JPH10500312A - 真菌応答性成分を含有するキメラ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 真菌を殺滅、不能化または排除できるようになるか、或いはそれ自身が死滅しまたは真菌の生育に適さないようになることによって、真菌感染の蔓延を防止できるような、真菌感染部位を取り囲む植物細胞を有するトランスジェニック植物を製造するための、改良された真菌応答性キメラ遺伝子が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 真菌応答性成分を含有するキメラ遺伝子 本発明は、植物への真菌（fungus）の感染に応答して、真菌感染部位の周りの 植物の細胞中で実質的に選択的にＤＮＡ断片の発現を誘導するための、トランス ジェニック植物中での、ｐｒｐ１−１プロモーターの新たに同定された真菌応答 性成分（真菌応答性ｐｒｐ１−１成分）の使用に関する。本発明の真菌応答性ｐ ｒｐ １−１成分の使用は、真菌感染部位のすぐ周りの植物の細胞中で選択的に発 現される外来ＤＮＡ断片を制御するためのトランスジェニック植物において特に 有用である。 本発明はさらに、植物の形質転換に使用することができる第１のまたは真菌応 答性のキメラ遺伝子であって、該キメラ遺伝子は第一の外来遺伝子を含み、この 外来遺伝子が、 ａ）真菌感染部位のすぐ周りの植物の細胞中で発現される時、ｉ）真菌感 染部位のすぐ周りの植物細胞を死滅させるかまたは少なくとも損傷するか、又は ii）真菌感染部位の１つまたはそれ以上の真菌を死滅、損傷又は撃退することが できる生成物をコードすると共に、 ｂ）少なくとも１つの真菌応答性ｐｒｐ１−１成分を含むプロモーターの 制御下にある、 第１のまたは真菌応答性キメラ遺伝子に関する。 本発明はさらに、第１のキメラ遺伝子および随時第２または修復（restorer） キメラ遺伝子を含有するようにそのゲノムが形質転換される植物の細胞に関し、 特に第１の外来ＤＮＡが他の植物細胞を死滅または障害することができる生成物 をコードする時、第２のキメラ遺伝子は、少なくとも真菌感染部位のすぐ周りの 植物細胞以外の植物細胞中で、第１の外来ＤＮＡまたはそのコードされた生成物 を阻害または不活性化する生成物をコードする、第２の外来ＤＮＡを制御する第 ２のプロモーターを含有する。 本発明は更に、 ａ）本発明の第１のまたは随時第２のキメラ遺伝子で形質転換した本発明 の植物細胞から再生した、ナス科（Solanaceae）（例えば、トマトもしくはジャ ガイモ）またはアブラナ科（Brassicaceae）（例えば、オイルシードレープ（oi lseed rape））植物のような、真菌耐性トランスジェニック植物； ｂ）再生トランスジェニック植物およびそのような植物の種子に由来する 真菌耐性トランスジェニック植物；および ｃ）本発明の形質転換された植物細胞を含む植物細胞培養物 に関する。 本発明の植物は、真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞中の、 本発明の第１のキメラ遺伝子の真菌応答性発現と特徴とし、かつ、 ａ）すべての他の植物細胞中で第１のキメラ遺伝子の発現が、実質的に好 適には完全に存在しないか、または ｂ）例えば本発明の２のキメラ遺伝子の発現により、すべての他の植物細 胞の第１のキメラ遺伝子の発現の影響が、実質的に存在しないおよび好適には完 全に存在しない（従って、該植物は真菌感染に対して耐性となる） ことを特徴とする。 〔発明の背景〕 真菌は、非常に古い群の微生物である。有害な真菌は、ヒト、他の動物および 特に植物の疾患を引き起こす。約８０００種の真菌が植物の疾患を引き起こし、 すべての植物は何らかの真菌による攻撃を受ける。ある植物病原性真菌は多くの 植物種を攻撃し、あるものは１つの植物種しか攻撃しない。 一般に、真菌による植物の疾患は２つのタイプに分類できる。１つは土壌の真 菌により引き起こされるものであり、他は空中の真菌により引き起こされるもの である。土壌の真菌は、最も広範で重大な植物の疾患の幾つか（例えばフサリウ ム種（Fusariumu spp.）の引き起こす根腐れ病や幹腐れ病、およびフィトフソラ 種（Phytophthora spp.）の引き起こす根腐れ病）を引き起こす。 空中の真菌は、風により遠くまで拡散するため、破壊的な損害（特に、広範囲 の地域で栽培されている穀物で）を引き起こす。これらの病原体の多くは、多種 類の穀物に対して広範囲の流行病を引き起こしてきた。空中の真菌が引き起こす 重要な疾患には、コムギの黒サビ病（プクキニア・グラミニス（Puccinia grami nis））、トウモロコシの黒穂病（ウスチラゴ・メイディス（Ustilago maydis） ）、およびジャガイモやトマトの疫病（late blight disease）（フィトフソラ ・インフェスタンス（Phytophthora infestans））である。 これらの多くの真菌による疾患は、防除することが難しく、農業従事者や栽培 業者は、種々の方法（そのような疾患に対して、例えば、衛生的方法、耐性品種 、および有効な真菌剤）の組合せを使用する必要がある。植物病原性真菌の化学 的制御のために、毎年何億ドルもの費用が費やされている。従って、植物病原性 真菌を制御するために、より有効でかつ安全な新しい方法が必要である。 植物は真菌疾患に対する防御機構を有することが知られている。植物は真菌の 攻撃を認識すると、真菌感染部位のすぐ周りの細胞に幾つかの反応を誘導して応 答することが知られている。最初の感染により耐性機構が活性化され、侵入する 真菌病原体の蔓延を防ぐ（Ward et al，1991）。耐性機構には、過敏性応答とし て知られている局所的細胞死、フィトアレキシンの蓄積、および木化がある（De Wit，1987）。真菌感染の蔓延を防ぐのに非常に有効なこの応答の特異性は、宿 主と病原体の遺伝子構成に依存する。 品種／品種特異的宿主／病原体の相互作用を制御する遺伝成分の特徴解析は、 現代の分子植物病原学研究のゴールである。防御関連遺伝子の転写活性化は、植 物が病原体候補との接触に対応することを可能にする複雑な防御機構の一部であ る（Collinge and Slusarenko，1987; Hahbrock and Scheel，1989; Bowles，19 90）。植物宿主による病原体の最初の認識が、シグナル変換連鎖によって防御反 応の誘導と結びつける反応を解明するために、防御関連遺伝子の発現を制御する ｃｉｓ−作用性成分の同定が求められている（Lamb et al.，1989）。幾つかの 他の宿主／病原体系で見いだされているように（van Loon，1985; Hahlbrock an d Scheel，1989）、疫病の起因菌である真菌フィトフソラ・インフェスタンス（Ph ytophthora infestans）によりジャガイモを感染させると、フェニルプロパノイ ド代謝とＰＲ蛋白の酵素をコードする遺伝子が転写活性化される（Fritzemeier et al，1987; Kombrink et al，1988; Taylor et al，1990）。これらの遺伝子 の転写は、異なるジャガイモ品種と異なるフィトフソラ・インフェスタンス（ph ytophthora infestans）種との間の適合性および非適合性相互作用の速度論と同 様の速度論で誘導される。大きなｐｒｐ１遺伝子ファミリーのメンバー（ハプロ イドゲノム当たり１０〜１５個の非常によく似たコピーを有する）である、「病 原性関連」（すなわち、「ＰＲ」）−蛋白の１つのヌクレオチドおよび推定アミ ノ酸配列は、大豆のＨＳＰ２６熱ショック蛋白をコードする遺伝子の対応する配 列と驚くほどよく似ている（Taylor et al.，1990）。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリ ダイゼーシヨン実験によって、ＰＲＰ１−１転写体は真菌侵入部位の周りに蓄積 することが示されたが、ジャガイモの防御機構におけるこの蛋白の機能は不明で ある。同族の大豆ＨＳＰ２６蛋白は、植物の低分子量熱ショック蛋白群内のユニ ークなメンバーであり、広範囲のストレス条件下で極めて高い相対的濃度で現れ る（Czamecka et al.，1984,; Vierling，1991）が、細胞代謝における役割は知 られていない。ｐｒｐ１−１遺伝子と他のナス科の種（Solanaceous species） の幾つかの既知のＰＲ−蛋白の間での配列の類似性は見いだされていない(Taylo r et al., 1990)。ＰＣＴ特許公報ＷＯ９３／１９１８８号およびMartini et al ．(1993)（何れも参考のため本明細書に引用）では、ｐｒｐ１−１プロモーター の２７３塩基対（ｂｐ）断片でも、真菌感染によりＤＮＡ配列の局所的発現を誘 導することが見いだされたが、未変性のｐｒｐ１−１プロモーターとは異なり、 プロモーター成分は重金属塩により誘導されないことが見いだされた。 ｃｉｓ−作用性成分のレベルで今日までに解析された、病原体防御に関連する 蛋白をコードする多くの植物遺伝子はまた、機械的傷害、光および／または高濃 度の重金属のようなストレス刺激によっても活性化される（Oshima et al.，199 0; Schmid et al，1990; Stermer et al，1990; Douglas et al，1991; Joos an d Hahlbrock，1992）。植物−線虫相互作用において、タバコＲＢ７プロモータ ー の一部は、ある種の線虫が感染したときに根で誘導される線虫給餌構造であり、 選択的および局所的発現を与えることが見いだされた（Opperman et al.，1994 ）。 最近の報告は、真菌病原体に対するあるレベルの耐性は、トランスジェニック 植物中で抗真菌蛋白を発現することにより得られることを示している。その例と しては、キチナーゼ単独（Benhamou et al.，1993）またはグルカナーゼとの組 合せ（Zhu et al.，1994）、オスモチンの発現（Lie et al.，1994）、またはあ るＰＲ蛋白の発現（Alexander et al.，1993）がある。 