PL196605B1 - Sposób oznaczania zdolności transformującej, sposób oznaczania predyspozycji do przekształcania się w komórkę nowotworową, sposób oznaczania predyspozycji do dziedziczenia rodzajów raka, sposób oznaczania mutacji genu i diagnostyczny zestaw testowy - Google Patents

Abstract

1. Sposób oznaczania zdolno sci transformuj acej ewentualnego czynnika transformuj acego, znamienny tym, ze dostarcza si e normaln a diploidaln a komórk e ssacz a z indukowaln a aktywno sci a apoptotyczn a apoptyny, dokonuje si e ekspozycji tej komórki na czynnik transformuj acy i oznacza si e lokalizacj e aktywno sci apoptotycznej wewn atrz komórki lub oznacza si e indukcj e apoptozy w wymienionej komórce, przy czym apoptyczna aktywno sc apoptyny jest dostarcza w plazmidzie koduj acym apoptyn e lub wirusowym wektorze z ekspresj a apoptyny. PL PL PL PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 338683	(11) 196605 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 11.08.1998	(51) Int.Cl. G01N 33/50 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 11.08.1998, PCT/NL98/00457	G01N 33/574 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej	18.02.1999, WO99/08108 PCT Gazette nr 08/99

Sposób oznaczania zdolności transformującej, sposób oznaczania predyspozycji do przekształcania się w komórkę nowotworową, sposób oznaczania predyspozycji do dziedziczenia rodzajów raka, sposób oznaczania mutacji genu i diagnostyczny zestaw testowy

(30) Pierwszeństwo: 12.08.1997,EP,97202501.9	(73) Uprawniony z patentu: LEADD B.V.,Leiden,NL
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 20.11.2000 BUP 24/00	(72) Twórca(y) wynalazku: Mathieu Hubertus Maria Noteborn,Leiderdorp,NL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2008 WUP 01/08	(74) Pełnomocnik: Urszula Bartnik, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ 1. Sposób oznaczania zdolności transformującej ewentualnego czynnika transformującego, znamienny tym, że dostarcza się normalną diploidalną komórkę ssaczą z indukowalną aktywnością apoptotyczną apoptyny, dokonuje się ekspozycji tej komórki na czynnik transformujący i oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej wewnątrz komórki lub oznacza się indukcję apoptozy w wymienionej komórce, przy czym apoptyczna aktywność apoptyny jest dostarcza w plazmidzie kodującym apoptynę lub wirusowym wektorze z ekspresją apoptyny.

PL 196 605 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania zdolności transformującej, sposób oznaczania predyspozycji do przekształcania się w komórkę nowotworową, sposób oznaczania predyspozycji do dziedziczenia rodzajów raka, sposób oznaczania mutacji genu i diagnostyczny zestaw testowy.

Niniejszy wynalazek należy do dziedziny diagnozowania i leczenia raka, jak również do dziedziny oznaczania zdolności transformującej czynników prawdopodobnie rakotwórczych lub pobudzających raka (te dwa terminy będzie się stosować wymiennie).

Wspólnym mianownikiem niniejszego wynalazku jest to, że wszystkie powyżej wymienione dziedziny są dziedzinami, w których zgodnie z wynalazkiem można stosować apoptynę lub jej pochodne i/lub fragmenty (dalej zwane - apoptyna lub aktywność podobna do apoptyny). Apoptyna jest białkiem początkowo wykrytym w wirusie anemii kurcząt (Noteborn i in., (1991) i z początku nazwanym VP3. Aktywność apoptotyczna tego białka została odkryta przez twórców niniejszego wynalazku (Noteborn i in., 1994). Jak ustalono powyżej, w niniejszym wynalazku wykorzystuje się wpływ apoptyny indukujący apoptozę.

Apoptoza jest aktywnym i zaprogramowanym procesem fizjologicznym do eliminowania zbędnych nadmiernie uszkodzonych lub złośliwych komórek (Earnshaw, 1995, Duke i in., 1996). Apoptozę charakteryzuje obkurczenie komórek, podział jądra i fragmentacja cytoplazmy, kondensacja i rozszczepienie DNA do fragmentów wielko ś ci domen, po którym nastę puje w wię kszoś ci przypadków, rozkład wewnątrznukleosomowy. Komórki apoptotyczne zostają podzielone na ciałka apoptotyczne, ograniczone błoną. Ostatecznie, komórki sąsiednie i/lub makrofagi będą szybko fagocytować te obumierające komórki (Wyllie i in., 1980, White, 1996). Komórki hodowane w warunkach hodowli tkankowej oraz komórki z tkanek, można analizować pod względem oznak apoptozy, z użyciem czynników barwiących chromosomowy DNA, jak np. DAPI lub jodku propiodyny, które barwią normalny DNA (chromatyczny) silnie i regularnie, lecz chromatynę apoptotyczną słabo i/lub nieregularnie (Noteborn i in., 1994, Telford i in., 1992).

Procesy apoptotyczne mogą być inicjowane różnymi bodźcami regulatorowymi (Wyllie, 1995, White, 1996 Levine, 1997). Zmiany tempa przeżycia komórek grają istotną rolę w patogenezie człowieka, np. w rozwoju raka, który jest powodowany przez zwiększoną proliferację i/lub przez zwiększoną śmierć komórek (Kerr i in., 1994, Paulovich, 1997). Przedstawiono rozmaite czynniki chemioterapeutyczne i napromieniowujące, indukujące apoptozę w komórkach rakowych, w której, w wielu przypadkach, pośredniczy białko supresorowe wobec nowotworu p53 (Thompson, 1995, Bellamy i in., 1995, Steller, 1995, McDonell i in., 1995). Jednak w wielu nowotworach powstaje mutacja w p53 podczas ich rozwoju, korelując często ze słabą odpowiedzią na terapię przeciwrakową. Białka transformujące wirusów DNA nowotworu inaktywują p53 pośrednio lub przez bezpośrednie wiązanie się z nim (Teodoro, 1997). Przykładem takiego czynnika jest wielki antygen T wirusa SV40 DNA nowotworu. W pewnych nowotworach krwiotwórczości, wysoki poziom ekspresji onkogenu Bcl-2 wiąże się z silną odpornością na różne chemioterapeutyczne czynniki indukujące apoptozę (Hockenberry 1994, Sachs i Lotem, 1997). Dla takich raków, które są oporne wobec wielu czynników cytotoksycznych, opracowuje się antynowotworowe terapie alternatywne, na podstawie indukcji apoptozy (Thompson, 1995 i Paulovich i in., 1997).

Apoptyna jest małym białkiem, pochodzącym od wirusa anemii kurcząt (CAV; Noteborn i in., 1991, Noteborn i in., 1994), które może indukować apoptozę w ludzkich złośliwych i transformowanych liniach komórkowych, lecz nie w ludzkich nie transformowanych komórkach diploidalnych. In vitro, apoptyna nie jest zdolna do indukcji programowanej śmierci komórkowej w normalnych komórkach limfoidalnych, fibroblastycznych skóry, naskórka, śródbłonkowych i mięśni gładkich. Jednakże, jeśli transformuje się normalne komórki, np. genami transformującymi SV40, stają się one podatne na apoptozę przez apoptynę. (Danen-van Oorschot, 1997 i Noteborn, 1996). Długotrwała ekspresja w normalnych ludzkich fibroblastach, ujawniła, że apoptyna nie wykazuje aktywności toksycznej lub transformującej w tych komórkach. Okazało się, że w komórkach normalnych apoptyna znajduje się przede wszystkim w cytoplazmie, podczas gdy w komórkach transformowanych lub złośliwych, znajdowała się w jądrze sugerując, że lokalizacja apoptyny wiąże się z jej aktywnością indukującą śmierć (Danen-van Oorschot i in., 1997).

Apoptyna może także indukować apoptozę przy nieobecności funkcjonalnego p53 (Zhuang i in., 1995a), i nie moż e być ona hamowana przez Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang i in., 1995), białko towarzyszące Bcl-2 BAG-1 oraz inhibitor kaspazy białko CrmA ospy krowiej (Danen-Van Oorschor, 1997,

PL 196 605 B1

Noteborn, 1996). Wreszcie, okazuje się, że komórki, które są jedynie unieśmiertelnione i przez to minimalnie transformowane, mogą być także zabite przez apoptynę.

Zatem, apoptyna jest niezwykle silnym czynnikiem antynowotworowym, także wobec nowotworów, które nie są lub są mniej podatne na czynniki (chemio)terapeutyczne, z powodu braku funkcjonalnego p53, (nad)-ekspresji Bcl-2 lub innych genów hamujących apoptozę. Fakt, że apoptyna nie indukuje apoptozy w normalnych komórkach człowieka sugeruje, że skutek toksyczny leczenia apoptyną in vivo, będzie bardzo niski. Oprócz tego, okazuje się, że nawet komórki przedrakowe, komórki minimalnie transformowane, mogą być wrażliwe na wpływ apoptotyny indukujący śmierć.

Wiedząc, że apoptyna jest całkowicie bezpieczna w komórkach normalnych, ale tylko do momentu gdy komórki transformuje się i/lub unieśmiertelnia (terminy można stosować w niniejszym wynalazku wymiennie), niniejsi twórcy zaplanowali pewne zastosowania na podstawie tego odkrycia.

