CZ20004858A3 - Sloučeniny získané z druhu Salvia mající protivirový účinek - Google Patents

Sloučeniny získané z druhu Salvia mající protivirový účinek Download PDF

Info

Publication number
CZ20004858A3
CZ20004858A3 CZ20004858A CZ20004858A CZ20004858A3 CZ 20004858 A3 CZ20004858 A3 CZ 20004858A3 CZ 20004858 A CZ20004858 A CZ 20004858A CZ 20004858 A CZ20004858 A CZ 20004858A CZ 20004858 A3 CZ20004858 A3 CZ 20004858A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bond
acid
conjugation product
virus
hydroxyl group
Prior art date
Application number
CZ20004858A
Other languages
English (en)
Inventor
Myum K. Han
Paul Lee
Original Assignee
Georgetown University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Georgetown University filed Critical Georgetown University
Publication of CZ20004858A3 publication Critical patent/CZ20004858A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F246/00—Copolymers in which the nature of only the monomers in minority is defined
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

Sloučeniny získané z druhu Salvia mající protivirový účinek
Oblast techniky
Tento vynález se týká účinných složek obdržených z extraktů rostliny rodu Salvia. Tyto aktivní složky zahrnují konjugáty molekul mající alespoň jeden zbytek kyseliny β-(3,4-dihydroxyfenyl)mléčné a/nebo kyseliny kofeinové. Tyto účinné složky jsou přednostně kyselina salvianolová, její dimery, trimery a tetramery. Tyto účinné složky, bud' samotné nebo přednostněji v kombinaci, lze podávat některému subjektu pro léčení virové infekce nebo stavu způsobeného viry.
Dosavadní stav techniky
Salvia miltiorrhiza
Rostlina Salvia miltiorrhiza (SM) se dlouhou dobu používá v tradiční čínském lékařství pro léčení kardiovaskulárních a jaterních onemocnění. Extrakty z rostliny poskytují vysoce účinné hepatoprotektivní působení in vitro i in vivo [Hase a kol., Planta Med., 63, 22-26 (1997)]. Jednou z hlavních účinných složek SM chránících játra může být magnesiumlithospermat B [Liu a kol., Chung Kuo Chung Hsi I Chih Ho Tsa Chih, 11, 352-353, 326 (1993)]. SM též obsahuje antioxidanty, které při léčení virové myokarditidy zřejmě pomáhaj í při obnově poškozených membrán [Meng a kol., Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 12, 345-347, 324-325 (1992)]. Pacienti, kteří trpí chronickou hepatitidou B, vykazují odpověď na léčení SM a/nebo polysacharidem Polyporus umbellatus (PUP) [Xiong, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 11, 33-35, 516-517 (1993)]. Bylinné extrakty z SM též prokazují účinnost proti virům HIV (US patent č. 5 178 865)
a účinnost proti hepatitidě (mezinárodní patentová přihláška PCT 98/24460, čínská patentová přihláška č. 1 192 922 a 1 192 918). Popisují se protivirové prostředky aktivní proti herpes, poliomyelitis, spalničkám, varicella zoster, cytomegaloviru, DNA-virům a RNA-virům, které obsahují alespoň jedno surové léčivo z kořenů Salvia miltiorrhiza Bunge (evropský patent č. 568 001). Připravují se též extrakty Salvia jako prostředky proti herpetickým virům (US patent č. 5 411 733) .
Rostlina SM má několik složek, které lze extrahovat. Složky z kořenů se nejprve extrahovaly ethanolem s následnou extrakcí chladnou vodou [SM(1)] nebo horkou vodou [(SM(2)]. Obě frakce extrahované ve vodě vykazují protivirovou aktivitu.
Vyvíjejí se protivirové prostředky, jejichž cílem jsou různá místa cyklu života virů. Například jsou známy antivirové prostředky pro léčení retrovirových infekcí, které působí na specifické enzymy retorvirů, jako je reverzní transkriptasa (RT) a integrasa. Výzkum pokračuje identifikací dalších protivirových prostředků pro boj s chorobami, jako je herpes, hepatitis a chřipka.
Protivirové prostředky proti retrovirům
Protivirové prostředky cílící na integrasový protein zahrnují peptidové inhibitory (US patent č. 5 578 573), inhibitory ligandu nukleových kyselin (US patent č. 5 756 287 a- 5 587 468) , stejně tak jako sloučeniny, jako je Equisetin (US patent č. 5 759 842) a ermofilanové seskviterpenoidy (US patent č. 5 858 738). V současné době z řady sloučenin identifikovaných a schválených Úřadem pro potraviny a léky (FDA) • · ······ · · · ···· · · · · · ·· • · · · · ··· • ····♦ · · · · • ♦ · · · · * · ··· ··· ·· · ·· ··· pro distribuci patří mezi sloučeniny schválené proti HIV pouze inhibitory reversní transkriptasy a proteasy.
Kyselina kofeinová jako protivirovy prostředek
Kyselinu kofeinovou lze izolovat z kmenů Bougainvillea spectabillis Wild (Nyctaginaceae), která se používá v lidovém lékařství proti hepatitidě [Chang a kol., Anticancer Res.,14. 501-506 (1994)]. Uvádí se, že kyselina kofeinová inhibuje xantinoxidasu, která souvisí s několika chorobami, jako je například dna, hepatitida a tumory [Chán a kol., Anticancer Res., 15, 703-707 (1995) a Chang a kol. (1994)] . Oxidační produkt kyseliny kofeinové (KOP) inhibuje herpes virus hominis typu 1 a typu 2 [Thiel a kol., Acta Virol., 27, 200-208 (1983)] . Tetramer kyseliny kofeinové a dvojsodné a sodnodraselné soli glukosidu tetrameru kyseliny kofeinové vykazují aktivity proti virům HIV podle Kashiwady a kol., J. Nat. Prod., 58. 392-400 (1995). Komerčně připravovaná kyselina kofeinová má rovněž protivirovou účinnost, jak prokazuje zkouška reversní transkriptasy pro viry HIV [Kreis a kol., Antiviral Res., 14, 323-337 (1990)]. Feneylestery kyseliny kofeinové (CÁPE) vykazují inhibiční působení na integrasový protein HIV-1 [Fesen a kol., Proč. Nati. Acad.
Sci. USA, 90. 2399-2403 (1993), Fesen a kol., Biochem. Pharmacol., 48, 595-608 (1994), Burke a kol., J. Med. Chem., 38, 4171-4178 (1995), Mazumder a kol., J. Med. Chem., 39. 2472-2481 (1996)]. Avšak způsob používaný pro přípravu polymerů kyseliny kofeinové ovlivňuje jejich působení jako inhibitorů HIV-1 a HIV-2 [Nakashima a kol., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 40, 2102-2105 (1992)]. Kyselina kofeinová spolu s kyselinou skořicovou a kyselinou rosmarinovou se též navrhují proti viru chřipky díky jejich antioxidačnímu působení (mezinárodní patentová přihláška PCT 98/30228).
• · ··«· ·· • · · · · · • · ··· · · · ······ ·· · ··
Kyselina rosmarinová a lithospermová jako protivirové prostředky
Kyselina rosmarinová je dimerem kyseliny kofeinové. Dimer rosmarinové kyseliny je lithospermat B. Kyselina rosmarinová i kyselina lithospermová se identifikují v extraktech kořenů SM [Kohda a kol., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo),
37. 1287-1290 (1989)]. Kyselina rosmarinová vykazuje působení proti virům HIV [Arda a kol., J. Nat. Prod., 60. 1170-1173 (1997)] a je potenciálně inhibitorem virů typu Herpes simplex 1 (HSV-1) [Dimitrova a kol., Acta Microbiol. Bulg., 29, 65-72 (1993)]. Kyselina rosmarinová se též navrhuje pro léčení zánětlivých onemocnění a poruch (US patent č. 4 329 361).
Kyselina skořicová jako protivirový prostředek
Estery substituované kyseliny skořicové inhibují infekční působení viru chřipky A/Hong Kong (H3N2) [Serkedjieva a kol., J. Nat. Prod., 55, 294-302 (1992)]. Sterylové estery derivátů kyseliny skořicové prokazují antivirové působení in vitro proti virům z čeledí Picornaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae a Herpesviridae [Antiviral activity of cholesteryl esters of cinnamic acid derivatives, Z. Náturforsch, 53, 883-887 (1998) a Conti a kol., Antivir. Chem. Chemother., 1, 511-515 (1998)]. Popisují se též dehydrogenační polymery substituovaných kyselin skořicových jako léčiva proti HIV-1 (US patent č. 5 346 695 a 5 632 980).
Kyselina salvianolová
V literatuře se dosud nepopisují protivirové vlast5 nosti kyseliny salvianolové. Některé formy kyseliny salvianolové (například kyselina salvianolové A, kyselina acetylsalvianolová), se popisují jako antioxidační prostředky [Lin a kol., J. Biochem. Pharmacol., 51, 1237-1241 (1996)]. Kyselina salvianolové se též indikuje pro prevenci poškození jater a fibrosy v souvislosti s jejím antilipidovým peroxidačním působením [Hu a kol., Acta Pharmacol. Sin., 18, 478-480 (1997)] a pro použití při léčení koronárních onemocnění (japonský patent č. 2 131 423) . Další formy kyseliny salvianolové popisované v literatuře zahrnují ty, které se izolují z vodných extraktů Salvia cavaleriei (například kyseliny salvianolové A, B, C, H a I) [Zhang a kol., Planta Med., 60, 70-72 (1994)] nebo z S. miltiorrhiza (například kyselina salvianolové K, trimer kyseliny kofeinové) [Kasimu a kol., Chem. Pharm. Bull., 46, 500-504 (1998) a Tezuka a kol., Chem. Pharm. Bull., 46, 107-112 (1998)]. Salvianolové kyseliny F2 a F3 lze připravit synteticky, jak popisuje Dalla a kol., Tetrahedron, 55., 6923-6930 (1999) a Dalla a kol·., Tetrahedron Lett., 39, 8285-8286 (1998). Lze použít další členy čeledi Salvia jako zdroje pro obdržení Danshenu včetně S. bowleyana, S. deserta, S. miltiorhiza var. miltiorhiza f. alba, S. paramiltiorhiza, S. paramiltiorhiza f. purpureo-rubra, S. przewalskii, S. przewalskii var. mandarinorum, S. sinica f. purpurea a S. trijuga) (Kasiumu a kol., 1998) . Popisují se též způsoby pěstování rostlin se zvýšenými hladinami sekundárních metabolitů, jako je kyselina salvianolové [viz US patent č. 5 869 340 (1999)].
