkušebního protokolu); a (c) provedení in vivo screeningu s potenciálním činidlem (například za použití funkčního zvířecího modelu). Pokud se toto potenciální činidlo podrobí screeningu (a) a (b), obvykle se poté provádí screening (c).
Diagnostika
Předmětem vynálezu je také diagnostická kompozice nebo kit pro detekci predispozice pro FSAD. Taková kompozice nebo kit obsahuje entitu, která je schopna indikovat přítomnost jednoho či více - nebo dokonce absenci jednoho či více - z cílů ve zkoušebním vzorku. V přednostním provedení se zkušební vzorek získá z ženských genitálií nebo jejich výměšku.
Diagnostická kompozice může například obsahovat kteroukoliv ze zde uvedených nukleotidových sekvencí nebo její variantu, homolog, fragment nebo derivát, nebo sekvenci, která je schopna se hybridizovat ke kterékoliv z uvedených nukleotidových sekvencí, a to úplné nebo částečné.
Aby se získala základna pro diagnosu choroby, měly by se stanovit normální či standardní hodnoty. To lze provést tak, že se tělesné kapaliny nebo buněčné extrakty odebrané normálním subjektům, zvířatům nebo lidem, uvedou do styku protilátkou proti cíli za podmínek vhodných pro tvorbu komplexu, které jsou v tomto oboru dobře známy. Množství tvorby standardního komplexu je možno kvantifikovat porovnáním se zřeďovacími sériemi pozitivní kontroly, v nichž je přítomno známé množství protilátky spolu se známými koncentracemi purifikovaného cíle. Poté je standardní hodnoty získané z normálních vzorků možno porovnat s hodnotami získanými ze vzorků odebraných subjektům, které jsou • · • · · · potenciálně postiženy FSAD. Odchylka mezi standardem a hodnotami subjektu prokazuje přítomnost chorobného stavu.
Cíl samotný, nebo jeho část, může představovat základ pro diagnostické a/nebo terapeutické sloučeniny. Pro účely diagnostiky lze použit cílové polynukleotidové sekvence při detekci a kvantifikaci exprese genu u stavů, poruch nebo chorob, na nichž se může podílet FSAD.
Polynukleotidovou sekvenci kódující cíl je možno použít pro diagnosu FSAD, která je vyvolána expresí cíle. Například je polynukleotidovou sekvenci kódující cíl možno použít při hybridizací nebo PCR stanovení tkání z biopsie nebo autopsie nebo biologických tekutin, za účelem detekce abnormalit v expresi cíle. Takové kvalitativní nebo kvantitativní postupy mohou například zahrnovat Southernovu analýzu nebo northern analýzu, tečkový přenos nebo jiné postupy založené na membránách; PCR postupy; postupy využívající máčecí tyčinky, dipů nebo čipů; a ELISA nebo jiné postupy pro větší počet vzorků.
Takové zkoušky lze přizpůsobit pro hodnocení účinnosti konkrétního terapeutického režimu a je možno jich používat při zkouškách na zvířatech, při klinických zkouškách nebo při monitorování léčení jednotlivého pacienta. Aby se získala základna pro diagnosu choroby, měl by se stanovit normální či standardní profil pro expresi cíle. To lze provést tak, že se tělesné kapaliny nebo buněčné extrakty odebrané normálním subjektům, zvířatům nebo lidem, uvedou do styku s cílem nebo jeho částí za podmínek vhodných pro hybridizací nebo amplifikaci. Standardní hybridizací je možno kvantifikovat porovnáním se zřeďovacími sériemi pozitivní kontroly získané při stejné zkoušce za použití známého množství purifikovaného cíle. Poté je standardní hodnoty získané z normálních vzorků možno • · porovnat s hodnotami získanými ze vzorků odebraných subjektům, které jsou potenciálně postiženy poruchou nebo chorobou spojenou s exprexí cílové kódující sekvence. Odchylka mezi standardem a hodnotami subjektu prokazuje přítomnost chorobného stavu. Pokud je choroba prokázána, podává se existující terapeutické činidlo, a tak lze získat profil nebo hodnoty léčení. Stanovení je možno pravidelně opakovat, aby se zjistilo, zda se hodnoty vyvíjejí nebo se navracejí k normálnímu či standardnímu profilu. Postupně vzniklých léčebních profilů je možno použít pro ilustraci účinnost léčení během doby několika dní nebo několika měsíců.
Podle jednoho aspektu je tedy předmětem vynálezu použití cílového polypeptidu nebo jeho varianty, homologu, fragmentu nebo derivátu pro výrobu anti-cílových protilátek, které je například možno použít diagnosticky za účelem detekce a kvantifikace hladiny cíle v stavů FSAD.
Dále jsou předmětem vynálezu diagnostická stanovení a kity pro detekci cíle v buňkách a tkáních, které obsahují purifikovaný cíl, kterého je možno použít jako pozitivní kontroly, a anti-cílovou protilátku. Takových protilátek je možno používat při postupech založených na roztocích, membránách nebo tkáních pro detekci jakéhokoliv chorobného stavu spojeného s expresí cílového proteinu nebo expresí delecí nebo jeho varianty, homologu, fragmentu nebo derivátu.
Postupy stanovení
Diagnostické kompozice a/nebo způsoby a/nebo kity je možno používat postupech, jako jejichž neomezující příklady je možno uvést kompetitivní a nekompetitivní stanovení, radioimunostanovení, bioluminiscenční a chemiluminis68
cenční stanovení, fluorometrická stanovení, sendvičová stanovení, imunoradiometrická stanovení, tečkový přenos, enzymově spražená stanovení, jako ELISA, mikrotitrační destičky, proužky nebo namáčecí tyčinky potažené protilátkou pro rychlé monitorování moči nebo krve, imunohistochemické a imunocytochemické analýzy.
Například imunohistochemický kit je také možno použít při lokalizaci aktivity NEP ve tkáni genitálií. Tento imunohistochemický kit umožňuje lokalizovat NEP v tkáňových řezech a buněčných kulturách za použití jak světelné, tak elektronové mikroskopie a lze ho využívat jak pro výzkumné, tak i pro klinické účely. Taková informace může být užitečná pro diagnostické a potenciální terapeutické účely při detekci a/nebo prevenci a/nebo léčení FSD, jako FSAD. Pro každý kit jsou stanoveny rozmezí, citlivost, přesnost, splehlivost, specificita a reprodukovatelnost stanovení. Variance ve stanovení (intraassay) a v čase (interassay) se stanoví při bodech 20%, 50% a 80% na standardních křivkách posunu nebo aktivity.
Sondy
Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou sondy pro hybridizací nukleových kyselin nebo PCR, které jsou schopny detekovat (zejména které jsou schopny selektivního výběru) polynukleotidových sekvencí, jako genomových sekvencí, kódující cílovou kódující oblast nebo blízce příbuzné molekuly, jako allely. Specificita sondy, tj. zda je odvozena od vysoce konzervované, konzervované nebo nekonzervované oblasti nebo domény, a stringence hybridizace nebo amplifikace (vysoká, střední nebo nízká) bude určovat, zda sonda bude identifikovat pouze přirozeně se vyskytující cílovou kódující sekvenci nebo příbuzné sekvence. Sondy pro detekci příbuzných sekvencí nukleových kyselin se volí z konzervo• · · • · •· ··· ·· ···· váných nebo vysoce konzervovaných nukleotidových oblastí příslušníků cílové třídy a takových sond je možno použít v poolu degenerovaných sond. Při detekci identických sekvencí nukleových kyselin, nebo v případě potřeby maximální specificity, se sondy, nukleové kyseliny, volí z nekonzervovaných nukleotidových oblastí nebo jedinečných oblastí cílových polynukleotidů. Pod pojmem nekonzervovaná nukleotidová oblast se zde rozumí oblast nukleotidu, která je vzhledem ke zde popsané cílové kódující sekvenci jedinečná a nevyskytuje se u příbuzných příslušníků téže třídy.
Další použití oligonukleotidů založených na cílových sekvencích představuje PCR, jak je například popsána v US-A-4 683 195, US-A-4 800 195 a US-A-4 965 188. Takové oligomery jsou obvykle chemicky syntetizovány, ale je možno je získat také enzymaticky nebo z rekombinantního zdroje. Oligomery obvykle obsahují dvě nukleotidové sekvence, z nichž jedna má orientaci po směru (5'->3') a druhá orientaci proti směru (3’<—5') používané za podmínek optimalizovaných pro identifikaci specifického genu nebo stavu. Pro detekci a/nebo kvantifikaci blízce příbuzných DNA nebo RNA sekvencí je možno použít dvou stejných oligomerů, sad oligomerů nebo dokonce degenerovaného poolu oligomerů.
Sekvence nukleové kyseliny pro cíl je také možno použít pro tvorbu hybridizačních sond, jak je popsáno výše, pro mapování endogenní genomové sekvence. Sekvence může být zamapována na konkrétní chromozom nebo na specifickou oblast chromozomu za použití dobře známých postupů. Jako příklad takových postupů je možno uvést hybridizací in šitu na rozvinuté chromosomální preparáty (Verma et al., 1988, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City, USA), na separované (flow sorted) chromosomální preparáty nebo umělé chromosomální konstrukce, jako jsou YAC (umělé kvasinkové chromosomy), umělé bakteriální *· « ·· » 00 00 • 0 00 00 00 0000
0 000 000 0000 000 00 0·* 00 0000 chromosomy (BAC), bakteriální PI konstrukce nebo cDNA knihovny jediného chromosomu.
In šitu hybridizace chromosomálních preparátů a fyzikální metody mapování, jako je analýza vazeb za použití daných chromosomálních markérů jsou při zvětšujícím se rozsahu genetických map neocenitelné. Příklady genetických map je možno nalézt v Science (1995, 270: 410f a 1994, 265: 1981f). Umístění genu na chromosom jiného savčího druhu často může odhalit související markéry, a to dokonce i když není známo číslo nebo raménko konkrétního lidského chromosomu. Nové sekvence je chromosomálnímu raménku nebo jeho části možno přidělit fyzikálním mapováním. To poskytuje výzkumníkům, kteří hledají geny chorob za použití pozičního klonování nebo jiných metod zjišťování genů, cenné informace. Jakmile je choroba nebo syndrom zhruba lokalizován genetickou vazbou na konkrétní oblast genomu, všechny sekvence zamapované na tuto oblast mohou představovat asociované nebo regulační geny pro další výzkum. Nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu je také možno používat při detekci rozdílů v chromosomální lokalizaci vyvolané translokací, inverzí atd. mezi normálními, přenášejícími nebo postiženými individui.
Hostitelské buňky
Pod pojmem hostitelská buňka se v souvislosti s tímto vynálezem rozumí jakákoliv buňka, která by mohla obsahovat cíl pro činidlo.
Dalším předmětem vynálezu jsou tedy hostitelské buňky transformované nebo transfekované polynukleotidem, který je cílem nebo cíl exprimuje. Přednostně je takový polynukleotid nesen ve vektoru pro replikaci a expresi nukleotidů, které mohou být cílem nebo mohou cíl exprimovat.
♦ · • ·· • 9 ·· ·· • 9 99 « 9
9
• • 9 9 • 9 9 9
·« · «· ♦ » * 99 9999
Buňky se volí tak, aby byly kompatibilní s vektorem, a mohou to být například buňky prokaryontní (například bakteriální), fungální, kvasinkové nebo rostlinné.
Pro expresi heterologních genů se jako hostitelské buňky používají buňky gram-negativní bakterie E. coli. Avšak heterologní protein má sklon se ve velkém množství akumulovat uvnitř buňky. Následná izolace požadovaného proteinu ze všech intracelulárních proteinů může být někdy obtížná.
Oproti E. coli jsou bakterie rodu Bacillus jako hostitelské buňky velmi vhodné, vzhledem k jejich schopnosti vylučovat proteiny do kultivačního média. Jako jiné vhodné bakteriální hostitele je možno uvést rody Streptomyces a Pseudomonas.
V závislosti na povaze polynukleotidu kódujícího polypeptid podle vynálezu a/nebo míře nutnosti dalšího zpracování exprimovaného proteinu, se dává přednost eukaryontním hostitelům, jako kvasinkám nebo jiným fungálním hostitelům. Obvykle se buňkám kvasinek dává větší přednost než fungálním buňkám, neboť se s nimi snáze manipuluje. Některé proteiny jsou však z kvasinkových buněk špatně vylučovány nebo v některých případech nejsou dobře zpracovány (například hyperglykosylace v kvasince). V těchto případech by bylo třeba zvolit jiného fungálního hostitele.
Jako příklady vhodných expresních hostitelů pro účely tohoto vynálezu je možno u vést houby, jako druhy Aspergillus (jaké jsou například popsány v EP-A-0 184 438 a EP-A-0 284 603) a druhy Trichoderma; bakterie, jako druhy Bacillus (jaké jsou například popsány v EP-A-0 314 048 a EP-A-0 253 455), druhy Streptomyces a Pseudomonas; kvasinky, jako druhy Kluyveromyces (jaké jsou například popsány v EP-A-0 096 430 a EP-A-0 301 670) a druhy Saccharomyces.
• ·
Typičtí expresní hostitelé mohou být například zvoleni z Aspergillus niger, Aspergillus niger var. butigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromaces lactis a Saccharomyces cerevisiae.
Za použití vhodných hostitelských buněk - jako kvasinkových, fungálních a rostlinných hostitelských buněk, je možno dosáhnout posttranslačních modifikací (například myristoylace, glykosylace, krácení, lapidace a fosforylace tyrosinu, šeřinu nebo threoninu), jak může být potřebné pro potvrzení biologické aktivity na rekombinantních expresních produktech podle vynálezu.
Organismus
Pod pojmem organismus se v souvislosti s vynálezem rozumí jakýkoliv organismus, který by mohl obsahovat cíl a/nebo produkt z něj získaný. Jako příklady organismů je možno uvést houby, kvasinky a rostliny.
Do rozsahu pojmu transgenní organismus v souvislosti s vynálezem spadá jakýkoliv organismus, který obsahuje cíl a/nebo získané produkty.
Transformace hostitelských buněk/hostitelského organismu
Jak již bylo uvedeno výše, hostitelským organismem může být prokaryontní nebo eukaryontní organismus. Jako vhodné prokaryontní hostitele lze například uvést E. coli a Bacillus subtilis. Poznatky o transformacích prokaryontních hostitelů jsou dobře dokumentovány - viz například Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání,
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, lne.
Pokud se používá prokaryontního hostitele, potom může být třeba nukleotidovou sekvenci před transformací vhodně modifikovat, jako odstraněním intronů.
V dalším provedení může transgenním organismem být kvasinka. Používání kvasinky jako vehikula pro expresi heterologních genů je rozšířené. Dlouhou historii průmyslového využití, jako je použití při expresi heterologních genů, mají druhy Saccharomyces cerevisiae. Přehledné články o expresi heterologních genů v Saccharomyces cerevisiae lze nalézt v Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., ed. str. 401 až 429, Allen and Unwin, Londýn) a King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts,
E. F. Walton a G. T. Yarronton, ed., str. 107 až 133, Blackie, Glasgow).
Saccharomyces cerevisiae je pro expresi heterologních genů vhodná z několika důvodů. Za prvé je nepatogenní pro člověka a je schopna produkovat určité endotoxiny, a za druhé po staletích jejího komerčního využívání k různým účelům má dlouhou historii bezpečného používání. To vedlo k široké akceptovatelnosti pro veřejnost. Za třetí, rozsáhlé komerční využití a výzkumy zasvěcené tomuto organismu vedly k nashromáždění velkého množství znalostí o genetice a fyziologii Saccharomyces cerevisiae a charakteristikách její fermentace ve velkém měřítku.
Přehled o principech exprese heterologních genů v Saccharomyces cerevisiae a sekreci genových produktů je podán v E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes, Yeasts, sv. 5,
Anthony H. Rose a J. Stuart Harrison, ed., 2. vydání, Academie Press Ltd.).
Je dostupných několik typů kvasinkových vektorů, jako jsou integrativní vektory, které pro udržení potřebují rekombinaci s genomem hostitele, a autonomně se replikující plasmidové vektory.
Za účelem přípravy transgenní Saccharomyces se insercí nukleotidové sekvence podle vynálezu do konstruktu sestaveného pro expresi v kvasince připraví expresní konstrukty. Pro heterologní expresi bylo vyvinuto několik typů konstruktů. Tyto konstrukty obsahují promotor aktivní v kvasince fúzovaný s nukleotidovou sekvencí podle vynálezu, obvykle se používá promotoru kvasinkového původu, jako promotoru GAL1. Obvykle se používá signální sekvence kvasinkového původu, jako sekvence kódující signální peptid SUC2. Expresní systém uzavírá terminátor aktivní v kvasince.
Pro transformaci kvasinek bylo vyvinuto několik transformačních protokolů. Například transgenní Saccharomyces podle vynálezu je možno připravit podle Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nátuře, Londýn, 275, 104) a Ito, H. et al., (1983, Bacteriology 153, 163 až 168).
Transformované kvasinkové buňky se selektují za použití různých selekčních markérů. Z markérů používaných pro transformaci je možno uvést řadu auxotrofních markérů, jako LEU2, HIS4 a TRPÍ a dominantní markéry resistence vůči antibiotikům, jako aminoglykosidové antibiotické markéry, například G418.
Dalším hostitelským organismem je rostlina. Základním principem při konstrukci geneticky modifikovaných ·· 9 9 9 · ·· • · · · · · · · · ··
- 75 rostlin je taková inserce genetické informaci do genomu rostliny, aby se dosáhlo stabilního zachování insertovaného genetického materiálu. Pro inserci genetické informace existuje několik technik, přičemž dva hlavní principy představují přímé zavedené genetické informace a zavedení genetické informace za použití vektorových systémů. Přehled takových obecných postupů je možno nalézt v článcích Potrykus (Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol, 1991, 42: 205 až 225) a Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994, 17 až 27). Další informace o transformaci rostlin je možno získat z EP-A-0 449 375.
Předmětem vynálezu je tedy dále způsob transformace hostitelské buňky nukleotidovou sekvencí, která má být cílem nebo má cíl exprimovat. Hostitelské buňky transformované nukleotidovou sekvencí je možno kultivovat za podmínek vhodných pro expresi a izolaci kódovaného proteinu z buněčné kultury. Protein produkovaný rekombinantní buňkou může být vylučován nebo může být obsažen uvnitř buňky v závislosti na použité sekvenci a/nebo vektoru. Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že expresní vektory obsahující kódující sekvence je možno sestrojit za použití signálních sekvencí, které řídí vylučování kódujících sekvencí přes membránu konkrétní prokaryontní nebo eukaryontní buňky. Jiné rekombinantní konstrukce mohou spojovat kódující sekvenci s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptidovou doménu, která umožní purifikaci rozpustných proteinů (Kroll, D. J. et al., 1993, DNA cell Biol. 12: 441 až 453).
Farmaceutické kompozice
Předmětem vynálezu je také farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje terapeuticky účinné množství činidla podle vynálezu a farmaceuticky vhodný nosič, ředidlo nebo excipienty (včetně jejich kombinací).
- 76 Farmaceutické kompozice mohou sloužit pro podávání lidem nebo zvířatům, v humánní a veterinární medicíně, a obvykle obsahují jedno či více z farmaceuticky vhodných ředidel, nosičů nebo excipientů. Nosiče nebo ředidla vhodné pro terapeutické použití jsou ve farmacii dobře známy a jsou popsány například v Remington's Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing C. (A. R. Gennaro edit., 1985). Při volbě farmaceutického nosiče, excipientů nebo ředidla se může brát v potaz zvolený způsob podávání a standardní farmaceutická praxe. Farmaceutické kompozice mohou jako nosič, excipient nebo ředidlo, nebo namísto nich, obsahovat vhodné pojivo (nebo pojivá), lubrikant (nebo lubrikanty) , suspenzní činidlo (nebo činidla), potahovací činidlo (nebo činidla) nebo solutilizační činidlo (nebo činidla).
Farmaceutické kompozice také mohou obsahovat konzervační přísady, stabilizátory, barvicí přísady a aromatizační činidla. Jako příklady konzervačních činidel je možno uvést benzoan sodný, kyselinu sorbovou a estery p-hydroxybenzoové kyseliny. Také je možno používat antioxidantů a suspenzeních činidel.
V závislosti na různých systémech dodávky se požadavky na kompozici/formulaci mohou lišit. Farmaceutická kompozice může být například formulována pro dodávku za použití minipumpy, nebo mukosální dodávku, například ve formě nasálního spreje nebo aerosolu pro inhalaci nebo vstřebatelného roztoku. Pro parenterální dodávku kompozice může být formu vhodnou pro injekční podávání, například intravenosní, intramuskulátní nebo subkutánní podávání. Alternativně formulace může být uzpůsobena pro podávání oběma způsoby.
Pokud se činidlo má podávat mukosálně, přes gastrointestinální sliznici, měla by být schopna zůstat
stabilní během průchodu gastrointestinálním traktem. Například by měla být resistentní vůči proteolytické degradaci, stabilní při kyselém pH a resistentní vůči detergenčním účinkům žluči.
Pokud je to vhodné, je farmaceutické kompozice možno podávat inhalačně, ve formě čípků nebo nebo pesarů, topicky ve formě lotionů, roztoků, krémů, mastí nebo zásypů, za použití náplastí na kůži. Také je možno je podávat perorálně ve formě tablet obsahujících takové excipienty, jako škrob nebo laktosu, nebo ve formě tobolek nebo ovulí, bud' samotné nebo ve směsi s excipienty, nebo ve formě elixírů, roztoků nebo suspenzí, které obsahují aromatizační nebo barvicí činidla. Dále je možno je podávat parenterálně, například intravenosně, intramuskulárně nebo subkutánně. Pro parenterální podávání se nejlépe hodí sterilní vodné roztoky, které mohou obsahovat i jiné látky, například soli nebo monosacharidy v množství dostatečném pro isotonizaci roztoku vzhledem ke krvi. Při bukálním a sublinguálním podávání je kompozice možno podávat ve formě tablet nebo pastilek, které lze připravovat obvyklým způsobem.
Při některých provedeních je činidla také možno používat v kombinaci s cyklodextriny. O cyklodextrinech je známo, že tvoří inklusní a neinklusní komplexy s molekulami léčiva. Tvorba komplexu léčivo-cyklodextrin může modifikovat rozpustnost, rychlost rozpouštění, biodostupnost a/nebo stabilitu molekuly léčiva. Komplexy léčivo-cyklodextrin jsou užitečné u většiny dávkovačích forem a způsobů podávání. Alternativu k přímé tvorbě komplexu léčiva s cyklodextrinem může představovat použití cyklodextrinu jako pomocné přísady, například nosiče, ředidla nebo solubilizační přísady.
Nejčastěji se používají alfa-, beta- a gamma-cyklo-dextriny, jejichž vhodné příklady jsou popsány ve WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 a WO-A-98/55148.
ΦΦ φ ·φ φ φφ ·· • · ·Φ φ φ φφ φ · ·
V přednostním provedení se činidla podle vynálezu podávají systemicky (jak perorálně, bukálně nebo sublinguálně), výhodněji perorálně.
Činidlo tedy má přednostně formu, která je vhodná pro perorální podávání.
Při některých provedeních činidlo - když se ho použije - přednostně nepůsoí na centrální nervový systém.
Při některých provedeních činidlo - když se ho použije - má přednostně periferní účinek.
Podávání
Pod pojmem podávání se rozumí dodávka pomocí virových nebo nevirových postupů. Jako neomezující příklady mechanismu virové dodávky je možno uvést adenovirové vektory, adeno-asociované virové (AW) vektory, herpesvirové vektory, retrovirové vektory, lentivirové vektory a bakulovirové vektory. Nevirové mechanismy dodávky zahrnují transfekci zprostředkovanou lipidy, liposomy, imunoliposomy, lipofektinem, kationtovými faciálními amfifily (CFA) a jejich kombinace.
Činidla podle vynálezu je možno podávat samotná, ale obvykle se budou podávat ve formě farmaceutických kompozic, v nichž je činidlo například smíseno s vhodným farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem zvoleným s ohledem na zamýšlený způsob podávání a standardní farmaceutickou praxi.
Činidlo podle vynálezu je například možno podávat (například orálně nebo topicky) ve formě tablet, tobolek, ovulí, elixírů, roztoků nebo suspenzí, které mohou obsahovat • 0 · ·· * ·· ·· • 0 0 0 « 0·0 « ·0 — 79 — · ·*«*·*··*· • ••4 ··· *» »»e ι· ··· aromatizační nebo barvicí činidla, určených pro okamžitou, odloženou nebo modifikovanou dodávku, dodávku s trvalým uvolňováním, pulsní dodávku nebo dodávku s řízeným uvolňováním.
Tablety mohou obsahovat excipienty, jako mikrokrystalickou celulosu, laktosu, citran sodný, uhličitan vápenatý, dibázický fosforečnan vápenatý a glycin, rozvolňovadla, jako škrob (přednostně kukuřičný, bramborový nebo tapiokový škrob), sodnou sůl škrobového glykolátu, sodnou sůl kroskarmelosy a některé komplexní silikáty, a granulační pojivá, jako polyvinylpyrrolidon, hydroxypropylmethylcelulosu (HPMC), hydroxypropylcelulosu (HPC), sacharosu, želatinu a klovatinu. Kromě toho mohou obsahovat také lubrikační činidla, jako stearan hořečnatý, kyselinu stearovou, glycerylbehenát a mastek.
Pevné kompozice podrobného typu je také možno použít jako náplně želatinových tobolek. Takové kompozice jako excipienty přednostně obsahují laktosu, škrob, celulosu, laktosu nebo vysokomolekulární polyethylenglykoly. Ve vodných suspenzích mohou být činidla v kombinaci s různými sladidly nebo aromatizačními činidly, barvicími látkami nebo barvivý, emulgačními a/nebo suspenzními činidly, a ředidly, jako vodou, ethanolem, propylenglykolem a glycerinem nebo jejich kombinacemi.
Jako neomezující příklady způsobů podávání (dodávky) je možno uvést perorální podávání (například ve formě tablet, tobolek nebo poživatelných roztoků), nasální, parenterální (například ve formě injekčních forem), gastrointestinální, intraspinální, intraperitoneální, intramuskulární, intravenosní, intrauterinní, intraokulární, intradermální, intrakraniální, intratracheální, intravaginální, intracerebrovaskulární, intracerebrální, subkutánní,
* · • ·♦ Φ * • · • · Φ* • · Φ· • ·
• • · • • * •
·· ··· 1* 5· «···
oftalmické (včetně podávání do sklivce nebo oční komory), transdermální, rektální, bukální, vaginální, epidurální a sublinguální podávání.
Je zřejmé, že všechna činidla nemohou být podávána stejným způsobem. Podobně, pokud kompozice obsahuje více než jednu účinnou přísadu, potom tyto přísady mohou být podávány různými způsoby.
Pokud se činidlo podle vynálezu podává parenterálně, je jako příklady takového podávání možno uvést intravenosní, intraarteriální, intraperitoneální, intracékální, intraventrikulární, intraurethrální, intrasternální, intrakraniální, intramuskulární nebo subkutánní podávání činidla a/nebo podávání za použití infúzních postupů.
Pro parenterální podávání se nejlépe hodí sterilní vodné roztoky, které mohou obsahovat i jiné látky, například soli nebo glukosu v množství dostatečném pro isotonizaci roztoku vzhledem ke krvi. Vodné roztoky by v případě potřeby měly být vhodně pufrovány (přednostně na pH 3 až 9). Odborník v tomto oboru je formulace vhodné pro parenterální podávání schopen snadno připravit za použití standardních farmaceutických postupů.
Jak již bylo uvedeno, činidlo podle vynálezu je možno podávat intranasálně nebo inhalačně a je účelně podáváno za použití suchého prášku v inhalátoru nebo aerosolového spreje v tlakovce, pumpě, spreji nebo rozprašovači za použití vhodného hnacího plynu, například dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, hydrofluoralkanu, jako 1,1,1,2-tetrafluorethanu (HFA 134a(R)) nebo 1,1,1,2,3,3,3-heptafluorpropanu (HFA 227EA^R^), oxidu uhličitého nebo jiných vhodných plynů. V případě tlakovaného aerosolu může být dávkovači jednotka dána použitím ventilu uvolňujícího odměřené množství. Tlakovky, pumpy, spreje nebo rozprašovače mohou obsahovat roztok nebo suspenzi účinné sloučeniny připravený například za použití směsi ethanolu a hnacího plynu jako rozpouštědla, a dále lubrikační činidlo, například sorbitantrioleát. Tobolky a patrony (vyrobené například z želatiny) pro použití v inhalátorech nebo insuflátorech mohou být například formulovány tak, že obsahují práškovou směs činidla a vhodného práškového základu, jako laktosy nebo škrobu.
Alternativně je činidlo možno podávat ve formě čípku nebo pesaru nebo ho lze podávat topicky ve formě gelu, hydrogelů, lotionu, roztoku, krému, masti nebo zásypu. Činidla lze také podávat dermálně nebo transdermálně, například za použití transdermálních náplastí na kůži. V úvahu také přichází pulmonární nebo rektální podávání a dále rovněž okulární podávání. Při očním podávání sloučeniny mohou být formulovány do podoby mikronizovaných suspenzí v isotonickém sterilním solném roztoku s nastaveným pH nebo, přednostně, do podoby roztoku v isotonickém sterilním solném roztoku s nastaveným pH, popřípadě v kombinaci s konzervačním činidlem, jako benzalkoniumchloridem. Alternativně činidla také mohou být začleněna do mastí, například vazelínových.
Pro účely topického podávání na kůži činidlo může být formulováno jako vhodná mast obsahující suspenzi nebo roztok účinné sloučeniny v jedné či více látkách zvolených ze souboru sestávajícího z minerálních olejů, vazelínového oleje, bílé vazelíny, propylenglykolu, polyoxyethylenpolyoxypropylenových sloučenin, emulgačních vosků a vody. Alternativně může být formulováno do podoby vhodného lotionu nebo krému, suspendováno nebo rozpuštěno například ve směsi jedné či více z následujících látek: minerálním oleji, sorbitanmonostearátu, polyethylenglykolu, kapalném parafinu,
Polysorbate 60, cetylesterovém vosku, cetearylalkoholu, 2-oktyldodekanolu, benzylalkoholu a vodě.
Kompozice podle tohoto vynálezu je možno podávat přímou injekcí.
Při některých aplikacích se činidlo přednostně podává perorálně.
Při některých aplikacích se činidlo přednostně podává topicky.
Dávkování
Přesnou dávku, která bude nejvhodnější pro jednotlivý subjekt obvykle určuje ošetřující lékař. Konkrétní výše dávek a frekvence podávání kterémukoliv konkrétnímu pacientu může kolísat a bude záviset na řadě faktorů, jako je účinnost použité sloučeniny, její metabolická stabilita a délka působení, věk, tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví a strava pacienta, způsob a doba podávání, rychlost vylučování, lékové kombinace, závažnost konkrétního stavu a individuální průběh léčení. Činidlo a/nebo farmaceutická kompozice podle vynálezu je možno podávat v souladu s režimem jednou až desetkrát za den, jako jednou nebo dvakrát za den.
Pro perorální a parenterální podávání humánním pacientům se denní dávka může podávat ve formě jediné dávky nebo několika dílčích dávek.
V závislosti na potřebě se činidlo může podávat v dávce od 0,01 do 30 mg/kg tělesné hmotnosti, jako od 0,1 do 10 mg/kg, přednostně od 0,1 do 1 mg/kg tělesné hmotnosti. Uvedené dávkování samozřejmě slouží jako příklad vhodný pro
průměrný případ. V jednotlivých případech se dávkování může pohybovat nad nebo pod hranicemi výše uvedených rozmezí.
Formulace
Činidlo je možno zpracovávat do formy farmaceutické kompozice například tak, že se smísí s jedním či více vhodnými nosiči, ředidly nebo excipienty za použití způsobů, které jsou v tomto oboru známy.
Dále jsou uvedeny neomezující příklady některých formulací.
Formulace 1
Tableta se připraví za použití následujících přísad:
hmotnost (mg)
Činidlo 250 Mikrokrystalická celulosa 400 Sublimovaný oxid křemičitý 10 Kyselina stearová 5 Celkem 665
Tyto složky se smísí a lisují na tablety, z nichž každá má hmotnost 665 mg.
Formulace 2
Intravenosní formulaci je možno připravit z následujících přísad:
Činidlo
Isotonický solný roztok
100 mg 1000 ml • ·
Farmaceuticky účinné soli
Činidlo může být podáváno jako farmaceuticky vhodná sůl. Farmaceuticky vhodné soli je obvykle možno snadno připravit za použití požadované kyseliny nebo báze, podle toho co je vhodné. Soli je z roztoku možno vysrážet a shromáždit filtrací nebo je izolovat odpařením rozpouštědla.
Zvířecí zkušební modely
In vivo modely je možno používat při zkoumání a/nebo navrhování terapií nebo terapeutických činidel pro léčení FSAD. Tyto modely je možno použít pro zkoumání účinků různých nástrojů/reprezentativních sloučenin z hlediska různých parametrů, které indikují odpověď v podobě sexuálního vzrušení. Takovým modelem je nehumánní zvířecí zkušební model.
Pro vaskulogenní ženskou sexuální dysfunkci (FSAD) je dostupná řada použitelných modelů.
Například je možno odkázat na invasivní zvířecí modely (například viz Park et al., 1997). V tomto případě je vaginální nebo klitoriální hemodynamické reakce možno zaznamenávat přímo po stimulaci pelvického nervu u normálních a atherosklerotických samic králíků.
Dále lze například odkázat na neinvasivní zvířecí modely (napříkla viz Goldstein et al., 1998; Laan et al., 1988). V tomto případě jsou prostředkem pro detekci změn krevního průtoku ve vaginálních a klitoriálních artériích pulzní vlny Dopplerovské ultrasonografie. Tento model je možno použít pro zkoumání vaskulogenních účinků během farmakologického podávání vasodilatancií.
·· ·· • · 0 0
Jako další použitelnou neinvasivní metodu je možno uvést vaginální fotoplethysmografii, která umožňuje kvantitativní měření překrvení vaginální sliznice, a metody vaginální termální clearance, které jsou založeny na principu, že vaginální prokrvení lze zaznamenat měřením transferu tepla z intravaginální sondy udržované při konstantní teplotě.
Zvířecí model sexuálního vzrušení
Při našich studiích byl vyvinut robustní reprodukovatelný model fyziologie sexuálního vzrušení. Tento model se používá na anestetizovaných králících a využívá laserových Dopplerovských technologií pro monitorování genitálního prokrvení při rutinním zaznamenávání kardiovaskulárních parametrů. Jsme schopni změřit malé změny vaginálního (a dokonce klitoriálního) prokrvení indukované stimulací pelvického nervu nebo infusí VIP za přítomnosti nebo za nepřítomnosti zkoušených činidel.
Věříme, že náš zvířecí model přímo reflektuje klinické údaje. Tento model je tedy možno používat při studiích činidel, která jsou potenciálně účinná při léčení FSAD, jako je měření zvýšení vaginálního nebo klitoriálního prokrvení.
Fyziologické měření ženského sexuálního vzrušení
Podle tohoto vynálezu je pro měření klitoriálního a vaginálního prokrvení možno použít řady různých postupů. Lze například použít vaginální fotoplethysmografie, NMR zobrazování klitoris nebo vagíny za použití kontrastního činidla, laser-Dopplerovského pulsního zobrazování klitoris/vulvy a ultrasonografie klitoris.
Zvlhčení vagíny je také možno měřit postupy známými v tomto oboru, jako je (a) vážení vaginálních tampónů před a po stimulaci, a (b) měření pH vaginální tekutiny.
K posledně uvedenému je účelné uvést, že médium, které se normálně nachází ve vagíně, se stává zásaditějším, když se při transsudaci kapaliny během sexuální stimulace přibližuje krevnímu pH.
NEP (neutrální endopeptidasa)
Podle vynálezu je cílem PcAMP cíl,, přičemž PcAMP cílem je NEP.
Nukleotidové sekvence a aminokyselinové sekvence NEP jsou dostupné v literatuře a některé z nich jsou uvedeny v připojeném sekvenčním protokolu.
Podle jednoho aspektu je NEP NEP (EC 3.4.24.11), také známá jako enkefalinasa nebo endopeptidasa-2. Nalezli jsme NEP EC 3.4.24.11 mRNA a exprimovaný protein v lidské a králičí vagíně.
Má se za to, že u žen, včetně žen, které trpí FSAD, je VIP degradován NEP EC 3.4.24.11. Inhibitory NEP tedy budou během vzrušení potencovat endogenní vasorelaxační účinek VIP. To povede k léčení FSAD, například prostřednictvím posílení vaginálního překrvení. Ukázali jsme, že selektivní inhibitory NEP EC 3.4.24.11 zvyšují genitální (například vaginální nebo klitoriální) prokrvení vyvolané stimulací pelvického nervu a indukované VIP. Kromě toho selektivní inhibitory NEP zvyšují relaxaci izolované stěny vagíny mediované VIP a nervově.
Základní poznatky o NEP zveřejnili Victor A. McKusick et al. na http://www3.ncbi.hlm.nih.gov/0mim/searchomim.htm..
• · · · · · · ···· ··· r· ··· «
Následující informace týkající se NEP jsou výňatkem z tohoto zdroje.
Obecný antigen akutní lymfocytové leukémie (common ALLA, CALLA) je důležitým buněčným povrchovým markérem při diagnóze lidské akutní lymfoblastové leukémie (ALL). Je přítomen na leukemických buňkách pre-B fenotypu, což představuje 85 % případů ALL. CALLA se však neomezuje na leukemické buňky, a lze ho nalézt u řady normálních tkání. CALLA je glykoprotein, který je zvláště hojný v ledvinách, kde je přítomen na kartáčovém lemu proximálních tubulů a na glomeruálním epithelu. Letarte et al. (1988) klonovali cDNA kódující CALLA a ukázali, že aminokyselinová sekvence dedukovaná z cDNA sekvence je identická se sekvencí lidské neutrální endopeptidasy asociované s membránami (NEP; EC 3.4.24.11), známé také jako enkefalinasa. NEP štěpí peptidy v aminovém místě hydrofobních zbytků a inaktivuje několik peptidových hormonů, jako glukagon, enkefaliny, látku P, neurotensin, oxytocin a bradykinin. Transfekční analýzou cDNA Shipp et al. (1989) potvrdili, že CALLA je funkční neutrální endopeptidasou typu, který byl dříve uváděn jako enkefalinasa. Barker et al. (1989) doložili, že CALLA gen, který kóduje lOOkD transmembránový glykoprotein typu II existuje v jediné kopii o více než 45 kb, které u malignancí exprimujících CALLA na povrchu buněk není přeskupen. Gen byl lokalizován na lidském chromozomu 3 studií hybridních somatických buněk a in šitu hybridizací lokalizován na 3q21-q27. Tran-Paterson et al. (1989) za použití Southernovy analýzy DNA z hybridních lidských-hlodavčích buněk lokalizovali tento gen na chromosomu 3. D'Adamio et al. (1989) doložili, že gen CALLA má rozsah více než 80 kb a je tvořen 24 exony.
9 · » » · <
*9 ··»·
I:NEP
Jak již bylo uvedeno výše, činidlem může být jakékoliv vhodné činidlo, které působí jako I:NEP.
Podrobnosti o vhodném systému pro identifikaci a/nebo studium I:NEP jsou uvedeny v následujícím oddílu.
I:NEP pojednávají následující přehledné články:
Pathol. Biol., 46(3), 1998, 191.
Current Pharm. Design, 2(5), 1996, 443. Biochem. Soc. Trans., 21(3), 1993, 678.
Gen. Pharmacol., (1996), 27(4), 581.
Cardiovasc. Drug Rev., (1994), 12(4), 271.
Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., (1995), 22(1), 63.
Handbook Exp. Pharmacol., 104/1,1993, 547 Cardiovasc. Drug Rev., (1991), 9(3), 285.
TiPS, 11,1990, 245.
Pharmacol. Rev., 45(1), 1993, 87.
Curr. Opin. Inves. Drugs, 2(11), 1993,1175. Antihypertens. Drugs, (1997), 113. Chemtracts, (1997), 10(11), 804.
Zino Metalloproteases Health Dis. (1996), 105. Cardiovasc. Drug Rev., (1996), 14(2), 166.
Exp. Opin. Ther. Patents (1996), 6(11), 1147.
I:NEP jsou popsány v následujících dokumentech
EP-509442A
US-192435
US-4929641
EP-599444B
US-884664
EP-544620A
US-798684
J. Med. Chem. 1993, 3821.
Circulation 1993, 88(4), 1.
EP-136883
JP-85136554 US-4722810
Curr. Pharm. Design, 1996, 2, 443.
EP-640594
J. Med. Chem. 1993, 36(1), 87.
EP-738711-A
JP-270957
CAS# 115406-23-0
DE-19510566
DE-19638020
EP-830863
JP-98101565
EP-733642
WO9614293
JP-08245609
JP-96245609
W09415908
JP05092948
Přednostní I:NEP jsou dokumentech: EP-A-0274234
JP-88165353
WO-9309101
WO-9109840
EP-519738
EP-690070
J. Med. Chem. (1993), 36, 2420.
JP-95157459
Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996, 6(1), 65 popsány v následujících
Biochem.Biophys.Res. Comm.,1989,164, 58
EP-629627-A
US-77978
Perspect. Med. Chem. (1993), 45.
EP-358398-B
Přednostní příklady I:NEP jsou zvoleny ze sloučenin následujících strukturních vzorců:
Sloučenina Strukturní vzorec Typ působení Odkaz
FXII Me l:NEP EP-509442A US-192435 US-4929641
FXIII Ω θ ho2c-a J [ -SH Y/ I:NEP (také inhibitor ACE) EP-599444B US-884664
FXIV ° 0 OH I:NEP EP-544620A US-798684 J. Med. Chem. 1993,3821.
FXV I.-NEP (také inhibitor ACE) Mixanpril Circulation 1993,88(4), 1.
- Π 0 1 HOjC Me
FXVI HS^, X? 1 H χγΝ'-/χσο2Η 0 I:NEP EP-136883 JP-85136554 US-4722810
FXVII c HS. \ O 0 A^o„ H I:NEP Retrothiorphan Curr. Pharm. Design, 1996, 2, 443.