Tak więc, przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania zdolności transformującej ewentualnego czynnika transformującego, polegający na tym, że dostarcza się normalną diploidalną komórkę ssaczą z indukowalną aktywnością apoptotyczną apoptyny, dokonuje się ekspozycji tej komórki na czynnik transformujący i oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej wewnątrz komórki lub oznacza się indukcję apoptozy w wymienionej komórce, przy czym apoptotyczna aktywność apoptyny jest dostarczana w plazmidzie kodującym apoptynę lub wirusowym wektorze z ekspresją apoptyny.

Korzystnie aktywność apoptotyczną zapewnia się przez transdukcję komórki cząsteczką rekombinowanego kwasu nukleinowego, kodującego wspomnianą aktywność. Ewentualnym czynnikiem transformującym w sposobie według wynalazku może być korzystnie substancja białkopodobna. Bardziej korzystna odmiana wynalazku pozwala na to, że białkopodobna substancja ulega koekspresji w nie transformowanej komórce z aktywnością apoptotyczną. Jeszcze bardziej korzystnie, wymienioną substancją białkopodobną jest wielki antygen T SV40 lub jego funkcjonalny równoważnik.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oznaczania predyspozycji normalnej diploidalnej komórki ssaczej do przekształcenia się w komórkę nowotworową, polegają cy na tym, że dostarcza się wspomnianą komórkę z indukowalną aktywnością apoptotyczną apoptyny i poddaje się tą komórkę relatywnie łagodnej aktywności rakotwórczej oraz oznacza się apoptozę w wymienionej komórce i/lub oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej w tej komórce, przy czym apoptyczną aktywność apoptyny dostarcza się w plazmidzie kodującym apoptynę lub wirusowym wektorze z ekspresją apoptyny.

Korzystnie jako łagodną aktywność rakotwórczą stosuje się napromieniowanie UV.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób oznaczania predyspozycji do dziedzicznych rodzajów raka u ssaka, polegający na tym, że dostarcza się próbkę istotnego podzbioru normalnych diploidalnych komórek tego ssaka z indukowalną apoptotyczną aktywnością i poddaje się wspomniane komórki relatywnie łagodnej aktywności rakotwórczej oraz oznacza się apoptozę w komórkach i/lub oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej w tych komórkach, przy czym indukowalną aktywność apoptotyczną dostarcza się przez apoptynę lub pochodną i/lub jej fragment. Korzystnie, łagodną aktywnością rakotwórczą jest napromieniowanie UV.

Przedmiotem wynalazku jest także, sposób oznaczania mutacji genu, mającego aktywność onkogeniczną i/lub transformującą w normalnej diploidalnej komórce ssaczej, polegający na tym, że dostarcza się wspomnianą komórkę z indukowalną aktywnością apoptotyczną i poddaje się komórkę relatywnie łagodnej aktywności rakotwórczej oraz oznacza się apoptozę w wymienionej komórce i/lub oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej w tej komórce, przy czym indukowalną aktywność apoptotyczną dostarcza się przez apoptynę i/lub jej fragment. W sposobie według wynalazku łagodną aktywnością rakotwórczą jest napromieniowanie UV.

Następnym przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny zestaw testowy, charakteryzujący się tym, że zawiera kodujący apoptynę kwas nukleinowy, zdolny do transdukcji komórki eukariotycznej i zdolny do ekspresji w takiej komórce i ponadto ś rodki do poddawania komórki ł agodnej aktywnoś ci rakotwórczej.

Zaleca się dostarczanie komórki z aktywnością apoptotyczną poprzez transdukcję cząsteczką rekombinowanego kwasu nukleinowego, kodującą aktywność apoptotyczną. Aktywność podobną do apoptyny (aktywność apoptyno-podobną) określa się jako każdą (korzystnie białkopodobną) substancję, mającą podobną aktywność jak VP3 lub apoptyna wirusa anemii kurcząt.

PL 196 605 B1

Definicja ta obejmuje odmiany alleliczne, pochodne i/lub fragmenty apoptyny, gdzie pochodne określa się jako mające zamiany aminokwasów, które nie powodują utraty całej aktywności apoptotycznej. Należy rozumieć, że podobna aktywność oznacza, że rodzaj aktywności jest taki sam, choć wielkość może być inna. Sposoby według wynalazku są szczególnie użyteczne w zastosowaniach, dzięki którym moż liwy czynnik transformują cy jest substancją biał kopodobną . Pozwala to substancji białkopodobnej na koekspresję w wymienionej komórce nie transformowanej z aktywnością apoptotyczną. Przykładową substancją białkopodobną jest wielki antygen SV40 lub jego funkcjonalny równoważnik.

Wynalazek oparty jest na modyfikacji genu Apoptyny, powodując zmiany białka apoptyny, umożliwiające wejście apoptyny do jądra w komórkach nie transformowanych i transformowanych/rakotwórczych, w wyniku czego następuje indukcja apoptozy. Białko apoptyny jest powiększone o jądrowy sygnał lokalizacji z SV40. Konkretnie, wymieniona definicja apoptyny obejmuje odmiany alleliczne, pochodne i/lub fragmenty apoptyny, gdzie pochodne określa się jako mające zamiany aminokwasów, które nie powodują utraty całej aktywności. Pozwala to na ekspresję białka apoptyny w nie transformowanych komórkach z wymienioną aktywnością apoptotyczną. Fragmenty apoptyny z wymienioną aktywnością apoptotyczną lecz nie zdolne do wejścia do jądra komórek nie transformowanych lub transformowanych dzięki swym własnym sekwencjom, są zdolne do wejścia do jądra za pomocą modyfikacji i do indukcji apoptozy.

W sposobie oznaczania predyspozycji komórki do przemiany w komórkę nowotworową , sprawdza się czy czynnik transformujący jaki omawia się w niniejszym wynalazku, wcześniej, jest już obecny w tej komórce w postaci mutacji, prowadzącej do aktywności onkogenicznej lub rakotwórczej. W takim wypadku, fakt, że apoptyna jedynie indukuje apoptozę w komórkach, które już transformowano, prowadzi do możliwości sprawdzenia, czy komórki posiadają mutację, prowadzącą do unieśmiertelnienia, czy transformacji w warunkach łagodnej ekpozycji na aktywność transformującą, taką jak napromieniowanie UV i traktowanie promieniami rentgenowskimi.

W ten sposób moż na okreś lić prawdopodobień stwo zbioru komórek, prowadzą cych do raka. Prowadzi to oczywiście, do zastosowań w dziedzinie diagnozowania szans dla ludzi, posiadających dziedziczne ryzyko zachorowania na raka, oraz podania leczenia zapobiegawczego, które jest innym przedmiotem niniejszego wynalazku. Ten rodzaj diagnozowania można także stosować przy doradztwie dla ludzi z prawdopodobieństwem, że ich dzieci będą predysponowane do raka.

Tak więc, wynalazek opisuje także sposób określania predyspozycji podmiotu do dziedzicznych typów nowotworów, obejmujący poddanie próbki istotnego podzbioru komórek takiego podmiotu, sposobowi jaki opisano w niniejszym. I dalej, wynalazek opisuje sposób określania mutacji genowej, mającej aktywność onkogeniczną i/lub transformującą w komórce, obejmujący poddanie wymienionej komórki sposobowi według wynalazku.

Wynalazek daje możliwość zapewnienia środków do leczenia profilaktycznego podzbioru komórek u osoby, której podzbiór komórek stał się rakotwórczy. Środki te obejmują kwas nukleinowy, kodujący aktywność podobną do apoptyny, korzystnie dostarczoną w postaci nośnika dostarczania genu. Nośniki dostarczania genu mogą być pochodzenia wirusowego lub innego. W stanie techniki opisano wiele nośników i są one znane fachowcom. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, wektory adenowirusowe, korzystnie w postaci cząstek adenowirusa; wektory retrowirusowe, korzystnie jako retrowirusy rekombinowane; te same rodzaje wektorów lecz pochodzące od innych wirusów; liposomy lub inne cząsteczki nośnikowe, itd.

Stwierdzono, że białko wirusowe apoptyna indukuje apoptozę w hodowanych komórkach transformowanych, pochodzących zarówno od człowieka jak i gryzonia, lecz nie w komórkach normalnych. Zaobserwowaliśmy obecnie, że apoptyna nie może indukować apoptozy w hodowanych mysich (lub szczurzych) fibroblastach zarodkowych. (Hodowle pochodziły od 16-18-dniowych zarodków mysich (szczurzych). Pokazuje to, że apoptyna może także ulegać ekspresji w nieuszkodzonych zarodkach bez powodowania toksyczności, przynajmniej zarodkach w niezbyt wczesnym etapie rozwoju zarodkowego.

Jesteśmy obecnie zdolni do wytworzenia transgenicznych myszy apoptynowych, które są zdolne do życia. Dostarczamy dowód, że konstytutywna ekspresja apoptyny w myszy transgenicznej nie powoduje efektów letalnych lub innych zagrażających życiu/ograniczających życie. Zaobserwowaliśmy także, że kotransfekcja hodowanych normalnych ludzkich fibroblastów genem apoptyny i genami transformującymi SV40, uaktywni proces apoptotyczny, któremu towarzyszy translokacja białka apoptyny z cytoplazmy, gdzie gromadzi się początkowo, do jądra.

PL 196 605 B1

Opisany wynalazek dostarcza podstawę dla aminokwasowych addycji do białka apoptyny lub jej fragmentów, umożliwiając im wejście i/lub akumulację w jądrze komórkowym, powodując indukcję apoptozy.

