CZ2000479A3 - Způsob zjištění transformační schopnosti látek, použití nukleové kyseliny, kódující apoptin a diagnostická testovací souprava - Google Patents

Description

Způsob zjištén! transformační schopnosti*, rokombinantni nukleovi kyselin», způsob zjištění predispozice· buněk, způsob zjištění genové mutace; použití nukleové kyseliny₍ 6^4^^ a diagnostická testovací souprava.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k oblasti diagnostiky rakoviny a jejího léčení, rovněž k oblasti zjišťování transformační schopnosti podezřelých, nádory vyvolávajících nebo nádory podporujících látek (při používání zde budou oba termíny zaměňovány).

Dosavadní stav techniky

V předkládaném vynálezu je společným jmenovatelem pro všechny výše uvedené oblasti to, že v nich může být uplatněn podle tonoto vynalezu apoptin, jeho deriváty anebo jeho fragmenty (zde jsou všechny označovány jako apoptin nebo apoptinu podobná aktivita). Apoptin je protein původně nalezený ve viru kuřecí anémie (Noteborn a kol, 1991) a původně byl pojmenován VP3. Apoptotická aktivita tohoto proteinu byla objevena skupinou autorů nynějšího vynálezu (Noteborn a kol, 1994).

Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález využívá indukováni apoptózy účinkem apoptinu.

Apoptóza je aktivní a programovaný fyziologický proces odstraňováni přebytečných, rozsáhle poškozených nebo maligních buněk (Earnshaw, 1995, Duke a kol, 1996).

Apoptóza je charakterizována svraštěním buněk, rozpadem jádra a fragmentací cytoplazmy, kondenzací a Štěpením DNA na fragmenty o velikosti domén, ve většině případů následovaným rozpadem v oblastech mezi nukleozómy. Apoptotické buňky se rozpadají na apoptotická tělíska, obalená membránou. Nakonec sousední buňky anebo makrofágy rychle tyto umírající buňky fagocytují (Wyllie a kol, 1980, White, 1996). U buněk rostoucích v podmínkách tkáňové kultury a u buněk ze tkání mohou být analyzovány příznaky apoptózy pomocí činidel barvících chromozomální DNA, jako jsou například DAPI nebo propidium jodid, který barví normální DNA (chromatickou) silně a pravidelně, ale apoptotický chromatin slabě anebo nepravidelně (Noteborn a kol, 1994, Telford a kol, 1992).

Apoptotický proces může být započat řadou regulačních podnětů (Willie, 1995, White 1996, Levine, 1997). Změny v buněčné schopnosti přežít hrají důležitou úlohu

v lidské patogenezi, například ve vývoji rakoviny, který je způsoben zvýšeným bujením anebo snížením umíráni buněk (Kerr a kol., 1994, Paulovich, 1997). Bylo ukázáno, že různá chemoterapeutická činidla a ozáření indukují apoptózu u nádorových buněk která je v mnoha případech zprostředkována supresorovým nádorovým proteinem p53 (Thompson, 1995, Bellamy a kol., 1995, Steller, 1995, McDonell a kol., 1995).

Mnoho nádorů však během svého vývoje vyžaduje mutaci v p53, což je často v souhlase se slabou odpovědí na rakovinnou terapii. Transformační proteiny DNA nádorových virů inaktivují p53 nepřímo nebo přímo vazbou na něho (Teodoro, 1997). Příkladem takové látky je velký T-antigen DNA nádorového viru SV40. U určitých nádorů systému krevní tvorby je vysoká expresní úroveň onkogenu Bcl-2 spojena se silnou odolností k různým chemoterapeutickým látkám, indukujícím apoptózu (Hockenberry 1994, Sachs a Lotem, 1997). Pro takové rakoviny, které jsou odolné k různým cytotoxickým látkám, se vyvíjejí alternativní protinádorové léčebné postupy, které jsou založené na indukci apoptózy (Thompson, 1995 a Paulovich a kol., 1997).

Podstata vynálezu

Apoptin je malý protein odvozený z viru kuřecí anémie (CAV; Noteborn a De Boer, 1995, Noteborn a kol., 1991, Noteborn a kol., 1994), který může indukovat apoptózu u lidských nádorových a transformovaných buněčných linii, ale nikoli u netransformovaných diploidních lidských buněk. In vitro není apoptin schopen indukovat programovanou smrt buňky u normálních lymfoidnfch, kožních fibroblastických, epidermálních a endoteliálních buněk ani u buněk hladkých svalů. Avšak když jsou normální buňky transformovány, například transformačními geny z SV40, stávají se citlivé k apoptóze navozené pomocí apoptinu. (Danen-van Ooschot, 1997 a Noteborn, 1996). Dlouhodobá exprese apoptinu v normálních lidských fibroblastech ukázala, že apoptin nemá toxický účinek ani transformační aktivitu na tyto buňky. U normálních buněk bylo zjištěno, že apoptin je umístěn převážně v cytoplazmě, zatímco v transformovaných nebo nádorových buňkách byl umístěn v jádře, což naznačuje, že umístění apoptinu má vztah k jeho aktivitě, která indukuje buněčnou smrt (Danen-van Ooschot, 1997).

Dále jsme zjistili, že apoptin může indukovat apoptózu i v nepřítomnosti funkčního p53 (Zhuang a kol., 1995a) a nemůže být inhibován proteinem Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang a kol., 1995), proteinem BAG-1, spojeným s Bcl-2 ani inhibitorem caspázy, proteinem CrmA viru vakcinie (Danen-van Ooschot, 1997 a Notebom, 1996). Zdá se, že buňky která jsou pouze imortalizovány a tedy minimálně transformovány, mohou být také apoptinem usmrceny.

Proto je apoptin výjimečně účinná protinádorová látka také proti nádorům, které nejsou vůbec anebo jsou méně citlivé k (chemo)terapeutickým látkám, bud protože ztratily funkční p53, pro (nad)produkci Bcl-2 nebo jiného genu, který inhibuje apoptózu. Skutečnost, že apoptin neindukuje apoptózu v normálních lidských buňkách naznačuje, že toxický účinek působení apoptinu in vivo bude velmi nízký. Navíc se zdá, že dokonce přednádorové, minimálně transformované buňky mohou být citlivé na smrt indukující účinek apoptinu. Na základě znalosti, že apoptin je zcela bezpečný pro normální buňky, ale že jakmile se buňka stane transformovanou anebo imortalizovanou (tyto termíny se zde mohou při používání zaměňovat), autoři tohoto vynálezu popsali některá využiti, založená na tomto zjištění.

Vynález tedy poskytuje metodu pro určení transformační schopnosti potenciálního transformačního činidla, která sestává z dodání indukovatelné, apoptinu podobné, apoptotické aktivity netransformovaným buňkám, vystavení zmíněných buněk uvedenému transformačnímu činidlu a zjištění lokalizace zmíněné apoptotické aktivity uvnitř zmíněných buněk, nebo zjištění indukce apoptózy v uvedených buňkách. Má se za to, že výše uvedená apoptotické aktivita označuje též entitu, která má řečenou aktivitu.

Je výhodné dodat uvedeným buňkám zmíněnou apoptotickou aktivitu pomocí transdukce uvedených buněk molekulou rekombinantní nukleové kyseliny, která uvedenou aktivitu kóduje. Apoptinu podobná aktivita je zde definována jako jakákoli látka (s výhodou proteinové podstaty), která má podobnou aktivitu jako VP3 nebo apoptin nebo virus kuřecí anémie. Zvláště jsou do uvedené definice zahrnuty alelické varianty, deriváty anebo fragmenty apoptinu, přičemž deriváty jsou definovány tak, že obsahují aminokyselinové záměny, které nemají za následek ztrátu veškeré apoptotické aktivity. Má se za to, že výraz podobná aktivita znamená, že druh aktivity je tentýž, třebaže její množství může být odlišné. Postupy podle předloženého vynálezu jsou zvláště vhodné v aplikacích, kde uvedené možné transformační činidlo je látka proteinové povahy. To umožňuje uvedené látce proteinové povahy být společně exprimována ve zmíněných netransformovaných buňkách s uvedenou apoptotickou aktivitou. Příkladem látky proteinové povahy je velký T-antigen viru SV40 nebo jeho funkční ekvivalenty.

Vynález také popisuje modifikace apoptinového genu, které mají za následek _ takové změny proteinu apoptinu, které umožní apoptinu vstoupit do jádra netransformovaných a transformovaných/nádorotvomých buněk, což má za následek indukci apoptózy. Apoptinový protein je zvětšen o signál pro umístění v jádře, který pochází od SV40. Zvláště jsou do řečené definice apoptinu zahrnuty alelické varianty, deriváty anebo fragmenty apoptinu, přičemž deriváty jsou definovány tak, že obsahují aminokyselinové záměny, které nemají za následek ztrátu veškeré apoptotické aktivity. To umožňuje proteinu apoptinu být společně exprimován v netransformovaných buňkách s uvedenou apoptotickou aktivitou. Fragmenty apoptinu s uvedenou apoptotickou aktivitou, ale neschopné vstoupit do jádra netransformovaných nebo transformovaných buněk pomocí svých vlastních sekvencí, jsou schopné do jádra vstoupit díky modifikacím a indukovat apoptózu.