FXVIII HS' O θ 0 >NA o co2h I:NEP (také inhibitor ACE) EP-640594
FXIX HSX c Π 1 C0,H 1 H 2 I:NEP J. Med. Chem. 1993, 36(1), 87.
FXX ^^hXC02H V-A 3 «X I.-NEP (také inhibitor ACE) EP-738711-A JP-270957
FXXI a 9 OH μ/- - AňV 0 0 M 0 I:NEP CAS# 115406-23-0
FXXII c H YYycOjEt I:NEP (také inhibitor ECE) DE-19510566 DE-19638020 EP-830863 JP-98101565
FXXIII X o φΓο °<A-O HO.C-7 I:NEP (také inhibitor ECE) EP-733642
FXXIV 0 0 Ό I:NEP WO96/14293
FXXV i 9 Η0Ίί^ΝΥΝΎΛθΗ ° ° I:NEP JP-08245609 JP-96245609
FXXVI ° h ho-n'O><yN'^-CO,h H 0 I:NEP WO9415908
FXXVII 0 0 ηο·ν^Λο2η I:NEP JP05092948
FXXVIII |H HS^zC^N^N, Y Y Yi 0 N-n '-COjH I:NEP WO-9309101
FXXIX HS^fNY^Sx· 0 co2h I:NEP WO-9109840
FXXXI t O ho2c I:NEP EP-519738 EP-690070
FXXXII HOjC.·/^ οθγΝ~γΗ ď I:NEP (také inhibitor ACE) J. Med. Chem. (1993), 36, 2420.
FXXXIII ^ho^^^^X^,n^co2h 0 0 I:NEP JP-95157459 Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996, 6(1), 65.
I:NEP, kterým se dává největší přednost jsou zvoleny ze sloučenin následujících strukturních vzorců:
Sloučenina Strukturní vzorec Typ působení Odkaz
FV w 0 I:NEP EP-A-0274234 (příklad 300)
FVI 0 I:NEP EP-A-0274234 (příklad 379)
FVII OMe s OH I.-NEP Kandoxatrilat EP-274234 JP-88165353 Biochem.Biophys.Res. Comm.,1989,164. 58
FVIII 4_/j3H ;^-n J? ?°2h 0 \Ν'Ϋ S H I-.NEP Omapatrilat (také inhibitor ACE) EP-0629627-A US-77978
FIX NHSO2Me h2n^YV '^OH I:NEP Sampatrilat (také inhibitor ACE) Perspect. Med. Chem. (1993), 45. EP-0358398-B
FX Me sX Α \__HO I H H0<v xP-nJVn'<vJh k/o 0 H « co2h H° OH I:NEP Fosforamidon (dostupný na trhu)
FXI ks^Y-V0» ď I:NEP Thiorfan (dostupný na trhu)
Větší přednost se dává I:NEP zvoleným z následujících sloučenin:
· ·· 0 00 00
0 · · 0 0 0 0 0 0 0 0 ·· 0 · · 0 0 * • · 000 000 0000 *00 00 000 00 0000
Tyto sloučeniny byly připraveny za použití způsobů popsaných v příkladech provedení. Také byly zkoušeny jako činidla, a ty, o nichž bylo zjištěno, že jsou užitečné při potenciaci cAMP, jsou tedy užitečné při léčení FSAD. Některé údaje ze zkoušek těchto sloučenin jsou uvedeny v příkladech provedení.
Stanovení NEP
Příprava a stanovení rozpustné neutrální endopeptidasy (NEP) z kůry ledvin psa, potkana a králíka
Rozpustná NEP byla získána z kůry ledviv a její aktivita byla stanovena měřením rychlosti štěpení NEP substrátu, Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp, za vzniku jeho fluorescenčního produktu, Abz-D-Arg-Arg.
Zkušební postup
1. Látky
Veškerá voda byla dvojitě deionizována.
1.1. Tkáně
Lidské ledviny IIAM (Pensylvania, USA)
Potkaní ledviny
Králičí ledviny
Psí ledviny
1.2. Homogenizační médium lOOmM mannitol a 20mM Tris o pH 7,1
2,42 g Tris (Fisher T/P630/60) se zředí v 1 litru vody a pH zředěné směsi se za použití 6M kyseliny chlorovodíkové při • φ
·· ·· • 9 Φ · • · · • * φ
Φ··· teplotě místnosti nastaví na 7,1. K této směsi se přidá mannitol (Sigma M-9546).
1.3. Tris pufr (NEP pufr)
50ml 50mM Tris pH 7,4 (Sigma T2663) se zředí 950 ml vody.
1.4. Substrát (Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp)
Připraví se podle pokynů firmy SNPE a skladuje se jako prášek při -20°C. 20mM zásobní suspenze se připraví šetrným resuspendováním substrátu v Tris pufru, přičemž by se nemělo používat ani vířivého pohybu ani sonikace. 600μ1 alikvoty 2mM zásobní suspenze se skladují až 1 měsíc při -20. (Medeiros, M.A.S., Franca, M. S. F. et al., 1997, Brazilian Journal of Medicinal and Biological Research, 30, 1157 až 1162 ) .
1.5. Úplný produkt
Na desku se zařadí vzorky odpovídající 100% konverzi substrátu na produkt, aby bylo možno stanovit % obratu substrátu. Úplný produkt se vytvoří inkubací 1 ml 2mM substrátu s 20 μΐ zásobní suspenze enzymu po dobu 24 hodin při 37°C.
1.6. Ukončovací roztok
Za použití NEP pufru se připraví 300μΜ zásobní roztok Fosforamidonu (Sigma R7385), který se v 50μ1 alikvotech skladuje při -20.
1.7. Dimethylsulfoxid (DMSO)
1.8. Chlorid hořečnatý (MgCl2.6H2O, Fisher M0600/53)
* · *·
• ·· • · 1 <
•
• • · · • · •
·· ··« «.· hlt *·
1.9. Černé destičky s 96 jamkami s kulatým dnem (Costar 3915)
1.10. TopSeal A (Packard 6005185)
1.11. Centrifugační zkumavky
2. Speciální zařízení
2.1. Centrifuga Sorvall RC-5B (rotor SS34 GSA, předchlazená na 4°C).
2.2. Miniprimer mixér Braun
2.3. Centrifuga Beckman CS-6R
2.4. Fluorstar Galaxy
2.5. Třepaný inkubátor Wesbart 1589
3. Postupy
3.1. Tkáňové preparáty
3.2. Psí, potkanní, králičí a lidská NEP se získá z kůry ledvin za použití modifikovaného způsobu popsaného v Booth,
A. G. a Kenny, A. J. (1974) Biochem. J. 142, 575 až 581.
3.3. Zmrazené ledviny se nechají roztát při teplotě místnosti a od medully se oddělí kůra.
3.4. Kůra se jemně naseká a homogenizuje přibližně v 10 objemech homogenizačního pufru (1.2) za použití mixéru Miniprimer Braun (2.2)
3.5. K homogenátu se přidá chlorid hořečnatý (1.8) (20,3 mg/ /g tkáně) a vzniklá směs se 15 minut míchá v lázni z ledové vody.
3.6. Homogenát se v centrifuze Beckman (2.3) centrifuguje při 1500xg (3820 min ) po dobu 12 minut. Supernatant se přemístí do čerstvé centrifugační zkumavky a peleta se zahodí.
3.7. Supernatant se v centrifuze Sovall (2.1) centrifuguje při 15 OOOxg (12 100 min“1) po dobu 12 minut a supernatant se zahodí.
3.8. Světle růžová vrstva na vrchu výsledné pelety se oddělí a resuspenduje v homogenizačním pufru obsahujícím chlorid sodný (9 mg chloridu sodného v 5 ml pufru na 1 g tkáně).
3.9. Suspenze se v centrifuze Beckman (2.3) centrifuguje při 2200xg (4630 min“1) po dobu 12 minut a peleta se zahodí.
3.10. Supernatant se v centrifuze Sovall (2.1) centrifuguje při 15 OOOxg (12 100 min“1) po dobu 12 minut a supernatant se zahodí.
3.11. Výsledná peleta se resuspenduje v homogenizačním pufru obsahujícím chlorid hořečnatý (0,9 mg chloridu hořečnatého v 0,5 ml pufru na 1 g tkáně). Homogenní suspenze se získá za použití mixéru Braun Miniprimer (2.2), v ΙΟΟμΙ alikvotech zmrazí a je možno ji zkoušet na aktivitu NEP.
4.0. Stanovení aktivity NEP
Aktivita se za použití alikvotů NEP připravených výše popsaným způsobem měří jako schopnost štěpit NEP specifický peptidový substrát.
4.1. Připraví se 4% roztok DMSO v NEP pufru (4 ml DMSO v 96 ml NEP pufru).
4.2. Zásobní substrát, úplný produkt, enzym a roztok fosforamidonu se nechají roztát na ledu.
4.3. Do každé jamky se přidá 50 μΐ 4% roztoku DMSO v NEP pufru.
4.4. 2mM zásobní substrát se zředí 1:4, čímž se získá 50μΜ roztok. Do každé jamky se přidá ΙΟΟμΙ 50μΜ substrátu (konečná koncentrace 25μΜ).
4.5. Reakce se zahájí přídavkem 50μ1 od každé koncentrace ze sériového ředění enzymu (obvykle se používá ředění 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 a 1:3200). Do prázdných jamek se přidá 50 μΐ NEP pufru.
4.6. 2mM úplný produkt se zředí v poměru 1:80, čímž se získá 25μΜ roztok. 200 μΐ 25μΜ produkt se přidá do prvních čtyřech jamek nové destičky.
4.7. Destičky se inkubují v třepacím inkubátoru po dobu 60 minut při 37°C.
4.8. 300μΜ zásobní roztok fosforamidonu se zředí 1:100, čímž se získá 300nM roztok. Reakce se zastaví přídavkem 100 μΐ 300nM fosforamidonu. Výsledná směs se inkubuje v třepacím inkubátoru 20 minut při 37“C a odečítá na zařízení Fluostar (ex320/em420).
Stanovení NEP inhibice
5.1. Substrát, úplný produkt, enzym a zásobní roztok fosforamidonu se nechají roztát na ledu.
100
5.2. Zásobní roztoky sloučenin se připraví za použití 100% dimethylsulfoxidu a zředí v poměru 1 : 25 NEP pufrem, čímž se získají 4% dimethylsulfoxidové roztoky. Všechna další ředění se provádějí za použití 4% dimethylsulfoxidového roztoku (4 ml DMSO v 96 ml NEP pufru).
5.3. 50μ1 sloučeniny se dvojmo navzorkuje do 96jamkových destiček; do kontrolních jamek a jamek pro slepý pokus se navzorkuje 50 μΐ 4% roztoku DMSO v NEP pufru.
5.4. 2mM zásobní substrát se zředí v poměru 1 : 40 za použití NEP pufru, čímž se získá 50μΜ roztok (275 μΐ 2mM substrátu na 10,73 ml pufru postačuje pro 1 destičku).
5.5. Zásobní enzym se zředí NEP pufrem (stanoveno z kontrol aktivity).
5.6. 2mM zásobní úplný produkt se zředí v poměru 1 : 80 NEP pufrem, čímž se získá 25μΜ roztok. Do prvních čtyřech jamek separátní destičky se navzorkuje 200 μΐ.
5.7. 300μΜ zásobní roztok fosforamidonu se zředí v poměru 1 : 1000, čímž se získá 300nM zásobní roztok (11 μΐ fosforamidonu na 10,99 ml NEP pufru).
5.8. Do každé jamky 96jamkové destičky se přidají následující látky:
101
Tabulka látek, které se mají navzorkovat do 96jamkové destičky
Sloučenina/ DMSO Tris pufr Substrát Enzym NEP Úplný produkt
vzorky 2 μΐ sloučeniny 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ žádný
kontrolní 2 μΐ DMSO 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ žádný
slepé pokusy 2 μΐ DMSO 100 μΐ 100 μΐ žádný žádný
s úplným produktem 2 μΐ DMSO žádný žádný žádný 200 μΐ
5.9. Reakce se zahání přídavkem NEP ’ enzymu a pokračuje
j ednohodinovou inkubací při 37°C v třepacím . inkubátoru
5.10. Reakce se ukončí 100 μΐ 300nM fosforamidonu. Směs se inkubuje 20 minut při 37°C v třepacím inkubátoru. Odečet se provádí za zařízení Fluostar (ex320/em420).
6. Výpočty
Aktivita enzymu NEP se stanoví za přítomnosti a za nepřítomnosti sloučeniny a vyjádří se pomocí procent.
FU = jednotky fluorescence
Kontrolní aktivita (%) (obrat enzymu)
Střední hodnota Střední hodnota
FU kontroly - FU slepých pokusů
- x 100
Střední hodnota FU s úplným produktem
Střední hodnota FU slepých pokusů
102
Aktivita s inhibitorem (%)
Střední hodnota Střední hodnota
FU sloučeniny - FU slepých pokusů
--- x 100
Střední hodnota
FU úplného - Střední hodnota produktu FU slepých pokusů
Aktivita vyjádřená jako % kontroly
Aktivita s inhibitorem (%) - x 100
Kontrolní aktivita (%)
Proloží se S-křivka závislosti odpovědi na dávce (% aktivity (% kontroly) versus koncentrace sloučeniny) a za použití balíčku LabStats pro extrapolaci křivek v Excelu se vypočítají hodnoty IC50·
PDE (fosfodiesterasa)
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu může přídavným cílem být další PcAMP cíl, jako PDE (fosfodiesterasa), konkrétně PDE hydrolyzující cAMP (a popřípadě hydrolyzující cGMP).
Je známo, že cyklické nukleotidy, jako cAMP a cGMP, jsou důležitým intracelulárními druhými posly. Cyklický nukleotid fosfodiesterasy - jinak známé jako PDE - tvoří třídu enzymů, které katalyzují degradaci cyklických nukleotidů, a tím že takto působí, představují jednu z buněčných složek, které regulují koncentraci cyklických nukleotidů.
103
V posledních letech bylo na základě substrátové afinity a potřeby kofaktorů definováno alespoň sedm PDE enzymů (jako PDEI až PDEVII) a dále mnoho podtypů těchto enzymů (Beavo J. A. a Reifsnyder D. Η., Trends Pharmacol. Sci. 11: 150, 1990; Beavo J., Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo, J. a Housley, M. D. (ed.), Wiley: Chichester, str. 3 až 15, 1990).
Jako příklady PDE je možno uvést PDEI, což je Ca2+/kalmodulin-dependentní PDE; PDEII, což je cAMP a cGMP stimulovaná PDE; PDEIII, což je cGMP inhibovaná PDE; PDEIV, což je vysoce afinitní cAMP-specifická PDE; a PDEV, což je cGMP specifická PDE. PDEI atd. jsou někdy také označovány jako PDE typu I atd. nebo PDE typu 1 atd.
Každá třída PDE může obsahovat dvě či více isoforem (tzn. že mohou existovat dva či více PDE isoenzymů). Například o savčím PDE IV, homologů genu hlupců (Dunce) octomilek (Chen, C. N. et al., Proč. Nat. Acad. Sci., 8SA, 83. 9313, 1986), je známo, že u potkanů tvoří čtyři isoformy (Swinnen J. V. et al., Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 86: 5325, 1989). O lidských PDE je také známo, že se vyskytují jako isoformy a mají sestřihové varianty. Například v roce 1990 bylo popsáno klonování lidské isoformy PDEIV z monocytů (Livi, G. P. et al., Mol. Cell. Biol., 10: 2678, 1990). Dále například jiní pracovníci nezávisle klonovali sestřihové varianty PDEIV, které jsou nyní označovány jako hPDEIV-Bl, hPDEIV-B2 a hPDEIV-B3.
Informace o cyklický nukleotid fosfodiesterasách lze také nalézt v US-A-5 932 423 a US-A-5 932 465.
Informace o cyklický nukleotid fosfodiesterase, zejména CN PCDE8, je možno nalézt ve WO-A-97/35989. Podle
104
• 9 9 9 9 9 9 • · 9 ·· • 9 9 9 99 9 · •
• 9 9 9 9 9 9 99 9 9 · 9 9 • ····
WO-A-97/35989 má CN PCDE8 dva isozymy, které se označují jako CN PCDE8A a CN PCDE8B. Pojmem isozym bývá v tomto boru někdy označována isoforma.
Podle WO-A-97/35989 byla identifikována řada inhibitorů PDE, a některé z nich prošly klinickými zkouškami. Například byly vyvinuty inhibitory PDEIII jako protitrombotická činidla, antihypertensivní činidla a jako kardiotonická činidla, užitečná při léčení městnavého srdečního selhání. Rolipram, inhibitor PDEIII, se používá při léčení deprese a jiné inhibitory PDEIII jsou nyní zkoušeny jako protizánětlivá činidla. Také se ukázalo, že Rolipram inhibuje lipopolysacharid (LPS) indukovaný TNF-alfa, o němž se ukázalo, že podporuje replikaci HIV-1 in vitro. Rolipram tedy může inhibovat replikaci HIV-1 (Angel et al., 1995, AIDS 9: 1137 až 1144). Kromě toho na základě své schopnosti potlačovat produkci TNF-alfa a beta a interferonu-gamma, se rolipram ukázal být užitečným při léčení encefalomyelitis, experimentálním zvířecím modelu roztroušené sklerosy (Sommer et al., 1995, Nat. Med. 1: 244 až 248) a může být účinný při léčení tardivní dyskinesie (Sasaki et al., 1995, Eur. J. Pharmacol. 282: 71 až 76).
Podle WO-A-97/35989 také existují nespecifické inhibitory PDE, jako teofylin, kterého se používá při léčení asthma bronchiale a jiných respiračních chorob, a pentoxifylin, kterého se používá při léčení intermitentní klaudikace a periferních vaskulárních chorob indukovaných diabetes. Teofylin je považován za látku, která ovlivňuje funkci hladkého svalu dýchacích cest a prostřednictvím svých protizánětlivých či imunomodulačních vlastností je užitečný při léčení respiračních chorob (Banner et al., 1995, Respir. J. 8: 996 až 1000), přičemž se předpokládá, že působí prostřednictvím inhibice hydrolýzy jak CN PDE cAMP tak cGMP (Banner et al., 1995, Monaldi Arch. Chest. Dis. 50: 256 až
105
V 9 9 9 0* • 0
0 0 • 0 · • · 0 0 • 0 0 0 0 0 •
• • 0· 0 · • 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
292). Pentoxyfilin, o němž je také známo, že blokuje produkci TNF-alfa, může inhibovat replikaci HIV-1 (Angel et al., viz výše). Seznam CN PDE inhibitorů je uveden v publikaci Beavo 1995 viz výše.
Předpokládá se, že selektivní inhibitory PDE, kromě svých isozymů a jejich podtypů, povedou k účinnější terapii s menšími vedlejšími účinky. Viz Vieshaar, R. E. et al., J. Med. Chem., 28: 537, 1985; Giembycz, M. A., Biochem. Pharm., 43: 2041, 1992; a Lowe, J. A. a Cheng, J. Β., Drugs of the Future, 17: 799 až 807, 1992.
Při některých aplikacích je tedy žádoucí dosáhnout selektivní inhibice konkrétního typu PDE.
Základní informace o PDE jsou uvedeny na adrese http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/searchomem.htm (Victor A. McKusick et al.). Následující údaje týkající se PDE2 nebo cGMP-stimulované PDE pocházejí z tohoto zdroje.
Cyklické nukleotidy slouží jako druzí poslové, kteří zprostředkovávají různé buněčné reakce na extracelulární signály, jako hormony, světlo a neurotrasmitery. Cyklický nukleotid fosfodiesterasy (PDE) se podílejí na transdukci signálu regulací koncentrace cyklických nukleotidů v buňkách. Savčí buňky obsahují různé PDE, které se na základě své afinity k substrátům a selektivní citlivosti ke kofaktorům a inhibičním látkám dělí do 7 tříd. Těmito třídami jsou: (I) Ca(2a)/kalmodulin-dependentní PDE; (II) cGMP-stimulované PDE; (III) cGMP-inhibované PDE; (IV) cAMP-specifické PDE; (V) cGMP-specifické PDE; (VI) fotoreceptorové PDE; a (VII) vysoce afinitní, cAMP-specifické. Z aminokyselinových sekvencí je zřejmé, že všechny třídy PDE obsahují příbuznou doménu, o níž se předpokládá, že je doménou katalytickou, s přibližně 30% sekvenční identitou •9 *· • 9 v
106
9 • ♦ ·· e · ·
• 9 ···· 1«· » 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 *99 99 9999 mezi třídami. Příslušníci stejné třídy si jsou podobnější; sdílejí 60 až 80% sekvenční identitu v rámci celé kódující oblasti.
Michaeli et al. (1993) vyvinuli vysoce citlivý funkční screening pro izolaci cDNA kódujících cAMP fosfodiesterasy komplementací defektů v kmeni Saccharomyces cerevisiae postrádajícím oba endogenní cAMP PDE geny, PDE1 a PDE2. Za použití tohoto funkčního screeningu byly z cDNA knihovky lidského glioblastomu izolovány tři skupiny cDNA odpovídající třem různým lidským genům kódujícím cAMP-specifické PDE. Dva z těchto genů jsou blízce příbuzné genu hlupců (dunce) cAMP-specifické PDE octomilky. Třetí gen, který Michaeli et al., (1993) označují jako HCP1, kódoval novou cAMP-specifřekou PDE. Aminokyselinová sekvence HCP1 byla podobná sekvencím katalytických domén všech cyklický nukleotid fosfodiesteras. Je to však vysoce afinitní cAMP-specifická PDE, která nesdílí jiné vlastnosti třídy cAMP-specifických PDE. PDE aktivita HCP1 nebyla citlivá na cGMP nebo jiné inhibitory cGMP-inhibovatelné PDE. Biochemické a farmakologické vlastnosti HCP1 kolektivu Michaeli et al. napověděly, že se jedná o příslušníka dříve neobjevené třídy cyklický nukleotid PDE, kterou tento kolektiv označil jako třídu VII. Analýza northern přenosem ukázala přítomnost vysokých hladin HCP1 RNA v kosterním svalstvu člověka.
Analýzou Southernovým přenosem hybridních linií somatických buněk Milatowich et al. (1994) zamapovali HCP1 lokus na chromosom 8; studií hybridních linií somatických buněk, které obsahovaly různé oblasti chromosomu 8, regionalizovali přiřazení na 8ql3-q22. Han et al. (1998) fluorescenční hybridizací in sítu zamapovali gen PDE7A na 8ql3 a mezidruhovou křížovou analýzou zamapovali myší gen Pde7A na proximální oblast chromosomu 3.
- 107
Základní informace o PDE2 zveřejnili Jennifer P. Macke et al. na adrese http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/ /searchomim.htm. Následující informace týkající se PDE2 stimulované cGPM jsou výtahem z tohoto zdroje.
Rosman et al. (1997) klonovali cDNA odpovídající lidské PDE2A. Gen PDE2A kóduje polypeptid s 941 aminokyselinami s předpokládanou molekulovou hmotností 106 kD. Sekvence proteinu je z 90 % identická s bovinní a potkaní sekvencí PDE2A. Analýza northern blot ukázala, že PDE2A se exprimována jako 4,2kb mRNA v různých úrovních ve všech zkoušených tkáních, s nejvyšší expresí v mozku. Expresní studie ukázaly, že PDE2A hydrolyzuje cAMP a cGMP a je inhibována PDE2A-specifickým inhibitorem EHNA.
Nukleotidové sekvence a aminokyselinové sekvence pro fosfodiesterasy jsou dostupné z literatury. Některé sekvence jsou uvedeny v připojeném sekvenčním protokolu.
Podle jednoho aspektu je PDE cíl zvolen z jednoho nebo více následujících PDE enzymů: PDEcAMp 1, PDEcAMp 2, PDEcAMP 3' PDEcAMP 4' PDEcAMP 7 a PDEcAMP θ·
Ve výhodnějším provedení je PDE cíl zvolen z jednoho nebo více následujících PDE enzymů: PDEcAMp 1, PDEcAMp 2, pdecAMP 3' pdecAMP 4· ’
Pro tento vynález je PDE cíl alespoň PDE2.
I:PDE
Jak již bylo uvedeno výše, přídavným činidlem může být jakékoliv vhodné činidlo, které může působit jako I:PDE. Navíc, nebo alternativně, činidlo podle vynálezu také může účinkovat jako I:PDE.
108
Příklady I:PDE jsou popsány v EP-A-091133 a EP-A-0771799.
I:PDE je přednostně I:PDE2. Přednostními příklady takových sloučenin jsou tedy sloučeniny uvedené v dokumentu EP-A-0771799.
Pro účelnost je zde uveden nárok 1 EP-A-0771799:
Deriváty purin-6-onu obecného vzorce I
R představuje vodík nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 8 atomů uhlíku;
R2 představuje lineární nebo rozvětvenou acylskupinu obsahující až 4 atomy uhlíku, nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 8 atomů uhlíku popřípadě substituovanou hydroxyskupinou, azidoskupinou nebo skupinou obecného vzorce -NR3R4 nebo -OSO2R5; kde
R3 a R4 jsou stejné nebo různé a představují cykloalkylskupinu obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, vodík, formylskupinu, nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou lineární nebo rozvětvenou alkoxyskupinou nebo alkoxykarbonylskupinou obsahující až 6 atomů uhlíku nebo skupinou obecného vzorce -(CO)a-NR6R7, kde • · ··
- 109
a představuje číslo 0 nebo 1;
R6 a R7 jsou stejné nebo různé a představují vodík, formylskupinu, hydroxyskupinu, fenylskupinu nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku popřípadě substituovanou hydroxyskupinou nebo lineární nebo rozvětvenou alkoxyskupinou obsahující až 5 atomů uhlíku; nebo
R3 a/nebo R4 představuje lineární nebo rozvětvenou alkoxykarbonylskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, karboxyskupinu nebo lineární nebo rozvětvenou acylskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku popřípadě substituovanou hydroxyskupinou nebo lineární nebo rozvětvenou alkoxyskupinou obsahující až 4 atomy uhlíku; nebo
R3 a/nebo R4 představuje zbytek vzorce -(CO)k-T-NR8R9,
-COR10, -SO2R1X nebo -SO2NR12R13, kde b má význam uvedený výše pro a, přičemž může mít konkrétní hodnotu stejnou jako a nebo odlišnou od a;
T může představovat lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 5 atomů uhlíku, nebo když b není rovno 0, může také představovat vazbu;
R8 a R9 mají význam uvedený pro R6 a R7, přičemž mohou být stejné jako R6 a R7 nebo odlišné od R6 a R7;
R představuje nasyceny, castecne nasyceny nebo nenasycený pěti- až sedmičlenný heterocyklus obsahující až 3 heteroatomy zvolené z atomů síry, dusíku a/nebo kyslíku, který je také popřípadě substituován na dusíkaté funkční skupině lineární nebo
- 110 • ·
rozvětvenou alkylskupinou, alkoxyskupinou nebo alkoxykarbonylskupinou obsahující až 4 atomy uhlíku, karboxyskupinou, benzyloxykarbonylskupinou nebo hydroxyskupinou;
R představuje lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 5 atomů uhlíku, benzylskupinu nebo fenylskupinu;
R12 a R13 jsou stejné nebo různé a představují vodík, fenylskupinu nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo
R3 a R4 dohromady s atomem dusíku tvoří pěti- nebo šestičlenný nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený heterocyklus, který může obsahovat až 3 heteroatomy zvolené z atomů dusíku, síry a/nebo kyslíku nebo zbytek -NR14 a který je popřípadě substituován karbonylskupinou, lineární nebo rozvětvenou alkoxykarbonylskupinou obsahující až 5 atomů uhlíku nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinou obsahující až 5 atomů uhlíku, která dále může být substituována hydroxyskupinou, karboxyskupinou nebo lineární nebo rozvětvenou acylskupinou, alkoxyskupinou nebo alkoxykarbonylskupinou, z nichž každá obsahuje až 6 atomů uhlíku; kde
R14 představuje vodík, karbonylskupinu nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu nebo alkoxykarbonylskupinu, z nichž každá obsahuje až 5 atomů uhlíku; a
R5 představuje fenylskupinu nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 5 atomů uhlíku;
• ·
- 111
A představuje lineární nebo rozvětvený alkylenový nebo alkenylenový řetězec, z nichž každý obsahuje až 6 atomů uhlíku;
D a L jsou stejné nebo různé a představují arylskupinu obsahující 6 až 10 atomů uhlíku nebo pěti- až sedmičlennou aromatickou, popřípadě benzoanelovanou heterocyklickou skupinu obsahující až 3 heteroatomy zvolené z atomů síry, dusíku a/nebo kyslíku, která je popřípadě substituována až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo různé, zvolenými ze souboru sestávajícího z halogenu, hydroxyskupiny nitroskupiny, trifluormethylskupiny, karboxyskupiny, lineární nebo rozvětvené alkylskupinu, alkoxyskupiny nebo alkoxykarbonylskupinu, z nichž každá obsahuje až 6 atomů uhlíku, nebo skupinou vzorce -(V)C-NR15R16 a/nebo -OR17, kde c představuje číslo 0 nebo 1;
V představuje zbytek vzorce -CO nebo -SO2;
R15 a R16 jsou stejné nebo různé a mají význam uvedený výše pro R3 a R4;
R17 představuje vodík, lineární nebo rozvětvenou alkenylskupinu obsahující až 8 atomů uhlíku nebo lineární nebo rozvětvenou alkylskupinu obsahující až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě substituována až 3 substituenty, které mohou být stejné nebo různé, zvolenými z hydroxyskupiny, karbonylskupiny a lineární nebo rozvětvené alkoxykarbonylskupiny obsahující až 5 atomů uhlíku; a/nebo kruhy jsou popřípadě substituovány arylskupinou obsahující 6 až 10 atomů uhlíku nebo pěti- až sedmičlenným
112
aromatickým, popřípadě benzoanelovaným heterocyklem obsahujícím až 3 heteroatomy zvolené z atomů síry, dusíku a/nebo kyslíku, který je dále popřípadě substituován až dvěma substituenty, které mohou být stejné nebo různé, zvolenými z halogenu, hydroxyskupiny, nitroskupiny, karboxyskupiny, trifluormethylskupiny nebo lineární nebo rozvětvené alkylskupiny, alkoxyskupiny nebo alkoxyskupiny, z nichž každá obsahuje až 5 atomů uhlíku nebo skupinou vzorce (V)d-NR18R19; kde d má význam uvedený výše pro a, přičemž může mít konkrétní hodnotu stejnou jako a nebo odlišnou od a;
η o η n o a
R a R mají vyznám uvedeny pro R a R, přičemž mohou být stejné jako R3 a R4 nebo odlišné od R3 a R4;
V má význam uvedený výše pro V, přičemž může být stejný jako V nebo odlišný od V; a/nebo představuje kruhový systém uvedený dále pro D, popřípadě substituovaný lineární nebo rozvětvenou acylskupinou obsahující až 5 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou hydroxyskupinou, lineární nebo rozvětvenou alkoxyskupinou obsahující až 5 atomů uhlíku nebo 2Ω 91 skupinou vzorce -NR R ; kde
Π 91 o
R a R jsou stejne nebo ruzne a mají vyznám uvedeny výše pro R3 a R4; nebo
E představuje zbytek vzorce -CH2-Y-Z-; kde
Y představuje vazbu nebo atom kyslíku nebo síry nebo skupinu vzorce -NH-;
113
Z představuje lineární nebo rozvětvený alkylový řetězec obsahující až 5 atomů uhlíku; a
D představuje zbytek vzorce
a jejich tautomery a soli.
Přednostní I:PDE jsou zvoleny ze sloučenin následujících strukturních vzorců:
Typ působení
Sloučenina Strukturní vzorec odkaz
Fla Ok 5^- I.PDE1 EP-A-0911333 (příklad 50)
Flb nh2 I:PDE2
-N '> -N EHNA
V (také inhibitor ade-
nosin deaminasy)
OH
FII OMe 0 I:PDE2
MeO-A. | ll ΗΝ'γ -N /d '> X > N _ /=^/ EP-A-0771799
A 2 N Milrinon
(dostupný na trhu)
0
Fill Λ I:PDE3
V Rolipram
VÍ (dostupný na trhu)
NY ''CN
OH
FIV A I:PDE4 Rolipram
MeO^X (dostupný na trhu)
YA Ό™
V o
114
NPY (néuropeptid Y)
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu je přídavným cílem PcAMP cíl, přičemž tímto PcAMP je NPY nebo jeho sdružené receptory.
Nukleotidové sekvence a aminokyselinové sekvence pro NPY a jeho receptory jsou dostupné z literatury. Některé sekvence jsou uvedeny v připojeném sekvenčním protokolu.
Zjistili jsme, že néuropeptid Y (NPY) uplatňuje inhibiční regulační vliv na vasorelaxaci zprostředkovanou vasoaktivním intestinálním peptidem (VIP). Inhibice receptorů NPY tedy povede ke zvětšení zvýšení prokrvení genitálií (například vagíny nebo klitoris) zprostředkovanému pelvickým nervem nebo VIP. To klinicky povede ke zvýšenému vaginálnímu a/nebo klitoriálnímu překrvení, což se nakonec projeví ve zvýšené lubrikaci prostřednictvím trassudace plasmy a zvýšení poddajnosti vagíny. Vhodným cílem pro léčení FSAD je tedy NPY nebo některý z jeho sdružených receptorů.
Podle jednoho přednostního aspektu je tedy přídavným činidlem antagonista NPY Y^ Y2 nebo Y5, přednostně perorální antagonista NPY Yp Y2 nebo Y5. Toto činidlo bude FSAD léčit zvětšením zvýšení prokrvení a lubrikace genitálií (například vagíny nebo klitoris).
NPY-mediovaný antagonismus VIP-indukovaného zvýšení prokrvení tedy představuje potenciální terapeutický cíl, kterým je možno ovlivnit prokrvení ženských genitálií. Mechanismem, jehož prostřednictvím k tomuto antagonismu dochází, je nejpravděpodobněji aktivace indukovaná NPY
Y-L-receptorem. V jiných fyziologických systémech se receptory NPY Υ·^ podílejí na mediaci vasokonstrikce a inhibici sympatického uvolnění transmiterů (Lundberg et all., 1996;
«· * ·· ·· • «·· · «· · • « · · * ·
115 přičemž nelze vyloučit vliv NPY Y2)· Máme za to, že tento NPY v ženském genitálním traktu inhibuje vasorelaxaci prostřednictvím přímé inhibice adenylát cyklasy přímo inhibující uvolňování VIP nebo sympatické neurotransmise.
Jak již bylo uvedeno, přídavným Ρο^Μρ cílem je jeden z receptorů NPY.
Neuronální uvolňování NPY reguluje vasorelaxaci vaskulárního lože vagíny indukovanou VIP. K tomu nejspíše dochází prostřednictvím presynaptického mechanismu zahrnujícího receptory NPY Yp, ačkoliv nelze vyloučit ani postsynaptickou formu. Antagonista NPY bude potencovat vasodilataci vaskulárního lože vagíny indukovanou VIP, což klinicky povede ke zvýšení vaginální lubrikace a poddajnosti zprostředkovanému překrvením stěny vagíny.
Při expresních pokusech s NPY receptorem, které jsme provedli, byly v lidské vagíně identifikovány podtypy receptorů NPY Yj, Y2 a Y5·
Základní poznatky o NPY a jeho sdružených receptorech uvádějí Victor A. McKusick et al. na adrese http:/ /www3.nebi.nim.nih.gov/Omim/searchomim.htm. Následující text pochází z tohoto zdroje.
Neuropeptid Y (NPY) je hojným a rozšířeným peptidem v nervovém systému savců. Vykazuje sekvenční homologii s peptidem YY a více než 50% homologii v aminokyselinové a nukleotidové sekvenci s pankreatickým polypeptidem (PNP; 167780). NPY je peptidem zahrnujícím 24 aminokyselin. Minth et al. (1984) klonovali gen NPY, za použití výchozí mRNA feochromocytomu. Takeuchi et al. (1985, 1986) izolovali cDNA klony genů NPY z feochromocytomu, a PNP z endokrinního nádoru pankreatu. Za použití těchto cDNA sond pro analýzu ·· · ·· ·· • « · · · «« · • · · « 9 9 • ·
- 116
9 9 9 · 9
9· 9 9 9 9 9 9 99 9 genomové DNA z panelů chrosomálních přiřazení hybridních lidských-myších somatických buněk potom zkoumali otázku, zda jsou tyto geny synténní. Studie ukázaly nesyntenitu s NPY na 7pter-7q22 a PNP na 17pll.l-17qter. Na základě zkoušek se zpětným křížením Mus spretus, Bahary et al. (1991) zamapovali homologní NPY gen na myší chromosom 6. Jelikož je myší chromosom 6 homologní s lidským 7q, je pravděpodobné, že NPY gen je u člověka umístěn v regionu 7cen-q22. Meisler et al. (1987) vyloučili blízkou vazbu mezi místy pro cystickou fibrosu a neuropeptidem Y. Terenghi et al. (1987) za použití postupů hybridizace in šitu určili distribuci mRNA kódující NPY v neuronech mozkové kůry ve vzorcích z chirurgické biopsie a mozku post mortem. Ukázali shodnou lokalizaci transkripce a exprese genu NPY v normálních maturovaných kortikálních neuronech. Baker et al. (1995) pomocí fluorescenční hybridizace in šitu zjistili, že NPY gen je umístěn na 7pl5.1 a vyskytuje se v jediné kopii. Poznamenali, že NPY je jedním z nejvíce konzervovaných peptidů, jaké jsou známy, kde rozdíl mezi člověkem a žralokem představují pouze 3 aminokyseliny. Neuropeptid Y je neuromodulátorem, který se podílí na regulaci energetické rovnováhy a je nadprodukován v hypothalamu myší ob/ob. Při stanovování úlohy NPY při odpovědi na nedostatek leptinu (164160) Erickson et al. (1996) vytvořili ob/ob myši s nedostatkem NPY. Za nepřítomnosti NPY byly ob/ob myši méně obézní, jelikož měly snížený příjem potravy a zvýšené vydávání energie, a byly méně závažně postiženy diabetem, sterilitou a somatotropními defekty. Tyto výsledky byly interpretovány jako důkazy, že NPY je centrálním efektorem nedostatku leptinu. Analýzou genetické vazby u potkanů, kteří byly selektivně vyšlechtěni na preferenci alkoholu byl identifikován chromosomální region, který obsahuje NPY gen (Carr et al., 1998). Potkani preferující alkohol měli v několika oblastech mozku nižší hladinu NPY než potkani nepreferující alkohol. Thiele et al. (1998) proto studovali «· · 0· · ♦ · ·♦ • « · · « * »· · » · · • · ♦ · · ·· ·
117 • · ··· ··· «··· ··♦ ·· ··· ·0 ···· spotřebu alkoholu u myší, které úplně postrádají NPY jako výsledek cíleného vyřazení genu (Erickson et al., 1996). Zjistili, že NPY-deficientní myši vykazují zvýšenou spotřebu roztoků obsahující 6 %, 10 % a 20 % obj. ethanolu ve srovnání s myšmi divokého typu. NPY-deficientní myši byly také méně citlivé na sedativní/hyptonické účinky ethanolu, což se ukázalo při rychlejším zotavení ze spánku vyvolaného ethanolem, přestože se u nich koncentrace ethanolu v plasmě výrazně neodlišovala od kontrolních. Oproti tomu, myši, které v neuronech nadexprimovaly značený NPY gen, jak obvykle exprimují, vykazovaly nižší preferenci ethanolu a byly vnímavější k jeho sedativním/hyptonickým účinkům než myši kontrolní. Tyto údaje poskytly přímý důkaz, že spotřeba alkoholu a rezistence k němu jsou v nepřímo úměrně spojeny s hladinou NPY v mozku. V rámci probíhající studie genetického základu obezity Karvonen et al. (1998) identifikovali 1128T-C polymorfismus, který vede k substituci leucinu prolinem na zbytku 7 v signální peptidové části pre-pro-NPY. Tento polymorfismus není spojen s obezitou nebo energetickým metabolismem, ale je významně a konsistentně spojen s vysokými hladinami celkového a LDL cholesteronu u Finů s normální hmotností a obézních Finů a u obézních Holanďanů. Uusitupa et al. (1998) nalezli pro7 polymorfismus u 14%
Finů, ale pouze u 6 % Holanďanů. Subjekty s pro7 v NPY měly průměrné o 0,6 až 1,4 mmol/litr vyšší hladinu celkového cholesterolu než subjekty bez této varianty genu. Vzhledem k tomu, že u Holanďanů s normální hmotností nebylo možno nalézt vliv pro7 NPY na hladinu cholesterolu v séru, lze učinit závěr, že obézní osoby mohou být susceptibilnější k účinkům této genové varianty. Bylo vypočteno, že pravděpodobnost výskytu pro7 v NPY by u obézních subjektů s celkovým cholesterolem v séru >8 mmol/litr by mohla být až 50 - 60 %. Alespoň u Finů je pro7 forma NPY jedním z nejsilnějších genetických faktorů ovlivňujících hladinu
118
cholesterolu v séru. Viz také Allen a Bloom (1986); Dockray (1986); Maccarrone a Jarrott (1986); Minth et al. (1986).
Jak již bylo uvedeno výše, základní poznatky o NPY a jeho sdružených receptorech, připravili Victor A. McKusick et al. (tamtéž). Následující text týkající se NPYR1 pochází z tohoto zdroje.
Neuropeptid Y (NPY, 162640) je jedním z nejhojnějších neuropeptidů v nervovém systému savců a vykazuje různorodé důležité fyziologické aktivity, jako jsou účinky na psychomotorickou aktivitu, příjem potravy, regulaci centrální endokrinní sekrece a značné vasoaktivní účinky na kardiovaskulární systém. Na základě farmakologických kritérií byly definovány dva hlavní podtypy NPY (Yl a Y2). Receptory NPY Yl byly identifikovány v různých tkáních, jako mozku, slezině, tenkém střevě, ledvinách, varlatech, placentě a hladkém svalu aorty. Receptor Y2 se vyskytuje především v centrálním nervovém systému. Herzog et al.