Wynalazek dostarcza podstawy dla testu diagnostycznego do wykrywania genów potencjalnie transformujących. Normalne diploidalne komórki ssaków, takie jak komórki ludzkie i/lub gryzoni, kotransfekuje się plazmidem, zawierającym badane gen(y) i plazmidem, kodującym apoptynę, albo transfekuje się badanym genem(ami) i zakaża wektorem wirusowym, z ekspresją apoptyny. Indukcja apoptozy indukowanej apoptyną i/lub obecność apoptyny w jądrze, pokazuje, że badany gen posiada siłę transformującą/rakotwórczą.

Ponadto, odkryliśmy, że diploidalne komórki człowieka wyizolowane od osobników, którzy niosą mutację linii zarodkowej w genie supresorowym wobec nowotworu i w wyniku czego są predysponowani do rozwoju pewnego spektrum nowotworów (cytowani także w niniejszym opisie jako skłonni do raka), są oporne na wpływ apoptyny indukujący apoptozę, po prostu jako diploidalne komórki od zdrowych osobników, jednak uwrażliwiają się jeśli hodowle napromieniuje się światłem ultrafioletowym.

Pozwoliło to zaprojektować test diagnostyczny do przewidywania skłonności do rakowacenia. W rodzinach z dziedziczną predyspozycją do raka z powodu mutacji linii zarodkowej w genie supresorowym wobec nowotworu, bez szerokiej analizy chromosomowego DNA często nie jest możliwe przewidzenie, czy członek rodziny jest obarczony i niesie gen chorobowy. Nasze wyniki ukazują, że jest to proste przy zastosowaniu genu apoptyny. W tym celu, od testowanych osobników izoluje się diploidalne fibroblasty skóry albo limfocyty i hodowane komórki transfekuje genem apoptyny, po czym napromieniowuje światłem UV (266 nm). Jeśli transfekowane komórki staną się apoptotyczne bez ekspozycji wobec UV, wtedy jest to (mocny) wskaźnik, że osobnik jest skłonny do raka. Nie przetestowano jeszcze wszystkich rodzajów predyspozycji na raka, powodowanego mutacją w genie supresorowym wobec nowotworu, za pomocą testu Apoptotyny/UV. Jednak nie ma powodu do przypuszczenia, że nie zaobserwuje się takiego samego zjawiska w innych komórkach skł onnych do raka. Podobne testy diagnostyczne do przewidywania skłonności do raka można także przeprowadzić, stosując traktowanie promieniowaniem rentgenowskim zamiast napromieniowania UV.

Wynalazek pozwala nam także na uzyskanie więcej informacji na podstawie molekularnej skłonności do raka i jej związku z pewnymi odpowiedziami stresowymi, takimi jak wzmożona reaktywacja (ER) (Abrahams i in., 1996). Wzmożona reaktywacja jest jedną z reakcji normalnych (ludzkich) komórek na pewne czynniki niszczące DNA, i okazuje się, że odzwierciedla podatność komórek na transformację onkogeniczną.

Wynalazek zostanie wyjaśniony bardziej szczegółowo w następującej części doświadczalnej. Służy ona jedynie do celów ilustracyjnych i nie powinno się jej interpretować jako ograniczającą zakres wynalazku.

Część doświadczalna

Komórki i warunki hodowli komórkowej

Wytworzono fibroblasty zarodkowe szczura (REF) z 14-dniowych zarodków szczurzych. Komórki rozmrożono z ciekłego azotu, hodowano w DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą i transfekowano plazmidowym DNA podczas 2 pasażu komórkowego.

Wytworzono mysie fibroblasty zarodkowe (MEF) z p53+/+ myszy lub z p53 -/- myszy znokautowanych (Tyler, Jacks, 1994 i 1996; Tyler, Jacks i in., 1994). Komórki hodowano na płytkach Corning w pożywce F15 uzpełnionej 10% płodową surowicą cielęcą . Komórki P19 pochodzą od mysiego raka zarodkowego/potworniaka złośliwego (Burney i in., 1982). Komórki hodowano na płytkach Petriego z żelatyną w DMEM uzupełnionym 8% płodową surowicą cielęcą.

Wytworzono komórki BRK/xho z komórek nerkowych młodych szczurów, przez transformowanie regionem E1 adenowirusa typu 5 (Schrier i in., 1983). Komórki hodowano w DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.

Ludzkie diploidalne fibroblasty napletkowe VH10 i VH25 (Klein i in., 1990) hodowano w pożywce Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) uzpełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.

Zainicjowano pierwotne hodowle ludzkich keratynocytów naskórkowych (FSK-1) w kompletnej pożywce, jaką opisano (Rheinwald i Green, 1975), z pomniejszymi modyfikacjami, zgodnie z M.Ponec i in., 1981 i nastę pnie hodowano w poż ywce dla keratynocytów pozbawionej surowicy (KSFM). Do doświadczeń opisanych tutaj, użyto pasaż numer 3.

PL 196 605 B1

Komórki F9605 są diploidalnymi fibroblastami, będ ącymi p16 -/-, uzyskanymi od pacjentów z zespołem znamienia dysplastycznego (DNS), który uważ a się za prekursora rodzinnego wielokrotnego a-typowego zespołu znamienia-czerniaka (FAMM) (Gruis i in., 1995). Komórki hodowano w DMEM z 10% płodową surowicą cielę c ą .

Komórki GM1492 są ludzkimi diploidalnymi fibroblastami, które nie wykazują ekspresji p53 i pochodzą od pacjentów z zespołem Bloom'a, autosomalnego schorzenia recesywnego z częstym występowaniem raka (Val Laar i in., 1994). Komórki hodowano w DMEM, zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą.

LF2675T są diploidalnymi fibroblastami skóry od pacjentów z zespołem Fraumeni (LFS). Choroba ta charakteryzuje się mutacją linii zarodkowej w jednym allelu genu p53 i wczesnym występowaniem różnych typów raka (Srivastava i in., 1990; Abrahams i in., 1996). Komórki hodowano w DMEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.

Komórki 401 są diploidalnymi fibroblastami skóry od osoby z rodziny z zespołem Lynch'a typu 2 o czę stym wystę powaniu róż nych typów raka. Komórki pochodził y od osoby, która zmarł a na raka piersi (Abrahams i in., 1996).

Komórki hodowano w DMEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.

Wszystkie pożywki hodowlane otrzymano od GIBCO/BRL i zawierały antybiotyki penicylinę i streptomycynę.

Napromieniowanie hodowli komórek

Kondycjonowaną pożywkę usunięto z hodowli i komórki przepłukano dwukrotnie PBS. Po usunięciu PBS, hodowle napromieniowano UV jak opisano poprzednio (Abrahams i in., 1984), lub traktowano promieniami rentgenowskimi (kontrast 5) przez użycie Andrex 225 SMART (Andrex St, Kopenhaga) przy 200 KV, 4 mA z filtrem 1 - mm A1. Dawkę i tempo dawkowania monitorowano za pomocą dozymetru PTW. Po traktowaniu UV, przywrócono kondycjonowaną pożywkę i hodowlę inkubowano w temperaturze 37°C.

Plazmidy

Plazmid ekspresji pCMV-VP3 zawiera sekwencję DNA CAV, kodującą wyłącznie białko apoptyny (nt 427-868; Noteborn i in., 1991, Noteborn i De Boer, 1996), a plazmid pCMV-des koduje desminę, strukturalne białko komórek mięśniowych (Menke i in., 1997). Plazmid pCMV-neo stosuje się jako „pustą” kontrolę ujemną dla plazmidów, kodujących produkty genowe o potencjalnym wpływie na apoptozę indukowaną apoptyną. Wszystkie geny wykazujące ekspresję podlegają regulacji (wczesnego) wzmocnionego promotora cytomegalowirusa.

Plazmid SV40 zawiera klon wczesnego regionu z defektywnym początkiem (ori-), obejmujący regiony, kodujące zarówno wielki antygen T jak i mały antygen T SV40, regulowane przez ich własny promotor (Dinsart i in., 1984). Plazmid pR-s884 wykazuje ekspresję pełnego wielkiego antygenu T SV40 i skróconego małego antygenu T pod kontrolą transkrypcyjną długoterminowego powtórzenia (LTR) wirusa mięsaka Rous'a (RSV; De Ronde i in., 1989; Smits i in., 1992). Plazmid PR-SV-t zawiera sekwencje cDNA, kodujące mały gen T SV40, który poddano fuzji z LTR RSV (Philips i Bundell, 1988).

Plazmid ekspresji 21EcoA, który składa się z mysiego genu antygenu zgodności tkankowej H-2Kb/regionów promotora (Mellor i in., 1982) i sekwencją pBr327 jest darem od prof. dr. Franka Grosvelda, Uniwersytet Erasmusa, Rotterdam, Holandia. Plazmid 21EcoA zawiera Not1 wewnątrz pierwszego egzonu genu H-2Kb, który umożliwia integrację obcego genu, który zaczyna podlegać regulacji przez promotor H-2Kb. Fragment BamH1, zawierający sekwencje, kodujące apoptynę, wyizolowano z pCMV-VP3 i klonowano w miejscu Not1 plazmidu 21EcoA przez użycie linkerów Not1-BamH1. Ostateczny plazmid, zawierający gen apoptyny regulowany promotorem H-2Kb, nazwano p21EcoA-VP3. Następnie, usunięto miejsce EcoRI za genem apoptyny przez linearyzację plazmidu p21EcoA-VP3 w tym specyficznym miejscu EcoRI i traktowanie polimerazą Klenowa. Plazmid nazwano p21EcoA-VP3-Eco.