Vynález dále poskytuje způsob pro určení jaká je predispozice buňky k tomu, aby se stala buňkou nádorovou tím, že je do uvedené buňky vnesena indukovatelná, apoptinu podobná apoptotická aktivita, uvedená buňka je vystavena relativně slabé nádorotvomé aktivitě a v uvedené buňce je zjišťována apoptóza anebo je zjišťována lokalizace řečené apoptotické aktivity v uvedené buňce. V tomto případě podezřelé transformační činidlo, jak zde bylo dříve diskutováno, je již přítomno v uvedené buňce jako mutace, vedoucí k nádorové nebo nádorotvomé aktivitě. V tom případě skutečnost, že apoptin indukuje apoptózu pouze v buňkách, které byly již transformované, vede k možnosti kontrolovat, zda buňky obsahují mutaci, která vede k immortalizaci nebo transformaci při vystavení slabé transformační aktivitě, jako je ozáření UV a působení záření paprsky X.

Tímto způsobem může být určena pravděpodobnost, že další vývoj daných buněk povede směrem k rakovině. To ovšem vede k uplatnění na poli diagnózy změn u těch osob, které mají riziko dědičného získání rakoviny a poskytnutí jim preventivní léčby, což je jiným předmětem předloženého vynálezu. Tento druh diagnózy může být také uplatněn, když jsou lidem podávány konzultace o pravděpodobnosti, s jakou budou jejich děti predisponovány k rakovině.

Předkládaný vynález tedy také poskytuje metodu pro zjišťování predispozice subjektu k dědičným typům rakoviny, která sestává ze zpracování vzorku příslušného

·..··..· souboru buněk tohoto subjektu pomoct postupu, zde popsaného. Vynález dále poskytuje metodu pro zjišťování genové mutace, která má nádorovou anebo transformační aktivitu pro buňky, která sestává ze zpracování uvedených buněk pomocí postupu, podle předloženého vynálezu.

Jak zde bylo dříve uvedeno, dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnout způsoby preventivního léčení určitých souborů buněk u osoby, u níž jsou tyto soubory buněk náchylné k rakovině. Tyto způsoby obsahují nukleovou kyselinu kódující apoptinu podobnou aktivitu, s výhodou podanou ve formě nosiče, přenášejícího geny. Nosiče, přenášející geny mohou být virového či jiného původu. V oboru bylo popsáno mnoho nosičů a jsou známé osobám se zkušeností v tomto oboru. Zahrnují mimo jiné adenovirové vektory, s výhodou ve formě adenovirových částic; retrovirové vektory, s výhodou ve formě rekombinantních retrovirú a tytéž druhy vektorů, ale odvozené od jiných virů; lipozómy nebo jiné nosičové molekuly atd.

Vynález dále poskytuje diagnostickou testovací soupravu pro provádění metody, popsané v předloženém vynálezu, pro určení schopnosti činidla vyvolávat nádor, skládající se z netransformovaných buněk, transdukovaných nukleovou kyselinou, kódující apoptin nebo jeho fúnkční derivát či fragment a popřípadě všechny další potřeby nezbytné k provedení testu a detekci výsledku.

Vynález dále poskytuje diagnostickou testovací soupravu pro provádění metody, popsané v předloženém vynálezu, pro určení sklonu buněk k rakovině, obsahující nukleovou kyselinou, kódující apoptin nebo jeho funkční derivát Či fragment, schopnou transdukovat eukaryotickou buňku a schopnou být v takové buňce exprimována a popřípadě všechny další potřeby nezbytné k provedení testu a detekci výsledku.

Je výhodné, když jsou též poskytnuty prostředky pro vystavení buněk slabé nádorotvomé aktivitě, jako je ozáření UV či paprsky X.

Vynález také poskytuje metodu pro studium indukce apoptinem indukované apoptózy transformujícími činidly, jako jsou chemikálie, viry, UV ozáření a X ozáření na modelu transgenních myší, jejímž výsledkem je inhibice tvorby nádoru. Myši stransgennlm apoptinem mohou být použity pro analýzu protinádorového účinku apoptinu v transgenních chimérách, nesoucích dědičné typy rakoviny a schopné exprimovat apoptin. Dále může být pomocí popsaných myší s transgenním apoptinem studován účinek exprese apoptinu v in vivo modelech.

Podrobný popis vynálezu.

·..··„·

Již dříve jsme ukázali, že virový protein apoptin indukuje apoptózu v kultivovaných transformovaných buňkách jak lidského tak hlodavčího původu, nikoli však v normálních lidských buňkách. Nyní jsme pozorovali, že apoptin není schopen indukovat apoptózu v kultivovaných myších (nebo krysích) embryonálních fibroblastech (kultury byly odvozeny z 16 až 18 dní starých myších (krysích) embryí). To ukazuje, že apoptin může být také exprimován v nepoškozeném embryu bez toho, že by působil toxicky, přinejmenším u embryí, která již nejsou ve velmi časném stádiu embryonálního vývoje.

Nyní jsme byli schopni vytvořit myši, nesoucí transgenní apoptin, které byly životaschopné. Podáváme tak důkaz, že konstitutivní exprese apoptinu v transgenní myši nemá žádné smrtelné nebo jiné život ohrožující Čí život omezující účinky. Také jsme pozorovali, že současná transfekce kultivovaných normálních lidských fibroblastú apoptinovým genem a transformujícími geny z SV40, aktivuje apoptotický proces, který je spojen stranslokací apoptinového proteinu zcytoplazmy, kde se akumuluje původně, do jádra.

Popsaný vynález poskytuje základ pro přidávání aminokyselin k apoptinovému proteinu nebo jeho fragmentům, které jim umožní vstoupit do buněčného jádra anebo se v něm akumulovat, což má za následek indukci apoptózy.

Vynález poskytuje základ k diagnostickému testu pro zjištění potenciálně transformujících genů. Pro takový test jsou použity normální diploidní savčí buňky, jako jsou lidské anebo hlodavčí buňky. Pro tento účel jsou normální diploidní buňky kotransfekovány plazmidem obsahujícím gen (geny), které jsou studovány a současně plazmidem obsahujícím apoptin nebo transfekovány genem (geny), které jsou studovány a současně virovým vektorem, který exprimuje apoptin. Vyvolání apoptinem indukované apoptózy anebo přítomnost apoptinu v jádře ukazuje, že testovaný gen má transformační popřípadě nádorotvomou schopnost.

Dále jsme zjistili, že diploidní lidské buňky, izolované z jedinců nesoucích v zárodečné linii mutaci v genu, který potlačuje vývoj nádorů, následkem Čehož jsou predisponovány k vývoji určitého spektra nádorů (jsou zde také označovány, že mají sklon k nádorům), jsou odolné k účinku apoptinu indukovat apoptózu, stejně jako diploidní buňky ze zdravých jedinců, nicméně stanou se citlivými, když jsou v buněčných kulturách ozářeny ultrafialovým světlem.

To nám umožnilo vyvinout diagnostický test pro předpovědění náchylnosti k rakovině. V rodinách s dědičnou predispozicí k vývoji rakoviny, způsobenou tím, že v zárodečné linii se nachází mutace v genu, který potlačuje vývoj nádorů, často není možné bez rozsáhlé analýzy chromozomální DNA předpovědět, zda člen rodiny je postižen a nese v sobě gen, způsobující nemoc. Naše výsledky ukazují, že toto je jednoduše proveditelné tím, že se použije apoptinový gen. Pro tento účel jsou z testovaného jedince izolovány diploidní kožní fibroblasty nebo lymfbcyty a kultivované buňky jsou transfekovány apoptinovým genem s následujícím ozářením UV světlem (266 nm). Pokud se transfekované buňky stanou po UV ozáření apoptotickými, ale současně se nestávají apoptotickými bez expozice UV ozáření, potom se jedná o (závažný) ukazatel toho, Že jedinec má sklon k vyvinutí rakoviny. Ne všechny typy nádorové predispozice, způsobené mutací v genu, který potlačuje vývoj nádorů, byly doposud testovány tímto apoptin/UV testem. Nicméně není důvod předpokládat, že tentýž jev nebude pozorován u jiných buněk se sklonem k vývoji nádoru. Podobný diagnostický test pro předpovědění náchylnosti k rakovině může být též proveden za použití X paprsků namísto UV ozáření.