(1992) popsali klonování cDNA kódující lidský receptor NPY, o němž se potvrdilo, že je členem nadtřídy receptorů spražených s G proteinem. Pokud je receptor exprimován v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO) nebo buňkách ledvin lidského embrya, vykazuje charakteristickou ligandovou specificitu. V ledvinové buněčné linii je receptor spřažen s toxinem černého kašle - sensitivním G proteinem, který zprostředkovává inhibici akumulace cyklického AMP. V buněčné linii CHO byl receptor oproti tomu spřažen nikoliv s inhibicí adenylát cyklasy, ale se zvýšením intracelulámího kalcia. Tento druhý posel zapojující receptor NPY je tedy speficický vzhledem k buněčnému typu v závislosti na specifickém repertoáru G proteinů a efektorovém systému, které jsou přítomny v daném buněčném typu. Larhammar et al. (1992) nezávisle klonovali a charakterizovali neuropeptid Y. Herzog et al. (1993) určili molekulární organizaci a regulaci genu
444 4
119
4 44 4 44
4 44 4 4 44 44
4 4 4 4 4 4
4444 4444
4 4 4 4 4 4
4444 444 ·· 444 44 pro lidský receptor NPY Yl. Oproti souvislé struktuře většiny genů receptorů spřažených s G-proteinem zjistili, že gen pro receptor NPY Yl má 3 exony. Fluorescenční hybridizací in šitu s vysokým rozlišením lokalizovali gen na 4q31.3-q32. Herzog et al. (1997) zjistili, že geny pro NPY1R a NPY5R (602001) jsou společně umístěny na chromosomu 4q31-q32. Tyto dva geny jsou transkribovány v opačném směru od společné promotorové oblasti. Jeden z alternativně sestřižených 5' exonů genu pro receptor Yl tvoří část kódující sekvence receptoru Y5. Na základě tohoto neobvyklého uspořádání Herzog et al. (1997) usoudili, že tyto dva geny vznikly genovou duplikací a že mohou být exprimovány koordinovaně. Analýzou mezidruhového zpětného křížení Lutz et al. (1997) zamapovali geny Npylr a Npy2r na konzervované vazbové skupiny na myší chromosomy 8 (Npylr) a 3 (Npy2r), což odpovídá distální oblasti lidského chromosomu 4q.
Jak již bylo uvedeno výše, základní poznatky o NPY a jeho sdružených receptorech, připravili Victor A. McKusick et al. (tamtéž). Následující text týkající se NPYR2 pochází z tohoto zdroje.
Neuropeptid Y (NPY) přenáší signál přes třídu receptorů spřažených s G proteinem přítomných v mozku a neuronech sympatiku. Na základě farmakologických kritérií, distribuce v tkáních a struktury kódujícího genu byly definovány alespoň tři typy receptoru neuropeptidu Y; viz 162641 a 162643. Rose et al. (1995) uvádějí expresní klonování cDNA pro lidský receptor typu 2, NPY2R, v buňkách COS. Transfekované buňky vykázaly vysokou afinitu pro NPY (162640), peptid YY (PYY, 600781) a fragment NPY obsahující aminokyseliny 13 až 36. Předpokládaný 381-aminokyselinový protein má 7 transmembránových domén charakteristických pro receptory sdružené s G-proteinem a vykazuje pouze 31% shodu s lidským receptorem Yl (NPY1R; 162641). Northern přenosem • to • ·· · ·· · • · · to · · • to ··· · • ·
- 120 ♦ ♦ · « to ·· · toto · tkáňových vzorků z různých oblastí nervového systému, byla detekována 4kb mRNA. Gerald et al. (1995) klonovali cDNA odpovídající lidskému receptoru Y2 z cDNA expresní knihovny lidského hippocampu za použití vazebného stanovení radioznačeného PYY. Exprimovali gen pro Y2 v buňkách COS-7 a provedli hormonální vazebnou zkoušku, která ukázala, že receptor Y2 váže hormony (v pořadí od nejvyšší po nejnižší afinitu) PYY, NPY a pankreatický polypeptid (PP; 167780). Ammar et al. (1996) klonovali a charakterizovali lidský gen kódující receptor NPY typu 2. Transkript zahrnuje 9 kb genomové sekvence a je kódován ve 2 exonech. Jako u genu pro receptor NPY typu 1 je 5' netranslatovaná oblast NPY2R přerušena 4,5kb mezilehlou sekvencí. Ammar et al. (1996) Southernovou analýzou hybridních hlodavčích-lidských buněk a následnou fluorescenční hybridizací in šitu (FISH) zamapovali gen NPY2R na 4q31, stejnou oblast, jaká obsahuje gen NPY2R, což napovídá, že tyto podtypy přes své strukturální rozdíly vznikly genovou duplikací. Analýzou mezidruhového zpětného křížení Lutz et al. (1997) zamapovali geny Npylr a Npy2r na konzervované vazbové skupiny na myší chromosomy 8 (Npylr) a 3 (Npy2r), což odpovídá distální oblasti lidského chromosomu 4q.
Postup pro stanovení, zda se domnělé nebo skutečné činidlo může vázat k NPY je uveden ve WO-A-98/52890 (viz dále).
I:NPY
Jak již bylo uvedeno výše, přídavným činidlem může být jakékoliv vhodné činidlo, které může působit jako I:NPY (někdy označovaný jako antagonista NPY). Navíc, nebo alternativně, činidlo podle vynálezu může také působit jako I:NPY.
φ «
- 121
Ι:ΝΡΥ (zejména antagonisté NPY) jsou diskutovány v následující přehledných článcích:
Dunlop J, Rosenzweig-Lipson S : Therapeutic approaches to obestity Exp Opin Ther Pat 1999 8 12 1683-1694
Wang S, Ferguson KC, Burris TP, Dhurandhar NV: 8th annual International conference on obesity and non-insulin dependent diabetes mellitus: novel drug developments. Exp Opin Invest Drugs 1999 8 7 1117 -1125
Ling AL : Neuropeptide Y receptor antagonists Exp Opin Ther Pat 1999 9 4 375-384 Adham N, Tamm J, Du P, Hou C, et al : Identification of residues involved in the binding of the antagonist SNAP 6608 to the Y5 receptor Soc Neurosci Abstr 1998 24 part 2 626.9
Shu YZ, Cutrone JQ, Klohr SE, Huang S : BMS-192548, a tetracyclic binding inhibitor of neuropeptide Y receptors, from Aspergillus niger WB2346. II. Physico-chemical properties and structural characterization J Antibiot 1995 48 10 1060-1065
Rigollier P, Rueger H, Whitebread S, Yamaguchi Y, Chiesi M, Schilling W, Criscione L : Synthesis and SAR of CGP 71683A, a potent and selective antagonist of the neuropeptide Y Y5 receptor. Int Symp Med Chem 1998 15th Edinburgh 239
Criscione L, Rigollier P, Batzl-Hartmann C, Rueger H, Stricker-Krongrad A, et al : Food intake in free-feeding and energy-deprived lean rats is mediated by the neuropeptide Y5 receptor. J Clin Invest 1998 102 12 2136 -2145
Neurogen Corp : NGD 95-1 Clin Trials Monitor 1996 5 10 Ab 19244
Buttle LA : Anti-obesity drugs: on target for huge market sales. Exp Opin Invest Drugs 1996 5 12 1583-1587 • «4 44 4 44 44
4«·· 4 4 44 4444 • 4 444 44 ·
122
4 444 444
4444 «44 44 444 44 4444
Gehlert DR, Hipskind PA : Neuropeptide Y receptor antagonists in obesity. Exp Opin Invest Drugs 1996 7 9 1827 -1838
Goldstein DJ, Trautmann ME : Treatments for obesity. Emerging Drugs 1997 2 - 127
Hipskind P A, Lobb K L, Nixon J A, Britton T C, Bruns R F, Catlow J, Dieckman McGinty D K, Gackenheimer S L, Gitter B D, lyengar S, Schober D A, et al. : Potent and selective 1,2,3-trisubstituted indole NPY Y-1 antagonists. J Med Chem 1997 40 3712-3714
Zimmerman DM, Cantrall BE, Smith ECR, Nixon JA, Bruns RF, Gitter B, Hipskind PA, Ornstein PL, Zarrinmayeh H, Britton TC, Schober DA, Gehlert DR: Structureactivity relationships of a series of 1-substituted-4-methylbenzimidazole neuropeptide Y-1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1998 8 5 473 -476
Zarrinmayeh H, Nunes A, Ornstein P, Zimmerman D, Arnold MB, et al : Synthesis and evaluation of a series of novel 2-[(4-chlorophenoxy)methy]benzimidazoles as selectiveneuropeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1998 41 15 2709 2719
Britton TC, Spinazze PG, Hipskind PA, Zimmerman DM, Zarrinmayeh H, Schober DA, Gehlert DR, Bruns RF : Structure-activity relationships of a series of benzothiophene-dervied NPY-Y1 antagonists: optimization of the C2 side chain Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 3 475 -480
Zarrinmayeh H, Zimmerman DM, Cantrell BE, Schober DA, Bruns RF, Gackenheimer SL, Ornstein PL, Hipskind PA, Britton TC, Gehlert DR : Structure-activity relationship of a series of diaminoalkyl substituted benzimidazole as neuropeptide Y Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 5 647 -652
Murakami Y, Hara H, Okada T, Hashizume H, Kii M, Ishihara Y, Ishikawa M, Mihara S-l, Kato G, Hanasaki K, Hagishita S, Fujimoto M : 1,3-disubstituted benzazepines as novel, potent, selective neurpeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1999 42 14 2621-2632
0« « 0 0 «
• 0
0
000 0
123 ·
»00 . <
• 0
0 • 00 0 «04
Rudolf Κ, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN : The first highly potent and selective non-peptide neuropeptide YY1 receptor antagonist; BIBP3226 Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 R11 -R13
Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Doods HN ; Subtype selectivity and antagonbist profile of the nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonist BIBP 3226 J Pharmacol Exp Ther 1995 275 1 143 -149.
Wright J, Bolton G, Creswell M, Downing D, Georgic L, Heffner T, Hodges J, MacKenzie R, Wise L : 8-amino-6-(arylsulphonyi)-5-nitroquinolones: novel nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1996 6 15 1809-1814
Capurro D, Huidobro-Toro JP : The involvement of neyropeptide Y Y1 receptors in the blood pressure baroreflex:studies with BIBP 3226 and BIB 3304. Eur J Pharmacol 1999 376 3 251 -255
Dumont Y, Cadieux A, Doods H, Quirion R : New tools to investigate neuropeptide Y receptors in the centrál and peripheral nervous systems: BIBO-3304 (Y1), BIIE-246 (Y2) and [125I]-GR-231118 (Y1/Y4). Soc Neurosci Abstr 1999 25 Part 1 Abs 74.11
Hegde SS, Bonhaus DW, Stanley W, Eglen RM, Moy TM, Loeb M, et al : Pharmacological evaluation of 1229U91, a high affinity and selective neuropeptide Y(NPY) - Y1 receptor antagonist Pharmacol Res 1995 31 190
Matthews JE, Chance WT, Grizzle MK, Heyer D, Daniels AJ : Food intake inhibition and body weight loss in rats treated with Gl 264879A, an NPY-Y1 receptor. Soc Neurosci Abstr 1997 23 Pt 2 1346
Doods HN, Willim K-D, Smith SJ : BIBP 3226: a selective and highly potent NPY-Y1 antagonist Proč Br Pharmacol Soc 1994 13-16 Dec. C47
Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN : The first highly potent and selective non-peptide
124 ♦«* » ·
Λ • ••Ο • · Ο · » · · • •β ·· • Φ *» « · · ♦ • · · • · · • · · ·· ···· neuropeptide ΥΥ1 receptor antagonist: ΒΙΒΡ3226 Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 R11 -R13
Serradelil-Le-Gal C, Valette G, Rouby PE, Pellet A, Villanova G, Foulon L, Lespy L, Neliat G, Chambon JP, Maffrand JP, Le-Fur G : SR 120107A and SR 120819A: Two potent and selective, orally-effective antagonists for NPY Y1 receptors Soc Neurosci Abstr 1994 20 Pt 1 907 -Abs 376.14
Hong Y, Gregor V, Ling AL, Tompkins EV, Porter J, Chou TS, Paderes G, Peng Z, Hagaman C, Anderes K, Luthin D, May J : Synthesis and biological evaluation of novel guanylurea compounds as potent NPY Y1 receptor antagonist Acs 1999 217 Anaheim MÉDI 108
I:NPY (zejména antagonisté NPY) jsou popsány v následujících dokumentech:
WO-98/07420 EP-0614911
WO-94/00486 WO-98/40356
WO-96/22305 EP-0448765
WO-97/20821 EP-0747356
WO-97/20822 WO-98/35941
WO-96/14307 WO-97/46250
JP-07267988 EP-0747357
WO-96/12489
US-5552422
WO-98/35957
WO-96/14307
WO-94/17035
Přednostní příklady I:NPY jsou zvoleny ze sloučenin následujících strukturních vzorců. Tyto sloučeniny byly zkoušeny a bylo zjištěno, že jsou užitečné při potenciaci
125
cAMP, a tedy i užitečné při léčení FSAD. Některé experimentální údaje vztahujících se k těmto sloučeninám jsou uvedeny v příkladech provedení.
Sloučenina Strukturní vzorec Typ působení Odkaz
F34 ''u./L· νγΝγΝΗ· l:NPY Y1 WO-98/07420 odkaz 3
F35 o / 0 o 3H >5Η H I:NPY odkaz 5
F36 I:NPY Y5 odkazy 1, 4
F37 Ile - Cys- Pro- Cys- Tyr- Arg- Leu- Arg- TyrNH2 cyklický (2,2j,(4,4*)disulfid, dimerní I:NPY Yl WO-94/00486 WO-96/22305 odkazy 1, 2, 23
F38 v ΖΊι η ΓΟΖYj γ η-či NH2 I;NPY Y5 WO-97/20821 WO-97/20822 odkazy 1, 3, 6, 7
F39 u u I:NPY Yl WO-96/14307 odkazy 1, 8, 9, 10, 11
126
F40 “Ύ NH H □Η HN H 0., ÍT γ° 0 Lx k tJ Ν Η Η λ 0 rVNHi > ΝΗο γΝγ^ΝΗ; Ι:ΝΡΥ Υ1 JP-07267988 odkaz 1
xir X Y 0 0 Α Ok
F41 γ^ .Ο. Ι:ΝΡΥ Yl
°< (f odkazy WO-96/12489 3, 12, 13, 14, 15,
\/
<0· 'iT Vh ^Λ-ο / 16, 17
Yx ’N \—i
O k
F42 r 4Η2 .Ν. I:NPY Yl US-5552422
] odkazy 17, 18, 19, 20
A
χχ
F43 0 0 X Η Υ0 F.NPY Y5 WO-98/35957
JÍ sí> k.W Ύζ'Λ odkaz 3
xj IN H
F44 Chíral I:NPY Yl
O O odkazy 21, 22
ΧΎ s ''''Χ'' Τι
Μ 0 0 1 Λ ^ν'^νη, II Νχ.ΝΗ2 τ 0
0 F F OH Η
F45 I:NPY Yl WO-96/14307
odkaz 3
/k Ί( Ύ ^*Ν ι 0 ^ΝνΎ
Μ
127
F46 vzorec viz odkaz Ι.-ΝΡΥ Υ1 odkaz 24
F47a ^A^chirální HO'^^ Q ° NH H 2 Ι:ΝΡΥ Υ1 WO-94/17035 odkazy 3, 17, 25, 26
F47b vzorec viz odkaz Ι:ΝΡΥ Υ1 odkazy 3, 12,13,14,15,16,17
F48 CQ,/? „ oQQ/OQa 0 Ι-.ΝΡΥ Υ1 ΕΡ-0614911 odkaz 27
F49 OQa? „ cÍqQdq.a 0 Ι:ΝΡΥ Υ1 ΕΡ-0614911 odkaz 27
F50 NH 0 rj η h H q AH Ι:ΝΡΥ Υ1 odkaz 28
F51 O Ι.-ΝΡΥ Υ5 WO-98/40356
F52 0____ Η Ι:ΝΡΥ ΕΡ-0448765
128
F53 /Ov Η ίϊ γ\ Ι:ΝΡΥ ΥΙ ΕΡ-0747356
0 0 /
Q H-CI Λ»- Η Η —O-b
F54 Ο Ι:ΝΡΥ Υ1
Λ.Λ., > /0Η WO-98/35941
Η Η π Ζ 0
—Ν
F55 Π Z Η Ζ Π °ν° Ι:ΝΡΥ Υ5 WO-97/46250
Μ WN Vs/V Η
^,ΝΗ
π Η—CI
F56 ι ¥ Ι:ΝΡΥ Υ1 ΕΡ-0747357
/ γ «Ζχ
0 0
Λ-
Η L 1
Η—CI Ζη
V
°\
129
VIP (vasoaktivní intestinální peptid)
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu je přídavným cílem PcAMP cíl, přičemž PcAmp cílem je VIP nebo jeden z jeho sdružených receptorů. Současná klasifikace/nomenklatura je uvádí jako VPAC1, VPAC2 a PACAP.
Nukleotidové sekvence a aminokyselinové sekvence VIP a jeho receptorů jsou dostupné z literatury. Některé sekvence jsou uvedeny přiloženém sekvenčním protokolu.
Zjistili jsme, že VPAC1 a VPAC2 jsou přítomny ve vagíně člověka a králíka. PACAP ve vagíně králíka i člověka chybí.
VIP je hlavním endogenním neurotransmiterem uvolňovaným během sexuálního vzrušení, který je zodpovědný za nervově indukovanou vaginální vasodilataci vaskulárního lože umístěného ve vaginální stěně. Tyto vasodilatační účinky jsou zprostředkovány aktivací adenylát cyklasy a produkcí cAMP. Aniž bychom se chtěli vázat nějakou teorií, tento účinek může být zprostředkován přes receptory VIP podtypů VPAC^, VPAC2 nebo PACAP (hypofyzární peptid aktivující adenylát cyklasu). VPAC2 a PACAP receptory jsou nejrozsáhleji exprimovány v CNS, a přestože jsou exprimovány v hypofýze, nezdá se, že by měly širší biologickou funkci.
Činidlo může potencovat VIP a/nebo působit jako VIP mimetikum nebo jeho analog. Činidlo tedy bude potencovat a/nebo napodobovat vasorelaxační účinky endogenního VIP uvolňovaného během sexuálního vzrušení. Činidlo také může mít přídavný účinek na relaxaci hladkého svalstva vagíny indukovanou VIP. To klinicky povede k léčení FSAD prostřednictvím zvýšení vaginální lubrikace, k níž dojde překrvením vaginální stěny, a zvýšení poddajnosti vagíny.
• · 9 ·9 9 99 99 • · · · « ··· · · · ♦
130 • · 9 · · · · · ···· ··» ·· 999 99 9999
Nežádoucí vlastnosti VIP jsou popsány výše, ačkoliv mimetika nebo analogy by je neměly vykazovat.
Základní poznatky o VIP a s ním spojených receptorech uvedli Victor A. McKusick et al. na adrese http:// www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/searchomim.htm. Následující text týkající se VIP pochází z tohoto zdroje:
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP), peptid tvořený 28 aminokyselinami, který byl původně izolován z dvanáctníku vepře, není přítomen pouze v gastrointestinálních tkáních, ale také v nervové tkáni, pravděpodobně jako neurotransmiter, a vykazuje různé biologické účinky. Jelikož je VIP podobný glukagonu, sekretinu a žaludečnímu inhibičnímu peptidu (GIP), byl považován za člena glukagon-sekretinové třídy. Primární translační produkt mRNA kódující VIP (prepro-VIP) měl molekulovou hmotnost 20 daltonů. Klonováním DNA sekvence komplementární k mRNA kódující lidský VIP Itoh et al. (1983) zjistili, že prekursor VIP obsahuje nejen VIP, ale také nový peptid o 27 aminokyselinách označený jako PHM27, který obsahoval aminoterminální histidin a karboxyterminální methionin. Od PHI17 izolovaného z vnitřností vepře se lišil dvěma aminokyselinami; PHI27, jak napovídá jeho označení, obsahuje karboxyterminální isoleucin. Linder et al. (1987) izolovali lidský gen pro VIP a PHM27 a zkoumali jeho expresi v různých tkáních potkana. Heinz-Erian et al. (1985) navrhli, že nedostatečná obnova potních žláz u pacientů trpících cystickou fibrosou prostřednictvím neuropeptidu VIP může být základním mechanismem sníženého obsahu vody a relativní nepropustnosti epithelu pro chloridové a jiné ionty, která je charakteristická pro cystickou fibrosu. Pro ověření této hypotézy Gozes et al. (1987) zvolili přístup s genovými kandidáty. Bodner et al. (1985) ukázali, že VIP a PHM-27 jsou kódovány sousedními exony. Gozes et al. (1987) použili genomového fragmentu
Μ 0 ·0 · 00··
0000 0 000 0 00 0
131 · ··· 000 0000 000 00 000 00 0000 kódujícího PHM-27 pro detekci přítomnosti VIP genu na 6q21-qter. Tímto tedy vyloučili defektní VIP gen jako potenciální primární příčinu cystické fibrosy (která je kódována chromosomem 7). Metodami hybridiizace in sítu Gozet et al. (1987) určili VIP gen na 6q24. Umístili VIP na oblast MYB (189990), která byla zamapována na 6q22. Gozes et al. (1987) zkoumali funkční vztah mezi těmito dvěma geny v neuronální tkání. Pozorovali ostrý pík MYB mRNA v hippokampu třídenních potkanů, předcházející pík VIP mRNA, který se v této oblasti objevil ve stáří 8 dnů. Omary a Kagnoff (1987) nalezli jaderné receptory pro VIP v buněčné linii lidského adenokarcinomu tlustého střeva. Gotoh et al.
(1988) spot blot hybridizací molekulárně klonovaného fragmentu genu s chromosomálními preparáty VIP přiřadili chromosomu 6. Lokalizace byla upřesněna hybridizací in sítu na 6q26-q27.
Jak již bylo uvedeno výše, základní poznatky o VIP a jeho sdružených receptorech, připravili Victor A. McKusick et al. (tamtéž). Následující text týkající se VIPR1 či VPAC1 pochází z tohoto zdroje.
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP; 192320) je oktakosamerním neuroendokrinním mediátorem, který se převážně nachází v cholinergických presynaptických neuronech centrálního nervového systému a v periferních peptidergických neuronech inervujících různé tkáně. Od řady neuroendokrinních peptidů s imunologickými funkcemi se VIP odlišuje svou schopností působit přímo na B i T buňky. Zvláštní podskupiny nervových, respiračních, gastrointestinálních a imunitních buněk nesou specifické receptory s vysokou afinitou pro VIP, které jsou spojeny s proteinem vázajícím nukleotid guanin (G), který je schopen aktivovat adenylát cyklasu. Libert et al. (1991) selektivní amplifikaci a klonováním z thyroidní cDNA získali čtyři nové receptory
132 z třídy receptorů sdružených s G proteinem. Jeden z nich, označený jako RDC1, Sreedharan et al. (1991) identifikovali jako VIP receptor. Libert et al. (1991) in šitu hybridizací zamapovali gen pro VIPR na 2q37. Pozdější informace zpochybnily, že tento gen zamapovaný na 2q37 je skutečně genem pro VIP receptor (Vassart, 1992). O sekvenci, která byla Sreedharanem et al. (1991) označena jako GPRN1 a zamapována na 2q37, Wegner et al. (1993) zjistili, že neváže VIP. Sreedharan et al. (1995) izolovali autentický gen pro receptor VIP typu I a fluorescenční hybridizací in šitu ho zamapovali na 3p22 pás v oblasti spojené s malobuněčnou rakovinou plic. Analýzou pomocí mezidruhového zpětného křížení Hashimoto et al. (1999) zamapovali gen Viprl na distální oblast chromosomu 9, oblast, která vykazuje synténní homologii s lidským chromosomem 3p. Sreedharan et al. (1993) klonovali gen lidského intestinálního receptoru VIP; dedukovaná aminokyselinová sekvence vykazovala 84% identitu s VIP receptorem plic potkana. Couvineau et al. (1994) z cDNA knihovny lidských buněk epithelu jejuna izolovali dva VIPR cDNA klony. Jeden kóduje receptor VIP tvořený 460 aminokyselinami a sedmi předpokládanými transmembránovými doménami, jak je tomu i u jiných receptorů sdružených s G proteinem. Druhý kóduje protein příbuzný VIP receptoru se 495 aminokyselinami, jehož 428 aminokyselin na
C-terminální oblasti vykazuje 100% homologii s funkčním receptorem VIP, ale jeho N-terminální 67-aminokyselinová doména je zcela odlišná. Při expresi v buňkách COS druhý protein neváže VIP značený radioaktivním jodem, ačkoliv je při imunofluorescenčním stanovení normálně rozpoznáván na plasmatické membráně. 0 receptoru VIP typu I, který bývá také označován jako receptor PACAP typu II (další typ receptoru PACAP viz 102981), Sreedharan et al. (1995) zjistili, že měří asi 22 kb a obsahuje 13 exonů (v rozmezí od 42 do 1400 bp) a 12 intronů (v rozmezí od 0,3 do 6,1 kb).
133
• · • « * • · ·· · • · ·· • · ·· • ·
• • • · · • · •
• ♦ · · • · · • · · · · ·♦ • · · ·
Sreedharan et al. (1995) také charakterizovali promotor a 5' lemující oblast genu.
Jak již bylo uvedeno výše, základní poznatky o VIP a jeho sdružených receptorech, připravili Victor A. McKusick et al. (tamtéž). Následující text týkající se VIPR2 či VPAC2 pochází z tohoto zdroje.
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP, 192320) a hypofyzární peptid aktivující adenylát cyklasu (PACAP, 102980) jsou homologní peptidy, které působí jako neurotransmitery a neuroendokrinní hormony. Zatímco receptory VIP a PACAP jsou vzájemně homologní, ve své substrátové specificitě a profilu exprese se liší. Viz VIPR1 (192321) a ADCYAP1R1 (102981). Svoboda et al. (1994) provedli PCR za nízké stringence za použití primerů na bázi sekvence konzervované u VIP receptorů. Klonovali gen pro lidský receptor VIP2 z cDNA knihovny lymfoblastu. Tyto geny kódovaly polypeptid o 438 aminokyselinách, který byl z 86 % identický s receptorem VIP2. Exprimovali lidský receptor VIP2 v buňkách vaječníků čínského křečka a zjistili, že se váže k PACAP-38, PACAP-27, VIP a heloderminu, a tato vazba receptorů ke kterémukoliv z těchto peptidů aktivuje adenylát cyklasu. O vazbě peptidů se zjistilo, že je inhibována GTP. Adamou et al. (1995) klonoval gen receptorů VIP2 z cDNA knihovny lidské placenty. Northern přenosem se zjistilo, že VIPR2 je exprimován ve formě dvou transkriptů o 4,6 kb a 2,3 kb, přičemž úroveň exprese je vysoká v kosterním svalstvu a nižší v srdci, mozku, placentě a pankreas. Mackay et al. (1996) za použití fluorescenční hybridizace in šitu zamapovali gen VIPR2 na lidský chromosom 7q36.3. Dalším mapováním buněčných linií od pacientů postižených holoprosencefalií typu 3 (HPE3; 142945) se zjistilo, že gen pro VIPR2 leží v minimálním kritickém regionu HPE3. Mackay et
134 ·« · *· · ·· ·♦ • · · · · · ♦ · · ♦ · · ·· · · · · · · • · · · · 9 9 9 9 9 • · ··· 9 · 9
9999 999 99 999 99 9999 al. (1996) uvedli, že ačkoliv se VIPR2 může na fenotypu HPE3 může podílet, není jediným zodpovědným faktorem.
AC (adenylát cyklasa)
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu, přídavným cílem je PcAMP cíl, přičemž tímto PcAMP cílem je AC.
Nukleotidové sekvence a aminokyselinové sekvence pro AC jsou dostupné z literatury.
Abychom potvrdili, že VIP indukuje vasorelaxaci prostřednictvím zvýšení iňtračelulární hladiny cAMP a následné aktivace adenylát cyklasy, měřili jsme koncentrace cAMP ve vagíně během stimulace VIP a použili jsme forskolinu, aktivátoru adenylát cyklasy, pro napodobení účinků aktivace cAMP/AC dráhy.
Při těchto zkouškách jsme zjistili, že ošetření vasointestinálním peptidem a ošetření forskolinem zvyšuje iňtračelulární koncentrace cAMP v izolované tkáni vagíny.
Také jsme zjistili, že forskolin u zvířecího modelu sexuálního vzrušení zvyšuje prokrvení vagíny.
Kromě toho jsme zjistili, že forskolin indukuje relaxaci v izolované vagíně.
Základní poznatky o AC uvádějí Victor A. McKusick et al. na http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/searchomim.htm. Následující text týkající se AC pochází z tohoto zdroje:
Adenylyl cyklasa (EC 4.6.1.1) katalyzuje transformaci ATP na cyklický AMP. Tato enzymatická aktivita je pod kontrolou několika hormonů a na trandukci signálu z
135
< · ·· · toto ··
to ·· • · · to • · • ·
• • · · • to t
• to · to · ·· ··· toto ·«>·
receptoru na katalytický zbytek se podílí různé polypeptidy. Stimulační nebo inhibiční receptory (Rs a Ri) interagují s G proteiny (Gs a Gi), které vykazují GTPasovou aktivitu a modulují aktivitu katalytické podjednotky adenylyl cyklasy. Parma et al. (1991) klonovali cDNA odpovídající adenylylcyklase lidského mozku, kterou označili symbolem HBAC1. Hybridizací in šitu s preparáty chromosomů v metafázi za použití cDNA sondy z lidského mozku Stengel et al. (1992) ukázali, že gen je umístěn na 8q24.2. Vysoce homologický gen, ADCY2 (103071) byl stejným postupem určen na 5ql5.3.
Obecné postupy genového inženýrství
Ačkoliv obecné postupy, které uváděny v tomto textu jsou o sobě známé, lze učinit odkaz zejména na Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) a Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1990), 4. vydání, John Wiley & Sons, lne. Polymerasové řetězová reakce je popsána v US-A-4 683 159, US-A-4 800 195 a US-A-4 965 188.
Souhrn
Souhrně lze uvést, že se vynález týká použití I:NEP pro léčení FSD, zejména FSAD.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je v následujícím textu popsán pouze pomocí příkladů, v nichž jsou uvedeny odkazy na následující obrázky:
obr. 1, kterým je graf;
obr. 2, kterým je graf;
obr. 3, kterým je graf;
obr. 4, kterým je graf;
136
• · ·· « * • · * a · 9 9 99 9 9
a • a · • 9 9 •
• · » · a · · • · ··· ····
obr. 5, kterým je graf;
obr. 6, kterým je graf;
obr. 7, kterým je graf;
obr. 8, kterým je graf;
obr. 8, kterým je graf;
obr. 9, kterým je graf;
obr. 10 , kterým je graf;
obr. 11 , kterým je graf;
obr. 12 , kterým je graf.
Rozumí se, že činidlem podle vynálezu je I:NEP. Jsou zde také uvedeny informace týkající se I:PDE a I:NPY, jelikož, jak to bude odborníkům v tomto oboru zřejmé, oba typy těchto činidel je možno použít v kombinaci s činidlem podle vynálezu za účelem dosažení popsaného pozitivního účinku. Tyto další poznatky jsou zde uvedeny pro podporu našich původních poznatků.
Přehled obr, na výkresech
Obr. 1:
Elektrická stimulace pelvického nervu při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících indukuje zvýšení prokrvení vagíny v závislosti na frekvenci. Zvýšení stimulační frekvence indukuje větší zvýšení prokrvení. Změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Na obr. 1 je graficky znázorněn vztah mezi stimulací pelvického nervu a prokrvením genitálií jako závislost prokrvení na frekvenci. Parametry stimulace: 2 až 16 Hz, 15 až 20 V, 0,5 ms, 10 s. Černé čtverečky označují prokrvení klitoris a bílá kolečka označují prokrvení vagíny.
137
« * ♦ ♦ 49
• ·· • 9 ·· 4 « • ·
• 4 · • • · •
«· ··· « « 944 44 9···
Obr. 2:
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP) indukuje zvýšení vaginálního prokrvení při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anesterizovaných králících.
Na obr. 2a je graficky znázorněn účinek VIP na změnu vaginálního prokrvení. VIP byl podán infuzí ve formě intravenosních bolů (trojúhelníčky - VIP v dávce 6 čtverečky - VIP v dávce 20 μg/kg, obrácené trojúhelníčky - VIP v dávce 60 μg/kg; sonda 2, vnější stěna vagíny).
Na obr. 2b je graficky znázorněn účinek dvou opakovaných infuzí VIP (bílé čtverečky - VIP v dávce 60 μgkg-1, černé čtverečky - VIP v dávce 60 μgkg-1) na změnu vaginálního prokrvení. Tento obr. demonstruje, že dochází k podobnému zvýšení prokrvení. Také doba trvání odpovědi je podobná.
Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Vasoaktivní intestinální peptid (VIP) snižuje střední arteriální tlak krve při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Tento graf ilustruje typické účinky vasoaktivních činidel (bílá kolečka - Hepsaline, černé trojúhelníčky - VIP v dávce 6,0 \iq/kq, černé čtverečky - NEPi v dávce 7,5 mg/kg, černé kosočtverečky - PDEcAMpI v dávce 25 μg/kg) a parametrů stimulace pelvického nervu (černá kolečka), kterých bylo použito pro zkoumání vaginálního prokrvení prostřednictvím středního arteriálního tlaku u anestetizovaného králíka. Pozorované
138
účinky jsou typické pro trendy pozorované u všech zkoušených zvířat. VIP indukuje významné snížení středního arteriálního tlaku, zatímco stimulace pelvického nervu, kontrolní infúze Hepsaline nebo inhibitorů pDEcAMp nebo NEP nemají žádný vliv na krevní tlak. Snížení krevního tlaku spojené s infúzemí VIP je také doprovázeno velkým zrychlením srdeční frekvence.
Obr. 4:
Aktivace cAMP/adenylát cyklasové dráhy napodobuje VIP mediovanou vasorelaxaci a relaxaci hladkého svalu ve tkáni vagíny.
Na obr. 4a je graficky znázorněna indukce významného zvýšení vaginálního prokrvení infúzí forskolinu (40 nmol/kg, i.v. bolus, cAMP mimetikum). Lze si povšimnout, že amplituda a trvání odpovědi jsou podobné jako indukce prostřednictvím VIP (20,0 gg/kg, i.v. bolus). Zajímavé je, že účinky na prokrvení se déle projevují na vnější stěně vagíny (vnitřní stěna vagíny - obdélníčky, vnější stěna vagíny - kolečka). Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Na obr. 4b je znázorněn sloupcový graf, který demonstruje, že jak VIP (Ο,ΙμΜ), tak forskolin (ΙΟμΜ) v izolované králičí vagíně významně zvyšují intracelulární koncentrace cAMP (μΜ) nad bazální hladinu.
Na obr. 4c je uveden graf, který znázorňuje, jak forskolin (cAMP mimetikum) indukuje účinnou relaxaci prekontrahovaných (ΙμΜ fenylefrin) proužků králičí vagíny při IC50 přibližně 300nM (kontrola+vehikulum - bílé čtverečky, forskolin IC50 302 ± 20nM - černé čtverečky). Všechny změny byly kvantifikovány in vivo laserovou
139
Dopplerovskou technologií, biochemickým cAMP enzymatickým imunostanovením nebo relaxací tkáně in vitro.
Obr. 5:
Infuze VIP zvyšuje prokrvení klitoris a aktivace dráhy cAMP/adenylát cyklasa simuluje vasorelaxaci klitoris zprostředkovanou VIP při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Infuze VIP (60 až 200 μg/kg) indukuje zvýšení prokrvení klitoris závislé na koncentraci.
Po i.v. infuzí 200 μg/kg VIP bylo pozorováno 115% zvýšení prokrvení klitoris. Účinek VIP na prokrvení klitoris je možno simulovat infuzí cAMP mimetika, forskolinu (FSK, 40 nmol/kg, i.v. bolus). Po i.v. infuzi forskolinu v dávce 40 nmol/kg bylo pozorováno 156% zvýšení prokrvení klitoris. Všechna zvýšení představovala významné zvýšení oproti kontrolním infuzím (Hepsaline). Amplituda odpovědi byla podobná amplitudě odpovědi při indukci VIP (200 μg/kg, i.v bolus) a srovnatelná s hodnotami zjištěnými u vaginálního prokrvení (viz obr. 2 a 4). Všechny změny byly kvantifikovány in vivo za použití laserové Dopplerovské technologie a ve srovnání s infuzemi vehikule (Hepsaline) se jednalo o významná zvýšení.
Obr. 6:
Selektivní inhibitor NEP EC 3.4.24.11 podporuje zvýšení vaginálního prokrvení inkukované stimulací pelvického nervu při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Opakovaná stimulace pelvického nervu v 15minutových intervalech indukuje reprodukovatelné zvýšení vaginálního prokrvení (bílý sloupec). Podání inhibitoru NEP (šedý sloupec) zvedá pík zvýšení vaginálního prokrvení indukovaného submaximálními stimulačními frekvencemi (například 4Hz) ve srovnání se zvýšeními pozorovanými během
140
srovnávacích kontrolních stimulací nebo za použití kontrolního vehikula (čárkovaný sloupec). V závislosti na dávce byla pozorována následující zvýšení - dávka 0,3 mg/kg iv. indukovala 40% zvýšení a dávka 0,1 mg/kg iv. indukovala 91% zvýšení (střední hodnota, n = 3). Inhibitor neměl žádný účinek na bazální (nestimulované) prokrvení vagíny (data nejsou znázorněna). Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Obr. 7:
Selektivní inhibitory NEP EC 3.4.24.11 podporují zvýšení vaginálního prokrvení indukované VIP při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Opakované infuze VIP v 30minutových intervalech indukovaly reprodukovatelná zvýšení vaginálního prokrvení (viz obr.
2b). Inhibitor NEP potencuje amplitudu a také prodlužuje dobu přetrvání zvýšeného prokrvení, pokud jsou tato zvýšení indukována submaximálními dávkami VIP, například 6,0 pg/kg. Při dávkách VIP, které indukují maximální zvýšení vaginálního prokrvení, například 60 μg/kg, inhibitory NEP pouze potencují dobu přetrvání zvýšeného vaginálního prokrvení. Zvýšení indukovaná VIP za přítomnosti inhibitoru NEP jsou označena černými trojúhelníčky a kontrolní VIP odpovědi jsou znázorněny jako bílé trojúhelníčky. Kontrolní infuze Hepsaline neměla na amplitudu odpovědí žádný účinek. Všechny změny byly minotorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Na obr. 7a je tedy graficky znázorněn účinek VIP v dávce 6 μ/kg na vaginální prokrvení za přítomnosti a za nepřítomnosti inhibitoru NEP.
Na obr. 7b je tedy graficky znázorněn účinek VIP v dávce 60 μ/kg na vaginální prokrvení za přítomnosti a za
- 141
nepřítomnosti inhibitoru NEP. (sonda 2, vnější stěna vagíny).
Obr. 8:
Selektivní inhibitor PDEcAMP typu 2 podporuje zvýšení vaginálního prokrvení indukovaného stimulací pelvického nervu (PNS) při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Opakovaná PNS v 15minutových intervalech indukuje reprodukovatelná zvýšení vaginálního prokrvení (bílé čtverečky). Podání inhibitoru pdecAMP typu 2 zveda Pik zvýšení vaginálního prokrvení indukovaného submaximální stimulační frekvencí (černé čtverečky; při 4 Hz) ve srovnání s hodnotami pozorovanými během kontrolní časově sladěné stimulace (bílé čtverečky). Vehikulum je označeno černým kolečkem. Infuze inhibitoru PDE2 (500 pg/kg) indukovala 86,8±21,9% zvýšení vaginálního prokrvení (střední hodnotaiSEM, n = 2). Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Obr. 9:
Selektivní inhibitory PDEcAMp podporují zvýšení vaginálního prokrvení indukované VIP při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Opakované infuze VIP ve 30minutových intervalech indukuji reprodukovatelná zvýšení vaginálního prokrvení (viz obr. 2b). Selektivní inhibitor PDEcAMp typu 2 (25 ^g/kg iv. bolus) potencuje dobu přetrvání zvýšeného prokrvení vagíny indukovaného VIP (60 μg/kg iv. bolus). Zvýšení indukovaná VIP za přítomnosti inhibitoru PDEcAMP jsou znázorněna jako černé trojúhelníčky a kontrolní VIP odpovědi jsou znázorněny jako bílé trojúhelníčky. Kontrolní infuze Hepsaline na odpovědi neměla žádný účinek. Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
- 142
Obr. 10:
Selektivní antagonista receptorů NPY Yl podporuje zvýšení vaginálního prokrvení indukovaná stimulací pelvického nervu (PNS) při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Opakovaná PNS v 15minutových intervalech indukuje reprodukovatelná zvýšení vaginálního prokrvení (není znázorněno). Podání antagonisty NPY Yl (šedé sloupce) zvedá pík zvýšení vaginálního prokrvení indukovaného submaximální stimulační frekvencí (např. 4 Hz) ve srovnání se zvýšeními pozorovanými během kontrolní časově sladěné stimulace nebo kontrolním vehikulem (čárkovaný sloupec). V závislosti na dávce byla pozorována následující zvýšení - dávka 0,01 mg/kg iv. indukovala 15,8±19,6% zvýšení, dávka 0,03 mg/kg iv. indukovala 35,1±27,4%zvýšení; dávka 0,10 mg/kg iv. indukovala 60,l±16,9% zvýšení a dávka 0,3 mg/kg iv. indukovala 91,9±27,4% zvýšení (střední hodnota±SEM, n = 3). Antagonista NPY Yl neměl žádný účinek na bazální (nestimulované) prokrvení vagíny (data nejsou znázorněna). Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Obr. 11:
Na obr. 11 je znázorněn sourhnný graf některých údajů, které zde byly uvedeny, který ukazuje, že uvedená činidla jsou velmi užitečná při zvyšování vaginálního prokrvení prostřednictvím potenciace hladiny endogenního cAMP. Zvýšení cAMP signalizace potencuje nervově stimulované zvýšení vaginálního prokrvení u králíka.
Obr. 12:
Na obr. 12 je graficky znázorněn účinek NEPi na prokrvení klitoris indukované stimulací pelvického nervu.