Fragment DNA, zawierający jednostkę ekspresji H-2Kb z genem apoptyny oddzielono od sekwencji DNA prokariotycznego za pomocą trawienia EcoRI i elektroforezy w żelu agarozowym.

DNA plazmidu oczyszczono przez wirowanie w gradiencie CsCL i chromatografię kolumnową w Sephacryl S500 (Pharmacia, Szwecja).

PL 196 605 B1

Transfekcja krótkotrwała

Komórki transfekowano jednowarstwowymi hodowlami za pomocą czynnika transfekcji DOTAP (Boehringer, Mannheim, Niemcy) zasadniczo jak opisano przez Fischer i in., 1996 lub transfekowano plazmidowym DNA przez wytrącanie fosforanem wapnia jak opisano u Graham i Van der Eb (1973).

Immunofluorescencja pośrednia.

Wszystkie komórki hodowano na szkiełkach mikroskopowych. Szkiełka powleczono albo nie powleczono (VH10, VH25) lub powleczono 3-aminopropylotrietoksysilanem (TESPA; FSK-1). Komórki utrwalono 80% acetonem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i użyto do pośredniej immunofluorescencji, jak opisano (Van den Heuvel, 1990). Aby zademonstrować obecność i/lub lokalizację apoptyny w komórce w komórkach transfekowanych, użyto mysiego przeciwciała monoklonalnego (Mab) CVI-CAV-85.1 (85.1; Noteborn i in., 1991); dla ludzkiej desminy, mysiego Mab 33 (Monosan, Uden, Holandia), wobec antygenów T SV40 Pab 419, uprzejmie dostarczonego przez dr J.-G Jochemsen, uniwersytet Leiden, Holandia. Jako drugie przeciwciało użyto kozie przeciwciało mysie znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (Jackson Immunosearch Laboratories Inc., West grove PA, USA). Jądrowy DNA zabarwiono 2,4-diamino-2-fenyloindolem (DAPI).

Utworzenie transgenicznej myszy apoptotynowej.

W celu wytworzenia transgenicznej myszy apoptotynowej, zapłodniono oocyty ze szczepu myszy FVB i myszy ze szczepu mysiego użyto jako karmicielki. Przeprowadzono mikroinjekcje w męskim przedjądrzu zgodnie z Brinster i in., (1981). Na mikroinjekcję wstrzyknięto 500 kopii fragmentu DNA EcoR1, pochodzących z plazmidu p21EcoA-Vp3-Eco, zawierających wymaganą jednostkę transkrypcji H-2Kb i pełny gen apoptyny.

Wyniki i omówienie

Apoptyna indukuje apoptozę w transformowanych komórkach gryzoni, lecz nie w normalnych komórkach zarodkowych.

Aby zbadać, czy apoptyna nie może indukować apoptozy w normalnych komórkach zarodkowych gryzoni, hodowle mysich komórek zarodkowych i szczurzych komórek zarodkowych, transfekowano krótkotrwale plazmidem, kodującym apoptynę. Jako kontrolę ujemną, komórki transfekowano plazmidem, kodującym desminę, która nie posiada aktywności apoptotycznej. Komórki, wykazujące ekspresję apoptyny poddano skriningowi poprzez pośrednią immunofluorescencję z użyciem Mab 85.1, a komórki, wykazujące ekspresję desminy, z użyciem mysiego Mab 33. Indukcję apoptozy w komórkach dodatnich pod względem apoptyny lub desminy analizowano za pomocą DAPI, który powoduje regularne zabarwienie w nieuszkodzonych jądrach, lecz nieregularne i/lub słabe zabarwienie w jądrach apoptotycznych.

Pięć dni po transfekcji około 10-20% komórek dodatnich pod względem desminy było apoptotycznych, co jest poziomem podstawowym, spowodowanym w większości zajściem transfekcji (dane nie ukazane, Menke i in., 1997, Danen-van Oorschot, 1997a). Dwa, 3, 4 lub 5 dni po transfekcji, procent komórek apoptotycznych wśród komórek dodatnich pod względem apoptyny, nie przekroczył znacząco procentu komórek apoptotycznych obserwowanych w hodowlach dodatnich pod względem desminy, wskazując, że apoptyna nie indukuje apoptozy w normalnych hodowlach komórek zarodkowych. Krótkotrwała transfekcja transformowanych mysich/szczurzych komórek zarodkowych lub komórek nerkowych młodych szczurów plazmidem, kodującym apoptynę, dowiodła, że apoptyna jest zdolna do indukcji apoptozy w tych komórkach. Wyniki ekspresji apoptyny w „normalnych” komórkach zarodków gryzoni kontra transformowanym komórkom gryzoni, ukazuje się w fig. 1.

Dane te pokazują, że apoptyna nie może indukować apoptozy w normalnych dorosłych i zarodkowych komórkach gryzoni, lecz indukuje apoptozę w transformowanych wirusem pochodnych, przynajmniej w warunkach hodowli komórkowej.

Wyniki koekspresji wielkiego antygenu T SV40 i apoptyny w apoptozie indukowanej apoptyną w normalnych ludzkich komórkach diploidalnych.

Zbadaliśmy wpływ ekspresji genów transformujących na apoptozę indukowaną apoptyną w normalnych komórkach człowieka, pochodzących od zdrowych osobników. W tym celu, ludzkie diploidalne fibroblasty VH10 i diploidalne keratynocyty FSK-1 poddano krótkotrwałej koekspresji plazmidem pCMV-VO3, kodującym apoptynę i albo plazmidem pSV40, kodującym zarówno wielki antygen SV40 jak i mały antygen T, albo kontrolą ujemną - plazmidem pCMV-neo. Przez pośrednią immunofluorescencję komórki analizowano pod względem apoptozy indukowanej apoptyną. Zarówno komórki VH10 jak FSK-1 nie uległy apoptozie, jeśli apoptynę transfekowano plazmidem kontrolnym.

PL 196 605 B1

Zgodnie z oczekiwaniami, wyniki pokazały, że ekspresja samej apoptyny nie może indukować apoptozy w normalnych ludzkich komórkach diploidalnych, potwierdzając dane opisane przez Danen-Van Oorschot (1997). Jednakże, normalne diploidalne fibroblasty człowieka i keratynocyty, wykazujące ekspresję zarówno apoptyny jak i wielkiego antygenu T SV40, pojedynczo lub razem z małym antygenem T, uległy apoptozie indukowanej apoptyną (fig. 2). Tempo indukcji apoptozy zwiększyło się znacznie w obecności wirusowych genów transformujących. Koekspresja małego antygenu T SV40 z apoptyną nie powodowała indukcji apoptozy przez apoptynę. Przejście normalnych komórek, od opornych na apoptynę do podatnych na apoptynę, można prawdopodobnie wytłumaczyć przez fakt, że białko apoptyny przemieszcza się z lokalizacji w cytoplazmie do lokalizacji jądrowej. To przejście staje się widoczne już około 2 dni po transfekcji plazmidów SV40 (fig. 3). Można wywnioskować, że zdarzenie ma miejsce w tym wypadku dzięki ekspresji produktu transformującego z wirusa DNA nowotworu, w wyniku czego nastąpiło przemieszczenie apoptyny z cytoplazmy do jądra, po czym indukcję apoptozy.

Wyniki koekspresji wielkiego antygenu T SV40 i apoptyny w apoptozie indukowanej apoptyną, w normalnych komórkach diploidalnych gryzoni.

Następnie, zbadaliśmy wpływ koekspresji genów transformujących i apoptyny na indukcję apoptozy w normalnych mysich fibroblastach zarodkowych (MEF) pochodzących od myszy p53 +/+ lub od transgenicznych myszy p53 -/-. Oba typy MEF krótkotrwale transfekowanych, wykazujących koekspresję transformującego wielkiego genu T SV40 z, lub bez małego antygenu T w połączeniu z apoptyn ą , uległ y apoptozie, podczas gdy MEF z ekspresją apoptyny razem z plazmidem kontrolnym lub plazmidem, kodującym nie transformujący mały antygen T, nie powodowały apoptozy indukowanej apoptyną. Wyniki ukazuje się w fig. 4.

Analiza immunofluorescencji ujawniła także, że koekspresja apoptyny i wielkiego antygenu T SV40 powodował a przemieszczenie komórkowe apoptyny. W badanych MEF apoptyna znajduje się w cytoplazmie. Podczas ekspresji wielkiego antygenu T SV40, apoptyna wchodzi do j ą dra, po czym inudukuje apoptozę. Dla porównania, w fig. 5 podano również procent transformowanych komórek myszy dodatnich pod względem apoptyny.

Wyniki te wskazują, że apoptyna nie indukuje apoptozy w fibroblastach myszy zarówno p53 +/+ i p53 -/-, lecz indukuje podczas ekspresji białka transformującego. Informacja ta jest istotna, ponieważ wiadomo, że „normalne komórki p53 -/- są bardzo podatne na spontaniczną transformację i łatwo stając się fenotypami wyżej transformowanymi. Jednakże utrata samego p53 nie wystarcza do stworzenia charakteru transformowanego. Ponadto, odkrycie to ukazuje, że apoptyna może indukować apoptozę podczas ekspresji białka transformującego w komórkach ssaków innych, niż komórki człowieka.

Wyniki koekspresji wielkiego antygenu T SV40 i apoptyny w apoptozie indukowanej apoptyną, w normalnych komórkach diploidalnych, pochodzących od osobników ludzkich skłonnych do raka.