Vynález nám také umožňuje získat více informací o molekulárním základu sklonu k rakovině a jeho vztahu k určitým odpovědím na stress, jako je zvýšená reaktivace (ER) (Abrahams a kol., 1996). Zvýšená reaktivace je jedna z reakcí normálních (lidských) buněk na určité látky, poškozující DNA a zdá se že odráží citlivost buněk k nádorové transformaci.

Experimentální část - popis použitých materiálů a metod

Buňky a podmínky pro pěstování buněčných kultur.

Krysí embryonální fibroblasty (REF) byly připraveny z 14 dní starých krysích embryí. Buňky byly ponechány rozmrazit po vyzvednutí z tekutého dusíku, kultivovány v médiu DMEM, doplněném 10 % fetálního telecího séra a transfekovány v druhé buněčné pasáži plazmidovou DNA.

Myší embryonální fibroblasty (MEF) byly připraveny z myší p53+/+ nebo z myší s vyřazeným p53-/- (Tyler Jacks, 1994 a 1996; Tyler Jacks a koi., 1994). Buňky byly pěstovány na miskách Corning v médiu F15, doplněném 10 % fetálního telecího séra. Buňky P19 byly odvozeny z myšího embryonálního karcinomu/teratokarcinomu (Burney a kol., 1982). Buňky byly pěstovány na Petriho miskách, potažených želatinou, v médiu DMEM, doplněném 8 % fetálního telecího séra.

Buňky BRK/xho byly připraveny zledvinných buněk mladých krys pomoci transformace oblasti E1 adenoviru typu 5 (Schrier a kol., 1983). Buňky byly pěstovány v DMEM, doplněném 10 % fetálního telecího séra.

Lidské diploidní fibroblasty z předkožky, VH10 a VH25 (Klein a kol., 1990) byly pěstovány v Eaglově médiu, modifikovaném podle Dullbecca (DMEM), doplněném 10 % fetálního telecího séra.

Počátek pěstování primárních kultur lidských epidermálních keratinocytů (FSK1) byl proveden v kompletním médiu popsaném v Rheinwald a Green, 1975, s malou změnou podle M. Ponec a kol., 1981 a potom pěstovány v médiu pro keratinocyty (KSFM) bez přítomnosti séra. Pro zde popsané pokusy byla použita třetí buněčná pasáž.

Buňky F9605 jsou diploidní fibroblasty, které jsou p16-/-, odvozené z pacientů se syndromem dysplastického mateřského znaménka (DNS), o němž je stanoveno, Že je předstupněm syndromu familiárního a-typického mnohotného melanotického mateřského znaménka (FAMMM) (Gruis a kol., 1995). Buňky byly pěstovány v DMEM, s 10 % fetálního telecího séra.

Buňky GM1492 jsou lidské diploidní fibroblasty, které neexprimují p53 a jsou odvozeny z pacientů s Bloomovým syndromem, autozomální recesivní poruchou s vysokým výskytem rakoviny (Van Laar a kol., 1994). Buňky byly pěstovány v DMEM, obsahujícím 10 % fetálního telecího séra.

Buňky LF2675T jsou diploidní kožní fibroblasty, které jsou odvozené z pacientů s Li-Fraumei syndromem (LFS). Tato nemoc je charakterizována tím, že v zárodečné linii se vyskytuje mutace v jedné alele genu pro p53 a také Časným objevováním se různých typů rakoviny (Srivastava a kol., 1990; Abrahams a kol., 1996). Buňky byly pěstovány v DMEM, doplněném 10 % fetálního telecího séra.

Buňky 401 jsou diploidní kožní fibroblasty z jedince s Lynchovým syndromem typu 2 z rodiny s časným objevováním se různých typů rakoviny. Buňky byly odvozeny z pacientky, která zemřela na rakovinu prsu (Abrahams a kol., 1996). Buňky byly pěstovány v DMEM, doplněném 10 % fetálního telecího séra.

Všechna kultivační média byla získána od Gibco/BRL a obsahovala antibiotika penicilín a streptomycin.

Ozařování buněčných kultur.

Upravené médium bylo z kultur odstraněno a buňky byly dvakrát opláchnuty PBS. Po odstranění PBS byly kultury ozářeny UV, jak bylo dříve popsáno (Abrahams a kol., 1984) nebo na ně bylo působeno paprsky X (5 grejů) pomocí přístroje Andrex 225 SMART (Andrex St, Copenhagen) při 200 kV, 4 mA s filtrem 1 - mm A1. Dávka a intenzita dávky byly kontrolovány dozimetrem PTW. Po UV ozáření bylo navráceno upravené médium a kultury byly inkubovány při teplotě 37 °C.

Plazmidy.

Expresní plazmid pCMV-VP3 obsahuje DNA sekvenci zCAV, která kóduje výlučně apoptinový protein (nukleotidy 427 až 867; Notebom a kol, 1991, Notebom a De Boer 1996) a plazmid pCMV-des, který kóduje desmin, strukturální protein svalových buněk (Menke a kol., 1997). Plazmid pCMV-neo je použit jako .prázdná“ negativní kontrola pro plazmidy kódující genové produkty s potenciálním účinkem na apoptózu, indukovanou apoptinem. Všechny exprimované geny jsou regulovány (časným) rozšířeným promotorem cytomegaloviru.

Plazmid SV40 obsahuje časnou oblast SV40 bez originu (ort-) s kódujícími oblastmi jak pro velký T antigen SV40, tak pro malý T antigen SV40, regulované jejich vlastním promotorem (Dinsart a kol., 1984). Plazmid pR-s884 exprimuje kompletní velký T antigen SV40 a zkrácený malý T antigen pod transkripční kontrolou dlouhého koncového opakování (LTR) z viru Rousova sarkomu (RSV; De Ronde a kol., 1989; Smits a kol., 1992). Plazmid PR-SVt obsahuje cDNA sekvence kódující malý T antigen SV40, fúzovaný s RSV LTR (Philips a Bundell, 1988).

Expresní plazmid 21EcoA, který se skládá ze sekvencí oblasti myšího genu pro histokompatibilitní antigen/promotor (Mellor a kol., 1982) a pBR327, je darem od Prof. Dr. Franka Grosvelda, Erasmova univerzita, Rotterdam, Nizozemsko. Plazmid 21EcoA obsahuje cílové místo pro Notl uvnitř prvního exonu H-2Kb genu, které umožňuje zabudování cizorodého genu, který se tak stane regulovaný promotorem H-2Kb. Fragment BamHI, obsahující sekvence kódující apoptin byl izolován z pCMV-VP3 a klonován pomocí linkeru Notl-BamHI do Notl místa plazmidu 21EcoA. Výsledný plazmid, obsahující apoptinový gen pod regulační kontrolou H-2Kb promotoru, byl pojmenován p21EcoA-VP3. Poté bylo EcoRI místo, nacházející se v blízkosti apoptinového gen odstraněno tak, že byl plazmid p21EcoA-VP3 na tomto specifickém EcoRI místě linearizován a bylo na něho působeno Klenowovým fragmentem DNA polymerázy. Plazmid je pojmenován p21EcoA-VP3-Eco.

Fragment DNA obsahující expresní jednotku H-2kB s apoptinovým genem, byl oddělen od sekvencí prokaryotické DNA pomocí štěpení EcoRI a elektroforézou v agarózovém gelu.

Plazmidová DNA byla čištěna centrifugací v gradientu CsCI a chromatografií na sloupci Sephacrylu S5000 (Pharmacia, Švédsko).

Přechodná transfekce.

Buňky byly tranfekovány ve formě jednovrstevné tkáňové kultury v přítomnosti tranfekčního činidla DOTAB (Boehringer Mannheim, Spolková republika Německo) v podstatě tak, jak bylo popsáno ve Fischer a kol., 1996 nebo byly tranfokovány plazmidovou DNA pomocí precipitace fosfátem vápenatým, jak bylo popsáno v Graham a Van der Eb (1873).

Nepřímá imunofluorescence.

Všechny buňky byly pěstovány na mikroskopických sklíčkách. Sklíčka buď nebyla potažena (VH10, VH25) nebo byla potažena 3-amino-propyltriethoxysilanem (TESPA; FSK-1). Buňky byly fixovány 80% acetonem po dobu 10 minut při teplotě místnosti a použity pro nepřímou imunofluorescenci, jak bylo popsáno (Van den Heuvel, 1990). Pro demonstraci přítomnosti anebo buněčné lokalizace apoptinu v transformovaných buňkách byly použity myší monoklonální protilátky (Mab) CVI-CAV85.1 (85.1; Notebom a kol., 1991); pro lidský desmin myší Mab 33 (Monosa, Uden, Nizozemsko); pro T antigeny SV40 Pab 419, laskavě poskytnuté Dr. A. -G Jochemsen, Univerzita v Leidenu, Nizozemsko). Jako druhá protilátka byla použita kozí protimyší protilátka značená fluorescein izothiokyanátem (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West grove PA, USA). Jaderná DNA byla barvena 2,4-diamino-2-fenylindolem (DAPI).