Kyselina (3,4-dihydroxyfenyl)mléčná
Základní složkou SM je Danšhensu, chemicky známý jako natrium-B-3,4-dihydroxyfenyllaktat [Fen a kol., Acta Acad. Med. Primae Shanghai, 10, 133-136 (1983), Zhao a kol.,
Chin. Pharm. J., 29, 291-293 (1994)]. Je meziproduktem při přípravě kyseliny rosmarinové v buněčné kultuře [Al-Sereiti a kol., Indián J. Exp. Biol., 32, 124-130 (1999), Bogucki a kol., Can. J. Chem., 75. 1783-1794 (1997) a US patent č. 5 011 775].
Léčení onemocnění způsobovaných viry antivirovými prostředky může být značně drahé. Například léčení HIV-1 inhibitory reversní transkriptasy a proteasy stojí zhruba 12 000 až 20 000 US dolarů na jednoho pacienta za rok. Při úvaze, že většina pacientů infikovaných HIV žije v rozvojových zemích, je třeba nalézt pro léčení HIV a dalších virových onemocnění další léčiva, která jsou ekonomicky přitažlivější. Tento náhlý vynález poskytuje nový způsob identifikace, přípravy a použití nových sloučenin a přípravků z těchto sloučenin pro použití jako antivirových léčivých látek.
Podstata vynálezu
Jeden aspekt tohoto vynálezu popisuje prostředky obsahující molekuly mající alespoň jeden zbytek kyseliny β-(3,4-dihydroxyfenyl)mléčné a/nebo kyseliny kofeinové, které se vyskytují v extraktech z rostlin rodu Salvia, obecných vzorců *
molekulová hmotnost těchto účinných prostředků je alespoň 190,
R1 zbytku kyseliny β-(3,4-dihydroxyfenyl)mléčné může být buď hydroxylová skupina, atom kyslíku nebo vazba a
R2 může být buď atom vodíku nebo vazba,
R3 zbytku kofeinové kyseliny může být buď hydroxylová skupina nebo atom kyslíku,
R4 může být buď vazba nebo skupina ve které R5 je hydroxylová Skupina nebo vazba,
Re může být buď atom vodíku nebo vazba a
R-7 může být buď atom vodíku nebo vazba.
V dalším ztělesnění se uvažuje produkt konjugace, který je homopolymerem nebo heteropolymerem monomerních jednotek kyseliny salvianolové a/nebo dehydrogenovaných forem kyseliny salvianolové, kde tento produkt konjugace má molekulovou hmotnost zhruba 492 nebo vyšší nebo jeho acetylové, esterové či anhydridové deriváty nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli. V jednom preferovaném ztělesnění je tímto konjugačním produktem homopolymer nebo heteropolymer monomerních jednotek kyseliny salvianolové I a/nebo dehydrogenovaných forem II nebo III kyseliny salvianolové, která má strukturu
a dehydrogenované formy kyseliny salvianolové mající strukturu
(II)
(III)
• • ·
• • • • • •
• • i • •
9 · • · • ·
ve které
Rx, R2, R3, R4, Rs a Rs jsou atomy vodíku nebo vazby a monomerní jednotky popisovaných homopolymerů či heteropolymerů se navzájem připojují prostřednictvím Rx, R2, R3, R4, R5 a R6
Tento vynález se též týká způsobu přípravy protivirového prostředku zahrnujícího inkubaci salvianolové kyseliny při alkalickém pH, takže se vytvářejí homopolymery či heteropolymery, které vykazují vyšší antivirovou účinnost než kyselina salvianolová.
Prostředky podle tohoto vynálezu vykazují antivirovou účinnost a mohou se podávat systémově nebo lokálně spolu s farmaceuticky přijatelnými nosnými látkami.
Přehled obrázků na výkresech
Obr.
1. Troj rozměrné znázornění sloučeniny příkladu
Obr.
2.
Troj rozměrné znázornění sloučeniny příkladu
Obr.
3.
Troj rozměrné znázornění sloučeniny příkladu
Obr.
4.
Troj rozměrné znázornění sloučeniny příkladu
Obr. 5. Trojrozměrné znázornění sloučeniny 9 příkladu
4.
4.
Obr. 6. Troj rozměrné znázornění sloučeniny 10 příkla-
du 4.
Obr. 7. Troj rozměrné znázornění sloučeniny 11 příkla-
du 4.
Obr. 8. Troj rozměrné znázornění sloučeniny 12 příkla-
du 4 .
Obr. 9. Troj rozměrné znázornění sloučeniny 13 příkla-
du 4 .
Obr. 10. Trojrozměrné znázornění sloučeniny 2 příkladu 4 získané dehydrogenací uhlíků 24 a 38 kyseliny salvianolové.
Obr. 11. Trojrozměrné znázornění sloučeniny 3 příkladu 4 získané dehydrogenací uhlíků 24 a 35 kyseliny salvianolové.
Obr. 12. Trojrozměrné znázornění sloučeniny 4 příkladu 4 získané dehydrogenací uhlíků 27 a 38 kyseliny salvianolové.
Obr. 13. Trojrozměrné znázornění sloučeniny 24 příkladu 4.
Následuje podrobný popis vynálezu.
Tento vynález používá alternativní přístup k vývoji léků odvozených od rostlinných extraktů, konkrétně od ex12 * · ······ ·· • · ·· · · · · · · • · · · s »· • ····· « · · • · · · · 9· ······ · t + ·«· traktů rostliny rodu Salvia. Tyto aktivní prostředky inhibují virovou integraci u řady různých virů včetně retrovirů.
V jednom preferovaném ztělesnění inhibují tyto účinné prostředky integraci celého virového genomu nebo jeho části do genomu hostitelské buňky. Tyto aktivní prostředky mohou též inhibovat virovou infekci, progresi virového onemocnění a/nebo proliferaci virů interferencí v jiných místech životního cyklu virů.
Rod Salvia (čeleď Lamiaceae) zahrnuje zhruba 700 druhů, které se vyskytuji v tropických a mírných pásmech světa, z toho 300 druhů v Asii, Evropě a Africe a 400 druhů v Americe [J. C. Willis, A Dictionary of Flowering Plants and Ferns, (7. vydání, University Press, Cambridge, 1966), J. Briquet, Labiatae, v: Die Naturlichen Pflanzenfamilien, díl IV, 3a, s. 183-378 (redakce Engler a Prantl, Englemann, Leipzig, 1897)]. Protivirové sloučeniny a prostředky podle tohoto vynálezu lze odvozovat od kteréhokoliv druhu rodu Salvia, avšak přednostně od SM a SY (S. miltiorrhiza a S. yunanensis).
A. Definice pojmů
Pojmy účinná množství pro inhibici virů, terapeuticky účinné množství nebo terapeuticky účinná dávka znamenají množství účinné složky nebo účinných složek, které při podání subjektu postiženému virovou infekcí či chorobou způsobenou viry zlepšují tuto infekci či onemocnění v rozsahu, který převažuje nad jakýmikoliv negativními vedlejšími účinky způsobovanými tímto prostředkem či prostředky. Tyto prostředky lze uvažovat jako protivirové prostředky.
Pojmy virový stav nebo stav způsobený virem zna menají fenotyp onemocnění spojeného s virovou infekcí. Například komplex onemocnění spojený s AID (ARC) je stav spojený s infekcí HIV-1.
Pojem protivirová účinnost znamená schopnost inhibovat či zlepšovat virovou infekci či stav spojený s virovou infekcí. Sloučeniny vykazující protivirovou účinnost podle tohoto vynálezu budou přednostně inhibovat infekci in vitro při dávkách s 1 μΜ nebo méně přednostně při dávkách menších nebo rovných zhruba 10 mM in vitro.
Pojem integrasová aktivita znamená integrasový protein nebo protein, který může integrovat virový genom či segment virového genomu do genomu hostitelské buňky. Většina integrasových proteinů souvisí s druhy virů čeledi Retroviridae.
Rostlina rodu Salvia znamená rostlinu z rodu Salvia, čeledi Lamiaceae. Preferované rostliny Salvia pro izolaci sloučenin podle tohoto vynálezu jsou Salvia miltiorrhiza neboli SM a Salvia yunanesis neboli SY.
Konjugované deriváty nebo větší polymery znamenají aktivní prostředky, které zahrnují dimer, trimer, tetramer atd., ve kterých monomerní jednotkou je jeden z následujících zbytků:
Konjugovanými deriváty velkých polymerů mohou být homodimery, homotrimery, homotetramery atd. nebo heterodimery, heterotrimery, heterotetramery atd. předchozích zbytků. Jedním příkladem konjugačního derivátu je lithospermat B, který je dimerem kyseliny rosmarinové, která je opět dimerem kyseliny kofeinové.
B. Viry
Léčení inhibice jakékoliv virové infekce citlivé na protivirové sloučeniny a prostředky, které se zde popisují, spadá do obsahu tohoto vynálezu. Preferují se viry následujících čeledí virů: hepatitis-viry, herpes-viry, orthomyxoviry, papillomaviry, paramyxoviry, picornaviry, polyomaviry a retroviry.
Retroviry
Sloučeniny a prostředky, které se zde popisují, se přednostně používají pro léčení retrovirových infekcí.
I když retroviry patří k jasně definovanému a relativně homogennímu virovému rodu, historicky se blíže rozdělují do tří taxonomických seskupení, především na základě patologických následků infekce. Skupina onkovirů zahrnuje retroviry, které j sou schopné způsobovat neoplastické onemocnění u infikovaného hostitele, stejně tak jako několik příbuzných dosud zdánlivě benigních virů. Lentiviry způsobují pomalé chronické onemocnění, které obecně, i když ne vždy, postrádá neoplastickou složku. Dosud je třeba objasnit spojitost lentivirů s jakýmkoliv lidským či zvířecím onemocněním.
Replikace retrovirů se zahajuje intracytoplasmatickým proniknutím jádra virionu, což je děj zprostředkovaný specifickou interakcí glykoproteinu virového obalu se specifickým receptorem povrchu buňky. Následkem toho RNA-dependentní DNA-polymerasa spojená s virionem převádí transkripci jednovláknového genomu RNA na provirový meziprodukt dvojvláknové lineární DNA (reversní transkripce). Integrační protein (integrasa) specificky rozpoznává oba konce virové DNA a odstraňuje dva nukleotidy od konců 3' (3’-donorové zpracování) . Zpracovaná virová DNA a integrasa potom migrují do jádra, kde se virová integrasa váže kovalentně na retrovirový genom k hostitelské chromozomové DNA (přenos vlákna), čímž se vytváří retrovirový provirus.