〔発明の概要］ 本発明によれば、真菌感染に際してキメラ遺伝子の発現を誘導することができ るが、配列番号１のＤＮＡ配列に比較すると、根での発現が実質的に低く、およ び／または植物ホルモン適用による誘導が有意に低いｐｒｐ１−１プロモーター 領域の部分、好適には、真菌感染によりキメラ遺伝子の発現を誘導することがで きるが根での発現が実質的になく、また植物ホルモン適用に対する応答が有意に 低いｐｒｐ１−１プロモーター領域の部分が提供される。 更に、本発明によれば、配列番号１のＤＮＡ配列から直接または間接に得られ るが、配列番号１の１〜１００位のヌクレオチドが欠如しているか、または２３ ９〜２７３位のヌクレオチドが欠如している真菌応答性ｐｒｐ１−１成分、また は配列番号１のＤＮＡ配列から直接または間接に得られる真菌応答性ｐｒｐ１− １成分であって、かつ： ａ）配列番号１のヌクレオチド１００位と１７６位の間の位置から、ヌク レオチド２７３位までのヌクレオチド配列を含む（ただし、真菌応答性成分は配 列番号１のＤＮＡ配列ではない）か、または ｂ）配列番号１のヌクレオチド１位から、ヌクレオチド１５３位と２３９ の間の位置までのＤＮＡ配列を含む（ただし、真菌応答性成分は配列番号１のＤ ＮＡ配列ではない）、 真菌応答性ｐｒｐ１−１成分が提供される。 最も好適な真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は、ヌクレオチド１〜２３９位の配列 番号１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１〜１５３位の配列番号１のＤＮＡ配列、ヌ クレオチド１００〜２７３位の配列番号１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１４０〜 ２７３位の配列番号１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１７６〜２７３位の配列番号 １のＤＮＡ配列、およびＤＮＡ配列が基本的に同じプロモーター活性を有するよ うに実質的に同じヌクレオチド配列を有する任意の真菌応答性成分（その結果、 該ＤＮＡ配列は基本的に同じプロモーター活性を有する、よりなる群から選択さ れるものである。 また、新たに同定された真菌応答性ｐｒｐ１−１成分の任意のものも本発明に 含まれる（ただし、この真菌応答性プロモーターは図１のＤＮＡ配列を含まない ）。 本発明にはさらに、本発明の真菌応答性プロモーター以外に、真菌感染部位の 周り、好適にはすぐ周りの植物の細胞中で産生もしくは過剰産生される時に、ａ ）真菌を死滅、損傷又は撃退するか、またはｂ）該真菌感染部位の周り、好適に はすぐ周りの植物細胞を死滅させるか、もしくはその代謝、機能および／または 成長を少なくとも有意に妨害して、真菌のさらなる蔓延を制限する、第１のＲＮ Ａおよび／または蛋白またはポリペプチドをコードする第１の外来ＤＮＡ；およ び該真菌感染部位の周りの好適にはすぐ周りの植物細胞中で第１の外来ＤＮＡを 発現するための適当な３’転写停止シグナルを含む、真菌応答性キメラ遺伝子が 包含される。 また本発明によれば、本発明の第１のキメラ遺伝子と、特に第１の外来ＤＮＡ が上記タイプｂ）の場合には任意に第２のもしくは回復キメラ遺伝子とを、好適 にはこれらが同じ遺伝子座中に含有されるように、ゲノムが形質転換された植物 細胞であって；この第２のキメラ遺伝子は、以下の機能的にリンクしたＤＮＡ配 列を含む植物細胞が提供される： １）少なくとも真菌感染部位の周り、好適にはすぐ周りの細胞以外の植物 細胞中で外来ＤＮＡの転写を指令することができる、真菌抑制性プロモーターの ような第２のプロモーター； ２）少なくともそのような他の植物細胞中で産生または過剰産生されると 、少なくともそのような植物細胞中の第１の外来ＤＮＡまたは第１のＲ ＮＡまたは蛋白もしくはポリペプチドを阻害もしくは不活性化する、第２のＲＮ Ａおよび／または蛋白もしくはポリペプチドをコードする第２の外来ＤＮＡ；お よび ３）少なくともそのような植物の他の細胞中で第２の外来ＤＮＡを発現す るための適当な３’転写停止シグナル。 さらに、本発明によれば、本発明の形質転換された植物細胞から再生される真 菌耐性植物、これに由来する真菌耐性植物および種子、並びにその各々が本発明 の形質転換された植物細胞を含む植物細胞培養物が提供される。 本発明によればさらに、本発明の第１のまたは真菌応答性キメラ遺伝子、およ び随時本発明の第２のキメラ遺伝子で植物のゲノムを形質転換する工程を含む、 １つまたはそれ以上の真菌、特に、フィトフソラ（Phytophthora）（例えば、フ ィトフソラ・インフェスタンス（P．infestans））、およびクラドスポリウム（ Cladosporium）（例えば、クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum ）、ピチウム種（Pythium spp）、フサリウム種（Fusarium spp）、スクレロチ ニア種（Sclerotinia spp）、プクキニア種（Puccinia spp）、ウスチラゴ種（U stilago spp）、アルテマリア種（Altemaria spp）、ヘルミントスポリウム種（ Helminthosporium spp）、セプトリア種（Septoria spp）、ピレノフォラ種（Py renophora spp）、ボツリチス種（Botrytis spp）、エリシフェ種（Erysiphe sp p）、ならびにピレノペリザ・ブラシシー（Pyrenoperiza brassicae）、シリン ドロスポリウム・コンセントリカム（Cylindrosporium concentricum）、フォー マ・リンガム（Phoma lingam）、レプトスフェリア・マキュランス（Leptosphae ria maculans）、スクレロチニア・スクレロトイラム（Sclerotinia sclerotoir um）、ボツリチス・シネリー（Botrytis cinerea）、エリシフェ・クルシフェロ ルム（Erysiphe cruciferorum）、ペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora par asitica）、プラスモジオフォラ・ブラシシー（Plasmodiophora brassicae）、 およびシュードセルコスポレラ・カプセラ（Pserdocercosporella capsella）の ような植物病原性真菌に対して、植物を耐性にする方法が提供される。 〔発明の詳細な説明〕 本願明細書での説明および請求の範囲においては、以下の定義を使用する。 本明細書において使用する「真菌感染性植物」とは、少なくとも１つの真菌種 、特に植物病原性真菌種、例えばフィトフソラ種（Phytophthora spp）、クラド スポリウム種（Cladosporium spp）、ピチウム種（Pythium spp）、フサリウム 種(Fusarium spp)、スクレロチニア種(Sclerotinia spp)、プクキニア種(Puccin ia spp)、ウスチラゴ種（Ustilago spp）、アルテマリア種（Altemaria spp）、 ヘルミントスポリウム種（Helminthosporium spp）、セプトリア種（Septoria s pp、ピレノフォラ種（Pyrehophora spp）、ウスチラゴ種（Ustilago spp）、ボ ツリチス種（Botrytis spp）、エリシフェ種（Erysiphe spp）、ならびにピレノ ペリザ・ブラシシー（Pyrenoperiza brassicae）、シリンドロスポリウム・コン セントリカム（Cylindrosporium concentricum）、フォーマ・リンガム（Phoma lingam）、レプトスフェリア・マキュランス（Leptosphaeria maculans）、スク レロチニア・スクレロチオラム(Sclerotinia sclerotiorum)、ボツリチス・シネ リー(Botrytis cinerea)、エリシフェ・クルシフェロルム（Erysiphe crucifero rum）、ペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora parasitica）、プラスモジオ フオラ・ブラシシー（Plasmodiophora brassicae）、およびシュードセルコスポ レラ・カプセラ（Pserdocercosporella capsella）のような、真菌種により感染 される植物である。 本明細書において使用する「プロモーター」とは、転写の開始時にＤＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、（直接または間接に）該ＲＮＡポリメラ ーゼが結合するＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは、転写開始部位、並びに 転写開始因子とＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含んでおり、また遺伝子制御蛋 白が結合する可能性のある種々の他の部位を含んでもよい。本明細書において使 用する「ｐｒｐ１−１プロモーター」は、ｇｓｔ１という名称も示唆されている (Hahn & Strittmatter，1994)ｐｒｐ１−１遺伝子の本来のプロモーター配列を 意味し、Maritni et al.(1993)の図３に記載の部分配列を特徴とする。本明細書 において使用する「２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーター」とは、ｐｒｐ１− １プロモーターの２７３塩基対断片を意味し、Martini et al.(1993)により、真 菌感染部位において迅速で厳密に局在化された転写活性化に充分であると記載さ れている。２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーターは、配列番号１に示す。 本明細書において使用する「真菌応答性プロモーター」とは、プロモータであ って、その植物におけるＤＮＡ配列の転写を制御する作用が、１）真菌、特に植 物病原性真菌による植物の感染により誘導（すなわち、刺激）され、２）真菌感 染部位の周り、好適には真菌感染部位のすぐ周りの植物細胞中において、実質的 に選択的に、好適には独占的に存在するプロモーターを意味する。 