Příprava transgenních myší, nesoucích gen pro apoptin.

Pro přípravu transgenních myší, nesoucích gen pro apoptin, byly použity oplodněné oocyty z myšího kmene FVB a myši z myšího kmene byly použity jako pěstouni. Mikroinjekce do samčího pronukleu byly provedeny podle Brinster a kol., (1981). V jedné mikroinjekci bylo podáno 500 kopií EcoRI DNA fragmentu, odvozeného zplazmidu p21EcoA-Vp3-Eco, který obsahuje požadovanou transkripční jednotku a kompletní apoptinový gen.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje apoptinem indukovanou apoptozovou aktivitu u .normálních embryonálních fibroblastů hlodavců ve srovnání s transformovanými buněčnými liniemi hlodavců. Buňky byly přechodně transfekovány pCMV-VP3. Poté byly buňky v několika časových intervalech po transfekci fixovány a analyzovány nepřímou imunofluorescencl pomocí Mab 85.1, specifických kapoptinu. Jako relativní míra indukce apoptózy je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin, které se abnormálně barví DAPI.

Obrázek 2 ukazuje účinek velkého T antigenu SV40 anebo malého T antigenu SV40 na apoptinem indukovanou apoptózu u fibroblastů a keratinocytů z normálních jedinců. Buňky VH10 a FSK-1 byly přechodně transfekovány plazmidem pCMV-VP3 a pCMVΙΛΛΛ nfikA nQWjíA awtrimi lífztím iiaIL·/* T caIiaaa a T aaIi/iaa GWjIA mD aOQX i · w nwv |^wv-rv ν/γι i* i imjivii 11 Twmj i a utarj ι wtVj |/i\evwr exprimujícím velký T antigen SV40 a pR-SVt exprimujícím malý T antigen SV40. Poté byly buňky v několika časových intervalech po transfekci fixovány a analyzovány nepřímou imunofiuorescencí pomocí Mab 85.1, specifických kapoptinu. Jako relativní míra indukce apoptózy je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin, které se abnormálně barví DAPI.

Obrázek 3 ukazuje lokalizaci apoptinu v normálních lidských diploidních buňkách, exprimujících buď samotný apoptin nebo apoptin společně s velkým T antigenem SV40 anebo malým T antigenem SV40. U týchž buněk, které byly analyzovány v obrázku 2 pokud se týká indukce apoptózy, bylo také zjišťováno, zda je apoptin lokalizován v jádře nebo v cytoplazmě. Jako relativní míra lokalizace apoptinu v jádře je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin a obsahujících apoptin v jádře.

Obrázek 4 ukazuje ukazuje účinek velkého T antigenu SV40 anebo malého T antigenu SV40 na apoptinem indukovanou apoptózu u myších fibroblastů, které jsou odvozeny z normálních myší p53+/+ nebo z transgenních myší p53-A. Buňky byly přechodně transfekovány plazmidem pCMV-VP3 exprimujícím apoptin a kontrolním plazmidem pCMV-neo nebo pSV40 exprimujícím velký T antigen SV40, pR-s884 exprimujícím velký T antigen a pR-SVt kódujícím malý T antigen. Poté byly buňky v několika časových intervalech po transfekci fixovány a analyzovány nepřímou imunofiuorescencí

pomocí Mab 85.1, specifických kapoptinu. Jako relativní míra indukce apoptózy je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin, které se abnormálně barví DAPI.

Obrázek 5 ukazuje lokalizaci apoptinu v embryonálních myších p53+/+ nebo p53-/fibroblastech, exprimujících buď samotný apoptin nebo apoptin společně s velkým T antigenem SV40 anebo malým T antigenem SV40. U týchž buněk, které byly analyzovány v obrázku 4, pokud se týká indukce apoptózy, bylo nyní také zjišťováno, zda je apoptin lokalizován v jádře nebo vcytoplazmě. Jako relativní míra lokalizace apoptinu v jádře je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin a obsahujících apoptin v jádře a které jsou stále ve stavu apoptózy.

Obrázek 6 ukazuje účinek velkého T antigenu SV40 na apoptinem indukovanou apoptózovou aktivitu u .normálních“ diploidních lidských fibroblastú 9605 nebo G4905, odvozených z jedinců se sklonem k vývinu rakoviny. Buňky byly přechodně transfekovány pCMV-VP3 a pCMV-neo nebo pSV40 exprimujícím jak velký T antigen tak malý T antigen SV40, pR-s884 exprimujícím velký T antigen SV40 a pR-SVt exprimujícím malý T antigen SV40. Poté byly buňky v několika časových intervalech po transfekci fixovány a analyzovány nepřímou imunofluorescencí pomocí Mab 85.1, specifických k apoptinu. Jako relativní míra indukce apoptózy je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin, které se abnormálně barví DAPI.

Obrázek 7 ukazuje účinek ozáření UV na apoptinem indukovanou apoptózu u .normálních“ diploidních fibroblastú, odvozených z normálních zdravých jedinců ve srovnání s pacienty se sklonem k vývinu rakoviny. Buňkám bylo simulováno působení UV (kontrola) nebo byly skutečně ozářeny UV světlem a potom byly přechodně transfekovány pCMV-VP3 nebo pCMV-des. Nakonec byly buňky v několika časových intervalech po transfekci fixovány a analyzovány nepřímou imunofluorescencí pomocí Mab 85.1, specifických kapoptinu. Jako relativní míra indukce apoptózy je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin, které se abnormálně barví DAPI.

Obrázek 8 ukazuje schematické znázornění vektoru exprimujíciho transgenní apoptin.

Obrázek 9 ukazuje apoptinem indukovanou apoptózovou aktivitu u buněk Saos-2. Buňky byly přechodně transfekovány p21EcoA-VP3-Eco, pCMV-VP3 (oba exprimují apoptin) nebo pCMV-des exprimující m neapoptotický protein desmin. Poté byly buňky v několika Časových intervalech po transfékci fixovány a analyzovány nepřímou imunofluorescencí pomocí Mab 85.1, specifických kapoptinu. Jako relativní míra indukce apoptózy je uvedeno procento buněk pozitivních na apoptin, které se abnormálně barví DAPI.

Obrázek 10 ukazuje schematické znázornění rodokmenu transgenních myší, obsahujících VP3 (apoptin). Bíle zbarvené čtverečky jsou myši - zakladatelé rodokmenu. Žlutě a zeleně zbarvené Čtverečky představují potomstvo (F1) různých zakladatelů rodokmenu transgenních myší, obsahujících apoptin.

Vynález bude do větších podrobností vysvětlen v následující experimentální části. Ta slouží pouze k ilustračním účelům a neměla by být interpretována jako omezování rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Apoptin indukuje apoptózu vhlodavčích transformovaných buňkách, nikoli však v normálních embryonálních buňkách.

Pro zjištění, zda apoptin není schopen indukovat apoptózu v normálních embryonálních hlodavčích buňkách, kultury myších embryonálních buněk a krysích embryonálních buněk byly přechodně transfekovány plazmidem, kódujícím apoptin. Jako negativní kontrola byly buňky transfekovány plazmidem, kódujícím desmin, který nemá apoptotickou aktivitu. Buňky exprimující apoptin byly vyhledány pomocí nepřímé imunofluorescence sMab 85.1 a buňky exprimující desmin pomocí myších Mab 33. Indukce apoptózy v buňkách pozitivních na apoptin a v buňkách pozitivních na desmin byla zjišťována pomocí DAPI, který vytváří pravidelné zbarvení u nepoškozených jader, zatímco apoptotická jádra jsou zbarvena nepravidelně anebo slabě.

Pět dní po transfékci bylo apoptotických 10 až 20 % buněk pozitivních na desmin, což je základní hladina, nejpravděpodobněji způsobená samotnou transfékci (údaje nejsou uvedeny, Menke a kol., 1997, Danen-van Oorschot, 1997a). Dva, tři, čtyři nebo pět dní po transfékci procento apoptotických buněk v buňkách pozitivních na • · t * t »

- . ♦···»·»· apoptin nepřevyšovalo významně procento apoptotických buněk, pozorovaných v kulturách pozitivních na desmin, což naznačuje, že apoptin neindukuje apoptózu v normálních embryonálních buněčných kulturách. Přechodná transfekce , transformovaných myších či krysích embryonálních buněk nebo ledvinných buněk z mladých krys plazmidem kódujícím apoptin dokázala, že apoptin je schopen indukovat v těchto buňkách apoptózu. Výsledky exprese apoptinu v .normálních“ embryonálních hlodavčích buňkách ve srovnání s transformovanými hlodavčími buňkami jsou ukázány na obrázku 1. Údaje ukazují, že apoptin není schopen indukovat apoptózu v normálních dospělých a embryonálních hlodavčích buňkách, ale indukuje apoptózu v jejich virově transformovaných analozích, přinejmenším v podmínkách buněčné tkáňové kultury.