Za pomocą krótkotrwałej transfekcji i immunofluorescencji, zbadaliśmy również wpływ apoptyny w normalnych fibroblastach F9605 i GM1492, które uzyskano od osób, wykazujących zwiększone występowanie raka z powodu defektu genetycznego. Apoptyna nie mogła indukować apoptozy w normalnych komórkach diploidalnych od tych skłonnych do raka osób. Jednakże, podczas ekspresji wielkiego antygenu T SV40, apoptyna indukuje apoptozę (fig. 6) po wejściu do jądra (dane nie ukazane).

Dane te potwierdzają, że komórki diploidalne od dziedzicznych zespołów skłonności do raka nie są podatne na apoptynę, lecz stają się takie, jeśli wykazują ekspresję genu transformującego. Tak więc, komórki diploidalne od takich dziedzicznych zespołów są identyczne jak „normalne diploidalne komórki człowieka w tym teście.

Wpływ na indukcję apoptozy wiązania kowalentnego sygnału lokalizacji jądrowej wielkiego antygenu T SV40 z białkiem apoptyny.

Następnie zbadaliśmy, czy ekspresja chimerycznego białka, składającego się z apoptyny i sygnału lokalizacji jądrowej antygenu LT SV40 (aminokwasy N-prolina-prolina-lizyna-lizyna-lizyna-arginina-lizyna-walina-C wielkiego antygenu T SV40 połączonego kowalentnie z końcem N apoptyny) powoduje indukcję apoptozy w nie transformowanych i transformowanych komórkach człowieka. Białko chimeryczne nazwano NLS-apoptyną. W tym celu, nie transformowane ludzkie fibroblasty VH10 i transformowane ludzkie komórki Saos-2, pochodzą ce od kostniakomię saka (Danen-van Oorschot i in., 1997) transfekowano plazmidem, kodującym białko chimeryczne NLS-apoptynę. W obu typach komórek ekspresja NLS-apoptyny powodowała lokalizację jądrową apoptyny i indukcję apoptozy.

PL 196 605 B1

Ekspresja białka nie apoptotycznego Green Fluorescent Protein (GFP; (Pines, 1995)) kowalentnie połączonego z NLS, weszła do jądra, co nie spowodowało indukcji apoptozy.

Dane te dowodzą, że modyfikowana apoptyna, będąc zdolną do lokalizacji jądrowej w sposób niezależny od transformowanej komórki, będzie mogła przenieść się do jądra, po czym indukować apoptozę.

Produkt fuzyjny pierwszych 69 aminokwasów N-terminalnych apoptyny i nie apoptotycznego białka GFP, nie powoduje indukcji apoptozy, co jest zgodne z faktem, że to chimeryczne białko nie wchodzi do jądra (Noteborn i Pietersen, 1998). Obecnie połączyliśmy kowalentnie 8 aminokwasów NLS z końcem N fragmentu apoptyny, składającym się z aminokwasów 1-69 (NLS-apoptyna/1-69). Transfekcja zarówno nie transformowanych komórek VH10 jak i rakotwórczych komórek człowieka (takich jak ludzkie komórki Saos-2 pochodzące od kostniakomięsaka) plazmidem, kodującym NLS-apoptynę/1-69 powodowało lokalizację jądrową NLS-apoptyny/1-69 po czym indukcję apoptozy.

Dane te wskazują, że poza C-terminalną częścią apoptyny, indukuje także część N-terminalna (a.a.1-69), jeśli jest przeniesiona do jądra. W tych doświadczeniach, jak oczekiwano, NLS-GFP przeniesiono do jądra lecz nie spowodowało do indukcji apoptozy.

Normalne komórki diploidalne od osób skłonnych do raka przechodzą apoptozę indukowaną apoptyną, w następstwie napromieniowania UV.

Zbadaliśmy także wpływ napromieniowania UV na indukcję apoptozy przez apoptynę, w komórkach diploidalnych. Diploidalne fibroblasty pochodz ące od zdrowych osób (VH25) lub od osobników z zespołem skłonności do raka (komórki LF2675T od pacjenta z zespołem Li Fraumeni, oraz komórek 401 od pacjenta z zespołem Lyncha typu 2) transfekowano krótkotrwale plazmidem, kodującym apoptynę. Przed transfekcją, część komórek napromieniowano UV. Jako kontrolę ujemną, komórki transfekowano plazmidem, kodującym białko desminę.

Wszystkie 3 typy komórek, VH25, LF2675T i 401 nie ujawniły apoptozy indukowanej apoptyną bez napromieniowania UV. Jednak w połączeniu z napromieniowaniem UV komórki LF2675T i 401, ale nie komórki VH25, bardzo szybko uległ y apoptozie indukowanej apoptyną . Mimo, ż e nie mieliśmy wytłumaczenia dla tego zjawiska, okazało się, że jest ono skorelowane z inną właściwością komórkową. Komórki diploidalne od pacjentów, którzy są skłonni do raka z powodu mutacji linii zarodkowej w genie supresorowym wobec nowotworu, wykazują nieoczekiwaną reakcję na napromieniowanie UV. Gdy normalne fibroblasty diploidalne traktuje się UV lub innym czynnikiem uszkadzającym DNA, reagują oni ogromną ilością różnych krótkotrwałych odpowiedzi, łącznie z aktywacją szlaków przenoszenia sygnał ów, indukcją ekspresji róż nych genów, inhibicją replikacji DNA w komórce i aktywacją zjawisk podobnych do SOS, tak jak wzmożona reaktywacja (ER) oraz wzmożona mutageneza (EM). Abrahams i in., (1996) odkrył, że normalne diploidalne fibroblasty od pacjentów z dziedziczną predyspozycją do raka z powodu mutacji w linii zarodkowej genu supresorowego wobec nowotworu, wykazują takie same odpowiedzi na napromieniowanie UV jak komórki od normalnych osobników, z wyjątkiem jednej odpowiedzi: wzmożonej reaktywacji. Odpowiedź ER w komórkach od tych pacjentów jest znacznie wyższa niż w komórkach od normalnych osobników, stąd komórki tych pacjentów nazywa się ERsuper (+). Molekularno-biologiczna podstawa zjawiska ER jest wciąż niejasna. Wykrycie ER jest podejściem czasochłonnym, jako że opiera się na pomiarze (wzmożonego) przeżycia wirusa napromieniowanego UV w komórkach uszkodzonych przez UV (lub uszkodzonych przez promienie rentgenowskie), w porównaniu z przeż yciem komórek nie uszkodzonych. Test w oparciu o apoptozę indukowaną przez apoptynę w warunkach napromieniowania UV jest znacznie prostszy i szybszy (patrz poniżej). Fakt, że apoptyna uaktywnia się w komórkach skłonnych do raka przy napromieniowaniu UV umożliwia także zbadanie procesu ER. Istnieje przesłanka do stwierdzenia, że ER odgrywa istotną rolę w procesie indukcji raka przez czynniki uszkadzające DNA.

Normalne diploidalne komórki od osobników skłonnych do raka ulegają apoptozie indukowanej apoptyną po traktowaniu promieniami rentgenowskimi.

Następnie, zbadaliśmy również wpływ traktowania promieniami rentgenowskimi na apoptozę indukowaną apoptyną w ludzkich komórkach diploidalnych. Diploidalne fibroblasty, pochodzące od zdrowych osobników (VH10) lub od osób z zespołem skłonności do raka, takie jak komórki LF2675T i 401 transfekowano plazmidem, koduj ącym apoptynę . Przed transfekcj ą , część komórek potraktowano promieniami Roentgena (dawka; kontrast 5). Jako kontrolę ujemną, komórki transfekowano plazmidem, kodującym białko desminę.

PL 196 605 B1

Jak oczekiwano, wszystkie analizowane nie napromieniowane komórki z linii komórkowych: VH10, LF2675T i 401 nie wykazywały apoptozy indukowanej apoptyną. Jednak w połączeniu z traktowaniem promieniami Roentgena, linie komórkowe pochodzące od osobników skłonnych do raka, uległy apoptozie, podczas gdy pochodzące od zdrowych osób, nie. Pięć dni po transfekcji, większość tych komórek skłonnych do raka, dodatnich pod względem apoptyny, traktowanych promieniami rentgenowskimi, stały się apoptotyczne. Komórki traktowane promieniami rentgenowskimi i wykazujące ekspresję czynniki nie apoptotycznego - desminy, nie uległy apoptozie indukowanej apoptyną.

Wyniki te implikują, że w wyniku traktowania promieniami rentgenowskimi, powodującymi uszkodzenie DNA, tak jak wyżej opisane traktowanie UV-C, następuje indukcja apoptozy przez apoptynę w normalnych nie transformowanych komórkach człowieka.

Test diagnostyczny pod względem genów indukujących raka w oparciu o apoptozę indukowaną apoptyną.

Danen-van Oorschot i in., (1997a) doniósł, że lokalizacja komórkowa apoptyny jest inna w ludzkich komórkach rakotwórczych/transformowanych w porównaniu z lokalizacją w normalnych komórkach nie transformowanych. Ponadto, akumulacja apoptyny w jądrze koreluje z indukcją apoptozy, podczas gdy lokalizacja cytoplazmatyczna koreluje z żywotnością komórki i normalną zdolnością proliferacyjną.