本明細書において使用する「真菌抑制プロモーター」とは、植物中でＤＮＡ配 列（例えば、遺伝子）の転写を制御するその作用が、植物病原性真菌が植物に感 染することにより局所的に抑制される（すなわち、部分的または完全に阻害され る）プロモーターを意味する；そしてこの抑制作用は、真菌感染部位の周りの、 特に真菌感染部位のすぐ周りの植物細胞中において、実質的に選択的に、好適に は独占的に起きる。好適には、このプロモーターは植物中で構成的に発現される が、真菌感染部位で局所的に抑制される。 本明細書において使用する「植物プロモーター」または「植物発現性プロモー ター」とは、植物細胞中で転写を開始させることができるプロモーター配列を意 味する。これは植物起源の任意のプロモーター、および植物起源ではないが植物 細胞中での転写を可能とする任意のプロモーター（すなわち、Ｔ−ＤＮＡや３５ Ｓもしくは１９Ｓプロモーターのようなウイルス起源または細菌起源のある種の プロモーター）を意味する。 真菌応答性プロモーターに関して本明細書で使用する「真菌応答性成分」とは 、プロモーターの真菌応答性に関与するプロモーターの成分または一部を意味す る。プロモーターは、最小のプロモーター成分やエンハンサー領域以外に、幾つ かの真菌応答性成分を有することができる。本発明において好適な真菌応答性成 分は、図１に示す実施例１の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分である。 「人工的な過敏性細胞死」とは、本発明の第１のキメラ遺伝子で形質転換され た植物に対して該第１のキメラ遺伝子により与えられ、病原体感染部位での植物 細胞の壊死が関与し、こうして病原体のさらなる蔓延を制限するような、植物防 御機構を意味する。この機構は、非融和性の植物／病原体相互作用で起きる天然 の過敏性細胞死に似ている。 本発明の第１のまたは第２の外来ＤＮＡのようなＤＮＡ配列に関して「外来」 とは、そのようなＤＮＡがその供給源の植物、細菌、動物、真菌、またはウイル スなどに天然に存在する時と同じゲノム環境で、本発明のそのようなＤＮＡによ り形質転換される植物細胞中では存在しない（例えば、同じプロモーターおよび ／または３’末端に機能的に結合はしていない）ことを意味する。従って本発明 の外来ＤＮＡは、本来は植物ゲノム中に見いだされるＤＮＡであるが、内因性Ｄ ＮＡに比較して異なる遺伝子座または部位に挿入されているＤＮＡを含有する（ この意味でヨーロッパ特許公報（ＥＰ）０３４４０２９号も参照されたい）。 本明細書において使用する「真菌耐性植物」とは、通常の真菌感染解析（この 方法は例えばＷＯ９３／１９１８８号に記載されている）により測定した時、真 菌病原体に対して耐性が向上した植物を意味する。真菌耐性植物は典型的には、 野性型植物と比較して真菌の攻撃下での作物としての性能（例えば、収率）が優 れている。 本発明の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分に関して本明細書において使用する「選 択的発現」とは、真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞中での特 異性の高い発現を意味する。本明細書において使用する選択的発現という用語は 、ある成長の段階で植物の他の細胞（例えば、必須でない植物細胞）で起きる発 現を排除するものではなく、プロモーター部分が真菌病原体により独占的に誘導 されなければならないことを意味するものではない。 本明細書において使用する「真菌感染部位のすぐ周りの細胞」とは、真菌のす ぐ近くに位置する細胞を意味する。好適には真菌感染部位のすぐ周りの細胞は、 本発明の１のキメラ遺伝子の局所的発現により死滅させられるかもしくは悪影響 を受ける時、（直接または間接に）真菌のさらなる増殖や蔓延を防止するものを 意味する。 本明細書において使用する「必須植物細胞」とは、破壊されたりその機能が阻 害されたりした時、農作物としての植物の収率または価値に悪影響を与えるよう な植物の細胞を意味する。ヨーロッパのジャガイモ塊茎生産場のジャガイモの花 の細胞、または切り花として売られる植物の約の花粉細胞、またはその死滅もし くは機能不全が組織の機能に影響しない細胞のように、植物の経済的価値に必須 でない細胞もある。 本発明において、真菌病原体によりより選択的に誘導される２７３塩基対ｐｒ ｐ １−１プロモーターの部分、すなわち、根発現が実質的に喪失し、および／ま たは植物ホルモン適用による誘導が有意に低いが、それでも真菌感染により局所 的発現誘導性を与える部分が同定されている。本明細書において使用する「真菌 応答性ｐｒｐ１−１成分」という用語は、有意な真菌応答性を保持するが非標的 発現の喪失および／または植物ホルモン適用に対する低応答性のような改良され た特徴を有する、ＷＯ９３／１８１９９号の２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモー ターの部分（配列番号１に示してある）である、新たに同定された真菌応答性プ ロモーター成分を意味する。真菌応答性ｐｒｐ１−１成分のこの定義に包含され るものは、配列番号１の２７３塩基対ｐｒｐ１−１ＤＮＡの任意の部分である。 ただし、この部分を含有するプロモーターからの転写は、２７３塩基対ｐｒｐ１ −１プロモーターと比較して、植物ホルモン適用による誘導が有意に低いかおよ び／または実質的に根での誘導が低い。好適には、これらの真菌応答性ｐｒｐ１ −１成分は、配列番号１の２７３塩基対ｐｒｐ１−１ＤＮＡの植物ホルモン応答 性の約５％未満、より好適には約２〜４％未満であり、好適には根で組織化学的 に検出できない発現を有する（実施例２に記載のＧＵＳ結合マーカー遺伝子解析 により同定される）。 ２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーターの欠失解析は、２７３塩基対ｐｒｐ１ −１プロモーターの根発現は、配列番号１のヌクレオチド２３９〜２７３位の部 分にあることが証明された。同時にｐｒｐ１−１プロモーター由来であるが、こ の部分の欠失、置換または変化のため根での有意な発現が欠如している、真菌応 答性プロモーターを作成することができる。またこの欠失解析により、真菌感染 により誘導されるがサリチル酸やインドール酢酸のような植物ホルモンによる誘 導は有意に低い真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は、配列番号１のヌクレオチド１７ ６〜２７３位の間に位置することが証明された。すなわち、本発明の好適な真菌 応答性ｐｒｐ１−１成分は、配列番号１のＤＮＡ配列から直接（すなわち、配列 番号１に示すＤＮＡ配列に通常の分子生物学的方法を応用することにより）得ら れるか、または間接的（すなわち、配列番号１のＤＮＡ配列から理論的に得られ る；例えば、インビトロＤＮＡ合成）に得られるが、配列番号１の１〜１００位 のヌクレオチドの欠如したプロモーター成分であり、好ましくは、配列番号１の ＤＮＡ配列から直接または間接に得られるが、配列番号１の２３９〜２７３位の ヌクレオチドの欠如したプロモーター成分である。あるいは、配列番号１の１〜 １００位のヌクレオチドまたは２３９〜２７３位のヌクレオチドのＤＮＡ配列は 、ヌクレオチドの欠失、付加または置換（例えば、部位特異的突然変異誘発）に より機能しなくさせることにより、本発明の配列番号１のＤＮＡ配列由来の、好 適な真菌応答性ｐｒｐ１−１成分を得る。 本発明の好適な真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は、真菌応答性成分としてヌクレ オチド１００〜１７６位の間のヌクレオチドからヌクレオチド２７３位までの配 列番号１のＤＮＡ配列、または配列番号１のヌクレオチド１位から、ヌクレオチ ド１５３〜２３９位の間の位置までの配列番号１のＤＮＡ配列を含むものである 。ただし、これらの真菌応答性プロモーターは、その真菌応答性成分として配列 番号１のＤＮＡ配列を含まないか、または２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモータ ーと比較した時に有意に低い植物ホルモン応答性および／または実質的に低い発 現を示すものである。 本発明の特に好適な真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は、ｄｅｌＢ３４（配列番号 １中のヌクレオチド１４０〜２７３位）、ｄｅｌＢ３５（配列番号１中のヌクレ オチド１００〜２７３位）、およびｄｅｌＢ５１（配列番号１中のヌクレオチド １７６〜２７３位）と呼ばれるものであり、２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモー ターと比較した時、サリチル酸やインドール酢酸適用に対して有意に低い応答性 を示すものである。本発明の更に好適な真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は、ｄｅｌ Ｘ４（配列番号１中のヌクレオチド１〜２３９位）、およびｄｅｌＸ５（配列番 号１中のヌクレオチド１〜１５３位）と呼ばれるものである［これらの部分は２ ７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーターによる根の先端で観察される発現が実質的 に（すなわち、劇的に）喪失しており（ＷＯ９３／１９１８８号、例えば、根の ｄｅｌＸ４−もしくはｄｅｌＸ５−ＧＵＳキメラ遺伝子により組織化学的に検出 可能なＧＵＳ蛋白はない）、２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーターと比較する とサリチル酸やインドール酢酸適用に対して応答性が有意に低いが、有意な真菌 応答性を保持しているため、好ましい］。