143
Selektivní inhibitor NEP (NEPi) EC 3.4.24.11 podporuje zvýšení prokrvení klitoris indukované stimulací pelvického nervu při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících. Podání inhibitoru NEP (šedý sloupec) zvedá pík zvýšení prokrvení klitoris indukovaného submaximální stimulační frekvencí (například 4 Hz) ve srovnání se zvýšeními pozorovanými během časově sladěných kontrolních stimulací nebo za použití kontrolního vehikula (čárkovaný sloupec). V závislosti na dávce byla pozorována následující zvýšení - dávka 1,0 mg/kg iv. indukovala 131% zvýšení (střední hodnota n = 3). NEP inhibitor neměl žádný účinek na bazální (nestimulované) prokrvení vagíny (data nejsou znázorněna). Všechny změny byly monitorovány za použití laserové Dopplerovské technologie.
Zkušební postupy měření aktivity/hladiny cAMP
Měření cAMP ze vzorků vaginální tkáně za použití kitu pro enzymatické imunostanovení (EIA) Biotrak cAMP (Amersham Life Sciences RPN 225).
cAMP hladina se měří pomocí EIA ve vzorcích vaginální tkáně. EIA je založena na kompetici mezi neznačným cAMP a fixním množstvím cAMP značeným peroxidasou o omezené množství cAMP specifické protilátky.
1. Látky
Všechny látky byly dodány v rámci kitu pro EIA Amersham Life Science (RPN 225), pokud není uvedeno jinak.
1.1. Mikrotitrační destičky - 96jamkové destičky potažené oslím antikráličím IgG.
·· ·· .4 · · 4
144
4· 4 4··
1.2. Zkouškový pufr - 0,05M pufr na bázi octanu sodného o pH 5,8 obsahující po rekonstituci 0,02% hovězí sérový albumin a 0,5% konzervační látku. Obsah nádoby se trojím propláchnutím 15 ml destilované vody převede do odměrného válce a poté se doplní na konečný objem 500 ml.
1.3. cAMP standard (pro acetylační postup). cAMP o koncentraci 10,24pmol/ml v 0,05M acetátovém pufru o pH 5,8 obsahujícím po rekonstituci 0,02% hovězí sérový albumin a 0,5% konzervační látku.
1.4. Antisérum. Anti-cAMP protilátka v 0,05M acetátovém pufru o pH 5,8 obsahujícím po rekonstituci 0,02% hovězí sérový albumin a 0,5% konzervační látku. Před použitím se protilátka zředí 11 ml zkouškového pufru a promíchá mírným obracením, aby se obsah rozpustil.
1.5. cAMP konjugát. cAMP-křenová peroxidasa v 0,05M acetátovém pufru o pH 5,8 obsahujícím po rekonstituci 0,02% hovězí sérový albumin a 0,5% konzervační látku. Před použitím se roztok zředí 11 ml zkouškového pufru a promíchá mírným obracením, aby se obsah rozpustil.
1.6. Promývací pufr. 0,01M fosfátový pufr o pH 7,5 obsahující po rekonstituci 0,05% (obj.) Tween^R^ 20. Obsah nádoby se trojím propláchnutím 15 ml destilované vody převede do odměrného válce a poté doplní na konečný objem 500 ml.
1.7. TMB substrát. 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB)/ peroxid vodíku v 20% (obj.) dimethylformamidu.
1.8. Acetylační činidlo. 2ml acétanhydridu, 4 ml triethylaminu, připraví se podle požadavků.
1.9. Kyselina sírová (1M). 1M kyselina sírová se připraví z
145
18M zásobního roztoku (BDH). 1,11 ml kyseliny se přidá k 18,8 ml destilované vody.
2. Speciální vybavení
2.1. 5ml skleněné zkumavky pro jedno použití
2.2. Spektrofotometrické čtecí zařízení pro destičky (Spectra max 190)
2.3. Třepačka mikrotitračních destiček (Luckham R100)
3. Postupy
- Příprava tkáňových vzorků: Tkáně se podrobí příslušnému předběžnému ošetření v 5ml vzorcích ve fyziologickém solném roztoku například agonistů, cAMP mimetik apod. Po ošetření se vzorky rychle zmrazí v kapalném dusíku a poté rozbijí kladivem. Prášek se seškrábne do centrifugační zkumavky, do níž se poté přidá 1 ml 0,5M ledově chladné kyseliny chloristé (PCA). Vzorek se promíchá vířivým pohybem a 1 hodinu nechá stát na ledu.
- Extrakce cAMP z tkáňových vzorků: Vzorky se 5 minut centrifugují při 4°C a 10 OOOxg. Supernatant se oddělí a umístí do jiných centrifugačních zkumavek. Peleta se pro analýzu proteinů uchovává při -80°C. Vzorky supernatantu se za použití fosforečnanu draselného (K3PO4) zneutralizují na pH asi 6 a centrifugují 5 minut při 4°C a 10 OOOxg. Supernatant se izoluje a promyje 4x5 objemy (5 ml) vody nasycené diethyletherem. Horní etherová vrstva by se po každém promytí měla zahodit. Vodné fáze se převedou do krátké tenké zkumavky a suší pod proudem dusíku při 60’C. Vysušený extrakt se rozpustí v 1 ml zkouškového pufru a až do použití skladuje v lednici (nebo může být zmrazen).
146
- Zásobní reagenty se nechají vyrovnat s teplotou místnosti a poté se připraví pracovní roztoky.
- Ve skleněných zkumavkách značených 2, 4, 8, 16, 32, 64,
128, 256 a 512fmol se připraví cAMP standardy. Toho se dosáhne tak, že se 1 ml zkouškového pufru přidá do všech zkumavek s výjimkou 512fmol standardu. Poté ke dvěma horním standardům (256 a 512 fmol) přidá 1 ml acetylačního standardu (10,24 pmol/ml). 256fmol standard se vířením promíchá a 1 ml se převede do 128fmol standardu. Tak se pokračuje, dokud se nezíská 2fmol standard, kdy se připraví 1 ml roztoku.
Připraví se zkumavka s nulovým standardem obsahující 1 ml zkouškového pufru.
- Vzorky tkáňového extraktu se nechají roztát na ledu (pokud je to nutné) a stonásobně zředí (10 μΐ vzorku na 990 μΐ zkouškového pufru) ve značených skleněných zkumavkách.
- cAMP ve všech standardech a vzorcích se v digestoři acetyluje přídavkem 100 μΐ acetylačního činidla, které se přidá po straně zkumavky bezprostředně před promíchání vířivým pohybem.
- 50 μΐ všech standardů a vzorků se navzorkuje do odpovídajících jamek 96jamkové destičky a do jamek pro nespecifickou vazbu (NSB) se přidá 150 μΐ zkouškového pufru.
- 100 μΐ antiséra se navzorkuje do všech jamek, vyjma jamek pro slepé pokusy (B) a NSB a poté následuje dvouhodinová inkubace při 3 až 5°C.
- Po inkubaci se do všech jamek, kromě B, navzorkuje 100 μΐ cAMP peroxidasového konjugátu a následuje jednohodinová inkubace při 3 až 5°C.
147
- Destičky se vyprázdní tak, že se obrátí dnem vzhůru, odsají absorpčním papírem a poté se každá jamka promyje čtyřikrát 400 μΐ promývacího pufru. Po každém promytí se destičky znovu odsají, aby se zajistilo úplné odstranění promývacího pufru. Ihned poté se do všech jamek rozdělí 200 μΐ TMB.
- Destičky se při teplotě místnosti na 30 minut umístí do třepačky, načež se do všech jamek přidá 100 μΐ kyseliny sírové. Na zařízení Spectra max 190 se při 450 nm v průběhu 30 minut odečítá optická densita.
4. Standardy
Pro každou zkoušku se připraví následující standardní zkumavky:
4.1. Přidání standardu do zkouškovém pufru
Za účelem zjištění účinnosti stanovení se do zkouškového pufru přidá známé množství cAMP. Do zkouškového pufru se přidá 70 pmol/ml cAMP, ekvivalent 35 fmol/jamku při zkoušce, což je střed křivky závislosti odpovědi na dávce.
Pro přípravu 1 ml standardu: 68,4 μΐ 521fmol standardu/jamka 931,6 μΐ zkouškového pufru
4. Účinky sloučenin na destičku
Za účelem stanovení, zda sloučeniny použité při funkčních zkouškách mají účinek na 96jamkové destičky nebo ovlivňují vazbu cAMP, se připraví standardy tak, že se
- do samotného zkouškového pufru přidá sloučenina, čímž se stanoví účinky sloučeniny přímo na destičku;
- 148 - sloučenina se přidá do plasmy obsahující bazální hladinu cAMP, čímž se stanoví účinky sloučeniny na vazbu cAMP na destičku.
Do každého standardu se přidá sloučenina v 5nM koncentraci. Koncentrace 5nM je zvolena proto, že celkové koncentrace léčiva na konci infuze v minulosti byly přibližně 150 až 300mM. Vzorky se před zkouškou zředí 1 : 100, 5nM koncentrace tedy počítá s jakokoliv vyšší koncentrací, než je předpokládaná celková koncentrace léčiva na konci infuze.
5. Výpočty
Spectra max odečítá optickou hustotu (OD) při 450 nm.
Standardní křivka se sestrojí tak, že se vynese %B/Bo (na osu y) proti cAMP fmol/jamka (na osu x) na Spectra max, kde Bo představuje nulový standard (viz postup 3.2) %B/Bo (% vazby) pro každý vzorek a standard se vypočítá podle následujícího vzorce
OD standardu nebo vzorku - OD NSB) %B/Bo = - x 100 (OD Bo - OD NSB)
Hodnoty fmol/objem v jamce je možno odečíst přímo ze standardní křivky pro každý vzorek. Hodnoty se poté převedou na pmol/ml, načež se stanoví střední hodnota každého páru vzorků.
Převod hodnot z fmol/jamka na pmol/ml:
fmol na pmol objem v jamce = děleno 1000 = 50 μΐ ... So (xlOOO)
- 149
Vzorky se ředí 1 : 100, takže celkem = 1 x 1000/1000x100/50 = 2
Z toho vyplývá, že hodnoty v fmol/jamka je třeba násobit dvěma, aby se získaly hodnoty v pmol/ml.
Zvířecí zkušební model
Potenciace účinků cyklického adenosin-3',5'-monofosfátu (cAMP) vede ke zvýšení vaginálního prokrvení při modelové zkoušce sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících.
1.0. Cíle
1. Vyvinout a ověřit zvířecí model ženského sexuálního vzrušení.
2. Identifikovat mechanismus (mechanismy) zodpovědný za regulaci prokrvení genitálií u anestetizovaného králíka.
3. Identifikovat potenciální přístupy ke zvýšení vaginálního a klitoriálního prokrvení.
4. Zkoumat mechanismus (mechanismy), který je základem relaxace hladkého svalu vagíny a identifikovat potenciální přístupy ke zvýšení vaginální relaxace.
2.0. Úvod
Normální sexuální vzrušení je tvořeno řadou fyziologických odpovědí, které jsou pozorovány během sexuální excitace. Tyto změny, jako překrvení vagíny, labií a klitoris, jsou výsledkem zvýšeného prokrvení genitálií. Překrvení vede ke zvýšení vaginální lubrikace prostřednict44 4 44 φ 44 44
444 4 444 4 44 4
150
4 444 4 · 4
4444 444 44 444 44 4444 vím transsudace plasmy, zvýšení poddajnosti vagíny (relaxaci hladkého svalu vagíny) a zvýšení citlivosti vagíny a klitoris.
Porucha sexuální vzrušivosti u žen (FSAD) je poruchou s vysokou prevalencí, která postihuje až 40 % pre-, peri- a postmenopausálních (±HRT) žen. Primárním důsledkem FSAD je snížené překrvení či zbytnění genitálií, které se manifestuje jako nedostatečná lubrikace vagíny a nedostatek příjemných vjemů. Druhotným důsledkem je snížená sexuální touha, bolest během styku a obtížné dosahování orgasmu.
Nej obvyklejší příčinou FSAD je snížené prokrvení genitálií, které vede ke sníženému překrvení vagíny, labií a klitoris.
(Park, 1997; Goldstein, 1998; Berman, 1999a, Werbin, 1999).
Jak již zde bylo vysvětleno, tento vynález poskytuje prostředky pro obnovení nebo potenciaci normálního sexuálního vzrušení u žen, které trpí FSAD, prostřednictvím zvyšování prokrvení genitálií.
Při našich zkouškách jsme identifikovali cAMP (cyklický adenosin-31,5'-monofosfát) jako mediátor vasorelaxace, přičemž jsme pro měření malých změn prokrvení genitálií použili laserové Dopplerovské technologie. Za použití inhibitoru VIP metabolismu (inhibitoru NEP EC 3.4.24.11) jsme také doložili, že zvýšení prokrvení genitálií pozorované během stimulace pelvického nervu (tj. sexuálního vzrušování) je zprostředkováno VIP. Tato činnost zahrnovala vyvinutí zvířecího modelu sexuálního vzrušení a doložení, že data reflektují fyziologické změny pozorované během sexuálního vzrušení ženy. Tohoto modelu bylo použito pro identifikaci a potvrzení mechanismů, které podporují prokrvení genitálií, například přímé nebo nepřímé potenciace vasorelaxace zprostředkované cAMP.
»« · ·· · ·· ·· • ··« · 9 ·· » · 9 ·
151 • · «·· 9 · · ··«· ··· ·« 999 99 9999
3.0. Postupy
3.1. Anestetický protokol
Samice novozélandského králíka (asi 2,5 kg) se premedikují kombinací medetomidinu (Domitor, 0,5 ml/kg i.m.), a ketaminu (Vetalar^R\ 0,25 ml/kg i.m), přičemž se udržuje přívod kyslíku za použití obličejové masky. Králíci se tracheotomizuji za použití endotracheální trubice bez manžety Protex^R^ 3 ID., napojí na ventilátor a udržují při ventilační frekvenci 30 až 40 dechů za minutu s průměrným respiračním objemem 18 až 20 ml a maximálním tlaku 981 Pa. Anestezie se poté převede na Isoflurane a ventiluje se provádí kyslíkem (2 1/min). Pravá marginální usní véna se kanyluje za použití katétru 23G nebo 24G a perfunduje se laktátovaným Ringerovým roztokem (0,5 ml/min). Králík se během invazivní chirurgie udržuje na 3% Isofluranu, který se při udržovací anestezii sníží na 2%.
3.2. Kanylace cév
Oblast levého třísla králíka se oholí a podél stehna se provede vertiální řez o délce asi 5 cm. Exponuje se femorální véna a artérie, které se izolují a kanylují PVC katétrem (17G) pro infuzi léčiv a sloučenin. U femorální artérie se kanylace opakuje, přičemž se katétr zavede do hloubky asi 10 cm, aby se zajistilo, že katétr dosáhne abdominální aorty. Arteriální katétr se spojí s systémem Gould, aby bylo možno zaznamenávat krevní tlak. Arteriálním katétrem se také odebírají vzorky pro analýzu krevních plynů. Měří se systolický a diastolický tlak a za použití vzorce (diastolický x 2 + systolický) + 3 se vypočítá střední arteriální tlak. Srdeční frekvence se měří pomocí pulzního oxymetru a softwarového systému pro sběr dat ** * ·· · ·· »· *··· ···· ····
152 • · « 9 · 9 9 9
99 9 9 99 9 9 99 9 9 9 99 9 9
Po-ne-mah (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems lne.).
3.3. Stimulace pelvického nervu
Do abdominální dutiny se vede řez střední čárou břicha. Řez je asi 5 cm těsně nad stydkou kostí. Tuk a svaly se tupě oddělí, čímž se odhalí hypogastrický nerv, který sbíhá do tělní dutiny. Je nezbytné udržet boční stěnu pubis uzavřenou, aby nedošlo k porušení femorální vény a artérie, které leží pod stydkou kostí. Ischiatický a pelvický nerv jsou uloženy hlouběji a objeví se po další disekci na dorsální straně králíka. Po identifikaci ischiatického nervu lze snadno lokalizovat pelvický nerv. Pojem pelvický nerv je používán volně; anatomické knihy při identifikaci těchto nervů v dostatečných detailech selhávají. Stimulace tohoto nervu však vyvolává zvýšení vaginálního a klitoriálního prokrvení, a inervaci pánevní oblasti. Pelvický nerv se zbaví obklopujících tkání a kolem něho se umístí bipolární stimulační elektroda Harvard. Nerv se mírně nadzvedne, aby se vyvolalo určité napětí, načež se bezpečně upevní v poloze. Okolo nervu a elektrody se nanese asi 1 ml lehkého parafinového oleje. Ten funguje jako ochranný lubrikant nervu a zabraňuje kontaminaci elektrody krví. Elektroda se spojí se stimulátorem Grass S88. Pelvický nerv se stimuluje při následujících parametrech: 5 V, šířka impulzu 0,5 ms, trvání stimulu 10 sekund a frekvence v rozmezí 2 až 16 Hz. Při stimulaci nervu každých 15 až 20 minut se dosáhne reprodukovatelných odpovědí.
Na začátku každé zkoušky se stanoví křivka závislosti odpovědi na frekvenci za účelem stanovení optimální frekvence, které se používá jako sub-maximální odpovědi, obvykle 4 Hz. Sloučenina (sloučeniny), která se má zkoušet, se podá infuzí do femorální vény za použití infuzní pumpy
153
«0 • · 00 • 0 • 0 «0 0· • ·
0 0
9 • « 0 · • 0 · 0 0
• • • « • 0 0 0
···« 00* 00 000 *0 0000
Harvard 22 umožňující pokračování 15minutového stimulačního cyklu.
3.4. Umístění laserové Dopplerovské sondy
Provede se řez ventrální střední čárou na kaudálním konci pubis, aby se exponovala pubická oblast. Pojivové tkáně se odstraní, čímž se exponuje obal klitoris. Tím se zajistí, že stěna bude zbavena malých cév. Vnější stěna vagíny se také exponuje a zbaví veškeré pojivové tkáně.
Jedna laserová Dopplerovská průtoková sonda se vloží 3 cm do vagíny tak, že držadlo sondy zůstává stále viditelné. Druhá sonda se umístí tak, aby ležela právě nad vnější stěnou klitoris. Polohy těchto sond se upravují, dokud se nezíská signál. Druhá sonda se umístí těsně nad povrch cévy vnější vaginální stěny. Obě sondy se v polohách upevní svorkami.
Vaginální a klitoriální prokrvení se zaznamenává bud' ve formě čísel přímo z průtokoměru za použití softwarového systému pro sběr dat Po-ne-mah (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems lne.) nebo nepřímo ze stopy pásového záznamníku Gould. Na začátku zkoušky se provede kalibrace (0 až 125 ml/min/100 g tkáně).
3.5. Infuze vasoaktivního intestinálního peptidu (VIP)
Infuzi iv. se podá VIP v dávkách 2,0, 6,0, 20,0, 60,0 μg/kg v objemu 0,5 ml solného roztoku. Infuze VIP se provádí za použití pumpy Harvard 22 rychlostí 500 μΐ/min pomocí trojčestného napojení do femorální vény. Po infuzi VIP se katétr propláchne heparinizovaným solným roztokem (Hepsaline) tak, aby v katétru nezůstal žádný VIP. Pro zkoušky za použití infuzi VIP je třeba sestrojit křivku závislosti odpovědi na počáteční sensitizační dávce (2 až 60 μg/kg), aby bylo možno získat reprodukovatelné odpovědi.
154
Počáteční infuze Hepsaline (50 Ul/ml) slouží jako negativní kontrola.
3.6. Infuze inhibitorů
Inhibitory NEP (neutrální nedopeptidasy EC 3.4.24.11), inhibitory fosfodiesterasy typu 5 (PDE5) a antagonisty NPY Yl se připraví jako roztoky v solném roztoku nebo 5% roztoku glukosy (200 μΐ 50% glukosy v 1,8 ml vody pro injekce). Inhibitory PDEcAMp se rozpustí ve 40% ethanolickém roztoku (200 μΐ 50% glukosy v 1,8 ml směsi vody a ethanolu pro injekce). Inhibitory a kontrolní vehikulum se podají infuzí stejnou rychlostí jako VIP. NEP inhibitory se nechají stát 30 minut před sestrojením křivky závislosti odpovědi na dávce VIP, zatímco inhbitory VIP, antagonisty receptoru NPY Yl a inhibitory PDEcAMp se nechají stát 15 minut před stimulací pelvického nervu.
3.7. Měření relaxace hladkého svalu na izolované králičí vagíně
3.7. (a) Králičí vagína in vitro: Samice novozélandských bílých králíků (2,0 až 3,0 kg) se usmrtí cervikální dislokací. Jejich břišní dutina se otevře a vyřízne se vagína. Tkáňové proužky se hedvábnou chirurgickou nití (6/0) podélně upevní do 5ml silanizovaných komor pro orgány Wesley Co. při počátečním klidovém napětí 1,5 g v Krebsově bikarbonátovém pufru udržovaném při 37°C a aerovaném směsí 5 % kysličníku uhličitého a 95 % kyslíku. Horní ligatura každého tkáňového proužku se napojí na zařízení pro měření změn v isometrické síle s kapacitou 10 g a naměřené hodnoty se zaznamenávají za použití systému DART pro sběr dat in vitro. Tkáně se během 1 hodiny nechají ekvilibrovat a pravidelně promývají Krebsovým roztokem.
- 155
3.7. (b) Relaxace králičí vagíny indukovaná vasoaktivním intestinálním peptidem: Každá tkáň se kontrahuje za použití lázně fenylefrinu o ΙμΜ koncentraci. Když kontraktilní odpověd dosáhne stabilního platě (asi 15 minut) VIP se kumulativně přidává do komory pro orgány v logaritmických jednotkách, aby se dosáhlo koncentrací 0,1 až lOOnM. Relaxační odpovědi se měří 5 minut po přídavku každé koncentrace VIP, dokud se nedosáhne maxima relaxace. Tkáně se poté ošetřují bud’ zkoušenou sloučeninou (například inhibitorem NEP nebo PDE) nebo DMSO vehikulem (časově sladěná kontrola).
3.7 (c) Analýza dat ze zkoušek VIP relaxace: Vždy se sestrojí křivka relaxační odpovědi na koncentraci VIP, relaxační odpověď indukovaná VIP se vyjádří jako procento maxima kontrakce indukované fenylefrinem. Tyto hodnoty se vynesou do grafu proti logaritmu koncentrace VIP a proloží se S-křivkou. Křivka se proloží mezi bodem odpovídajícím 0 % (minimum relaxační odpovědi), přičemž bod odpovídající maximu relaxační odpovědi se neupravuje. Stanoví se koncentrace VIP potřebná pro dosažení 50% relaxaci fenylefrinové kontrakce (EC5Q pE).
3.7 (d) Relaxace králičí vagíny stimulovaná elektrickým polem: Proužky z králičí vagíny se připraví způsobem popsaným v části 3.7 (a). Tkáňové proužky se umístí mezi dvě platinové elektrody umístěné na vrchu a na dně komory pro orgány asi 4 cm od sebe. Každá tkáň se kontrahuje za použití lázně s ΙμΜ koncentrací fenylefrinu. Když kontraktilní odpověď dosáhne stabilního platě (15 minut), tkáně prodělají křivku relaxace indukované stimulací elektrickým polem (EFS) v rámci předběžného ošetření. To se provádí při 40 až 60 V za použití řady frekvencí 2, 4, 8 a 16 Hz jako desetisekundová řada pulsů o šířce 0,5 milisekund. Tkáně se mezi každou frekvencí nechají vrátit na základní linii prekontraktilního napětí (5 minut) a zaznamená se velikost relaxační odpovědi.
- 156
Po předběžné charakteristice EFS odpovědi se všechny tkáně 15 minut promývají, přičemž se nechají vrátit na základní linii napětí. Tkáně se poté ošetří bud zkoušeným činidlem (například inhibitorem NEP nebo PDE, inhibitorem oxid dusnatý synthasy (NOS)) nebo DMSO vehikulem (časově sladěná kontrola). Tkáně se 15 minut po přídavku sloučeniny nebo vehikula znovu kontrahují fenylefrinem (ΙμΜ) a způsobem popsaným výše se stanoví křivka EFS-indukované relaxační odpovědi.
Při EFS zkouškách se Krebsův roztok doplní atropinem (ΙΟμΜ) a guanethidinem (150μΜ), aby se odstranila cholinergická nebo adrenergická neuronální inervace vagíny.
3.8. Měření hladiny cAMP v izolované vagíně králíka
Koncentrace cAMP se měří v extraktech z vaginální tkáně za použití kitu pro enzymatické imunostanovení Biotrak cAMP (EIA) (Amersham Life Sciences RPN 225).
Izolované vzorky tkáně vagíny se ošetří zkoušenými činidly (například forskolinem nebo VIP). Po 5 minutách se vzorky rychle zmrazí za použití kapalného dusíku, homogenizují a extrahuje se cAMP. Hladiny cAMP se měří pomocí EIA. EIA je založeno na kompetici mezi neznačeným cAMP a fixovaným množstvím cAMP značeného peroxidasou o omezené množství cAMP specifické protilátky.
3.9. Měření aktivity fosfodiesterasy (PDE) v izolované vagíně králíka
Cytosolické extrakty ze stěny lidské vagíny byly dodány firmou ABS lne., Delaware, USA (věk dárců byl 41 a 61 let). PDE isoenzymy se oddělí chromatografii na anexu Mono-Q a charakterizují na základě substrátové selektivity, citli157
vosti k alosterickým modulátorům a selektivních inhibitorů. Za účelem detekce exprese PDE v lidské vagíně se také provede Western analýza za použití PDE isoenzymových protilátek.
Všechna data se uvedou jako střední hodnota ± SEM. Významné změny se identifikují za použití Studentova t-testu.
4.0. Výsledky a diskuse
4.1. Zvířecí model sexuálního vzrušení
Při našich studiích byl vyvinut robustní reprodukovatelný model fyziologie sexuálního vzrušení. Za použití tohoto modelového organismu, anestetizovaného králíka, jsme schopni měřit malé změny prokrvení genitální za použití laserové Dopplerovské technologie. Pro stimulaci neuronálních efektů sexuálního vzrušení se používá stimulace pelvického nervu.
Zjistili jsme, že stimulace pelvického nervu indukuje zvýšení vaginálního a klitoriálního prokrvení závislé na frekvenci (viz obr. 1). Tato zvýšení vaginálního prokrvení jsou významné při snímání na vnitřní nebo vnější stěně vagíny. Stimulace pelvického nervu při 2 Hz indukuje střední maximum zvýšení vaginálního prokrvení o 10,3±l,8, při 4 Hz 20,0±4,6, 8 Hz 36,3±4,8 a 16 Hz 46,6±4,7 ml/min/100 g tkáně (n - 4, 0,5 ms, lOs) a zvýšení klitoriálního prokrvení o 14,7±3,6 při 2 Hz, 29,4±1,4 Hz a 69,7±2,1 při 8 Hz. Tyto hodnoty mají podobnou amplitudu jako hodnoty dříve pozorované při zkouškách na člověku a zvířecích modelech vzrušení (Berman, 1999a, Park, 1997).
158
Zjistili jsme, že submaximální stimulace pelvického nervu vede k reprodukovatelným zvýšením genitálního prokrvení (například stimulace 4 Hz každých 15 minut vede ke střednímu zvýšení vaginálního prokrvení o 8,5±0,10 ml/min/100 g tkáně, n = 8, a střednímu zvýšení klitoriálního prokrvení o 13,65±0,86 ml/min/100 g tkáně, n = 11). Tato reprodukovatelnost se udržela až 5 hodin. Tuto reprodukovatelnost odpovědí může použít pro a) identifikaci endogenního vasoaktivního činidla/mechanismu, kterým je zprostředkováno překrvení genitálií a b) zkoumáníí vlivu léčiv, která mohou být účinná při zvyšování vaginálního a/nebo klitoriálního prokrvení.
Zjistili jsme, že se stimulací pelvického nervu u anestetizovaného králíka nejsou spojeny žádné nežádoucí účinky (viz obr. 3).
Prokrvení genitálií se během sexuálního vzrušení zvyšuje (Berman, 1999) prostřednictvím zvýšené dodávky arteriální krve: vaginální artérie, vaginální větev děložní artérie, stydká artérie a střední větev střední rektální artérie se všechny podílejí na zásobování vagíny a klitoris krví. Pelvický nerv, který vychází z míšní oblasti S2/S4, inervuje ženské genitálie a má větve, které jsou zakončeny v dolní vagíně, klitoris a s nimi souvisejících cévách. Stimulací pelvického nervu můžeme stimulovat efekty prokrvení pozorované během sexuálního vzrušení, tj. zvýšení arteriálního prokrvení genitálií. Je zajímavé, že zvýšené arteriální prokrvení se neodráží v žilní drenáži, což umožňuje překrvení sítě kapilár. Překrvení vagíny vede k její lubrikací prostřednictvím zvýšené transsudace plasmy, a to je jedna z prvních pelvických odpovědí pozorovaných během sexuální stimulace. Neurotransmitery, které jsou uvolňovány po stimulaci pelvického nervu nebo během sexuálního vzrušení v současné době nejsou identifikovány. Nervy obsahující
- 159
neuropeptidy a jiné potenciální neurotransmitery, které inervují vaskulaturu a mikrovaskulaturu vagíny a klitoris, byly identifikovány imunohistologicky. Tyto studie napovídají, že peptid se vztahem ke kalcitoninovému genu (CGRP), neuropeptid Y (NPY), oxid dusnatý synthasa (NOS), látka P a vasoaktivní intestinální peptid (VIP) jsou všechny přítomny v nervech, které inervují lidskou vagínu a klitoris (Hoyle, 1996; Burnett, 1997; Hauser-Kronberger, 1999).
4.2. Ověřování modelu sexuálního vzrušení na anestetizovaných králících
Za účelem korelace dat týkajících se prokrvení získaných za použití tohoto modelu s daty pozorovanými na lidském modelu sexuálního vzrušení jsme přímo porovnávali naše data o vaginálním prokrvení a kardiovaskulární data získaná v předklinických zkouškách.
Zjistili jsme, že infuze VIP měla u králičího modelu sexuálního vzrušení následující účinky:
- Exogennní VIP (iv. bolus) indukuje významné zvýšení vaginálního prokrvení v závislosti na koncentraci (viz obr. 2a). Tato zvýšení jsou významně nad bazálními hodnotami prokrvení při snímání na intra- nebo extravaginální stěně. Intravenosním podáváním VIP (60 μg/kg) se vaginální prokrvení významně zvyšuje o 24,7 ± 3,6 ml/min/100 g tkáně. Prokrvení zůstává zvýšeno nad bazální hodnotu asi 11 minut po infuzi. Nižší dávky indukují menší zvýšení, například dávka 6,0 μg/kg vyvolá zvýšení prokrvení o 7,5 ± 1,3 ml/min/ /100 g tkáně a zvýšení přetrvává asi 7 minut po infuzi.
- Opakované infuze podobných dávek VIP (iv. v 30minutových intervalech) indukuje významná reprodukovatelná zvýšení vaginálního prokrvení (viz obr. 2b).
160
- VIP (iv.) významně zvyšuje srdeční frekvenci a snižuje střední arteriální tlak krve (viz obr. 3). VIP v dávce 6,0 M-g/kg (iv.) vyvolává významné snížení středního arteriálního tlaku krve o 1760±93 Pa a významné zvýšení srdeční frekvence o 16±4 tepy za minutu.
Zvířecí model přímo odráží klinická data pozorovaná po infuzi VIP zdravým dobrovolníkům, tj. zvýšení vaginálního prokrvení, snížení krevního tlaku a zvýšení srdeční frekvence. Tento model je tedy možno použít pro zkoumání mechanismu (nebo mechanismů), které jsou základem fyziologických změn, k nimž dochází během sexuálního vzrušení, a dále pro ověření nových přístupů ke zvyšování vaginálního prokrvení, a tedy léčení FSAD.
4.3. Změny prokrvení vagíny indukované VIP prostřednictvím stimulace dráhy cAMP/adenylát cyklasové dráhy
Ottesen a spolupracovníci demonstrovali, že VIP indukuje zvýšení vaginálního prokrvení a lubrikaci u zdravých dobrovolníků. Mechanismus, jakým k tomu dochází, je však nejasný. V literatuře je řada příkladů VIP signalizace přes různé systémy druhých poslů, jako cGMP/guanylát cyklasu (Ashur-Fabian, 1999), oxid uhičitaný/hem oxygenasu (Fan, 1988) a cAMP/adenylát cyklasu (Schoeffter, 1985; Gu, 1992; Foda, 1995). To je doloženo příklady v nedávné zprávě, která popisuje, jak je relaxační účinky VIP v děložní artérii možno vysvětlit uvolňováním oxidu dusného (Jovanovic, 1998). Pozoruhodné je, že existuje také důkaz o VIP modulaci NO/cGMP při urogenitální funkci samců (Kim, 1994) a existuje přímý důkaz, že ošetření kultur buněk hladkého svalu ženské vagíny vasoaktivním intestinálním peptidem (0,5μΜ) nezvyšuje hladinu cAMP (Traish, 1999, tamtéž).
161
Při této zkoušce jsme demonstrovali, že VIP indukuje vasorelaxaci prostřednictvím zvýšení hladiny intracelulárního cAMP. Při řadě funkčních experimentů jsme kromě biochemického měření intracelulárních koncentrací cAMP měřili prokrvení a relaxaci hladkého svalu. Pro napodobení aktivačních účinků na cAMP/adenylát cyklasovou dráhu jsme použili forskolinu, aktivátoru adenylát cyklasy či cAMP mimetika. VIP a forskolin mají stejné účinky na fyziologické projevy vzrušení z hlediska vaginálního prokrvení a relaxace.
VIP (20 μg/kg) a forskolin (40 nmol/kg) indukují významné zvýšení vaginálního prokrvení (VIP 13,2 ml/min/100 mg tkáně, VIP 12,7 ml/min/100 mg tkáně) (viz obr. 2a a 4a). Tyto změny v amplitutě indukované VIP a forskolinem se významně nelišily. Tato zvýšení jsou významně nad hodnotami bazálního prokrvení při měření na intra- nebo extravaginální stěně.
VIP (Ο,ΙμΜ) a forskolin (ΙΟμΜ) významně zvyšovaly iňtračelulární koncentrace cAMP nad bazální hladinu v izolované tkáni vagíny (viz obr. 4b)
VIP (Ο,ΙμΜ) a forskolin (ΙΟμΜ) zvyšují bazální koncentrace od 276nM o 156 % (VIP) a 238 % (forskolin). Rozdíl v těchto procentických hodnotách odráží rozdíl v použitých koncentracích VIP a forskolinu; například VIP v koncentraci Ο,ΙμΜ relaxuje prekontrahovanou izolovanou vagínu přibližně z 80 %, zatímco ΙΟμΜ forskolin postačuje pro úplnou relaxaci izolované tkáně.
Kromě toho jsme ukázali, že VIP a forskolin indukují relaxaci v izolované tkáni vagíny při EC50 18,8±0,6nM (VIP) a 320±20nM (forskolin) (viz obr. 4 c).
162
Tato data potvrzují, že VIP indukuje vaginální vasorelaxaci prostřednictvím cAMP/adenylát cyklasové dráhy, takže je tohoto modelu možno použít pro zkoumání, zda stimulace pelvického nervu, tj. sexuální vzrušování, vede k uvolnění VlP/aktivaci cAMP/adenylát cyklasové dráhy. Také lze zkoumat přístupy ke zvyšování vaginálního prokrvení během sexuálního vzrušení, například přímým nebo nepřímým posílením cAMP signalizace.
4.4. cAMP je mediátorem vaginální vasorelaxace
Potenciální neurotransmitery a druzí poslové zodpovědní za zvýšení vaginálního prokrvení během sexuálního vzrušení dosud nebyli identifikováni. Výzkumníci se dosud zaměřovali na dráhu oxid dusnatý (NO)/cGMP. V souvislosti s tímto vynálezem jsme doložili, že 1) cAMP/adenylát cyklasová dráhy zprostředkovává zvýšení vaginálního prokrvení indukované VIP; 2) VIP je endogenním neurotransmiterem uvolňovaným během sexuálního vzrušení; a 3) endogenně uvolněný VIP navozuje své vasorelaxační účinky prostřednictvím zvýšení cAMP.
Neurotransmiter zodpovědný za relaxaci vaginální stěny dosud nebyl identifikován. Doložili jsme, že VIP je neurotransmiterem uvolňovaným po stimulaci pelvického nervu a že cAMP je mediátorem vasorelaxace zprostředkované VIP. Činidla, která zabraňují metabolismu VIP nebo přímo posilují cAMP signalizaci podporují zvýšení vaginálního prokrvení při stimulaci pelvického nervu, například inhibitory NEP nebo inhibitory PDEcAMp (viz následující odstavce).
Při našich zkouškách jsme zjistili, že můžeme vyloučit roli NO při relaxaci vagíny indukované VIP. Účinné a selektivní inhibitory PDE typu 5 mají minimální účinek na
163 • · * · · · ·
• · ♦ ··· relaxaci izolovaného svalu vagíny indukovanou VIP (30% zvýšení relaxace indukované VIP, viz tabulka 1).
Tabulka 1
Zvýšení relaxace izolované králičí vagíny zprostředkované VIP
Tato tabulka ilustruje procentické zvýšení EC5Q pro relaxace prekontrahovaného (ΙμΜ fenylefrinem) hladkého svalu vagíny indukované VIP. Selektivní inhibitory pDFcAMp typu 1, 2, 3 a 4 všechny významně potencují relaxace zprostředkované VIP, zatímco selektivní inhibitor PDEcGMp typu 5 nebo kontrolní vehikulum nemají na relaxaci zprostředkovanou VIP žádný vliv.
PDE inhibitor Zvýšení relaxace v selektivní dávce indukované VIP
PDEcAMP typu 1 210 %
PDEcAMP typu 2 130 %
PDEcAMP typu 3 220 %
PDEcAMP typu 4 160 %
PDEcGMP typu 5 žádný účinek (30
Kontrola . - vehikulum žádný účinek
Rovněž jsme ukázali, že VIP je také endogenním NANC (neadrenergickým, necholinergickým) neurotransmiterem zčásti zodpovědným za EFS indukovanou relaxaci izolovaného hladkého svalu vagíny. Vysoká dávka inhibitoru oxid dusnatý synthasy (L-NOARG, 300μΜ) inhibuje pouze 50 % EFS-indukovaných relaxací. Inhibitor NEP (ΙμΜ), který zabraňuje metabolismu VIP indukovanému NEP, a tedy zesiluje VIP signalizaci, zvyšuje non-oxid dusnatý NANC relaxaci indukovanou EFS. Prokázali jsme, že jak NO, tak VIP regulují tonus hladkého svalu vaginální stěny. Terapeuticky bude možné zvýšit
00 » 0 0 I
164 ·
► 0 0 0· relaxaci hladkého svalu vagíny za použití činidel, která posilují NO/cGMP a/nebo VIP/cAMP zprostředkovanou signalizaci .
4.5. VIP indukuje klitoriální vasorelaxaci přes cAMP dráhu
Potenciální neurotransmitery a druzí poslové zodpovědní za zvýšení prokrvení klitoris při sexuálním vzrušení dosud nebyly indentifikovány. Paralelně s výzkumy prokrvení vagíny byla vytvořena teorie, a výzkum se zaměřil na dráhu oxid dusnatý (NO)/cGMP. Neexistují žádné zprávy o podílu VIP na zprostředkování prokrvení/překrvení klitoris, ačkoliv neurony obsahující VIP byly ve tkáni klitoris vizualizovány (Hauser-Kronberger et al., 1999).
Při našich zkouškách jsme prokázali, že
1. Infuze VIP zvyšuje prokrvení klitoris.
2. cAMP/adenylát cyklasová dráha zprostředkovává zvýšení prokrvení klitoris indukované VIP.
3. VIP je endogenním klitoriálním neurotransmiterem, který je uvolňován během sexuálního vzrušení:
1. Infuze VIP (60 až 200 μg/kg, iv. bolus) indukuje zvýšení prokrvení klitoris závislé na koncentraci (obr. 5). 115% zvýšení prokrvení klitoris je pozorováno po iv. infuzi VIP v dávce 200 μg/kg, což představuje významné zvýšení oproti kontrolním infuzím (Hepsaline).
2. Účinky VIP na prokrvení klitoris lze napodobit infuzí cAMP mimetika, forskolinu (40nmol/kg, iv. bolus, obr.
5). Po iv. infuzi forskolinu v dávce 40 nmol/kg bylo pozorováno 156% zvýšení prokrvení klitoris, což
165
• 4 • • 4 4 te 4«
• 4 • 4 • • 44 4 4 4 4
• • • • 4 « 4
• 4
4 • 4 • 4 4 4 4
4444 4« « 44 4« 4 44 4444
představuje významné zvýšení oproti kontrolním infuzím (Hepsaline). Amplituda odpovědi je podobná jako u VIP (200 μg/kg, iv. bolus) a srovnatelná s hodnotami pozorovanými u prokrvení vagíny (viz obr. 2 a 4).
3. Selektivní inhibitory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantních dávkách významně posilují zvýšení prokrvení klitoris indukované stimulací pelvického nervu (viz obr. 12). NEP inhibitor zvedá pík zvýšení prokrvení klitoris až o 131 % ve srovnání s hodnotami zvýšení za použití vehikula jako kontroly.
Tato data prokazují, že VIP je schopný zvýšit prokrvení/vasorelaxaci klitoris a že tento účinek může být napodoben aktivací cAMP/adenylát cyklasové dráhy. Zjištění, že inhibitor NEP EC 3.4.24.11 (zodpovědný za metabolismus VIP) posiluje zvýšení prokrvení klitoris při stimulaci pelvického nervu, dokazuje, že VIP je neurotransmiterem, který je uvolňován během stimulace pelvického nervu/sexuálního vzrušení.
4.6. Prokrvení genitálií je posíleno farmaceutickými činidly, která přímo nebo nepřímo zvyšují hladinu cAMP
FSAD je spojena se sníženým prokrvením genitálií, které tuto poruchu může vyvolávat. Potenciální přístupy k léčení této poruchy byly zaměřeny na posílení prokrvení genitálií. Je-li prokázáno, že cAMP je mediátor genitální vasorelaxace a že zvýšené hladiny cAMP jsou výsledkem neuronálně uvolněného VIP, máme za to, že pokud je posílena cAMP signalizace, dojde následkem toho ke zvýšení prokrvení genitálií, a tedy k obnovení normálních hladin prokrvení a léčení FSAD.