W oparciu o niniejszy opis, jesteś my w stanie zaprojektować test diagnostyczny do identyfikacji czynników lub genów indukujących raka i/lub transformujących. Pierwszy rodzaj testu składa się z transfekcji „normalnych komórek, np. pochodzenia ludzkiego albo od gryzoni, plazmidem, kodują cym apoptynę, albo zakażenia komórek wektorami wirusowymi, wykazującymi ekspresję apoptyny, razem z plazmidem, kodującym przypuszczalnie gen transformujący/indukujący raka. Następnie, komórki zostaną zbadane, (1) pod względem zdolności do ulegania apoptozie przez gen apoptyny oraz (2) pod względem przesunięcia lokalizacji apoptyny z cytoplazmy do jądra.

Lokalizację wewnątrzkomórkową apoptyny można określić stosując test immunofluorescencyjny z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi wobec apoptyny, takimi jak CVI-CAV-85.1. Jeśli procent apoptozy w komórkach normalnych wykazujących koekspresję apoptyny i przypuszczalnego genu transformującego/indukującego raka jest istotnie wyższy niż w komórkach kontrolnych dodatnich pod względem apoptyny, wykazujących ekspresję plazmidu kontrolnego, można wywnioskować, że analizowany gen może w rzeczywistości posiadać aktywność transformującą/indukującą raka.

Drugi przykład testu diagnostycznego opiera się o traktowanie hodowanych normalnych komórek diploidalnych czynnikiem przypuszczalnie rakotwórczym. Czynnik ten można dodawać, np. do pożywki hodowlanej przez różną długość czasu. Następnie, komórki transfekuje się plazmidem, kodującym apoptynę lub zakaża wektorem wirusowym, wykazującym ekspresję apoptyny. Podejście to można także przeprowadzić najpierw transfekując/zakażając komórki normalne, a potem traktując komórki testowanym czynnikiem. Kolejne etapy testu są takie same jak opisano dla pierwszego rodzaju testu diagnostycznego.

Test diagnostyczny pod względem skłonności do raka

Dane przedstawione w tym opisie pozwalają nam na zaprojektowanie testu, do oznaczania, czy osobnik o nieznanym tle komórkowym/genetycznym, ma skłonność do raka w porównaniu z normalną, zdrową osobą. Normalne komórki diploidalne od osobnika ze skłonnością do raka są niewrażliwe na apoptozę indukowaną apoptyną, lecz stają się takie po potraktowaniu promieniami UV lub rentgenowskimi lub innym czynnikiem uszkadzającym DNA. Poniżej, opisuje się przykład takiego testu diagnostycznego na podstawie wpływu napromieniowania UV. Test ten można także przeprowadzić z uż yciem innych czynników mutagenicznych/rakotwórczych.

Pierwotne normalne komórki diploidalne izoluje się z biopsji skóry testowanego osobnika i hoduje w odpowiedniej poż ywce. Następnie, komórki te napromieniowuje się UV i kolejno transfekuje plazmidem, kodującym apoptynę, albo zakaża wektorem wirusowym, wykazującym ekspresję apoptyny, albo komórki najpierw transfekuje się/zakaża, a potem napromieniowuje. Równolegle stosuje się komórki od zdrowego osobnika, będące kontrolą.

Stosując test immunofluorescencji pośredniej w oparciu o Mab specyficzne wobec apoptyny, komórki analizuje się pod względem obecności apoptyny w jądrze i/lub pod względem zachodzącej apoptozy. Jeśli procent komórek, ulegających apoptozie wśród komórek traktowanych UV dodatnich pod względem apoptyny jest znacznie wyższy od procentu apoptozy w komórkach traktowanych UV

PL 196 605 B1 od osobników normalnych, będzie to silna przesłanka, że osobnik, od którego wyizolowano komórki, będzie skłonny do raka.

Zastosowanie białek apoptyny w preparatach farmaceutycznych do terapii przeciwnowotworowej.

Na podstawie wyżej wspomnianych wyników można również zaprojektować sposoby zastosowania apoptyny w terapii przeciwnowotworowej, nie w postaci genu (DNA) lecz w postaci białka. Apoptyna jest porównywalnie małym białkiem, co ułatwia wprowadzenie go do komórek w postaci białka. (Jeśli fragmenty białka apoptyny wciąż będą posiadać żądany wpływ apoptotyczny na komórki rakowe, będziemy stosować fragmenty białka zamiast nieuszkodzonego białka). Naszym celem jest zaplanowanie skutecznych preparatów farmaceutycznych, które zapewniają stabilność składnika aktywnego (= apoptyny lub jej fragmentu) oraz, jeśli możliwe, specyficzność wobec komórki nowotworowej, będącej celem.

Nowotwory, które mamy nadzieję leczyć odpowiednimi preparatami, zawierającymi apoptynę, zarówno lecząc jak i zapobiegając, obejmują: dziedziczne postacie raka okrężnicy i odbytnicy (rodzinna polipowatość gruczolakowata (APC) i dziedziczny rak okrężnicy i odbytnicy nie polipowaty (HNPCC), rak wątroby (lub innych narządów, które można leczyć technikami perfuzji), białaczki i chł oniaki (do leczenia poprzez krążenie krwi), nowotwory skóry i prawdopodobnie nowotwory pł uc (poprzez drogi oddechowe).

Konstruowanie i analiza plazmidu ekspresji w celu utworzenia transgenicznej myszy apoptynowej.

Fakt, że zaobserwowaliśmy obecnie, że apoptyna nie może indukować apoptozy w hodowanych mysich fibroblastach zarodkowych, pozwala na wniosek, że apoptyna może także ulegać ekspresji w nieuszkodzonym zarodku i dorosłej myszy bez powodowania toksyczności, przynajmniej zarodkach w niezbyt wczesnym stadium rozwojowym. Wybraliśmy układ ekspresji w oparciu o jednostkę transkrypcji H-2Kb myszy, która pozwala na konstytutywną ekspresję obcych genów, podczas embriogenezy i dorosłych stadiach w różnych narządach (Drezen i in., 1992; Morello i in., 1986). Zatem, skonstruowaliśmy plazmid ekspresji p21EcoA-Vp3-Eco, który wykazuje ekspresję apoptyny regulowanej przez mysi promotor H-2Kb. Ponadto, wektor ekspresji zawiera inne elementy H-2Kb, które pozwolą na ekspresję genu apoptyny. Fig. 8 ukazuje schemat transgenicznego wektora ekspresji p21EcoA-Vp3-Eco.

Za pomocą krótkotrwałych transfekcji transformowanych komórek Saos-2 plazmidem p21EcoA-Vp3-Eco byliśmy w stanie dowieść, że apoptyna rzeczywiście mogła ulegać ekspresji w kontekście sekwencji H-2Kb. Ponadto, ekspresja apoptyny spowodowała również indukcję apoptozy o podobnej rozległości co ekspresja apoptyny za pomocą plazmidu pCMV-VP3 (patrz fig. 9).

Wyniki te implikują, że użyty wektor ekspresji p21EcoA-Vp3-Eco wykazuje ekspresję apoptyny w taki sposób, ż e transformowane komórki ulegają apoptozie.

Utworzenie transgenicznej myszy apoptynowej

Całość 300 zapłodnionych oocytów poddano mikroinjekcjom fragmentem DNA, obejmującym jednostkę transkrypcji H-2Kb oraz gen apoptyny, i przeniesiono do 11 myszy żywicielek. U wszystkich zebraliśmy potomstwo w liczbie 51 nowonarodzonych myszy.

Za pomocą analizy Southern-blot (Southern, 1975) mysiego DNA ogonowego trawionego BamHI lub Xbal, przy użyciu fragmentu DNA znakowanego 32P, składającego się z pełnego genu VP3, ukazano, że jednostka apoptyna/H-2Kb była zintegrowana wewnątrz genomowego DNA u wszystkich 7 myszy założycielskich (F0). Wszystkie transgeniczne myszy apoptynowe wyglądały zdrowo. Jedna z nieznanych powodów, 1 transgeniczna mysz apoptynowa padł a w wieku 5-6 tygodni. Transgeniczne myszy apoptynowe skojarzono z samcami lub samicami FVB. Ogonkowy DNA od potomstwa analizowano pod względem obecności genu apoptyny, przy uż yciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)-analizy stosujące primery P1 (5'-CTCTCCAACAACATACT-CCACCCGG-3') oraz P2 (CTTATACGCCTTTTT-GCGGTTCGGG-3'). Od wszystkich myszy F0 uzyskaliśmy 1 lub więcej transgenicznych myszy apoptynowych F1 (fig. 10).

Wszystkie myszy z pokolenia F1 transgenicznych zwierząt apoptynowych okazały się żywotne, i dotąd nie wykazują żadnych defektów patologicznych, które mogłyby korelować z ekspresją apoptyny.

Za pomocą analizy Nothern-blot (Noteborn i in., 1992) ekspresję genu apoptyny można było oznaczyć, jak oczekiwano, w różnych narządach.

Opis rysunków

Figura 1 ukazuje aktywność apoptozy indukowanej apoptyną w „normalnych fibroblastach zarodkowych gryzoni, przeciw komórkom transformowanych linii komórkowych gryzoni. Komórki krótko12

PL 196 605 B1 trwale transfekowano pCMV-VP3. Następnie komórki utrwalono przy kilku przedziałach czasowych po transfekcji i analizowano przez immunofluorescencję pośrednią z użyciem Mab 85.1 specyficznych wobec apoptyny. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, które zabarwiły się nienormalnie za pomocą DAPI, podano jako relatywny pomiar dla indukcji apoptozy.