Objev viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) jako důležitého lidského patogenu zvyšuje vědecký zájem o retroviry. Průkazy zejména ukazují, že výše znázorněný jednoduchý životní cyklus nepopisuje plně replikační cyklus všech retrovirů. Například HIV-1 kóduje nejméně šest genových produktů navíc k charakteristickým retrovirovým Gag, Pol a Env. Ty se překládají z nového souboru jednoduše spojovaných a více16
násobně spojovaných typů virové mRNA. Alespoň dva z těchto přídavných proteinů označovaných Tat a Rev působí při translaci pro přímou regulaci exprese genu HIV-1. Proto kroky mezi penetrací a provirovou integrací MLV (viru myší leukémie) a HIV-1 vyhlížejí podobně, i když u druhého případu jsou postintegrační děje významně složitější. Nedávno se zjistilo, že HIV-1 je pouze jeden z celé skupiny zvířecích retrovirů, které se nyní uvažují jako komplexní retroviry. Retroviry, které patří k těmto komplexním retrovirům, zahrnují lentiviry, spumaviry, stejně tak jako HTLV-1 a příbuzné viry (tabulka 1).
Tabulka 1: Hlavní taxonomická rozdělení retrovirů
Kategorie Podskupina Prototyp Další příklady
Jednoduché retroviry typu C, RSV ALV, ASV
retroviry skupina A
retroviry typu C, MLV FeLV, MSV, SNV,
skupina B REV, SSV
retroviry typu B MMTV
retroviry typu D MPMV SRV-1
Komplexní lentiviry HIV-1 HIV-2, SIV
retroviry visna-virus, FIV
viry T-buněčné leu- HTLV-1 EIAV HTLV-II,
kémi e, spumavi ry STLV, BLV
HSRV SFV, BFV
Zkratky: RSV - virus Rousova sarkomu, ALV - virus ptačí leukémie, ASV - virus ptačího sarkomu, FeLV - virus leukémie koček, MSV - virus myšího sarkomu, SNV - virus nekrosy sle17 • · · · · · · ······ «· · · · · ziny, REV - virus retikuloendotheliosy, SSV - virus opičího sarkomu, MMTV - virus myšího tumoru mamy, MPMV
- Mason-Pfizerův opičí virus, SRV-1 - myší retrovirus typu 1, STLV - opičí virus T-buněčné leukémie, BFV - hovězí pěnivý virus.
Kroky při virové integraci se ukazují být zcela podobnými pro jednoduché i komplexní retroviry. Vzhledem k tomuto společnému mechanismu bude inhibitor retrovirové integrasy inhibovat široké rozmezí organismů, jako je virus lidské imunodeficience (HIV), virus opičí imunodeficience (SIV), virus kočičí imunodeficience (FIV), virus kočičí leukémie (FeLV), virus myší leukémie (MuLV), virus Rousova sarkomu (RSV), virus hovězí imunodeficience (BIV), virus lidské buněčné leukémie (HTLV). Navíc k těmto retrovirům lze použít účinné prostředky podle tohoto vynálezu jako inhibitory proti proteinům podobným integrase pro inhibici replikace jiných virů, jako je virus hepatitidy B (HBV).
Ostatní viry
Účinné prostředky, které se zde popisují, se též uvažují pro použití při léčení virových infekcí způsobovaných například viry hepatitidy, herpes-viry, orthomyxoviry, papillomaviry, paramyxoviry, picornaviry a polyomaviry. Preferované viry, které lze léčit účinnými prostředky, které se zde popisují, zahrnují druhy, které shrnuje tabulka 2.
Tabulka 2
Čeleď virů
Hepadnaviridae
Herpesviridae
Obecný název
Hostitelský živočich
Orthomyxovirinae
Papillomavirinae
Paramyxovirinae
virus hepatitidy B virus hepatitidy svišťů virus hepatitidy B kachen člověk svišť lesní ptáci
virus 1 herpex simplex člověk
virus 2 herpes simplex člověk
virus Variacella zoster člověk
Epsteinův-Barrův virus člověk
cytomegalovirus člověk
virus infekční bovinní
rhinotracheitidy savci
virus bovinní mammilliti-
dy savci
virus potratu koní savci
pseudorabies-virus savci
virus Marekovy choroby ptáci
herpes-virus krůt ptáci
virus chřipky typu A řada druhů
virus chřipky typu B hlavně člověk
virus chřipky typu C hlavně člověk
virus 1 bovinního pa-
pillomu (BPV-1) skot
virus 2 bovinního pa-
pillomu (BPV-2) skot
virus 4 bovinního pa-
pillomu (BPV-4) skot
CRPV králíci
DPV jeleni
virus 1 lidského pa-
pillomu (HPV-1) člověk
HPV-5 člověk
HPV-6 člověk
HPV-8 člověk
HPV-11 člověk
HPV-16 člověk
HPV-18 člověk
HPV-31 člověk
HPV-33 člověk
viry lidské chřipky
typy 1 až 4 člověk
SV5 pes
Čeleď virů
Obecný název
Hostitelský živočich
Picornavirinae
Polyomavirinae
virus příušnic člověk
virus Newcastleské
choroby kuřata
virus spalniček člověk
virus psinky pes
virus dobytčího moru skot
respirační sincyciální
virus (RSV) člověk
bovinní respirační
sincyciální virus skot
virus lidské polyomye-
litidy člověk
lidský koxsackievirus člověk
lidský echovirus člověk
lidský enterovirus člověk
virus lidské hepatitidy A člověk
porčinní enteroviry 1-11 vepř
bovinní enteroviry 1 a 2 skot
lidský rhinovirus 1-100 člověk
bovinní rhinoviry 1 a 2 skot
viry 1-7 encelophalomyo-
karditidy skot a člověk
koňské rhinoviry 1 a 2 kůň
polyomavirus myš
opičí vakuolační virus 40
(SV40) opice
lymfotropní papovavirus
(LPV) opice
BKV člověk
JCV člověk
vakuolační virus
králičích ledvin (RKV) králík
Viz Fundamental Virology (redakce Bernard N. Fields a kol.,
1991)
C. Způsoby přípravy sloučenin
Obecné podmínky pro přípravu rostlinných extraktů z jakýchkoliv druhů rodu Salvia a přednostně z druhů SM a SY, které obsahují účinné prostředky, se provádějí tak,
jak popisuje příklad 1 níže. Tyto sloučeniny lze připravit synteticky následujícím způsobem. Různé sloučeniny obsahující zbytky kyseliny β-(3,4-dihydroxyfenyl)mléčné nebo salvianolové a/nebo kyseliny kofeinové vznikají inkubací příslušných sloučenin při koncentraci 5 mg/ml v 0,1% roztoku hydroxidu amonného po dobu 24 h. Obsahují dehydrogenované formy kyseliny salvianolové, konjugované dimery a velké polymery. Preferovaná doba je 3 až 24 h. Inkubační doby delší než 48 h v 0,1% roztoku hydroxidu amonného mohou způsobit inaktivaci sloučeniny. Doba aktivace též závisí na výchozí koncentraci sloučeniny. Vyšší koncentrace sloučeniny požadují delší doby inkubace pro aktivaci. Tato tvorba může též nastávat úpravou pH sloučenin v roztoku na vyšší pH než 8 jinými alkalickými činidly. Reakce se zastaví přídavkem kyseliny, jako je 1% kyselina octová tak, že pH výsledného roztoku je á 7. Další faktory, které mohou přispívat k tvorbě nových sloučenin, jsou teplota a oxidace kyslíkem.
D. Farmaceutické prostředky a jejich podávání
Pro léčení či zmírňování virových infekcí se může sloučenina podle tohoto vynálezu podávat perorálně, lokálně, parenterálně, inhalačním sprejem nebo rektálně v dávkově jednotkových formulacích obsahujících konvenční netoxické farmaceuticky přijatelné nosné látky, adjuvantní prostředky a vehikula. Pojem parenterální”, jak se zde používá, zahrnuje subkutánní injekce, intravenózní, intramuskulární, intravaskulární injekce nebo infuzní způsoby. Navíc k léčení teplokrevných zvířat, jako jsou myši, krysy, koně, skot, ovce, psi, kočky atd. lze sloučeniny a prostředky, které se zde popisují, použít pro léčení virových infekcí lidí.
Pro podávání do centrální nervové soustavy se tyto přípravky mohou podávat do mozkomíšního moku. Pro intrathekální podávání jsou vhodné nosiče pro parenterální podávání, zejména nosiče, jako je glukosa ve vodě nebo fyziologickém roztoku. Tyto prostředky se též mohou připravovat v liposomech pro zvýšení přechodu membránovými bariérami. Prostředky lze připravovat pro transdermální podávání pomocí náplastí. Pro tento účel lze též používat rozpouštědla pro podávání hydrofobních sloučenin, jako je dimethylsulfoxid nebo oleje, která přecházejí kožní bariérou.
Pro parenterální podávání lze připravit roztoky léčivé látky podle tohoto vynálezu, například s použitím sezamového nebo podzemnicového oleje nebo vodného propylenglykolu. Je-li třeba, měly by se vodné roztoky vhodným způsobem pufrovat (přednostně pH vyšší než 8) a osmotický tlak kapalných zřeďovacích prostředků by se měl upravit na hodnotu isotonického roztoku. Takové vodné roztoky jsou vhodné pro účely intravenózní injekce. Olejové roztoky jsou vhodné pro intraartikulární, intramuskulární a subkutánní injekce. Příprava všech těchto roztoků za sterilních podmínek se snadno provádí standardními farmaceutickými způsoby, které jsou dobře známé tomu, kdo má zkušenost v oboru.
Farmaceutické prostředky obsahující účinnou složku mohou být ve formě vhodné pro perorální užívání, například jako tablety, pilulky, pastilky, vodné či olejové suspenze, dispergovatelné prášky či granule, emulze, tvrdé či měkké tobolky nebo sirupy či elixíry. Přípravky zamýšlené pro perorální užívání se mohou připravit kterýmkoliv známým způsobem pro přípravu farmaceutických prostředků a takové přípravky mohou obsahovat jeden či více prostředků zvolených ze skupiny zahrnující sladidla, aromatizační přísady, barviva a konzervační prostředky pro zajištění přijatelných příprav22 • · ···· · · • · · · · · • · · · · ků. Tablety mohou obsahovat účinnou složku ve směsi s netoxickými farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami, které jsou vhodné pro přípravu tablet.
Pro perorální podávání lze tablety obsahující různé pomocné látky, jako je mikrokrystalická celulosa, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dikalciumfosfat a glycin, použít spolu s různými rozvolňovadly, jako je škrob (přednostně kukuřičný, bramborový či tapiokokový škrob), kyselina alginová a určité komplexní silikáty spolu s granulačními pojivý, jako je polyvinylpyrrolidon, sacharosa, želatina a akaciová klovatina. Navíc lze pro účely tabletování používat maziva, jako je stearat hořečnatý, laurylsulfat sodný a mastek. Tuhé prostředky pomocného typu lze též použít jako plnidla v želatinových tobolkách. Preferované látky v této souvislosti též zahrnují laktosu nebo mléčný cukr, stejně tak jako vysokomolekulární polyethylenglykoly. Pokud se požadují vodné suspenze a/nebo elixíry pro perorální podávání, lze kombinovat účinnou látku nebo kombinaci látek s různými sladidly nebo aromatizačními přísadami, barvivý a v případě požadavku s emulgačními a/nebo suspenzačními prostředky spolu s ředidly, jako je voda, ethanol, propylenglykol, glycerol a různé jejich kombinace. Prostředky pro perorální použití lze též poskytovat ve formě tvrdých želatinových tobolek, ve kterých se účinná složka mísí s některým inertním tuhým zřeďovacím prostředkem, například s uhličitanem vápenatým, fosforečnanem vápenatým nebo kaolinem nebo ve formě měkkých želatinových tobolek, ve kterých se účinná složka mísí s vodným nebo olejovým prostředím, například se slunečnicovým olejem, kapalným parafinem nebo olivovým olejem.