166
Ve vysoce přednostní aspektu jsme za účelem přímého nebo nepřímého posílení vasorelaxace zprostředkované cAMP zvolili tří cíle: inhibitory PDEcAMp, například inhibitory PDEcAMP ťYPu 2' inhibitory NEP (EC 3.4.24.11) a antagonisty receptoru neuropeptidu Y Yl (NPY Yl).
4.6.1. Inhibitory neutrální endopeptidasy (NEP EC 3.4.24.11)
NEP EC 3.4.24.11 metabolizuje VIP, a tedy ukončuje biologickou aktivitu zprostředkovanou VIP. Inhibitory NEP budou potenciovat endogenní vasorelaxační účinek VIP uvolněného během vzrušení. To se klinicky projeví v posílení překrvení genitálií.
V předchozí literatuře nejsou žádné zprávy o lokalizaci nebo funkční roli NEP EC 3.4.24.11 ve tkáni vagíny nebo její úloze při sexuálním vzrušení.
Selektivní inhibitory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantních dávkách významně posilují zvýšení vaginálního prokrvení při stimulaci pelvického nervu (viz obr. 6).
NEP inhibitor zvedá pík zvýšení vaginálního prokrvení až o 53 % ve srovnání s časově sladěnými kontrolními zvýšeními. Toto zvýšení submaximálních stimulačních frekvencí (např. 4 Hz), bylo závislé na dávce, například dávka 0,1 mg/kg iv. indukovala 35,0±7,6% zvýšení; dávka 0,3 mg/kg iv. indukuvala 42,6±27,7% zvýšení a dávka 1,0 mg/kg iv. indukovala 52,8±32,5% zvýšení. Inhibitory NEP neměly žádný účinek na bazální (nestimulované) prokrvení vagíny. Činidla podle vynálezu tedy zvyšují vzrušení potenciaci cAMP signalizace, a neindukují vzrušení bez přítomnosti sexuální touhy, tj. přímým zvýšením cAMP signalizace.
- 167 • ·
Selektivní inhibitory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantních dávkách významně posilují zvýšení prokrvení klitoris při stimulaci pelvického nervu (viz obr. 12). NEP inhibitor zvedá pík zvýšení klitoriálního prokrvení až o 131 % ve srovnání s kontrolními zvýšeními za použití vehikula. Inhibitory NEP neměly žádný účinek na bazální (nestimulované) prokrvení vagíny. To představuje další podporu pro náš předpoklad, že činidla podle vynálezu zvyšují vzrušení potenciaci cAMP signalizace, a neindukují vzrušení bez přítomnosti sexuální touhy, tj. přímým zvýšením cAMP signalizace.
Selektivní inhibitory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantních dávkách posilovaly zvýšení vaginálního prokrvení indukovaného VIP ve srovnání s časově sladěnou kontrolou. Při submaximálních dávkách VIP (například 6,0 μύ/kg) došlo k významné potenciaci píku zvýšení (95±6%) a také prodloužení doby zvýšení (asi 140 % - ze 7 minut na více než 17 minut, viz obr. 7). Inhibitory NEP významně prodlužují dobu přetrvání zvýšení vaginálního prokrvení indukovaného VIP, pokud jsou podávány v kombinaci s dávkou VIP, která vyvolává maximální zvýšení prokrvení (asi 80% prodloužení doby - 11 až 20 minut).
Inhibitory NEP v klinicky relevantních dávkách významně zvyšovaly relaxaci indukovanou VIP a nervově zprostředkovanou relaxaci v izolované tkáni. Hodnota EC5Q VIP je za přítomnosti selektivního inhibitoru NEP (ΙμΜ) významně snížena - z 18,8±0,6nM na 2,9±0,3nM. Účinek inhibitoru NEP je závislý na koncentraci.
NEP EC 3.4.24.11 mRNA informace a protein je exprimován a byl identifikován v lidské a králičí vagíně Northern a Western analýzou.
168
4.6.2. Inhibitory fosfodiesterasy (PDE) cAMP je degradován fosfodiesterasami hydrolyzujícími cAMP, tj. PDEcAMp. Inhibitory PDEcAMp tedy budou potencovat endogenní vasorelaxační účinek cAMP uvolněné během vzrušení. To by se klinicky mělo projevit jako zvýšení vaginálního překrvení.
V literatuře nejsou žádné informace o lokalizaci pdecAMP nek° ° funkční úloze těchto isozymů ve vaginální tkáni nebo při sexuálním vzrušení. Analýzou PDE lidské a králičí vagíny, jsme prokázali, že v nich jsou přítomny isozymy PDEcAMp 1, 2, 3, 4, 7a8. Inhibitory těchto PDEcAMp představují potenciální činidla zvyšující vaginální prokrvení a/nebo relaxující hladký sval vagíny.
Selektivní inhibitor PDEcAMp typu 2 v klinicky relevantních dávkách významně posiloval zvýšení vaginálního prokrvení při stimulaci pelvického nervu (viz obr. 9). Inhibitor PDEcAMp (500 iig/kg) zvedal pík zvýšení vaginálního prokrvení o 86,8±21,9 % ve srovnání se zvýšeními pozorovanými během časově sladěné kontroly (při 4 Hz).
Selektivní inhibitor PDEcAMp typu 2 významně prodlužoval přetrvání zvýšení indukovaných VIP (60 μg/kg) na píku vaginálního prokrvení o více než 100 % (měřeno při 50% amplitudě, viz obr. 9). Selektivní inhibitor PDEcAMp typu 2 významně zvedal pík zvýšení prokrvení indukovaného stimulací VIP (asi 15±3 %, 200 μg/kg).
Významně prodlužoval přetrvání zvýšení indukovaného VIP na píku vaginálního prokrvení o více než 100 % (měřeno při 50% amplitudě, viz obr. 8). Selektivní inhibitor PDEcAMp typu 2 významně zvedal pík zvýšení prokrvení indukovaného stimulací pelvického nervu (asi 15±3 %, 200 μg/kg, při 4 Hz).
• ·
- 169
Inhibitory PDEcAMp zvyšují relaxaci prekontrahovaného izolovaného hladkého svalu vagíny indukovanou VIP (ΙμΜ fenylefrin, viz tabulka 1). Všechny selektivní inhibitory PDEcAMP tV'Pu 2' 3 a 4 významě potencují relaxaci zprostředkovanou VIP. (210 % při 76nM, 130 % při 8nM, 220 % při 3,4μΜ a 160 % při 686nM potenciace VIP EC5Q). Tyto inhibitory se podávají v dávkách, o nichž je známo, že jsou selektivní vůči konkrétní pdecamP' která je předmětem zájmu. Selektivní inhibitor edecamp typu 5 nebo kontrolní vehikulum neměly žádný zřetelný účinek na relaxaci zprostředkovanou VIP.
4.6.3. Antagonisté receptoru NPY Yl
NPY vykazuje inhibiční vliv na vasorelaxaci zprostředkovanou VIP, a antagonisté receptoru NPY Yl budou podporovat vasorelaxační účinek endogenního VIP uvolňovaného během vzrušení. To se klinicky projeví jako zvýšení vaginálního překrvení.
Literatura neobsahuje žádné informace o lokalizaci receptorů NPY nebo jejich funkční úloze ve tkáni vagíny nebo při sexuálním vzrušení.
Northern a Western analýzou při expresních studiích receptoru NPY bylo zjištěno, že v lidské a králičí vagíně jsou přítomny receptory NPY podtypů Υχ Y2 a Y5.
Selektivní inhibitory NPY Yl v klinicky relevantních dávkách posilují zvýšení vaginálního prokrvení při stimulaci pelvického nervu (viz obr. 10). Antagonisté NPY Yl zvedají pík zvýšení vaginálního prokrvení až o 92 % ve srovnání s časově sladěnou kontrolou. Toto zvýšení submaximální stimulační frekvence (například 4 Hz) bylo závislé na dávce; například dávka 0,01 mg/kg iv. indukovala
170
15,8119,6% zvýšení, 0,03 mg/kg iv. indukovala 35,1±17,17% zvýšení, 0,10 mg/kg iv. indukovala 60,1116,9% zvýšení a 0,3 mg/kg iv. indukovala 91,9±27,4% zvýšení (střední hodnota 1 SEM, n = 3). Antagonisty NPY Yl nevykázaly žádný účinek na bazální (nestimulované) vaginální prokrvení. To posiluje náš názor, že budou zvyšovat vzrušení potenciaci cAMP signalizace, a nikoliv indukovat vzrušení při absenci sexuální touhy, tj. přímým zvýšením cAMP signalizace.
4.7 Účinky činidel, která zvyšují cAMP nebo zvyšují vaginální prokrvení,, na střední arteriální tlak krve u anestetizovaného králíka
Při hledání perorální terapie FSAD je třeba mít na mysli, aby taková terapie nebyla spojena s nežádoucími kardiovaskulárními účinky, například účinky na krevní tlak nebo srdeční frekvenci. Při našich zkouškách jsme zjistili, že infuze VIP významně snižuje střední arteriální tlak krve (viz obr. 3) a významně zvyšuje srdeční frekvenci. Ve vysoce přednostním provedení tedy činidlem není VIP. Stimulace pelvického nervu a inhibitory pDEcAMp a NEP však nevykázaly žádné účinky na krevní tlak. Vasoaktivní intestinální peptid v dávce 6,0 μg/kg (iv.) vyvolává významné snížení středního arteriálního tlaku o 1760193 Pa (13,2±0,7 mm rtuťového sloupce) a významné snížení srdeční frekvence o 16±4 tepy za minutu. VIP (iv.) při vysokých dávkách, jako 60,0 μ9/Ι<Χί vyvolává významné snížení středního arteriálního tlaku o 19601183 Pa, což je spojeno s významným zvýšením srdeční frekvence o 111130 tepů za minutu, které následně vede ke zvýšení středního arteriálního tlaku o 11331187 Pa.
Zkoušené sloučeniny
Řada sloučenin uvedených výše byla zkoušena podle vynálezu, a ukázalo se, že jsou účinné podle tohoto vynále• · • ·· · · ··
zu, tj. že mohou působit jako PcAMP za účelem léčení FSD, zejména FSAD.
Jako tyto sloučeniny je možno uvést:
Sloučeninu vzorce la (Fla) - viz 5-[4-(diethylamino)benzyl]-l-methyl-3-propyl-6,7-dihydro-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-on. Sloučeninu Fla je možno připravit podle EP-A-0 911 333 (podle příkladu 50).
Sloučeninu vzorce II (FII) - viz 9-(l-acetyl-4-fenylbutyl)-2-[ (3,4-dimethoxyfenyl)methyl]-1,9-dihydro-6H-purin-6-on. Sloučeninu FII je možno připravit podle EP-A-0 771 799 (podle příkladu 100).
Sloučeninu vzorce III (Fill) - viz milrinon. Sloučenina Fill je produktem dostupným na trhu.
Sloučeninu vzorce IV (FIV) - viz rolipram. Sloučenina FIV je produktem dostupným na trhu.
Sloučeninu vzorce V (FV) - viz 1-ethylester 3-[[[l-(2-karboxy-4-pentenyl)cyklopentyl]karbony1]amino]cyklohexankarboxylové kyseliny. Sloučeninu FV je možno připravit podle EP-A-0 274 234 (příkladu 300).
Sloučeninu vzorce VI (FVI) - viz 3-[[[1-(2-karboxy-4-pentenyl)cyklopentenyl]karbonyl]amino]cyklohexankarboxylová kyselina. Sloučeninu vzorce FVI je možno připravit podle EP-A-0 274 234 (příkladu 379).
Konkrétně jsou sloučeniny Fla, FII, Fill a FIV inhibitory PDEcAMp. Sloučenina Fla je I:PDEI, FII je I:PDEII, Fill je I:PDEIII a FIV je I:PDEIV.
• ·
172
Údaje o těchto sloučeninách jsou uvedeny výše například v tabulce I.
Je zřejmé, že tyto inhibitory PDEcAMp zvyšují relaxaci izolované tkáně indukovanou VIP.
Sloučenina FII, která je selektivním I:PDEII, v klinicky relevantních dávkách posiluje zvýšení vaginálního prokrvení indukované VIP.
Sloučenina FII v klinicky relevantních dávkách také posiluje zvýšení vaginálního prokrvení indukované stimulací pelvického nervu.
Sloučeniny FV a FVI jsou selektivními inhibitory NEP EC 3.4.24.11.
Informace uvedené výše se týkají sloučeniny FVI. Podobných výsledků se však dosáhlo i pro sloučeninu FV.
Jak je zřejmé, sloučeniny FV a FVI v klinicky relevantních dávkách posilují zvýšení vaginálního prokrvení indukované VIP.
Sloučeniny FV a FVI v klinicky relevantních dávkách posilují zvýšení vaginálního prokrvení indukované stimulací pelvického nervu.
Sloučeniny FV a VI v klinicky relevantních dávkách také posilují relaxaci izolované tkáně, která je indukovaná VIP a nervově zprostředkovaná.
Jako další zkoušené sloučeniny, které se ukázaly jako účinné, je možno uvést:
- 173
2—[(1-{[(l-benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]-4-methoxybutanovou kyselinu (F57);
2-{[l-({[3-(2-oxo-l-pyrrolidinyl)propyl]amino}karbonylcyklopentyl]methyl)-4-fenylbutanovou kyselinu (F58);
(+)—2—{[l-({[2-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopentyl]methyl)-4-fenylbutanovou kyselinu (F59);
2—[(1—{[(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]-4-fenylbutanovou kyselinu (F60);
cis-3-(2-methoxyethoxy)-2-[(l-{[(4-{[(fenylsulfonyl)amino]karbonyl}cyklohexy1)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]propanovou kyselinu (F61);
(+)-2-([1-({[2-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopentyl]methyl}pentanovou kyselinu (F62);
(+)-2-[(l-{[5-ethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]pentanovou kyselinu (F63);
2-((l-[(3-benzylanilino)karbonyl]cyklopentyl}methyl)pentanovou kyselinu (F64);
2-[(l-{[(l-benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]pentanovou kyselinu (F65); a
2-{[1—({[(lR,3S,4R)-4-(aminokarbonyl)-3-butylcyklohexyl]amino)karbonyl)cyklopentyl]methyl)pentanovou kyselinu (F66).
Všechny sloučeniny F57 až F66 jsou I:NEP.
174
Syntéza sloučenin F57 až F66
V preparativních postupech je popsána syntéza meziproduktů, zatímco v příkladech je popsána syntéza jednotlivých sloučenin podle vynálezu.
Příklad 1
2-[(l-{[(l-Benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]-4-methylbutanová kyselina (F57)
Směs benzylesteru z preparativního postupu 1 (1/62) (850 mg, 1,64 mmol) a 5% palladia na uhlíku (250 mg) ve 40% vodném ethanolu (21 ml) se 30 minut hydrogenuje při teplotě místnosti a tlaku 206,1 kPa. Reakční směs se přefiltruje přes Hyflo(R) a filtrát se odpaří za sníženého tlaku. Pěnovitý zbytek se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 97 : 3 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (550 mg, 79 %). 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 1,24 - 2,17 (m, 12H), 2,18 - 2,31 (m, 1H), 3,07 (s, 3H), 3,21 (t, 2H), 5,08 (s, 2H), 6,63 (d, 1H), 7,23 7,41 (m, 5H), 7,72 (d, 1H), 8,24 (s, 1H). Analýza pro C24H30N2°5: nalezeno: C 67,46, H 7,18, N 6,24, vypočteno: C 67,58, H 7,09, N 6,57 %.
Příklad 2
2-{[1-({[3-(2-0xo-l-pyrrolidinyl)propyllamino}karbonylcyklopentyl]methyl)-4-fenylbutanová kyselina (F58) ··
o o
Směs benzylesteru z preparativního postupu 3 (3/67) (780 mg, 1,55 mmol) a 10% palladia na uhlíku (100 mg) ve směsi ethanolu a vody v objemovém poměru 90 : 10 se 1,5 hodiny hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku vodíku 412,2 kPa. Katalyzátor se odfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (473 mg, 74 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 1,26 - 1,77 (m, lOh), 1,78 - 2,46 (m, 11H), 2,49 - 2,70 (m, 2H), 2,95 - 3,36 (m, 4H), 6,92 - 7,38 (m, 5H). Analýza pro C24H34N2°4'0'75H2O: nalezeno: C 64,05, H 7,73, N 6,22, vypočteno: C 65,88, H 7,83, N 6,40 %.
Příklad 3 (+)-2-([l-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopentyl]methyl}-4-fenylbutanová kyselina
2-{[1—({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopentyl]methyl}-4-fenylbutanovou kyselinu (W091/10644) je možno přečistit standardní vysokotlakou
176
Φ φ kapalinovou chromatografií na sloupci AD za použití směsi hexanu, isopropylalkoholu a trifluoroctové kyseliny v poměru 70 : 30 : 0,2 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (99,5% enantiomerní nadbytek). [a]D = +9,1° (c = 1,76 v ethanolu).
Příklad 4
2-[(1-{[(5-Methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]-4-fenylbutanová kyselina (F60)
Směs benzylesteru z preparativního postupu 4 (4/70) (187 mg, 0,39 mmol) a 10% palladia na uhlíku (80 mg) v ethanolu (20 ml) se 18 hodin hydrogenuje za tlaku 412,2 kPa. Chromatografie na tenké vrstvě ukáže, že v reakční směsi se ještě nachází výchozí látka, takže se k ní přidá další dávka 10% palladia na uhlíku (100 mg) a v reakci se pokračuje dalších 5 hodin. Chromatografie na tenké vrstvě ukáže, že v reakční směs stále obsahuje výchozí látku, takže se k ní přidá další katalyzátor (100 mg) a v hydrogenaci se pokračuje 18 hodin. Reakční směs se přefiltruje přes
Arbocel(R) a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se azeotropicky odpaří s dichlormethanem. Surový produkt se přečistí chromatografií na sloupci silikagelu Biotage(R) za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 95 : 5 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě čirého oleje (80 mg, 53 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 1,51 - 1,89 (m, 9H), 2,03 (m, 1H),
177 *··« ·
2,20 (m, 1H), 2,40 (m, 2H), 2,60 (m, 5H), 7,15 - 7,30 (m, 5H). LRMS: m/z 387,8 (MH+)
Příklad 5 cis-3-(2-Methoxyethoxy)-2-[(1-{[(4-{[(fenylsulfonyl)amino]karbonyl}cyklohexy1)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]-
Roztok terc-butylesteru z preparativního postupu 8 (8/66) (446 mg, 0,75 mmol) v dichlormethanu (5 ml) a trifluoroctové kyselině (5 ml) se 18 hodin míchá při teplotě místnosti a poté zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se azeotropicky odpaří s dichromethanem, poté s toluenem a nakonec s etherem. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě pěny (385 mg, 95 %). 1H NMR (CDClg, 400 MHz): δ 1,48 2,17 (m, 18H), 2,40 (s, 1H), 2,66 (s, 1H), 3,37 (ε, 3H),
3,50 - 3,70 (m, 6H), 3,94 (s, 1H), 6,10 (d, 1H), 6,59 (s, 1H), 7,55 (t, 2H), 7,61 (m, 1H), 8,02 (d, 2H), 9,11 (s, 1H) . Analýza pro C26H38N2°8S,1,7H2O: nalezeno: C 54,88, H 6,90, N 5,04, nalezeno: C 57,97, H 7,11, N 5,20 %.
Příklad 6 (+)-2-([l-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino)karbonyl)cyklopentyl]methyl}pentanová kyselina (F62)
178
2-{[1-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopentyl]methyl}pentanová kyselina (WO 91/10644) se dále přečistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií na sloupci AD za použití směsi hexanu, isopropylalkoholu a trifluoroctové kyseliny v poměru 90 : 10 : 0,1 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (99% enantiomerní nadbytek). [a]D = +10,4° (c = 0,067, ethanol).
Příklad 7 (+)-2-[(1—{[5-Ethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]pentanová kyselina (F63)
Kyselina z preparativního postupu 18 (18/ex4) (824 mg) se dále přečistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií na sloupci AD za použití směsi hexanu, isopropylalkoholu a trifluoroctové kyseliny v poměru 85 : 15 : 0,2 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (386 mg, 99% enantiomerní nadbytek). 1H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 0,90 (t, 3H), 1,38 (m, 6H), 1,50 - 1,79 (m, 9H),
2,19 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,60 (m, 1H), 2,98 * · · · · · · · ·04· 000 9· 0*0 00 0000 (q, 2H), 12,10 - 12,27 (bs, 1H). LRMS: m/z 338 (MH-).
[α]β = +3,8° (c = 0,1, ethanol).
Příklad 8
179
2-({1-[(3-Benzylanilino)karbonyl]cyklopentyl}methyl)pentanová kyselina (F64)
Směs benzylesteru z preparativního postupu 10 (10/53) (1,3 mg, 2,47 mmol) a 5% palladia na uhlíku (130 mg) ve vodě (10 ml) a ethanolu (40 ml) se 2 hodiny hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku 206,1 kPa. Reakční směs se přefiltruje přes Arbocel^R\ filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se trituruje s dichlormethanem. Pryskyřičný zbytek se trituruje s etherem a poté hexanem a vysuší při 50°C. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě pevné látky (0,79 g, 81 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,95 (t, 3H), 1,24 - 1,51 (m, 3H), 1,58 - 1,80 (m, 7H), 1,88 (dcd, 1H), 2,15 (m, 2H), 2,24 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,00 (s, 2H), 6,98 (d, 1H), 7,24 (m, 6H), 7,40 (m, 3H). Analýza pro C2gH34NO3.0,25H2O: nalezeno: C 75,48, H 7,76,
N 3,59, vypočteno: C 75,44, H 7,98, N 3,51 %.
Příklad 9
2-[(l-{[(l-Benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methylJpentanová kyselina (F65)
h3c
Z benzylesteru z preparativního postupu 13 (13/56) se podobným způsobem, jaký je popsán v preparativním postupu 19 (19/ex21), při němž se však přečištění provádí chromatografií na sloupci silikagelu za použití ethylacetátu jako elučního činidla, získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (výtěžek 51 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,96 (t, 3H), 1,28 - 1,80 (m, 12H), 2,01 (m, 1H), 2,30 2,52 (m, 2H), 5,02 (dd, 2H), 6,60 (d, 1H), 7,27 (m, 5H),
7,70 (s, 1H), 8,34 (s, 1H). Analýza pro C24H30N2°4'0'25H2°: nalezeno: C 69,52, H 7,41, N 6,51, vypočteno: C 69,45, H 7,41, N 6,75.
Příklad 10
2-{[1-({[(IR,3S,4R)-4-(aminokarbonyl)-3-butylcyklohexyl]amino}karbonyl)cyklopentyllmethyl}pentanová kyselina (F66)
Sloučeniny obecného vzorce Ic, tj. sloučeniny q obecného vzorce I, kde Rx představuje propylskupinu
(Ic) se připraví z odpovídajícího terc-butylesteru za použití podobného způsobu, jaký je popsán v preparativním postupu 14 (14/exl).
181
Preparativní postup 1 (1/62)
Benzyl-2-[(1-{[(l-Benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)methyl]-4-methoxybutanoát
Oxalylchlorid (0,26 ml, 3,0 mmol) se přidá k ledem chlazenému roztoku l-{2-[(benzyloxy)karbonyl]-4-methoxybutyl}cyklopentankarboxylové kyseliny (EP 274 234) (1,0 g, 3,0 mmol) a Ν,Ν-dimethylformamidu (2 kapky) v dichlormethanu (20 ml). Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti. Vzniklý roztok se zkoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se azeotropicky odpaří s dichlormethanem (3 x 10 ml).
Zbytek se rozpustí v dichlormethanu (20 ml), dichlormethanový roztok se ochladí v ledové lázni a přidá se k němu amin z preparativního postupu 2 (2/28) (600 mg, 3 mmol) a N-methylmorfolin (0,6 ml, 5,45 mmol). Reakční směs se 18 hodin míchá při teplotě místnosti a poté zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se rozdělí mezi vodu a ether. Organická vrstva se promyje kyselinou chlorovodíikovou (2M), roztokem hydrogenuhličitanu sodného a poté vodou, vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Zelený pevný zbytek se přečistí středotlakou chromatografií na sloupci silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 90 : 10 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (880 mg, 57 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 1,37 2,28 (m, 12H), 2,46 - 2,64 (m, 1H), 3,20 (s, 3H), 3,31 (m, 2H), 4,97 (dd, 2H), 5,08 (dd, 2H), 6,57 (d, 1H), 7,12 (m, 1H), 7,18 - 7,48 (m, 10H), 8,08 (d, 1H)
182
Preparativní postup 2 (2/28)
5-Amino-l-benzyl-2(lH)-pyridinon
Směs l-benzyl-5-nitro-lH-pyridin-2-onu (Justus Liebigs Ann. Chem. 484, 1930, 52) (1,0 g, 4,35 mmol) a granulovaný cín (3,5 g, 29,5 mmol) v koncentrované kyselině chlorovodíkové (14 ml) se 1,5 hodiny zahřívá na 90 °C. Výsledný roztok se zředí vodou a vodná směs se neutralizuje za použití roztoku uhličitanu sodného a extrahuje ethylacetátem (250 ml celkem). Spojené organické extrakty se přefiltrují, vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě světle zelené pevné látky (která časem zmodrá) (440 mg, 51 %). PH NMR (CDd3, 250 MHz): δ 4,12 - 4,47 (bs, 2Η) , 5,00 (s, 2Η) , 6,31 (d, 1H), 6,86 (s, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,14 - 7,42 (m,
5H)
Preparativní postup 3 (3/67)
Benzyl-2-{[l-({[3-(2-oxo-l-pyrrolidinyl)propyl]amino)karbonylcyklopentyl]methyl}-4-fenylbutanoát
Hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (1,06 g, 5,53 mmol), hydrát 1-hydroxybenzotriazolu
183 (0,60 g, 4,44 mmol) a 4-methylmorfolin (0,56 g, 5,53 mmol) se při teplotě místnosti postupně přidají k chlazenému roztoku 1—{2—[(benzyloxy)karbonyl]-4-fenylbutyl}cyklopentankarboxylové kyseliny (EP 274 234) (1,5 g, 3,94 mmol) v suchém dichlormethanu (15 ml). Ke vzniklé směsi se přidá N-(3-aminopropyl)-2-pyrrolidinon (0,56 g, 3,94 mmol). Reakční směs se 18 hodin míchá při teplotě místnosti, poté promyje vodou, 2M kyselinou chlorovodíkovou a nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Žlutý olejovitý zbytek se přečistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití směsi ethylacetátu a pentanu v poměru 50 : 50 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě čiré pryskyřice (800 mg, 40 %). 1H NMR (CDClg, 300 MHz): δ 1,37 -2,20 (m, 16H), 2,34 - 2,58 (m, 5H), 2,92 - 3,46 (m, 6H), 5,07 (d, 1H), 5,18 (d, 1H), 6,98 - 7,47 (m, 10H).
Preparativní postup 4 (4/70)
Benzyl-2-[(!—{[(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]karbonyllcyklopentyl)methyl]-4-fenylbutanoát
Z 1-{2-[(benzyloxy)karbonyl]-4-fenylbutyl}cyklopentankarboxylové kyseliny (EP 274 234) a 2-amino-5-methyl-1,3,4-thiadiazolu se podobným způsobem, jaký je popsán v preparativním postupu 5 (5/68), získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě čirého oleje (výtěžek 74 %). 1H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,58 - 1,76 (m, 7H), 1,83 - 1,98 (m,
3H), 2,03 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,44 (m, 3H),
184
2,65 (s, 3H), 5,02 (dd, 2H), 7,00 (d, 2H), 7,15 (m, 1H), 7,19 (m, 2H), 7,35 (m, 5H). LRMS: m/z 478,7 (MH+).
Preparativní postup 5 (5/68)
Benzyl-2-{[l-({[3-(methylamino)-3-oxopropyl]amino}karbonyl)cyklopentyl]methyl}-4-fenylbutanoát
Hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (122 mg, 0,64 mmol), hydrát 1-hydroxybenzotriazolu (86 mg, 0,64 mmol) a 4-methylmorfolin (173 μΐ, 1,59 mmol) se při teplotě místnosti postupně přidají k chlazenému roztoku 1—{2—[(benzyloxy)karbonyl]-4-fenylbutyl}cyklopentankarboxylové kyseliny (EP 274 234) (202 mg, 0,53 mmol) v N,N-dimethylformamidu (5 ml). Ke vzniklé směsi se přidá aminhydrochlorid z preparativního postupu 6 (6/23) (146 mg, 1,06 mmol). Reakční směs se 18 hodin míchá při 90°C. Vzniklý roztok se ochladí a zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se rozdělí mezi vodu (20 ml) a ethylacetát (100 ml). Vrstvy se oddělí a organická fáze se promyje vodou (3 x 30 ml) a vodným roztokem chloridu sodného (25 ml), vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Získá se čirý olej. Tento surový produkt se přečistí chromatografii na sloupci silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 98 : 2 jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bezbarvého oleje (162 mg, 67 %). 1H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,38 - 1,53 (m, 2H) , 1,53 - 1,96 (m, 8H), 2,02 (m, 2H), 2,27 (t, 2H), 2,46 (m, ŠH), 2,76 (d, 3H), 3,44 (m, 2H), 5,13 (s, 2H), 5,79 (bs,
185
1H), 6,38 (m, 1H), 7,06 (d, 2H), 7,18 (m, 1H), 7,22 (m, 2H), 7,38 (m, 5H). LRMS: m/z 465,5 (MH+).
Preparativní postup 6 (6/23)
Hydrochlorid 3-amino-N-methylpropanamidu
O
Směs benzylkarbamátu z preparativního postupu 7 (7/13) (7,92 g, 33,5 mmol) a 5% palladia na uhlíku (800 mg) v ethanolu (300 ml) se 4 hodiny hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku 343,5 kPa. Reakční směs se přefiltruje přes Arbocel(R) za promývání ethanolem. Ke spojeným filtrátům se přidá ÍM kyselina chlorovodíková (36,9 ml, 36,9 mmol). Výsledný roztok se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se azeotropicky odpaří s dichlormethanem. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bezbarvé pěny (4,66 g). -^H NMR (DMSO-dg, 300 MHz): δ 2,46 (t, 2H), 2,60 (s, 3H), 2,95 (m, 2H), 7,98 - 8,16 (m, 2H).
Preparativní postup 7 (7/13)
Benzyl-3-(methylamino)-3-oxopropylkarbamát
Směs N-[(benzyloxy)karbonyl]-β-alaninu (10 g, 44,8 mmol), hydrochloridu methylaminu (3,33 g, 49,28 mmol), hydrátu 1-hydroxybenzotriazolu (6,05 g, 44,8 mmol), hydrochloridu 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu
186 • · · · · «·· ···· ··· ·· ··· ·« ···· (10,3 g, 53,76 mmol) a N-methylmorfolinu (11,33 ml, 103 mmol) v dichlormethanu (200 ml) se 18 hodin míchá při teplotě místnosti. Vyloučená sraženina se odfiltruje, čímž se získá požadovaný produkt ve formě bezbarvé pěny. Filtrát se odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití elučního gradientu ethylacetát : hexan 90 : 10 až 100 : 0. Získá se další produkt (7,96 g, celkový výtěžek 75 %). ’ή NMR (CDClg, 300 MHz): δ 2,42 (t, 2H), 2,80 (s, 3H), 3,50 (m, 2H), 5,21 (s, 2H), 5,49 (bs, 1H), 5,63 (bs, 1H),7,36 (m, 5H). Analýza pro c12h16n2°3: nalezeno: C 60,68, H 7,00, N 11,95, vypočteno: 61,00, H 6,83 , N 11,86 %.
Preparativní postup 8 (8/66) cis-terc-Butyl-3-(2-methoxyethoxy)-2-[(l-{[(fenylsulfonyl)amino]karbonyl}cyklohexyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)-
N,N'-Dicyklohexylkarbodiimid (199 mg, 0,97 mmol), 4-dimethylaminopyridin (118 mg, 0,97 mmol) a benzensulfonamid (152 mg, 0,97 mmol) se přidají k ledem chlazenému roztoku kyseliny z preparativního postupu 9 (9/63) (400 mg, 0,878 mmol) v dichlormethanu (12 ml) a N,N-dimethylformamidu (0,5 ml). Reakční směs se 20 hodin míchá při teplotě místnosti a poté zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se suspenduje v chladném ethylacetátu. Výsledná nerozpustná látka se odfiltruje a filtrát se promyje kyselinou chloro«» ·· • · · · • · *
187 vodíkovou (ÍM) a vodou, vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Surový produkt se přečistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití elučního gradientu dichlormethan : methanol 95 : 5 až 90 : 10. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (480 mg, 92 %). 1H NMR (CDC13, 400 MHz): S 1,44 (s, 9H), 1,63 (m, 13H), 1,80 (m, 2H), 1,88 (m, 1H), 1,98 (m, 2H), 2,36 (m, 1H), 2,57 (m,
1H), 3,38 (S, 3H), 3,40 (m, 1H), 3,51 (t, 2H), 3,58 (m, 3H),
3,95 (m, 1H), 5,92 (d, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 8,05 (d, 2H), 8,75 (bs, 1H). LRMS: m/z 618 (MNa+)
Preparativní postup 9 (9/63)
4-{[(1-{3-terc-Butoxy-2-[(2-methoxyethoxy)methyl]-3-oxopropy1}cyklopentyl)karbonyl]amino}cyklohexankarboxylová
Směs benzyl-4-{[(l-{3-terc-butoxy-2-[(2-methoxyethoxy )methyl]-3-oxopropyl}cyklopentyl)karbonyl]amino}cyklohexankarboxylátu (EP 274 234) a 10% palladia na uhlíku (250 mg) ve vodě (10 ml) a ethanolu (50 ml) se 18 hodin hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku 343,5 kPa. Reakční směs se přefiltruje přes Solkafloc^) a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se azeotropicky odpaří s toluenem (3x) a poté s dichlormethanem (3x), čímž se získá titulní sloučenina (2,0 g, 96 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 1,48 (s, 9H), 1,53 - 1,84 (m, 14H), 1,94 - 2,10 (m, 5H), 2,60 (m, 2H), 3,40 (s, 3H), 3,41 - 3,63 (m, 5H), 3,96 (m, 1H), 5,90 (bd, 1H)
188
Preparativní postup 10 (10/53)
Sloučenina vzorce
CH3 kde
Prep. postup R Výtěžek (%) Data
10 (10/53)* 90 *H NMR (CDClj, 300MHz) δ: 0,84 (t, 3H), 1,24 (m, 2H), 1,40-1,76 (m, 7H), 1,84 (dd, 1H), 1,98 (m, 1H), 2,19 (dd, 1H), 2,28 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 3,98 (s, 2H), 4,99 (dd, 2H), 6,98 (d, 1H), 7,19-7,42 (m, 15H).
Jako elučního činidla se použije dichlormethanu.
se připraví z chloridu kyseliny z preparativního postupu 11 (11/3) a odpovídajícího aminu podobným postupem, jaký je popsán v preparativním příkladu 12 (12/52).
Preparativní postup 11 (11/3)
Benzyl-2-{[1-(chlorkarbonyl)cyklopentyl]methyljpentanoát
Oxalylchlorid (1,15 ml, 13,2 mmol) se přidá k ledem chlazenému roztoku 1—(2—[(benzyloxy)karbonyl]pentyl}cyklopropankarboxylové kyseliny (EP 274 234) (2,0 g, 6,3 mmol) v suchém dichlormethanu (20 ml). Výsledný roztok se 2 hodiny
189 míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se zkoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se azeotropicky odpaří s dichlormethanem (3 x). Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě zlatého oleje (2,1 g). ΣΗ NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,88 (t, 3H), 1,28 (m, 2H), 1,43 (m, 2H), 1,63 (m, 6H),
2,00 (m, 1H), 2,08 - 2,35 (m, 3H), 2,44 (m, 1H), 5,15 (s, 2H), 7,28 (m, 5H)
Preparativní postup 12 (12/52)
Benzyl-2-({1-[(3-pyridylamino)karbonyl]cyklopentyl}methyl)-
Triethylamin (0,11 ml, 0,78 mmol) se přidá ke směsi chloridu kyseliny z preparativního postupu 11 (11/3) (200 mg, 0,60 mmol) a 2-aminopyridinu (61 mg, 0,65 mmol) v dichlormethanu (3 ml). Reakční směs se 16 hodin míchá při teplotě místnosti a poté odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se rozdělí mezi roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ml) a ethylacetát (20 ml) a vrstvy se oddělí. Organická fáze se vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Pryskyřičný surový produkt se přečistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití ethylacetátu jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (130 mg). ΣΗ NMR (CDC13, 400 MHz): δ 0,82 (t, 3H), 1,21 (m, 3H), 1,40 (m, 1H), 1,43 - 1,72 (m, 6H), 1,81 (d, 1H), 1,98 (m, 1H), 2,18 (m, 1H), 2,24 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 4,98 (m, 2H), 7,20 7,38 (m, 6H), 7,42 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 8,35 (d, 1H), 8,56 (s, 1H)
190
Preparativní postup 13 (13/56)
Prep. postup R Výtěžek (%) Data
13 0 II 53 *H NMR (CDClj, 300MHz) δ: 0,84 (t, 3H), 1,25 (m,
(13/56)2 (V ^-NH υ 2H), 1,27-1,99 (m. 10H), 2,07-2,30 (m, 2H), 2,47 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 5,10 (dd, 2H), 6,59 (d. 1H), 7,15 (d, 1H), 7,34 (m, 11H), 8,10 (s, 1H).
2Jako báze se použije N-methylmorfolinu.
se připraví z chloridu kyseliny z preparativního postupu 11 (11/3) a odpovídajícího aminu podobným postupem, jaký je popsán v preparativním příkladu 12 (12/52).
Preparativní postup 14 (14/ex 1)
2-({1-[(1,3-Benzodioxol-5-ylamino)karbonyl]cyklopentyl}methyl)pentanová kyselina
O
191
9 to ·· < «· · · ♦·*· 9 9 9 9 to ♦ · · • 9 9 9 9 9 9 · to · · 9 · · · «
9999 999 to· «toto toto totototo
Trifluoroctová kyselina (5 ml) se přidá k roztoku terc-butylesteru z preparativního postupu 15 (15/34) (130 mg, 0,31 mmol) v dichlormethanu (5 ml). Výsledný roztok se 4 hodiny míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se zkoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se azeotropicky odpaří a toluenem a dichlormethanem. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě čirého oleje (112 mg). 1H NMR (CDC13, 400 MHZ): δ 0,83 (t, 3H), 1,22 - 1,40 (m, 3H), 1,50 - 1,72 (m, 8H), 1,95 (m, 1H), 2,10 (m, 2H), 2,19 (m, 1H), 4,30 (m, 2H), 5,93 (s, 2H), 5,99 (bs, 1H), 6,74 (m, 3H). LRMS: m/z 380 (MH“).
Preparativní postup 15 (15/34)
Sloučenina vzorce
Prep. postup R Výchozí amin Výtěžek (%) Data
15 (15/3 4) Piperonylamin 88 *H NMR (CDC13,400MHz) δ: 0,85 (t, 3H), 1,26 (m, 4H), 1,42 (s, 9H), 1,46 (m, 2H), 1,59-1,75 (m, 5H), 1,95 (m, 2H), 2,06 (m, 1H), 2,22 (m, 1H), 4,26 (dd, 1H), 4,39 (dd, 1H), 5,95 (m, 3H), 6,78 (m, 3H). LRMS : m/z 418,3 (MH+)
se připraví z kyseliny z preparativního postupu 16 (16/1) (11/3) a odpovídající aminové sloučeniny podobným postupem, jaký je popsán v preparativním příkladu 17 (17/33).
• 9 9 9 9
- 192 • 9 9 · 4 9
9 9 9 9 »99 9 9 9 9 9
Preparativní postup 16 (16/1)
1-[2-(terc-Butoxykarbonyl)-4-pentyl]cyklopentankarboxylová kyselina
Směs 1-[2-(terc-butoxykarbonyl)-4-pentenyl]cyklopentankarboxylové kyseliny (EP 274 234) (23 g, 81,5 mmol) a 10% palladia na uhlíku (2 g) v suchém ethanolu (200 ml) se 18 hodin hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku 206,1 kPa. Reakční směs se přefiltruje přes Arbocel^R^ a filtrát se odpaří za sníženého tlaku. Žlutý olejovitý zbytek se přečistí chromatografií na sloupci silikagelu za použití směsi ethylacetátu a pentanu v poměru 40 : 60 jako elučního činidla, získá se požadovaný produkt ve formě čirého oleje (21 g, 91 %). ΤΗ NMR (CDC13): δ 0,86 (t, 3H) , 1,22 - 1,58 (m, 15 H), 1,64 (m, 4H), 1,78 (dd, 1H), 2,00 - 2,18 (m, 3H), 2,24 (m, 1H). LRMS: m/z 283 (M-H)-
Preparativní postup 17 (17/33) terc-Butyl-2-{[l-({[1-(hydroxymethyl)cyklopentyllamino}karbony1)cyklopenty1]methyl}pentanoát
193
Hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (41 mg, 0,21 mmol), hydrát 1-hydroxybenzotriazolu (27 mg, 0,2 mmol), N-methylmorfolin (35 μΐ, 0,31 mmol) a na závěr 1-amino-l-cyklopentanmethanol (25 mg, 0,22 mmol) se přidá k roztoku kyselinu z preparativního postupu 16 (16/1) (150 mg, 0,53 mmol) v N,N-dimethylformamidu (3 ml). Reakční směs se 18 hodin míchá při 90°C. Výsledný roztok se ochladí a zředí ethylacetátem (90 ml). Ethylacetátová směs se promyje vodou (3 x 25 ml) a vodným roztokem chloridu sodného (25 ml), vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a pentanu v poměru (30 : 70) jako elučního činidla. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (38 mg, 57 %). 1H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 0,88 (t,
3H) , 1,29 (m, 3H) , 1,41 - 1 ,78 (m, 26H ), i, ,78 - 1,98 (m,
4H) , 2,04 (m, IH) , 2,26 (m, IH) , 3,59 (dd, IH) , 3,70 (dd,
IH) , 4,80 (t, IH) , 5,81 (s, IH) . LRMS: m/z 380 (MH).
