CZ20004746A3 - Indukovatelné promotory - Google Patents

Abstract

Řešení se týká indukovatelných promotorů pro použití při kontrole heterologních genů v transformovaných rostlinách. Vhodnými indukovatelnými promotory jsou ty, kteréjsou citlivé na nízké hladiny environmentálně přijatelného a nefytotoxického indukujícího činidla a které také vykazují nízkou hladinu vývojově nebo environmentálně indukované exprese. Výhodný promotor přirozeně řídí expresi proteinu o Ί hmotnosti 21,3 kDa v Asparagus officinalis nebo ekvivalentního proteinu z čeledi Lilliaceae nebo Amaryllodaceae. Při řízení promotorem podle vynálezu bude gen exprimován po indukci pomocí SA nebo BTH, ale s výhodou nebude vývojově exprimován, systémově aktivován po patogenní infekci nebo v odpověď na ABA, ethylen, oxidační nebo osmotické vlivy nebo poranění.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje na nové indukovateiné promotory odvozené z rostlin a jejich užití při kontrolované expresi heterologních genů.

Dosavadní stav techniky

Cílem genového inženýrství užitkových plodin je zavedení genu (nebo genů), který změní charakteristiku rostliny, aniž by jakkoli změnil žádoucí prvky genotypu původní rostliny. Tak může být genetická sestava plodin rozšířena zahrnutím genů, které nepatří do původního genetického fondu a nejsou dostupné tradičními postupy pěstování plodin. Jedním důležitým aspektem takové modifikace je výběr promotoru. Identifikace a charakterizace promotorů umožňuje vytvoření chimérních genů, v nichž slouží promotor jednoho genu k řízení exprese proteinu kódovaného genem jiným za podmínek a na místech v rostlině, které jsou určeny promotorem.

Promotory často obsahují prvky, které jsou rozpoznávány indukovatelnými faktory. Tyto faktory řídí načasování exprese genů a její specifitu vůči konkrétnímu rostlinnému pletivu. Těmito prvky jsou obvykle krátké sekvence, které se vyskytují v promotorech mnoha (ne-li všech) genů reagujících na identický signál. Tak například u rostlin byl, analýzou promotorů genů regulovaných fytohormonem abscisovou kyselinou, identifikován společný úsek CCACGGT v rámci těchto promotorů (Marcotte a kol., Plant Cell 1 969 až 976 (1989) a Pia a kol., Plant Mol. Biol. 21 259 až 266 (1993)). Obdobně promotory, které reagují na ethylen, obsahují tzv. PR box AGCCGCC (Broglie a kol., Plat Cell 1 599 až 607 (1989) a Deickman a kol., Plant Physiol. 100 2013 až 2017 (1992)). Dále vlastnictví volby takových odezvových prvků může udělit promotoru buď schopnost řídit genovou expresi v odpověď na jakýkoli z několika signálů nebo předvést synergické posílení exprese v odpověď na několik signálů. V tabulce 1 je seznam mnoha sekvencí souhlasných odezvových prvků nalezených v rostlinách.

ft ft

Tabulka 1

Odezvové prvky promotorů
Název	Sekvence	Citlivost
ABRE	CCACGTT	ABA
DRE1	TACCGACAT	sucho
E-8	ATAAGGGGTTGGT
G Box	GTGTCAC
H Box	GGTAGG
JA Box	CCCTATAGGG	JA?
Myb	TGGTTA
Myc	CANNTG
PR Box	AGCCGCC	ethylen
TCA	TTATCTCCTT

Nalezením již identifikovaných úseků v DNA sekvenci promotorů je tedy možné předpovědět, za jakých podmínek bude promotor exprimován. Tato přihláška se bude týkat takovýchto indukovatelných promotorů.

V minulosti byla exprese cizích proteinů v rostlinách řízena „konstitutivními“ promotory, jako například 35S promotor z viru květákové mozaiky (CaMV 35S). Komerční využití takových promotorů je omezeno tam, kde promotor řídí syntézu toxického proteinu nebo proteinů, které značně zatěžují metabolismus rostliny. Tyto problémy mohou být překonány, jestliže je exprese cílového proteinu pod kontrolou indukovatelného promotoru, buď těsně před nebo těsně po sklizni.

Některé promotory odvozené z rostlin byly již dříve navrženy jako vhodné k chemicky regulované expresi transgenů (Gatz, C (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89 až 108). Takové promotory jsou indukovatelné obrannými látkami, elicitory, chemickáliemi, které zprostředkovávají odezvy na poranění, nebo chemikáliemi indukujícími systémovou získanou rezistenci (SAR). Nejvíce byly studovány promotory indukované obrannými látkami a chemikáliemi, které indukují SAR. Tak například ve WO 93/01294 a v Jepson a kol., (1994) Plant Mol. Biol. 26, 1855 až 1866“ je popsána izolace genu kódujícího glutathion-S-transferasu (GST-27), který je indukovatelný obrannou látkou N,N-dialyl-2,2-dichloracetimidem. Užití tohoto promotoru je však omezené, protože tento promotor je exprimován konstitutivně v kořenech rostlin.

Jev systémové získané rezistence (SAR), který následuje po infekci rostliny patogenním mikroorganismem, je již dlouho znám. Obranná odpověď je spouštěna při napadení rostliny potenciálním patogenem, kterého je schopna rozpoznat. Tato odpověď,

->

známá jako nekompatibilitní reakce, obvykle zahrnuje hypersenzitivní smrt buněk v místě vstupu patogenu, syntézu fytoalexinů, tvorbu částic aktivního kyslíku, zesilování buněčných stěn, lokální indukci obranných genů a nahromadění kyseliny salicylové (SA). Následně po této lokální odpovědi se vytvoří v celé rostlině SAR. SAR vybaví nenapadené pletivo schopností odpovídat rychleji na další infekci a tato rezistence je účinná proti široké škále patogenů. Začátek a ustavení SAR doprovází syntéza řady relativně nepříbuzných proteinů, které jsou obecně známy jako proteiny spojené s patogenezí (PR proteiny).

Již dlouho je známo, že působení SA nebo acetylo-SA (aspirin) na rostliny může indukovat rezistenci kpatogenům (White, R.F. (1979). Virology 99, 410 až 412). Nedávný výzkum prokázal, že SA hraje klíčovou roli jak v místní, tak v systémové indukci PR proteinů a ve vývoji SAR (Malamy a kol., (1990) Science 250, 1002 až 1004; Metraux a kol., (1990) Science 250, 1004 až 1006; Yalpani a kol., (1991) Plant Cell 3, 809 až 818). Navíc proces shromažďování PR proteinů a SAR jsou v rovnováze u rostlin, které konstitutivně exprimují bakteriální salicyláthydroxylasu (která mění SA na katechol), což dále podporuje roli endogenní SA v těchto procesech (Gaffney a kol., (1993) Science 261, 754 až 756). Postřik, injekce nebo vstřebávání SA kořenovým systémem silně indukuje expresi promotorů PR genů, a to 50 až 1000krát nad základní hladinu (např. Mur a kol., (1996) Plant J. 9, 559 až 571). Avšak vzhledem k fytotoxicitě SA v koncentracích, které byly použity při těchto pokusech (obvykle 1 až 2 mM), bylo věnováno velké úsilí do hledání méně škodlivých látek schopných napodobit SA.

Zvláště pak jedna taková sloučenina, BTH (S-metylester benzo-(1,2,3)-thiadiazol7-karbothiové kyseliny) je již na trhu pro použití ve velkém na polích, coby „posilovač plodin“ (Gorlach a kol., (1996) Plant Cell 8, 629 až 643). K indukci exprese PR genů stačí vodný roztok BTH o koncentraci 1,2 μΜ (Friedrich a kol., (1996) Plant J. 10, 61 až 70). Komerční přípravky BTH jsou dostačující k indukci velmi silné exprese PR genů u všech testovaných rostlin včetně huseníčku (Arabidopsis) a pšenice.

Genová indukce po postřiku BTH je maximální dva dny po aplikaci a přetrvává nejméně 10 dnů. Přestože tato látka indukuje zvýšenou rezistenci pletiva, není znám mechanismus působení a stejně tak není známo, zda je schopna napodobit všechny účinky SA, jako je zesilování genové indukce nebo oxidační praskání indukované patogenem.

Rodina genů spojených s patogenezí (PR genů) spjatých s obranným systémem je tedy potenciálním zdrojem indukovatelných promotorů. PR geny jsou skupinou roz• « ·· · · · ·· · • · · · · · · «··· ···· ·· · · · · ······ · · · · · ··· · · · · · · ···· ·4 ·· ··· ·· ··· dílných proteinů, z nichž některé (například třídy PR-2 a PR-3) mají známé funkce jako chitinasy nebo beta-1,3-glukanasy. Jiné (například třídy PR-1 a PR-5) jsou indukovány v průběhu odpovědi rostliny na patogenní atak, ale nemají jasně identifikovatelnou funkci. Každá třída PR proteinů obsahuje obvykle členy s kyselým nebo zásaditým pH. Přestože toto pravidlo má své výjimky, jsou většinou bazické proteiny lokalizovány uvnitř buňky (například ve vakuole), zatímco kyselé PR proteiny jsou vyměšovány.

Rostliny musí odpovídat také celé řadě dalších environmentálních stresových faktorů, včetně vlivu vody, poranění mechanické nebo způsobené býložravci, ozáření UV zářením, oxidativní stres a vysoké a nízké teploty. Geny PR jsou regulovány při mnohých z těchto podmínek. Tak například osmotin z tabáku (bazický vakuolámí produkt PR-5 genu) je indukován nejen atakem patogenu, ale také stresem způsobeným solemi (Grillo a kol., Physiologia Plantarum 93, 498 až 504 (1995)). Exprese PR-1 a je indukována po působení peroxidu vodíku (což indukuje oxidativní stres) a u rostlin podrobeným působení UV záření (Yalpani a kol., Planta 193, 327 až 376 (1994)). Odpovědi na poranění a atak patogenu mají mnoho podobných znaků. Patří sem exprese obranných genů a vybudování systémové odpovědi, která je zprostředkována mobilními signály. Je pravidlem, že bazické PR proteiny reagují také při zranění.

Byla identifikována celá řada úseků přítomných v promotorech PR genů. Gen PR-2d (kódující β-1,3-glukanasu) z tabáku je exprimován v pletivu, ve kterém probíhá hypersenzitivní reakce (HR) po ataku viru mozaiky tabáku (TMV) a je indukován exogenní SA (Shan a kol., Plant J. 10 1089 až 1101 (1996)). Úsek -364 až -288 v promotoru PR-2d dodává citlivost k SA a úsek dlouhý 25 pb v této oblasti je rozpoznáván jadernými faktory z tabáku. Úsek citlivý k SA byl také izolován z promotoru CaMV 35S, a to v pozici -90 až -46. Tento úsek odpovídá místu as-1 (Qin a kol., Plant Cell 6, 863 až 874 (1994)). V promotoru β-1,3-glukanasy z ječmene se několikrát opakuje sekvence TCATCTTCTT a nachází se ve více než 30 genech indukovaných stresem (Goldsbrough a kol., Plant J. 3(4): 563 až 571 (1993b)). Tento úsek váže 40kDa jaderné proteiny z tabáku. Vázání tohoto úseku se zvyšuje u rostlin, na které bylo působeno SA. Proteiny, které se váží na úsek citlivý k ethylenu z Arabidopsis, se váží, jak bylo ukázáno v Buttner a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94 5961 až 5966 (1997), na PR box, přičemž PR box a G box mají synergické účinky.

Geny PR-1 byly detailně studovány a promotor jednoho z nich, promotor PR-1 a z tabáku, byl navržen jako vhodný indukovatelný promotor (EP 0 332 104 A2). PR-1 a z tabáku je exprimován jak lokálně v infikovaném pletivu, tak později v průběhu ústavo5

vání SAR. Infekce rostlin tabáku ekotypu Samsun NN tedy vede ke hromadění endogenních proteinů PR-1 jak v očkovaných listech (přibližně 4 dny po infikaci), tak později v horních neinfikovaných listech (přibližně osmý den) téže rostliny. U rostlin tabáku Pseudomonas syringae infikovaného patovarem syringae byla popsána lokální (přibližně 12 hod. po očkování) a systémová (přibližně 3 až 7 dní) indukce exprese PR-1a-GUS (Bi a kol. (1995) Plant J. 8: 235 až 245; Mur a kol. (1996) Plant J. 9: 559 až 571). U transgenického tabáku indukuje přímá aplikace SA vysokou hladinu exprese GUS pod promotorem PR-1 a [Bi a kol., viz výše]. Induktory SAR, BTH a INA také indukují vysokou hladinu exprese jak endogenního PR-1 a, tak PR-1a-GUS.