Pomocné látky mohou být například inertní zřeďovací prostředky, jako je uhličitan vápenatý, uhličitan sodný, ·· ··· · ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· « · · · laktosa, fosforečnan vápenatý, fosforečnan sodný, granulační a rozvolňovací prostředky, například kukuřičný škrob nebo kyselina alginová, pojivá, například škrob, želatina nebo akaciová klovatina a maziva, například stearat horečnatý, kyselina stearová nebo mastek. Tablety mohou být nepotahované nebo mohou být potahované známými způsoby pro pozdržení rozpadu a absorpce v gastrointestinálním traktu, čímž se poskytuje trvalé působení po delší dobu. Například lze použít látky pro časové pozdržení, jako je glycerylmonostearat nebo glyceryldistearat. Mohou se též potahovat způsoby popsanými v US patentech č. 4 256 108, 4 166 452 a 4 265 874 s vytvořením osmotických terapeutických tablet pro řízené či časované uvolňování.
Vodné suspenze mohou obsahovat účinné látky ve směsi s pomocnými látkami vhodnými pro přípravu vodných suspenzí. Takové pomocné látky zahrnují suspenzační prostředky, například sodnou sůl karboxymethylcelulosy, methylcelulosy, hydroxypropylmethylcelulosy, alginat sodný, pólyvinyIpyrrolidon, tragakantovou klovatinu a akaciovou klovatinu. Dispergačními či smáčecími prostředky mohou být přirozený fosfatid, například lecithin či kondenzační produkty alkylenoxidu s mastnými kyselinami, například polyoxyethylenstearat nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s alifatickými alkoholy s dlouhým řetězcem, například s heptadekaethylenoxycetanolem, nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s parciálními estery odvozenými od mastných kyselin a hexitolu, jako je polyoxyethylensorbitol-monooleat nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s parciálním esterem odvozeným od mastných kyselin a hexitolanhydridů, například polyethylensorbitan-monooleat. Tyto vodné suspenze mohou též obsahovat jeden nebo více konzervačních prostředků, například ethyl- nebo n-propyl(p-hydroxybenzoat).
< · ······ · β • · ·· · · · 9
Olejovou suspenzi lze připravit suspendováním účinné složky v některém rostlinném oleji, například arašídovém oleji, olivovém oleji, sezamovém oleji či kokosovém oleji nebo v minerálním oleji, jako je kapalný parafin. Olejové suspenze mohou obsahovat zahušřovací prostředek, například včelí vosk, tuhý parafin nebo cetylalkohol. Tyto prostředky se mohou konzervovat přídavkem některého antioxidačního prostředku, jako je kyselina askorbová.
Dispergovatelné prášky a granule jsou vhodné pro přípravu vodné suspenze jejich míšením s vodou. Tyto prostředky mohou poskytovat účinnou složku ve směsi s dispergačním či smáčecím prostředkem, suspenzačním prostředkem a jedním či více konzervačními prostředky. Příklady vhodných dispergačních či smáčecích prostředků a suspenzačních prostředků se popisují výše.
Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu mohou být též ve formě emulzí oleje ve vodě. Olejovou fází může být rostlinný olej, například olivový olej nebo arašídový olej, nebo minerální olej, například kapalný parafin, nebo jejich směsi. Vhodnými emulgačními prostředky mohou být přirozené klovatiny, například akaciová klovatina nebo tragakantová klovatina, přirozené fosfatidy, například ze sojových bobů, lecithin a estery nebo parciální estery odvozené z aminokyselin a hexitolanhydridů (například sorbitanmonooleat) a kondenzační produkty těchto parciálních esterů s ethylenoxidem (například polyoxyethylensorbitanmonooleat).
Lze připravit mast obsahující farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu, kromě dalších způsobů známých v oboru kombinací účinné složky s prostředím obsahujícím
• • · 4 • · ·* ··«· • · · ·· • · • 4 ·
• • • • · · • • ·· · • · · • I · ·· · • · • » • ♦ • • • • · ·
glykol, nižší alkanol a vodu, gelatinizační prostředek a případně adjuvantní prostředek, jako je diisopropyladipat, diethylsevakat, ethylkaproat a ethyllaurat. Vhodné glykoly zahrnují polypropylenglykol, butylenglykol, polyethylenglykol a podobně. Obecně lze jako gelatinizační prostředek použít karboxyvinylovy polymer předem zneutralizovaný organickým aminem, jako je diisopropylamin a triethylamin, nebo celulosu (například hydroxyethylcelulosu, methylcelulosu, karboxymethylcelulosu, hydroxypropylcelulosu).
Sloučeniny a prostředky podle tohoto vynálezu se mohou též podávat ve formě čípků pro rektální podávání léku. Tyto prostředky lze připravit smísením léku s vhodnými nedráždivými pomocnými látkami, které jsou tuhé při běžných teplotách, jako je teplota místnosti, avšak kapalné při teplotě v rektu a proto v rektu tají s uvolněním léku. Takovými látkami jsou kakaové máslo a polyethylenglykoly.
Množství účinné látky nebo kombinace látek, které lze kombinovat s nosnými látkami s obdržením jednotkových dávek, se bude měnit v závislosti na léčeném hostiteli a konkrétním způsobu podávání. Formy dávkových jednotek budou obecně obsahovat od zhruba 25 mg do zhruba 1 g účinné složky. Denní dávka účinných složek bude obvykle v rozmezí mezi zhruba 1 až zhruba 300 mg na kg tělesné hmotnosti pro perorální cestu podávání a mezi zhruba 0,1 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti pro běžné způsoby injekčního podávání. Toto množství se může podávat najednou nebo rozdělené do dvou či více alikvótů podávaných v průběhu dne. Je však třeba si uvědomit, že specifická dávková hladina pro každého konkrétního pacienta či subjekt bude záviset na řadě faktorů včetně účinnosti použité specifické látky, stáří, tělesné hmotnosti, celkového zdravotního stavu, pohlaví, potravy, způsobu podávání, cesty • · »
♦ ··
• · A··· 9 • • V • · ♦ · • ·
• • •
• • 9 • ·
• · ·· • ·· • ·
podávání, rychlosti vylučování, kombinace léků, trvání virové infekce u léčeného subjektu a závažnosti konkrétní virové infekce, která se má léčit.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu lze podávat samotné nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosnými nebo zřeďovacími prostředky jakoukoliv účinnou cestou, přednostně jednou ze tří výše popsaných cest. Toto podávání lze provádět v jednotlivých nebo vícečetných dávkách. Konkrétněji lze nové terapeutické prostředky podle tohoto vynálezu podávat v širokém rozmezí různých dávkových forem, to jest lze je kombinovat s různými farmaceuticky přijatelnými nosiči ve formě tablet, tobolek, pastilek, pilulek, tvrdých bombonů, prášků, sprejů, krémů, balzámů, čípků, želé, gelů, past, pleťových vod, mastí, vodných suspenzí, roztoků pro injekce, eliksírů, sirupů a podobně, jak se popisuje výše.
Příklady provedení vynálezu
Níže popsané příklady slouží pouze pro znázornění určitých ztělesnění tohoto vynálezu a nezamýšlejí se tak, aby omezovaly tento vynález.
Příklad 1
Extrakce protivirových prostředků z rostlin SM a SY
Extrakty z rostlin SM a SY se připraví následujícím způsobem.
Krok 1. Vysušená SY se vaří v destilované vodě Milli-Q (18,0 mOhm/cm) a odpaří se do obdržení konečné hustoty 1,30 g/ml. Extrakt se poté zředí destilovanou vodou
- 27 1:5, centrifuguje při frekvenci otáčení 8000 min-1 po dobu 90 min při teplotě 25 °C v rotoru GS-3. Peleta se odstraní do odpadu a supernatant se uchová. K tomuto supernatantu se přidá jedna desetina objemu 1,0 N roztoku kyseliny chlorovodíkové pro získání konečné koncentrace kyseliny chlorovodíkové 0,1 N. Supernatant se inkubuje přes noc při teplotě 25 °C. Roztok se centrifuguje při frekvenci otáčení 8000 min-1 po dobu 90 min při teplotě 25 °C v rotoru GS-3 a výsledná peleta se poté promyje 95% ethanolem s následnou filtrací filtračním systémem 0,2 gm. To se opakuje do získání čirých promývacích podílů. Peleta se poté vysuší ve filtrační jednotce při teplotě místnosti s následnou inkubací v sušárně přes noc při teplotě 70 °C. Prášek se resuspenduje v destilované vodě při hmotnostním poměru pelety k vodě 1:5. Výsledný produkt se poté centrifuguje při frekvenci otáčení 25000 min-x po dobu 30 min při teplotě 25 °C v rotoru Ti45. Supernatant se odstraní a výsledná peleta se resuspenduje v 50% ethanolu. Alternativně lze peletu též resuspendovat v 50% methanolu.
Krok 2. Resuspendovaný roztok se zfiltruje pro odstranění nerozpustných látek.
Krok 3. Zfiltrovaný roztok se odpaří na 1/5 původního objemu s vytvořením sraženiny. Vysrážená peleta se promyje destilovanou vodou. Promytá peleta se poté přes noc lyofylizuje. Vysušená promytá peleta se označí jako frakce 1.
Krok 4. Vysušený prášek obdržený z kroku 3 se rozpustí v 50% methanolu. Roztok se centrifuguje pro odstranění jakýchkoliv nerozpustných látek. Supernatant se nalije na sloupec Sephadex LH-20, který je v rovnováze s destilovanou vodou. Sloupec se promyje velkým množstvím destilované vody a eluuje roztoky v následujícím pořadí: 15 objemových % methanolu ve vodě, 30 objemových % methanolu ve vodě s 1 % kyseliny octové, 40 objemových % methanolu ve vodě, 50 objemových % methanolu ve vodě, 75 objemových % methanolu ve vodě a 100% methanol. Pořadí použitých roztoků závisí na výchozím roztoku. Frakce eluovaná 50% roztokem methanolu ve vodě se odpaří a nanese na reversní sloupec pro vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii (Ultrasphere ODS, 4,6 x 250 mm, 5 μΜ), který je v rovnováze s 10% roztokem methanolu a 0,1% roztokem kyseliny mravenčí. Sloupec se eluuje s použitím 25 min gradientu 10% methanol/0,1% kyselina mravenčí a 100% methanol/0,1% kyselina mravenčí při průtoku 1 ml/min. Sloučeniny se detekují sledováním absorbance při vlnové délce 275 nm.
Krok 5. Molekulová hmotnost každé frakce eluované z reversního sloupce vysokovýkonné kapalinové chromatografie se analyzuje způsoby hmotnostní spektrometrie. Hmotnostní spektrometrie identifikuje následující sloučeniny.
Mol. hm. Sloučeniny
1. 180 kyselina kofeinová (#1)
2. 198 kyselina D-(3,4-dihydroxyfenyl)mléčná (#2)
3. 359 kyselina rosmarinová (#3)
4 . 387 formy solí kyseliny rosmarinové (kyselina yunnanová C a kyselina yunnanová D)
5 . 494 kyselina 2-(3,4-dihydroxyfenylethenyl)kofeinová (#5) nebo kyselina salvianolová
7. 717 lithospermat B (#7)
8. 739 magnesium-lithospermat B (#8)
9. 853 kombinace kyseliny rosmarinové a kyseliny
2-(3,4-dihydroxyfenylethenyl)kofeinové (#9)
10. 987 dimery látky #5 o molekulové hmotnosti 987 (#10), jak se diskutují v příkladu 4, níže.
Sloučeniny mají vzorce
OH (#1)
COOH
H—C—OH /^rr
OH (#2)
(#3)
Kyselina yunnanová C ť·
Λ
4 4 4
4 «
Kyselina yunnanová D
Ov OH
• * · · · · · 0 · • · · 0 « «·· ♦ *00 00 • 0 0*0 000 •00 000 00 · 00 004
OH
OH (#5) • · • · · · «
HO (#7)
(#8)
(#9)
Příklad 2
Protivirová zkouška: Účinnost virové inhibice
Zkouška na HIV-1 integrasu: Níže se popisují vyvinuté rozbory in vitro pro sledování aktivity HIV-1 integrasy. Tyto rozbory používají purifikovanou rekombinantní HIV-1 integrasu a oligonukleotidové substráty, které představují konce LTR virové deoxyribonukleové kyseliny. Funkční význam údajů obdržených z těchto rozborů in vitro spočívá na tom, že tyto rozbory odrážejí skutečné funkční děje, které nastávají in vivo. Jsou známy fluorometrické [Lee a kol., Analytical Biochemistry, 227, 295-301 (1995)] a radioaktivní rozbory, které zlepšují dříve popsanou zkoušku in vitro [Lee a kol., Biochemistry, 34. 10205-10214 (1995), Lee a kol.,
Biochemistry, 34, 10215-10223 (1995)]. Navíc původci tohoto vynálezu modifikovali přípravu enzymu, což zlepšuje kvalitu vzorku HIV-1 integrasy [Lee a Han, Biochemistry, 35, 3837-3844 (1996), Lee a kol., Biochemistry, 36, 173-180 (1997)]. Tyto modifikace zkoušky in vitro a přípravy vzorku se zahrnují pro lepší přiblížení dějům nastávajícím in vivo. Tím jsou výsledky rozboru in vitro velice užitečnými prediktory infekčnosti viru při vyhledávání potenciálních inhibitorů integrasy.
Aktivita frakce 1 při inhibici HIV-1 integrasy se určuje následujícím způsobem. Frakce 1 se nejprve rozpustí ve vhodném objemu 0,1% roztoku hydroxidu amonného (hmotnost/ /objem) pro získání konečné koncentrace 15 mg/ml. Tyto vzorky se poté centrifugují při frekvenci otáčení 10000 min-1 po dobu 30 min. Pokud se vytvoří peleta, supernatant se odstraní. Peleta se vysuší a znovu se rozpustí v 0,1% roztoku hydroxidu amonného. Výsledný roztok je zásobním roztokem frakcí extraktu. Z tohoto zásobního roztoku se připraví následující zředění: 1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 a 1:10000. Po 1 μΐ každého z těchto zředění se přidá ke každé reakční směsi, což odpovídá konečné koncentraci 75, 15, 7,5, 3,75, 2,5, 1,875, 1,5, 1,25, 1,07, 0,9375, 0,833, 0,75, 0,375, 0,25, 0,1875, 0,15 a 0,075 gg/ml. Poté se provede zkouška, jak se popisuje výše [Lee a kol., Biochemistry, 34. 10214-10214 (1995), Lee a kol., Biochemistry, 34, 10215-10223 (1995), Lee a Han (1996)].
Pro určení ICso a IC5O každé frakce se gel vystaví sítu PHOSPHORIMAGER™ a procento štěpení se určí pomocí Molecular Dynamics PHOSPHORIMAGER™. Procento inhibice se stanoví odečtením procenta štěpení každé frakce od procenta po37 ·· ···· ··
Φ ♦ ·· φ · • · ·· φ φφφ ·· ······ ·φ « φφφ zitivní kontroly a vydělením této hodnoty procentem štěpení pozitivní kontroly. Výsledky ukazují, že frakce 1 má ICso 0,2 až 1,2 pig/ml a ICso 2,5 až 3,5 gg/ml v kultuře. V souladu s tím u živých savců mohou být koncentrace v krvi činící až 100 násobek této hladiny tolerované a prospěšné.
Příklad 3
Testování extraktů SM in vitro
Model virů imunodeficience koček (FIV) je přijímaným zvířecím modelem pro studium léků použitých proti infekci HIV. FIV je T buněčný-trofický lentivirus izolovaný z koček. FIV se biologicky a biochemicky podobá HIV, což zahrnuje značnou homologii mezi FIV a HIV integrasou. U koček infikovaných FIV se rozvíjí syndrom získané imunodeficience koček (FAIDS), který je podobný plně rozvinutému syndromu AIDS u lidí.
Model FIV v buněčné kultuře. Crandellova-Reesova linie buněk z kočičích ledvin (CrFK) je citlivá na infekci FIV a umožňuje replikaci virů. Buňky CrFK jsou účinným prostředkem pro tvorbu virů a pro studie infekce FIV. I když FIV není pro buňky CrFK infikované FIV cytopatický, jsou k dispozici rozbory pro skreening infekce FIV v tkáňové kultuře. Studie prokazují účinnost extraktu z SY.
Stanovení EDbq. Frakce 1 se testuje ohledně ochrany buněk CrFK před infekcí FIV. Buňky CrFK se pěstují paralelně v trojím provedení při hustotě 1χ10Ξ buněk/baňka T25. Po 24 h inkubace pro dosažení připojení a růstu buněk se roztoky sloučenin aplikují na buněčné kultury na dobu 24 h. Roztoky se připravují rozpuštěním aktivních látek podle tohoto vyná38 * · ······φ · • · · · · ♦ · ·Β· • · φ · · «· • ♦ 9 9 9 99
9 9 9 9 99 99 9 lezu v fosfátovém pufru při pH 8, při koncentraci 100 mg/ml, s následnou centrifugací při frekvenci otáčení 25000 min-1· po dobu 30 min při teplotě 25 °C v rotoru Ti45. Supernatant se odstraní a tři alikvóty 1 ml se vysuší centrifugací při otevřeném vakuu pro stanovení koncentrace roztoku. Aktivní prostředek se dále zředí na 2 mg/ml, zfiltruje filtrem z acetatu celulosy 0,2 /xm a koncentrace se stanoví určením hmotnosti vysušené rozpuštěné složky ve srovnání s tárovanou kontrolou.
Výsledky ukazují, že frakce 1 má rozmezí EDso mezi 0,1 a 1,0 gg/ml a EDgo mezi 0,2 a 2,5 jxg/ml při prevenci infekce buněk CrFK viry FIV. Podle těchto výsledků lze přípravky podle tohoto vynálezu ve farmaceuticky přijatelných nosičích podávat, a měly by se podávat, v dostatečné dávce pro obdržení koncentrace v krvi 10 nM až 1000 nM. Avšak v některých případech je nutné podávat dávky pro obdržení koncentrací až 10000 nM v krvi. Aktivnější prostředky mohou být účinné již při koncentracích v krvi 1 nM.
Příklad 4
Konjugace kyseliny salvianolové
Za alkalických podmínek může kyselina salvianolová (sloučenina 1) tvořit tři další dehydrogenované formy (sloučeniny 2 až 4). Konjugace kyseliny salvianolové a jejích derivátů (dehydrogenované formy kyseliny salvianolové) na dimerní formy vede ke tvorbě několika sloučenin, jejichž struktury jsou známé. Tyto konjugáty vznikají z homodimerů a/nebo heterodimerů kyseliny salvianolové a z jejích dehydrogenovaných forem. Tyto sloučeniny vykazují anti-HIV-1 integrasovou aktivitu při koncentracích nižších než 1 gg/ml.
- 39 Základní struktura kyseliny salvianolové, sloučeniny je znázorněná níže:
A, B, C a D představují atomy vodíků při atomech uhlíku 24, 27, 35 a 38 sloučeniny 1. Tyto atomy vodíku jsou potenciálními místy konjugace. Proto konjugace dvou molekul kyseliny salvianolové (sloučenina 1) vytváří homodimer v následujících kombinacích (sloučeniny 5 až 13): sloučenina 5 je konjugovaná místem A k místu A (obr. 1), sloučenina 6 je konjugovaná místem A k místu B (obr. 2), sloučenina 7 je konjugovaná místem A k místu C (obr. 3), sloučenina 8 je konjugovaná místem A k místu D (obr. 4), sloučenina 9 je konjugovaná místem B k místu B (obr. 5), sloučenina 10 je konjugovaná místem B k místu C (obr. 6), sloučenina 11 je konjugovaná
místem C k místu C (obr. 7), sloučenina 12 je konjugovaná místem C k místu D (obr. 8), sloučenina 13 je konjugovaná místem D k místu D (obr. 9), sloučenina 24 je konjugovaná místem B sloučeniny 1 k místu D sloučeniny 1 (obr. 13).
Dále lze vytvořit tři dehydrogenované formy kyseliny salvianolové (sloučeniny 2 až 4) dehydrogenací na uhlících 24 a 38, 24 a 35 a 27 a 38. Tyto formy mají následující základní struktury. Sloučenina 2, 24 až 38 (obr. 10)
Sloučenina 3, 24 až 35 (obr. 11)
E představuje místo konjugace.
Sloučenina 4, 27 až 38 (obr. 12)
F představuje místo konjugace.
♦ 4 444444··
444 4 4 · 44 • 4 4 4 4 44
9 9 9 9 9 9 99
9 4 4 4 44 • 99 999 44 4 444
Dehydrogenované formy kyseliny salvianolové (sloučeniny 2 až 4) mohou vytvářet homodimery. To znamená, že sloučenina 3 se může konjugovat s další molekulou téže sloučeniny v místě E s vytvořením sloučeniny 14 a v místě F s vytvořením sloučeniny 15.
Tyto dehydrogenované formy mohou též vytvářet heterodimery s kyselinou salvianolovou. Potenciální heterodimery, které se vytvářejí, vznikají konjugací v místě A sloučeniny 1 s místem E sloučeniny 3 s vytvořením sloučeniny 16, v místě B sloučeniny 1 s místem E sloučeniny 3 s vytvořením sloučeniny 17, v místě C sloučeniny 1 s místem E sloučeniny 3 s vytvořením sloučeniny 18, v místě D sloučeniny 1 s místem E sloučeniny 3 s vytvořením sloučeniny 19, v místě F sloučeniny 4 s místem A sloučeniny 1 s vytvořením sloučeniny 20, v místě F sloučeniny 4 s místem B sloučeniny 1 s 'vytvořením sloučeniny 21, v místě F sloučeniny 4 s místem C sloučeniny 1 s vytvořením sloučeniny 22 a v místě F sloučeniny 4 s místem D sloučeniny 1 s vytvořením sloučeniny 23 .
Navíc k těmto dimerům lze tvořit trimery a větší polymery těchto sloučenin. Rozmezí struktury těchto sloučenin bude známé tomu, kdo má zkušenost v oboru.
Lze též uvažovat, že se tyto sloučeniny mohou modifikovat tak, aby obsahovaly acetylové skupiny, estery, anhydridy nebo farmaceuticky přijatelné soli této sloučeniny.
Příklad 5
Časově závislá aktivace antiintegrasové aktivity jako výsledek konjugace
Sloučenina 1 příkladu 4 se purifikuje a ověřuje hmotnostní spektrometrií a nukleární magnetickou resonancí. Poté se sloučenina 1 inkubuje s 0,1% roztokem hydroxidu amonného po různé doby (5 min, 30 min, lh, 2h, 3h, 4h, 5 h a 24 h) při koncentraci 5 mg/ml. Reakce se zastaví přídavkem 1% kyseliny octové a provede se zkouška na anti-HIV-1 integrasovou aktivitu. Výsledky prokazují, že následkem inkubace s 0,1% hydroxidem amonným dochází k časově závislé aktivaci frakcí. Tato aktivace je výsledkem různých konjugací sloučeniny 1. Výsledky shrnuj e tabulka 3
Tabulka 3
Doba IC5o (gg/ml) pH 6,0
pH 6,0 3,5
5 min 1,8
30 min 1,7
1 h 1,5
2 h 1,5
3 h 1,05
4 h 1,0
5 h 0,9
24 h 0,5
Purifikované sloučeniny mající molekulovou hmotnost 492 (například sloučeniny 2 až 4, jak se popisují výše) se inkubují s 0,1% roztokem hydroxidu amonného po různě doby (5 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2,0 h a 3,0 h) při koncentracích 5,0 mg/ml. Reakce se zastaví přídavkem 1% kyseliny octové
a provede se rozbor na anti-HIV-1 integrasovou aktivitu. Výsledky ukazují, že dochází k časově závislé aktivaci sloučenin 2 až 4 následkem inkubace s 0,1% roztokem hydroxidu amonného. Tato aktivace však není tak vysoká jako při konjugaci se sloučeninou 1. Výsledky shrnuje tabulka 4.
Tabulka 4
Vzorek
IC50
5 min >7,5
30 min 5,5
1 h 5,2
1,5 h 4,2
2,0 4,1
3,0 h 2,1
Příklad 6
Anti-HIV-1 integrasová aktivita aktivované sloučeniny 1
0,8 g sloučeniny 1 z příkladu 4 se inkubuje v 80 ml
0,1% roztoku hydroxidu amonného při koncentraci 10 mg/ml po dobu 8 h. Získaná aktivovaná frakce se poté nanese na sloupec SEPHADEXrLH20 a eluuje při vzrůstajících koncentracích methanolu ve vodě. Eluované frakce se lyofilizují a provede se rozbor na anti-HIV-1 integrasovou aktivitu. Výsledky shrnuj e tabulka 5.
Tabulka 5 ··«· • · • ·
Frakce ICso (^g/ml)
původně 1,1
10% methanol 1,1
20% methanol 0,69
30% methanol 0,81
40% methanol 0,92
50% methanol 0,4
60% methanol 0,92
70% methanol 3,2
80% methanol >7,5
Vzorek frakce 50%, který má nejvyšší aktivitu, se poté analyzuje hmotnostní spektrometrií. Hmotnostní spektra vykazují dva velké vrcholy 492 a 986. Tyto vrcholy odpovídají monomeru kyseliny salvianolové a dimeru kyseliny salvianolové, což ukazuje, že tyto sloučeniny představují aktivní protivirové látky. Proto tyto výsledky ukazují, že aktivní protivirový prostředek odpovědný za inhibici integrasy je buď kyselina salvianolová a/nebo její dimer.
Účinnost těchto frakcí proti infekci HIV-1 se hodnotí pomocí buněk CEM™5·-1·. Tyto buňky jsou vypěstované z CEM, jak popisuje příklad 8. Použije se rozbor záchytu antigenu HIV p24, jak popisuje příklad 8. Výsledky shrnuje tabulka 6 níxz ze.
Tabulka 6
Vzorek ICso (M9/ml)
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
2,2
3,8 nestanoveno
Příklad 7
Anti-HIV-1 integrasová aktivita
Frakce 1 z příkladu 1 se rozpustí ve 40% methanolu (ve vodě) a centrifuguje po dobu 30 min při frekvenci otáčení 8000 min1 v rotoru GSA. Frakce supernatantu se nanesena sloupec SEPHADEXK'LH20, který je v rovnováze se 40% methanolem (ve vodě). Sloupec se promyje 40% roztokem methanolu (ve vodě) a eluuje 50, 60, 70, 80 a 90% roztokem methanolu (ve vodě). Poté se vzorky lyofilizují a rozpustí v příslušném objemu methanolu pro obdržení konečné zásobní koncentrace 5 mg/ml. Tyto vzorky se poté podrobí rozboru na anti-HIV-1 integrasovou aktivitu. Analyzované koncentrace jsou 5, 2,5, 2, 1,5, 1,25, 1, 0,8, 0,6, 0,4 a 0,2 gg/ml. Procento inhibice se stanoví odečtením procenta štěpení každé frakce od procenta štěpení pozitivní kontroly a vydělením této hodnoty procentem štěpení pozitivní kontroly.
Tabulka 7
Výsledky rozboru na HIV-1 integrasovou aktivitu in vitro
• ·· 0 • ·· • ·· 4 0 • 9 ♦ ··· 0 0 • 0 0 · 4 · 4 • · •
• • 4 0 • 0 0 •
04 0 ··· 0» • >· • 0«
Frakce # IC SO (Ag/ml)
40 0,84
50 0,70
60 0,68
70 0,60
80 0,57
90 0,50
Frakce ze sloupce SEPHADEXRLH20 60 až 80 % se spojí a rozpustí ve 40% methanolu ve vodě. Resuspendovaný vzorek se centrifuguje po dobu 30 min při frekvenci otáčení 8000 min-1 v rotoru GSA. Roztok supematantu se nanese na sloupec MCI GEL CHP20P (75 až 150 μπι) , který jev rovnováze se 40% vodným roztokem methanolu. Sloupec se promyje 40% methanolem ve vodě a eluuje 50, 60 a 70% methanolem ve vodě. Poté se vzorek lyofilizuje a podrobí rozboru, jak se popisuje výše, za různých podmínek.
Tabulka 8
Výsledky rozboru in vitro na HIV-1 integrasovou aktivitu # vzorky ICso v methanolu (/zg/ml)
ICSO při pH 6,0 (jiig/ml)
ICso v 0,1% hydroxidu amonném (ptg/ml)
MCI 40 0,32 0,70 0,44
MCI 50 0,34 0,80 0,58
MCI 60 0,42 1, 00 0, 62
Vzorky MCI GEL CHP20P (75 až 150 μτα) se poté analyzují hmotnostní spektrometrií (negativní režim). Výsledky ukazují, že MCI 40 má veliký vrchol 986 s menším vrcholem 494. MCI 50 má velké vrcholy 492 a 986. MCI 60 má velké vrcholy 984 a 986. Zjišéuje se, že vrchol 494 představuje kyselinu salvianolovou, jak ukazuje hmotnostní spektrometrie a nukleární megnetická resonance. Vrchol 492 představuje dehydrogenovanou formu kyseliny salvianolové. Vrchol 986 představuje dimerní formu kyseliny salvianolové. Vrchol 984 představuje směsný dimer 492 a 494. Tyto výsledky ukazují, že aktivní složky frakce 1 jsou sloučeniny o molekulové hmotnosti 984 a/nebo 986. Tyto experimentální údaje ukazují, že dimerní sloučeniny molekulové hmotnosti 984 a 986 vznikají ze sloučeniny 1.
Příklad 8
Rozbor anti-HIV-1 aktivity účinného prostředku
Účinnost frakcí MCI GEL CHP20P (75 až 150 μτα) proti infekci HIV-1 se hodnotí pomocí buněk CEMTART. Tyto buňky jsou vypěstované z buněk CEM a exprimují konstitučně geny HIV-1 tat a rev. Buňky CEM'rART poskytují bezpečný systém pro vyhodnocení infekce HIV, neboř jsou vypěstované tak, aby byly produkční při replikaci inkompetentní formy HIV-1, <c»t> / . účinnost těchto sloučenin inhibovat infekci HIV-1 se hodnotí s použitím rozboru záchytu antigenu p24 HIV. Tento rozbor používá monoklonální protilátku proteinu jádra p24 k potažení 96-jamkových desek, na kterých se média pro pěstování buněk nebo sérum inkubují po dobu 2 h. Supernatanty se odstraní od buněk alespoň jeden týden po infekci HIVcl®lta <tat> z . Jamky se promyjí před přídavkem biotinylované polyklonální protilátky proti HIV-1 p24. Po
přídavku substrátu pro amplifikaci signálu se exprese p24 přímo kvantitativně vyjádří vzhledem ke známému standardu.
MCI 40, 50 a 60 se rozpustí v methanolu a schopnost těchto látek inhibovat infekci HIV-1 se hodnotí při následujících koncentracích: 100, 20, 10, 5 a 1 /ig/ml. Do 24-jamkových misek se přidávají 2 ml 3,33 x 104 buněk CEMTART spolu se zkušebními koncentracemi látky. K těmto 5000 TCIDso/ /10e buňkám se přidá inokulum HIV-1. Médium se mění dvakrát týdně, takže se 0,8 ml buněčné suspenze resuspenduje ve 2 ml nového média. Supernatanty bez buněk se poté podrobí rozboru na přítomnost p24. Účinnost anti-HIV-1 se hodnotí srovnáním tvorby antigenu HIV-1 p24 za přítomnosti a nepřítomnosti přidaného léku po 7 a 10 dnech. Výsledky ukazují tabulky 9 a 10.
Tabulka 9 - den 7
Vzorek Koncentrace % inhibice (gg/ml)
MCI 40 100 100
20 100
10 100
1 0
MCI 50 100 100
20 100
10 100
1 0
MCI 60 100 100
20 100
10 100
1 0
MCI 40
MCI 50
MCI 60
100
100
100
100
100
100 o
100
100
100 o
100
100
100 o
Veškeré výše diskutované citace se zde zahrnují formou odkazu. Odkazem se též zahrnuje mateřská přihláška, US přihláška č. 09/104 363 podaná 25. června 1998.

Claims (56)

  1. ··· · ·· ·· · ·· ···
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob léčení nebo prevence virové infekce, vyznačující se tím, že se podává přípravek obsahující účinné množství inhibující viry alespoň jednoho prostředku, který má alespoň jeden zbytek obecných vzorců ve kterých
    R1 je hydroxylové skupina, atom kyslíku nebo vazba,
    R2 je atom vodíku nebo vazba,
    R3 je hydroxylové skupina nebo atom kyslíku,
    R4 je vazba nebo skupina ve které
    R5 je hydroxylová skupina nebo vazba,
    Rs je atom vodíku nebo vazba a
    Rv je atom vodíku nebo vazba a tento aktivní prostředek má molekulovou hmotnost vyšší než 190.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že zbytek obecného tento aktivní prostředek má alespoň jeden vzorce 0H
    C a alespoň jeden zbytek obecného vzorce
    4 · • · * · · · · <· ·
    4 4 · · « · 4 4
    444444 4 * 4
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že tímto aktivním prostředkem je dimer, trimer, tetramer nebo vyšší polymer těchto zbytků.
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se tyto aktivní prostředky volí ze skupiny sloučenin zahrnující kyselinu D-(2,3-dihydroxyfenyl)mléčnou, kyselinu rosmarinovou, kyselinu 2-(3,4-dihydroxyfenylethenyl)kofeinovou, lithospermat B, magnesium-lithospermat B, dimery kyseliny 2-(3,4-dihydroxyfenylethenyl)kofeinové nebo
    OH
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že virová infekce je způsobená virem hepatitidy, orthomyxovirem, papillomavirem, paramyxovirem, pikornavirem, polyomavirem nebo rětrovirem.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že tímto retrovirem je virus HIV nebo FIV.
  7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že tato virová infekce je způsobovaná virem, který tvoří integrasu nebo protein vykazující integrasovou aktivitu.
  8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se tento prostředek podává intranasálně, perorálně, transdermálně, parenterálně, intrathekálně nebo int ravenó zně.
  9. 9. Způsob léčení subjektu nebo prevence virové infekce,vyznačující se tím, že se subjektu, který toto léčení nebo prevenci potřebuje, podává přípravek obsahující účinné množství dvou či více účinných prostředků inhibující viry či více účinných prostředků a alespoň dva z těchto účinných prostředků zahrnují alespoň jeden podle následujících vzorců ve kterých
    R1
    R2
    R3
    R4
    V0H
    I , H-C—R
    OH je hydroxylová skupina, atom kyslíku nebo vazba, je atom vodíku nebo vazba, je hydroxylová skupina nebo atom kyslíku, je vazba nebo skupina —R ve které
    Rs je hydroxylová skupina nebo vazba,
    Re je atom vodíku nebo vazba a
    R-7 je atom vodíku nebo vazba a tyto účinné prostředky mají molekulovou hmotnost převyšující 190.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že tímto aktivním prostředkem je dimer, trimer, tetramer nebo vyšší polymer popsaných zbytků.
  11. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že se tyto účinné prostředky volí ze skupiny sloučenin zahrnující kyselinu
    D-(2,3-dihydroxyfenyl)mléčnou, kyselinu rosmarinovou, kyselinu (3,4-dihydroxyfenylethenyl)- kofeinovou, lithospermat B, magnesium-lithospermat B, dimery kyseliny 2-(3,4-dihydroxyfenylethenyl)kofeinové nebo #9
  12. 12. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že tuto virovou infekci způsobuje virus hepatitidy, orthomyxovirus, papillomavirus, paramyxovirus, pikornavirus, polyomavirus nebo retrovirus.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se t í m, že tímto retrovirem je virus HIV nebo FIV.
  14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se t í m, že tuto virovou infekci způsobuje virus, který tvoří integrasu nebo protein, který vykazuje integrasovou aktivitu.
  15. 15. Způsob podle nároku 9, vyznačující se t í m, že se tento prostředek podává intranasálně, perorálně, transdermálně, parenterálně, intrathekálně nebo intravenózně.
  16. 16. Protivirový prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje dvě či více účinných látek, kde tyto účinné látky obsahují alespoň jeden z následujících zbytků ve kterých
    Rx je hydroxylová skupina, atom kyslíku nebo vazba,
    R2 je atom vodíku nebo vazba,
    R3 je hydroxylová skupina nebo atom kyslíku,
    R4 je vazba nebo skupina
    O
    C—R ve které
    R5 je hydroxylová skupina nebo vazba,
    Re je atom vodíku nebo vazba a
    Rv je atom vodíku nebo vazba, a tyto aktivní prostředky mají molekulovou hmotnost vyšší než 190 a tento prostředek je schopen inhibovat virovou infekci při podání subjektu, který jej potřebuje.
  17. 17. Způsob identifikace protivirových prostředků z rostliny rodu Salvia, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky (a) extrakce účinného prostředku z rostliny obsahujícího jeden ze dvou následujících zbytků nebo konjugát takového zbytku • · · · ve kterém
    Rx je hydroxylová skupina, atom kyslíku nebo vazba,
    R2 je atom vodíku nebo vazba,
    R3 je hydroxylová skupina nebo atom kyslíku,
    R4 je vazba nebo skupina ve které
    R5 je hydroxylová skupina nebo vazba,
    Rs je atom vodíku nebo vazba a
    Rv je atom vodíku nebo vazba, (b) kombinaci prvního účinného prostředku s druhým účinným prostředkem, který obsahuje zbytek nebo jeho konjugát, který není představován prvním popsaným účinným prostředkem a (c) zkoušku kombinace prvního účinného prostředku a druhého účinného prostředku na protivirové působení.
  18. 18. Konjugační produkt, který je homopolymerem nebo heteropolymerem monomerních jednotek kyseliny salvianolové a/nebo dehydrogenovaných forem kyseliny salvianolové, a tento konjugační produkt má molekulovou hmotnost zhruba 492 nebo vyšší nebo acetylové, esterové či anhydridové deriváty tohoto produktu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.
  19. 19. Konjugační produkt podle nároku 18, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od zhruba 492 do zhruba 986.
  20. 20. Konjugační produkt podle lekulovou hmotnost zhruba 492.
    nároku
    19, který má mo
  21. 21. Konjugační produkt podle lekulovou hmotnost zhruba 984.
    nároku
    19, který má mo
  22. 22. Konjugační produkt podle lekulovou hmotnost zhruba 986.
    nároku
    19, který má mo
  23. 23. Konjugační produkt podle který nároku mopolymerem či heteropolymerem monomerních salvianolové a/nebo dehydrogenovaných forem II nebo III kyseliny salvianolové, kde kyselina je ho19, jednotek kyseliny salvianolová má strukturu (I) a dehydrogenované formy kyseliny salvianolové mají struktury ··
    - 63 ·· ·
    HO OH (III) ve kterých
    Rx, R2, R3, R4, Rs a Rs jsou atomy vodíku nebo vazby, a monomerní jednotky těchto homopolymerů nebo heteropolymerů se spolu navzájem váží pomocí Rx, R2, R3, R4, R5 a Rs.
  24. 24. Konjugační produkt podle nároku 23, který je homodimerem.
  25. 25. Konjugační produkt podle nároku 24, ve kterém se monomerní jednotky navzájem váží vazbou, která je Rx-Rx, R2-R2, R3-R3, R4-R4, Rs-Rs nebo R6-R6.
  26. 26. Konjugační produkt podle nároku 24, ve kterém se monomerní jednotky navzájem váží vazbou, která je Rx-R2, Rx-R3, Rx-R4, R2-R3, R2-R4 nebo R3-R4.
  27. 27. Konjugační produkt podle nároku 23, který je heterodimerem.
  28. 28. Konjugační produkt podle nároku 27, jehož monomerní jednotky se spolu váží vazbami Rx-R®, R2-R5 nebo R4-Rs.
  29. 29. Konjugační produkt podle nároku 27, jehož monomerní jednotky se spolu váží vazbami Rx-R6, R2-Rs, R3-Rs, R4-Rs nebo Rs-Re.
  30. 30. Konjugační produkt podle nároku 18, který je homotrimerem.
  31. 31. Konjugační produkt podle nároku 18, který je he- terotrimerem.
  32. 32. Konjugační produkt podle nároku 18, který je homopolymerem o 4 nebo více monomerních jednotkách.
  33. 33. Konjugační produkt podle nároku 18, který je heteropolymerem o 4 nebo více monomerních jednotkách.
    .
  34. 34. Způsob léčení nebo prevence virové infekce, vyznačující se tím, že se podává prostředek obsahující množství konjugačního produktu podle nároku 18, které je účinné při inhibici virů.
  35. 35. Způsob podle nároku 34, vyznačuj ící se tím, že konjugační produkt je homodimerem, heterodimerem, homotrimerem nebo heterotrimerem.
  36. 36. Způsob podle nároku 34, vyznačuj ící se t í m, že tato virová infekce je způsobovaná hepatovirem, orthomyxovirem, papillomavirem, paramyxovirem, pikornavirem, polyomavirem nebo retrovirem.
  37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačuj ící se t í m, že tímto retrovirem je virus HIV nebo FIV.
  38. 38. Způsob podle nároku 36, vyznačuj ící se t í m, že tuto virovou infekci způsobuje virus, který * tvoří integrasu nebo protein, který vykazuje integrasovou aktivitu.
  39. 39. Způsob podle nároku 34, vyznačuj ící se t í m, že se konjugační produkt podává intranasálně, perorálně, transdermálně, parenterálně, intrathekálně nebo intravenózně.
  40. 40. Způsob přípravy protivirového prostředku, vyznačující se tím, že se kyselina salvianolová inkubuje při alkalickém pH, takže se vytvářejí homopolymery nebo heteropolymery, které vykazují vyšší protivírovou účinnost než kyselina salvianolová.
  41. 41. Způsob podle nároku 40, vyznačuj ící se t í m, že homopolymery či heteropolymery mají molekulovou hmotnost zhruba 492 nebo vyšší.
  42. 42. Způsob podle nároku 40, vyznačuj ící se t í m, že homopolymery nebo heteropolymery mají molekulovou hmotnost v rozmezí od zhruba 492 do zhruba 986.
  43. 43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se t í m, že homopolymery nebo heteropolymery mají molekulovou hmotnost okolo 492.
  44. 44. Způsob podle nároku 42, vyznačuj íc í se t í m, že homopolymery nebo heteropolymery mají molekulovou hmotnost okolo 984.
  45. 45. Způsob podle nároku 42, vyznačuj ící se t í m, že homopolymery nebo heteropolymery mají molekulovou hmotnost okolo 986.
  46. 46. Způsob podle nároku 42, vyznačuj íc í se t í m, že homopolymery nebo heteropolymery obsahují monomerní jednotky kyseliny salvianolové a/nebo dehydrogenovaných forem II nebo III kyseliny salvianolové a tato kyselina salvianolová má strukturu (I) a tyto dehydrogenované formy kyseliny salvianolové mají struktury (II) (III) ve kterých
    Rx, R2, R3, R4, Rs a R6 jsou atomy vodíku nebo vazby a monomerní jednotky těchto homopolymerů nebo heteropolymerů se navzájem váží prostřednictvím R1, R2, R3, R4, Rs a Rs.
  47. 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se t í m, že se vytváří homodimer.
  48. 48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se t í m, že se monomerní jednotky navzájem váží vazbami R^-R1, R2-R2, R3-R3, R4-R4, R5-R5 nebo R6-Rs.
  49. 49. Způsob podle nároku 47, vyznačuj íc í se t í m, že se monomerní jednotky navzájem váží vazbami R^-R2, Rx-R3, R^-R4, R2-R3, R2-R4 nebo R3-R4.
    4 • · · 4 4 · 4 4 • 4 • • 4 4 4 4 4 4 • 4 · • • • • • 4 4 4 4 · • · · • · · ♦ · 44
  50. 50. Způsob podle nároku 46, vyznačující se t í m, že se tvoří heterodimer.
  51. 51. Způsob podle nároku 50, vyznačující se t i m, že se monomerní jednotky navzájem váží vazbami R^-R5, R2-Rs, R3-Rs nebo R4-R5.
  52. 52. Způsob podle nároku 40, vyznačuj ící se t í m, že se monomerní jednotky se spolu váží vazbami R^-R6, R2-R6, R3-R6, R4-R6 nebo Rs-Rs.
  53. 53. Způsob podle nároku 50, vyznačuj ící se t í m, že se tvoří homotrimer.
  54. 54. Způsob podle nároku 40, vyznačuj ící se t í m, že se tvoří heterotrimer.
  55. 55. Způsob podle nároku 40, vyznačuj ící se t í m, že se tvoří homopolymer 4 nebo více monomerních jednotek.
  56. 56. Způsob podle nároku 40, vyznačuj íc í se t í m, že se tvoří heteropolymer 4 nebo více monomerních jednotek.
CZ20004858A 1998-06-25 1999-06-25 Sloučeniny získané z druhu Salvia mající protivirový účinek CZ20004858A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/104,363 US6037369A (en) 1998-06-25 1998-06-25 Compounds obtained from salvia species having antiviral Activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20004858A3 true CZ20004858A3 (cs) 2001-09-12

Family

ID=22300096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004858A CZ20004858A3 (cs) 1998-06-25 1999-06-25 Sloučeniny získané z druhu Salvia mající protivirový účinek

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6037369A (cs)
EP (1) EP1089747A1 (cs)
JP (1) JP2002518455A (cs)
KR (1) KR20010071580A (cs)
CN (1) CN1312722A (cs)
AU (1) AU740698B2 (cs)
BR (1) BR9912218A (cs)
CA (1) CA2335956A1 (cs)
CZ (1) CZ20004858A3 (cs)
HU (1) HUP0103398A2 (cs)
ID (1) ID28792A (cs)
IL (1) IL140483A0 (cs)
IS (1) IS5792A (cs)
MX (1) MXPA01000195A (cs)
NO (1) NO20006631L (cs)
PL (1) PL345086A1 (cs)
TR (1) TR200100450T2 (cs)
WO (1) WO1999066942A1 (cs)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994400A (en) * 1996-12-05 1999-11-30 Georgetown University School Of Medicine Extracts of salvia species having antiviral activity
US6043276A (en) * 1998-06-25 2000-03-28 Georgetown University School Of Medicine Compounds obtained from salvia species having antiviral activity
ATE304859T1 (de) * 2000-05-05 2005-10-15 Parsenn Produkte Ag Verwendung einer zubereitung zur topischen behandlung von durch virusinfektionen verursachten manifestationen
SG98409A1 (en) * 2000-06-21 2003-09-19 Chi Chiang Yang Pharmaceutical compositions and combinations for the treatment or prophylaxis of disorders related to hiv and retrovirus
JP2002020283A (ja) * 2000-06-22 2002-01-23 Yang Chi-Chiang Ｈｉｖおよびレトロウイルスに関連する障害の処置または予防のための薬学的組成物および組み合わせ
KR20020005222A (ko) * 2000-06-28 2002-01-17 치-치앙 양 Ｈｉｖ 또는 레트로바이러스에 관련된 질환의 치료 또는예방용 약학적 조성물 및 조합물
WO2002026726A2 (en) * 2000-09-26 2002-04-04 The Johns Hopkins University Antiviral compositions and methods of use
US20070027209A1 (en) * 2005-08-01 2007-02-01 Lee Hyun C Prevention and treatment of atherosclerosis with lithospermate B
WO2008117901A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University A method for isolation of high concentration of magnesium lithospermate b from salviae miltiorrhizae
KR20120006029A (ko) * 2009-03-30 2012-01-17 티안진 타슬리 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 신규한 화합물 살비아놀릭산 ｌ, 이의 제조방법 및 용도
CN101919836A (zh) * 2009-06-17 2010-12-22 山东绿叶天然药物研究开发有限公司 迷迭香酸的新用途
CN103054976B (zh) * 2011-10-21 2014-09-24 上海中医药大学 一种治疗血小板减少症的中药组合物及其制备方法和应用
CN103845403B (zh) * 2014-02-27 2016-10-05 河南大学 丹参配方颗粒在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用
CN104974119B (zh) * 2014-04-01 2018-10-19 中国科学院上海药物研究所 一种高纯度丹酚酸b镁及其制备方法
CN108042524A (zh) * 2017-12-21 2018-05-18 南方医科大学 丹酚酸b及其结构类似物在制备抗hpv病毒感染药物中的应用
CN109771410B (zh) * 2019-03-06 2020-11-24 湖北大学 紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途
CN109771407B (zh) * 2019-03-29 2021-11-26 成都医学院 迷迭香酸在制备抑制水痘-带状疱疹病毒的药物中的用途
CN110922286B (zh) * 2019-11-23 2022-08-16 上海化工研究院有限公司 一种非对称芳基取代富烯化合物及其制备方法与应用
JP7778685B2 (ja) * 2020-04-30 2025-12-02 富士フイルム富山化学株式会社 ピラジン誘導体と他のコロナウイルス感染症治療薬とを組み合わせてなるコロナウイルス感染症治療剤
CN114712342B (zh) * 2022-05-10 2023-04-21 湖北大学 紫草酸在制备抗流感病毒药物中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5178865A (en) * 1990-06-19 1993-01-12 Cedars-Sinai Medical Center Chinese herbal extracts in the treatment of hiv related disease in vitro
US5346695A (en) * 1991-03-27 1994-09-13 Tampa Bay Research Institute Methods of inhibiting HIV replication in vitro using polymers of p-hydroxylated cinnamic acids
US5994400A (en) * 1996-12-05 1999-11-30 Georgetown University School Of Medicine Extracts of salvia species having antiviral activity

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0103398A2 (hu) 2002-01-28
KR20010071580A (ko) 2001-07-28
AU740698B2 (en) 2001-11-15
CN1312722A (zh) 2001-09-12
IL140483A0 (en) 2002-02-10
IS5792A (is) 2000-12-22
CA2335956A1 (en) 1999-12-29
JP2002518455A (ja) 2002-06-25
PL345086A1 (en) 2001-12-03
AU4714999A (en) 2000-01-10
TR200100450T2 (tr) 2001-07-23
WO1999066942A9 (en) 2000-06-22
NO20006631L (no) 2001-02-26
EP1089747A1 (en) 2001-04-11
ID28792A (id) 2001-07-05
NO20006631D0 (no) 2000-12-22
WO1999066942A1 (en) 1999-12-29
BR9912218A (pt) 2002-07-23
MXPA01000195A (es) 2002-04-24
US6037369A (en) 2000-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20004858A3 (cs) Sloučeniny získané z druhu Salvia mající protivirový účinek
US6043276A (en) Compounds obtained from salvia species having antiviral activity
JPH05500824A (ja) Ｈｉｖ関連疾病の処置での漢方薬草抽出物
WO1990004968A1 (en) Inhibition of human retroviruses
CN113350330B (zh) 杨梅素类化合物在制备防治新冠肺炎药物中的应用
US20100278943A1 (en) Anti viral composition
CN101416958A (zh) 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的用途
US5994400A (en) Extracts of salvia species having antiviral activity
US5733904A (en) Method for prevention and treatment of viral infectious diseases for viral suppression
JP2725813B2 (ja) 芳香族多環式ジオンを含有する抗ウイルス性薬剤及びレトロウイルス感染治療方法
CN119424465A (zh) 核苷类似物在制备治疗湿地病毒病治疗药物中的应用
Tewtrakul et al. HIV-1 protease inhibitory effects of some selected plants in Caesalpiniaceae and Papilionaceae families
CN114903897B (zh) 千金藤素在制备抗蜱传脑炎病毒药物中的应用
CN103565970B (zh) 一种治疗艾滋病的地榆提取物及其制备方法
CN1634031A (zh) 治疗艾滋病的药物及其应用
CN1136844C (zh) β－硝基苯乙烯在制备抗艾滋病药物中的应用
CN108926588B (zh) 扶芳藤提取物及其制备方法和抗hiv应用
CN119055667A (zh) 高车前苷在制备防治艾滋病药物中的应用
WO2010064790A1 (ko) 항-ｈｉｖ-1 저해 활성을 갖는 감태 유래 플로로글루시놀 유도체
CN108125939B (zh) 治疗艾滋病毒感染后致神经炎症介导神经元损伤的药物
CN1122510C (zh) 一种治疗艾滋病的药物组合物及其用途
JPH0987193A (ja) ショウガ科植物の抽出物を含有する抗ヒト免疫不全ウイルス剤
TW202342082A (zh) 獲得密花豆(ssd)萃取物、其部分及組成物且使用來對抗病毒性疾病之方法
KR20240136030A (ko) 삼백초 추출물을 포함하는 코로나 바이러스 치료용 조성물
CN114099600A (zh) 水蜈蚣草在预防和治疗病毒感染中的应用