Příklad 2. Společná exprese velkého T antigenu SV40 a apoptinu má za následek vznik apoptinem indukované apoptózy u normálních lidských diploidních buněk.

Zjišťovali jsme účinek exprese transformačních genů na apoptinem indukovanou apoptózu u normálních lidských buněk, odvozených ze zdravých jedinců. Pro tento účel byly lidské diploidní fibroblasty VH10 a diploidní keratinocyty FSK-1 přechodně společně transfekovány plazmidem pCMV-VP3 kódujícím apoptin a buď plazmidem pSV40 kódujícím velký i malý T antigen SV40, pR-s884 kódujícím velký T antigen, pRSVt kódujícím malý T antigen nebo plazmidem pCMV-neo jako negativní kontrolou. U buněk byla pomocí nepřímé imunofluorescence zjišťována apoptinem indukovaná apoptóza. Obojí normální buňky VH10 a FSK-1 neprodělaly apoptózu, když jim byl kontrolním plazmidem transfekován apoptin.

Výsledky ukázaly, jak bylo očekáváno, že exprese samotného apoptinu není schopna indukovat apoptózu u normálních lidských diploidních buněk, což potvrzuje údaje popsané vDanen-Van Oorschot (1997). Avšak normální diploidní lidské fibroblasty a keratinocyty, exprimující současně apoptin a velký T antigen SV40, buď samotný nebo společně s malým T antigenem, prodělají apoptinem indukovanou apoptózu (obrázek 2). Míra indukce apoptózy byla zřetelně zvýšena v přítomnosti virových transformačních genů. Společná exprese malého T antigenu SV40 a apoptinu neměla za následek indukci apoptózy apoptinem. Přechod normálních buněk ze stavu necitlivosti vůči apoptinu do stavu citlivosti, může být pravděpodobně vysvětleno

skutečností, že se apoptinový protein přemístí z pozice v cytoplazmé do pozice v jádře. Tento přechod se stává zřejmý již přibližně dva dny po transfekci plazmidú SV40 (obrázek 3). Lze uzavřít, že došlo k události, v tomto případě způsobené expresí . transformujících produktů DNA nádorových virů, která má za následek přemístění apoptinu z cytoplazmy do jádra a toto přemístění je následováno indukcí apoptózy.

Příklad 3. Společná exprese velkého T antigenu SV40 a apoptinu má za následek vznik apoptinem indukované apoptózy u normálních hlodavčích diplotdních buněk.

Dále jsme zjišťovali účinek společné exprese transformujících genů a apoptinu na indukci apoptózy u normálních myších embryonálních fibroblastů (MEF) odvozených z myší p53+/+ nebo z transgenních myší p53-/-. Oba typy přechodně transfekovaných MEF společně exprimujících transformující velký T gen SV40 buď s anebo bez malého T antigenu v kombinaci s apoptinem, prodělaly velmi rychle apoptózu, zatímco MEF exprimující apoptin společně s kontrolním plazmidem, kódujícím netransformující malý T antigen neprodělaly apoptózu indukovanou apoptinem. Výsledky jsou ukázány na obrázku 4.

Imunofluorescenční analýza také odhalila, že společná exprese apoptinu a velkého T antigenu SV40 mělo za následek přemístění apoptinu v buňce. V testovaných MEF je apoptin umístěn v cytoplazmé. Po expresi velkého T antigenu SV40 vstoupí apoptin do jádra, po čemž následuje indukce apoptózy. Pro srovnání je také na obrázku 5 ukázáno procento transformovaných myších buněk pozitivních na apoptin.

Výsledky naznačuji, že apoptin neindukuje apoptózu ani v p53+/+ ani v p53-/myších fibroblastech, ale učiní tak po expresi transformujícího proteinu.

Tato informace je důležitá neboť je známo, že .normální“ buňky p53+/+ jsou velmi citlivé na spontánní transformaci a snadno vyvinou silněji transformované fenotypy. Ztráta samotného p53 však není postačující pro vytvoření transformovaného charakteru. Tento nález dále ukazuje, že apoptin může indukovat apoptózu po expresi transformujícího proteinu v jiných savčích buňkách než jsou buňky lidské.

Příklad 4. Společná exprese velkého T antigenu SV40 a apoptinu má za následek vznik apoptinem indukované apoptózy u normálních diploidních buněk, odvozených z lidských jedinců se sklonem k vývinu rakoviny.

*..··..*

Pomocí přechodné transfekce a imunofluorescence jsme také zjišťovali účinek apoptinu na normálních fibroblasty F9605 a GM1492, které jsou odvozeny z jedinců, kteří vykazují zvýšený výskyt rakoviny, způsobený genetickým poškozením. Apoptin není schopen indukovat apoptózu u normálních diploidních buněk z těchto jedinců, náchylných k vývinu rakoviny. Avšak po expresi velkého T antigenu SV40 apoptin indukuje po vstupu do jádra (údaje nejsou uvedeny) apoptózu (obrázek 6).

Tyto údaje potvrzují, že diploidní buňky, pocházející z dědičných syndromů sklonu k vývinu rakoviny, nejsou citlivé k apoptinu, zatímco citlivými se stanou pokud exprimují transformační gen. Tedy diploidní buňky, pocházející z takovýchto dědičných syndromů, jsou v tomto pokusu shodné s .normálními diploidními lidskými buňkami.

Příklad 5. Účinek kovalentní vazby signálu pro jadernou lokalizaci z velkého T antigenu SV40 k apoptinovému proteinu na indukci apoptózy.

Dále jsme zjišťovali, zda exprese chimemího proteinu obsahujícího apoptin a signál pro jadernou lokalizaci z LT antigenu SV40 (aminokyseliny N-prolin-prolin-lyzinlyzin-lyzin-arginin-lyzin-valin-C z velkého T antigenu, kovalentně vázaný kN-konci apoptinu) má za následek indukci apoptózy v netransformovaných a transformovaných lidských buňkách. Chimemí protein je nazýván NLS-apoptin. Za tímto účelem byly netransformované lidské fibroblasty VH10 a transformované buňky Saos-2, odvozené z lidského osteosarkomu (Danen-vn Oorschot a kol., 1997) transfekovány plazmidem kódujícím chimerní protein NSL-apoptin. U obou typů buněk má exprese NSL-apoptinu za následek umístění apoptinu v jádře a indukci apoptózy.

Exprimovaný neapoptotický, zeleně fluoreskující protein (Green Fluorescent Protein - GFP; Pines, 1995) kovalentně vázaný k NLS, vstoupil do jádra, nemělo to však za následek indukci apoptózy.

Údaje dokazují, že pozměněný apoptin umožňující své umístění do jádra v buňkách transformovaných nezávislým způsobem, se bude schopen přemístit do jádra a po tomto přemístění následuje indukce apoptózy.

Fúzní produkt prvních 69 aminokyselin na N-konci apoptinu a neapoptotického GFP proteinu nemělo za následek indukci apoptózy, což souhlasí se skutečností, že tento chimerní protein nevstupuje do jádra (Notebom a Pietersen, 1998). My jsme nyní připojili kovalentně 8 aminokyselin z NLS k N-konci apoptinového fragmentu, obsahujícího aminokyseliny 1 až 69 (NLS-apoptin/1-69). Transfekce jak

·..··„· netransformovaných buněk VH10, tak nádorotvomých lidských buněk (jako jsou buňky Saos-2, odvozené z lidského osteosarkomu) plazmidem kódujícím NLS-apoptin/1-69 mělo za následek umístění NLS-apoptin/1-69 do jádra po tomto přemístění následovala indukce apoptózy.

Tyto údaje naznačují, že vedle C-koncové části apoptinu, také jeho N-koncová část (aminokyseliny 1 až 69) má stejný účinek, když je přemístěna do jádra. V těchto pokusech, jak bylo očekáváno, byl NLS-GFP přemístěn do jádra, ale nemělo to za následek indukci apoptózy.

Příklad 6. Normální diploidní buňky, odvozené z jedinců se sklonem k vývinu rakoviny, prodělají apoptinem indukovanou apoptózu po ozáření UV.

Také jsme zjišťovali účinek ozáření UV na indukci apoptózy apoptinem u diploidních buněk. Diploidní fibroblasty, odvozené ze zdravých osob (VH25) nebo z jedinců se syndromem sklonu k vývinu rakoviny (buňky LF2675T z pacienta s Li Fraumeniho syndromem a buňky 401 z pacienta s Lynchovým syndromem typu 2) byly přechodně transfekovány plazmidem kódujícím apoptin. Před transfekcí byla část buněk ozářena UV. Jako negativní kontrola byly buňky transfekovány plazmidem kódujícím protein desmin.