Také poranění mírně zvyšuje expresi PR-1a-GUS (Darby, R., nepublikovaná pozorování, Oshima a kol., (1990) Plant Cell 2, 95 až 106). PR-1a, stejně jako ostatní PR1 proteiny, vykazuje vývojovou expresi. Tak PR-1a-GUS je exprimováno v listech, řapících, povrchu stonku, pylu a okvětních lístcích kvetoucího tabáku (Uknes a kol., Plant Cell, 5(2): 159 až 169 (1993)). PR-1a-GUS je také exprimován v kořenech (Kenton, P., nepublikovaná pozorování).

Promotor PR-1 a byl podrobně studován. Van de Rhee a Bol (Plant Mol. Biol., 21(3): 451 až 461 (1993b)) identifikovali čtyři regulační úseky v rámci promotoru PR-1a. Všechny tyto úseky byly potřebné pro maximální aktivitu a žádný z úseků nebyl schopen vyvolat aktivitu promotoru samostatně. Promotor PR-1 a obsahuje řadu úseků schopných vázat transkripční faktory podobné GT-1 a Myb1 (Buchel a kol., Plant Mol. Biol., 30(3): 493 až 504 (1996)). Navíc SA a její aktivní analogy indukují expresi nejen PR genů, ale i myb1.

Vysoká citlivost k SA prokázaná u PR-1 a genu a velice vysoká hladina exprese PR-1a-GUS po působení SA nebo infekce by mohly vést k nevhodné expresi jakékoli fúze promotoru PR-1 a s jiným genem. To by mohlo být výsledkem změny endogenní hladiny SA (způsobené např. změnou redoxního stavu). Toto může omezovat užitnou hodnotu při řízení genů, jejichž produkty jsou bud toxické při vysokých hladinách nebo vkládají významnou metabolickou zátěž na rostlinu. A konečně, obecně geny PR-1 a zvláště pak PR-1 a vykazují vysokou hladinu konstitutivní/vývojové exprese, zejména v době kvetení. Toto opět může vést k vysokému stupni neplánované exprese transgenů řízených promotorem PR-1 a.

Další třídou PR proteinů jsou proteiny PR-5, které mohou být rozděleny do dvou skupin. Jednou skupinou jsou proteiny podobné kyselému extracelulárnímu thaumatinu a druhou skupinou jsou bazické intracelulární osmotiny. Původně byly osmotiny spojo6 • · * · · ·· · · · ···· 9 9 9 9 9 vány s abiotickým stresem. Tato osmoticky vyvolaná exprese je však obvykle pouze doplňkem vysoké konstitutivní (Stintzi a kol., Biochimie, 75: 687 až 706 (1993); Leone a kol., Plant Physiol., 106: 703 až 712 (1994); Van Kan a kol., Plant Mol. Biol., 27 1205 až 1213 (1995)) a vývojové exprese (Linthorst, Crit. Pev. Plant Sci., 10: 123 až 150 (1991); Stintzi a kol., Physiol. Mol. Plant Pathol., 38: 137 až 146 (1991); Raghothama a kol., Plant Mol. Biol., 34: 393 až 402 (1997)). Exprese osmotinů také vzrůstá jako odpověď na stres, způsobený například suchem, poraněním, nízkou teplotou (Raghothama a kol., Plant Mol. Biol., 23: 1117 až 1128 (1993); Grillo a kol. (1995), viz výše; Zhu a kol., Plant Mol. Biol., 28: 17 až 26 (1995b) a chemickými faktory jako je ethylen (u tabáku Raghothama a kol., 1993, viz výše; Chang a kol., Physiologia-Plantarum, 100: 341 až 352 (1997)) a cytokininy (Thomas & Bohnert, Plant Physiol., 103: 1299 až 1304 (1993)). Atak patogenem také indukuje expresi osmotinů (Zhu a kol., Plant Physiol., 108: 929 až 937 (1995a); (1995b), viz výše; Chang a kol., (1997), viz výše), která může být v případě některých osmotinů systémová (Zhu a kol., (1995b), viz výše) nebo lokální pro jiné osmotiny (Zhu a kol., (1995a), viz výše). Geny osmotinů se tedy nejeví jako ideální zdroj indukovatelných promotorů.

Na rozdíl od osmotinů lokalizovaných do vakuoly jsou PR-5s (aPR-5) sekretovány vně buňky a postrádají C-terminální část, která může představovat směrovací signál do vakuoly (Lindhorst, (1991), viz výše; Stintzi a kol., (1993), viz výše). Prokázalo se, že se proteiny aPR-5 akumulují v místě ataku patogenů, jak je tomu například u ječmene (Bryngelsson & Green, Plant Mol. Plant Path., 35: 45 až 52 (1989); Boyd a kol., Plant Mol. Plant Path., 45: 47 až 58 (1994); Reiss & Bryngelsson, Physiol. Mol. Plant Path., 43: 331 až 341 (1996); Schweizer a kol., Plant Physiol., 114: 73 až 88 (1997); Vale a kol., Physiol. Mol. Plant Path., 44: 207 až 215 (1994)) a pšenice (Rebmann a kol., Plant Mol. Biol., 17: 283 až 285 (1991)). Za použití western blotů Stintzi a kol. (1991) nebyl schopen detekovat aPR-5 u listů zdravého tabáku, zatímco osmotin byl konstitutivně exprimován. aPR-5 se objevilo 4 až 6 hodin po ataku TMV, zatímco akumulace osmotinů nastala 2 až 4 hodiny po naočkování (Stinzi a kol., 1991). aPR-5 bylo lokalizováno do extracelulárních útvarů podobných kapsám mezi mesofilními buňkami, poblíž infikovaného místa u tabáku infikovaného TMV (Doře a kol., Arch. Virol., 120: 97 až 107 (1991)).

Jak bylo ukázáno, působení řady dalších faktorů indukovalo expresi extracelulárního proteinu aPR-5. Extracelulární proteiny aPR-5 je indukován v listových discích slunečnice 5 mM aspirinem, 10 mM ethefonem, 10 mM NAA, 10 mM 2,4 D, UV zářením,

Ί

99 99 9 99 9

9 9 9 9 99 9 9 99

999 999 9 9 9 mM MnCb, 5 mM HgCh, 5 mM kyselinou citrónovou a 5 mM kyselinou šťavelovou (Jung a kol., Journal of Plant Physiol., 145; 153 az 160 (1995)). 1 ppm INA indukuje u ječmene expresi proteinu homologického thaumatinu z rýže a JA indukuje expresi aPR5 z ječmene (Schweitzer a kol., (1997) viz výše). aPR-5 je také exprimováno v ozimém žité aklimatizovaném na chladné podnebí, kde může hrát roli v ochraně před poškozením mrazem (Hon a kol., Plant Physiol., 109: 879 až 889 (1995)).

Informace týkající se vývojové exprese aPR-5 jsou však omezené. U kukuřice je konstitutivní exprese hlavně spojena s neembryonálními pletivy vyvíjejícího se semene s maximem mezi druhým a čtvrtým týdnem po opylení, nicméně je stále zjistitelná ve vysušených semenech. Jen slabá exprese byla zaznamenána v listech kukuřice (Malehorn a kol., Plant Physiol., 106; 1471 až 1481 (1994)). Protein o hmotnosti 29 kDa podobný thaumatinu byl také detekován ve zralých plodech višní (Flis-Lycaon a kol., Plant Physiol., 111: 267 až 273 (1996)). O promotorech aPR-5 je toho známo málo, protože byl izolován pouze promotor aPR-5 genu E2 z tabáku, který byl fuzně spojen s reportérovým genem GUS a analyzován (Albrecht a kol., (1992) Plant Mol. Biol., 18: 155 až 158). Tato studie prokázala, že TMV indukoval jak lokální, tak systémovou aktivitu GUS. Lokální odpověď byla větší než systémová. Vmiste -1364 až -718 byl(y) v promotoru nalezen(y) úsek(y) zodpovědný(é) za tuto indukci aPR-5 způsobenou TMV. S pomocí techniky hybridizace nukleových kyselin nebyla nalezena žádná významná homologie mezi tímto promotorem PR-5 z tabáku a PR-1a promotorem.

Tento vynález je založen na objevu nových a užitečných indukovatelných promotorů, které řeší některé nebo všechny problémy spojené s dosavadním stavem techniky. Je poskytnut indukovatelný promotor, který je citlivý k nízkým hladinám environmentálně přijatelné a nefytotoxické indukční látky, kterou lze využít jak pro zemědělské, tak pro „in vitro“ užití. Tento promotor také vykazuje v porovnání s obdobnými promotory nízkou hladinu environmentálně nebo vývojově indukované exprese a nízké hladiny systémové aktivace indukované patogenem.

Podstata vynálezu

V první části se tedy tento vynález týká rekombinantní nebo izolované molekuly

DNA, která obsahuje indukovatelný promotor genu, kde tento promotor:

i) přirozeně řídí expresi proteinu o hmotnosti 21,3 kDa zAsparagus offícinalis v závislosti na indukci rostlinnými regulátory, nebo

ii) přirozeně řídí expresi proteinů, které jsou ekvivalentní proteinu o hmotnosti

21,3 kDa zAsparagus offícinalis, a které pocházejí z čeledí Lilliaceae nebo

Amaryllidaceae, nebo iii) přirozeně řídí expresi proteinů, které jsou podstatně homologní k proteinům uvedeným v bodech i) nebo ii), nebo iv) hybridizuje za přísných podmínek na kterýkoli promotor uvedený pod body i), ii) nebo iii).

Promotor definovaný bodem i) je odvozen z genu Asparagus offícinalis, který je podobný genu thaumatinu a příbuzný PR-5 genům (AoPRT-L). Tento promotor je schopen řídit expresi heterologních genů dvouděložných a jednoděložných rostlin. Při expresi heterologních genů má pAoPRT-L několik výhod oproti dříve popsaným promotorům. V tabulce 2 jsou porovnány vlastnosti promotoru AoPRT-L s vlastnostmi promotoru PR1a a osmotinu.

• φ * · • · φφφφ φ φ « » φ « » φ φ φ φ

Tabulka 2

Srovnávací expresní vlastnosti PR-1a, osmotinu a AoPRT-L
Působení	Místo	PR-1a	Osmotin	AoPRT-L
žádné	listy	+ (kvetení)	+	-
	stonek	+ (vodivá pletiva+) (úžlabí listu)	+	+ (úžlabí listu)
	řapík	+ (kvetení)	?	+ (úžlabí listu)
	kořeny	+	+	+/-
	květy	+ (okvětní lístky + pyl)	?	+ (vrcholy okvětních lístků)
Patogen	HR léze	+	?	+ (TMV)
	lokálně	+	+	+
	systémově	+	+/-	-
BTH		+	?	+
INA		+	+	+
poranění		+/-	+	-

Z těchto dat a z dat uvedených v příkladech je vidět, že:

1) pAoPRT-L vykazuje minimální vývojově řízenou expresi.

2) pAoPRT-L není systémově aktivován patogenní infekcí, na rozdíl od pPR1a a aPR5-E2 z tabáku.

3) pAoPRT-L není citlivý vůči ABA, ethylenu, oxidativním a osmotickým vlivům a vůči poranění.

4) exprese pAoPRT-L je indukována SA a BTH (Novartis) a chemikálií, která je povolena k použití na polích.

Tyto vlastnosti dělají z promotoru pAoPRT-L vhodného kandidáta k použití při expresi cizích proteinů v transgenických rostlinách. Dále mohou být vhodné promotory, které byly definovány body ii) a iii), a které řídí expresi PR proteinů ekvivalentních nebo homologních k pAoPRT-L zAsparagus officinalis, identifikovány i v čeledi Lilliaceae nebo Amaryllidaceae, případně jiné rostlinné čeledi.