また、この定義には、前記で定義した ｄｅｌＸ４、ｄｅｌＸ５、ｄｅｌＢ３４、ｄｅｌＢ３５、およびｄｅｌＢ５１Ｄ ＮＡ配列のいずれかに実質的に同様のＤＮＡ配列を有する、天然のまたは人工的 プロモーター成分（すなわち、あるヌクレオチドが欠失、置換または付加されて いるが、実質的に同じプロモーター的特徴が保持されているもの）が含まれる。 本発明において、真菌耐性植物は、公知の方法で植物細胞を形質転換して、少 なくとも１つの第１の外来ＤＮＡを含む本発明の第１のキメラ遺伝子を、その各 ゲノムの中に安定に挿入することにより、植物の１つの細胞から産生することが できる。ここで、該外来ＤＮＡは、本発明の少なくとも１つの真菌応答性ｐｒｐ １−１成分を含む真菌応答性プロモーターの制御下にあり、該真菌応答性プロモ ーターは、ＷＯ９３／１９１８８号に記載の２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモー ター成分を含まないか、または該真菌応答性プロモーターはＷＯ９３／１９１８ ８号の２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーターよりも、根でのおよび／または植 物ホルモン適用による有意に低い転写活性を有し；そして、その下流（すなわち 、３’末端、または３’非翻訳トレーラー（trailer）配列の下流）で、ポリア デニル化シグナルを含む適当な転写停止（または制御）シグナルに融合している 。好ましくは、第１のキメラ遺伝子において、真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は３ ５Ｓ最小プロモーターのような最小プロモーター成分と組合せて使用される。 こうして、第１のＲＮＡおよび／または蛋白またはポリペプチドは、主に真菌 感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞中で産生または過剰産生される 。１つまたはそれ以上のこれらの真菌応答性ｐｒｐ１−１成分は、内因性または 外来ＴＡＴＡボックスと共に、およびエンハンサー領域もしくは、例えばOpperm an et al.(1994)が記載した線虫応答成分のような他の病原体応答性と共に、プロ モーター中に存在することができる。また、本発明の真菌応答性ｐｒｐ１−１成 分は、任意のプロモーター配列に取り込まれて、そのプロモーターに病原体（例 えば、真菌）感染に応答する能力を与えることができる。例えば、本発明の同じ かまたは異なる真菌応答性ｐｒｐ１−１成分はまた、複数の連続コピーで連結さ して、本発明の数個の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分を含むプロモーターを形成す ることもできる（Benfey et al.，1990）。 植物細胞ゲノムはまた任意に、少なくとも１つの第２の外来ＤＮＡを含む第２ のキメラ遺伝子で随時安定に形質転換することができる：ここで該第２の外来Ｄ ＮＡは、少なくとも第１の外来ＤＮＡが発現される植物細胞中で第２の外来ＤＮ Ａの発現を指令することができが、真菌感染部位の周り、好適にはすぐ周りの細 胞中では好適には抑制されるような、第２のプロモーターの制御下にある。ある いは、第２のプロモーターは、第１の外来ＤＮＡの発現が、真菌感染部位の周り ではない、好適にはすぐ周りではない細胞に傷害を与えるような植物細胞中で、 第２の外来ＤＮＡの発現を実質的に選択的に指令することができる。第２のキメ ラ遺伝子は、ポリアデニル化シグナルなどの適当な転写停止シグナルを、さらに 含有する。形質転換された植物細胞から再生される植物の子孫への第１のキメラ 遺伝子と第２のキメラ遺伝子の共同の分離を、高い確度で保証するために、第２ のキメラ遺伝子は、好適には第１のキメラ遺伝子と同じ遺伝子座中にある。しか しある場合には、そのような共同分離が必ずしも常に好ましい訳ではなく、第２ のキメラ遺伝子が第１のキメラ遺伝子と異なる遺伝子座にあることもある。第１ の外来ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白が植物細胞の生存性に影響を与える場合（例え ば、１の外来ＤＮＡがバマーゼ（bamase）蛋白をコードする場合）には、真菌応 答性プロモーターが真菌感染部位のすぐ周りの植物細胞中で選択的にまたは独占 的に誘導される時でも、第２のＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白も、すべての必須の植 物細胞中（好適には、真菌感染部位の周りの細胞以外のすべての植物細胞中）で 発現されて（例えば、第１の外来ＤＮＡがバマーゼ（bamase）蛋白をコードする 場合、第２のＤＮＡはバースター（barstar）蛋白をコードするであろう）、植 物 成長のどの段階においても真菌感染部位の周りではない細胞に悪影響を与えるプ ロモーターの発現を防止することが好ましい。 第２のキメラ遺伝子において、第２の外来ＤＮＡはまた、３５Ｓ最小プロモー ターのような最小プロモーターの制御下にあってもよい。本明細書において使用 する「最小プロモーター」とは、コード領域の基礎レベルの発現を開始すること ができて、幾つかのＲＮＡ、蛋白またはポリペプチドを産生させるＤＮＡ配列で あって、少なくともＴＡＴＡボックス領域を含む、好適には３５Ｓ遺伝子のヌク レオチド−４８〜＋８位までの３５Ｓ最小プロモーターである（Benfey et al., 1990）。典型的には、最小プロモーターはＲＮＡポリメラーゼIIにより認識さ れるＤＮＡ配列（例えば、ＴＡＴＡボックス）であるが、植物ゲノム中のＲＮＡ の少ない発現を可能にする任意のｃｉｓ−作用性ＤＮＡ配列であってもよい。そ のような最小プロモーターは、挿入された遺伝子の周りの植物ゲノムＤＮＡ中に 位置することもでき、この場合第２のキメラ遺伝子は植物発現性プロモーターを 含有しなくてもよい。 本発明において、第１のキメラ遺伝子中の第１の外来ＤＮＡは、第１のＲＮＡ および／または蛋白またはポリペプチドをコードするＤＮＡ断片であり、これは 真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞中で産生または過剰産生さ れる時、ａ）周りの植物細胞を死滅させたか、または少なくともその代謝、機能 および／または成長を妨害して、進入する真菌のさらなる蔓延を制限し；および ／またはｂ）真菌がそのような周りの植物細胞に感染する時、その真菌を死滅、 損傷または撃退する。第１の外来ＤＮＡは、好適には例えば周りの植物細胞を死 滅させるか、もしくはその代謝、機能および／または成長を少なくとも有意に妨 害する以下のものをコードする：ＲＮａｓｅ、例えばバマーゼ（bamase）、ＲＮ ａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＳＡ（ＳＡＲＮａｓｅ）、またはビナーゼ（binase）； 毒性蛋白、例えばジフテリアＡ毒素（例えば、Palmiter et al.，1987）、リシ ン、またはボツリン。第１の外来ＤＮＡの候補は、エンドヌクレアーゼ（例えば 、ＥｃｏＲＩ）のようなＤＮａｓｅ；パパインのようなプロテアーゼ；植物ホル モンの合成を触媒する酵素、例えばイソペンテニルトランスフェラーゼ、または アグ ロバクテリウム（Agrobacterium）のＴ−ＤＮＡの遺伝子１と遺伝子２の遺伝子 産物の合成を触媒する酵素；グルカナーゼ；リパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ； 植物細胞壁インヒビター、リボゾーム不活性化蛋白（例えば、Stirpe et al.，1 992）およびリボザイムがある。このような第１の外来ＤＮＡの他の好適な例と しては、周りの植物細胞の代謝、機能および／または成長に必須の成分をコード する遺伝子に相補的なＲＮＡをコードするアンチセンスＤＮＡである。このよう なアンチセンスＲＮＡは、内因性ｐｒｐ１−１ＲＮＡに相補的であり、真菌感染 部位で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの作用を阻害する（Ha hn and strittmatter，1994）。 別の戦略では、病原体がより直接に死滅させられるかまたは悪影響を受ける時 、第１の外来ＤＮＡは、例えば真菌を死滅、撃退または損傷させる以下の第１の ポリペプチドまたは蛋白をコードする：溶解酵素、例えば真菌の細胞壁の加水分 解を触媒する、キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ；プロテアーゼイン ヒビター(Ryan，1990);真菌阻害性リボヌクレアーゼ(ＷＯ９４／１８３３５号) ；およびレクチン（Broekaert et al，1989）;および抗真菌活性を有する他の植 物蛋白、例えばトウモロコシから単離される小塩基性ペプチドであるＣＭIII（ ＥＰ４６５００９号）、およびオスモチン様蛋白（ＥＰ４６０７５３号およびＷ Ｏ９４／０８１０号）、ならびにBroekaert et al.(1992)が記載したアマランツ ス・カウダツス（Amaranthus caudatus）種子からの抗真菌ペプチド、Cammue et al.(1992)が記載したミラビリス・ジャラパ（Mirabilis jalapa）種子からの抗 真菌ペプチド、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／２０８００号に記載のアスペルギルス・ギ ガンテウス（Aspergillus giganteus）からの抗真菌ペプチド、ＥＰ４６５００ ９号に記載のトウモロコシの種子からの塩基性ペプチドであるＣＭIII、ＰＣＴ特 許公報ＷＯ９３／０５１５３号とTerra et al(1992)に記載の大根からのＲｓ− ＡＦＰ蛋白、そして植物アレキジン（Hain et al.，1993）をコードする遺伝子 。 第１の外来ＤＮＡはまた、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９１／１５５８５号に記載の 非毒性遺伝子（例えば、ａｖｒ９遺伝子）および／または対応する耐性遺伝子Ｒ ＮＡ（例えば、Ｃｆ９遺伝子）をコードするＤＮＡ配列であってもよい。この戦 略では、 Ｃｆ９遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列（Jones et al.