Všechny tři typy buněk, VH25, LF2675T a 401, neprojevovaly apoptinem indukovanou apoptózu bez ozáření UV. V kombinaci s UV ozářením však buňky LF2675T a 401, nikoli však buňky VH25 prodělaly apoptinem indukovanou apoptózu velmi rychle. Třebaže jsme neměli pro tento jev vysvětlení, zdálo se že je v souhlase s jinými buněčnými vlastnostmi. Diploidní buňky z pacientů, kteří mají sklon k vývinu rakoviny, který je způsoben tím, že v zárodečné linii je přítomna mutace v genu, který potlačuje vznik rakoviny, ukazují neočekávané reakce na ozáření UV. Když je na normální diploidní fibroblasty působeno UV nebo jiným činidlem poškozujícím DNA, reagují velkým počtem rozmanitých přechodných odpovědí, včetně aktivace signální transdukční dráhy, indukce exprese rozmanitých genů, inhibice replikace buněčné DNA a aktivace jevu podobného SOS, jako je zvýšená reaktivace (ER) a zvýšená mutageneze (EM). Abrahams a kol., (1996) zjistili, že normální diploidní fibroblasty z pacientů, kteří mají dědičnou predispozici k vývinu rakoviny, která je způsobena tím, že v zárodečné linii je přítomna mutace v genu, který potlačuje vznik rakoviny, ukazují tytéž odpovědi na ozáření UV jako buňky z normálních jedinců, vyjma jediné odpovědi:

zvýšené reaktivace. Odpověď ER u buněk z těchto pacientů je mnohem vyšší než u buněk z normálních jedinců, tedy tyto pacientské buňky jsou nazývány ERsuper (+). Molekulámě-biologický základ jevu ER je stále nejasný. Detekce ER je časově náročným přístupem, protože je založen na měření (zvýšeného) přežívání viru ozářeného UV v buňkách poškozených UV (nebo paprsky X), ve srovnání s přežíváním v nepoškozených buňkách. Test založený na apoptinem indukované apoptóze pod vlivem ozáření UV je zřetelně jednodušší a rychlejší (viz níže). Skutečnost, že se apoptin stává v buňkách se sklonem k vývoji nádorů pod vlivem ozáření UV aktivní, umožňuje také studovat proces ER. Existují důkazy které ukazují, že ER hraje důležitou ůiohu v procesu indukce rakoviny činidly, které poškozují DNA.

Příklad 7. Normální diploidní buňky, odvozené z jedinců se sklonem k vývinu rakoviny, prodělají apoptinem indukovanou apoptózu po ozáření X paprsky.

Jako další jsme také zjišťovali účinek ozáření X paprsky na indukci apoptózy apoptinem u lidských diploidnfch buněk. Diploidní fibroblasty, odvozené ze zdravých jedinců (VH10) nebo z osob se syndromem sklonu k vývinu rakoviny, jako jsou buňky LF2675T a 401 byly transfekovány plazmidem kódujícím apoptin. Před transfekcí byla Část buněk ozářena X paprsky (dávka 5 grejů). Jako negativní kontrola byly buňky transfekovány plazmidem kódujícím protein desmin.

Jak bylo očekáváno, všechny analyzované neozářené buňky buněčných linií: VH10, LF2675T a 401, neukázaly apoptinem indukovanou apoptózu. V kombinaci s ozářením X paprsky však buňky odvozené z jedinců se sklonem k vývinu rakoviny prodělaly apoptinem indukovanou apoptózu, zatímco ty buňky, které byly odvozené ze zdravých jedinců, ji neprodělaly. Pět dní po transfekcí se většina z těchto buněk se sklonem k vývinu rakoviny, ozářených X paprsky a na apoptin pozitivních, stala apoptotickými. Buňky ozářené X paprsky a exprimující neapoptotické činidlo desmin, neprodělaly apoptinem indukovanou apoptózu.

Tyto výsledky naznačují, že ozáření X paprsky, způsobující poškození DNA, jako výše popsané působení UV-C, má u normálních netransformovaných lidských buněk za následek indukci apoptózy apoptinem.

Příklad 8. Diagnostický test pro geny indukující rakovinu, založený na apoptinem indukované apoptóze.

·..··..·

Danen-Van Ooschot a kol., (1997a) publikoval, že buněčná lokalizace apoptinu je odlišná v nádorotvomých/transformovaných lidských buňkách ve srovnání s lokalizací v normálních netransformovaných buňkách. Hromadění apoptinu v jádře koreluje s indukci apoptózy, zatímco lokalizace vcytoplazmě koreluje s životaschopností buněk a normální schopností množení.

Na základě předkládané skutečností, jsme schopni vyvinout diagnostický test pro určování Činidel nebo genů, které mají schopnost indukovat rakovinu anebo schopnost transformovat. První typ testu sestává ztransfekce „normálních“ buněk, například buněk lidského či hlodavčího původu, plazmidem kódujícím apoptin nebo infekce těchto buněk virovými vektory, exprimujícími apoptin, společně s plazmidem, kódujícím předpokládaný transformující anebo rakovinu indukující gen. Poté budou buňky testovány (1) na schopnost prodělat apoptózu vlivem apoptinového genu a (2) bude u nich sledována změna v lokalizaci apoptinu z cytoplazmy do jádra.

Vnitrobuněčnou lokalizaci apoptinu lze určit pomocí imunofluorescenčního testu s monoklonálními protilátkami, specifickými k apoptinu, jako jsou CVI-CAV-85.1. Jestliže procento apoptózy v normálních buňkách společně exprimujících apoptin a předpokládaný transformující anebo rakovinu indukující gen je významně vyšší, než v kontrolních buňkách pozitivních na apoptin a exprimujících kontrolní plazmid, lze uzavřít, že analyzovaný gen může vskutku mít transformující anebo rakovinu indukující aktivitu.

Druhý příklad diagnostického testu je založen na působení předpokládaného karcinogenního činidla na kultivované normální diploidní buňky. Činidlo může být přidáno například do kultivačního média po různě dlouhou dobu. Poté jsou buňky transfekovány plazmidem kódujícím apoptin nebo infikovány virovými vektory, exprimujícími apoptin. Tento postup může být také proveden tak, že jsou nejprve normální buňky transfekovány/infikovány a teprve potom je na ně působeno testovaným činidlem. Následující kroky testu jsou tytéž jako u prvního typu diagnostického testu.

Příklad 9. Diagnostický test na sklon k vývoji rakoviny.

Údaje uvedené v této zprávě nám dovolují vyvinout diagnostický test pro určování, zda jedinec s neznámým buněčným/genetickým základem, je ve srovnání s normálními zdravými osobami náchylnější k vývoji rakoviny. Normální diploidní buňky z jedince se sklonem k vývoji rakoviny jsou necitlivé k indukci apoptózy apoptinem, ale stávají se citlivými po působení UV nebo X paprsků nebo jiného činidla, poškozujícího DNA. Níže je popsán příklad takového diagnostického testu, který je založen na účinku UV ozáření. Tento test se může také provádět s jinými mutagenními/kancerogenními činidly.

Primární normální diploidní buňky jsou izolovány z kožní biopsie testovaného jedince a kultivovány ve vhodném médiu. Dále jsou buňky ozářeny UV a potom jsou transfekovány plazmidem kódujícím apoptin nebo infikovány virovým vektorem, exprimujícím apoptin nebo jsou buňky napřed transfekovány/infikovány a poté ozářeny. Paralelně jsou jako kontrola použity diploidní buňky z normálního zdravého jedince.

Pomocí testu nepřímé imunofluorescence, založeného na monoklonálních protilátkách specifických k apoptinu, jsou buňky analyzovány na přítomnost apoptinu v jádře anebo je zjišťováno, zda probíhá apoptóza. Jestliže procento buněk u kterých probíhá apoptóza je mezí UV ozářenými buňkami pozitivními na apoptin významné vyšší než procento apoptózy u UV ozářených buněk normálního jedince, je to silným důkazem, že jedinec ze kterého byly buňky izolovány, má sklon k vývinu rakoviny.

Příklad 10. Použití apoptinových proteinů ve farmaceutických přípravcích pro léčbu rakoviny.

Na základě výše zmíněných výsledků je možno též vyvinout metody pro použití apoptinu v protirakovinné léčbě, nikoli však ve formě jeho genu (DNA), nýbrž jako proteinu. Apoptin je poměrné malý protein, což usnadňuje jeho vnesení jako proteinu do buňky. (Pokud fragmenty apoptinového proteinu stále mají požadovaný apoptotický účinek na rakovinné buňky, budou použity proteinové fragmenty namísto intaktního proteinu). Naším cílem je vyvinout účinné farmaceutické přípravky, které zajistí stabilitu aktivních složek (tj. apoptinu nebo jeho fragmentů) a pokud možno specificity pro nádorové buňky, které budou cílem působení přípravku.