Proteiny podstatně homologní k proteinu AoPRT-L z Asparagus officinalis nebo k ekvivalentním proteinům z čeledí Lilliaceae nebo Amaryllidaceae mohou být snadno • · · 9 4 9 4 V 4 4

9 94 99 4 44 identifikovány odborníky v oboru s použitím známých technik, například těch, které jsou zde popsány. Takovými proteiny jsou ty, které jsou funkčně ekvivalentní proteinu AoPRT-L. Podstatně homologní proteiny jsou tedy s výhodou indukovatelné PR proteiny, které významně nepodléhají systémově aktivované expresi a vývojově regulované expresi.

Důležitou výhodou indukovatelných promotorů z tohoto vynálezu je absence vývojově regulované nebo systémově aktivované exprese, na rozdíl od konstitutivních promotorů obvykle využívaných k řízení exprese heterologních genů v transgenických rostlinách, nebo indukovatelných promotorů, které jsou také aktivovány vývojově nebo v celé rostlině jako výsledek invaze patogenu. Použití indukovatelného promotoru, který není vývojově nebo systémově aktivován je zvláště vhodné pro výrobu produktů transgenických genů z rostlin v polních podmínkách, protože je tím umožněno kontrolované zpracování požadovaného produktu. Promotor, který není vývojově regulován, umožní expresi genů, jejichž produkty mohou být škodlivé pro rostlinu nebo mohou zhoršovat zdravotní stav rostlin. Jestliže byly tyto produkty byly exprimovány konstitutivně buď v celé rostlině nebo ve významné její části, nebo v klíčovém stádiu vývoje, mohla by rostlina strádat, abnormálně se vyvíjet nebo uhynout. Tak například promotory jako jsou GST27 a PR1a mají značnou vývojovou expresi, která omezuje rozsah transgenů, které mohou být s jejich použitím exprimovány. Použije-li se však indukovatelný promotor podle vynálezu, může být exprimován jakýkoli gen, protože je zabráněno riziku exprese genu v nevhodných vývojových stadiích. Použití promotoru podle vynálezu, který dále není systémově aktivován při odpovědi na útok patogenu, také rozšiřuje spektrum genů, které mohou být exprimovány z tohoto promotoru, protože je zabráněno nevhodné expresi, která by mohla být pro rostlinu škodlivá, v polních podmínkách, kde jsou rostliny vysoce citlivé k patogennímu útoku. Souhrnně a výsledkem absence aktivační odpovědi na takové stimuly jako je oxidativní a osmotický vliv, ABA, ethylen a poranění je tedy zlepšená kontrolovatelnost exprese oproti nyní existujícím promotorům odvozeným z rostlin, které jsou nebo budou potenciálně použity k chemicky aktivované expresi transgenů. Indukovatelnost promotoru chemikálií, která je vhodná k polnímu využití, dále zdůrazňuje vhodnost promotoru AoPRT-L k expresi heterologních genů u polních rostlin.

Proteiny spojené s patogenezí, nebo zkráceně PR proteiny, mohou být pro účely tohoto vynálezu definovány jako takové proteiny, které jsou exprimovány v rostlinách v odpověď na útok patogenů. Hypersenzitivita k patogenu je charakterizována jako

místní odpověď, která zahrnuje odumření pletiva bezprostředně přiléhajícího k infikovanému místu. Mezi další znaky lokální hypersenzitivní odpovědi patří syntéza fytoalexinů, tvorba aktivního kyslíku, zesilování buněčných stěn, lokální indukce obranných genů a akumulace kyseliny salicylové. Těmito znaky se odlišuje hypersenzitivní reakce od senzitivní, při které se patogen rozšíří do celé rostliny. Místní hypersenzitivní reakce může být následována indukcí systémové získané rezistence (SAR). Tím je umožněna rychlá odpověď neinfikovaného pletiva v případě opětovné invaze patogenu. PR proteiny mohou být exprimovány v průběhu hypersenzitivní odpovědi a v průběhu budování SAR. K příkladům patogenů, které mohou vyústit v expresi jednoho nebo více PR proteinů patří viry nebo viroidy, houby, bakterie a mšice. Mezi viry patří například vir mozaiky tabáku nebo okurky, vir kroužkovitosti, nekrotický virus, vir kadeřavosti listů pelargonií, vir skvrnitosti červeného jetele a další podobné viry. Mezi houby patří například Phytopophthora parasitica nebo Peronospora tabacina, mezi bakterie například Pseudomonas syringae nebo Pseudomonas tabaci a mezi mšice například Mycus persicae. Je třeba mít na zřeteli, že toto není kompletní seznam a hypersenzitivní reakce a SAR mohou být indukovány řadou dalších patogenů, které zde nejsou uvedeny.

PR proteiny mohou být stanoveny řadou známých způsobů. Například mohou být identifikovány porovnáním proteinů izolovaných před, v průběhu a po infekci patogenem. PR proteiny mohou být také stanoveny homologií ke známým PR proteinům, analýzou promotorů nebo funkční analýzou produktů exprese z knihovny cDNA. Tyto způsoby spolu s dalšími vhodnými technikami by byly odborníku v oboru známé.

Pro účely tohoto vynálezu může být systémová aktivace genu definována jako aktivace genu před nebo během odpovědi systémové získané rezistence rostliny na rezistenci patogenu. Jak bylo popsáno výše, tyto geny budou většinou exprimovány v neinfikovaných částech rostliny nebo spíše v celé rostlině, jako následek lokální odpovědi rostliny na patogenní infekci. Obvykle takové geny kódují produkty, které jsou zapojené do systémové získané rezistence rostliny proti vniku patogenu, například PR proteiny. Naopak gen, který není podstatně systémově aktivován, bude pod kontrolou promotoru, který neaktivuje expresi genu v neinfikovaných rostlinných pletivech vzdálených od místa útoku patogenu. Exprese takových genů je omezena na vlastní místo infekce nebo na blízké okolí. Promotory, které nemají podstatně systémově aktivovanou expresi, nezvyšují hladinu exprese v rostlině před, v průběhu ani po odpovědi systémové získané rezistence výrazně nad úroveň bazální exprese, a nespouští takovou expresi v celé rostlině, která by dosáhla podstatné části hladin exprese dosažené lokálně

v částech v místě infekce nebo v částech přiléhajících k tomuto místu. Taková bazální hladina se může lišit od rostliny k rostlině, nicméně v ideálním případě by se měla blížit k nebo být rovna nule.

Buňky kterékoli konkrétní rostliny budou všechny obsahovat stejný genom a budou se tedy chovat podle stejných pravidel. Buňky rostliny se však mohou nacházet v různých stádiích v závislosti na vývojové větvi, kterou se ubírají. Na kontrole výběru vývoje, který postupuje rostlinná buňka, se podílí řada genů. Tyto geny, známé jako geny kontrolující vývoj, jsou vývojově regulovány a obvykle jsou exprimovány jen v určitých pletivech nebo orgánech rostliny v určitém stádiu vývoje. Například gen kontrolující vývoj orgánů květu bude exprimován pouze v těch pletivech, ze kterých se orgány květu vyvíjí, a to před nebo v průběhu kvetení. Gen, jehož exprese není vývojově regulována, může být definován jako gen, který není exprimován pouze v určitém pletivu nebo orgánu v určitém stadiu vývoje, nebo jeho exprese v těchto pletivech nebo orgánech dosahuje pouze bazální hladiny. Geny, které nemají podstatně vývojově regulovanou expresi, mohou být exprimovány ve většině pletiv, v průběhu života rostliny, jako například geny zapojené do produkce živin, jejich transportu a ukládání. Jiné geny, které nemají podstatně vývojově regulovanou expresi, mohou být exprimovány jen jako odpověď na vnější popud, kam patří vlivy vnějšího prostředí a vlivy chemické. Vývojově regulované geny a jejich promotory mohou být identifikovány řadou způsobů. Např. analýza mutantů umožní identifikaci mutací, které zabraňují nebo inhibují vývoj konkrétního orgánu nebo pletiva rostliny a tím identifikaci odpovídajících promotorů a genů nutně zapojených do regulace vývoje. Takovéto promotory a geny mohou být také identifikovány z cDNA, genomových DNA nebo mRNA knihoven, na základě homologii aminokyselinových sekvencí nebo sekvencí nukleotidů se sekvencemi známých vývojově regulovaných genů, nebo na základě homologii předřazených regulačních sekvencí.

Promotor, u kterého podstatně není vývojově regulována exprese, může být identifikován, v souladu s tímto vynálezem, mnoha způsoby. Například mutace nebo delece promotoru, podstatně nevykazujícího vývojově regulovanou expresi, se neprojeví inhibici nebo zabráněním vývoje nebo porušením stavby rostlinného těla.

Rekombinantní nebo izolovaná DNA z tohoto vynálezu s výhodou kóduje promotor, který dále není podstatně aktivován v odpověď na podmínky okolí, hormonální podněty, jako je ABA, ethylen, oxidativní a osmotický vliv a poranění. Výsledkem je zamezení nevhodné exprese genu pod kontrolou promotoru podle vynálezu při působení • · · 0 0 0 0 · · · · ···· 0 0 0 0 0 ·

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · 0 0 0 0··

0000 00 00 000 00 ··· výše zmíněných podnětů. V tomto směru je umožněna kontrolovaná exprese daného genu. Promotory, které nejsou podstatně aktivovány odpověďmi na vnější podmínky nebo hormonální podněty, mohou být identifikovány různými způsoby, např. spojením požadované sekvence promotoru se sekvencí reportérového genu, transfekce rostliny konstruktem promotoru a reportérového genu a analýza exprese reportérového genu po aplikaci enviromentálních nebo hormonálních podnětů. Promotory, které neaktivují expresi reportérového genu jako odpověď na výše uvedené podněty, nebo které zapříčiňují pouze nízké nebo základní hladiny reportérového genu, mohou být identifikovány jako promotory, které nejsou podstatně aktivovány chemickými nebo enviromentálními podněty. Přijatelné hladiny nízké nebo základní hladiny budou zcela záviset na genu, který je exprimován. Jestliže tedy gen kóduje neškodný produkt, nebude pravděpodobně nízká hladina konstitutivní exprese vkládat velkou metabolickou zátěž na rostlinu. Je-li však produktem fytotoxická látka, může i nízká hladina exprese působit zhoubně.

Rekombinantní nebo izolovaná DNA tohoto vynálezu s výhodou kóduje promotor inukovatelný v odpověď na rostlinné regulátory. Rostlinnými regulátory jsou hlavně induktory SAR a mohou být přirozeného nebo syntetického původu. Mezi příklady takových induktorů SAR patří kyselina salicylová (SA), BTH (Novartis) a jejich analogy, jako 4-chlor-SA, 5-chlor-SA a 3,5-dichlor-SA, kyselina benzoová (BA), 2,3-dihydro-BA, kyselina dichlorisonikotinová (INA) a řada halogenidů těchto sloučenin (Sanchez-Casas & Klessig, Plant Physiol., 106: 1675 až 1679 (1994); Conrath a kol., PNAS, 92: 7143 až 7147(1995)).

V tomto vynálezu budou gen kódující PR protein o velikosti 21,3 kDa z Asparagus offícinalis a ekvivalentní proteiny z čeledí Lilliaceae nebo Amaryllidaceae označovány jako gen AoPRT-L. AoPRT-L má vysoký stupeň homologie s dalšími PR proteiny, zvláště s proteiny z rodiny PR-5, jako jsou osmotin z tabáku a osmotinu podobné proteiny. Několik proteinů z rodiny PR-5 bylo charakterizováno a u některých, jako například osmotinu, byla prokázána lokální a systémová aktivace při vniku patogenu a také vývojově regulovaná exprese. Na druhou stranu se zdá, že produkty genů kyselých PR-5 vykazují lokální aktivaci jako odpověď na patogeny. O vývojové expresi těchto genů je toho známo jen velice málo, přestože důkazy naznačují, že jsou také vývojově regulovány. Konstitutivní exprese byla například pozorována v pletivu, nepocházejícím z embrya, vyvíjejícího se z kukuřičného semene (Malehorn a kol., 1994 Plant Physiol., 106: 1471 až 1481) a akumulace proteinu podobného thaumatinu byla pozorována ve zrajících plodech vyšně (Fils-Lycaon a kol., 1996). Transkripční

9 · * 9 · 9 99 9

9 · 9 999 9 · 9 9

9999 99 9 99 9

999 9 999 9 9

999 ··· 999

9999 ·« 99 999 9 9 ·99 profil genu AoPRT-L se od uvedených liší tím, že není aktivován v rámci systémové odpovědi na atak patogenu a vykazuje minimální vývojově regulovanou expresi. Dále AoPRT-L není, na rozdíl od genů PR-5, indukován při odpovědi na řadu podnětů včetně ABA a ethylenu. Jak kyselina salicylová, tak její syntetický analog BTH mají schopnost indukovat expresi kontrolovanou promotorem AoPRT-L.