Figura 2 ukazuje wpływ wielkiego antygenu T SV40 i/lub małego antygenu T na apoptozę indukowaną apoptyną w fibroblastach i keratynocytach od osobników normalnych. Komórki VH10 i FSK-1 krótkotrwale transfekowano plazmidem pCMV-VP3 i pCMV-neo lub pSV40, wykazującym ekspresję wielkiego antygenu T SV40 i małego antygenu T, pR-s884, wykazującym ekspresję wielkiego antygenu T SV40, oraz pR-SVt, wykazującym ekspresję małego antygenu T SV40. Następnie komórki utrwalono kilka przedziałów czasowych po transfekcji i analizowano przez immunofluorescencję pośrednią z uż yciem Mab 85.1 specyficznych wobec apoptyny. Procent komórek dodatnich pod wzglę dem apoptyny, które zabarwiły się nienormalnie za pomocą DAPI, podano jako relatywny pomiar dla indukcji apoptozy.

Figura 3 ukazuje położenie apoptyny w normalnych ludzkich komórkach diploidalnych, wykazujących ekspresję tylko apoptyny lub razem z wielkim antygenem T SV40 i/lub małym antygenem T. Te same komórki analizowane w fig. 2, ze względu na indukcję apoptozy, zbadaliśmy także pod względem położenia apoptyny w jądrze lub cytoplazmie. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, zawierających apoptynę w jądrze i wciąż nie ulegające apoptozie, podano jako relatywny pomiar lokalizacji apoptyny w jądrze.

Figura 4 ukazuje wpływ wielkiego antygenu T SV40 i/lub małego antygenu T na apoptozę indukowaną apoptyną w fibroblastach myszy, które pochodzą od normalnej myszy p53 +/+ lub transgenicznej znokautowanej myszy p53 -/-. Komórki krótkotrwale transfekowano plazmidem pCMV-VP3, wykazującym ekspresję apoptyny i kontrolnego plazmidu pCMV-neo lub pSV40, wykazującym ekspresję wielkiego antygenu T SV40, pR-s884 wykazującym ekspresję wielkiego antygenu T SV40, oraz pR-SVt, wykazującym ekspresję małego antygenu T SV40. Następnie komórki utrwalono kilka przedziałów czasowych po transfekcji i analizowano przez immunofluorescencję pośrednią z użyciem Mab 85.1 specyficznych wobec apoptyny. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, które zabarwiły się nienormalnie za pomocą DAPI, podano jako relatywny pomiar dla apoptozy.

Figura 5 ukazuje położenie apoptyny w mysich zarodkowych fibroblastach p53 +/+ lub p53 -/-, wykazujących ekspresję jedynie apoptyny albo razem z wielkim antygenem T SV40 lub małym antygenem T. Te same komórki, które analizowano w fig. 4 pod względem indukcji apoptozy, zbadano obecnie pod względem położenia apoptyny w jądrze lub cytoplazmie. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, zawierających apoptynę w jądrze i wciąż apoptotycznych, podano jako relatywny pomiar lokalizacji apoptyny w jądrze.

Figura 6 ukazuje wpływ wielkiego antygenu T SV40 i/lub małego antygenu T na aktywność apoptozy indukowaną apoptyną w „normalnych diploidalnych fibroblastach człowieka 9605 lub G4905 pochodzących od osobników skłonnych do raka. Komórki krótkotrwale transfekowano pCMV-VP3, pCMV-neo lub pSV40, wykazującym ekspresję zarówno wielkiego antygenu T SV40 jak i małego antygenu T, pR-s884 wykazującym ekspresję wielkiego antygenu T SV40, oraz pR-SVt, wykazującym ekspresję małego antygenu T SV40. Następnie komórki utrwalono kilka przedziałów czasowych po transfekcji i analizowano przez immunofluorescencję pośrednią z użyciem Mab 85.1 specyficznych wobec apoptyny. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, które zabarwiły się nienormalnie za pomocą DAPI, podano jako relatywny pomiar dla apoptozy.

Figura 7 ukazuje wpływ napromieniowania UV na apoptozę indukowaną apoptyną w „normalnych” diploidalnych fibroblastach pochodzących od normalnych zdrowych osobników, przeciw pacjentom ze skłonnością do raka. Komórki traktowano pozornie lub traktowano światłem UV, a nastę pnie krótkotrwale transfekowano pCMV-VP3 lub pCMV- des. Ostatecznie, komórki utrwalono w róż nych przedziałach czasowych po transfekcji i analizowano przez immunofluorescencję pośrednią z uż yciem Mab 85.1 specyficznych wobec apoptyny. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, które zabarwiły się nienormalnie za pomocą DAPI, podano jako relatywny pomiar dla apoptozy.

Figura 8 ukazuje schematyczne przedstawienie transgenicznego apoptynowego wektora ekspresji.

Figura 9 ukazuje aktywność apoptozy indukowanej apoptyną w komórkach Saos-2. Komórki krótkotrwale transfekowano p21EcoA-Vp3-Eco, pCMV-VP3 (oba z ekspresją apoptyny) lub pCMV-des, wykazującym ekspresję nie apoptotycznego białka desminy. Następnie komórki utrwalono w różnych

PL 196 605 B1 przedziałach czasowych po transfekcji i analizowano przez immunofluorescencję pośrednią z użyciem Mab 85.1 specyficznych wobec apoptyny. Procent komórek dodatnich pod względem apoptyny, które zabarwiły się nienormalnie za pomocą DAPI, podano jako relatywny pomiar dla indukcji apoptozy.

Figura 10

Schematyczne przedstawienie rodowodu myszy VP3(apoptynowej)-transgenicznej. Białe kwadraty oznaczają myszy założycielskie. Żółte i zielone kwadraty reprezentują potomstwo (f1) różnych apoptynowych-transgenicznych założycieli.

Odniesienia

1. Abrahams, P.J., Huitema, B.A., i Van der Eb, A.J. (1984). Enhanced reactivation and enhanced mutagenesis of herpes simplex wirus in normal and xeroderma pigmentosum cells. Molecular Cellular Biology 4, 2341-2346.

Abrahams, P.J., Houweling, A., i Van der Eb, A.J. (1992) High levels of enhaced reactivation of Herpes simplex wirus in skin fibroblasts from various hereditary cancerprone syndromes. Cancer Research 52, 53-57.

2. Abrahams, P.J., Houweling, A., Cornelissen-Steijger, P.D.M., Arwert, F., Menko, F.H., Pinedo, H.M., Terleth, C., i Van der Eb, A.J. (1996) Inheritance of Abnormal Expression of SOS-like Response in Xeroderma Pigmentosum and Hereditary Cancer-prone Syndromes. Cancer Research 56, 2621-2625.

3. Bellamy, C.OC., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., i Wyllie, H (1995). Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12.

4. Brinster, R.L., Chen, H.Y., i Trumbauer, M.E. (1981). Mouse oocytes transcribe injected Xenopus 5S RNA gene. Science 211, 396-398.

5. Danen-van Oorschot, A.A.A.M. Fischer, D., Grimbergen, J.M., Klein, B., Zhuang, S.-M., Falkenberg, J.H.F., Backendorf, C., Quax, P.H.A., Van der Eb, A. J. i Notebrorn, M.H.M. (1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: 94, 5843-5847.

6. Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Den Hollander, A., Takayama, S., Reed, J., Van der Eb, A.J. i Notebrorn, M.H.M. (1997). BAG-1 inhibits p53-induced but not apoptininduced apoptosis. Apoptosis, In Press.

7. Dinsart, C., Cornelis, J.J., Klein, B., Van der Eb, A. J. i Rommelaere, J., (1984). Transfection with extracellularly UV-damaged DNA induces human and rat cells to express a mutator phetotype towards parvovirus H-1. Molecular Cellular Biology 4, 324.

8. Drezen, J.M., Nouvel, P., Babinet, C., i Morello, D. (1992). Diffrent regulation of class I gene expression in the adult mouse and during development. The A Journal of Immunology 149, 429-437.

9. De Ronde, A., i in., (1989). The SV40 smali t antigen is essential for the morphological transformation of human fibroblasts. Virology 171, 260-263.

10. Duke, R.C., Ocjius, D.M., Young, J., D-E.(1996). Cell suicide in health and disease. Scientific American December 1996, 48-55.

11. Earnshaw, W.C., 1995. Nuclear changes in apoptosis. Current Opinion in Cell Biology 7, 337-343.

12. Fischer, D.F., Gibbs, S., Van den Putte, P., i Backendorf, C. (1996). Independent transcription control elements regulate the exspression of the SPRR2A gene during keratinocyte terminal differentiation. Molecular and Cellular Biology 16, 5365-53-74.

13. Graham, F.L. i Van der Eb, A. J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenowirus 5 DNA. Wirology 52, 456-467.

14. Gruis, N.A. i in., (1995). Homozygotes for CDKN2 (p16) germline mutation in Dutch familial melanoma kindreds. Nature Genetics, 10: 351-353, 1995.

15. Hockenberry, D.M.(1994). Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55.

16. Jacks, T. Lessons from the p53 mutant mouse (1996). Journal of Cancer Research and Clininal Oncology 122, 19-27.

17. Jacks, T. (1994). Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Current Biology 4, 1-7.

18. Kerr, J.F.R., Winterford, C.M., i Harmon, B.V. (1994). Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73, 2013-2026.

PL 196 605 B1

19. Klein, B., Pastink, A., Odijk, H., Westerveld, A., i Van der Eb, A. J. (1990). Transformation and immortalization of diploid Xeroderma pigmentosum fibroblasts. Experimental Cellular Research 191, 256-262.