Novotvary které zamýšlíme léčit vhodnými přípravky, obsahujícími apoptin, jak léčebně tak preventivně, zahrnují: dědičné formy rakoviny konečníku (familiální adenomatózní polypóza (APC) a dědičná nepolypózní rakovina konečníku (HNPCCJ), rakovina jater (nebo jiných orgánů, které mohou být léčeny promývacími technikami), leukémie a lymfbmy (budou léčeny cestou krevního oběhu), nádory kůže a možná plicní nádory (cestou dýchacího ústrojí).

Příklad 11. Konstrukce a analýzy expresního plazmidu pro přípravu transgenních myší, nesoucích gen pro apoptin.

Skutečnost, že jsme pozorovali, že apoptin není schopen indukovat apoptózu v kultivovaných myších embryonálních fibroblastech, nás vedla k závěru, že apoptin může být také exprimován v intaktním embryu a dospělé myší bez toho, že by působil toxicky, přinejmenším u embryí, která nejsou v příliš časném stádiu embryonálního vývoje. Vybrali jsme si expresní systém založený na myší transkripční jednotce H-2Kb, která umožňuje stálou expresi cizích genů během embryogeneze a ve stadiu dospělosti v různých orgánech (Drezen a kol., 1992; Morello a kol., 1986).

Proto jsme konstruovali expresní plazmid p21EcoA-Vp3-Eco, který exprimuje apoptin pod regulací myšího promotoru H-2Kb. Dále expresní vektor obsahuje jiné části H-2Kb, které umožní expresi apoptinového genu. Obrázek 8 ukazuje schematicky expresní vektor p21EcoA-Vp3-Eco pro transgenní expresi apoptinu.

Metodou přechodné transfekce transformovaných buňky Saos-2 plazmidem p21EcoA-Vp3-Eco jsme byli schopni dokázat, že apoptin může být skutečně exprimován v prostředí sekvencí H-2Kb. Dále exprimovaný apoptin také indukoval apoptózu v podobném rozsahu, jako apoptin exprimovaný pomocí plazmidu pCMV-VP3 (viz obrázek 9).

Tyto výsledky naznačují, že použitý expresní vektor p21EcoA-Vp3-Eco exprimuje apoptin takovým způsobem, že transformované buňky prodělávají apoptózu.

Příklad 12. Příprava transgenních myší, nesoucích gen pro apoptin.

Celkem do 300 oplodněných vajíček byl mikroinjekcí vpraven DNA fragment, který obsahuje transkripční jednotku H-2Kb a gen pro apoptin a přeneseno do 11 pěstounských myší. Celkem jsme získali jako potomstvo 51 novorozených myší.

Pomocí blotovací analýzy podle Southema (Southern, 1975) DNA z myších ocásků, štěpené BamHI nebo Xbal a za použití 32P označeného DNA fragmentu obsahujícího kompletní gen VP3 bylo ukázáno, že jednotka apoptin/H-2Kb byla včleněna do genomové DNA celkem sedmi myší - zakladatelů linie (F0). Všechny transgenní myši, nesoucích gen pro apoptin, vypadaly zdravě. Z neznámých důvodů však jedna transgenní myš, nesoucích gen pro apoptin, uhynula ve stáří 5 až 6 týdnů.

Transgenní myši, nesoucíh gen pro apoptin, byly zkříženy se samci nebo samicemi myšího kmene FVB. V DNA z myších ocásků potomstva byla zjšťována přítomnost apoptinového genu analýzou pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) - za použití primerů P1 (5-CTCTCCAACAACATACT-CCACCCGG-3) a P2 (CTTATACGCCII i 1i-GCGGTTCGGG-3'). Od všech myší FO jsme získali jednu nebo více transgenních myší F1, nesoucích gen pro apoptin (obrázek 10).

Všechny myši generace F1 těchto transgenních zvířat, nesoucích gen pro apoptin, prokázaly životaschopnost a neprojevily se u nich žádné defekty, které by mohly být dávány do souvislosti s expresí apoptinu.

Metodou analýzy Northem-blot (Noteborn a kol, 1992) může být exprese apoptinového genu, jak je možno očekávat, zjištěna v různých orgánech.

rrúmvsiová využitelnost

Předkládaný vynález je možno využít při léčení některých druhů rakoviny. Poskytuje diagnostické soupravy pro zjištění transformační aktivity předpokládaných transformujících látek, zjištění predispozice buněk k tomu, že se vyvinou v nádorové buňky a podobné zjištění predispozice jedince pro vývin dědičných typů rakoviny. Dále vynález poskytuje lék pro preventivní léčení osob, které jsou dědičně náchylné k vývinu některých druhů rakoviny.

Reference

1. Abrahams, P.J., Huitema, B.A., and Van der Eb, A.J. (1984). Enhanced reactivation and enhanced mutagenesis of herpes simplex virus in normal human and xeroderma pigmentosum cells. Molecular Cellular Biology 4, 2341-2346. Abrahams, P.J. , Houweling, A., and Van der Eb, A.J. (1992) High levels of enhanced reactivation of Herpes simplex virus in skin fibroblasts from various hereditary cancer-prone syndromes. Cancer Research 52, 53-57.

2. Abrahams, P.J., Houweling, A., Cornelissen-Steijger, P ΓΊ Μ Tiruo-rf- P V U TT ΑΛ m___Ί _ x. 1_ _Λ - w / * . f * _Λ — , * , i* , j x , u . ri . , icxicon, and Van der Eb, A.J. (1996). Inheritance of Abnormal Expression of SOS-like Response in Xeroderma Pigmentosum and Hereditary Cancer-prone Syndromes. Cancer Research, 56, 26212625 .

3. Bellamy, C.OC., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., and Wyllie,H.1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12. 4. Brinster, R.L., Chen, H.Y., and Trumbauer, M.E. (1981). Mouse oocytes transcribe injected Xenopus 5S RNA gene. Science 211, 396-398.

5. Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Fischer, D., Grimbergen, J.M., Klein, B., Zhuang, S.-M., Falkenburg, J.H.F., Backendorf, C., Quax, P.H.A., Van der Eb, A.J., and Noteborn, M.H.M. (1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: 94, 5843-5847.

6. Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Den Hollander, A., Takayama, Ξ., Reed, J., Van der Eb, A.J., and Noteborn, M.H.M. (1997). BAG-1 inhibits p53-induced but not apoptininduced apoptosis. Apoptosis, In Press.

7. Dinsart, C. , Cornelis, J. J., Klein, B., van der Eb, A. J., and Rommelaere, J. (1984) . Transfection with extracellularly UV-damaged DNA induces human and rat cells to f express a mutator phenotype towards parvovirus H-l. Molecular

Cellular Biology_ 4 , 324w * Drezen, J.M., Nouvel, P., Babinet, C. , and Morello, D.

(1992 ). Different regulation of class I gene expression in the adult mouse and during development. The Journal of Immunology 149, 429-437.

9. De Ronde, A., et al. (1989). The SV40 small t antigen is essential for the morphological transformation of human fibroblasts. Virology 171, 260-263.

10. Duke, R.C., Ocjius, D.M., Young, J, D-E. (1996). Cell suicide in health and disease. Scientific American December 1996, 48-55.

11. Earnshaw, W.C., 1995. Nuclear changes in apoptosis. Current Opinion in Cell Biology 7, 337-343.

12. Fischer, D.F., Gibbs, S., Van de Putte, p. , and Backendorf, C. (1996). Interdependent transcription control elements regulate the expression of the SPRR2A gene during keratinocyte terminal differentiation. Molecular and Cellular Biology 16, 5365-5374.

13. Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.

14. Gruis, N.A. et al. (1995). Homozygotes for CDKN2(P16) germline mutation in Dutch familial melanoma kindreds. Nature ) Genetics, 10: 351-353, 1995.

. 15. Hockenberry, D.M. (1994) . Bel-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55.

, 16. Jacks, T. Lessons from the p53 mutant mouse (1996).

Journal of Cancer Research and Clininal Oncology 122, 19-27.

17. Jacks, T. (1994). Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Current Biology 4, 1-7.

18. Kerr, J.F.R., Winterford, C.M., and Harmon, B.V. (1994). Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy.

Cancer 73, 2013-2026.

19. Klein, B., Pastink, A., Odijk, H., Westerveld, A., and Van der Eb, A.J. (1990). Transformation and immortalization of diploid Xeroderma pigmentosum fibroblasts. Experimental Cellular Research 191, 256-262.

20. Levine, A.J. (1997). P53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88, 323-331.

21. Lowe, S.W., et al. (1994). Abrogation of oncogeneassociated apoptosis allows transformation of p53-deficient cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 2026-2030.

22. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, New York, USA.

23. McBurney. M. W. et al. (1982). Isolation of male murine embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developments in Biology 89, 503- 508.

22. McDonell T.J., Meyn, R.E., Robertson, L.E. (1995). Implications of apoptotic cell death regulation in cancer therapy. Seminars in Cancer Biology 6, 53-60.

23. Menke, A.L., Shvarts, A., Riteco, N., Van Ham, R.C.A., Van der Eb, A.J., and Jochemsen, A.G. (1997). Wilms' Tumor 1 (WT1) splice variants lacking the KTS induce apoptosis in p53-negative and p53-positive HepG2 cells. Cancer Research 57, 1353-1363.

24. Mellor, A.L., Golden, L., Weiss, E., Bullman, H., Hurst, Simpson, E., James, R.F., Townsend, A.R., Taylor, P.M., Schmidt, W., Ferluga, J., Leben, L., Santamaria, M., Atfield, G. Festenstein, H., Flavell, R.A. (1982). Expression of murine H-2Kb histocompatibility antigen in cells transformed with cloned H-2 genes. Nature 298, 529-534.

25. Morello, D., Moore, G., Salmon, A.M., Yaniv, M., and Babinet, C. (1986) . Studies on the expression of an H2K/human growth hormone fusion gene in giant transgenic mice. The EMBO Journal 5, 1877-1883.

26. Noteborn, M.H.M. and Pietersen, A.M. (1998). PCT application 98/00213 entitled Adenovirus vector.

27. Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of an anti-tumor therapy.

28. Noteborn and De Boer, G.F. (1996). Patent USA/no. 030, 335.

29. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, 0., Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. Journal of Virology 65, 31313139.

30. Noteborn, M.H.M., Hoeben, R.C., and Pietersen, A.

(1997) . A gene delivery vehicle expressing the apoptosisinducing proteins VP2 and/or apoptin. European Patent Application no. 97201121.7

31. Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, C.A.J., De Gauw, H.W.F.M., Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A.J., McNulty, M.S., Van der Eb, A.J., and Koch, G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. Journal of Virology 68,. 346-351.

32. Noteborn, M.H.M., Kranenburg, 0., Zantema, A., Koch, G., De Boer, G.F, and Van der Eb, A.J. (1992) . Transcription of the chicken anemia virus (CAV) genome and synthesis of its 52-kDa protein. Gene 118, 267-271.

33. Paulovich, A.G., Toczyski, D., Hartwell, H. (1997). When checkpoints fail. Cell 88, 315-321.

34. Philips, B., and Rundell, K. (1988). Failure of semian virus 40 small t antigen to disorganize actin cables in nonpermissive cell lines. Journal of Virology 62, 768-775. 35. Pines, J. (1995). GFP in mammalian cells. Trends in Genetics 11, 326-327.

36. Ponec , M., Kempenaar, J.A., and De Kloet, E.R. (1981) . Corticoids and cultured human epidermal keratinocytes: specific intra-cellular binding and clinical efficacy. Journal Investmental Dermatology 76, 211-214.

37. Reinwald, J.G. and Green, H. (1975). Cell 6, 331-343.

38. Sachs, L. and Lotem, J. (1993). Control of programmed cell death in normal and leukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15-21.

Schrier, P. I,, Bernards, R.., Vaessen, R. T. M. J., Houweling, A. and Van der Eb, A. J. (1983). Expression of classl major histocompatibility antigens switched off by highly oncogenic adenovirus 12 in transformed rat cells. Nature, 305, 771-775.

40. Smits, P.H.M. et al. (1992). Modulation of the human papillomavirus type 16 induced transformation and transcription by deletion of loci on the short arm of human chromosome 11 can be mimicked by SV4 0 small t. Virology 190, 40-44.

41. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98, 503-517.

42. Srivastava, S., Zou. Z., et al. (1990). Germline transmission of a mutated p53 gene in a cancer- prone family with Li-Fraumeni syndrome. Nature 348, 747-749.

43. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445-1449.

44. Telford, W.G., King, L.E., Fraker, P.J. (1992). Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry. Cytometry 13, 137-143.

45. Teodoro, J.G. and Branton, P.E. (1997). Regulation of apoptosis by viral gene products. Journal of Virology 71, 1739-1746.

46. Thompson, C.B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267, 1456-1462.

47. Van den Heuvel, S.J.L., Van Laar, T., Kast, W.M., Melief, C.J., Zantema, A., and Van der Eb, A.j. (1990). Association between the cellular p53 and the adenovirus 5 ElB-55kD proteins reduces the oncogenicity of Ad-transformed cells. EMBO Journal 9, 2621-2629.

48. Van Laar T., Steegenga wt et al. (1994). Bloom's Syndrome cells GM1492 lack detectable p53 protein but exhibit normal G1 cell-cycle arrest after UV irradiation. Oncogene. 9: 981-983

49. White, E. (1996). Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and development 10, 1-15.

50. Wyllie, A.H. (1995). The genetic regulation of apoptosis. Current Opinion in Genetics and Development 5, 97104 .

51. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.R., Currie, A.R. (1980). Cell death: The significance of apoptosis. International Review of Cytology 68, 251-306.

52. Zhuang, S.-M., Landegent, J.E., Verschueren, C.A.J., Falkenburg, J.H.F., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein encoded by chicken anemia virus, induces cell death in various human hematologic malignant cells in vitro. Leukemia 9 SI, 118-120. 53. Zhuang, S.-M., Shvarts, A., Van Ormondt, H., Jochemsen, A.-G., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus, induces a p53independent apoptosis in human osteosarcoma cells. Cancer Research 55, 486-489.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob zjištění transformační schopností předpokládaných transformujících látek, vyznačující se tím, že poskytuje netransformované buňky s indukovatelnou apoptinu podobnou apoptotickou aktivitou, vystavení uvedené buňky zmíněné transformující látce a zjištění lokalizace uvedené apoptotické aktivity uvnitř uvedené buňky nebo zjištění indukce apoptózy u zmíněné buňky.
2. 2. Způsob podle patentového nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená apoptotická aktivita je vyvolána transdukcí zmíněné buňky molekulou rekombinantní nukleové kyseliny, která uvedenou aktivitu kóduje.
3. 3. Způsob podle patentových nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zmíněná předpokládaná transformující látka má bílkovinnou podstatu.
4. 4. Způsob podle patentového nároku 3, vyznačující se tím, že zmíněná látka bílkovinné podstaty je v uvedených netransformovaných buňkách exprimována společně se zmíněnou apoptotickou aktivitou.
5. 5. Způsob určení predispozice buňky ktomu, že se stane nádorovou buňkou, vyznačující se t í m, že se do uvedené buňky dodá indukovatelná apoptinu podobná apoptotická aktivita a uvedená buňka se vystaví relativně slabé nádorotvomé aktivitě, zjistí se apoptóza v uvedené buňce anebo se určí lokalizace uvedené apoptotické aktivity v uvedené buňce.
6. 6. Způsob podle patentového nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená slabá nádorotvomé aktivita je ozáření UV.
7. 7. Způsob zjištění predispozice jedince pro dědičné typy rakoviny, vyznačující se tím, že vzorek příslušného souboru buněk tohoto jedince zpracuje způsobem podle patentových nároků 5 nebo 6.

   30 ···*· «· · ·
8. 8. Způsob zjištění genové mutace, která má onkogenní anebo transformační aktivitu v buňce, vyznačující se tím, že se uvedená buňka zpracuje způsobem podle patentových nároků 5 nebo 6.
9. 9. Použití nukleové kyseliny kódující apoptin nebo jeho funkční derivát Čí fragment k přípravě léku pro preventivní léčení souborů takových buněk u osob, které jsou náchylné k vývinu rakoviny.
10. 10. Použití podle patentového nároku 9, kdy uvedená nukleové kyselina je poskytnuta ve formě prostředku pro přenos genů.
11. 11. Diagnostická testovací souprava pro provedení způsobu podle kteréhokoli z patentových nároků 1až4, vyznačující se tím, že obsahuje netransformované buňky transdukované nukleovou kyselinou kódující apoptin nebo jeho funkční derivát či fragment.
12. 12. Diagnostická testovací souprava pro provedení způsobu podle kteréhokoli z patentových nároků 5 až 9, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinou kódující apoptin nebo jeho funkční derivát či fragment, schopnou transdukovat eukaryotické buňky a schopnou se v takové buňce exprimovat.
13. 13. Diagnostická testovací souprava podle patentového nároku 12, vyznačující se t í m, že obsahuje způsob podrobení buněk slabé nádorotvorné aktivitě.
14. 14. Způsob podle patentového nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená látka proteinové podstaty je velký T antigen SV40 nebo jeho funkční ekvivalent.