P r e p a rat i v n i P o s t u P 1 8 (18/e x4 )
O (Ic) «* · ··
9 99 9 9 9
9* 9 9
9 9 • t
194
9 9 9 9
9999 999 99 999
Př. N R Výtěž. Data
18 (18/e x.4)3 0 Yn, N—N 86 'H NMR (CDClj, 400MHz) δ: 0,92 (t, 3H), 1,35 (t, 3H), 1,25-1,80 (m, 11H), 2,20-2,50 (m, 4H), 2,95 (q, 2H), 12,10 (bs, 1H). LRMS : m/z 339,8 (MHj; Anal. nalezeno: C, 56,46; H, 7,46; N, 12,36. CieH^NjOaS vypoč. : C, 56,62; H, 7,44; N, 12,37%.
prekrystalovani z etheru se připraví z odpovídajího terc-butylesteru podobným způsobem, jaký je popsán v preparativním postupu 14 (14/exl).
Preparativní postup 19 (19/ex21)
2-({1-[(3-Benzylanilino)karbonyl]cyklopentyl}methyl)pentanová kyselina
Směs benzylesteru z preparativního postupu 10 (10/53) (1,3 mg, 2,47 mmol) a 5% palladia na uhlíku (130 mg) ve vodě (10 ml) a ethanolu (40 ml) se 2 hodiny hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku 206,1 kPa. Reakční směs se přefiltruje přes Arbocel^R^ a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se trituruje s dichlormethanem.
ft ft
195
• · ♦ · • • ft · ft ftft • • • • ft • · • ·· ftft •
ft ft ♦ •
• • • • • • • •
··· · • a · ft· • ftft ♦ ft ·*·
Výsledná pryskyřice se trituruje s etherem a poté s hexanem a vysuší při 50 °C. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě pevné látky (0,79 g, 81 %). ^H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,95 (t, 3H), 1,24 - 1,51 (m, 3H), 1,58 - 1,80 (m, 7H), 1,88 (dd, 1H), 2,15 (m, 2H), 2,24 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,00 (s, 2H), 6,98 (d, 1H), 7,24 (m, 6H), 7,40 (m, 3H). Analýza pro c25H3iN°3.0,25H2°: nalezeno: C 75,48, H 7,76, N 3,59, vypočteno: C 75,44, H 7,98, N 3,51 %.
Stanovení ACE
Příprava a stanovení rozpustného enzymu konvertujícího angiotensin (ACE) z kůry ledvin vepře a člověka
Rozpustný NEP byl získán z kůry ledviv a jeho aktivita byla stanovena měřením rychlosti štěpení ACE substrátu, Abz-Gyl-p-nitro-Phe-Pro-OH, za vzniku jeho fluorescenčního produktu, Abz-Gly.
1. Látky
Veškerá voda byla dvojitě deionizována.
1.1. Lidské ledviny IAM (Pensylvania, USA) nebo
UK Human Tissue Bank (UK HTB)
1.2. ACE z ledvin vepře Sigma (A2580)
1.3. Homogenizační pufr 1 lOOmM mannitol a 20mM Tris o pH 7,1
2,42 g Tris (Fisher T/P630/60) se zředí 1 litrem vody a pH zředěné směsi se za použití 6M kyseliny chlorovodíkové při teplotě místnosti nastaví na 7,1. K této směsi se přidá 18,22 g mannitolu (Sigma M-9546).
196
1.4. Homogenizační pufr 2 lOOmM mannitol a 20mM Tris o pH 7,1 a lOmM hexahydrát chloridu horečnatého (Fisher M0600/53)
K 500 ml homogenizačního pufru 1 (1.4) se přidá chlorid hořečnatý (1,017 g).
1.4. Tris pufr (ACE pufr)
50mM Tris pH 7,4 a 300mM chlorid sodný o pH 7,4 ml 50mM Tris pH 7,4 (Sigma 2663) a 17,52 g chloridu sodného (Fisher S/3160/60) se doplní vodou do objemu 1000 ml.
1.6. Substrát (Abz-D-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH) (Bachem M-1100)
ACE substrát se skladuje ve formě prášku při -20°C. 2mM zásobní suspenze se připraví šetrným resuspendováním substrátu v ACE pufru, přičemž by se nemělo používat ani vířivého pohybu ani sonikace. 400μ1 alikvoty 2mM zásobní suspenze se skladují až 1 měsíc při -20.
1.7. Úplný produkt
Na destičku se zařadí vzorky odpovídající 100% konverzi substrátu na produkt, aby bylo možno stanovit % obratu substrátu (viz výpočty). Úplný produkt se vytvoří inkubací 1 ml 2mM substrátu s 20 μΐ zásobní suspenze enzymu po dobu 24 hodin při 37°C.
1.8. Ukončovací roztok
0,5M EDTA (Promega CAS (6081/92/6)) se zředí v poměru 1 :
250 ACe pufrem, čímž se získá 2mM roztok.
1.9. Dimethylsulfoxid (DMSO)
197
99 • 9 9 « • · 9 ·· • • « • 99 9 9 99 9 9 9
• • 9 9
9 •
9 • • 9 • 9 4 •
9 9 9 9 ·»· 99 • 99 99 • 99 9
1.10. Chlorid hořečnatý (MgCl2.6H2O, Fisher M0600/53)
1.11. Černé destičky s 96 jamkami s kulatým dnem (Costar 3915 nebo Packard)
1.12. TopSeal A (Packard 6005185)
1.13. Centrifugační zkumavky
2. Speciální vybavení
2.1. Centrifuga Sorvall RC-5B (rotor SS34 GSA, předchlazená na 4’C).
2.2. Miniprimer mixér Braun
2.3. Centrifuga Beckman CS-6R
2.4. Fluorstar Galaxy
2.5. Třepací inkubátor Wesbart 1589
3. Postupy
3.1. Tkáňové preparáty
3.2. Lidský ACE se získá z kůry ledvin za použití modifikovaného způsobu popsaného v Booth, A. G. a Kenny, A. J. (1974) Biochem. J. 142, 575 až 581.
3.3. Zmrazené ledviny se nechají roztát při teplotě místnosti a od medully se oddělí kůra.
3.4. Kůra se jemně naseká a homogenizuje přibližně v 10 objemech homogenizačního pufru 1 (1.4) za použití mixéru Miniprimer Braun (2.2)
198
3.5. K homogenátu se přidá chlorid hořečnatý (1.11) (20,3 mg/ /g tkáně) a vzniklá směs se 15 minut míchá v lázni z ledové vody.
3.6. Homogenát se v centrifuze Beckman (2.3) centrifuguje při 1500xg (3820 min-1) po dobu 12 minut. Supernatant se přemístí do čerstvé centrifugační zkumavky a peleta se zahodí.
3.7. Supernatant se v centrifuze Sovall (2.1) centrifuguje při 15 OOOxg (12 100 min-1) po dobu 12 minut a supernatant se zahodí.
3.8. Světle růžová vrstva na vrchu výsledné pelety se oddělí a resuspenduje v homogenizačním pufru 2 (1.5) (5 ml pufru na g tkáně).
3.9. Suspenze se v centrifuze Beckman (2.3) centrifuguje při 2200xg (4630 min“1) po dobu 12 minut a peleta se zahodí.
3.10. Supernatant se v centrifuze Sovall (2.1) centrifuguje při 15 OOOxg (12 100 min“1) po dobu 12 minut a supernatant se zahodí.
3.11. Výsledná peleta se resuspenduje v homogenizačním pufru (0,5 ml pufru na 1 g tkáně). Homogenní suspenze se získá za použití mixéru Braun Miniprimer (2.2), v 100μ1 alikvotech zmrazí a je možno ji zkoušet na aktivitu ACE.
4.0. Stanovení aktivity ACE
Aktivita se za použití alikvotů ACE připravených výše popsaným způsobem měří jako schopnost štěpit ACE specifický peptidový substrát.
199
Vepřový ACE (1.2) se rozmrazí a resuspenduje v pufru ACE (1.6) při 0,004υ/μ1, a vzniklá suspenze se zmrazí ve formě 50μ1 alikvotů.
4.1. Připraví se 4% roztok DMSO v ACE pufru (4 ml DMSO v 96 ml ACE pufru).
4.2. Substrát (1.7), úplný produkt (1.8), enzym (1.1, 1.2,
1.3) se nechají roztát na ledu.
4.3. Do každé jamky se přidá 50 μΐ 4% roztoku DMSO v pufru ACE.
4.4. 2mM zásobní substrát se zředí 1 : 100, čímž se získá 20μΜ roztok. Do každé jamky se přidá ΙΟΟμΙ 20μΜ substrátu (konečná koncentrace ΙΟμΜ).
4.5. Reakce se zahájí přídavkem 50μ1 od každé koncentrace ze sériového ředění enzymu (obvykle se používá ředění 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 a 1:3200). Do prázdných jamek se přidá 50 μΐ ACE pufru.
4.6. 2mM úplný produkt se zředí v poměru 1:200, čímž se získá ΙΟμΜ roztok. 200 μΐ ΙΟμΜ produktu se přidá do prvních čtyřech jamek nové destičky.
4.7. Destičky se inkubují v třepacím inkubátoru po dobu 60 minut při 37°C.
4.8. Reakce se zastaví přídavkem 100 μΐ 2mM EDTA v pufru ACE. Výsledná směs se inkubuje v třepacím inkubátoru 20 minut při 37°C a snímá na zařízení Fluostar (ex320/em420).
♦ * · »4 · 4« »4 • · · · 4 4 44 4 » · 4
200
4 4»· « « 4
4444 444 44 444 44 444·
Stanovení inhibice ACE
5.1. Zásobní substrát, úplný produkt a enzym se nechají roztát na ledu.
5.2. Zásobní roztoky sloučenin se připraví za použití 100% dimethylsulfoxidu a zředí v poměru 1 : 25 pufrem ACE, čímž se získají 4% dimethylsulfoxidové roztoky. Všechna další ředění se provádějí za použití 4% dimethylsulfoxidového roztoku v pufru ACE (4 ml DMSO v 96 ml pufru ACE).
5.3. 50μ1 sloučeniny se dvojmo navzorkuje do 96jamkových destiček, do kontrolních jamek a jamek pro slepý pokus se navzorkuje 50 μΐ 4% roztoku DMSO v pufru ACE.
5.4. Stupně 5.2 a 5.3 je možno provádět ručně nebo za použití vícesondových robotů Packard.
5.5. 2mM zásobní substrát se zředí v poměru 1 : 100 za použití pufru ACE, čímž se získá 20μΜ roztok (10μΜ konečná zkoušková koncentrace) (110 μΐ 2mM substrátu přidaného k 10,89 ml pufru postačuje pro 1 destičku).
5.6. Zásobní enzym se zředí pufrem ACE (stanoveno z kontrol aktivity) (4.0).
5.7. 2mM zásobní úplný produkt se zředí v poměru 1 : 200 pufrem ACE, čímž se získá 10μΜ roztok. Do prvních čtyřech jamek separátní destičky se navzorkuje 200 μΐ.
5.8. 0,5mM zásobní roztok EDTA se zředí 1 : 250, čímž se získá 2mM zásobní roztok (44 μΐ EDTA v 10,96 ml pufru ACE).
5.9. Do každé jamky 96jamkové destičky se přidají následující látky:
φφ *» φ φ · • Φ φφφ
201 • · »φ «φφ
Tabulka látek, které se navzorkují do 96jamkové destičky
Sloučenina/ Tris Substrát Enzym Úplný
DMSO pufr ACE produkt
vzorky 2 μΐ niny slouče- 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ žádný
kontrolní 2 μΐ DMSO 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ žádný
slepé pokusy 2 μΐ DMSO 100 μΐ 100 μΐ žádný žádný
s úplným 2 μΐ DMSO žádný žádný žádný 200 μΐ
produktem
5.10. 50 μΐ každého roztoku sloučenin o nejvyšší koncentraci použité při zkoušce se dvojmo navzorkuje do stejných 96jamkových destiček jako úplný produkt (5.7). Za účelem stanovení fluorescence se přidá 150 μΐ pufru ACE.
5.11. Reakce se zahájí přídavkem enzymu ACE a pokračuje jednohodinovou inkubací při 37°C v třepacím inkubátoru.
5.12. Reakce se ukončí 100 μΐ 2mM EDTA. Směs se inkubuje 20 minut při 37°C v třepacím inkubátoru. Odečítání se provádí za použití zařízení BMG Fluostar Galaxy (ex320/em420).
6. Výpočty
Aktivita enzymu ACE se stanoví za přítomnosti a za nepřítomnosti sloučeniny a vyjádří se pomocí procent.
FU = jednotky fluorescence (i) Kontrolní aktivita (%) (obrat enzymu)
44
Střední hodnota
FU slepých pokusů
- x íoo
202 ·· • · ···· • 44
9 4 4 « · · • e · · • 4 4
444 99 ·
9 4 4 4 9 4
4 4 · • · · ·· 4444
Střední hodnota FU kontroly
Střední hodnota FU úplného produktu
Střední hodnota FU slepých pokusů (ii) Aktivita s inhibitorem (%)
Střední hodnota Střední hodnota
FU sloučeniny - FU slepých pokusů
- x 100
Střední hodnota
FU úplného - Střední hodnota produktu FU slepých pokusů (iii) Aktivita vyjádřená jako % kontroly
Aktivita s inhibitorem (%) - x 100
Kontrolní aktivita (%) nebo
Střední hodnota Střední hodnota
FU sloučeniny - FU slepých pokusů
-- x íoo
Střední hodnota Střední hodnota
FU kontroly - FU slepých pokusů (iv) % Inhibice = 100 - % kontroly (v) Pro fluorescentní sloučeniny se střední hodnota FU slepých pokusů obsahujících sloučeninu (5.10) odečte ze
203
střední hodnoty FU sloučenin, které bylo použito pro výpočet % aktivity.
S-křivka závislosti odpovědi na dávce se proloží % aktivity (% kontroly) versus koncentrace sloučeniny a za použití balíčku LabStats se v Excelu vypočítají hodnoty
Závěry
Vyvinuli jsme zvířecí model, který reflektuje fyziologickou odpověď pozorovanou během sexuálního vzrušení ženy a přímo odráží klinické údaje získané na lidských dobrovolnících. V tomto modelu se pro zaznamenávání malých změn prokrvení vagíny nebo klitoris indukovaných stimulací pelvického nervu nebo vasoaktivními neurotransmitery používá laserové Dopplerovské technologie. Během sexuálního vzrušení dochází ke zvýšení prokrvení genitálií vyvolanému zvýšenou inervaci z pelvického nervu. Zvýšení prokrvení vagíny a klitoris indukované stimulací pelvického nervu pozorované na zvířecím modelu představuje endogenní vaskulární účinky pozorované během sexuálního vzrušení ženy, tj. překrvení. Tento model je tedy možno použít 1) pro identifikaci mechanismu, který se podílí na regulaci prokrvení vagíny a klitoris a 2) pro ověření nových přístupů ke zvýšení prokrvení genitálií.
Tato studie úspěšně využila kombinace postupů prováděných in vivo a in vitro a biochemických postupů při prokazování, že VIP zprostředkovává prokrvení genitálií a při identifikaci cAMP jako mediátoru/druhého posla regulujícího vasorelaxaci genitálií (a relaxace vaginální stěny). Na tomto zvířecím modelu jsme doložili, že infuze VIP indukuje zvýšení vaginálního a klitoriálního prokrvení. Za použití inhibitoru metabolismu VIP (například inhibitoru
204
NEP EC 3.4.24.11) jsme také prokázali, že zvýšení prokrvení genitálií pozorované během stimulace pelvického nervu (tj. sexuálního vzrušení) je zprostředkováno VIP. Ukázali jsme, že zvýšení prokrvení genitálií zprostředkované VIP je výsledkem zvýšení tkáňového cAMP, přičemž vliv VIP na zvýšení prokrvení vagíny u zdravých dobrovolníků již byl znám, avšak nebyl znám buněčný mechanismus. Dále jsme prokázali, že prokrvení genitálií je možno zvýšit přímo, za použití cAMP mimetika, nebo nepřímo, prostřednictvím zvýšení koncentrace cAMP za použití inhibitoru PDEcAMp typu 2 nebo antagonisty receptoru NPY Yl.
Hlavní příčinou FSAD je snížené prokrvení genitálií, které se manifestuje jako snížené prokrvení vagíny, labií a klitoris. Ženy postižené FSAD lze léčit obnovením normální sexuální vzrušivosti. Toho je možno dosáhnout zvýšením prokrvení genitálií. Náš přístup k léčení FSAD spočívá ve zvýšení prokrvení genitálií, a tedy potenciaci překrvení/lubrikace vagíny a překrvení/citlivosti klitoris buď přímou nebo nepřímou potenciaci cAMP signalizace, například za použití inhibitoru NEP (EC 3.4.24.11), inhibitoru PDE hydrolyzující cAMP nebo antagonisty receptoru NPY. Celkovým účinkem pak bude obnovení nebo potenciace normálního vzrušení bez vedlejších kardiovaskulárních účinků. Tak dojde ke zvýšení sexuálního vzrušení/překrvení, a nikoliv k jeho prosté indukci bez přítomnosti sexuální touhy, jak tomu může být v případě některých exogenně podávaných vasoaktivních činidel, například VIP.
Předmětem vynálezu je tedy mj.:
- Farmaceutická kompozice pro použití (či když se jí používá) při léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž tato farmaceutická kompozice obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně
205
FSAD; a toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem.
- Použití činidla při výrobě léčiva pro léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD.
- Způsob léčení žen (jako žen trpících FSD, přednostně FSAD), jehož podstata spočívá v tom, že se ženě podává činidlo, které je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech, v množství, které vyvolává potenciaci cAMP v pohlavních orgánech ženy; přičemž toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem.
Ve vysoce přednostním provedení je předmětem vynálezu mj:
- Farmaceutická kompozice pro použití (či když se jí používá) při léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž tato farmaceutická kompozice obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD; a toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem a je podáváno perorálně.
- Použití činidla při výrobě léčiva pro léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD a je podáváno perorálně.
- Způsob léčení žen (jako žen trpících FSD, přednostně FSAD), jehož podstata spočívá v tom, že se ženě podává činidlo, které je schopné potencovat cAMP v pohlav206
nich orgánech, v množství, které vyvolává potenciaci cAMP v pohlavních orgánech ženy; přičemž toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem a je podáváno perorálně.
V ještě výhodnějším provedení je předmětem vynálezu mj :
- Farmaceutická kompozice pro použití (či když se jí používá) při léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž tato farmaceutická kompozice obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD; a činidlo jé popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, přičemž činidlo potencuje endogenní cAMP.
- Použití činidla při výrobě léčiva pro léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD a potencuje endogenní cAMP.
- Způsob léčení žen (jako žen trpících FSD, přednostně FSAD), jehož podstata spočívá v tom, že se ženě podává činidlo, které je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech, v množství, které vyvolává potenciaci cAMP v pohlavních orgánech ženy; přičemž toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem a potencuje endogenní cAMP.
V ještě výhodnějším provedení je předmětem vynálezu mj . :
- Farmaceutická kompozice pro použití (či když se jí používá) při léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž tato farmaceutická kompozice obsahuje činidlo schopné potencovat
• ·· · · • · · « · ·
207 cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD; a činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, přičemž činidlo se podává perorálně a potencuje endogenní cAMP.
- Použití činidla při výrobě léčiva pro léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD, podává se perorálně a potencuje endogenní cAMP.
- Způsob léčení žen (jako žen trpících FSD, přednostně FSAD), jehož podstata spočívá v tom, že se ženě podává činidlo, které je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech, v množství, které vyvolává potenciaci cAMP v pohlavních orgánech ženy; přičemž toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, podává se perorálně a potencuje endogenní cAMP.
Všechny citované publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohto textu. Odborníci m v tomto oboru budou schopni způsoby a systémy podle tohoto vynálezu různě modifikovat či obměňovat, a takové modifikace či varianty nebudou představovat únik z rozsahu tohoto vynálezu. Ačkoliv je vynález popsán ve spojení s konkrétními provedeními, na taková provedení se neomezuje. Různé modifikace popsaných forem tohoto vynálezu, které jsou odborníkům v oboru biochemie a biotechnologie zřejmé, spadají do rozsahu připojených patentových nároků.
208
Obecné odkazy
Ashur-Fabian, O., Perl ,0., Lilling, G., et al. (1999). SNV, a lipophilic superactive VIP analog, acts through cGMP to promote neuronal survival. Peptides, 20, 629-633.
Berman, J.R., Berman, L. & Goldstein, I. (1999). Female sexual dysfunction: Incidence, pathophysiology, evaluation, and treatment options. Urology, 54, 385-391.
Berman, J., Goldstein, I., Werbin, T. et al. (1999a). Double biind piacebo controlled study with crossover to assess effect of sildenafii on physiological parameters of the female sexual response. J. Urol., 161, 805.
Burnett, A, Calvin, D., Silver, R. et al. (1997). Immunohistochemical description of nitric oxide synthase isoforms in human clitoris. J. Urol., 158, 75-78.
Diagnostíc and statistical manual of mental disorders-IV, American Psychiatrie Association: Washington, DC., 1987, pp 493-518.
Fan, Y.P., Chakder, S. & Ratton, S. (1998). Inhibitory effect of zinc protoporphyrin IX on lower esophageal sphincter smooth muscle relaxation by vasoactive intestinal polypeptide and other receptor agonists. J. Pharmacol. Exp. Ther., 285, 468-474.
Foda, H.D., Sharaf, H.H., Absood, A. et al. (1995). Pituitary adenylate cyclaseactivating peptide (PACAP), a VlP-like peptide, has prolonged airway smooth muscle relaxant activity. Peptides, 16,1057-1061.
Frank, E., Anderson, C. & Rubinstein, D. (1978). Frequency of sexual dysfunction in “normál” couples. N. Eng!. J. Med., 229,111-115.
Goldstein, I. & Berman, J.R. (1998). Vasculogenic female sexual dysfunction: vaginal engorgement and clitoral erectile insufficiency syndromes. Int. J. Impot. Pes., 10, S84-S90.
Gu, Z.F., Jensen, R.T. & Maton, P.N. (1992). A primary role for protein kinase A in smooth muscle relaxation induced by adrenergic agonists and neuropeptides. Am. J. Physiol., 263, G360-G364.
209 • ·· · · · · · • · · · ··· ♦ ·· » • · ··· · · · • · · · · · · ·· ··· 99 999 99 9999
Hauser-Kronberger, C., Cheung, A., Hacker, G. et al. (1999). Peptidergic innervation of the human clitoris. Peptides, 20, 539-543.
Hoyle, C.H.V., Stones, R.W., Robson, T. et al. (1996). Innervation of vascuiature and microvasculature of the human vagína by NOS and neuropeptide containing nerveš. J. Anat., 188, 633-644.
Ingenhoven, N. & Beck-Sickinger, A.G. (1997). Flourescent labelled analogues of neuropeptide Y for the characterisation of cells expressing NPY receptor subtypes. J. Recept. Signál Transduct. Res., 17, 407-418.
Jovanovic, A., Jovanovic, S., Tulíc,. I. et al. (1998). Predominant role for nitric oxide in the relaxation induced by vasoactive intestinal poiypeptide in human uterine artery. Mol. Human Reprod., 4, 71-76.
Kaplan, H.S. (1974). The New Sex Therapy. London, Bailliere Tindall.
Kaplan, S.A., Reis, R.B., Kohm, I.J. et al. (1999). Safety and efficacy of sildenafil in postmenopausal women with sexual dysfunction. Urology, 53, 481-486.
Kim, Y.C., Choi, H.K., Ahn, Y.S., ef al. (1994). The effect of vasoactive intestinal poiypeptide (VIP) on rabbit cavernosal smooth muscle contractility. J. Androl., 15, 392-739.
Laan, E. & Everaerd, W. (1998). Physiological measures of vaginal vasocongestion. Int. J. Impot. Res., 10, S107-S110.
Leiblum, S.R. (1998). Definition and classification of female sexual disorders. Int. J. Impotence Res., 10, S104-S106.
Levin, R.J. (1980). The physiology of sexual function in women. Clin. Obstet. Gynecol., 7, 213-252.
Levin, R.J. (1991). VIP, vagína, clitoral and preurethral glans: An update on female genital arousal. Exp. Clin. Endocrinol., 98, 61-69.
9 99 9 99 99 • · · · · ··· · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 ·
9 9 · 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 999 99 ·99 99 9999
Levin, R.J. (1992). The mechanisms of human female sexual arousal. Ann. Rev. Sex Res., 3,1-48.
Levin, R.J. & Wagner, G. (1986). TRH and vaginal biood flow-effects in concious women and anaesthetised sheep. J. Physiol., 373, 83P.
Lundberg, J.M., Modin, A. & Malmstrom, R.E. (1996). Recent developments with neuropeptide Y receptor antagonists. Trends. Pharmacol. Sci., 17, 301-304.
Masters, W.H., Johnson, V.E. Human Sexual Response. Little, Brown; Boston, 1996.
Ottesen, B., Gerstenberg, T., Ulrichsen, H. et al. (1983). Vasoactive intestinal polypeptide (VIP) increases vaginal blood flow and inhibits smooth muscle activity in women. Eur. J. Clin. Invest., 13, 321-324.
Ottesen, B., Wagner, G. & Fahrenkrug, J. Peptide innervation of the sexual organs. In: Handbook of Sexology, Vol. 6, The Pharmacoiogicai and Endocrinology of Sexual Function, Sitsen, J.M.A. (eds), Amsterdam: Elsevier Science Publishers (1988), chapter 4, pp 66-97.
Ottensen, B., Pedersen, B., Nielsen, J. et al. (1987). Vasoactive intestinal polypeptide (VIP) provokes vaginal lubrication in normál women. Peptides, 8, 797800.
Park, K., Goldstein, I., Andry, C., et al. (1997). Vasculogenic female sexual dysfunction: The hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. Int. J. Impotence Res., 9, 27-37.
Rosen, R., Taylor, J., Leiblum, S. et al. (1993). Prevalence of sexual dysfunction in women: results of a survey of 329 women in an outpatient gynecological clinic. J. Sex Marital Ther., 19, 171-188.
Schiavi, R.C. & Seagraves, R.T. (1995). The biology of sexual function. Psychiat. Clin. North. Am., 18, 7-23.
Schoeffter, P. & Stoclet, J.C. (1985). Effect of vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on cyclic AMP level and relaxation in rat isolated aorta. Eur. J. Pharmacol., 109, 275279.
Serradeii-Le Gal, C., Valette, G., Rouby, P.E. et al. (1995). SR 120819A, an orallyactive and selective neuropeptide Y Y1 receptor antagonist. FEBS Letters, 3, 192196.
Sjoberg, I. (1992). The vagína: Morphological, functional and ecological aspects. Acta Obst. Gynecol. Scand., 71, 84-85.
Spector, I.P. & Carey, M.P. (1990). Incidence and prevalence of sexual dysfunctions: a critical review of the empirical literatuře. Arch. Sex. Behav., 19, 389-408.
Wagner, G. (1992). Aspects of genital physiology and pathology. Sem. Neurol., 12, 87-97.
Werbin, T., Salimpour, P., Berman.L., et al. (1999). Effect of sexual stimulation and age on genital blood flow in women with sexual stimulation. J. Urol., 161, 688
Wincze, J.P., Albert, A. & Bansal, S. (1993). Sexual arousal in diabetic females: Physiological and self-report measures. Arch. Sex Behav., 22, 587-601.
Wieland, H.A., Willim, K.D., Entzeroth, M. et al. (1995). Subtype selectivity and antagonist profile of the nonpeptide Y1 receptor antagonist BIBP 3226. J Pharmacol Exp Ther., 275, 143-9.
Odkazy pro část týkající se PDE
Han, P.; Fletcher, C. F.; Copeland, N. G.; Jenkins, N. A.; Yaremko, L. M.; Michaeli, T. : Assignment of the mouše Pde7A gene to the proximal region of chromosome 3 and of the human PDE7A gene to chromosome 8q13. Genomics 48: 275-276, 1998.
2. Michaeli, T.; Bloom, T. J.; Martins, T.; Loughney, K.; Ferguson, K.; Riggs, M.; Rodgers, L.; Beavo, J. A.; Wigler, M. : Isolation and characterization of a previously undetected human cAMP phosphodiesterase by complementation of cAMP
Mi> .·*♦ .: .··. .:
• · · · · • · · · · · · · · « · · phosphodiesterase-deficient Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 268: 1292512932, 1993.
3. Milatovich, A.; Bolger, G.; Michaeli, T.; Francké, U. : Chromosome localizations of genes for five cAMP-specific phosphodiesterases in man and mouše. Sómat. Cell Molec. Genet. 20: 75-86, 1994.
4. Rosman, G. J.; Martins, T. J.; Sonnenburg, W. K.; Beavo, J. A.; Ferguson, K.; Loughney, K. : Isolation and characterization of human cDNAs encoding a cGMPstimulated 3-prime,5-prime-cyclic nucleotide phosphodiesterase. Gene 191: 89-95, 1997.
Odkazy pro část týkající se NEP
1. Barker, P. E.; Shipp, M. A.; DAdamio, L.; Masteller, E. L.; Reinherz, E. L. The common acute lymphoblastic leukemia antigen gene maps to chromosomal region 3(q21-q27). J. Immun. 142: 283-287,1989.
2. DAdamio, L.; Shipp, M. A.; Masteller, E. L.; Reinherz, E. L. : Organization of the gene encoding common acute lymphoblastic leukemia antigen (neutrál endopeptidase 24.11): multiple miniexons and separate 5-prime untranslated regions. Proč. Nat. Acad. Sci. 86: 7103-7107, 1989.
3. Letarte, M.; Vera, S.; Tran, R.; Addis, J. B. L.; Onizuka, R. J.; Quackenbush, E. J.; Jongeneel, C. V.; Mclnnes, R. R. : Common acute lymphocytic leukemia antigen is identicai to neutrál endopeptidase. J. Exp. Med. 168:1247-1253,1988.
4. Shipp, M. A.; Vijayaraghavan, J.; Schmidt, E. V.; Masteller, E. L.; DAdamio, L.; Hersh, L. B.; Reinherz, E. L. : Common acute lymphoblastic leukemia antigen (CALLA) is active neutrál endopeptidase 24.11 ('enkephalinasej: direct evidence by cDNA transfection analysis. Proč. Nat. Acad. Sci. 86: 297-301, 1989.
5. Tran-Paterson, R.; Willard, H. F.; Letarte, M. : The common acute lymphoblastic leukemia antigen (neutrál endopeptidase--3.4.24.11) gene is located on human chromosome 3. Cancer Genet. Cytogenet. 42:129-134,1989.
·· · ·φ · ·· 99 » · · · 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 999 99 999 99 9999
Odkazy pro část týkající se NPY
1. Allen, J. M.; Bloom, S. R. : Neuropeptide Y: a putative neurotransmitter. Neurochem. Int. 8: 1-8, 1986.
2. Bahary, N.; Zorich, G.; Pachter, J. E.; Leibel, R. L.; Friedman, J. M. : Molecular genetic linkage maps of mouše chromosomes 4 and 6. Genomics 11: 33-47, 1991.
3. Baker, E.; Hort, Y. J.; Balí, H.; Sutherland, G. R.; Shine, J.; Herzog, H. : Assignment of the human neuropeptide Y gene to chromosome 7p15.1 by nonisotopic in šitu hybridization. Genomics 26: 163-164, 1995.
5. Carr, L. G.; Foroud, T.; Biče, P.; Gobbett, T.; Ivashina, J.; Edenberg, H.; Lumeng, L.; Li, T. K. : A quantitative trait locus for alcohol consumption in selectively bred rat lineš. Alcohol Clin. Exp. Res. 22: 884-887,1998.
5. Dockray, G. J. : Neuropeptide Y: in search of a function. Neurochem. Int. 8: 9-11, 1986.
6. Erickson, J. C.; Clegg, K. E.; Paimiter, R. D.: Sensitivity to leptin and susceptibility to seizures of mice lacking neuropeptide Y. Nátuře 381: 415-421, 1996. PubMed ID : 8632796
7. Erickson, J. C.; Hollopeter, G.; Paimiter, R. D. : Attenuation of the obesity syndrome of ob/ob mice by the loss of neuropeptide Y. Science 274: 1704-1706, 1996.
8. Karvonen, Μ. K.; Pesonen, U.; Koulu, M.; Niskanen, L.; Laakso, M.; Rissanen, A.; Dekker, J. M.; 't Hart, L. M.; Valve, R.; Uusitupa, Μ. I.: Association of a leucine(7)-toproline(7) polymorphism in the signál peptide of neuropeptide Y with high sérum cholesterol and LDL cholesterol levels. Nátuře Med. 4:1434-1437, 1998.
9. Maccarrone, C.; Jarrott, B. : Neuropeptide Y: a putative neurotransmitter. Neurochem. Int. 8: 13-22, 1986.
- -Μ
10. Meisler, Μ. Η.; Spence, J. Ε.; Dixon, J. E.; Caldwell, R. M.; Minth, C. D.; Beaudet, A. L. : Exclusion of close linkage between the loci for cystic fibrosis and neuropeptide Y on human chromosome 7. Cytogenet. Cell Genet. 44: 175-176, 1987.
11. Minth, C. D.; Andrews, P. C.; Dixon, J. E. : Characterization, sequence, and expression of the cloned human neuropeptide Y gene. J. Biol. Chem. 261: 1197411979, 1986.
12. Minth, C. D.; Bloom, S. R.; Polák, J. M.; Dixon, J. E. : Cloning, characterization, and DNA sequence of a human cDNA encoding neuropeptide tyrosine. Proč. Nat. Acad. Sci. 81: 4577-4581,1984.
13. Takeuchi, T.; Gumucio, D.; Eddy, R.; Meisler, M.; Minth, C.; Dixon, J.; Yamada, T.; Shows, T. : Assignment of the related pancreatic polypeptide (PPY) and neuropeptide Y (NPY) genes to regions on human chromosomes 17 and 7. (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 40: 759 only, 1985.
14. Takeuchi, T.; Gumucio, D. L.; Yamada, T.; Meisler, Μ. H.; Minth, C. D.; Dixon, J. E.; Eddy, R. E.; Shows, T. B. : Genes encoding pancreatic polypeptide and neuropeptide Y are on human chromosomes 17 and 7. J. Clin. Invest. 77: 10381041, 1986.
15. Terenghi, G.; Polák, J. M.; Hamid, Q.; 0'Brien, E.; Denny, P.; Legon, S.; Dixon,
J.; Minth, C. D.; Palay, S. L.; Yasargil, G.; Chan-Palay, V. : Localization of neuropeptide Y mRNA in neurons of human cerebral cortex by means of in šitu hybridization with a complementary RNA probe. Proč. Nat. Acad. Sci. 84: 73157318, 1987.
16. Thiele, T. E.; Marsh, D. J.; Ste. Marie, L.; Bernstein, I. L.; Palmiter, R. D. : Ethanol consumption and resistance are inversely related to neuropeptide Y levels. Nátuře 396: 366-369,1998.
17. Uusitupa, Μ. I. J.; Karvonen, Μ. K.; Pesonen, U.; Koulu, M. : Neuropeptide Y: a novel link between the neuroendocrine systém and cholesterol metabolism. Ann. Med. 30:508-510, 1998.
j/r
- 2-i*
9
Odkazy pro část týkající se NPYR1
1. Herzog, H.; Baumgartner, M.; Vivero, C.; Selbie, L. A.; Auer, B.; Shine, J. : Genomic organization, localization, and allelic differences in the gene for the human neuropeptíde Y Y1 receptor. J. Biol. Chem. 268: 6703-6707, 1993.
2. Herzog, H.; Darby, K.; Balí, H.; Hort, Y.; Beck-Sickinger, A.; Shine, J.: Overlapping gene structure of the human neuropeptíde Y receptor subtypes Y1 and Y5 suggests coordinate transcriptional regulation. Genomics 41: 315-319, 1997.
3. Herzog, H.; Hort, Y. J.; Balí, H. J.; Hayes, G.; Shine, J.; Selbie, L. A. : Cloned human neuropeptíde Y receptor couples to two different second messenger systems. Proč. Nat. Acad. Sci. 89: 5794-5798, 1992.
4. Larhammar, D.; Blomqvist, A. G.; Yee, F.; Jazin, E.; Yoo, H.; Wahlestedt, C. : Cloning and functional expression of a human neuropeptíde Y/peptide YY receptor of the Y1 type. J. Biol. Chem. 267:10935-10938, 1992.
5. Lutz, C. M.; Frankel, W. N.; Richards, J. E.; Thompson, D. A. : Neuropeptíde Y receptor genes on human chromosome 4q31-q32 map to conserved linkage groups on mouše chromosomes 3 and 8. Genomics 41: 498-500, 1997.
Odkazy pro část týkající se NPYR2
1. Ammar, D. A.; Eadie, D. M.; Wong, D. J.; Ma, Y.-Y.; Kolakowski, L. F„ Jr.; YangFeng, T. L.; Thompson, D. A. : Characterization of the human type 2 neuropeptíde Y receptor gene (NPY2R) and localization to the chromosome 4q region containing the type 1 neuropeptíde Y receptor gene. Genomics 38: 392-398, 1996.
2. Gerald, C.; Walker, M. W.; Vaysse, P. J.-J.; He, C.; Branchek, T. A.; Weinshank, R. L. : Expression cloning and pharmacologicai characterization of a human hippocampal neuropeptíde Y/peptide YY Y2 receptor subtype. J. Biol. Chem. 270: 26758-26761,1995.
·· · ·· 99 · · · · · 9 9 •««k ···
9 9 · 9
9 99 9 99 999 9
3. Lutz, C. M.; Frankel, W. N.; Richards, J. E.; Thompson, D. A. : Neuropeptide Y receptor genes on human chromosome 4q31-q32 map to conserved linkage groups on mouše chromosomes 3 and 8. Genomics 41: 498-500, 1997.
4. Rose, Ρ. M.; Fernandes, P.; Lynch, J. S.; Frazier, S. T.; Fisher, S. M.; Kodukula,
K.; Kienzle, B.; Seethala, R.: Cloning and functional expression of a cDNA encoding a human type 2 neuropeptide Y receptor. J. Biol. Chem. 270: 22661-22664, 1995.
Odkazy pro část týkající se VIP
1. Bodner, M.; Fridkin, M.; Gozes, I. : Coding sequences for vasoactive intestinal peptide and PHM-27 peptide are located on two adjacent exons in the human genome. Proč. Nat. Acad. Sci. 82: 3548-3551, 1985.
2. Gotoh, E.; Yamagami, T.; Yamamoto, H.; Okamoto, H.: Chromosomal assignment of human VIP/PHM-27 gene to 6q26-q27 region by spot blot hybridization and in sítu hybridization. Biochem. Int. 17: 555-562,1988.
3. Gozes, I.; Avidor, R.; Yahav, Y.; Katznelson, D.; Croce, C. M.; Huebner, K. : The gene encoding vasoactive intestinal peptide is located on human chromosome 6p216qter. Hum. Genet. 75: 41-44,1987.
4. Gozes, I.; Nakai, H.; Byers, M.; Avidor, R.; Weinstein, Y.; Shani, Y.; Shows, T. B. : Sequential expression in the nervous systém of C-MYB and VIP genes, located in human chromosomal region 6q24. Sómat. Cell Molec. Genet. 13: 305-313,1987.
5. Heinz-Erian, P.; Dey, R. D.; Flux, M.; Said, S. I. : Deficient vasoactive intestinal peptide innervation in sweat glands of cystic fibrosis patients. Science 229: 14071408, 1985.
6. Itoh, N.; Obata, K.; Yanaihara, N.; Okamoto, H. : Human preprovasoactive intestinal polypeptide contains a novel PHI-27-like peptide, PHM-27. Nátuře 304: 547-549, 1983.
7. Linder, S.; Barkhem, T.; Norberg, A.; Persson, H.; Schalling, M.; Hokfelt, T.; Magnusson, G. : Structure and expression of the gene encoding the vasoactive intestinal peptide precursor. Proč. Nat. Acad. Sci. 84: 605-609, 1987.
«« φ·
Φ ♦ 9 • 9 9 99 9
8. Omary, Μ. B.; Kagnoff, Μ. F. : Identification of nuclear receptors for VIP on a human colonic adenocarcinoma cell line. Science 238:1578-1581, 1987.
Odkazy pro část týkající se ACE
1. Parma, J.; Stengel, D.; Gannage, M.-H.; Poyard, M.; Barouki, R.; Hanoune, J. : Sequence of a human brain adenylyl cyclase partial cDNA: evidence for a consensus cyclase domain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 455-462, 1991.
2. Stengel, D.; Parma, J.; Gannage, M.-H.; Roeckel, N.; Mattei, M.-G.; barouki, R.; Hanoune, J. : Different chromosomal localization of two adenylyl cyclase genes expressed in human brain. Hum. Genet. 90:126-130,1992.
Odkazy pro část týkající se VPAC1
1. Couvineau, A.; Rouyer-Fessard, C.; Darmoul, D.; Maoret, J.-J.; Carrero, I.; OgierDenis, E.; Laburthe, M. : Human intestinal VIP receptor: cloning and functional expression of two cDNA encoding proteins with different N-terminal domains. Biochem. Biophys. Res. Commun. 200: 769-776, 1994.
2. Hashimoto, H.; Nishino, A.; Shintani, N.; Hagihara, N.; Copeland, N. G.; Jenkins, N. A.; Yamamoto, K.; Matsuda, T.; Ishihara, T.; Nagata, S.; Baba, A. : Genomic organization and chromosomal locatíon of the mouše vasoactive intestinal polypeptide 1 (VPAC-1) receptor. Genomics 58: 90-93,1999.
3. Libert, F.; Passage, E.; Parmentier, M.; Simons, M.-J.; Vassart, G.; Mattei, M.-G. : Chromosomal mapping of A1 and A2 adenosine receptors, VIP receptor, and a new subtype of serotonin receptor. Genomics 11: 225-227,1991.
4. Sreedharan, S. P.; Huang, J.-X.; Cheung, M.-C.; Goetzl, E. J. : Structure, expression, and chromosomal localization of the type I human vasoactive intestinal peptide receptor gene. Proč. Nat. Acad. Sci. 92: 2939-2943, 1995.
5. Sreedharan, S. P.; Patel, D. R.; Huang, J.-X.; Goetzl, E. J.: Cloning and functional expression of a human neuroendocrine vasoactive intestinal peptide receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193: 546-553,1993.