20. Levine, A. J. (1997). P53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88, 323-331.

21. Lowe, S.W. i in.(1994). Abrogation of oncogene-associated apoptosis allows transformation of p53-dificient cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 2026-2030.

22. Maniatis, T., Fritsch, E.F., i Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, Nowy Jork, USA.

23. McBurney, M.W. i in. (1982). Isolation of male murine embryonal carcinoma cells and their chromosome replicationpatterns. Developments in Biology 89, 503-508.

24. McDonell, T.J., Meyn, R.E., Robertson, L.E. (1995). Implications of apoptotic celi death regulation in cancer therapy. Seminars in Cancer Biology 6, 53-60.

25. Menke, A.L., Shvarts, A., Riteco, N., VanHam, R.C.A., Van der Eb, A.J., i Jochemsen, A.G. (1997). Wilm's Tumor 1 (WT1) splice variants lacking the KTS induce apoptosis in p53-negative and p53-positive HepG2 cells. Cancer Research 57, 1353-1363.

26. Mellor, A.L., Golden, L., Weiss, E., Bullman, H., Hurst, Simpson, E., James, R.F., Townsend, A.R., Taylor, P.M., Schmidt, W., Ferluga, J., Leben, L., Snatamaria, M., Atfield, G., Festenstein, H., Flavell, R.A. (1992). Expression of murine H-2Kb histokompatibility antigen in cells transformed with kloned H-2 genes. Nature 298, 529-534.

27. Morello, D., Moore, G., Salmon, A.M., Yaniv, M., i Babinet, C. (1986). Studies on the expression of an H-2K/human growth hormone fusion gene in giant transgenic mice. The EMBO Journal 5, 1877-1883.

28. Noteborn, M.H.M. i Pietersen, A.M. (1998). Zgłoszenie PCT 98/00213 zatytułowane Adenowirus vector.

29. Noteborn, M.H.M. (1996). Zgłoszenie PCT WO 96/41191. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of an anti-tumor therapy.

30. Noteborn and De Boer, G.F. (1996) Patent USA/no. 030, 335.

31. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, O., Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. Journal of Virology 65, 3131-3139.

32. Noteborn, M.H.M., Hoeben, R.C., and Pietersen, A. (1997). A gene delivery vehicle expressing the apoptosis inducing proteins VP2 and/or apoptin. European Patent Application no. 97201121.7.

33. Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, C.A.J., De Gauw, H.W.F.M., Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A. J., McNulty, M.S., Van der Eb, A.J., and Koch, G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. Journal of Virology 68, 346-351.

34. Noteborn, M.H.M., Kranenburg, O., Zantema, A., Koch, G., De Boer, G.F, and Van der Eb., A.J. (1992). Transcription of the chicken anemia virus (CAV) genome and synthesis of its 52-kDa protein. Gene 118, 267-271.

35. Paulovich, A.G., Toczyski, D., Hartwell, H. (1997). When checkpoints fail. Cell 88, 315-321.

36. Philips, B., and Rundell, K. (1988). Failure of semian virus 40 small t antigen to disorganize actin cables in nonpermissive cell lines. Journal of Virology 62, 768-775.

37. Pines, J. (1995). GFP in mammalian cells. Trends in Genetics 11, 326-327.

38. Ponec, M., Kempenaar, J.A., and De Kloet, E.R. (1981). Corticoids and cultured human epidermal keratinocytes: specific intra-cellular binding and clinical efficacy. Journal Investmental Dermatology 76, 211-214.

39. Reinwald, J.G. and Green, H. (1975). Cell 6, 331-343.

40. Sachs, L. and Lotem, J. (1993). Control of programmed cell death in normal and leukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15-21.

41. Schrier, P.I., Bernards, R., Vaessen, R.T.M., J., Houweling, A. and Van der Eb, A.J. (1983). Expression of classl major histocompatibility antigens switched off by highly oncogenic adenovirus 12 in transformed rat cells. Nature, 305, 771-775.

PL 196 605 B1

42. Smits, P.H.M. et al. (1992). Modulation of the human papillomavirus type 16 induced transformation and transcription by deletion of loci on the short arm of human chromosome 11 can be mimicked by SV40 small t. Virology 190, 40-44.

43. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98, 503-517.

44. Srivastava, S., Zou. Z., et al. (1990). Germline transmission of a mutated p53 gene in a cancerprone family with Li-Fraumeni syndrome. Nature 348, 747-749.

45. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445-1449.

46. Telford, W.G., King, L.E., Fraker, P.J. (1992). Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by fIow cytometry. Cytometry 13, 137-143.

47. Teodoro, J.G. and Branton, P.E. (1997). Regulation of apoptosis by viral gene products. Journal of Virology 71, 1739-1746.

48. Thompson, C.B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267, 1456-1462.

49. Van den Heuvel, S.J.L., Van Laar, T., Kast, W.M., Melief, C.J., Zantema, A., and Van der Eb, A.J. (1990). Association between the cellular p53 and the adenovirus 5 E1B-55kD proteins reduces the oncogenicity of Ad-transformed cells. EMBO Journal 9, 2621-2629.

50. Van Laar T., Steegenga wt et al. (1994). Bloom's Syndrome cells GM1492 lack detectable p53 protein but exhibit normal G1 cell-cycle arrest after UV irradiation. Oncogene.9: 981-983

51. White, E. (1996). Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and development 10, 1-15.

52. Wyllie, A.H. (1995). The genetic regulation of apoptosis. Current Opinion in Genetics and Development 5, 97104.

53. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.R., Currie, A.R. (1980). Cell death: The significance of apoptosis. International Review of Cytology 68, 251-306.

54. Zhuang, S.-M., Landegent, J.E., Verschueren, C.A.J., Falkenburg, J.H.F., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein encoded by chicken anemia virus, induces cell death in various human hematologic malignant cells in vitro. Leukemia 9 S1, 118-120.

55. Zhuang, S.-M., Shvarts, A., Van Ormondt, H., Jochemsen, A.-G., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus, induces a p53 independent apoptosis in human osteosarcoma cells. Cancer Research 55, 486-489.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób oznaczania zdolnoś ci transformują cej ewentualnego czynnika transformują cego, znamienny tym, że dostarcza się normalną diploidalną komórkę ssaczą z indukowalną aktywnością apoptotyczną apoptyny, dokonuje się ekspozycji tej komórki na czynnik transformujący i oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej wewnątrz komórki lub oznacza się indukcję apoptozy w wymienionej komórce, przy czym apoptyczna aktywność apoptyny jest dostarczana w plazmidzie kodującym apoptynę lub wirusowym wektorze z ekspresją apoptyny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność apoptotyczną zapewnia się przez transdukcję komórki cząsteczką rekombinowanego kwasu nukleinowego, kodującego wspomnianą aktywność.
3. 3. Sposób wedł ug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ż e ewentualnym czynnikiem transformują cym jest substancja białkopodobna.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że substancja biał kopodobna ulega koekspresji w nie transformowanej komórce z aktywnością apoptotyczną .
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wymienioną substancją białkopodobną jest wielki antygen T SV40 lub jego funkcjonalny równoważnik.
6. 6. Sposób oznaczania predyspozycji do przekształ cenia się w komórkę nowotworową normalnej diploidalnej komórki ssaczej, znamienny tym, że dostarcza się wspomnianą komórkę z indukowalną aktywnością apoptotyczną apoptyny i poddaje się tą komórkę relatywnie łagodnej aktywności rakotwórczej oraz oznacza się apoptozę w wymienionej komórce i/lub oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej w tej komórce, przy czym apoptyczna aktywność apoptyny dostarcza się w plazmidzie kodującym apoptynę lub wirusowym wektorze z ekspresją apoptyny.

   PL 196 605 B1
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że łagodną aktywnoś cią rakotwórczą jest napromieniowanie UV.
8. 8. Sposób oznaczania predyspozycji do dziedzicznych rodzajów raka u ssaka, znamienny tym, że dostarcza się próbkę istotnego podzbioru normalnych diploidalnych komórek tego ssaka z indukowalną apoptotyczną aktywnością i poddaje się wspomniane komórki relatywnie łagodnej aktywności rakotwórczej oraz oznacza się apoptozę w komórkach i/lub oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej w tych komórkach, przy czym indukowalną aktywność apoptotyczną dostarcza się przez apoptynę lub pochodną i/lub jej fragment.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że łagodną aktywnoś cią rakotwórczą jest napromieniowanie UV.
10. 10. Sposób oznaczania mutacji genu, mającego aktywność onkogeniczną i/lub transformującą w normalnej diploidalnej komórce ssaczej, znamienny tym, że dostarcza się wspomnianą komórkę z indukowalną aktywnoś cią apoptotyczną i poddaje się komórkę relatywnie ł agodnej aktywnoś ci rakotwórczej oraz oznacza się apoptozę w wymienionej komórce i/lub oznacza się lokalizację aktywności apoptotycznej w tej komórce, przy czym indukowalną aktywność apoptotyczną dostarcza się przez apoptynę i/lub jej fragment.
11. 11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że łagodną aktywnością rakotwórczą jest napromieniowanie UV.
12. 12. Diagnostyczny zestaw testowy, znamienny tym, że zawiera kodujący apoptynę kwas nukleinowy, zdolny do transdukcji komórki eukariotycznej i zdolny do ekspresji w takiej komórce i ponadto środki do poddawania komórki łagodnej aktywności rakotwórczej.