，1994）は、真菌応答 性ｐｒｐ１−１成分（例えば、実施例１のｄｅｌＸ４）の制御下にあり、ａｖｒ ９コード領域（Van Den Ackerveken et al.，1992）は、真菌応答性ｐｒｐ１− １成分の制御下、または傷害誘導もしくは構成性プロモーターの制御下にあって もよい。Ｃｆ９トマト植物では、ａｖｒ９コード領域は、ｄｅｌＸ４真菌応答性 成分を含むプロモーターに結合して、真菌感染部位で局所的壊死を引き起こすこ とができる。新たに同定された真菌応答性ｐｒｐ１−１成分を含むプロモーター もまた、他の植物病原体の毒性／非毒性遺伝子の組合せの成分の転写を開始させ ることができるか、または植物で真菌耐性を得るための他の方法（例えば、分子 的植物−微生物相互作用に関する第７回国際シンポジウム（the 7th Internatio nal Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions）、エジンバラ大学 （例えば、The Plant Cell，October 1994，pp.1332-1341を参照）に記載のもの ）に応用することができる。第１の外来ＤＮＡは、天然に存在するものまたは完 全にもしくは部分的に人工（例えば、合成）のものであってもよいが、ＤＮＡ配 列により本来コードされるものと同じ蛋白または実質的に同じ活性を有する蛋白 がコードされる。コードされる蛋白の配列を変えることなくＤＮＡ配列またはＲ ＮＡ配列を大きく変更できることは公知であり、従って普通に観察される生物活 性を越えてＤＮＡまたはＲＮＡの活性または機能を大きく変更することなく、Ｄ ＮＡ配列またはＲＮＡ配列の幾つかのヌクレオチドを変えることができる。また 、外来ＤＮＡ配列の高度の発現が必要な場合は、異種宿主細胞中でのＤＮＡ配列 の非効率的な転写または翻訳を防ぐために、ＤＮΛ中の幾つかのヌクレオチドを 変更してもよい。 幾つかの選択された植物−病原体相互作用については、真菌の病原性が毒素の 産生に大きく依存する場合は、本発明の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分はまた、病 原性真菌により生成される毒素を阻害するＲＮＡ、蛋白またはポリペプチドをコ ードするＤＮＡの選択的転写を駆動させることができる。ある種の植物−真菌相 互作用では、そのような真菌毒素の産生は病原性にとって必須の要因である（Sc hafer，1994）。同様に、天然の植物の抗真菌毒素を無毒化する真菌酵素のイン ヒ ビターは、本発明により感染部位で選択的に発現することができる。ギウマノミ セス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）の病原性変種は、１つの真菌酵 素により、植物アベナシン（avenacin）を無毒化することが知られている（Scha fer，1994）。同様に、そのような真菌酵素のインヒビターは、真菌病原体に対 する耐性を与えるために、植物細胞により選択的に産生または分泌させることが できる。特に興味深いものは、カノーラ（canola）植物でレプトスフェリア・マ キュランス（Leptosphaeria maculans）（フォーマ・リンガム（Phoma lingam） の無性世代）により産生されるフォマリド（phomalide）毒素である（Soledade et al.，1993）。真菌感染部位において選択的に、このペンタデプシペプチドの 毒性作用を阻害する戦略を作成することができるであろう。 あるいは、本発明の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分により、真菌感染部位におい て選択的に抗真菌抗体を発現させることができる。 本発明の第１のキメラ遺伝子中の第１の外来ＤＮＡで形質転換した植物は；真 菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞が、実質的に選択的な方法で 植物の真菌応答性破壊により過敏性応答を与えること；または、例えば真菌感染 部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞により実質的に選択的にその場（in situ）で産生される真菌毒素により、真菌が死滅、撃退または障害されること によって、真菌感染に対して耐性となるであろう。 本発明の好適な真菌応答性プロモーターは、図１のｄｅｌＸ４またはｄｅｌＸ ５真菌応答性ｐｒｐ１−１成分、より好適にはｄｅｌＸ４真菌応答性ｐｒｐ１− １成分を含む。本発明の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分に対する実質的な配列相同 性を有する真菌応答性成分は、通常の方法でハイブリダイゼーションプローブと して実施例１（および図１）に記載のプロモーター断片を用いて、他の植物（例 えば、レープシード（rapeseed）、コーンなど）のゲノムＤＮＡ中で同定するこ とができる。真菌感染により上昇した欠失断片ｄｅｌＸ４およびｄｅｌＸ５の特 異性によって、これらの改良されたプロモーター部分およびｐｒｐ１遺伝子ファ ミリーの他のメンバーの類似の部分は、真菌感染による植物での局所的転写活性 化の特異性を改良させるｃｉｓ−作用性成分を与えるのに適した候補になるよう である。 適当な植物発現性の第２のプロモーターの例としては以下のものがある：単離 物ＣＭ１８４１（Gardner et al，1981）、ＣａｂｂＢ−Ｓ（Franck et al，198 0）およびＣａｂｂＢ−Ｊｌ（Hull and Howell，1987）のカリフラワーモザイク ウイルスの強い構成性３５Ｓプロモーター；比較的弱い構成性ｎｏｓプロモータ ー（De Picker et al，1982）；および傷害誘導性プロモーター、例えばＴ−Ｄ ＮＡのそれぞれ１’および２’遺伝子の発現を指令するＴＲ１’およびＴＲ２’ プロモーター（Velten et al，1984）。あるいは、１つまたはそれ以上の植物組 織または臓器（例えば、葉）、特に、真菌に感染されないが第１の外来ＤＮＡが 発現される特異的組織または臓器（例えば、根）に対して特異的な、第２のプロ モーターを使用することができ、こうして第２のキメラ遺伝子が、特異的な植物 組織または臓器でのみ発現される。別の方法では、発現が誘導性であるプロモー ターを用いる（例えば、温度因子または化学的因子）。本明細書において使用す る第２のプロモーターとは、真菌感染により真菌感染部位の周りの、好適にはす ぐ周りの植物細胞中で、本発明の真菌応答性または第１のプロモーターより低い レベルで絶えず転写を指令するプロモーターであり、その結果真菌感染部位で第 １の外来ＤＮＡは完全には阻害または不活性化されない。 本発明の別の実施態様においては、第２のプロモーターは真菌抑制性プロモー ターであり、例えば転写を制御するその作用が、真菌感染部位の周りの、好適に はすぐ周りの植物細胞中で真菌感染によりダウンレギュレーションまたは阻害さ れる、本来的に構成性の植物プロモーターがある。そのような真菌抑制性プロモ ーターの例は、ボツリチス・シネリー（Botrytis cinerea）により感染された植 物中の３５Ｓプロモーターである（植物分子生物学の第４回国際会議（the 4th International Congress of Plant Molecular Biology）でのDr．R.Hainによる 口頭発表、アムステルダム、１９９４年６月１９−２４日）。 本発明において、第２のキメラ遺伝子中の第２の外来ＤＮＡは、植物細胞中で 産生または過剰産生された時に、そのような細胞中で発現される第１の外来ＤＮ Ａまたは任意の第１のＲＮＡ、蛋白またはポリペプチドを阻害または好適には不 活性化する、第２のＲＮＡ、および／または蛋白またはポリペプチドをコードす るＤＮＡ断片である（特に、第１のＲＮＡ、蛋白またはポリペプチドが、そのよ うな細胞を死滅させるかまたはその代謝、機能または成長に悪影響を与える場合 ）。第２の外来ＤＮＡは好適には、例えば以下のものをコードする：バーナーゼ （barnase）（これは任意のグアニン残基の後の結合を加水分解することにより ＲＮＡ分子を分解する）の活性を中和するバースター（barstar）、ビナーゼ（b inase）の活性を中和するビンスター（binstar）、サーナーゼ（sarnase）の活 性を中和するサースター（sarstar）；エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの活性を 妨害するＥｃｏＲＩメチラーゼ；またはパパインのようなプロテアーゼの活性を 中和するプロテアーゼインヒビター（例えば、パパインチモーゲン（zymogen） 、およびパパイン活性蛋白）、または第１の外来蛋白を特異的に不活性化する抗 体または抗体断片。 第２の外来ＤＮＡの別の好適な例は、ジフテリア、リシン またはボツリンＲＮＡの活性を阻害するアンチヤンスＲＮＡのような、第１のＲ ＮＡのセンス鎖に相補的な、第２のＲＮＡのアンチヤンス鎖をコードする（例え ば、ＥＰ２２３３９９号に記載されている）。 本発明の第１および第２のキメラ遺伝子において、３’転写停止シグナルまた は３’末端は、植物細胞中で正しい転写停止およびｍＲＮΛのポリアデニル化を 提供できるものから選択することができる。転写停止シグナルは、転写される第 １および第２の外来ＤＮＡの天然のもの、または外来性のものでもよい。３’転 写停止シグナルの例には、オクチピン（octopine）シンターゼ遺伝子（Gielen e t al，1984; Ingelbrecht，1989）、３５Ｓ遺伝子（Sanfacon et al，1991）お よびＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Velten and Schell，1985）のものがある。 また本発明のキメラ遺伝子は、本来のまたは外来のイントロンを含有してもよ い。植物イントロンは、特に単子葉植物のトランス遺伝子の発現を増加させるこ とが記載されている（Callis et al，1987）。