000
0 0 0· 000 »0
0 0 0 • 0 0
0 0 • 00
0000
6. Sreedharan, S. P.; Robichon, A.; Peterson, K. E.; Goetzl, E. J. : Cloning and expression of the human vasoactive intestinal peptide receptor. Proč. Nat. Acad. Sci. 88: 4986-4990, 1991.
7. Vassart, G. : Personál Communication. Brussels, Belgium, 1/15/1992. 8. Wenger, G. D.: Personál Communication. Columbus, Ohio, 8/3/1993.
Odkazy pro část týkající se VPAC2
1. Adamou, J. E.; Aiyar, N.; Van Horn, S.; Elshourbagy, N. A. : Cloning and functional characterization of the human vasoactive intestinal peptide (VIP)-2 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commmun. 209: 385-392,1995.
2. Mackay, M.; Fantes, J.; Scherer, S.; Boyle, S.; West, K.; Tsui, L.-C.; Belloni, E.; Lutz, E.; Van Heyningen, V.; Harmar, A. J.: Chromosomal localization in mouše and human of the vasoactive intestinal peptide receptor type 2 gene: a possible contributor to the holoprosencephaly 3 phenotype. Genomics 37: 345-353, 1996.
3. Svoboda, M.; Tastenoy, M.; Van Rampelbergh, J.; Goossens, J.-F.; De Neef, P.; Waelbroeck, M.; Robberecht, P.: Molecular cloning and functional characterization of a human VIP receptor from SUP-T1 lymphoblasts. Biochem. Biophy. Res. Commun. 205: 1617-1624, 1994.
·· ·· ·· ··
0 0 «0 • 0 00 • • • 1
• • • • • • • •
• • • • • • • •
0··· ··<* ·· 0 0· -»· ····
Seznam zkratek
FSD
FSAD cAMP cGMP PcAMP PcGMP AcAMP AcGMP AMcAMP ^cGMP ZcAMP ZcGMP 1:ZcAMP 1:ZcGMP 1: ^cAMP 1: ^cGMP U:AcAMP U:AcGMP
AC
A:AC
NEP
I:NEP
VIP
VlPr = sexuální dysfunkce u žen = porucha sexuální vzrušivosti u žen = cyklický adenosin-35'-monofosfát = cyklický guanosin-35'-monofosfát = potenciátor cAMP = potenciátor cGMP = aktivátor cAMP = aktivátor cGMP = negativní modulátor cAMP = negativní modulátor cGMP = inhibitor cAMP = inhibitor cGMP = inhibitor inhibitoru cAMP = inhibitor inhibitoru cGMP = inhibitor negativního modulátoru cAMP = inhibitor negativního modulátoru cGMP = pozitivní regulátor aktivátoru cAMP = pozitivní regulátor aktivátoru cGMP = adenylát cyklasa = aktivátor AC = neutrální = inhibitor endopeptidasa
NEP = vasoaktivní intestinální peptid = receptor VIP (může být také označen jako VIPR)
27)
2Ί9- -
VIPn = podtyp receptoru VIP (jako VIPR1, VIPR2)
A:VlPr = aktivátor VlPr
A:VIPn = aktivátor VIPn
I:VIPr = inhibitor VlPr
I:VIPn - inhibitor VIPn
1:1:VlPr = inhibitor inhibitoru VlPr
I:I:VIPn = inhibitor inhibitoru VIPn
PDE = fosfodiesterasa
PDEn = třída PDE (například PDE1, PDE2 atd.)
PDEcAMP = PDE hydrolyzující cAMP
PDEcGMP = PDE hydrolyzující cGMP
I:PDE = inhibitor PDE
I: ΡΟΕθ^ρ = inhibitor PDE hydrolyzující cAMP
1:PDEcAMP - inhibitor PDE třídy hydrolyzující cAMP
NPY = neuropeptid Y
NPYr = receptor NPY (může být označen také jako NPYR)
NpYn = receptor NPY podtypu Yn (například (například NPYR1) NPY Y
I:NPY = inhibitor NPY
I:NPY Yn = inhibitor NPY Yn
kDa = kilodalton
bp = bázový pár (pár bází)
kb = 1000 bázových párů
• ft
- 2-25V• ·· · ·· ·· • •ft · ··· · ftft · • ft ··· · · · • · · · ft ft ·· ft·· ·· ··· ·· ····
Sekvenční protokoly
1. NEP (EC
3.4.24.11)
LOKUS
DEFINICE
PŘÍRŮSTEK
VERZE
KLÍČOVÁ
SLOVA
ZDROJ
ORGANISMUS
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
ZNAKY
Zdroj
HSMRNAEN 3181 bp mRNA PRI 12-SEP-1993
Lidská mRNA pro enkefalinasu (EC 3.4.24.11).
X07166
X07166.1 GI:34757 enkefalinasa; metalloprotein; neutrální endopeptidasa. člověk.
Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
(báze 1 až 3181)
Malfroy,B., Kuang,W.J., Seeburg,P.H., Mason,A.J. and Schofield,P.R. Molecular cloning and amino acid sequence of human enkephalinase (neutrál endopeptidase)
FEBS Lett. 229 (1), 206-210 (1988)
88152222
Poloha/kvalifikátory 1. .3181 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 /klon=lambda H7 /tkáňový_typ=placenta /klon_knih=lambda gtlO kódující sekv.
18. .2249 /označení=enkefalinasa (AA 1-743) /kodon_start=l /protein_id=CAA3 0157.1 /db_xref=GI:34758 /db_xref=SWISS-PROT:P08473 /translace= MDITDINTPKPKKKQRWTPLEISLSVLVLLLTIIAVTMIALYAT YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDI LRDELEWLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGW PVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLG LPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEI ANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISI TNE EDVWYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALY GTTS ETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGE S KHWEDLIAQI RE VFIQTLDD LTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNL KFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAWNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSL NYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSW DLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGE E KLL PGLDLNHKQLFFLN FAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKC RVW různ.znak 3073..3078 /označení=póly A signál
POČET BÁZÍ 1055 a 582 c 657 g 887 t
PŮVOD gcaagtcaga aagtcagatg gatataactg atatcaacac tccaaagcca aagaagaaac agcgatggac tccactggag atcagcctct cggtccttgt cctgctcctc accatcatag
121 ctgtgacaat gatcgcactc tatgcaacct acgatgatgg tatttgcaag tcatcagact
181 gcataaaatc agctgctcga ctgatccaaa acatggatgc caccactgag ccttgtacag
241 actttttcaa atatgcttgc ggaggctggt tgaaacgtaa tgtcattccc gagaccagct
301 cccgttacgg caactttgac attttaagag atgaactaga agtcgttttg aaagatgtcc
361 ttcaagaacc caaaactgaa gatatagtag cagtgcagaa agcaaaagca ttgtacaggt
421 cttgtataaa tgaatctgct attgatagca gaggtggaga acctctactc aaactgttac
481 cagacatata tgggtggcca gtagcaacag aaaactggga gcaaaaatat ggtgcttctt
541 ggacagctga aaaagctatt gcacaactga attctaaata tgggaaaaaa gtccttatta
Μ)
-3^ -
601 atttgtttgt tggcactgat gataagaatt ctgtgaatca tgtaattcat attgaccaac 661 ctcgacttgg cctcccttct agagattact atgaatgcac tggaatctat aaagaggctt 721 gtacagcata tgtggatttt atgatttctg tggccagatt gattcgtcag gaagaaagat 781 tgcccatcga tgaaaaccag cttgctttgg aaatgaataa agttatggaa ttggaaaaag 841 aaattgccaa tgctacggct aaacctgaag atcgaaatga tccaatgctt ctgtataaca 901 agatgacatt ggcccagatc caaaataact tttcactaga gatcaatggg aagccattca 961 gctggttgaa tttcacaaat gaaatcatgt caactgtgaa tattagtatt acaaatgagg
1021 aagatgtggt tgtttatgct ccagaatatt taaccaaact taagcccatt cttaccaaat 1081 attctgccag agatcttcaa aatttaatgt cctggagatt cataatggat cttgtaagca 1141 gcctcagccg aacctacaag gagtccagaa atgctttccg caaggccctt tatggtacaa 1201 cctcagaaac agcaacttgg agacgttgtg caaactatgt caatgggaat atggaaaatg 1261 ctgtggggag gctttatgtg gaagcagcat ttgctggaga gagtaaacat gtggtcgagg 1321 atttgattgc acagatccga gaagttttta ttcagacttt agatgacctc acttggatgg 1381 atgccgagac aaaaaagaga gctgaagaaa aggccttagc aattaaagaa aggatcggct 1441 atcctgatga cattgtttca aatgataaca aactgaataa tgagtacctc gagttgaact 1501 acaaagaaga tgaatacttc gagaacataa ttcaaaattt gaaattcagc caaagtaaac 1561 aactgaagaa gctccgagaa aaggtggaca aagatgagtg gataagtgga gcagctgtag 1621 tcaatgcatt ttactcttca ggaagaaatc agatagtctt cccagccggc attctgcagc 1681 cccccttctt tagtgcccag cagtccaact cattgaacta tgggggcatc ggcatggtca 1741 taggacacga aatcacccat ggcttcgatg acaatggcag aaactttaac aaagatggag 1801 acctcgttga ctggtggact caacagtctg caagtaactt taaggagcaa tcccagtgca 1861 tggtgtatca gtatggaaac ttttcctggg acctggcagg tggacagcac cttaatggaa 1921 ttaatacact gggagaaaac attgctgata atggaggtct tggtcaagca tacagagcct 1981 atcagaatta tattaaaaag aatggcgaag aaaaattact tcctggactt gacctaaatc 2041 acaaacaact atttttcttg aactttgcac aggtgtggtg tggaacctat aggccagagt 2101 atgcggttaa ctccattaaa acagatgtgc acagtccagg caatttcagg attattggga 2161 ctttgcagaa ctctgcagag ttttcagaag cctttcactg ccgcaagaat tcatacatga 2221 atccagaaaa gaagtgccgg gtttggtgat cttcaaaaga agcattgcag cccttggcta 2281 gacttgccaa caccacagaa atggggaatt ctctaatcga aagaaaatgg gccctagggg 2341 tcactgtact gacttgaggg tgattaacag agagggcacc atcacaatac agataacatt 2401 aggttgtcct agaaagggtg tggagggagg aagggggtct aaggtctatc aagtcaatca 2461 tttctcactg tgtacataat gcttaatttc taaagataat attactgttt atttctgttt 2521 ctcatatggt ctaccagttt gctgatgtcc ctagaaaaca atgcaaaacc tttgaggtag 2581 accaggattt ctaatcaaaa gggaaaagaa gatgttgaag aatacagtta ggcaccagaa 2641 gaacagtagg tgacactata gtttaaaaca cattgcctaa ctactagttt ttacttttat 2701 ttgcaacatt tacagtcctt caaaatcctt ccaaagaatt cttatacaca ttggggcctt 2761 ggagcttaca tagttttaaa ctcatttttg ccatacatca gttattcatt ctgtgatcat 2821 ttattttaag cactcttaaa gcaaaaaatg aatgtctaaa attgtttttt gttgtacctg 2881 ctttgactga tgctgagatt cttcaggctt cctgcaattt tctaagcaat ttcttgctct 2941 atctctcaaa acttggtatt tttcagagat ttatataaat gtaaaaataa taatttttat 3001 atttaattat taactacatt tatgagtaac tattattata ggtaatcaat gaatattgaa 3061 gtttcagctt aaaataaaca gttgtgaacc aagatctata aagcgatata cagatgaaaa 3121 tttgagacta tttaaactta taaatcatat tgatgaaaag atttaagcac aaactttagg 3181 g // ¢01
2-Ž& 2. PDE typu 1
LOKUS
DEFINITICE
PŘÍRŮSTEK
VERZE
KLÍČOVÁ
SLOVA
ZDROJ
ORGANISMUS
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
JOURNAL
ZNAKY source • · ·«· ··· ···· ··· ·· ··· ·· ····
HSPDE1A3A 2008 bp mRNA PRI 12-APR-1996
Lidská mRNA pro 3',5' cyklický nukleotid fosfodiesterasu(HSPDE1A3A) úplná kódující sekvence.
U40370
U40370.1 GI:1151108
Kalmodulin-stimulovaná fosfodiesterasa.
člověk.
Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
(báze 1 až 2008)
Loughney,K., Martins,T.J., Harris,E.A., Sadhu,K., Hicks,J.B., Sonnenburg,W.K., Beavo,J.A. a Ferguson,K.
Isolation and characterization of cDNAs corresponding to two human calcium, calmodulin-regulated, 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterases
J. Biol. Chem. 271 (2), 796-806 (1996)
96132810 (báze 1 až 2008)
Loughney,K., Martins,T.J., Harris,E.A.S., Sadhu,K., Hicks,J.B., Sonnenburg,W.K., Beavo,J.A. a Ferguson,K. přímé podání podala (7. 11. 1995) Kate Loughney, ICOS, 22021 20th Ave. S.E., Bothell, WA 98021, USA
Poloha/kvalifikátory 1 . .2008 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 gen 1. .2008 /gen=PDElA kódující sekv. 85..1692 /gen=PDElA /označení=PDElA3; fosfodiesterasa typu I /kodon_start=l /produkt=3',5' cyklický nukleotid fosfodiesterasa /protein_id=AAC50436.1 /db_xref=GI:1151109 /trans1ace= MGSSATEIEELENTTFKYLTGEQTEKMWQRLKGILRCLVKQLER GDVNWDLKKNIEYAASVLEAVYIDETRRLLDTEDELSDIQTDSVPSEVRDWLASTFT RKMGMTKKKPEEKPKFRSIVHAVQAGIFVERMYRKTYHMVGLAYPAAVIVTLKDVDKW SFDVFALNEASGEHSLKFMIYELFTRYDLINRFKIPVSCLITFAEALEVGYSKYKNPY HNLIHAADVTQTVHYIMLHTGIMHWLTELEILAMVFAAAIHDYEHTGTTNNFHI QTRS DVAI LYNDRSVLENHHVSAAYRLMQEEEMNI L INLSKDDWRDLRNLVIEMVLSTDMSG HFQQIKNIRNSLQQPEGIDRAKTMSLILHAADISHPAKSWKLHYRWTMALMEEFFLQG DKEAELGLPFSPLCDRKSTMVAQSQIGFIDFIVEPTFSLLTDSTEKIVIPLIEEASKA ETSSYVASSSTTIVGLHIADALRRSNTKGSMSDGSYSPDYSLAAVDLKSFKNNLVDII QQNKERWKELAAQEARTSSQKCEFIHQ
POČET BÁZÍ 627 a 400 C 437 g 544 t
PŮVOD gaattctgat gtgcttcagt gcacagaaca gtaacagatg agctgctttt ggggagagct 61 tgagtactca gtcggagcat catcatgggg tctagtgcca cagagattga agaattggaa 121 aacaccactt ttaagtatct tacaggagaa cagactgaaa aaatgtggca gcgcctgaaa 181 ggaatactaa gatgcttggt gaagcagctg gaaagaggtg atgttaacgt cgtcgactta 241 aagaagaata ttgaatatgc ggcatctgtg ctggaagcag tttatatcga tgaaacaaga 301 agacttctgg atactgaaga tgagctcagt gacattcaga ctgactcagt cccatctgaa 361 gtccgggact ggttggcttc tacctttaca cggaaaatgg ggatgacaaa aaagaaacct 421 gaggaaaaac caaaatttcg gagcattgtg catgctgttc aagctggaat ttttgtggaa 481 agaatgtacc gaaaaacata tcatatggtt ggtttggcat atccagcagc tgtcatcgta
- 2-3-0- ·· · *· ·· • ·· · ·· · • · · * · • · · · · · • · · · · ·· ·· · ·« ····
541 acattaaagg atgttgataa atggtctttc gatgtatttg ccctaaatga agcaagtgga 601 gagcatagtc tgaagtttat gatttatgaa ctgtttacca gatatgatct tatcaaccgt 661 ttcaagattc ctgtttcttg cctaatcacc tttgcagaag ctttagaagt tggttacagc 721 aagtacaaaa atccatatca caatttgatt catgcagctg atgtcactca aactgtgcat 781 tacataatgc ttcatacagg tatcatgcac tggctcactg aactggaaat tttagcaatg 841 gtctttgctg ctgccattca tgattatgag catacaggga caacaaacaa ctttcacatt 901 cagacaaggt cagatgttgc cattttgtat aatgatcgct ctgtccttga gaatcaccac 961 gtgagtgcag cttatcgact tatgcaagaa gaagaaatga atatcttgat aaatttatcc
1021 aaagatgact ggagggatct tcggaaccta gtgattgaaa tggttttatc tacagacatg 1081 tcaggtcact tccagcaaat taaaaatata agaaacagtt tgcagcagcc tgaagggatt 1141 gacagagcca aaaccatgtc cctgattctc cacgcagcag acatcagcca cccagccaaa 1201 tcctggaagc tgcattatcg gtggaccatg gccctaatgg aggagttttt cctgcaggga 1261 gataaagaag ctgaattagg gcttccattt tccccacttt gtgatcggaa gtcaaccatg 1321 gtggcccagt cacaaatagg tttcatcgat ttcatagtag agccaacatt ttctcttctg 1381 acagactcaa cagagaaaat tgttattcct cttatagagg aagcctcaaa agccgaaact 1441 tcttcctatg tggcaagcag ctcaaccacc attgtggggt tacacattgc tgatgcacta 1501 agacgatcaa atacaaaagg ctccatgagt gatgggtcct attccccaga ctactccctt 1561 gcagcagtgg acctgaagag tttcaagaac aacctggtgg acatcattca gcagaacaaa 1621 gagaggtgga aagagttagc tgcacaagaa gcaagaacca gttcacagaa gtgtgagttt 1681 attcatcagt aaacaccttt aagtaaaacc tcgtgcatgg tggcagctct aatttgacca 1741 aaagacttgg agattttgat tatgcttgct ggaaatctac cctgtcctgt gtgagacagg 1801 aaatctattt ttgcagattg ctcaataagc atcatgagcc .acataaataa cagctgtaaa 1861 ctccttaatt caccgggctc aactgctacc gaacagattc atctagtggc tacatcagca 1921 ccttgtgctt tcagatatct gtttcaatgg cattttgtgg catttgtctt taccgagtgc 1981 caataaattt tctttgagca aaaaaaaa //
3. PDE typu 2
LOKUS
DEFINITION z JOL —
• · ··· «·· ···· ··· ·· *·· ·« ····
HSU67733 4240 bp mRNA PRI 21-MAY-1997
Lidská mRNA pro cGMP-stimulovanou 31,5'-cyclický nukleotid fosfodiesterasu PDE2A3 (PDE2A), úplná kódující sekvence.
PRIRUSTEK U67733
VERZE U67733.1 GI:2108051
KLÍČOVÁ SLOVA
ZDROJ člověk.
ORGANISMUS Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini 1 (báze 1 až 4240)
REFERENCE
AUTOŘI
Rosman,G.J., Martins,T.J., Sonnenburg,W.
Vertebrata; Euteleostomi;
; Hominidae; Homo.
K., Beavo,J.A., Ferguson,K.
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
JOURNAL a Loughney,K.
Isolation and characterízation of human cDNAs encoding a cGMP-stimulated 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase
Gene 191 (1), 89-95 (1997)
97354299 (báze 1 až 4240)
Rosman,G.J., Martins,T.J., Sonnenburg,W.K. , Beavo,J.A., Ferguson,K. a Loughney,K. přímé podání podal (21. 8. 1996) Icos Corporation, 22021 20th Ave. S.E.,
Bothell, WA 98021, USA
ZNAKY
Pozice/kvalifikátory zdroj 1. .4240 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 gen 1. .4240 /gen=PDE2A kódující sekv. 162..2987 /gen=PDE2A /funkce=cGMP-stimulovaná 35'-cyklický nukleotid fosfodiesterasa /označení=PDE2 rodina; varianta sestřihu 3 /kodon_start=l /produkt=PDE2A3 /protein_id=AAC51320.1 /db_xref=GI:2108052 /translace= MGQACGHSILCRSQQYPAARPAEPRGQQVFLKPDEPPPPPQPCA DSLQDALLSLGSVIDISGLQRAVKEALSAVLPRVETVYTYLLDGESQLVCEDPPHELP QEGKVREAIISQKRLGCNGLGFSDLPGKPLARLVAPLAPDTQVLVMPLADKEAGAVAA VILVHCGQLSDNEEWSLQAVEKHTLVALRRVQVLQQRGPREAPRAVQNPPEGTAEDQK GGAAYTDRDRKILQLCGELYDLDASSLQLKVLQYLQQETRASRCCLLLVSEDNLQLSC KVIGDKVLGEEVSFPLTGCLGQWEDKKSIQLKDLTSEDVQQLQSMLGCELQAMLCVP VISRATDQWALACAFNKLEGDLFTDEDEHVIQHCFHYTSTVLTSTLAFQKEQKLKCE CQALLQVAKNLFTHLDDVSVLLQEIITEARNLSNAEICSVFLLDQNELVAKVFDGGW DDESYEIRIPADQGIAGHVATTGQILNIPDAYAHPLFYRGVDDSTGFRTRNILCFPIK NENQEVIGVAELVNKINGPWFSKFDEDLATAFSIYCGISIAHSLLYKKVNEAQYRSHL ANEMMMYHMKVSDDEYTKLLHDGIQPVAAIDSNFASFTYTPRSLPEDDTSMAILSMLQ DMNFINNYKIDCPTLARFCLMVKKGYRDPPYHNWMHAFSVSHFCYLLYKNLELTNYLE DIΕIFALFIS CMCHDLDHRGTNNS FQVAS KS VLAALYS SEGSVMERHHFAQAI AILNT HGCNIFDHFSRKDYQRMLDLMRDIILATDLAHHLRIFKDLQKMAEVGYDRNNKQHHRL LLCLLMTSCDLSDQTKGWKTTRKIAELIYKEFFSQGDLEKAMGNRPMEMMDREKAYIP ELQI S FMEHIAMPIYKLLQDLFPKAAELYERVASNREHWTKVSHKFTIRGLPSNNSLD FLDEEYEVPDLDGTRAPINGCCSLDAE
POČET BÁZÍ 902 a 1260 c 1202 g 876 t
PŮVOD cagcagagct ggattggggt gttgagtcca ggctgagtag ggggcagccc actgctcttg 61 gtccctgtgc ctgctggggg tgccctgccc tgaactccag gcagcgggga cagggcgagg ·· · φφ · φφ φφ • φ φφ φφφφ φφφφ • · φφφ φφ φ
Μ,
2^2- φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφ φφφφ
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
3121
3181
3241
3301
3361
3421
3481
3541
3601
3661
3721 tgccacctta actccatcct agcaggtctt tgcaggacgc tcaaggaggc atggtgagtc tccgggaggc tgccagggaa tcatgccgct gccagctgag ccctgcggag agaacccccc accgcaagat tcaaagtgct tgtcggagga aggtcagctt agctgaagga tgcaggccat cctgcgcctt agcactgctt agaaactcaa tggatgacgt cagagatctg ggggcgtggt gacacgtggc tctaccgcgg tcaagaacga catggttcag gcatcgccca ccaatgagat atgatgggat ctcgttccct atttcatcaa agaagggcta tctgctacct ttgccttgtt tccaggtggc agaggcacca atcatttctc ccacagacct gctacgaccg gtgacctctc acaaagaatt tgatggaccg caatgcccat gcgtggcctc tcccaagtaa gcactagggc acttccctgc cagagccacg ccttcctggg gactttgtaa tgcacctctg atggtttctc tcccaccctt agagtgtggc gaaggccccc ggccccagga gagaagcagg atgaatgagc tctgggccaa gtctggctgg ctgcaggagc cctcaagccg cttgctgagt cctgtcagct ccagctggtg tatcatctcc gcccttggcc agcggacaag tgataatgag ggtgcaggtc ggaggggacg cctccaactg ccaatacctg caatctccag tcccttgaca cctcacctcc gctctgtgtc caacaagcta ccactacacc gtgtgagtgc ctctgtcctg ctctgtgttc ggatgatgag gaccacgggc cgtggacgac gaaccaggag caagttcgac ttctctccta gatgatgtac ccagcctgtg gcccgaggat caactacaaa ccgggatccc gctctacaag tatttcctgc ctcgaaatct ctttgctcag ccggaaggac ggcccaccat aaacaacaag tgaccagacc cttctcccag ggagaaggcc ctacaagctg caaccgtgag caactcgctg ccccatcaat ccaggccacc ggtcctgggt cctcagcttt tttgcttctc accacacctt cttgccccat tgggtctcca atcttggaaa tgaggaccac agaagctggc atgggattga cagccatgct acagggagcg ggaggcggac cagcagtacc gacgagccgc ctgggctctg gtgctccccc tgtgaggacc cagaagcggc aggctggtgg gaggctgggg gaatggagcc ctgcagcagc gcggaagacc tgcggggaac cagcaggaga ctttcttgca ggatgcctgg gaggatgtac cctgtcatca gaaggagact agcaccgtgc caggctcttc ctccaggaga ctgctggatc agctatgaga cagatcctga agcaccggct gtcatcggtg gaggacctgg tacaaaaaag cacatgaagg gctgccattg gacacgtcca attgactgcc ccctaccaca aacctggagc atgtgtcatg gtgctggctg gccatcgcca tatcagcgca ctccgcatct cagcaccaca aagggctgga ggagacctgg tatatccctg ttgcaggacc cactggacca gacttcctgg ggctgctgca tcccacagcc cctagaccag ctcgtctgta tgagagcaca ggcaagtctt ttctgcccca ggatcctcat cagtccttag tactatactg cagaggggca tgggcaggag tcctcctgcc ggtaagacaa gatgaggagt cggcagcgcg cgccgccgcc tcatcgacat gagtggaaac ccccacatga tgggctgcaa ctccactggc ccgtggcagc tgcaggcggt gcgggcccag agaagggcgg tctacgacct cccgggcatc aggtcatcgg gccaggtggt aacagctgca gccgggccac tgttcaccga tcaccagcac tccaagtggc tcatcacgga agaatgagct tccgcatccc acatccctga tccgcacgcg tggccgagct cgacggcctt tgaatgaggc tctccgacga actccaattt tggccatcct cgaccctggc actggatgca tcaccaacta acctggacca cgctctacag tcctcaacac tgctggatct tcaaggacct gacttctcct agactacgag agaaggccat agctgcaaat tgttccccaa aggtgtccca atgaggagta gccttgatgc ctccactggt gacttcctgt taatggaagc ggggtgacca tcccaagcca ccagatcttt ggaaggggaa ttctgtggga atggtgggat gctcagtgct ggatccccgc tgtgtgacgc tccatgctct gatggggcag accggctgag gcagccatgc ttcaggcctg tgtctacacc gctgccccag tgggctgggc tcctgatacc tgtcatcttg ggagaagcat ggaggctccc ggcggcgtac ggatgcctct ccgctgctgc agacaaagtg ggaagacaag gagcatgttg tgaccaggtg cgaggacgag cctggccttc aaagaacctc ggccagaaac ggtggccaag ggccgatcag cgcatatgcc caacatcctc ggtgaacaag ctccatctac tcagtatcgc tgagtatacc tgcaagtttc gagcatgctg ccggttctgt cgccttttct cctcgaggac cagaggcaca ctctgagggc ccacggctgc gatgcgggac ccagaagatg ctgcctcctc aaagatcgcg gggcaacagg cagcttcatg agcggcagag caagttcacc cgaggtgcct tgagtgatcc ctggccagat gtgaccctgg aagacttcca atgagcagtg ttctttgtct gctcctttcc ggtgagacat ggactagaaa tgggacctgg ctgcagagag actgggagac tgggcgagtc aagatccatt gcatgcggcc ccgcggggcc gccgacagcc caacgtgctg tacctactgg gaggggaaag ttctcagacc caagtgctgg gtgcactgtg accctggtcg cgagccgtcc accgaccgcg tccctgcagc ctcctgctgg ctcggggaag aagtccatcc ggctgtgagc gtggccttgg catgtgatcc cagaaggaac ttcacccacc ctcagcaacg gtgttcgacg ggcatcgcgg catccgcttt tgcttcccca atcaatgggc tgcggcatca agccacctgg aaacttctcc acctataccc caggacatga ttgatggtga gtctcccact atcgagatct aacaactctt tccgtcatgg aacatctttg atcatcttgg gctgaggtgg atgacctcct gagctgatct ccgatggaga gagcacattg ctgtacgagc atccgcggcc gatctggatg cctccaggac gcactgggaa acaagtacta acctcacgga ggccctactc gagcagcttg ctttgaggac ctgagtgagc cagccgcggc gggatacagg gggccctggg aggcccaggt tcttcccctg ttagatcaat
- 222
999 4 ·
« 4 • 4 ·
«•4 4 //
3781 gtctaaaata gctctatggc tctgcggagt cccagcagag gctatggaat gtttctgcaa 3841 ccctaaggca cagagagcca accctgagtg tctcagaggc cccctgagtg ttccccttgg 3901 cctgagcccc ttacccattc ctgcagccag tgagagacct ggcctcagcc tggcagcgct 3961 ctcttcaagg ccatatccac ctgtgccctg gggcttggga gaccccatag gccgggactc 4021 ttgggtcagc ccgccactgg cttctctctt tttctccgtt tcattctgtg tgcgttgtgg 4081 ggtgggggag ggggtccacc tgccttacct ttctgagttg cctttagaga gatgcgtttt 4141 tctaggactc tgtgcaactg tcgtatatgg tcccgtgggc tgaccgcttt gtacatgaga 4201 ataaatctat ttctttctac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa mRNA ·* 0 · ·· • 9 • · • · • tet ··· ·♦ 0 • 0 00 · · • 00 • 00 ·· 000 «0
0 » 0 0 0 · • 00 0 0 0 0
0000
4. NPY
LOKUS HUMNPY 551 :
DEFINICE Lidská mRNA pro neuropeptid Y
PŘÍRŮSTEK K01911
VERZE K01911.1 GI:189273
KLÍČOVÁ
SLOVA neuropeptid Y.
ZDROJ Lidský feochromocytom, cDNA -
ORGANISMUS Homo sapiens
Eukaryota,· Metazoa; Chordata;
Mammalia; Eutheria; Primates;
REFERENCE 1 (báze 1 až 551)
mRNA, klon pNPY3-75.
PRI 07-JAN-1995
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
KOMENTÁŘ
ZNAKY zdroj mRNA gen
Minth,C.D., Bloom,S.R., Polák,J.M. a Dixon,J.E.
Cloning, characterization, and DNA sequence of a human cDNA encoding neuropeptide tyrosine
Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81 (14), 4577-4581 (1984)
84272678
Neuropeptid Y (NPY) je jeden z nejhojnějších peptidů v nervovém systému savců a jeho rozsáhlá distribuce svědčí pro jeho neurotransmiterovou nebo neuromodulátorovou roli. NPY byl také nalezen v některých chromafinních buňkách dřeně nadledvinek.
Pozice/kvalifikátory 1. . 551 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 /map=7pter-q22 /typ_tkáně=feochromocytom <1. .551 /gen=NPY /označení=G00-119-456
1. .551 /gen=NPY kódující sekv. 87..380 /gen=NPY /kodon_start=l /produkt=neuropeptid Y /protein_id=AAA59944.1 /db_xref=GI:189274 /db_xref=GDB:G00-119-456 /1 rans1ac e = MLGNKRLGLSGLTLALSLLVCLGALAEAYPSKPDNPGEDAPAED MARYYSALRHYINLITRQRYGKRSSPETLISDLLMRESTENVPRTRLEDPAMW sig_peptid 87..170 /gen=NPY /označení=G00-119-456 mat_peptid 171..278 /gen=NPY /označení=G00-119-456 /produkt=neuropeptide Y
POČET BÁZÍ 131 a 171 c 129 g 120 t
PŮVOD 51 bp před Rsal místem.
accccatccg ctggctctca cccctcggag acgctcgccc gacagcatag tacttgccgc ccagccacgc ccgcgcgcca gccaccatgc taggtaacaa gcgactgggg ctgtccggac
121 tgaccctcgc cctgtccctg ctcgtgtgcc tgggtgcgct ggccgaggcg tacccctcca
181 agccggacaa cccgggcgag gacgcaccag cggaggacat ggccagatac tactcggcgc
241 tgcgacacta catcaacctc atcaccaggc agagatatgg aaaacgatcc agcccagaga
301 cactgatttc agacctcttg atgagagaaa gcacagaaaa tgttcccaga actcggcttg
361 aagaccctgc aatgtggtga tgggaaatga gacttgctct ctggcctttt cctattttca
421 gcccatattt catcgtgtaa aacgagaatc cacccatcct accaatgcat gcagccactg
481 tgctgaattc tgcaatgttt tcctttgtca tcattgtata tatgtgtgtt taaataaagt
541 atcatgcatt c
5. Receptor NPY Yl
- 235--
A26481 2624 bp mRNA cDNA genu pro lidský receptor NPY Yl. A26481
A26481.1 GI:1247452
PAT 17-OCT-1995
LOKUS
DEFINITICE PŘÍRŮSTEK VERZE
KLÍČOVÁ SLOVA ZDROJ člověk.
ORGANISMUS Homo sapiens
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
ZNAKY
Zdroj
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
(báze 1 až 2624)
LIDSKÝ RECEPTOR NEUROPEPTIDU Y-Yl
Patent: WO 9309227-A 3 13. květen 1993 ;
Pozice/kvalifikátory 1. .2624 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 kódující sekv.
POČET BÁZI PŮVOD
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
791 attgttcagt gggaataaga aaaataatct aaatcattca tgatgattgt gatcattctt gatgagaaat catcatgtgt ggcgatgtgt tctggttctc aaataataga tttgcctttc tgcgtacaaa ttataccact ctacttcaag caataagtac agcatttgca tcagatcatt gatatccact cttgcagttc agccatgtcc cgcatttaaa tatggtcccg tgttctccca ttttttactg gggtcttctg tataatataa
152..1306 /kodon_start=l /produkt=receptor neuropeptid Y Yl /protein_id=CAA01819.1 /db_xref=GI:1247453 /db_xre f =SWISS-PROT:P2 5 9 2 9 /1 ranslace=MNSTLFSQVENHSVHSNFSEKNAQLLAFENDDCHLPLAMIFTLA LAYGAVIILGVSGNLALIIIILKQKEMRNVTNILIVNLSFSDLLVAIMCLPFTFVYTL MDHWVFGEAMCKLNPFVQCVSITVSIFSLVLIAVERHQLIINPRGWRPNNRHAYVGIA VIWVLAVASSLPFLIYQVMTDEPFQNVTLDAYKDKYVCFDQFPSDSHRLSYTTLLLVL QYFGPLCFIFICYFKIYIRLKRRNNMMDKMRDNKYRSSETKRINIMLLSIWAFAVCW LPLTIFNTVFDWNHQIIATCNHNLLFLLCHLTAMISTCVNPIFYGFLNKNFQRDLQFF FNFCDFRS RDDDYETIAMSTMHTDVS KTSLKQAS PVAFKKINNNDDNEKI a 479 c 473 g 878 t 3 jiné tcaagggaat gaagaattca gaataatttt ggtaaatgga ttccaatatc ataagctgaa cagttgacct gctttgaaga aacatactgt ccatttgtct ataacaacca aaccaatcaa aatgaattca acattatttt cccaggttga gtccactcta atttctcaga gaagaatgcc cagcttctgg cttttgaaaa catctgccct tggccatgat atttacctta gctcttgctt atggagctgt ggtgtctctg gaaacctggc cttgatcata atcatcttga aacaaaagga gttaccaaca tcctgattgt gaacctttcc ttctcagact tgcttgttgc ctccccttta catttgtcta cacattaatg gaccactggg tctttggtga aagttgaatc cttttgtgca atgtgtttca atcactgtgt ccattttctc attgctgtgg aacgacatca gctgataatc aaccctcgag ggtggagacc catgcttatg taggtattgc tgtgatttgg gtccttgctg tggcttcttc ctgatctacc aagtaatgac tgatgagccg ttccaaaatg taacacttga gacaaatacg tgtgctttga tcaatttcca tcggactctc ataggttgtc ctcctcttgg tgctgcagta ttttggtcca ctttgtttta tatttatttg atatatatac gcctaaaaag gagaaacaac atgatggaca agatgagaga aggtccagtg aaaccaaaag aatcaatatc atgctgctct ccattgtggt gtctgctggc tccctcttac catctttaac actgtgtttg attggaatca gctacctgca accacaatct gttattcctg ctctgccacc tcacagcaat tgtgtcaacc ccatatttta tgggttcctg aacaaaaact tccagagaga ttcttcaact tttgtgattt ccggtctcgg gatgatgatt atgaaacaat acgatgcaca cagatgtttc caaaacttct ttgaagcaag caagcccagt aaaatcaaca acaatgatga taatgaaaaa atctgaaact acttatagcc gatgacatct gtttaaaaac aagcacaacc tgcaacatac tttgattacc aggaatgggg ttgaaatcat ttgaaaatga ctaagatttt cttgtcttgc cttttgttgt agtgtcataa ttacatttgg aacaaaaggt gtgggctttg gaaatagttt tgaccagaca tctttgaagt gctttttgtg aatttatgca agacttttat actgtactta ttggaatgaa atttctttaa agtattacga //0
1621 tnnnctgact tcagaagtac ctgccatcca atacggtcat tagattgggt catcttgatt 1681 agattagatt agattagatt gtcaacagat tgggccatcc ttactttatg ataggcatca 1741 ttttagtgtg ttacaatagt aacagtatgc aaaagcagca ttcaggagcc gaaagatagt 1801 cttgaagtca ttcagaagtg gtttgaggtt tctgtttttt ggtggttttt gtttgttttt 1861 tttttttttc accttaaggg aggctttcat ttcctcccga ctgattgtca cttaaatcaa 1921 aatttaaaaa tgaataaaaa gacatacttc tcagctgcaa atattatgga gaattgggca 1981 cccacaggaa tgaagagaga aagcagctcc ccaacttcaa aaccattttg gtacctgaca 2041 acaagagcat tttagagtaa ttaatttaat aaagtaaatt agtattgctg caaatagcta 2101 aattatattt atttgaattg atggtcaaga gattttccat tttttttaca gactgttcag 2161 tgtttgtcaa gcttctggtc taatatgtac tcgaaagact ttccgcttac aatttgtaga 2221 aacacaaata tcgttttcca tacagcagtg cctatatagt gactgatttt aactttcaat 2281 gtccatcttt caaaggaagt aacaccaagg tacaatgtta aaggaatatt cactttacct 2341 agcagggaaa aatacacaaa aactgcagat acttcatata gcccatttta acttgtataa 2401 actgtgtgac ttgtggcgtc ttataaataa tgcactgtaa agattactga atagttgtgt 2461 catgttaatg tgcctaattt catgtatctt gtaatcatga fctgagcctca gaatcatttg 2521 gagaaactat attttaaaga acaagacata cttcaatgta ttatacagat aaagtattac 2581 atgtgtttga ttttaaaagg gcggacattt tattaaaatc aagg // • · • · • · · · · · ·
1200 bp mRNA PRI 14-NOV-1995 receptor lidského neuropeptidu Y/peptidu YY Y2, úplná sekvence.
GI:1063633
6. Receptor NPY Y2
LOKUS
DEFINICE
PŘÍRŮSTEK
VERZE
HSU36269 mRNA pro kóduj ící U36269 U36269.1
KLICOVA SLOVA ZDROJ člověk.
ORGANISMUS
Ml
- 2ΎΤ-Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (báze 1 až 1200)
AUTOŘI Gerald,C., Walker,M.W., Vaysse,P.J., He,C., Branchek,T.A. a Weinshank,R.L.
NÁZEV Expression cloning and pharmacological characterization of a human hippocampal neuropeptide Y/peptide YY Y2 receptor subtype
ČASOPIS J. Biol. Chem. 270 (45), 26758-26761 (1995)
MEDLINE 96070760
REFERENCE 2 (báze 1 až 1200)
AUTOŘI Gerald,C.A.
TITLE přímé podání
JOURNAL podal (13. 9. 1995) Christophe A. Gerald, Synaptic
Pharmaceutical Corporation, Molecular Biology, 215 College Road, Paramus, NJ 07652, USA
ZNAKY Poloha/kvalifikátory zdroj 1. .1200 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 /klone=hhY2 /pohlaví=male /typ_tkáně=brain hippocampus /vývoj_stádium=dospělý
5'UTR 1..20 kódující sekv. 21..1166 /označení=receptor NPY/PYY Y2 'UTR POČET BÁZÍ PŮVOD /kodon_start=l /produkt=receptor neuropeptidu Y/peptidu YY Y2 /protein_id=AAC50281.1 /db_xref=GI:1063634 /translace= MGPIGAEADENQTVEEMKVEQYGPQTTPRGELVPDPEPELIDST KLIEVQWLILAYCSIILLGVIGNSLVIHWIKFKSMRTVTNFFIANLAVADLLVNTL CLPFTLTYTLMGEWKMGPVLCHLVPYAQGLAVQVSTITLTVIALDRHRCIVYHLESKI S KR IS FL11GLAWGIS ALLAS PLAIFREYS LIΕ11PDFEIVACTEKWPGE E KS IYGTV YSLSSLLILYVLPLGIISFSYTRIWSKLKNHVSPGAANDHYHQRRQKTTKMLVCWW FAVSWLPLHAFQLAVDIDSQVLDLKEYKLIFTVFHIIAMCSTFANPLLYGWMNSNYRK AFLSAFRCEQRLDAIHSEVSVTFKAKKNLEVRKNSGPNDSFTEATNV
1164..1200
292 a 295 c 299 g 314 t caagtggacc tgtactgaaa atgggtccaa taggtgcaga ggctgatgag aaccagacag 61 tggaagaaat gaaggtggaa caatacgggc cacaaacaac tcctagaggt gaactggtcc 121 ctgaccctga gccagagctt atagatagta ccaagctgat tgaggtacaa gttgttctca 181 tattggccta ctgctccatc atcttgcttg gggtaattgg caactccttg gtgatccatg 241 tggtgatcaa attcaagagc atgcgcacag taaccaactt tttcattgcc aatctggctg 301 tggcagatct tttggtgaac actctgtgtc taccgttcac tcttacctat accttaatgg 361 gggagtggaa aatgggtcct gtcctgtgcc acctggtgcc ctatgcccag ggcctggcag 421 tacaagtatc cacaatcacc ttgacagtaa ttgccctgga ccggcacagg tgcatcgtct 481 accacctaga gagcaagatc tccaagcgaa tcagcttcct gattattggc ttggcctggg 541 gcatcagtgc cctgctggca agtcccctgg ccatcttccg ggagtattcg ctgattgaga 601 tcatcccgga ctttgagatt gtggcctgta ctgaaaagtg gcctggcgag gagaagagca •IW
- 2^8- -
• · · · · · • · · · · · · · · · ·
661 tctatggcac tgtctatagt ctttcttcct tgttgatctt gtatgttttg cctctgggca 721 ttatatcatt ttcctacact cgcatttgga gtaaattgaa gaaccatgtc agtcctggag 781 ctgcaaatga ccactaccat cagcgaaggc aaaaaaccac caaaatgctg gtgtgtgtgg 841 tggtggtgtt tgcggtcagc tggctgcctc tccatgcctt ccagcttgcc gttgacattg 901 acagccaggt cctggacctg aaggagtaca aactcatctt cacagtgttc cacatcatcg 961 ccatgtgctc cacttttgcc aatccccttc tctatggctg gatgaacagc aactacagaa
1021 aggctttcct ctcggccttc cgctgtgagc agcggttgga tgccattcac tctgaggtgt 1081 ccgtgacatt caaggctaaa aagaacctgg aggtcagaaa gaacagtggc cccaatgact 1141 ctttcacaga ggctaccaat gtctaaggaa gctgtggtgt gaaaatgtat ggatgaattc // /33
3-2-9- 8. VIP
LOKUS VIP 1511 bp mRNA PRI 19-MAR-1999
DEFINICE mRNA pro vasoaktivní intestinální peptid (VIP) Homo sapiens.