Zde uvedená molekulová hmotnost AoPRT-L je pouze předpokládaná a je odvozena z počtu aminokyselin přítomných v proteinu. Protein o hmotnosti 21,3 kDa kódovaný genem AoPRT-L obsahuje 223 aminokyselin. Molekulové hmotnosti odpovídají nemodifikovanému proteinu a neberou v úvahu jakékoli změny způsobené posttranslačními modifikacemi.

Výše uvedená molekulová hmotnost odpovídá pouze proteinu kódovanému genem AoPRT-L z Asparagus officinalis. Odborníci v oboru budou jednoduše schopni identifikovat ekvivalentní proteiny z čeledí Lillyaceae nebo Amarylidaceae s použitím standardních způsobů známých v oboru. Geny kódující proteiny ekvivalentní AoPRT-L mohou být například identifikovány hybridizačními studiemi nukleových kyselin, mapováním polymorfie délky restrikčních fragmentů, PCR klonováním a jinými známými způsoby. Gen AoPRT-L a jeho fragmenty mohou být použity jako sondy k identifikaci genů nebo DNA sekvencí kódujících ekvivalentní proteiny. Fragmenty AoPRT-L genu mohou být dlouhé 10, 20, 30, 50, 75 nebo 100 nukleotidů. S výhodou jsou jako sondy používány fragmenty o délce od 15 do 20 nukleotidů. Obvykle bude sonda použita k hybridizaci na geny kódující ekvivalentní proteiny za přísných podmínek. Vhodné podmínky mohou být ty, které jsou popsány v Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual, vydavatel Draper, J a kol., 1988, Blackwell Scientific Publications, str. 252 až 255, (což je zde zahrnuto ve formě odkazu), které jsou změněny následovně: prehybridizace, hybridizace a oplachy prováděny při 55 až 65 °C, závěrečné promývání v 0,5x SSC, 0,1% SDS bylo vynecháno.

Výhodnými promotory tohoto vynálezu jsou ty, které řídí expresi proteinu o molekulové hmotnosti 21,3 kDa nebo proteinu ekvivalentního z čeledí Lilliaceae nebo Amaryllidaceae. Sekvence promotoru AoPRT-L je zobrazena na obr. 6. Může být použita jak celá sekvence promotoru, zobrazená na obr. 6, tak její fragmenty. Fragmenty mohou být 20, 50, 100 nebo 150 nukleotidů dlouhé. Jsou to takové fragmenty, které zachovávají vlastnosti sekvence nativního promotoru, jmenovitě se jedná o absenci systémové aktivované nebo vývojově regulované exprese. S výhodou takové fragmenty • · · · · · · · · · • · · · · · · · · budou také indukovatelné SA nebo BTH. Izolace promotorových sekvencí zobrazených na obrázcích bude popsána v příkladech.

Promotor genu AoPRT-L z Asparagus officinalis může být izolován z rostliny s použitím technik známých v oboru. Například může být promotor izolován: i) syntézou cDNA z mRNA, která byla izolována z kultivovaných, mechanicky izolovaných buněk Asparagus officinalis·, ii) diferenčním sledováním cDNA za účelem identifikace takových klonů, které jsou indukovány při adaptaci na podmínky kultivace buněk; iii) izolací diferenčně exprimovaných cDNA, které kódují chtěný gen; iv) použitím této cDNA k nalezení sekvence kódující chtěný gen v genomové DNA Asparagus officinalis·, v) identifikací předřazených regulačních úseků chtěného genu, což zahrnuje promotor genu. Promotory ekvivalentních proteinů z čeledí Lilliaceae nebo Amaryllaceae a promotory proteinů značně homologních k proteinům z první části tohoto vynálezu mohou být identifikovány s použitím standardních technik známých v oboru. Promotor může být například izolován: i) syntézou cDNA z mRNA rostlinných buněk, o které máme zájem; ii) prohledáním cDNA knihovny za účelem identifikace klonů, které mají žádoucí expresní profil; iii) izolací klonu cDNA, o který máme zájem; iv) použitím této cDNA k prohledání genomové knihovny; v) identifikací předřazených regulačních prvků tohoto genu.

Techniky použité ve výše uvedených krocích jsou všeobecně známé. Izolace životaschopných buněk z rostliny dle bodu i) je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 93/05164. Ve stručnosti, životaschopné buňky mohou být vystřihnuty z jakékoli jednoděložné nebo dvouděložné rostliny. Buňky izolované tímto způsobem z Asparagus officinalis a umístěné do růstového média budou dediferencovat. Když budou umístěny do buněčné kultury, budou iniciovat buněčné dělení. Adaptace na podmínky buněčné kultury má za následek expresi velkého množství genů, které nemusí být za normálních podmínek exprimovaný. Jelikož indukce buněčného dělení a dediferenciace jsou znaky obvykle spojené s odpovědí na poranění u dvouděložných, předpokládá se, že promotory z tohoto vynálezu izolované z jednoděložné rostliny Asparagus officinalis mohou být použity k indukci exprese genů jak u jednoděložných, tak u dvouděložných.

Změna v expresi genů při pěstování mechanicky izolovaných buněk je činí bohatým zdrojem transkriptů genů, a tedy vhodný zdroj k výrobě cDNA knihovny. Konstrukce a diferenciální prohledávání cDNA knihovny je popsáno v WO 93/05164.

··· · · * · ····

4 44 4 4 4 · · · ·*··«· 4 · · · · ··· «·· · 4 · ···· ·· 99 449 99 994

Případně je možné vhodnost promotorů, které hybridizují k výše zmíněným promotorům z tohoto vynálezu, testovat funkční analýzou. Výhodné promotory, které hybridizují na výše zmíněné promotory, jsou takové které nevykazují podstatnou systémovou nebo vývojově regulovanou aktivaci. Sekvence promotorů, které hybridizují za přísných podmínek na celé sekvence nebo části sekvence promotoru AoPRT-L z Asparagus officinalis, promotory ekvivalentních proteinů z čeledí Lilliaceae nebo Amaryllidaceae, nebo promotory proteinů k nim podstatně homologní jsou také zahrnuty do rámce tohoto vynálezu.

K identifikaci podstatně homologních proteinů nebo promotorů může být využito speciálních počítačových programů. Například může být použito původních parametrů v programu GAP z balíku programů GCG dostupného na SEQNET Computational Molecular Biology Facility v SERC, Drasebury, Velká Británie. Tento program poskytuje skóre pro % shodnosti a % podobnosti. S výhodou patří do rámce tohoto vynálezu sekvence, které vykazují identitu vyšší než 60 % nebo podobnost vyšší než 65 %. Sekvence, které vykazují identitu 70 %, 80 %, 90 %, 95 % nebo dokonce 99 % spadají do rámce tohoto vynálezu. Odborníci ocení, že tyto meze jsou použitelné jak pro sekvence nukleových kyselin, tak proteinů (když se například někdo snaží identifikovat analog proteinu z tohoto vynálezu). Obecně platí, že když se jedná o sekvenci na úrovni nukleové kyseliny, je stanovována identita/podobnost kódující sekvence a/nebo promotoru.

Takové sekvence promotorů mohou být identifikovány s pomocí standardních a známých technik. Promotor AoPRT-L, nebo promotor ekvivalentní z čeledi Lilliaceae nebo Amarylidaceae, nebo jejich fragmenty mohou být použity jako sondy, které budou na takové promotory hybridizovat. Obvykle bude vhodný fragment obsahovat 20, 30 nebo 40 nukleotidů. Vhodné přísné podmínky byly diskutovány výše.

V druhé části se tento vynález týká promotoru složeného nejméně z úseku od -247 pb po -132 pb, citlivého k SA, který je zobrazen na obr. 6. Zvláště pak mohou být vyrobeny chimerní proteiny, které mají požadovanou expresní charakteristiku nativního rostlinného promotoru a současně schopnost indukovat expresi jako odpověď na SA, což je dáno přítomností úseku citlivého k SA, uvedeného na obr. 6.

Takové chimerní promotory mohou být vyrobeny s použitím standardních technik nebo rekombinantní DNA technologií.

Ve třetí části se tento vynález týká sekvencí dvou nebo tří indukovatelných promotorů PR proteinů (definovaných výše v první části), které jsou poskládány za sebou v sérii. Vzniklý multimerní promotor může být kombinací libovolných dvou nebo více «· 4 9 99 9 99

9 9 9 9 4 9 9 9 9

444 44 4 44 výhodných promotorů, popsaných výše, v první části. Jakékoli množství promotorů může být zařazeno do série za sebe tvoříce multimer, v závislosti na jakýchkoli velikostních a stabilitních omezeních expresního systému a požadované hladiny exprese. S výhodou se multimer skládá z nejméně 2, nejméně 5 nebo v nejlepším případě z nejméně 7 sekvencí promotoru. Sekvence promotorů z multimeru mohou být spojeny přímo jedna s druhou, nebo mohou být propojeny prostřednictvím zprostředkujících spojovacích sekvencí. Zprostředkující spojovací sekvence mohou mít jakoukoli vhodnou délku tak, aby byla umožněna efektivní funkčnost celého multimeru, a mohou být odvozené z cizí DNA. S výhodou zahrnuje multimer nejméně jednu sekvenci promotoru, která obsahuje minimální promotorovou -132 pb sekvenci zobrazenou na obr. 6. V případě, že pouze jedna ze dvou nebo více promotorových sekvencí obsahuje minimálního promotorovou -132 pb sekvenci zobrazenou na obr. 6, je výhodné, aby tato sekvence byla umístěna nejblíže genu, který má být exprimován. Ve velmi výhodném provedení této části vynálezu je poskytnuta série fragmentů sekvence promotoru zobrazené na obr. 6, operativně spojených se sekvencí minimálního promotoru -132 pb, zobrazeného na obr. 6. V nejvýhodnějším provedení fragmenty obsahují prvek od -247 pb do -132 pb citlivý k SA.

Ve čtvrté části se tento vynález týká amplifikačního systému, který obsahuje sekvenci promotoru PR proteinu podle první části tohoto vynálezu. S výhodou je promotor z tohoto vynálezu operativně spojen s transaktivační sekvencí a sekvencí druhého promotoru, která je s výhodou cílem transaktivační sekvence a je spojena s DNA kódující požadovaný produkt. Systémy, které mohou být použity k amplifikaci genové exprese, byly popsány ve W098/05789 a v Moore a kol., PNAS 95 379 až 381 (1997). Příklady amplifikačních systémů, které neobsahují transaktivační sekvenci, zahrnují systém založený na virové mRNAreplikasy (Moři a kol., FEBS. Letters, 336: 171 až 174 (1993)), v němž je promotor z tohoto vynálezu funkčně spojen s virovou replikasou a druhým genem a kde je transkript genu amplifikován replikasou.

Druhý gen může být antimediátorový. V případě, že amplifikační systém obsahuje transaktivační sekvenci, je výhodné, aby tato sekvence byla umístěna následně za sekvenci promotoru z tohoto vynálezu, a směr transkripce promotoru tohoto vynálezu a sekvence druhého promotoru jsou v sérii nebo odlišné. Výhodný konstrukt je zobrazen na obr. 16. Odborníci však ocení, že jsou možné i obměny tohoto konstruktu, které budou mít vliv na amplifikaci exprese z promotoru tohoto vynálezu. Uvažuje se o tom, že v amplifikačním konstruktu z této části vynálezu bude promotor z tohoto vynálezu řídit

4 44 44 · ·· • · · ···· · · · • ··· ♦ · · · ·

4 9 9 9 4 9 4 4

4444 49 94 494 44 494 expresi transaktivátoru. Produkt transaktivátoru bude následně iniciovat mnohočetnou transkripci kýženého genu prostřednictvím druhého promotoru. V tomto případě bude amplifikace iniciačního signálu aktivována promotorem PR proteinu z tohoto vynálezu. Amplifikační konstrukt tak umožní použití sníženého množství použitých aktivátorových sloučenin jako jsou SA nebo BTH, zatímco bude zachována vysoká hladina exprese kýženého genového produktu. V dalším provedení tohoto vynálezu je uvažováno, že multimer definovaný ve druhé části tohoto vynálezu může obsahovat část amplifikačního systému.

Transaktivační sekvence jsou známy v oboru a pro účely tohoto vynálezu může být použita jakákoli taková vhodná sekvence. Transaktivační sekvence mohou být přírodní nebo syntetické. Ve výhodném provedení tvoří LhG4 transaktivátor, který se skládá z mutovaného genu lac I z E. coli, spojeného s transkripční aktivátorovou doménou Gal4 z kvasinek. Druhou sekvencí promotoru může být jakákoli sekvence aktivovatelná transaktivátorem. V případě, že je transaktivátor tvořen LhG4, je výhodným promotorem pOP910. Je to minimální CaMV promotor, který má dvě sady vazných míst pro LhG4 protein. Další transaktivátor zahrnuje transaktivátor Tet v kombinaci s pToplO promotorem (Wienmann a kol., Plant Journal 5: 559 až 569 (1994)).

V páté části se tento vynález týká promotoru, multimeru nebo amplifikačního systému podle předchozích aspektů vynálezu operativně spojeného s DNA sekvencí kódující kýžený produkt. DNA může kódovat kýžený protein nebo produkt schopný regulovat tvorbu kýženého proteinu. Proteiny, které jsou předmětem zájmu, představují produkty, které jsou hledány ke zpracování z rostlin nebo rostlinných buněčných kultur, produkty, které mohou být exprimovány v rostlině a pozměnit vlastnosti rostliny nebo rostlinné buněčné kultury, produkty zapojené do regulace určitých vlastností rostliny a produkty jako jsou značkové geny. Zvláště vhodné jsou DNA kódující produkty, které podporují výhodné znaky transgenních rostlin. Například může nukleová kyselina kódovat protein nebo antimediátorové RNA transktipty za účelem podpory zvýšené výživné hodnoty, vyšších výnosů, rezistence vůči škůdcům, rezistence vůči chorobám, umělé sterility samčích rostlin (například barnasa nebo PR-glukanasa), sterility samičích rostlin nebo kontroly kvetení a zrání plodu. Reprezentativní nukleové kyseliny jsou například bakteriální gen dap A pro zvýšený obsah lysinu, gen Bt-endotoxinu nebo inhibitor proteas pro tvorbu rezistence vůči hmyzu, gen lytického peptidu pro rezistenci vůči chorobám, bakteriální nebo rostlinný EPSP jako rezistence vůči glyfosfátovým herbicidům (US 4 940 835; US 5 188 642; US 4 971 908; US 5 145 783; US 5 312 910; US

633 435; US 5 627 061; US 5 310 667; WO 9704103), bakteriální nebo rostlinný HPPD (WO 9638567, WO 9802562) jako rezistence k HPPD-inhibitorům herbicidů (například diketol nebo isoxazoly), chitinasa nebo glukan endo-1,3-B-glukosidasa pro fungicídní vlastnosti. Dále může být sekvence DNA zavedena proto, aby sloužila jako genetický nástroj k výrobě mutantů nebo aby pomáhala při identifikaci, genetickém značkování nebo izolaci genetických sekvencí. Příklady nukleových kyselin užitečných při modifikaci kvality zahrnují: geny enzymů biosyntézy nebo degradace škrobu (například škrobsyntasa, škrob větvící enzym), geny zásobních proteinů ze semen (například podjednotky proteinu gluteninu, gliadinů nebo hordeinů), nebo geny spojené s tvrdostí semen.

Konstrukt promotoru a genu z páté části tohoto vynálezu může dále obsahovat značkový gen, který umožní monitorování exprese heterologní DNA. Je výhodné, když je značkový gen operativně spojen s promotorem, multimerem nebo amplifikačním systémem tohoto vynálezu, v sérii s heterologní DNA kódující kýžený produkt. Indukce promotoru, multimeru nebo amplifikačního systému vede k expresi značkového genu v transformované buňce nebo rostlině. Tím je umožněno stanovit hladinu exprese kýženého produktu jednoduše, bez nutnosti zpracování nebo zničení celé rostliny nebo její části nebo kultury rostlinných buněk. Může být použit jakýkoli vhodný značkový gen. Mezi příklady patří beta-glukuronidasa, luciferasa nebo zelený fluorescenční protein (GFP).

Konstrukt z promotoru a genu může navíc obsahovat regulační sekvence, potřebné k efektivní expresi nebo směrování produktu genu. Může obsahovat například transkripční 3’ regulační signály jako jsou signály pro polyadenylaci a stejně tak jakoukoli jinou regulační sekvenci jako jsou enhancery. Vhodné 3’ polyadenylační signály jsou odvozeny z genu viru mozaiky květáku, nicméně odborníci ocení i možnost, že mohou být použity i jiné 3’ polyadenylační sekvence. Přidání přenosové peptidové sekvence je vhodné v případě, kdy má být produkt sekretován vně buňky.

Rekombinantní nebo izolovaná DNA ze kterékoli části tohoto vynálezu může nabývat podoby vektoru. Vektorem může být plazmid, kosmid nebo fág. Vektory mohou být buď přímo zavedeny do rostlinných buněk způsoby známými v oboru nebo mohou být před zavedením do rostlinné buňky nejdříve klonovány do bakterií jako je např. E. coli. V případě, že mají být vektory klonovány do mikrobiální hostitelské buňky, je vhodné, aby vektor dále obsahoval jeden nebo více značkových genů, které umožní selekci transformovaných nebo transfektovaných mikrobiálních buněk obsahujících ·· ·· 00 0 90 9

0 9 9 9 90 9 9 0 9

9999 · · * · · · ······ · · · · · ··· ··· · * 9

9009 99 99 990 09 ··· konstrukt vektoru s heterologní DNA. Mohou být také začleněny dostatečné startovací a terminační signály a regulační sekvence umožňující expresi heterologní DNA a/nebo markerového genu v mikrobiální buňce.

Šestá část tohoto vynálezu se týká hostitelské buňky transformované nebo transfektované výše popsanou DNA. Hostitelskou buňkou může být buňka rostlinná nebo mikrobiální. Tento vynález se také týká kultury transgenických rostlinných buněk jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, transformovaných promotorem, multimerem nebo amplifikačním systémem z tohoto vynálezu, s výhodou funkčně spojeného s heterologním genem. Způsoby transformace jsou popsány níže. Buněčná rostlinná kultura může být použita ke generaci celých rostlin, takže ve svém dalším aspektu se tento vynález týká transgenických rostlin, semen a propagačního materiálu, například propagovaných výhonků obsahujících DNA podle tohoto vynálezu. Mezi rostliny, jejich části nebo buňky jsou vhodné k transformaci, patří rýže, kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, cukrová třtina, tabák, řepka, slunečnice, sója, bavlník, jetel a fazole, stejně tak jako cukrová řepa, brambor, zelenina jako např. rajče, meloun, zelí, salát, mrkev, fazole, paprika a pepř.

DNA z tohoto vynálezu může být připravena jakýmkoli vhodným způsobem, který zahrnuje spojování za sebou jdoucích nukleotidů a/nebo ligaci oligo- a/nebo polynukleotidů, včetně in vitro procesů. Rekombinantní DNA technologie zůstává způsobem volby.

DNA z tohoto vynálezu může být zavedena do rostlin s použitím standardních a známých způsobů. Vhodné je, když je DNA transformována do rostlinných buněk s pomocí odzbrojeného Ti-plazmidového vektoru neseného Agrobacteriem za použití způsobů známých v oboru. Alternativně může být cizí DNA zavedena přímo do rostlinné buňky s použitím mikroprojektilového přístroje nebo jakéhokoli jiného zaváděcího fyzikálního systému. Poslední techniky jsou výhodné, když je Agrobacteria neúčinný pro trvalou transformaci, jak je tomu například při transformaci rostlinných bunék obilovin. Je výhodné, aby vektor nesl klonovací místo nebo multiklonovací místo sloužící k zavedení genů nebo jiné DNA (dále označované jako cizorodé geny), která má být zavedena do rostlinné buňky. Cizorodé geny nebo jiná DNA mohou být kontrolovány promotorem, který se liší ve svých expresních vlastnostech od promotoru z tohoto vynálezu. Cizorodý gen může být například značkový gen kontrolovaný jiným promotorem než promotorem z tohoto vynálezu. Tak jak je tomu v případě, že je konstrukt exprimován v rostlině a značkový gen může být exprimován podle vlastností promotoru, který • · · · · ·· flflflfl • flflfl flfl fl flfl · ······ fl··· · flflfl··· ··· ···· ·· ·· flflfl flfl flflfl ho řídí, a nebýt tak omezen expresním profilem promotoru tohoto vynálezu. Jakékoli vhodné techniky jsou použitelné ke stabilní inkorporaci DNA z tohoto vynálezu do jaderné DNA rostlinné buňky.

V sedmé části se tento vynález týká způsobu identifikace látek schopných regulace exprese heterologních genů, které jsou funkčně spojeny s promotorem AoPRT-L. Způsob může být složen z kroků zahrnujících aplikaci předpokládané látky ke vzorku DNA obsahujícímu promotor AoPRT-L funkčně spojený s heterologním genem. Následně je měřena hladina exprese tohoto genu a porovnána s expresní hladinou kontrolního vzorku. To zajišťuje identifikaci schopnosti této látky řídit expresi genu pomocí promotoru AoPRT-L. Předpokládané látky, které jsou předmětem zájmu, mohou být aplikovány do transformované rostliny, buněčné kultury, vzorku tkáně nebo do systému in vitro obsahujícího vzorek DNA. Látky identifikované tímto způsobem jsou s výhodou ty, které indukují expresi genu funkčně spojeného s promotorem AoPRT-L.

Látkou může být jakýkoli přírodní nebo umělý produkt, například chemické sloučeniny jako jsou proteiny, peptidy, DNA nebo RNA sekvence nebo hormony a jejich analogy. Heterologním genem, se nímž je promotor funkčně spojen, může být jakýkoli gen, s výhodou takový, který vykazuje měřitelný produkt. Výhodnými heterologními geny jsou pro tento účel takové, které kódují měřitelné značkovače, například beta-glukuronidasu nebo zelený fluorescenční protein (GFP).

Látky identifikované výše zmíněným způsobem mohou být také účinné při regulaci exprese samotného genu AoPRT-L nebo genů kódujících PR proteiny ekvivalentní nebo homologní k proteinu AoPRT-L zAsparagus officinalis. Ktěm posledně zmíněným patří PR proteiny z čeledí Lilliaceae a Amaryllidaceae nebo i dalších rostlinných čeledí. Takovéto látky mohou účinně regulovat nebo indukovat plnou nebo částečnou odpověď SAR, což je činí užitečnými jako „ochránce zemědělských plodin“ při polním použití.

Tento vynález bude nyní ilustrován následujícími příklady, které se odvolávají na doprovodné výkresy, ve kterých:

Obr. 1 ukazuje sekvenci nukleotidů cDNA AoPRT-L současně s předpovězenou aminokyselinovou sekvencí AoPRT-L. Nad sekvencí cDNA jsou vyznačeny sekvence a pozice vazeb primerů použitých při IPCR a příslušná rozpoznávací místa restrikčních endonukleas jsou podtržena.

Obr. 2 ukazuje sekvenční homologii mezi AoPRT-L a dalšími PR proteiny.

04 ·» · <4 • 40 00 00 000

400 040 ··

Obr. 3 ukazuje akumulaci mRNA AoPRT-L u rostliny Aspargus. Obr. 3(a) znázorňuje indukci exprese AoPRT-L, která následuje po mechanické izolaci mesofilních buněk kladofilu Asparagu. Obr. 3(b) znázorňuje indukci exprese AoPRT-L v pořezaných etiolovaných klíčcích Asparagu a obr. 3(c) znázorňuje expresi AoPRT-L u Asparagu, na který bylo působeno SA.

Obr. 4 znázorňuje expresi AoPRT-L mRNA po infekci Asparagu Stemphylliem versicariem.

Obr. 5 ukazuje strategii izolace promotoru AoPRT-L s pomocí IPCR.

Obr. 6 ukazuje nukleotidovou sekvenci promotoru AoPRT-L. Sekvence homologní k charakterizovaným úsekům promotorů jsou zarámovány.

Obr. 7 ukazuje výrobu konstruktu AoPRT-L-GUS.

Obr. 8 ukazuje axiální expresi AoPRT-L-GUS u transgenického tabáku v porovnání s PR-1a-GUS.

Obr, 9 ukazuje expresi AoPRT-L-GUS v lokálních a systémových pletivech transgenního tabáku infikovaného virem mozaiky tabáku (TMV) nebo Pseudomonádou syringae, patovarem phaseolicola. Aktivita GUS byla měřena fluorimetricky na základě vzniklé sloučeniny 4-metylumbelliferonu (4-MU) za minutu/mg proteinového extraktu.

Obr. 10 ukazuje indukci exprese AoPRT-L-GUS a PR-1a-GUS u transgenického tabáku, na který bylo působeno exogenní SA nebo BTH.

Obr. 11 ukazuje expresi (a) AoPR-1-GUS a (b) AoPRT-L-GUS u poraněného transgenického tabáku a (c) expresi AoPRT-L-GUS v listových discích transgenického tabáku, na který bylo působeno exogenním jasmínanem.

Obr. 12 ukazuje expresi AoPRT-L-GUS v listech transgenního tabáku, který byl kořeny vyživován buď NaCI nebo PEG 8000, který byl podroben vodnímu stresu nebo v listových discích, na které bylo působeno ABA.

Obr. 13 ukazuje expresi AoPRT-L-GUS v listech transgenického tabáku, infiltrovaných peroxidem vodíku nebo t-butylhydroperoxidem.

Obr. 14 ukazuje expresi AoPRT-L-GUS a PR1a-GUS v listových discích TO trangenického B. napus, které plavaly 3 dny ve vodě, 1 mM SA nebo 250 μΜ BTH. Data jsou průměrem 6 nezávislých transformantů/transgenů.

Obr. 15(a) je graf reprezentující delece promotoru AoPRT-L fúzovaného s reportérovým genem GUS. Obr. 15(b) ukazuje jejich odpověď na exogenní SA v TO transgenickém tabáku. Obr. 15(c) je graf znázorňující uspořádání předpokládaných úseků citlivých na SA v promotoru pMultAoPRT-L.

99 • · • 9	99 • 9»9 9 ·	9« *	• 9 9 9	99 9
* 9 9 ·	• 9 9	99 9 9	9 9 9	99
99 a 9	9·	• 9		99·		9 9	9 9

Obr. 16 je graf reprezentující konstrukt pGB24 amplifikace exprese pAoPRT-L.

Pokud není v příkladech uvedeno jinak, byly veškeré postupy výroby a manipulace s rekombinantní DNA prováděny standardními postupy a protokoly popsanými v Sambrook J., Fritsch EF. & Maniatis T a kol., Molécular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory 1989.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace cDNA AoPRT-L a charakterizace exprese AoPRT-L v Asparagus offícinalis

Jednotlivé mezofilní buňky izolované z Asparagus offícinalis jsou ve vhodném kultivačním médiu schopny dediferenciace a iniciace buněčného dělení (Harikrishna a kol., (1991) J. Exp. Bot. 42: 791 až 799). V takovýchto izolovaných buňkách dochází v průběhu adaptace na podmínky kultivačního média k velkým změnám v expresi genů, takže mRNA izolovaná z těchto buněk může být použita k získání genů specificky indukovaných v průběhu adaptace. Patří sem geny regulované poraněním a stresem. Konstrukce a prohledávání cDNA knihovny, která byla vytvořena z mechanicky izolovaných buněk A. offícinalis, bylo již dříve popsáno (WO 93/05164; Warner a kol. (1992) Plant Molécular Biology 19: 555 až 561). U jednoho klonu cDNA, představujícího diferenčně exprimovanou mRNA, bylo zjištěno, že představuje až 0,2 % cDNA knihovny. Sekvenční analýza DNA (obr. 1) ukázala, že mRNA kóduje předpokládaný protein o předpovězené molekulové hmotnosti 21,3 kDa, který je homologní ke genům podobným thaumatinu (obr. 2) a je tedy členem genové rodiny PR5. Gen byl tedy nazván AoPRTL. Analýza předpokládané sekvence proteinu ukázala, že je velmi blízce příbuzný kyselým sekretovaným PR5 proteinům (a-PR5). Produkt genu AoPRT-L je rozpoznáván polyklonálním sérem obsahujícím protilátky proti PR-5 a je sekretován vně buňky, protože je nalézán v kultivačním médiu buněk Asparagu.

Analýza hybridizace Northern blotu s použitím RNA izolované z mechanicky izolovaných buněk A. offícinalis ukázala, že AoPRT-L je zcela regulován v buňkách kladofilu (obr. 3a). V pořezaných etiolovaných klíčcích A. offícinalis (<0,5cm dlouhých) byl detekovatelný transkript AoPRT-L od třetího dne po zranění (obr. 3b). AoPRT-L se však nechová jako gen AoPR1 indukovatelný zraněním (WO 93/05164; Warner a kol., (1992) » Λ · « · • · · ·

Plant Molecular Biology 19: 555 až 561). Liší se tím, že exprese není znatelná v sekcích pořezaných etiolovaných klíčků delších než 0,5 cm a exprese v sekcích o délce < 0,5 cm se rozprostírá v celé sekci a není omezena pouze na místo poranění (obr. 3b).

Akumulace mRNA AoPRT-L byla zaznamenána po působení SA (obr. 3c) a po infekci houbovým patogenem Stemphylium versicarium (obr. 4), ale nebyla indukována sloučeninou ethephonem, která generuje ethylen.

Příklad 2

Izolace předřazených promotorových úseků genu AoPRT-L inverzní polymerázovou řetězovou reakcí

Promotorový úsek AoPRT-L byl izolován z A. offícinalis inverzní polymerázovou řetězovou reakcí (IPCR) (obr. 5). Technika byla v podstatě popsána ve WO 93/05164 a Warner a kol., (1993) Plant Journal 3: 191 až 201).

Genomové DNA z A. offícinalis byla štěpena EcoRI a opět ligována za účelem cirkulace restrikčních fragmentů a PCR provedené s primery specifickými k AoPRT-L:

P1 5’-CGCGGAATTCGGTGTAGGTGCATTTGTTGG-3’ (105 až 86 pb) a Eco Rl

P1 5’-CGCCTGCAGCCAATCCTGGACCCTCACCG-3’ (152 až 172 pb)

Pst 1

Byl získán fragment DNA o délce 0,8 kb, který hybridizoval s větší částí 5' oblasti na AoPRT-L cDNA. Tento PCR produkt byl přímo klonován do vektoru pCR 2.1 (Invitrogen) s použitím protokolu dodaného s TA klonovací výbavou Invitrogenu. Výsledný konstrukt byl pojmenován pIPCR-TA. Analýza DNA sekvence PCR produktu potvrdila autentičnost fragmentu jako obsahujícího správnou předřazenou sekvenci promotoru (obr. 6).

Zkoumání sekvence promotoru AoPRT-L (obr. 6) ukazuje homologní úseky s jinými, identifikovanými PR promotory, včetně sekvencí PR-2 z tabáku, sekvencí podobných PR-3 a PR-4 z mrkve. Ukázalo se také, že v pozici -344 až -339 je přítomna sekvence se shodou c-myc. Promotor však neobsahuje žádnou shodu G-boxu, • · • · · · · · * • · · ···· ·· ···· · · · ·· • · · · · · · ·· · • · · ··· · · ···· ·· *· ··· ··

PR-boxu nebo ABRE, což naznačuje, že pAoPRT-L nebude indukovaný ABA nebo ethylenem.

Příklad 3

Konstrukce chiméry promotoru AoPRT-L a chimérického genu GUS

Promotor AoPRT-L byl získán s pomocí PCR z pIPCR-TA s použitím primerů konstruovaných proti jak 5’, tak 3’ konci promotoru s přesahy, které poskytnou vhodná restrikční místa k dalšímu klonování:

5’-GGGTACCAAGCTTCTTATTGCGACCTGACTCTC-3’

Κρη I Hind III

5‘-CGCGGATCCGTCGACCTGCAGGATTGGTTGTGTGTTGTTTT-3'

Bam HI Sal I Pstl

Tento produkt PCR byl následně štěpen KpnI a Pstl a ligován do vektoru pJIT60 (identický spJIT30 (Guerineau a kol., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 127 až 136), ale s dvojitým, raději než jedním promotorem 35S CaMV) štěpeného stejnými enzymy. Výsledek byl pojmenován p22-JIT60. Za sekvenci promotoru AoPRT-L byla, s pomocí štěpení BamHl a EcoRI, do p22-JIT60 vklonována sekvence kódující reportérový enzym β-glukuronidasu obsahující intron (GUS(INT) vpBIuscript SK-(Firek a kol., (1993) Plant Mol. Biol., 22: 129 až 142; Jefferson a kol., (1987) EMBO J. 6: 3901 až 3907; Vancanneyt a kol., (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245 až 250), čímž vznikl konstrukt p22-GUS(INT)JIT60. Na závěr byl z p22-GUS(INT) JIT60 uvolněn celý fragment složený z AoPRT-L promotoru a GUS s použitím KpnI a Xhol a ligován do binárního vektoru pBIN19 (Bevan (1984) Nuc. Acid. Res. 22: 8711 až 8721), který byl před tím štěpen KpnI a Sáli, čímž vznikl p22-GUS(INT) Bin19 (obr. 7).

Gen GUS je vyhovujícím reportérovým genem, jehož exprese může být jednoduše sledována. Je na srozuměnou, že zde a v dalších příkladech použitý GUS může být zaměněn jakýmkoli jiným genem, který je předmětem zájmu, a tím umožnit chemickou indukci genu, který je předmětem zájmu.

• ·

Příklad 4

Vývojová exprese promotoru AoPRT-L u transgenního tabáku.

Konstrukt obsahující AoPRT-L promotor (p22-GUS(INT) Bin19) byl transformován do Nicotiana tabacum (ekotyp Samsun) s použitím standardních technik, které využívají transformaci zprostředkovanou Agrobacteriem tumefacíens (Draper a kol., (1988): Plant Genetic Transformation and Gene Expression - A Laboratory Manual, Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK). Exprese genu GUS řízená promotorem AoPRT-L byla testována výše popsanými technikami (Draper a kol., (1988), viz výše).

V rostlinách, na které nebylo působeno žádnou látkou či zpracováním, bylo histochemickou analýzou prokázáno, že GUS řízený promotorem AoPRT-L je exprimován pouze v okvětních lístcích a ve spojení mezi řapíkem a stélkou (listové axily) (obr. 8). Dále bylo příležitostně pozorováno histochemické barvení kořenů v blízkosti korunky (základna stélky). Promotor tedy vykazuje, ve srovnání s jinými publikovanými promotory, minimální vývojovou aktivitu.

Příklad 5

Nesystémová indukce exprese GUS řízená promotorem AoPRT-L při ataku patogenu na transgenický tabák

Rostliny tabáku (ekotyp Samsun), které byly transformované s AoPRT-L-GUS, byly infikovány virem mozaiky tabáku (TMV). Bylo k tomu použito obroušení povrchu jednoho listu směsí viru a karborunda, jak bylo dříve popsáno (Bi a kol., (1995) Plant J., 8: 235 až 245). TMV indukuje hypersenzitivní odpověď, závislou na N-genu, pro kterou je charakteristický výskyt leží (ploch hypersenzitivní buněčné smrti) na infikovaném listu. Očkování tabáku Samsunu s TMV také indukuje SAR a systémovou akumulaci endogenního PR-1 a (Bi a kol., (1995), viz výše). V různých časových okamžicích po indukci byly vyříznuty listové disky z leží (tento vyříznutý materiál obsahoval také pletivo nevykazující HR, bezprostředně sousedící s leží, z neinfikovaných vnitřních leží pletiva na stejném listu a z neinfikovaného systémovového listu téže rostliny). V těchto discích byla fluorimetricky měřena aktivita GUS. Bylo zjištěno, že aktivita GUS vzrostla v očkovaných listech v pletivu, které podléhalo HR (nebo pletivu bezprostředně přiléhajícím k HR ležím), ale ne ve vnitřních lezích, ani v systémovém pletivu (obr. 9).

• · ft ·· · · · · · • ftftft ftft ·· ftftft ··

Rostliny tabáku Samsun obsahující fúzi promotoru AoPRT-L a GUS byly infikovány Pseudomonas syringae, patovarem phaseolica (2x10⁸ na ml) očkováním mezibuněčných prostor jednoho listu, jak bylo dříve popsáno (Bi a kol., (1995), viz výše). Pseudomonas syringae, patovar phaseolica indukuje v místě infiltrace nehostitelskou hypersenzitivní odpověď. Toto ošetření také indukuje systémovou akumulaci endogenních proteinů PR-1 (Bi a kol., (1995), viz výše). V různých časových okamžicích po infekci byly vyříznuty listové disky z infikovaných listů a z neinfikovaných systémových listů na téže rostlině. Vzorky odebrané z infikovaných listů zahrnovaly vzorky z místa infiltrace (směřující k, nebo právě prodělávající hypersenzitivní buněčnou smrt) a z pletiva, které nebylo infiltrováno, ležícího blízko očkovaného místa na stejném listu. V těchto discích byla stanovována aktivita GUS. V tomto případě byla aktivita GUS detekována pouze ve vzorcích z pletiva přiléhajícího k HR ležím (obr. 9). Nebyla zaznamenána žádná aktivita u pletiva podléhajícího HR nebo u systémového pletiva. To ukazuje, že za aktivitu pozorovanou u tabáku infikovaného TMV je zodpovědné spíše pletivo v okolí TMV leží než samotná leze. Vyšší aktivita pozorovaná po infekci TMV byla pravděpodobně způsobena přibližně desetinásobně vyšší hladinou SA, pozorovanou po ataku TMV, ve srovnání s atakem Pseudomonas syringae, patovaru phaseolica.

Tato data ukazují, že promotor AoPRT-L je na rozdíl od PR-1 a aktivován pouze v pletivu přiléhajícím k ležím s hypersenzitivní odpovědí a není indukován systémově.

Příklad 6

Indukce exprese GUS řízené promotorem AoPRT-L v transgenickém tabáku, na který bylo působeno SA a BTH

Rostlinám tabáku (ekotyp Samsun), které byly transformované AoPRT-L-GUS, byla podávána přes kořeny zvyšující se koncentrace SA po dobu 3 dnů, kde po této době byly odebrány listové disky a v nich fluorimetricky měřena aktivita GUS. Podstatná indukce fúze promotoru AoPRT-L a genu GUS byla zaznamenána při 1 mM SA a nízká indukce při 0,1 mM SA (obr. 10a). Fúze promotoru AoPRT-L a genu GUS je tedy o řád méně citlivá k SA než PR-1a-GUS, která je jednoznačně indukována při 10 až 100 μΜ SA (Bi a kol. (1995), viz výše; Mur a kol., (1996) Plant J. 9: 559 až 571). Při působení 1 mM SA byla zaznamenána jasná časově závislá indukce fúze promoru AoPRT-L a GUS, při porovnání s neaktivním analogem SA 4-hydroxybenzoovou kyselinou (4hBA). Toto bylo možno pozorovat 1 den po započetí působení (obr. 10b). Indukce SA • ··· • · · · · · ' . ···· ·· ·· ··· ** · se projevila u rostlin transformovaných AoPRT-L-GUS přibližně 1/3 aktivitou oproti aktivitě GUS u tabáku transformovaného pPR-1a-GUS (obr. 10c).

Transformované AoPRT-L-GUS rostliny tabáku Samsun byly postříkány 1 mM SA nebo 20 μΜ BTH (aplikované ve formě 0,01% sapogenátového roztoku použitého jako smáčecí prostředek). Rostliny byly nejdříve jednou postříkány a ponechány uschnout. Poté byly ještě týž den (den 0) postříkány podruhé. Po 3 nebo 6 dnech byly odebrány listové disky, ve kterých byla standarní fluorimetrickou metodou stanovena aktivita GUS. Bylo prokázáno, že BTH je stejně efektivní induktor exprese GUS řízené promotorem AoPRT-L jako SA (obr. 10d). Listové disky z tabáku obsahujícího fúzi promotoru AoPRT-L s GUS byly máčeny 3 až 6 dnů na vodě obsahující vzrůstající koncentraci BTH. Po této době byla aktivita GUS stanovována fluorimetricky. Aktivita GUS indukovaná BTH byla pozorována při použití 1,25 μΜ BTH (obr. 10e).

Tato data ukazují, že:

1) fúze promotoru AoPRT-L a GUS v transgenickém tabáku je indukovatelná SA.

2) fúze promotoru AoPRT-L a GUS je o řád méně citlivá ke koncentraci SA a vykazuje asi 1/3 indukci oproti konstruktu z promotoru PR-1a a GUS.

3) BTH je efektivním induktorem fúze promotoru AoPRT-L a GUS, když byla aplikována jako postřik listů nebo při použití in vitro.

Příklad 7

Poranění nebo jasmínová kyselina signálu poranění, ABA a osmotický stres nejsou schopny indukce exprese GUS řízeného promotorem AoPRT-L u transgenického tabáku

Rostliny tabáku obsahující buď fúzi promotoru AoPRT-L s GUS nebo konstrukt AoPR-1-GUS byly poraněny jedním ze tří způsobů. Listová čepel byla buď poškozena pinzetou, nastřižena nůžkami nebo poškozena kombinací rozbíjení a děrování listu za použití paličky na maso (kladiva). Po 1, 2, 3, 6 nebo 8 dnech byly odebrány listové disky z poškozeného pletiva, ve kterých byla měřena aktivita GUS. AoPR-1 je poraněním indukovaný gen exprimovaný v seříznutých etiolovaných klíčcích A. offícinalis. Konstrukt AoPR-1-GUS je také po zavedení do tabáku indukovatelný poraněním (Warner a kol., (1994) Plant J., 6: 31 až 43; Mur a kol., (1996) Plant J., 9 559 až 571). Aktivita GUS • ·

9

9 9 99 • · · · 9 ·

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9

999 9 9 9 9 9 řízeného promotorem AoPR-1 byla zvýšena všemi třemi způsoby poranění. Zvýšená aktivita byla detekovatelná 1 až 2 dny po poranění (obr. 11a). Na druhou stranu nebyl objeven žádný vzrůst exprese GUS řízeného promotorem AoPRT-L po žádném poranění. Jedinou výjimkou bylo mírné zvýšení aktivity 8. den po poranění pinzetou, které pravděpodobně nebylo způsobeno poraněním, protože v tomto stádiu je pletivo již velice vysušené (obr. 11b).

Poranění listů tabáku (s použitím kladiva) nebo infekce tabáku Pseudomonas syringae patovarem phaseolica indukuje lokální akumulaci fytohormonu jasmínové kyseliny (JA), která souvisí s poraněním (Kenton a kol., navrženo; Mur a kol., (1997) Trends in Microbiol., 5: 297 až 300). Listové disky z tabáku osahujícího fúzi promotoru AoPRTL a GUS byly ponechány 3 dny na vodě, která obsahovala vzrůstající koncentraci JA. Potom byla měřena aktivita GUS v závislosti na čase standardní fluorimetrickou metodou. Ve srovnání s flotací 1 mM SA, nebyla JA schopná indukovat zvýšení aktivity GUS řízeného promotorem AoPRT-L v žádné testované koncentraci (obr. 11).

Tato data ukazují, že konstrukt složený z promotoru AoPRT-L a GUS byl v zásadě necitlivý k mechanickému poškození, v porovnání s expresí fúze promotoru indukovatelného poraněním s GUS (promotor AoPR-1 a GUS). Navíc konstrukt AoPRT-L-GUS není indukován JA, která je známým signálem při poranění, ani ethylenem.

Příklad 8

K podstatné indukci exprese konstruktu promotoru AoPRT-L a GUS v transgenickém tabáku nedocházelo při působení stresu v důsledku zvýšené koncentrace solí ani sucha, ani při působení abscisové kyseliny (ABA), coby hormonu spojeného se stresem.

Jelikož AoPRT-L patří do rodiny 5 PR proteinů, kam také patří geny indukovatelné suchem jako jsou např. osmotiny, byla testována také odezva na řadu stresů spojených s vodou. Ani vysoká koncentrace soli, ani 20% PEG 8000 neindukovaly expresi konstruktu promotoru AoPRT-L a GUS u transgenického tabáku (obrázky 12a a 12b), přičemž oba tyto vlivy indukují expresi osmotinu nebo genů podobných osmotinu u několika druhů. Slabý nárůst exprese byl zaregistrován u tabáku, obsahujícího konstrukt promotoru AoPRT-L s GUS, který nebyl dvacet dnů zaléván. V této době byly rostliny velmi zvadlé (obr. 12c). Podobně i vysoká koncentrace ABA indukovala slabý nárůst u AoPRT-L-GUS v listových discích transgenického tabáku (obr. 12d). Dva body by měly být zdůrazněny: 1) Hladina indukce suchem nebo ABA je obvykle o řád nižší • · • · než tomu bylo při indukci s použitím SA. 2) Jak dehydratace, tak ABA indukují podstatnou ztrátu proteinů v tabáku, proto zjevný vzrůst aktivity GUS mohl být artefaktem způsobeným rozdílnou citlivostí GUS (ve srovnání s některými dalšími hlavními proteiny v listech) k mechanismu ztráty proteinů.

Tato data ukazují, že promotor AoPRT-L je v podstatě necitlivý ke stresu vyvolanému suchem a že jakkoli nízká hladina exprese, která se může vyskytnout, je pravděpodobná jen u rostliny s výrazným poškozením.

Příklad 9

Konstrukt promotoru AoPRT-L a GUS je necitlivý k prooxidantům.

Objev faktu, že aktivita GUS řízená promotorem AoPRT-L je zvýšena v pletivu těsně přiléhajícím místu ataku patogenu naznačuje roli SA coby původce indukce. Nicméně produkce částic reaktivního kyslíku (ROS) v průběhu interakce patogenu s rostlinou přitahuje v posledních letech značný zájem. Ve zkratce, rozpoznání patogenu rostlinou se projeví tvorbou průlomu H₂O₂. V současné době je nejoblíbenějším modelem tohoto „oxidativního průlomu“ to, že H₂O₂ se vytváří dismutací peroxidu, který byl vyroben NADPH oxidasou z buněčného povrchu. Několik genů spojených s obranným systémem (včetně AoPR1) je přímo citlivých k H₂O₂ (Bi a kol., (1995), viz výše). Navíc jsou vysoké hladiny H₂O₂ schopné vyvolat syntézu SA (Neuenschwander a kol., (1995), Plant Journal 8; 227 až 233); Summermatter a kol., (1995), Plant Physiology 108: 1379 až 1385). Nakonec akumulace ROS probíhá také při zmrazování, při účinku ozonu a UV stresu. Zvýšená hladina ROS byla také nalezena ve stárnoucích pletivech.

Aby bylo možné zjistit, zda oxidativní stres indukuje vysokou hladinu genové exprese řízené promotorem AoPRT-L, byl H₂O₂ infiltrován do listových ploten z transgenického tabáku, který obsahoval konstrukt promotoru AoPRT-L a GUS (obr. 13a). U použitých koncentrací H₂O₂ bylo prokázáno, že indukují expresi AoPR1-GUS u tabáku (Bi a kol., (1995), viz příklad 5). H₂O₂ nebyl schopen indukovat expresi AoPRT-L-GUS v testované koncentrační škále. H₂O₂ má však v apoplastech omezený poločas rozpadu (okolo 10 minut - Levine a kol., (1994) Cell 79: 583 až 593), proto byl pokus opakován se stabilním peroxidem t-bí/řy/-hydroperoxidem (obr. 13b). A opět nebyla detekována exprese GUS navzdory vážnému viditelnému poškození pletiva, které se objevilo při • * vyšších koncentracích t-buřy/-hydroxyperoxidu (na rozdíl od H2O2, který neprodukoval žádné viditelné symptomy).

Tato data ukazují, že na rozdíl od PR-1a (Bi a kol., (1995) - viz příklad 5; Neuenschwander a kol., (1995) Plant Journal 8 227 až 233), není pravděpodobná exprese genu řízená promotorem AoPRT-L i za podmínek silného ROS stresu nebo v přítomnosti poškození pletiva způsobeným ROS.

Příklad 10

Promotor AoPRT-L je indukován SA a BTH u Brassica napus.

Fúze AoPRT-L-GUS byla přemístěna z pJIT60-P22 GUS-int jako Sstl - Xhol fragment do pTZ19 (Pharmacia) štěpeného Sstl a Sáli, čímž byl vytvořen pGB4. Gen AoPRT-L-GUS byl poté klonován jako fragment HindlII do HindlII místa na binárním vektoru SCV-nos nptll (WO 96/30529), čímž byl vytvořen pGB4-SCV, ve kterém je směr transkripce AoPRT-L stejný jako u genu nptll. pGB4-SCV byl přemístěn do kmene Agrobacteria pGV2260 a transformován do rostlin B.napus vyrobených agrobakteriovou transformací, jak bylo popsáno v Moloney a kol., (1989) Plant Cell Reports 8: 238 až 242. U transformovaných rostlin dosahovala aktivita GUS podobných hladin po působení 1 mM SA nebo 250 μΜ BTH (obr. 14). Rostliny obsahující AoPRT-L-GUS a PR1 vykazovaly také podobné hladiny exprese aktivity GUS při indukci SA nebo BTH (obr. 14).

Příklad 11

Promotor AoPRT-L je indukován SA a BTH v Zea mays.

Rostliny kukuřice obsahující AoPRT-L-GUS byly vyrobeny biolostickou transformací kalusového materiálu s pJIT60-P22 GUS int. Transformované rostliny vykazovaly po působení SA nebo BTH aktivitu GUS.

Příklad 12

Identifikace a multimerizace úseku AoPRT-L promotoru, citlivého k SA/BTH.

S použitím následujících primerů vytvořených dle úseků promotoru AoPRT-L byla vytvořena série tří fúzních konstruktů delece 5’ promotoru AoPRT-L s GUS (obr. 15a):

• · fl · ♦

5’ GCGAAGCTTCCATGTCATGAGAGAAGCAC 3’ (-361 pb)

Hind III

5’ GCGAAGCTTTTGGAAACTGAATACCTACA 3’ (-247 pb)

Hind III

5’ GCGAAGCTTACAAAGGCTTAGACTTTCCA 3’ (-132 pb)

Hind III

Každý z výše uvedených primerů byl v kombinaci s níže uvedeným primerem použit k PCR reakci s použitím p22-JIT60 jako šablony:

5’ GGGATCCGTCGACCTGCAGATTGGTTGTGTGTTGTTTTTG 3’

BamHI Sáli Pstl

Produkty PCR byly klonovány jako HindlII, BamHI fragmenty do p22-GUS (INT) JIT60 štěpeného HindlII a BamHI. Výsledné chimerní geny pAoPRT-L-GUS-CaMV polyA byly klonovány jako fragmenty KpnI, Xhol do pBin19 štěpeného KpnI, Sáli. Ten byl následně transformován do tabáku Samsunu. Aktivita GUS byla u transformantů měřena po indukci listových disků pomocí 1 mM SA. Výrazné snížení aktivity bylo pozorováno po delecí do -132 pb (obr. 15b). Úsek citlivý k SA tedy leží mezi -247 pb a předpokládaným CAT (-50 -47) a TATA boxem na -64 pb až -57 pb.

Za účelem konstrukce AoPRT-L promotoru s vyšší expresí byl úsek -247 pb až -133 pb amplifikován zp22-JIT60 a vložen ve dvou kopiích před -24 pb promotoru AoPRT-L. Tento promotor AoPRT-Lx3 byl zkonstruován následně:

Níže uvedené primery byly použity na PCR fragmentu od 0 pb do -247 pb promotoru AoPRT-L z p22-JIT60.

5’ - TCTAGGTACCCTTTGCGTGGTCGACTTGGAAACTGAATACCTAC - 3’

KpnI

Sáli • ·

5’ GGGATCCGTCGACCTGCAGATTGGTTGTGTGTTGTTTTTG 3’

BamHI Sáli Pstl

Ten byl klonován jako fragment KpnI, Pstl do pUC19. Úsek -133 pb až -247 pb promotoru pAoPRT-L byl amplifikován s použitím primerů:

5’ TCTAGGTACCCTTTGCGTGGTCGACTTGGAAACTGAATACCTAC 3’

KpnI Sáli

5’ GAAAGTCTAAGCCTCGAGGGAATAAGGTACGAGTTCGTGGAC 3’

Xhol

Tento fragment byl klonován jako fragment KpnI, Xhol do plazmidů odvozeného od pUC19 mezi místa KpnI a Sáli. Tak byl vytvořen pAoPRT-Lx2. Fragment promotoru pAoPRT-L -133 pb až -247 pb byl následně klonován jako fragment KpnI, Xhol mezi místa KpnI a Sáli na pAoPRT-Lx2, čímž byl vytvořen pAoPRT-Lx3 (obr. 15c). Dále byl promotor AoPRT-Lx3 klonován jako fragment KpnI, Pstl do p22-JIT60 štěpeného KpnI, Pstl, čímž byl vytvořen pAoPRT-Lx3-JIT60. pAoPRT-Lx3 byl přemístěn z pAoPRT-L-x-JIT60 jako fragment KpnI, BamHI do p22-GUS (INT) JIT60 štěpeného KpnI, BamHI. Nakonec byl výsledný chimerní gen pAoPRT-Lx3-GUS-CaMV polyA klonován jako fragment KpnI, Xhol do pBin19 štěpeného KpnI, Sáli a byl transformován do tabáku Samsunu. Výsledné rostliny vykazovaly výrazně vyšší hladinu aktivity GUS po SA nebo BTH indukci než ekvivalentní rostliny obsahující AoPRT-L-GUS.

Příklad 13

Amplifikace exprese promotoru AoPRT-L s použitím transaktivačního systému.

Cestou, jak zvýšit aktivitu promotoru AoPRT-L, zatímco jeho přesná regulace zůstane zachována, je použití systému, který amplifikuje expresi promotoru AoPRT-L. Amplifikační systém byl vybudován s použitím transaktivátoru (popsáno ve WO 98/05789 a Moore a kol., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 95: 379 až 381). Promotor AoPRT-L je spojen se syntetickým transaktivátorem (LhG4) a cílový promotor transaktivátoru (pOP) s genem, který má být exprimován. LhG4 se skládá z mutovaného genu • · » 9 9 • ··· láci z E. coli fúzovaného s transkripční aktivační doménou GAL4 z kvasinek. pOP10 je minimálním promotorem 35S CaMV se dvěmi vazebnými místy pro protein LhG4. Jelikož transaktivátor dokáže iniciovat několik cyklů transkripce z pOP, dochází k amplifikaci počátečního signálu, který aktivoval AoPRT-L promotor.

Amplifikační systém byl zkonstruován následujícími kroky. Promotor pOP910 byl vystřižen zpX-910TAG (K. Palme, Max Plaňek Institut fůr Zůchtungsforschung, Kóln, Německo) coby fragment Sstl-Ncol a klonován do pDH68 (pDH68 se skládá z promotoru plastocyaninu hrachu (Pwee a Gray (1993) Plant J. 3: 437 až 449) štěpeného Sstl a Ncol spojeného s genem GUS intronu (D. Twell, Leicester University) klonovaného mezi místa Sstl a EcoRI vektoru pJIT30 (Guerineau a kol., (1990) Plant Mol. Biol. 15. 127 až 136). Výsledný chimérní gen pOP-GUS int-CaMV polyA byl přemístěn jako Sstl (poskytnutý necitlivý konec), Xhol fragment do klonovacího vektoru pIC19H (Marsh a kol., (1984) Gene 32: 481 až 485) štěpeného EcoRV, Xhol. Z tohoto plazmidu byl chimérní gen získán jako fragment Sáli, Xhol a klonován do pNos nptlI-SCV štěpeného Sáli. Tak byl vytvořen pWP320-SCVA. Ke konstrukci fúze pAoPRT-L k LhG4 byl nejdříve promotor AoPRT-L přemístěn jako fragment HindlII, Pstl z pGB4 do pBlueseriptu KS+ štěpeného HindlII, Pstl, za tvorby pGB21. pGALA (I. Moore, University of Oxford, UK) obsahuje gen LhG4 spojený s CaMV polyA terminátorem. Tento gen byl vystřižen jako fragment KpnI, Pstl a klonován mezi místa KpnI a Pstl vektoru pT7Blue2 (Novagen) za tvorby pGB22. Fragment Kpn (poskytnutý necitlivý konec), Notl z pGB22 byl klonován do míst Smál a Notl vektoru pGB21 za tvorby pGB23. Výsledná fúze pAoPRT-L-LhG4 byla přenesena jako fragment Sal do vektoru pWP320-SCVA štěpeného Sáli. Tak byl vytvořen pGB24 (obr. 16).

Rostliny tabáku a B. napus obsahující pGB24 T-DNA úsek vykazovaly výrazně vyšší hladinu aktivity GUS při indukci SA nebo BTH než ekvivalentní rostliny s AoPRT-L-GUS.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA obsahující indukovatelný promotor genu pro proteiny spojené s patogenezí, který:

   i) přirozeně řídí expresi proteinu o hmotnosti 21,3 kDa v Asparagus offícinalis po indukci rostlinnými regulátory; nebo ii) přirozeně řídí expresi proteinů z čeledí Lilliaceae nebo Amaryllidaceae, ekvivalentního proteinu o hmotnosti 21,3 kDa z Asparagus offícinalis·, nebo iii) přirozeně řídí expresi proteinů v podstatné míře homologního k proteinům z i) nebo ii); nebo iv) hybridizuje za přísných podmínek na jakýkoli promotor z i), ii) nebo iii).
2. 2. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 1, kde promotor, který přirozeně řídí expresi proteinu o hmotnosti 21,3 kDa z Asparagus offícinalis, je indukovatelný rostlinnými regulátory kyselinou salicylovou nebo BTH.
3. 3. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 1 nebo 2, kde protein o hmotnosti 21,3 kDa z Asparagus offícinalis patří mezi PR-5 proteiny podobné thaumatinu.
4. 4. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde promotor obsahuje sekvenci nukleotidů zobrazenou na obrázku 6.
5. 5. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA obsahující promotor s alespoň úsekem citlivým k SA od -247pb po -132 pb z obrázku 6.
6. 6. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA obsahující chimerní promotor včetně alespoň promotoru genu jiného než AoPRT-L a úsek citlivý na SA podle nároku 5.
7. 7. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA, obsahující alespoň dvě sekvence promotoru podle kteréhokoli nároku 1 až 6, uspořádané v sérii.
8. 8. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 7 obsahující mezi sekvencemi promotorů spojovací sekvence.
9. 9. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle kteréhokoli nároku 7 nebo 8, kde alespoň jeden ze promotorů obsahuje úsek citlivý k SA podle nároku 5.
10. 10. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA obsahující amplifikační systém, kde amplifikační systém je funkčně spojen s promotorem podle kteréhokoli z nároků 1 až 9.

    • ·
11. 11. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 10, kde amplifikační systém obsahuje sekvenci transaktivátoru nebo systém virové mRNA replikasy.
12. 12. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 11, kde amplifikační systém obsahuje sekvenci transaktivátoru a sekvenci druhého promotoru, kde sekvence druhého promotoru je cílem transaktivátoru.
13. 13. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 11 nebo nároku 12, kde sekvence transaktivátoru je LhG4 a sekvence druhého promotoru je pOP910.
14. 14. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 13, funkčně spojená s DNA sekvencí kódující žádaný produkt.
15. 15. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 14, kde žádaným produktem je protein nebo produkt, který je schopen řízení exprese proteinu.
16. 16. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 14 nebo nároku 15, kde když je produkt exprimován, ovlivňuje vlastnost rostliny.
17. 17. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle nároku 16, kde ovlivněná vlastnost rostliny je vybrána ze skupiny odolnost vůči patogenu, tlumení nemocí, sterilita, fertilita nebo zrání plodu.
18. 18. Rekombinantní nebo izolovaná molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 14 až 17, která navíc obsahuje značkový gen.
19. 19. Vektor obsahující rekombinantní nebo izolovanou molekulu DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 18.
20. 20. Hostitelská buňka obsahující molekulu DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 18, nebo vektor podle nároku 19.
21. 21. Hostitelská buňka podle nároku 20, kde hostitelská buňka je buňka rostlinná nebo mikrobiální.
22. 22. Transgenická rostlina obsahující alespoň jednu buňku podle nároku 21.
23. 23. Způsob identifikace látky schopné regulovat expresi heterologních genů, které jsou funkčně spojeny s promotorem podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, přičemž způsob zahrnuje kroky aplikace předpokládané látky ke vzorku, který obsahuje promotor podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 a který je funkčně spojený s genem, a měření hladiny exprese daného genu.
24. 24. Látka schopná regulovat expresi heterologních genů funkčně spojených s promotorem podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, kterou je možné získat způsobem podle nároku 23.