イントロンはまた、細菌のクロー ニング工程の際に遺伝子の正しい発現を妨害するので、非常に有用である。 植物、特にアグロバクテリウム（Agrobacterium）により感染され得る植物細 胞のゲノムは、本発明の第１のキメラ遺伝子および任意に第２のキメラ遺伝子を 含 有し、且つアグロバクテリウム（Agrobacterium）に含まれる無力化したＴｉ− プラスミドベクターを用いて形質転換することができる。この形質転換は、例え ばＥＰ１１６７１８号、ＥＰ２７０８２２号、ＥＰ６０４６６２号、およびGoul d et al(1991)に記載の方法を用いて行われる。好適なＴｉ−プラスミドベクタ ーは、ボーダー配列の間に第１のキメラ遺伝子と第２のキメラ遺伝子を含有する か、またはＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの少なくとも右のボーダー配列の左に 位置している。もちろん、直接の遺伝子移送（例えば、ＥＰ２３３，２４７号に 記載）、花粉介在形質転換（例えば、ＥＰ２７０，３５６号、ＰＣＴ公報ＷＯ８ ５／０１８５６号、および米国特許第４，６８４，６１１号に記載）、植物ＲＮ Ａウイルス介在形質転換（例えば、ＥＰ６７，５５３号および米国特許第４，４ ０７，９５６号に記載）、およびリポソーム介在形質転換（例えば、米国特許第 ４，５３６，４７５号に記載）のような方法を用いる場合には、植物細胞を形質 転換するために他のタイプのベクターを使用することができる。形質転換される 植物がトウモロコシの場合、より最近の進歩した方法、例えばＥＰ６０４６６２ 号に記載の方法およびFromm et al(1990)およびGordon-Kamm et al(1990)による トウモロコシのある株について記載された方法、およびＰＣＴ特許公報ＷＯ９２ ／０９６９６号に記載の穀類についての方法を用いることが好ましい。得られる 形質転換体は、通常の方法で、形質転換された植物を再生するために使用するこ とができる。 本発明の第１および第２のキメラ遺伝子は、植物ゲノム中で同じ遺伝子座中で 挿入すること、好適には真菌応答性プロモーターと第２のプロモーターのｃｉｓ −作用性成分の間の干渉が最小になるように挿入されることが好ましい。好まし くは、第１および第２のキメラ遺伝子はそれぞれ、通常のキメラマーカー遺伝子 として、同じ遺伝子座の植物細胞ゲノム中に挿入される。マーカーＤＮＡの選択 は決定的に重要ではない（例えば、既知のマーカー遺伝子のリストについてはPl ant Molecular Biology Labfax(1993)を参照）。マーカーＤＮＡはまた、形質転 換された植物細胞に識別可能な色を与える蛋白（例えば、ジヒドロクエルセチン −４−リダクターゼ（Meyer et al，1987））をコードすることができる。 得られる形質転換体は、通常の増殖方法で使用することにより、同じ特質を有 する多くの形質転換体を産生することができ、或いは、同一もしくは関連する植 物のうちの他の変種、または本発明の少なくとも１つの形質転換植物との交配か ら得られる雑種植物中に、第１のキメラ遺伝子および随時第２のキメラ遺伝子を 導入することができる。形質転換された植物から得られる種子は、安定なゲノム 挿入体として本発明のキメラ遺伝子を含有する。 本発明の別の実施態様において、真菌応答性ｐｒｐ１−１成分を含み、且つ選 択可能またはスクリーニング可能なマーカーＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白（例えば 、ＧＵＳマーカー蛋白（実施例参照））の発現を指令するキメラ遺伝子で形質転 換された植物は、マーカー遺伝子の発現で検出されるので、真菌応答性ｐｒｐ１ −１成分を選択的に誘導する分子のスクリーニングに使用できる。これらの分子 は、病原体に対する本来の耐性を向上させる可能なエンハンサーとして作用する ことができる（Doemer et al.，1990; Kessmann et al.，1994）。 以下の実施例では、本発明の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分の単離と性状解析、 および植物に真菌耐性を与えるためのプロモーター有効性部分の使用について説 明する。実施例に特に記載がなければ、すべての核酸の操作は、Sambrook et al 、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Ma nual）（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク（1989）、およびAusub el et al.、分子生物学の現代の方法(Current Protocols in Molecular Biology )、Current Protocols，USA(1994)の第１巻と第２巻に記載の方法により行なっ た。植物の分子的作業のための材料と方法は、ビオス・サイエンティフック・パ ブリケーションズ社（BIOS Scientific Publications Limited）（英国）および ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ社（Blackwell Sc ientific Publications）（英国）（1993）により共同出版された、R.R.D．Croy によるPlant Molecular Biology Labfaxに記載されている。 以下の実施例においては、下記の図および配列表が参照される： 図１ ２７３塩基対ｐｒｐ１−１プロモーターの欠失断片の略図。示されたヌクレ オチドの位置は、２７３塩基対プロモーター中の位置であり、Martini et al.(1 993)の本来のｐｒｐ１−１プロモーターの−４０２〜−１３０位に対応する。 配列表 配列番号１は、ｐｒｐ１−１プロモーターの２７３塩基対のＤＮＡ配列を示 す。この配列の最初のヌクレオチドと最後のヌクレオチドは、それぞれ２７３塩 基対ｐｒｐ１−１プロモーターの−４０２位と−１３０位に対応する（Martini et al.，1993）。 〔実施例〕実施例１：ｐｒｐ１−１プロモーター欠失断片の作成 Martini et al.(1993)に記載のプラスミドｐＢＳ２７−１は、ベクターｐＢＳ （＋）［ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア 州から購入した］中に、ＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限部位を介して挿入されたジャ ガイモｐｒｐ１−１遺伝子の−４０２〜−１３０位をカバーするプロモーター配 列（ｐｒｐ１−１配列の５’末端は、該ベクターのＢａｍＨＩ部位で連結させた Ｓａｕ３Ａ部位であり、ＸｂａＩ部位はＸｂａＩリンカーを用いてｐｒｐ１−１ 配列に付加し、その結果ｐｒｐ１−１配列の３’末端はベクターのＸｂａＩ部位 に連結された）を含有している。このプラスミドを出発物質として使用して、エ キソヌクレアーゼIII［ダブル−ストランディッド・ネスティッド・デリージョ ン・キット（Double-Stranded Nested Deletion Kit）、ファルマシア（Pharmac ia）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン、から購入した］で処理してｐｒｐ１ −１配列の欠失を作成した。３’末端欠失の作成のために、プラスミドｐＢＳ２ ７−１をＸｂａＩで消化し、次にエキソヌクレアーゼIIIで処理して、配列番号 １の１〜２３９位（ｄｅｌＸ４）と配列番号１の１〜１５３位（ｄｅｌＸ５）を カバーするｐｒｐ１−１プロモーター領域を得た（図１を参照）；ＸｂａＩリン カーを付加後、ＤＮＡを再環状化してプラスミドｐＢＳ２７−１／ｄｅｌＸ４と ｐＢＳ２７−１／ｄｅｌＸ５を作成した；５’末端欠失体の作成のために、プラ スミ ドｐＢＳ２７−１をＢａｍＨＩで切断し、次にエキソヌクレアーゼIIIで処理し て、１００〜２７３位（ｄｅｌＢ３５）、１４０〜２７３位（ｄｅｌＢ３４）お よび１７６〜２７３（ｄｅｌＢ５１）をカバーするｐｒｐ１−１プロモーター領 域を得た（図１）；ＢａｍＨＩリンカーの付加後、ＤＮＡを再環状化して、プラ スミドｐＢＳ２７−１／ｄｅｌＢ３５、ｐＢＳ２７−１／ｄｅｌＢ３４およびｐ ＢＳ２７−１／ｄｅｌＢ５１を得た。すべてのプラスミドでｐｒｐ１−１挿入体 の長さは、配列決定により求めた（Saner et al.，1977）。次にＥｃｏＲＩとＸ ｂａＩで切断して、プラスミドからｐｒｐ１−１プロモーター領域を単離した； そしてＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したベクターｐＥＴＶｇｕｓ（Martini et a l.，1993）中に挿入した；こうしてｐｒｐ１−１プロモーター配列は、ＣａＭＶ ３５ＳＴＡＴＡボックス領域（−４８〜＋８）、大腸菌（E．coli）のｂ−グル クロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子のコード領域、およびナシのｒｂｓＳ−３Ｃ遺伝 子（Benfey and Chua，1990）のポリアデニル化シグナルの５’末端に位置して 、ｐＥＴＶｇｕｓ２７−１／ｄｅｌＢ３５、ｐＥＴＶｇｕｓ２７−１／ｄｅｌＢ ３４、ｐＥＴＶｇｕｓ２７−１／ｄｅｌＢ５１、ｐＥＴＶｇｕｓ２７−１／ｄｅ ｌＸ４、およびｐＥＴＶｇｕｓ２７−１／ｄｅｌＸ５を与えた。これらのプラス ミドを大腸菌Ｓ１７−１株から、ヘルパープラスミドｐＭＰ９０ＲＫ（Koncz et al.，1989）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移動した。ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuber osum）Ｌ.）デジレ（Desiree）変種の形質転換は、De Block(1988)が概説した葉 円盤法（leaf disc technique）に従って行なった。適切に形質転換した植物は 、ＧＵＳ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ解析に より同定した。一次再生体を用いて塊茎を作成し、最終的に塊茎増殖植物の４〜 ６週令の切断部分を発現実験に使用した。トランスジェニック植物は、植物のゲ ノムに組み込まれたキメラ作成体に基づいて命名した：ｄｅｌＸ４、ｄｅｌＸ５ 、ｄｅｌＢ３４、ｄｅｌＢ３５およびＤＥＬＢ５１。これらの断片の長さと、ｐ ｒｐ １−１プロモーター中のその相対的位置を図１に示す。実施例２：トランスジェニックジャガイモ植物におけるマーカー遺伝子／ｐｒｐ １−１欠失作成体の発現 トランスジェニックジャガイモ植物の葉（１つの作成体につき２〜７個の独立 の株）を、既に記載されているように（Martini et al.，1993）、フィトフソラ ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）１−１１品種で感染させ、対照 として、葉を水で処理した。植物ホルモンによる刺激のために、コルクボーラー を用いてトランスジェニック葉がら直径０．５cmの円盤を切り抜き、１mMのイン ドール−３−酢酸（ＩＡＡ）または１０mMのサリチル酸ナトリウム（ＳＡ）を含 有する水溶液中で、一定の白色光の下で１８℃でインキュベートした。対照とし て、葉の円盤を水でインキュベートした。真菌の胞子で３日間インキュベート後 、または植物ホルモンで処理開始２４時間後に、葉材料を採取した。種々のｐｒ ｐ １−１プロモーター断片に媒介された転写活性化は、Jefferson（1987）に従 って、葉材料からの全蛋白抽出物中のｂ−グルコロニダーゼ活性を測定して求め た。 感染していない根のキメラ作成体の構成的発現は、トランスジェニック株から 無菌的に増殖させた根材料の組織化学的ＧＵＳ染色により測定した。切り離した 根を、１００mMのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と０．５mg/mlのＸ−ｇｌｕ ｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルｂ−Ｄ−グルクロニド）からなる 溶液で真空浸潤させた。次に３７℃で１６時間、酵素反応を進行させた；次に根 を７０％エタノールに移して、顕微鏡で観察した。 ＧＵＳ酵素活性の誘導速度（Jefferson，1987に従って測定した）を、真菌感 染および水処理した切り離した葉、または植物ホルモン処理した葉の円盤と水処 理した葉の円盤で比較した結果を表１に示す。さらに、感染していない根の構成 性ＧＵＳ活性の検出を、この表に示す。本発明のＧＵＳコード領域に融合した３ ５Ｓ最小プロモーターのみを含む対照作成体は、フィトフソラ・インフェスタン ス（Phytophthora infestans）による感染または植物ホルモン適用によっても、 幾つかの試験で検出できる量のＧＵＳ酵素を産生しなかった。根でもＧＵＳ酵素 は検出できなかった。表１から、最も興味深い株を選択することができる（例え ば、検出できる根の発現はないことと組合せて、高い真菌応答性と植物ホルモン 適用に対する低い応答性の組合せを有するｄｅｌＸ４−４または−３）。ｄｅｌ Ｂ３ ４−８株は、すべての値が非常に小さいためおそらく欠陥があるであろう。実施例３：植物形質転換ベクターの作成 後に詳細に記載するように、同定された真菌応答性ｐｒｐ１−１断片を用いて 本発明の第１のキメラ遺伝子を作成した。次に、これを用いて、例えば本発明の 第２のキメラ遺伝子共に、植物形質転換ベクターを作成した。好適なプロモータ ーは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのヌクレオチド−４８〜ヌクレオチド＋８の ＣａＭＶ３５Ｓ最小プロモーター断片に機能的に結合した、実施例１（図１）のｐｒｐ １−１プロモーター断片ｄｅｌＸ４またはｄｅｌＸ５を含む（Benfey et al.，1990）。プロモーター断片のそれぞれは、バシラス・アミロリクエファシ エンス（Bacilus amyloliquefaciens）由来のバマーゼ（bamase）をコードする 第１の外来ＤＮＡの上流、またはこれと同じ転写単位中にある（Harley et al. ，1988）。第１の外来ＤＮＡの下流には、ノパリンシンターゼ遺伝子由来の２６ ０塩基対のＴａｑＩ断片として単離されるノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端 （「３’ｎｏｓ」）がある（Gielen et al，1984）。こうして、「ｄｅｌＸ４／ ３５Ｓ−バマーゼ−３’ｎｏｓ」および「ｄｅｌＸ５／３５Ｓ−バマーゼ−３’ ｎｏｓ」と呼ぶキメラ遺伝子作成体が得られる。これらの第１のキメラ遺伝子は 、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１９１８８号に記載のように、ベクターｐＧＶ９４１の Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの間に導入される（Deblaere et al.，1987）。こ のベクターは、ノパリンシンターゼプロモーター（「ｐｎｏｓ」、Depicker et al，1982）、Ｔｎ５のｎｅｏコード領域（Beck et al，1982）、およびオクトピ ンシンターゼ遺伝子からの７０６塩基対のＰｖｕII断片に対応するオクトピンシ ンターゼ遺伝子の３’非翻訳末端（「３’ｏｃｓ」）を含有するキメラマーカー 遺伝子を含有する。キメラ「ｐｎｏｓ−ｎｅｏ−３’ｏｃｓ」遺伝子の作成は、 Hain et al(1985)およびＥＰ３５９６１７号に記載されている。 本発明の第２のキメラ遺伝子を有する、Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換ベクターを作 成するために、Ｐｎｏｓ−バースター−３’ｇ７遺伝子作成体を含有するＤＮＡ 断片を、ＷＯ９３／１９１８８号に記載のように前述の植物ベクター内に導入す る。 前述の方法を用いて、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９３／０５１５３号に記載の抗真菌 Ｒｓ＿ＡＦＰ２蛋白のＤＮＡコード配列を、第１の外来ＤＮＡとして用いて（外 来ＤＮＡを「阻害する」ことなく）、「ｄｅｌＸ４／３５Ｓ−Ｒｓ＿ＡＦＰ２− ３’３５Ｓ」と呼ぶ、第１のキメラ遺伝子を含有する植物形質転換ベクターも作 成される。 さらに前記で概説した方法に従い、コメ塩基性キチナーゼとZhu et al.(1994) のｂ−１，３−グルカナーゼ遺伝子（それぞれ、前述のｄｅｌＸ４／３５Ｓプロ モーター作成体の制御下にあり、ＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子の３’ポリアデニル化領 域と転写停止領域が両側に存在する）のコード領域を有する、植物形質転換ベク ターも作成される。実施例４：実施例３の植物形質転換ベクターを有するアグロバクテリウム・ツメ ファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株によるジャガイモとオ イルシード品種の形質転換 ジャガイモおよびオイルシード品種（ブラシカ・ナプス（Brassica napus）） の形質転換および主要な発現を行うために、実施例３の植物形質転換ベクターを それぞれ、Deblaere et al(1985)の記載した非毒性ＴｉプラスミドｐＧＶ２２６ ０を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien s）Ｃ５８Ｃ１ＲifＲ株に移した。トランス結合体は、サザンブロット法により 解析した。各アグロバクテリウム（Agrobacterium）株を用いて、De Block et a l(1987)が記載した塊茎円盤感染法を用いて、ジャガイモ植物（ソラヌム・ブテ ロスム（Solanum tuberosum）ビンチェ（Bintje）品種とデジレ（Desire）品種 ）を形質転換し、De Block et al(1989)が記載した方法を用いてオイルシードレ ープ（oilseed rape）を形質転換した。形質転換した細胞を、１００mg/mlのカ ナマイシンを含有する培地で選択し、耐性カルスを植物中に再生する。各形質転 換実験で、約１０個の各形質転換体を再生し、遺伝子取り込みパターンのために サザンブロット法により解析する。 実施例３の真菌応答性ｄｅｌＸ５／３５ＳプロモーターのｄｅｌＸ４／３５Ｓ Ｓの制御下で、バマーゼ（bamase）をコードする第１の外来ＤＮＡ配列を含む第 １のキメラ遺伝子で形質転換したジャガイモとオイルシードレープ（oilseed ra pe）植物、およびｎｏｓプロモーターの制御下でバースターをコードする第２の 外来ＤＮＡ配列を含む第２のキメラ遺伝子は、真菌感染、特にフィトフソラ・イ ンフェスタンス（Phytophthora infestans）（ジャガイモ）およびレプトスフェ リア・マキュランス（Leptosphaeria maculans）（オイルシードレープ（oilsee d rape））感染に対して、形質転換していない対照植物より有意に高度の耐性を 示す。その結果、真菌病原体で感染させた小規模野外試験の統計解析では、形質 転換した植物は対照植物より収率が有意に低い。対照植物に比較して、真菌の胞 子形成は、感染後７日間も有意に阻害される。真菌感染後ジャガイモの葉の底に ２０mlの小滴（２×１０６〜５×１０５胞子／mlを使用している場合）を添加し て、胞子形成後に実体鏡で観察する。葉を水の中で維持してから、真菌の増殖と 胞子形成の後に、実体鏡で観察する。形質転換した植物の疾患耐性表現型は、Ｒ ＮＡ定量に基づく分子的解析と、分離する子孫の表現型を評価して確認する。 真菌増殖の同様の有意な低下が、抗真菌キチナーゼおよびグルカナーゼ、また は抗真菌Ｒｓ／ＡＦＰ２蛋白をコードする、実施例３のキメラ遺伝子で形質転換 した、ジャガイモおよびオイルシードレープ（oilseed rape）植物で観察される 。 言うまでもなく、本発明の真菌応答性真菌応答性ｐｒｐ１−１成分およびキメ ラ遺伝子の使用は、特定の植物の形質転換に限定されない。プロモーターが遺伝 子発現を制御し、好適にはこのような発現が、傷害、ＩＡＡ、ＳＡによる主要な 誘導がなく、根の組織で有意な発現がなく、真菌感染部位のすぐ周りの植物細胞 中で豊富に起きる場合、このようなプロモーターやキメラ遺伝子は、アルファル ファ、トウモロコシ、綿花、テンサイ、アブラナ科植物、トマト、大豆、コムギ またはタバコのような任意の穀物の形質転換に有用である。 また、本発明の改良された真菌応答性プロモーターの使用は、特定の第１の外 来ＤＮΛの制御に限定されず、植物中の任意のＤＮＡ断片の発現の制御に使用す ることができる。 さらに本発明は、前述の実施例に記載の具体的な改良された真菌応答性ｐｒｐ １−１プロモーター断片に限定されない。むしろ本発明は、他のｐｒｐ１遺伝子 と同等のプロモーター断片（これは、真菌感染部位のすぐ周りの植物細胞中で少 なくとも実質的に選択的に、第１の外来ＤＮＡのような構造遺伝子の発現を制御 するのに使用することができる）のような、実施例のプロモーター、同等のプロ モーター断片を包含する。実施例のｐｒｐ１−１プロモーターおよびプロモータ ー断片のＤＮＡ配列は、その幾つかのヌクレオチドを他のヌクレオチドで置換す ることにより修飾することができるが、このような修飾は、真菌感染部位のすぐ 周りの植物細胞のポリメラーゼ複合体（転写アクチベーターを含む）のプロモー ターを認識する能力を実質的に変更してはならない。このような同等の真菌応答 性ｐｒｐ１−１成分は、配列番号１から得られる真菌応答性成分（例えば、ｄｅ ｌＸ４およびｄｅｌＸ５）の配列と、好適には８５％、より好適には９０％、特 に９５％のヌクレオチド配列類似性を有する。 また本発明は、フィトフソラ・インフェスタンス（P．infestans）のようなフ ィトフソラ（Phytophthora）真菌に対して、植物を保護するための本発明の真菌 応答性キメラ遺伝子の使用に限定されない。このようなキメラ遺伝子は、植物病 原性真菌、一般に特にフィトフソラ種（Phytophthora spp）、ピチウム種（Pyth ium spp）、フサリウム種（Fusarium spp）、スクレロチニア種（Sclerotinia s pp）、プクキニア種（Puccinia spp）、ウスチラゴ種（Ustilago spp）、アルテ マリア種（Altemaria spp）、ヘルミントスポリウム種（Helminthosporium spp ）、スクレロチニア・スクレロトイラム（Sclerotinia sclerotoirum）、ピレノ ペリザ・ブラシシー（Pyrenoperiza brassicae）、シリンドロスポリウム・コン セントリカム（Cylindrosporium concentricum）、フォーマ・リンガム（Phoma lingam）、およびレプトスフェリア・マキュランス（Leptosphaeria maculans） に対して、植物を保護するために使用することができる。 本明細書で言及したこれらの公表された書類および特許公報は、参考のため本 明細書に引用され、従ってこれらの文書の内容は、前述の説明および実施例中に 物理的に取り込まれたものと解するべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１のＤＮＡ配列と比較した時、根での発現が実質的に低く、およ び／または植物ホルモンの適用による誘導が有意に低い、配列番号１のＤＮＡ配 列の一部を含む、真菌応答性ｐｒｐ１−１成分。 ２．配列番号１のＤＮＡ配列から直接的または間接的に得られるが、配列番号 １の１〜１００位のヌクレオチドが欠如しているか、または配列番号１の２３９ 〜２７３位のヌクレオチドが欠如している、真菌応答性ｐｒｐ１−１成分。 ３．配列番号１のＤＮＡ配列から直接的または間接的に得られ、配列番号１の ヌクレオチド１００位と１７６位の間の位置から、ヌクレオチド２７３位までの 配列を含む、真菌応答性ｐｒｐ１−１成分（ただし、該真菌応答性成分は配列番 号１のＤＮＡ配列ではない）。 ４．配列番号１のＤＮＡ配列から直接的または間接的に得られ、配列番号１の ヌクレオチド１位から、ヌクレオチド１５３位と２３９位の間の位置までのＤＮ Ａ配列を含む、真菌応答性ｐｒｐ１−１成分（ただし、該成分は配列番号１のＤ ＮＡ配列ではない）。 ５．ヌクレオチド１〜２３９位までの配列番号１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド １〜１５３位までの配列番号１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１００〜２７３位ま での配列番号１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１４０〜２７３位までの配列番号１ のＤＮＡ配列、およびヌクレオチド１７６〜２７３位までの配列番号１のＤＮＡ 配列、よりなる群から選択される真菌応答性ｐｒｐ１−１成分、ならびに実質的 に同じヌクレオチド配列を有する任意の真菌応答性成分。 ６．請求の範囲第１項から第５項に記載の任意の真菌応答性ｐｒｐ１−１成分 を含む真菌応答性プロモーター（ただし、該真菌応答性プロモーターは、真菌応 答性成分として配列番号１のＤＮＡ配列を含まない）。 ７．真菌応答性プロモーターは、３５Ｓ最小プロモーターのような最小プロモ ーター成分をさらに含む、請求の範囲第６項に記載の真菌応答性プロモーター。 ８．請求の範囲第６項または７項に記載の真菌応答性プロモーターを含む真菌 応答性キメラ遺伝子であって、真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物 の細胞中で産生もしくは過剰産生される時、真菌感染部位の周りの、好適にはす ぐ周りの植物細胞を死滅させるか、またはその代謝、機能および／または成長を 少なくとも有意に妨害して、真菌のさらなる蔓延を制限する、第１のＲＮＡおよ び／または蛋白またはポリペプチドをコードする第１の外来ＤＮＡ；ならびに該 真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞中で第１の外来ＤＮＡを発 現するための適当な３’転写停止シグナルをさらに含む、上記真菌応答性キメラ 遺伝子。 ９．請求の範囲第６項または７項に記載の真菌応答性プロモーターを含む真菌 応答性キメラ遺伝子であって、真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物 の細胞中で産生もしくは過剰産生される時、真菌を死滅、損傷又は撃退する、第 １のＲＮＡおよび／または蛋白またはポリペプチドをコードする第１の外来ＤＮ Ａ；ならびに該真菌感染部位の周りの、好適にはすぐ周りの植物細胞中で第１の 外来ＤＮＡを発現するための適当な３’転写停止シグナルをさらに含む、上記真 菌応答性キメラ遺伝子。 １０．請求の範囲第８項または９項に記載の真菌応答性キメラ遺伝子で安定に 形質転換された、植物細胞または植物細胞培養物。 １１．請求の範囲第１０項に記載の植物細胞を含む、植物または種子。 １２．請求の範囲第８項に記載のキメラ遺伝子を含む植物細胞であって、好適 には真菌応答性キメラ遺伝子と同じ遺伝子座中に第２のキメラ遺伝子も含有し； 第２のキメラ遺伝子は、機能的にリンクしたＤＮＡ配列： ａ）真菌感染部位の周り以外の、好適にはすぐ周り以外の基本的な植物細 胞中で、外来ＤＮＡの転写を指令することができる、真菌抑制性プロモーターの ような第２のプロモーター； ｂ）少なくとも植物の他の細胞中で産生または過剰産生される時に、少な くともそのような植物の他の細胞中の第１の外来ＤＮＡまたは第１のＲＮＡまた は蛋白もしくはポリペプチドを阻害もしくは不活性化する、第２のＲＮＡおよび ／または蛋白もしくはポリペプチドをコードする第２の外来ＤＮＡ；および ｃ）少なくともそのような植物の他の細胞中で第２の外来ＤＮＡを発現す るための適当な３’転写停止シグナル を有する植物細胞。 １３．前記プロモーターは真菌抑制性プロモーターである、請求の範囲第１２ 項に記載の植物。 １４．請求の範囲第１３項に記載の植物の細胞、またはこれらの細胞を含む細 胞培養物。 １５．請求の範囲第１１項または１２項に記載の植物のゲノム。 １６．真菌、特にフィトフソラ種（Phytophthora spp）、クラドスポリウム種 （Cladosporium spp）、ピチウム種（Pythium spp）、フサリウム種（Fusarium spp）、スクレロチニア種（Sclerotinia spp）、プクキニア種（Puccinia spp） 、ウスチラゴ種（Ustilago spp）、アルテマリア種（Altemaria spp）、ヘルミ ントスポリウム種（Helminthosporium spp）、セプトリア種（Septoria spp）、 ピレノフォラ種（Pyrenophora spp）、ウスチラゴ種（Ustilago spp）、ボツリ チス種（Botrytis spp）、エリシフェ種（Erysiphe spp）、ならびにピレノペリ ザ・ブラシシー（Pyrenoperiza brassicae）、シリンドロスポリウム・コンヤン トリカム（Cylindrosporium concentricum)、フォーマ・リンガム（Phoma linga m）、レプトスフェリア・マキュランス（Leptosphaeria maculans）、スクレロ チニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）、ボツリチス・シネリ ー（Botrytis cinerea）、エリシフェ・クルシフェロルム（Erysiphe crucifero rum）、ペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora parasitica）、プラスモジオ フォラ・ブラシシー（Plasmodiophora brassicae）、およびシュードセルコスポ レラ・カプセラ（Pserdocercosporella capsella）のような植物病原性真菌に対 して植物を耐性にするための方法であって、請求の範囲第８項または９項に記載 のキメラ遺伝子で植物の核ゲノムを形質転換する工程を含む方法。 １７．請求の範囲第８項または９項に記載のキメラ遺伝子で植物細胞を安定に 形質転換し、この細胞から植物を再生することを特徴とする、植物の真菌病原体 を防除する方法。