PŘÍRŮSTEK NM_003381
NID g4507896
VERZE NM_003381.1 Gl:4507896
KLÍČOVÁ SLOVA
ZDROJ člověk.
ORGANISMUS Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
(báze 1 až 1511)
DeLamarter,J.F., Buell,G.N., Kawashima, E., Polák,J.M. a
Bloom,S.R.
Vasoactive intestinal peptide: expression of the prohormone in bacterial cells
Peptides 6 Suppl 1, 95-102 (1985)
86016352
REFSEQ: Tato sekvence byla odvozena z M36634.1.
PŘEDBĚŽNÁ RefSEQ: Tento záznam referenční sekvence je předběžný a dosud nebyl podroben lidské kontrole. Konečný revidovaný záznam referenční sekvence se od něho může poněkud lišit.
Pozice/kvalifikátory
1.. 1511 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 /chromosom=6 /mapa=6q26-q27 /typ_tkáně=pankreatický tumor
1..1511 /gen=VIP /db_xref=MIM:192320 /db_xref=LocusID:7432
67.. 129 /produkt=vasoaktivní intestinální peptid
67.. 579 /gen=VIP /kodon_start=l /produkt=vasoaktivní intestinální peptid /protein_id=NP_003372.1 /db_xref=PID:g4507897 /db_xref=GI .-4507897 /1 rans1ac e =MDTRNKAQLLVLLTLLSVLFSQTSAWPLYRAPSALRLGDRIPFE GANE PDQVS LKEDIDMLQNALAENDT P YYD VS RNARHADGVFTS DFS KLLGQLSAKKY LESLMGKRVS SNISEDPVPVKRHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGKRSS EGE SPDFPEELEK
307.. 387 /produkt=vasoaktivní intestinální peptid
439. .522 /produkt=vasoaktivní intestinální peptid
1326.. 1331
255 c 276 g 439 t
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
KOMENTÁŘ
COMMENT
ZNAKY zdroj gen sig_peptid kódující sekv.
mat_peptid mat_peptid polyA_signál POČET BÁZÍ 541
PŮVOD ggtcagctcc aaaacaatcc ggaacggcca gctccggggg agcacgactg ggcgagaggc acagaaatgg acaccagaaa taaggcccag ctccttgtgc tcctgactct tctcagtgtg
121 ctcttctcac agacttcggc atggcctctt tacagggcac cttctgctct caggttgggt
181 gacagaatac cctttgaggg agcaaatgaa cctgatcaag tttcattaaa agaagacatt
241 gacatgttgc aaaatgcatt agctgaaaat gacacaccct attatgatgt atccagaaat
301 gccaggcatg ctgatggagt tttcaccagt gacttcagta aactcttggg tcaactttct
361 gccaaaaagt accttgagtc tcttatggga aaacgtgtta gcagtaacat ctcagaagac
- 2-4-θ421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501 cctgfcaccag aaacaaatgg ggagaatctc agctgatgac ttagattcta tgtgttgtga aatagtattt gctgtatatc aattatatga gagtgtactt taagcagatg ataaaaagac ggcaaccttt aggctctctc ttccctttct tcaataataa ttctgtgaaa gagagaaaat aaaaaaaaaa tcaaacgtca ctgtaaagaa ccgactttcc aacttcccag cataagtaat atgttgtgat gagagttcta ctttctaaca gacgtttttg aactattcag gaatgctgtg attcttccaa atttttaatg ctgatagtct gcttgtgtta atatttttgc tacattttgg aaagaccttg a
ctcagatgca atatttgaac agaagagtta tgaattcttg tcaagaaaac gtattctagc aattttgtct aaaaaatata gaagagtagt gagagtagaa ttaaataaac aaagattttc gtgttttaaa ttcagttaag agtatgtgta cataatgact agacacaact cttatgattg gtcttcactg tcaattctga gaaaaatgat aaggaaaatg aacttcaata taatgtaata ttaactcata ttttaatgat aatagagcaa cagataatca ctcaaaatgt agaaaatatt aaatctcaaa gagaacgacc aaatgtgaag cagaatattg atttttccaa cagataaaaa acaactatac atggaaagag gaaaaagacc atacgcaaca tccaaaccaa actgtgaagt aaaagcctgc aagtaatgct aattgatgtg gtgtgtctaa ctaagatagt atgtgtttcc tttggattgc cctgcttctg tgaatgaaac ctttggtcat aataatttta aaaaaaaaaa ccgccttaga gagcagtgag tttggagcaa taattaaatt ataaaaatat ttacattgta aatttcatat aggttaatcc tttatttata atttgaatgt aacaatgaag atattttata taatcaccaa acactgaaac actcagttgt atgagcttcc agaaatcaaa aaaaaaaaaa //
2-4-i -
9. Receptor VPAC1
LOKUS VIP 1511 bp mRNA
DEFINICE mRNA pro vasoaktivní intestinální
PŘÍRŮSTEK NM_003381
NID g4507896
VERZE NM 003381.1 GI:4507896
KLÍČOVÁ SLOVA
ZDROJ člověk.
ORGANISMUS Homo sapiens
PRI 19-MAR-1999
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
(báze 1 až 1511)
DeLamarter,J.F., Buell,G.N., Kawashima,E., Polák,J.M. a Bloom,S.R.
Vasoactive intestinal peptide: expression of the prohormone in bacterial cells
Peptides 6 Suppl 1, 95-102 (1985)
86016352
REFSEQ: Tato sekvence byla odvozena z M36634.1.
PŘEDBĚŽNÁ RefSEQ: Tento záznam referenční sekvence je předběžný a dosud nebyl podroben lidské kontrole. Konečný revidovaný záznam referenční sekvence se od něho může poněkud lišit.
Pozice/kvalifikátory 1. .1511 /organismus=Homo sapiens /db_xref=taxon:9606 /chromosom=6 /mapa=6q2 6-g2 7 /typ_tkáně=pankreatický tumor
1..1511 /gen=VIP /db_xref=MIM:192320 /db_xref=LocusID:7432
67. .129 /produkt=vasoaktivní intestinální peptid
67. .579 /gen=VIP /kodon_start=l /produkt=vasoaktivní intestinální peptid /protein_id=NP_003372.1 /db_xref=PID:g4507897 /db_xref=GI:4507897 /translace=MDTRNKAQLLVLLTLLSVLFSQTSAWPLYRAPSALRLGDRIPFE GANEPDQVSLKEDIDMLQNALAENDTPYYDVSRNARHADGVFTSDFSKLLGQLSAKKY LESLMGKRVSSNISEDPVPVKRHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGKRSSEGE SPDFPEELEK mat_peptid 307..387 /produkt=vasoaktivní intestinální peptid mat_peptid 439..522 /produkt=vasoaktivní intestinální peptid polyA_signál 1326..1331
POČET BÁZÍ 541 a 255 c 276 g 439 t
PŮVOD ggtcagctcc aaaacaatcc ggaacggcca gctccggggg agcacgactg ggcgagaggc acagaaatgg acaccagaaa taaggcccag ctccttgtgc tcctgactct tctcagtgtg
121 ctcttctcac agacttcggc atggcctctt tacagggcac cttctgctct caggttgggt
181 gacagaatac cctttgaggg agcaaatgaa cctgatcaag tttcattaaa agaagacatt
241 gacatgttgc aaaatgcatt agctgaaaat gacacaccct attatgatgt atccagaaat
301 gccaggcatg ctgatggagt tttcaccagt gacttcagta aactcttggg tcaactttct
361 gccaaaaagt accttgagtc tcttatggga aaacgtgtta gcagtaacat ctcagaagac
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
KOMENTÁŘ
COMMENT
ZNAKY zdroj gen sig_peptid kódující sekv • · • · · · ·«
- -2-4-3- 421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501 cctgtaccag aaacaaatgg ggagaatctc agctgatgac ttagattcta tgtgttgtga aatagtattt gctgtatatc aattatatga gagtgtactt taagcagatg ataaaaagac ggcaaccttt aggctctctc ttccctttct tcaataataa ttctgtgaaa gagagaaaat aaaaaaaaaa tcaaacgtca ctgtaaagaa ccgactttcc aacttcccag cataagtaat atgttgtgat gagagttcta ctttctaaca gacgtttttg aactattcag gaatgctgtg attcttccaa atttttaatg ctgatagtct gcttgtgtta atatttttgc tacattttgg aaagaccttg a
ctcagatgca atatttgaac agaagagtta tgaattcttg tcaagaaaac gtattctagc aattttgtct aaaaaatata gaagagtagt gagagtagaa ttaaataaac aaagattttc gtgttttaaa ttcagttaag agtatgtgta cataatgact agacacaact cttatgattg gtcttcactg tcaattctga gaaaaatgat aaggaaaatg aacttcaata taatgtaata ttaactcata ttttaatgat aatagagcaa cagataatca ctcaaaatgt agaaaatatt aaatctcaaa gagaacgacc aaatgtgaag cagaatattg atttttccaa cagataaaaa acaactatac atggaaagag gaaaaagacc atacgcaaca tccaaaccaa actgtgaagt aaaagcctgc aagtaatgct aattgatgtg gtgtgtctaa ctaagatagt atgtgtttcc tttggattgc cctgcttctg tgaatgaaac ctttggtcat aataatttta aaaaaaaaaa ccgccttaga gagcagtgag tttggagcaa taattaaatt ataaaaatat ttacattgta aatttcatat aggttaatcc tttatttata atttgaatgt aacaatgaag atattttata taatcaccaa acactgaaac actcagttgt atgagcttcc agaaatcaaa aaaaaaaaaa //
10. Receptor VPAC2
LOKUS
DEFINICE
PŘÍRŮSTEK
VERZE
KLÍČOVÁ
SLOVA
ZDROJ
ORGANISM
REFERENCE
AUTOŘI
NÁZEV
ČASOPIS
MEDLINE
ZNAKY zdroj • ·· · •·» ·· ·
HUMHVRP 1640 bp mRNA PRI 16-FEB-1995
Lidský helodermin-preferující VIP receptor (VIP2/PACAP receptor) mRNA, úplná kódující sekvence.
L36566
L36566.1 GI:550477
PACAP receptor; VIP receptor; helodermin-preferující VIP receptor. Homo sapiens cDNA - mRNA.
Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
(báze 1 až 1640)
Svoboda,M., Tastenoy,M., Van Rampelbergh,J., Goossens,J.F., De Neef,P., Waelbroeck,M. a Robberecht,P.
Molecular cloning and functional characterization of a human VIP receptor from SUP-ΤΙ lymphoblasts
Biochem. Biophys. Res. Commun. 205 (3), 1617-1624 (1994)
95110300
Pozice/kvalifikátory sig_peptid
1. . 1640 /organismus=Homo sapiens / db__xr e f = t axon: 9 6 0 6 /buněč_linie=SUP TI lymfoblast /klone_knih=lamda ZAP II
163 . .231 /označení=putativní; putativní kódující sekv. 163..1479 /funkce=VIP a PACAP receptor /označení=lidský VIP2 receptor byl dříve nazýván 1helodermin-preferující VIP receptor1; transmembránové domény jsou umístěny v polohách: 637-696; 772-844; 880-948; 1003-1071; 1147-1209; 1243-1302.; Potenciální glycosylační místa jsou umístěna v :334-336,- 424-426;
436-438.
mat_peptide
POČET BÁZÍ PŮVOD
121
181
241
301
361
421
481
315 cgggacgagg ctccgcgcac aggcggcggg cccgcgctgc tttcatctgg gaaaaacaca gtgggagaga ggaaacataa gatgcctgtg /kodon_start=l /protein_id=AAC37569.1 /db_xref=GI:550478 /translace= MRTLLPPALLTCWLLAPVNSIHPECRFHLEIQEEETKCTELLRS QTEKHKACSGVWDNITCWRPANVGETVTVPCPKVFSNFYSKAGNISKNCTSDGWSETF PDFVDACGYSDPEDESKITFYILVKAIYTLGYSVSLMSLATGSIILCLFRKLHCTRNY IHLNLFLSFILRAISVLVKDDVLYSSSGTLHCPDQPSSWVGCKLSLVFLQYCIMANFF WLLVEGLYLHTLLVAMLPPRRCFLAYLLIGWGLPTVCIGAWTAARLYLEDTGCWDTND HSVPWWVIRIPILIŠIIVNFVLFIS1IRILLQKLTS PDVGGNDQSQYKRLAKSTLLLI PLFGVHYMVFAVFPISISSKYQILFELCLGSFQGLWAVLYCFLNSEVQCELKRKWRS RCPTPSASRDYRVCGSSFSHNGSEGALQFHRASRAQSFLQTETSVI
232. .1476 /funkce=VIP a PACAP receptor /produkt =nepoj menovaný a 512 c 461 g 352 t gggcggcccc cgcgctcggg gcgctcggct acagctgcgg ggcccgaggt tcgctcccgg cccatgctgg aggcggcgga acccggggga cctaggacgg cgctgggcgg cccccggcac gctgagctcg ggatgcggac gctgctgcct tgacctgctg gctgctcgcc cccgtgaaca gcattcaccc agaatgccga aaatacagga ggaagaaaca aaatgtacag agcttctgag gtctcaaaca aagcctgcag tggcgtctgg gacaacatca cgtgctggcg gcctgccaat ccgtcacggt gccctgccca aaagtcttca gcaattttta cagcaaagca gcaaaaactg tacgagtgac ggatggtcag agacgttccc agatttcgtc gctacagcga cccggaggat gagagcaaga tcacgtttta tattctggtg ·« · ·· ·· • « 4 · ·*·« • · · · · * • · · · · · · • · · · · · • > ·♦· ·♦ <···
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621 aaggccattt attctgtgcc ctgtccttca tctggcacgt gtcttcctgc ctccacaccc atcggatggg gaagacaccg ccgattttaa ctgcagaagt gccaagtcca tttcccatca cagggcctgg aagcgaaaat ggttcctcct gcccagtcct gcggcgggag agatgcccga ccactaaacc ataccctggg tcttcaggaa tcctgagagc tgcactgccc agtactgcat tcctggtggc gcctccccac gttgctggga tttccatcat taacatcccc cgctcctgct gcatctcctc tggtggccgt ggcgaagccg tctcccacaa tcctgcaaac gcccacggtt gcaccgtgtc ccatacctgg ctacagtgtc gctgcactgc catctcagtg tgaccagcca catggccaac catgctcccc cgtctgcatc tacaaacgac cgtcaatttt agatgtcggc tatcccgctg caaataccag cctctactgt gtgcccgacc cggctcggag ggagacctcg cggggcttct gggcaggtca tctctgatgt accaggaatt ctggtcaagg tcctcctggg ttcttctggc cctagaaggt ggtgcatgga cacagtgtgc gtccttttca ggcaacgacc ttcggcgtcc atactgtttg ttcctgaaca ccgtccgcga ggcgccctgc gtcatctagc gcggggctga gcgcggtcct ctcttgcaac acatccacct acgacgttct tgggctgcaa tgctggtgga gcttcctggc ctgcggccag cctggtgggt ttagtattat agtctcagta actacatggt agctgtgcct gtgaggtgca gccgggatta agttccaccg cccacccctg gacgccggct gactccgtca aggaagcata gaacctgttc ctactccagc gctgagcctg ggggctctac ctacctcctg gctctactta catacgaata acgaattttg caagaggctg gtttgccgtg cgggtcgttc gtgcgagctg cagggtctgc cgcgtcccga cctgtcggac tcctccttcc agctggttgt //
PATENT _ O HA ' _ 2Γ27Τ7
OVÉ

Claims (35)

  1. NÁROKY
    1. Farmaceutická kompozice pro použití při léčení FSD, přednostně FSAD; vyznačující se tím že obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD, které je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, přičemž činidlem je inhibitor NEP EC 3.4.24.11 nebo I:NEP.
  2. 2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že činidlem je mediátor vasorelaxace pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris.
  3. 3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je kompozicí pro perorální podávání.
  4. 4. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že cAMP je endogenní cAMP.
  5. 5. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že kompozice se podává před sexuální stimulací nebo během ní.
  6. 6. Použití činidla při výrobě léčiva pro léčení FSD přednostně FSAD; přičemž toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech ženy, která trpí FSD, přednostně FSAD, a tímto činidlem je I:NEP.
  7. 7. Použití podle nároku 6, při němž je činidlem mediátor vasorelaxace pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris.
  8. 8. Použití podle nároku 6 nebo 7, při němž je léčivem léčivo pro perorální podávání.
  9. 9. Použití podle podle některého z nároků 6 až 8, při němž je cAMP endogenní cAMP.
  10. 10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9, při němž se kompozice podává před sexuální stimulací nebo během ní.
  11. 11. Způsob léčení žen, jako žen trpících FSD, přednostně FSAD, vyznačující se tím, že se ženě podává činidlo, které je schopné potencovat cAMP v pohlavních orgánech, v množství, které vyvolává potenciaci cAMP v pohlavních orgánech ženy; přičemž toto činidlo je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, a je jím I:NEP.
  12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se t í m , že činidlem je mediátor vasorelaxace pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris.
  13. 13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že činidlo se podává perorálně.
    14. Způsob podle některého Z nároků 11 až 13, v y z n a č u j í c í s e tím z že cAMP je endogenní cAMP. 15. Způsob podle některého Z nároků 11 až 14, v y z n a č u j í c í s e tím z že kompozice se podává
    před sexuální stimulací nebo během ní.
  14. 16. Způsob identifikace činidla, které je možno použít pro léčení FSD, zejména FSAD, vyznačutoto·· — 4? 9 9 —
    Ti tíZL to·· ·· · to · jící se tím, že se stanoví zda činidlo přímo nebo nepřímo potencuje cAMP, přičemž potenciace cAMP za přítomnosti činidla svědčí o tom, že činidlo může být užitečné při léčení FSD, zejména FSAD; a přičemž takovým činidlem je I:NEP.
  15. 17. Způsob, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) stupeň, při němž se provede způsob podle nároku 16;
    (b) stupeň, při němž se identifikuje jedno činidlo či větší počet činidel, která přímo nebo nepřímo potencují cAMP; a (c) stupeň, při němž se připraví množství tohoto činidla či většího počtu činidel;
    přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  16. 18. Způsob léčení FSD, zejména FSAD, potenciaci cAMP in vivo za použití činidla, vyznačuj ící se t í m , že činidlo je schopné přímo nebo nepřímo potencovat cAMP při zkoušce in vitro, přičemž zkouška in vitro se provádí způsobem podle nároku 16 a činidlem je I:NEP.
  17. 19. Použití činidla při výrobě farmaceutické kompozice pro léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž toto činidlo je při zkoušce in vitro prováděné způsobem podle nároku 16 schopné přímo nebo nepřímo potencovat cAMP, a přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  18. 20. Činidlo identifikované způsobem podle nárokiu 16, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  19. 21. Činidlo podle nároku 20 pro použití v lékařství, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  20. 22. Činidlo podle nároku 21 pro použití při léčení FSD, přednostně FSAD, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  21. 23. Léčivo pro perorální podávání za účelem léčení FSD, přednostně FSAD, vyznačující se tím, že obsahuje činidlo podle nároku 20, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  22. 24. Způsob stanovení diagnózy, vyznačující se tím, že se izoluje vzorek z ženského organismu, stanoví se, zda vzorek obsahuje entitu přítomnou v takovém množství, aby vyvolávala FSD, přednostně FSAD; přičemž tato entita má přímý nebo nepřímý účinek na hladinu nebo aktivitu cAMP v pohlavních orgánech ženy a tuto entitu je možno modulovat za účelem dosažení pozitivního účinku pomocí činidla, kterým je I:NEP.
  23. 25. Diagnostická kompozice nebo kit, vyznačující se tím, že obsahuje prostředek pro detekci entity v izolovaném vzorku ženského organismu, kterého je možno použít pro stanovení, zda vzorek obsahuje entitu a zda ji obsahuje v takovém množství, aby vyvolávala FSD, přednost ně FSAD; přičemž tato entita má přímý nebo nepřímý účinek na hladinu nebo aktivitu cAMP v pohlavních orgánech ženy a tuto entitu je možno modulovat za účelem dosažení pozitivního účinku pomocí činidla, kterým je I:NEP.
  24. 26. Zvířecí model používaný pro identifikaci činidel schopných léčit FSD, přednostně FSAD, vyznačující se tím, že zahrnuje anestetizovanou samici zvířete včetně prostředku pro měření změn prokrvení pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris, tohoto • · · ·
    - 2-34- - zvířete po stimulaci pelvického nervu; přičemž činidlem je
    I:NEP.
  25. 27. Způsob identifikace činidla, které je schopno přímo nebo nepřímo potencovat cAMP za účelem léčení FSD, přednostně FSAD, vyznačující se tím, že se zvířecímu modelu podle nároku 26 podává činidlo, a měří se jakákoliv potenciace cAMP a/nebo zvýšení prokrvení pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris tohoto zvířete; přičemž činidlem je I:NEP.
  26. 28. Činidlo identifikované způsobem podle nároku 27, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  27. 29. Farmaceutická kompozice pro použití při léčení FSD, přednostně FSAD, vyznačující se tím, že obsahuje činidlo, které je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, přičemž činidlem je I:NEP.
  28. 30. Použití činidla pro výrobu léčiva, jako farmaceutické kompozice pro léčení FSD, přednostně FSAD; přičemž činidlem je I:NEP.
  29. 31. Způsob léčení ženy trpící FSD, přednostně FSAD, vyznačující se tím, že se ženě podává činidlo, které je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem, přičemž činidlem je I;NEP.
  30. 32. Farmaceutická kompozice pro použití při zvyšování prokrvení ženských pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris, vyznačující se tím, že obsahuje činidlo, které je popřípadě smíseno s farmaceuticky vhodným nosičem,
    I:NEP.
    ředidlem nebo excipientem, přičemž činidlem je
  31. 33. Použití činidla při výrobě léčiva, jako farmaceutické kompozice, pro zvyšování prokrvení ženských pohlavních orgánů, například vagíny nebo klitoris, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  32. 34. Způsob léčení ženy trpící FSD, přednostně FSAD, nebo prevence FSD, přednostně FSAD, vyznačuj ící se t i m , že se ženě podává činidlo, přičemž tímto činidlem je I:NEP.
  33. 35. Vynález podle kteréhokoliv z nároků 29 až 34, kde činidlo potencuje cAMP.
  34. 36. Vynález podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde cAMP je endogenní cAMP.
  35. 37. Vynález podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde činidlem je I:NEP, kde NEP je EC 3.4.24.11.
CZ20004110A 1999-11-08 2000-11-06 Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen CZ20004110A3 (cs)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9926437A GB9926437D0 (en) 1999-11-08 1999-11-08 Pharmaceutical
GB0004021A GB0004021D0 (en) 2000-02-18 2000-02-18 Pharmaceutical
GB0013001A GB0013001D0 (en) 2000-05-26 2000-05-26 Pharmaceutical
GB0016563A GB0016563D0 (en) 2000-07-05 2000-07-05 Pharmaceutical
GB0017141A GB0017141D0 (en) 2000-07-12 2000-07-12 Pharmaceutical

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20004110A3 true CZ20004110A3 (cs) 2002-04-17

Family

ID=27515922

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004106A CZ20004106A3 (cs) 1999-11-08 2000-11-06 Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen
CZ20004110A CZ20004110A3 (cs) 1999-11-08 2000-11-06 Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen
CZ20004107A CZ20004107A3 (cs) 1999-11-08 2000-11-06 Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004106A CZ20004106A3 (cs) 1999-11-08 2000-11-06 Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004107A CZ20004107A3 (cs) 1999-11-08 2000-11-06 Sloučeniny pro léčení sexuální dysfunkce u ľen

Country Status (25)

Country Link
US (1) US6734186B1 (cs)
EP (5) EP1097707A1 (cs)
JP (9) JP2001213802A (cs)
KR (7) KR20010082545A (cs)
CN (5) CN1322526A (cs)
AT (1) ATE285249T1 (cs)
AU (6) AU781186B2 (cs)
BR (3) BR0005266A (cs)
CA (4) CA2324484A1 (cs)
CO (2) CO5680108A1 (cs)
CZ (3) CZ20004106A3 (cs)
DE (1) DE60016877T2 (cs)
DK (1) DK1097719T3 (cs)
EA (3) EA006254B1 (cs)
ES (1) ES2233297T3 (cs)
HK (3) HK1040626A1 (cs)
HU (4) HUP0004349A2 (cs)
IL (4) IL139454A0 (cs)
MY (2) MY140534A (cs)
NO (3) NO20005661L (cs)
NZ (4) NZ508007A (cs)
PE (4) PE20010924A1 (cs)
PL (3) PL343754A1 (cs)
PT (1) PT1097719E (cs)
SK (3) SK16702000A3 (cs)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040014761A1 (en) * 1997-10-28 2004-01-22 Place Virgil A. Treatment of female sexual dysfunction with phosphodiesterase inhibitors
DK172900B1 (da) 1998-12-18 1999-09-27 Per Julius Nielsen Præparat samt kit til brug ved intraoculære operationer
US20040254153A1 (en) * 1999-11-08 2004-12-16 Pfizer Inc Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
US20020052370A1 (en) * 2000-07-06 2002-05-02 Barber Christopher Gordon Cyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as inhibitors of neutral endopeptidase
AU2002220977A1 (en) * 2000-12-15 2002-06-24 Pfizer Inc. Treatment of male sexual dysfunction
US6660756B2 (en) 2001-03-28 2003-12-09 Pfizer Inc. N-phenpropylcyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as inhibitors of neutral endopeptidase
HRP20030751A2 (en) 2001-03-28 2005-08-31 Pfizer Inc. N-phenpropylcyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as nep inhibitors for fsad
GB0111709D0 (en) * 2001-05-14 2001-07-04 Pfizer Ltd Novel pharmaceuticals
AR037097A1 (es) 2001-10-05 2004-10-20 Novartis Ag Compuestos acilsulfonamidas, composiciones farmaceuticas y el uso de dichos compuestos para la preparacion de un medicamento
HN2002000317A (es) * 2001-11-02 2003-05-21 Pfizer Inhibidores de pde9 para tratamiento de trastornos cardiovasculares
GB0219961D0 (en) 2002-08-28 2002-10-02 Pfizer Ltd Oxytocin inhibitors
GB0225908D0 (en) * 2002-11-06 2002-12-11 Pfizer Ltd Treatment of female sexual dysfunction
JP2006519243A (ja) * 2003-03-04 2006-08-24 アルタナ　ファルマ　アクチエンゲゼルシャフト プリン−６−オン誘導体
JP4565193B2 (ja) 2003-04-23 2010-10-20 バレリタス， インコーポレイテッド 長い持続時間の医薬投与のための液圧作動式ポンプ
US7291640B2 (en) 2003-09-22 2007-11-06 Pfizer Inc. Substituted triazole derivatives as oxytocin antagonists
US7452875B2 (en) 2003-09-26 2008-11-18 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7427611B2 (en) 2003-09-26 2008-09-23 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl)-cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7262184B2 (en) 2003-09-26 2007-08-28 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US20050267072A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Pharmaceutical compositions containing dually acting inhibitors of neutral endopeptidase for the treatment of sexual dysfunction
US20050267124A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Pharmaceutical compositions comprising NEP-inhibitors, inhibitors of the endogenous producing system and PDEV inhibiitors
WO2005123119A2 (en) * 2004-06-10 2005-12-29 Catalyst Biosciences, Inc. Administration of neutral endopeptidase to treat inflammatory bowel disease
WO2006014425A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 Biovalve Technologies, Inc. Methods and devices for delivering glp-1 and uses thereof
WO2006100557A1 (en) 2005-03-21 2006-09-28 Pfizer Limited Substituted triazole derivatives as oxytocin antagonists
ES2656675T3 (es) 2006-03-30 2018-02-28 Valeritas, Inc. Dispositivo de suministro de fluidos de múltiples cartuchos
WO2007143705A2 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
JP5701608B2 (ja) 2007-12-06 2015-04-15 イントラ−セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッドＩｎｔｒａ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ． 有機化合物
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
BRPI0922809A2 (pt) 2008-12-06 2018-05-29 Intracellular Therapies Inc compostos orgânicos
EP2367430B1 (en) 2008-12-06 2014-08-13 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
EA201170773A1 (ru) 2008-12-06 2012-01-30 Интра-Селлулар Терапиз, Инк. Органические соединения
US20130213393A1 (en) 2009-12-22 2013-08-22 Evoke Pharma, Inc. Nasal formulations of metoclopramide
JP2012526810A (ja) 2009-05-13 2012-11-01 イントラ−セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッド 有機化合物
US8680116B2 (en) 2009-07-22 2014-03-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Quinolinone PDE2 inhibitors
US20110152770A1 (en) 2009-07-30 2011-06-23 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
US9434730B2 (en) 2010-05-31 2016-09-06 Intra-Cellular Therapies, Inc. PDE1 inhibitor compounds
EP2590657A4 (en) 2010-05-31 2014-02-12 Intra Cellular Therapies Inc ORGANIC CONNECTIONS
RU2611403C1 (ru) * 2011-12-05 2017-02-21 Суда Лимитед Составы в форме спрея для перорального введения и способы введения силденафила
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US9381297B2 (en) 2012-06-07 2016-07-05 Tandem Diabetes Care, Inc. Sealed infusion device with electrical connector port
EP2956141A4 (en) 2013-02-17 2016-10-26 Intra Cellular Therapies Inc NEW USES
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
EP3087060B1 (en) 2013-12-23 2020-05-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Pyrimidone carboxamide compounds as pde2 inhibitors
US9546175B2 (en) 2014-08-07 2017-01-17 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US10131671B2 (en) 2014-08-07 2018-11-20 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US10285992B2 (en) 2014-08-07 2019-05-14 Intra-Cellular Therapies, Inc. Combinations of PDE1 inhibitors and NEP inhibitors and associated methods
WO2016145614A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Triazolyl pyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
WO2016154081A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Pyrazolyl pyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
US10195201B2 (en) 2015-05-05 2019-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Heteroaryl-pyrimidinone compounds as PDE2 inhibitors
WO2016183741A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Pyrimidinone amide compounds as pde2 inhibitors
WO2016191935A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. 6-alkyl dihydropyrazolopyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
WO2016192083A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Dihydropyrazolopyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
US10647727B2 (en) 2015-06-25 2020-05-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrazolo/imidazolo bicyclic compounds as PDE2 inhibitors
WO2017000277A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted triazolo bicycliccompounds as pde2 inhibitors
WO2017000276A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Bicyclic heterocyclic compounds as pde2 inhibitors
IL280619B2 (en) 2015-07-07 2023-10-01 H Lundbeck As Phosphodiesterase 9 inhibitors with an imidazo triazinon or imidazo pyrazinone skeleton for the treatment of peripheral diseases
US10492141B2 (en) 2015-11-17 2019-11-26 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods for reduction of battery usage in ambulatory infusion pumps
US10682354B2 (en) 2016-03-28 2020-06-16 Intra-Cellular Therapies, Inc. Compositions and methods
WO2017168174A1 (en) 2016-04-02 2017-10-05 N4 Pharma Uk Limited New pharmaceutical forms of sildenafil
EP3554489A4 (en) 2016-12-15 2020-06-17 Evoke Pharma, Inc. TREATMENT FROM MODERATE TO HEAVY GASTROPARESIS
US11839614B2 (en) 2018-01-31 2023-12-12 Intra-Cellular Therapies, Inc. Methods for treating or mitigating cardiotoxicity characterized by inhibition of adenosine A2 signaling and/or adenosine A2 receptor expression
EP4349403A3 (en) 2018-05-25 2024-06-05 Cardurion Pharmaceuticals, Inc. Monohydrate and crystalline forms of 6-[(3s,4s)-4-methyl-1- (pyrimidin-2-ylmethyl)pyrrolidin-3-yl]-3-tetrahydropyran-4-yl- 7h-imid azo [1,5- a] pyrazin-8-one
EP4586274A3 (en) * 2018-07-05 2025-10-01 Boston Scientific Scimed, Inc. Devices, systems, and methods for determining inflammation and/or fibrosis
MA53501A (fr) 2018-08-31 2021-07-07 Imara Inc Inhibiteurs de pde9 pour le traitement de la drépanocytose
CN114533740B (zh) * 2022-02-10 2024-04-12 广州威生医药科技有限公司 一种公猪气味剂组合物及其应用
CN115944584A (zh) * 2023-01-18 2023-04-11 南京诺令生物科技有限公司 一种妇科用凝胶产品及制备方法和应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666908A (en) * 1985-04-05 1987-05-19 Warner-Lambert Company 5-Substituted pyrazolo[4,3-d]pyrimidine-7-ones and methods of use
KR880007441A (ko) * 1986-12-11 1988-08-27 알렌 제이.스피겔 스피로-치환된 글루타르아미드 이뇨제
US4749717A (en) * 1987-01-08 1988-06-07 Smithkline Beckman Corporation Dopamine-beta-hydroxylase inhibitors
AU6522590A (en) * 1989-09-18 1991-04-18 Senetek Plc Method for inducing vaginal lubrication
US5380758A (en) 1991-03-29 1995-01-10 Brigham And Women's Hospital S-nitrosothiols as smooth muscle relaxants and therapeutic uses thereof
US6143746A (en) 1994-01-21 2000-11-07 Icos Corporation Tetracyclic cyclic GMP-specific phosphodiesterase inhibitors, process of preparation and use
GB9514465D0 (en) 1995-07-14 1995-09-13 Glaxo Lab Sa Chemical compounds
US5612314A (en) 1995-04-21 1997-03-18 Brigham & Women's Hospital Nitrosylated neuropeptides
DE19541264A1 (de) * 1995-11-06 1997-05-07 Bayer Ag Purin-6-on-derivate
AU7692696A (en) * 1995-12-01 1997-06-27 Novartis Ag Heteroaryl derivatives
US5798246A (en) 1996-03-25 1998-08-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cyclic nucleotide phosphodiesterase
GB9608408D0 (en) * 1996-04-23 1996-06-26 Adams Michael A Treatment of erectile dysfunction
ATE230403T1 (de) * 1996-07-23 2003-01-15 Neurogen Corp Einige amido- und ammo- substituierte benzylaminderivate: eine neue klasse von neuropeptid y1 spezifische ligande
US6331543B1 (en) * 1996-11-01 2001-12-18 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated phosphodiesterase inhibitors, compositions and methods of use
US5958926A (en) 1996-11-01 1999-09-28 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated phosphodiesterase inhibitor compounds, compositions and their uses
US6043252A (en) 1997-05-05 2000-03-28 Icos Corporation Carboline derivatives
US20020004529A1 (en) * 1997-10-20 2002-01-10 Gary W. Neal Methods, compositions, and kits for enhancing female sexual desire and responsiveness
US5965718A (en) * 1997-10-24 1999-10-12 The Scripps Research Institute Analogs of sarcodictyin and eleutherobin
GB9722520D0 (en) * 1997-10-24 1997-12-24 Pfizer Ltd Compounds
CA2306837C (en) 1997-10-28 2007-05-08 Vivus, Inc. Treatment of female sexual dysfunction
AUPP010397A0 (en) * 1997-10-30 1997-11-20 Vaisman, Jakov Method and composition for treatment of sexual dysfunction
NZ504436A (en) * 1997-11-12 2001-08-31 Bayer Ag 2-Phenyl substituted imidazotriazinones as phosphodiesterase inhibitors
CA2314369A1 (en) * 1997-12-18 1999-06-24 Nathan Earl Scott Prostaglandin e2/f2.alpha. combination for treating impotence and enhancing sexual arousal
CA2339630C (en) 1998-09-16 2006-05-23 Icos Corporation Carboline derivatives as cgmp phosphodiesterase inhibitors
US6486207B2 (en) * 1998-12-10 2002-11-26 Nexmed (Holdings), Inc. Compositions and methods for amelioration of human female sexual dysfunction
US20020169101A1 (en) * 1999-05-10 2002-11-14 Gonzalez Maria Isabel Treatment of sexual dysfunction
US20020052370A1 (en) * 2000-07-06 2002-05-02 Barber Christopher Gordon Cyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as inhibitors of neutral endopeptidase

Also Published As

Publication number Publication date
NZ508011A (en) 2002-06-28
KR20010082544A (ko) 2001-08-30
EP1097707A1 (en) 2001-05-09
IL139454A0 (en) 2001-11-25
EA200001044A3 (ru) 2002-04-25
JP2005350482A (ja) 2005-12-22
NO20005618D0 (no) 2000-11-07
SK16722000A3 (sk) 2002-09-10
US6734186B1 (en) 2004-05-11
JP2005043377A (ja) 2005-02-17
CN1322526A (zh) 2001-11-21
EA200001043A3 (ru) 2002-04-25
MY141651A (en) 2010-05-31
PE20010926A1 (es) 2001-09-15
AU781403B2 (en) 2005-05-19
BR0005299A (pt) 2003-04-15
DE60016877D1 (de) 2005-01-27
HU0004347D0 (cs) 2001-01-29
NZ508007A (en) 2002-06-28
EP1481667A1 (en) 2004-12-01
PE20010924A1 (es) 2001-09-13
BR0005266A (pt) 2003-04-08
KR20040074021A (ko) 2004-08-21
ES2233297T3 (es) 2005-06-16
KR20010082545A (ko) 2001-08-30
CA2323191A1 (en) 2001-05-08
NO20005618L (no) 2001-05-09
DE60016877T2 (de) 2005-12-15
PT1097719E (pt) 2005-04-29
NZ508012A (en) 2002-06-28
CO5680108A1 (es) 2006-09-29
KR20040074023A (ko) 2004-08-21
CA2324484A1 (en) 2001-05-08
NZ508006A (en) 2002-06-28
CZ20004107A3 (cs) 2002-04-17
NO20005661L (no) 2001-05-09
AU781186B2 (en) 2005-05-12
AU7140900A (en) 2001-05-10
EP1097718A1 (en) 2001-05-09
IL139455A0 (en) 2001-11-25
HK1040627A1 (zh) 2002-06-21
EA006242B1 (ru) 2005-10-27
IL139456A0 (en) 2001-11-25
CO5680109A1 (es) 2006-09-29
JP2001247478A (ja) 2001-09-11
EA200001043A2 (ru) 2001-12-24
HUP0004350A2 (hu) 2001-06-28
HK1041646A1 (zh) 2002-07-19
HU0004349D0 (cs) 2001-01-29
CN1328824A (zh) 2002-01-02
AU781400B2 (en) 2005-05-19
HK1040626A1 (zh) 2002-06-21
AU2005202750A1 (en) 2005-07-21
PE20010925A1 (es) 2001-09-17
CN1575816A (zh) 2005-02-09
MY140534A (en) 2009-12-31
HUP0004347A2 (hu) 2001-06-28
SK16702000A3 (sk) 2002-07-02
CN1320426A (zh) 2001-11-07
HUP0004349A2 (hu) 2001-06-28
AU7141100A (en) 2001-05-10
PL343755A1 (en) 2001-05-21
ATE285249T1 (de) 2005-01-15
KR20010086267A (ko) 2001-09-10
CA2323183A1 (en) 2001-05-08
CA2323464A1 (en) 2001-05-08
EA200001042A3 (ru) 2002-04-25
AU2005202166A1 (en) 2005-06-16
HUP0004348A2 (hu) 2001-06-28
EA006254B1 (ru) 2005-10-27
AU7140700A (en) 2001-05-17
NO20005662L (no) 2001-05-09
DK1097719T3 (da) 2005-03-29
EP1097719A1 (en) 2001-05-09
KR20040074022A (ko) 2004-08-21
JP2005013237A (ja) 2005-01-20
EA200001042A2 (ru) 2001-12-24
HU0004348D0 (cs) 2001-01-29
PL343753A1 (en) 2001-05-21
PE20010817A1 (es) 2001-08-14
KR20010051481A (ko) 2001-06-25
JP2005070055A (ja) 2005-03-17
PL343754A1 (en) 2001-05-21
EA200001044A2 (ru) 2001-12-24
HU0004350D0 (cs) 2001-01-29
SK16712000A3 (sk) 2002-07-02
JP2005021167A (ja) 2005-01-27
JP2001247479A (ja) 2001-09-11
CZ20004106A3 (cs) 2002-04-17
JP2001213802A (ja) 2001-08-07
NO20005662D0 (no) 2000-11-07
JP2001206855A (ja) 2001-07-31
EP1097719B1 (en) 2004-12-22
AU7140800A (en) 2001-05-17
EP1097706A1 (en) 2001-05-09
IL139457A0 (en) 2001-11-25
CN1636597A (zh) 2005-07-13
BR0005276A (pt) 2003-04-08
NO20005661D0 (no) 2000-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6734186B1 (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
US20040254153A1 (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
AU2005201482A1 (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
HK1069536A (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction