CZ2000681A3 - Oligonukleotidy dovolující identifikaci prekursorů amidovaných polypeptidových hormonů - Google Patents

Abstract

Oligonukleotidy ajejich použití jako sond pro identifikaci RNAm, která kóduje pro prekursory amidovaných polypeptidových hormonů, čímž identifikují nové amidované polypeptidové hormony. Olugonukleotidy s popsanou nukleotidovou sekvencí a způsob identifikace prekursorů amidovaných hormonů.

Description

Předložený vynález se vztahuje k novým o 1 igonuk1eoti dům a jejich použití jako sondy pro identifikaci mRNA, která kóduje prekursory amidovaných po Iypepti dových hormonů a k identifikaci nových amidovaných po 1ypepti dových hormonů. Vynález se tedy vztahuje k o 1 igonuk1eoti dům, u nichž je nukleotidová sekvence popsána níže a na metodu identifikace prekursorů hormonů.

Dosavadní stav techniky

Amidované po 1ypepti dové hormony jsou synteti sovány ve formě prekursorů, který podstupuje maturaci. Tato maturace spočívá v amidační reakci.

Amidační reakce C-konce je charakteristická reakce amidovaných po 1ypepti dových hormonů. Tato reakce, ke které dochází na prekursorů jednoho nebo více hormonů, dovoluje maturaci hormonu a také zajišťuje jeho biostabilitu ve fyziologickém mediu: vytvořená amidová skupina je méně zranitelná nežli volná kyselá funkce. Hormon je tedy odolnější ke karboxypeptidásám, zůstává v buňce aktivní po delší dobu a uchovává si optimální afinitu pro své receptorové místo.

Amidace byla široce popsána (Peptide amidation, Alan F. Bradbury a Derek G.Smyth, TIBS .16.: 112 až 115, březen 1991 Functional and structural characterisation of peptidylamidoglyco1 ate lyase, the enzyme catalysing the second step in peptide amidation, A.G.Katopodis, D.S.Ping, C.E.Smith

a S.W.May, Biochemistry, 30 (25): 6189 až 6194, červen 1991), a její mechanismus je následující:

~ štěpení prekursoru po 1ypepti dového řetězce hormonu endoproteásou u dvou základních aminokyselin, to jest argininu a/nebo lysinu,

- následně dochází ke dvěma štěpením karboxypeptidásou, což vede k protaženému meziproduktu glycinu, ~ enzym PAM (peptidy1~g1ycin-a~amidující monooxyganása) obsahuje dvě rozdílné enzymatické aktivity: za prvé, přeměňuje protažený meziprodukt glycinu na derivát a-hydroxyglyci nu, podjednotka enzymu PAM, která zásah provádí, je PHM (peptidyl-glycin-a-hydroxylující monooxygenása). Získaný derivát slouží jako substrát pro druhou podjednotku PAM (označená PAL: peptidy1-a-hydroxyg1ycin-a-amidující lyása), která fixuje aminovou funkci glycinu na aminokyselinu, bezprostředně přiléhá k boku N-termi ná 1 ní mu místu a uvolňuje g1yoxy1át.

Tato reakce vyžaduje přítomnost rozlišovacího místa na prekursoru hormonu nebo hormonů což je místo, které vždy obsahuje sekvenci: glycin a dvě základní aminokyseliny (arginin nebo lysin) (viz A.G.Katopodis a kol., Biochemistry, 30 (25), 6189 až 6194, červen 1991, a citované odkazy).

Je známo, že amidované po 1ypepti dové hormony, které mají být secerovány mimo endoplasmické retikulum, obsahují konsensuální signální sekvenci přibližně patnácti az třiceti aminokyse1 in, přičemž tato sekvence je přítomna na N-terminá1 ovém konci po 1ypepti dového řetězce. Později je rozříznuta signálem peptidásového enzymu, takže v již jednou secerovaném proteinu se již dále nenachází, (viz F.Cuttitta, The Anatomical Record, .236, 87 až 93 (1993) a v citovaných odkazech).

Nalezení nového proteinu není v současné době snadné. Proteiny mohou být isolovány a čištěny různými technikami: srážením v isoe1ektrickém bodě, selektivní extrakcí určitými rozpouštědly a poté čistěním krysta1 isací , protiproudou distribucí, adsorpcí, rozdělovači nebo ionexovou chromatografií, e1ektroforesou atd. Tyto techniky však předpokládají znalost vlastností proteinu, který má být isolován. Navíc, jestliže čistý vzorek nového proteinu, o který se jedná, je na terapeutické úrovni k disposici, stále ještě zbývá několik stupňů k tomu, nežli je k disposici geneticky modifikovaný mikroorganismus schopný ho synthet i sovat.

Způsob navržený předloženým vynálezem nabízí výhodu použitím charakteristické peptidové sekvence prekursoru všech dosud známých amidovaných hormonů, dovolující simultánní detekci několika nových hormonů této kategorie. Tento průzkum se provádí přímou identifikací nukleotidové sekvence, která kóduje uvedené prekursory v cDNA bankách připravených z tkání, ve kterých prekursory těchto hormonů mohou být syntet i sovány.

Průzkum pomocí tohoto způsobu je mnohem méně restrikční nežli výše uvedené běžně používané biochemické techniky protože:

- může vést k isolaci něko1 ika rozdí1ných prekursorů pří to mn ýc h ve stejné tkáni na základě stejného principu,

- dovoluje detekci prekursorů odpovídajících hormonům, majících při stejných technických podmínkách velmi rozdílné biochemické a biologické vlastnosti, ~ dovoluje průvodní identifikaci všech peptidových hormonů, které mohou být obsaženy ve stejném prekursoru.

Výsledkem tohoto vynálezu je, že dovoluje nikoli zanedbatelnou úsporu času a peněz v oblasti, kde náklady na výzkum a vývoj představují velmi vysoký podíl z obratu.

Předkládaný vynález rovněž dovolí far mako 1ogickou studii aktivních látek majících základní fyziologickou roli v organismu savců: hormonů a obzvláště amidovaných po 1ypepti dových neurohorrnonů. Vzhledem k tomu, že je poprvé k disposici aktivním látkám odpovídající cDNA, bude poté možné zavést pomocí genetického inženýrství klonovaný vektor, což povede k syntéze hormonů, majících terapeutické využití pomocí mikroorganismů.

Podstata vynálezu

Vynález se vztahuje nejprve na jednořetězcový o 1 igonuk1eotid OX, který může za mírných podmínek hybridizovat s o 1 i gonuk 1 eot i dem OY sekvence Y1 ~Y2--Y3~-Y4~Y5, kde Y1 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci od 1 do 12 nukleotidů nebo Y1 je potlačen, Y2 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje Gly, Y3 a Y4 nezávisle představují tri nuk 1eotid, který kóduje pro Arg nebo Lys a Y5 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci od 1 do 20 nukleotidů nebo je Y5 potlačen.

Pod pojmem nukleotid se rozumí monomerní jednotka RNA

nebo DNA mající chemickou strukturu fosforečného esteru nukleosidu. Nukleosid vzniká vazbou purinové báze (purin, adenin, guanin nebo analogy) nebo pyrimidinové báze (pyrimidin, cytosin, uracil nebo analogy) s ribosou nebo deoxyri bosou. 01 igonuk1eotid je polymer nukleotidů označující sekvenci primeru, sondu nebo fragment RNA nebo DNA.

Zmíněné o 1 igonuk1eotidy mohou bytí získány syntézou, existuje automatizovaná referenční metoda, která je popsána v následujících publikacích: DNA synthesis , S.A.Narang, Tetrahedron, 39, 3 (1983) a v Synthesis and use of synthetic oligonucleotides, K.Itakura, J.J,.Rossi a R.B.Wallace, Annu . Rev.Biochem., 53, 323 ( 1984) .

Přednostně OX může hybridizovat s OY za přísných podmí nek .

Výhodněji je možná hybridizace OX s o 1 igonukleoti dem OY sekvence Y2-Y3-Y4-Y5.

Ještě více je preferována možná hybridizace OX s o 1 igonuk1eotidem OY sekvence Y1“Y2-Y3-Y4 nebo Y2-Y3-Y4 .

Ve zvláštním případě může OX hybridizovat s oligonuk1eotidem OY tak, že Y5 představuje nuk 1eotidovou sekvenci Y6-Y7-Y8-Y9, ve které Y6 představuje trinukleotid, který kóduje pro Ser, Thr nebo Tyr, Y7 představuje trinukleotid, který kóduje pro jakoukoli aminokyselinu, Y8 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Glu nebo Asp a Y9 představuje nukleotidovou sekvenci obsahující 1 až 12 nukleotidů. Ve zcela zvláštním případě může OX hybridizovat s oligonukleotidem OY tak, že Y1 a Y9 jsou potlačeny.

V® zcela zvláštním případě může OX hybridizovat s o 1 igonukleoti dem OY, ve kterém Y2 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Gly, Y3 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Lys, Y4 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Arg a Y5 představuje sekvenci 3 nukleotidů, které kódují pro Ser—A1 a ~G1u.

Tato sekvence byla určena pomocí statistické studie 27 známých amidovaných míst a vedla k definici daného modelu aminokyselin na 6 polohách: G1y~Lys~Arg-Ser-Ala~G1u.

Vzhledem k degeneraci genetického kódu a kvůli vysokému počtu kodonů odpovídajících Gly (4 kodony), Arg (6 kodonů) a Ser (6 kodonů) byla sekvence o 1 igonuk1eotidu sestavena pomocí dvou postupů, které dovolují, aby tato degenerace byla vzata v úvahu:

- použití určitých poloh inosinu, což je nukleotid, ve kterém se dusíková báze hypoxanti nu váže náhodným způsobem se 4 dusíkovými bázemi, které doplňují DNA, ~ změna povahy na určitých místech včleněné dusíkové báze, čímž se vytváří řada kombinací o 1 igonuk1eotidů úměrná počtu různých zavedených bází.

Předkládaný vynález se rovněž vztahuje na o 1 igonuk1eotid OY obsahující 9 až 42 nukleotidů sekvence Y1 “Y2~-Y3~Y4“Y5, kde Y1 představuje nukleotid sekvence 1 až 12 nukleotidů nebo Y1 je potlačen, Y2 představuje trinukleotid, který kóduje pro Gly, Y3 a Y4 nezávisle představují tri nuk 1eotid, který kóduje pro Arg nebo Lys a Y5 představu je nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 21 nukleotidů nebo Y5 je potlačen.

Vynález se přednostně vztahuje na o 1 igonuk1eotid OY tak, že Y1 je potlačen nebo tak, že Y5 je potlačen.

Vynález se zvláště vztahuje na o 1 igonuk1eotid OY tak, že Y5 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci Y6-Y7-Y8-Y9, ve které Y6 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Ser, Thr nebo Tyr, Y7 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro jakoukoli aminokyselinu, Y8 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje Glu nebo Asp a Y9 představuje nuk 1eotidovou sekvenci, obsahující 1 až 12 nukleotidů.

Vynález se obzvláště vztahuje na o 1 igonuk1eotid OY tak, že Y1 a Y9 jsou potlačeny.

Ve zcela zvláštním případě se vynález vztahuje na o 1 igonuk1eotid OY vyznačující se tím, že Y1 je potlačen, Y2 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Gly, Y3 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Lys, Y4 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Arg a Y5 představuje sekvenci tří trinukleotidů, která kóduje pro

Ser-A1 a —G1u.

Předložený vynález se rovněž vztahuje na jednořetězový o 1 igonuk1eotid 02 vyznačující se tím, že obsahuje 15 až 39 nukleotidů a je schopen hybridizace s konsensuální signální sekvencí charakteristickou pro amidované po 1ypepti dové hormony, přičemž uvedená sekvence má vzorec 21-22-Z3-24-2526-27, ve kterém 21 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo je 21 potlačen, 22 a 23 představují dva tri nuk 1eotidy, které kódují pro Leu, 24 a 25 představují dva tri nuk 1eotidy, které kódují pro kterékoliv dvě aminokyse1 iny, 26 představuje trinukleotid, který kóduje pro Leu a 27 představuje nuk 1eotidovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo je potlačen.

V tomto vynálezu budou pod pojmem hormon uvažovány amidované po 1ypeptidové hormony endokrinního systému a obzvláště neurohormony.

Konsensuální signální sekvence je sekvence nesená prekursory proteinů, které jsou secerovány buňkami po jejich maturac i.

Konečně se předkládaný vynález vztahuje na skupinu oligonukleotidů OX nebo 02, která vytváří kombinatoriá1 ní kni hovnu.

V popsaném vynálezu se pod pojmem kombinatoriá1 ní knihovna rozumí skupina o 1 igonuk1eotidů syntetizovaná takovým způsobem, že za model se bere nukleotidová sekvence, která kóduje pro sekvenci aminokyselin, z nichž některé se mohou měnit. Z důvodu degenerace genetického kódu se získá skupina různých o 1 igonuk1eotidů.

Vynález se rovněž vztahuje na způsob identifikace peptidového prekursoru majícího amidovaný C-~termi ná 1 o vý konec, vyznačující se následujícími postupnými stupni:

1- Získání DNA banky,

2™ Hybridizace jednoho nebo více o 1 igonuk1eotidu pomocí dané DNA banky,

3~ Identifikace sekvence nebo sekvencí DNA dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eotidem OX,

4™ Identifikace v této sekvenci nebo v těchto sekvencích jednoho nebo více peptidů s možným amidovaným Ckoncem.

Bude upřednostněn takový způsob, že DNA banka je banka cDNA.

Komplementární DNA (cDNA) je nukleotidový řetězec, jehož sekvence je komplementární se sekvencí mRNA. Reakce, vedoucí k jednořetězcové cDNA, je katalysována inversní transkriptásou. Dvouřetězcová cDNA může být získána účinkem DNA polymerásy, je poté vložena pomocí ligásy do plazmidu nebo vektoru odvozeného od bakteriofágu lambda.

Banka cDNA obsahuje cDNA odpovídající cytoplasmickým mRNA extrahovaným z dané buňky. Buňka se nazývá kompletní, jestliže obsahuje alespoň jeden bakteriální klon pro každou počáteční mRNA.

K hybridisaci dochází jestliže dva o 1 igonuk1eotidy mají značně komplementární sekvence nukleotidů a mohou se spojovat po jejich délce tím, že vytvářejí mezi komplementárními bázemi vodíkové můstky.

Zvláště bude preferován takový způsob, při kterém o 1 igonuk1eotid OX může být zjištěn pomocí značkovacího činidla, jako ³²P nebo digoxigen i nu.

Činidla, nejčastěji používaná pro radioaktivní značení, jsou prvky emitující β-paprsky, například ³H, ¹²Q, ³²P, ³³P a ³»S.

Značení o 1 igonuk1eotidů se provádí vnesením fosfátové o

skupiny nesené ( gamma-³² P)-ATP na svůj 5' konec, tato reakce je katalysována enzymem T4-po1ynuk1eoti dovou kinásou. Značení pomocí digoxigeninu je imunoenzymatické, digoxigenin je připojen k dusíkové bázi a začleněn do o 1 igonuk1eotidu. Jeho přítomnost se projeví použitím protilátky namířené proti digoxigeninu a připojené k alkalické fosfatáse. Přítomnost se projeví použitím barvy vyvolané substrátem hydro 1ysováným alkalickou fosfatásou.

Mohou být použity jiné techniky značení: o 1 igonuk1eotidy modifikované chemicky tak, že obsahují komplexní kovové činidlo (často se užívají komplexy lanthanidu), skupina obsahující biotin nebo ester akridinu, fluorescenční látka (fluorescein, rhodamin, Texasová červeň) nebo jiné.

Způsob identifikace prekursoru amidovaného polypeptidového hormonu, který ve stupni hybridizace používá kombinatoriální knihovny o 1 igonuk1eotidů OX, bude obzvláště preferován.

Vynález se rovněž vztahuje na způsob identifikace peptidového prekursoru mající amidovaný C-konec, který se skládá z následujících stupňů:

získání banky DNA, použití techniky PCR pro amplifikací fragmentu o který je zájem pomocí skupiny o 1 igonuk1eotidů OX a jiné skupiny oligonukleotidů OZ, identifikace DNA sekvence dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eoti dem OX a která byla amp 1 ifikována reakcí PCR,

1

identifikace v této sekvenci jednoho nebo více peptidů s možným amidovaným C-koncem.

Pod pojmem fragment, o který je zájem, se rozumí cDNA sekvence, která kóduje pro prekursor jednoho nebo více amidovaných po 1 ypepti dových hormonů.

Reakce amplifikace DNA pomocí PCR (polymerase chain reaction - řetězová reakce polymerásy) vyžaduje přípravu DNA denaturované zahříváním při 95 °C. Tento preparát je poté spárován s přebytkem dvou komplementárních o 1 igonuk1eotidů na protilehlých řetězcích DNA na obou stranách sekvence, která má být amp 1 ifikována. Každý o 1 igonuk1eotid slouží poté jako primer pro polymerásu DNA (extrahované z termofilní bakterie typu Thermus aquatis: Tag polymerása) pro kopii každého z řetězců DNA. Tento cyklus může byt automatickým způsobem opakován následnými denaturacemi-renaturacemi.

Existuje mnoho odkazů podrobně popisujících PR.C protokoly: US patent č. 4 683 192, 4 683 202, 4 800 159 a 4 965 188, PCR technology: principles and applications for DNA amplification, H.Erlich, vyd. Stockton Press, New York (1989) a PCR protocols: a guide to methods and applications, Innis a koi., vyd. Academic Press, San Diego, Kalifornie (1990).

Daná DNA banka je přednostně cDNA banka.

Výhodněji může být řečený o 1 igonuk1eotid OX zjištěn pomocí značkovacího činidla, jako je například ³²P nebo d i goxi gen i n.

2

Obzvláště bude upřednostněn způsob identifikace prekursorů amidovaného po 1ypepti dového hormonu vyznačující se tím, že stupeň amplifikace používá kombinatoriá1 ní knihovnu o 1 igonuk1eotidů OX a další kombinatoriá1 ní knihovnu oligonukleotidů 02.

Vynález se rovněž vztahuje na způsob identifikace peptidového prekursorů majícího amidovaný C-terminá1 ový konec, který obsahuje následující stupně:

získání banky DNA, použití techniky PCR pro amplifikací fragmentu, o který je zájem, pomocí skupiny oligonukleotidů OX, identifikace DNA sekvence, dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eoti dem OX a která byla amp 1 ifikována PCR. reakcí, identifikace v této sekvenci jednoho nebo více peptidů s možným amidovaným C--koncem.

Cílem tohoto způsobu je charakter isovat nukleotidové sekvence, které kódují pro prekursory obsahující více nežli jedno amidované místo.

DNA banka je přednostně cDNA banka.

Výhodněji může být daný o 1 igonuk1eotid OX zjištěn pomocí značkovacího činidla, jako je ³²P nebo digoxigenin.

Obzvláště bude upřednostněn způsob identifikace prekursorů amidovaného po 1ypepti dového hormonu vyznačující se

3

tím, že amplifikační stupeň využívá kombinatoriá1 ní knihovnu o 1 igonuk1eotidů OX.

Jiný způsob identifikace prekursoru polypeptidu obsahujícího amidovaný C-terminá1 ový konec, navržený předkládaným vynálezem, je char aktér i so ván následujícími stupn i:

získání banky DNA, použití techniky PCR. pro amplifikaci fragmentu, o který je zájem, pomocí o 1 igonuk1eoti du OX a dalšího jednořetězcového o 1 igonuk1eotidu schopného za mírných nebo přísných podmínek hybridizace s universální konsensuální sekvencí obsaženou v sekvenci plazmidového vektoru, ve kterém jsou DNA dané DNA banky klonovány, jako například primery T3, T7, KS, SK, M13, Reverse, identifikace DNA sekvence dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eotidem OX, identifikace v této sekvenci jednoho nebo více peptidů s možným amidovaným C~terminá1 ovým koncem.

Universální konsensuální sekvence je sekvence nesená vektorem, ve kterém je DNA banky klonována. Tato sekvence může sloužit jako primer pro sekvencování. Sekvence nukleotidů těchto primerů jsou k disposici v J.Sambrook, E.F.Fritch, T.Maniatis, ” Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, 1989, Colei Spring Harbor Laboratory Press.

PCR reakce vyžaduje, aby dva o 1 igonuk1eotidy byly

fixovány na cDNA klonované ve vektoru, aby došlo k její amp 1 ifikaci . V případě, kde je známa pouze jediná sekvence náležející fragmentu DNA, který má být amp 1 ifi kován, je řešením pro překonání tohoto problému použití oligonukleotidu, který může hybridizovat s nuk 1eoti dovou sekvencí náležející vektoru, ve kterém byla cDNA klonována jako je universální konsensuální sekvence.

Daná DNA banka je přednostně banka cDNA.

Bude upřednostněn o 1 igonuk1eotid OY, který může být zjištěn pomocí značkovací ho činidla jako je ³² P nebo d i g o x i g e n i n ..

Obzvláště bude upřednostněn amplifikační stupeň používající konsensuální knihovnu o 1 igonukleotidů OX.

Příklady provedení vynálezu

Způsob popsaný ve vynálezu byl prohlášen platným jeho aplikací na již isolovaný hormon. Vybraný neurohormon je cholecystokinin (CCK), což je neuromediátor, který je kvantitativně v mozku nejvíce zastoupen.

1.1. Příprava matrice DNA sloužící pro reakce PCR z komerční banky Lambda Zapp II (Rat Brain cDNA Library Vector ref. číslo 936 501) ze STRATAGENE (Lafolla, USA).

Tato Stratagene cDNA banka obsahuje klony cDNA z buňek krysího mozku.

1.1.1 . Uvolnění klonované cDNA ve formě fagemidů Bluescript (Stratagene, Lajolla, USA)

Toto se provádí podle následujícího protokolu: 250 μΐ banky cDNA o koncentraci 2.10® PFU/ml, 200 μΐ XL modré bakterie (genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi~1hsdR17 supE44 relA1 lac/F'proAB lacPZ/X M1 5Tn 1 0( Tet^r ) /^c ~ srovnej Bullock, Fernandez, Short, Biotechniques, 5, 376 až 379 (1987) - optická hustota při 600 nm: OD - 2,5) a 1 μΐ tágu ExAssist™ (viz B.Hay, J.Short, Strategies, 5, 16 až 18 (1992)) o koncentraci 1O¹⁰ PFU/ml jsou uvedeny do kontaktu po dobu 15 minut při 37 °C. Celý systém je poté inkubován na 50 ml LB media (složení: směs 10 g chloridu sodného, 5 g kvasnicového extraktu a 10 g Bactotryptonu na 1 litr sterilní fyziologické vody) po dobu 3 hodin při 37 ⁰ C.. Kultura živné půdy je odstředěna a supernatant je poté aktivován zahříváním při 70 °C po dobu 20 minut.

1.1.2 Získání cDNA ve formě dvouřetězové plazmidové banky

Tento stupeň vyžaduje při teplotě 37 °C 15 minut, inkubace 100 μΐ i naktivováného supernatantu a 200 μΐ SOLR™ bakterie (genotyp: e14'(McrA') /\ (mcrCB-hsdSMR-mrr)171 sbsC recB recd uvrC umuC::Tn5 (Kan^lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1 lambda^/F' proAB lacPZ/X M15/^c Su' (nepot1ačující), viz B.Hay, J.M.Short, Strategies 5(1), 16 až 18 (1992) ~ OD = 1 až 600 nm). Po přidání 50 μΐ ampicilinu (o koncentraci 100 mg/ml) a 50 ml LB media, byl celý systém za stálého míchání inkubován po jednu noc při teplotě 37 °C. Plazmidy byly připraveny z 50 ml kultury s použitím QIAGEN Plasmid Midi Kit protokolu a sloupci z QIAGENu (sloupce QIAGEN obsahují aniontový iontoměnič s kladně nabitými diethylamino~ ethanolovými skupinami na svém povrchu, které navzájem reagují s fosfáty skeletu DNA). Takto byl získán roztok DNA o koncentraci 1,37 pg/μΐ.

6

1.2. Amplifikace části prekursoru CCK z takto připravené plazmidové banky

1.2.1. Vytvoření sekvencí dvou o 1 igonukIeotidů potřebných pro PCR reakci

Jeden z těchto dvou nukleotidů bude obsahovat sekvenci komplementární k té, která kóduje pro amidované místo CCK, které je známé a má sekvenci G1y~Arg-Arg-Ser~A1a~G1u. Tento o 1 igonuk1eotid, který bude nazván oligo CCK amid, má jako svoji nuk 1eotidickou sekvenci:

5'CTCAGCACTGCGCCGGCC 3'

Druhý o 1 igonuk1eotid, nazvaný oligo CCK 5', odpovídá konsensuální signální sekvenci:

5'GTGTGTCTGTGCGT6GTG 3'

Velikost očekávaného produktu amplifikace je 315 párů bází, což je vzdálenost mezi sekvencemi, která odpovídá těmto dvěma o 1 igonuk1eoti dům na prekursoru sekvence CCK.

1.2.2. P C R reakce

Připraví se zředěný roztok D1 obsahující 1 μΐ enzymu Taq polymerásy Goldstar 5 U/μΙ (viz P.Reynier, J.F.Pe11 issier, J.R.Harle, Y.Malthiéry, Biochemical and Biophysical Research Communications, 20.5 (1), 375 až 380 ( 1994)) , 1 μΐ pufru 10-krát koncentrovaného ve standartní Taq polymerase a 8 μΐ vody.

Poté se smísí 1 μΐ oligo CCK 5' o koncentraci 250 ng/μΐ, 1 μΐ oligo CCK amidu o koncentraci 250 ng/μΐ, 1 μΐ dNTP o koncentraci 10 mM každý, 1 μΐ banky cDNA o koncentraci 250 ng/μΐ, 5 μΐ pufru koncentrovaného 10~krát v enzymu Taq polymerásy, 2 μΐ chloridu horečnatého o koncentraci 25 mM, 1 μΐ zředěného roztoku D1 a 37 μΐ vody.

Podmínky amplifikace jsou následující: nejprve se provede tepelné zpracování po dobu 5 minut při teplotě 95 °C, poté se opakuje 30 cyklů. Denaturace se provede při 95 °C po dobu 45 sekund, hybridisace při 60 °C po dobu 30 sekund a prodloužení po dobu 1 minuty při teplotě 72 °C. Nakonec se při teplotě 72 °C a po dobu 10 minut provede doplňkový cyklus s prod 1 o úžení m.

1.2.3. Výsledky

Výsledky se čtou migrací na 0,8 % gelu agarosy z 1/10 produktu PCR. reakce. V přítomnosti 3,8™di ami no-5~ethyl -6“ -íeny1fenanthridiniumbromidu (ethidiumbromidu) je na gelu visualizován jeden intensivní pás o rozměru nepatrně větším nežli značkovací látka o molekulové hmotnosti 300.

1.3 Subklonování produktu PCR do vektoru dovolující sekvencování

Použitý vektor je pGEM T-easy Vektor (dodávaný PROGEMA Corporation, Madison, USA, ref . označení A 1380 ~ sekvence udána v příloze I). Etapy jsou následující:

- čištění pásu odpovídajícího produktu PCR elektroelucí,

- ligace po jednu noc při 16 °C s 1 μΐ vektoru pGEM T-easy při 50ng/pl a 1 μΐ pufru používaného při ligaci 1O~krát koncentrovaného.

- extrakce 3 μΐ produktu z vyčištěného pásu odhadovaného na 20ng/pl, ~ doplnění vodou na 10 μΐ.

Bakterie JM 109 (genotyp: e14-(McrA) recA1 endA1 gyrA96 thi~1 hsdR17(rk“mk+) supE44 relA1 ,A( 1 ac-pr o AB) /F ' traD36 proAB 1 aď’ Z.Z.\M1 5/-vi z C . Yan i sh-Perron, J.Viera, J.Messing, Gene, 33, 103 až 199 (1985)) se staly kompetenční předchozím zpracováním s chloridem vápenatým a poté pomocí termálního šoku trvajícího 45 sekund transformovány při 45 »C s 1/5 ligační směsi. Buňky byly poté kultivovány přes noc v mediu LB-ampici 1 i nu v Petriho misce při teplotě 37 °C.

Připraví se plazmidy DNA rekombinací několika klonů.

Subklonování se potom ověří enzymatickou digescí s Eco RI.

1.4 Sekvence vání

Provádí se klasickou technikou dideoxynuk1eotidů SANGER na vektoru pGEM T-easy Vector, přičemž došlo k začlenění 315 párů bází produktu PCR (připraven ve velkém měřítku použitím soupravy QIAGEN tip 100). Primer použitý pro sekvencování je universální o 1 igonukleotid T7 přítomný na plazmidu pGEM

T-easy Vector.

1.5 Výs1edek

Byly získány následující hrubé sekvence

GTG TGT CTG TGC GTG GTG ATG GCA GTC CTG GCA GCA GGC GCC CTG GCG CAG CCG GTA GTC CCT GTA GAA GCT GTG GAC CCT ATG GAG CAG CGG GCG GAG GAG GCG CCC CGA AGG CAG CTG AGG GCT GTG CTC CGA CCG GAC AGC GAG CCC CGA GCG CGC CTG GGC GCA CTG .CTA GCC CGA TAC ATC CAG CAG GTC CGC AAA GCT CCC TCT GGC CGC ATG TCC GTT CTT AAG AAC CTG CAG GGC CTG GAC CCT AGC CAC AGG ATA AGT GAC CGG GAC TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTC GGC CGG CGC AGT GCT GAG

Z překladu sekvence získané v aminokyselinách vyplývá :

VCLCVV MAVLAAGALA QPVVPVEAVD PMEQRAEEAP

RRQLRAVLRP DSEPRARLGA 'LLARYIQQVR KAPSGRMSVL

KNLQGLDPSH RISDRDYMGW MDFGRRSAE což umožňuje snadno nalézt nuk 1eoti dovou sekvenci prekursoru OCR (sekvence, která byla poskytnuta švýcarskou databankou Swiss prot no. p 0 1 3 5 5) .

Zkratky aminokyselin jsou následující:

A1 a n i n	A	Leuc i n	L
Ar g i n	R	Lys i n	K
Kyselina aspartová	D	Methi on i n	M
Asparag i n	N	Fenylalanin	F
Cystein	C	Pro 1 in	P
Kysel i na g1utamová	E	Serin	S

G1utami η	Q	Threon i n	γ
G1 yc i η	G	Tryptofan	w
Hi st i d i η	H	Tyros i n	Y
I so 1euc i η	I	Valin	v

Claims (25)

1 až 7 nebo oligonukleotidů 02 podle nároku 14, vyzna čující se t í m, že vytváří kombinatoriá1 ní knihovnu.

1. Jednořetězcový o 1 igonuk1eotid OX, vyznačuj í c í se t í m, že obsahuje 9 až 42 nukleotidů a za mírných podmínek je schopen hybridizace s o 1 igonuk1eoti dem OY sekvence Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, ve které Y1 představuje nuk 1eotidovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo Y1 je potlačen, Y2 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Gly, Y3 a Y4 nezávisle představují trinukleotid, který kóduje pro Arg nebo Lys a Y5 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 21 nukleotidů nebo je Y5 potlačen.

2 4

2. Ol igonukleotid OX podle nároku 1 , v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje 9 až 42 nukleotidů a je za přísných podmínek schopen hybridizace s o 1 igonuk1eoti dem OY sekvence Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, ve které Y1 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo je Y1 potlačen, Y2 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Gly, Y3 a Y4 nezávisle představují tri nuk 1eotid, který kóduje pro Arg nebo Lys a Y5 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 21 nukleotidů nebo je Y5 potlačen.

3. , 01 i gonukl eot i d OX podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že Y1 ie potlačen v o 1 igonuk1eotidu OY.

4. 01 igonukleotid OX podle nároku 1, 2, nebo 3, vyznačující se t í m, že Y5 je potlačen v o 1 igonuk1eotidu

OY.

5. 01 igonukleotid OX podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačující se t í m, že Y5 představuje v OY nuk 1eoti dovou

sekvenci Y6-Y7-Y8-Y9, ve které Y6 představuje trinukleotid, který kóduje pro Ser, Thr nebo Tyr, Y7 představuje trinukleotid, který kóduje pro kteroukoliv aminokyselinu, Y8 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Glu nebo Asp a Y9 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci obsahující 1 až 12 nukleotidů.

6, . 01 igonukleotid OX podle nároku 5, vyznačující se tím, že Y1 a Y9 jsou v o 1 i gonuk 1 e ot i du OY potlačeny..

7. 01 igonuk1eotid OX podle nároku 6, vyznačující se tím, že může hybridizovat s daným o 1 igonukleotidem OY, ve kterém Y2 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Gly, Y3 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Lys, Y4 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Arg a Y5 představuje sekvenci tří tri nuk 1eotidů, které kódují pro Ser A 1 a —G 1 u .

8. dednořetězcový o 1 igonuk1eotid OY, vyznačuj í cí se t í m, že obsahuje 9 až 42 nukleotidů sekvence Y1“Y2-Y3-Y4-Y5, ve které Y1 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo je Y1 potlačen, Y2 představuje trinukleotid, který kóduje pro Gly, Y3 a Y4 nezávisle představují trinukleotid, který kóduje pro Arg nebo Lys a Y5 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 21 nukleotidů nebo je Y5 potlačen.

9. 01 igonukleotid OY podle nároku 8, vyznačující se t í m, že Y1 je potlačen.

10. Ol igonukleotid OY podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se t í m, že Y5 je potlačen.

11. 01igonuk1eotid OY podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se t í m, že že Y5 představuje nuk 1eotidovou sekvenci Y6-Y7-Y8-Y9, ve které Y6 představuje trinukleotid, který kóduje pro Ser, Thr nebo Tyr , Y7 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro kteroukoliv aminokyselinu, Y8 představuje tri nuk 1eotid, který kóduje pro Glu nebo Asp a Y9 představuje nuk 1eotidovou sekvenci obsahující 1 až 12 nukleotidů.

12. 01 igonukleotid OY podle nároku 11, vyznačují c í s e t í m, že Y1 a Y9 jsou potlačeny.

13. 01 igonukleotid OY podle nároku 12, vyznačují c í se tím, že Y2 představuje trinukleotid kódující Gly, Y3 představuje trinukleotid, který kóduje pro Lys, Y4 představuje trinukleotid, který kóduje pro Arg a Y5 představuje sekvenci 3 tri nuk 1eotidů, které kódují pro Ser-Ala-G1u.

14. Jednořetězcový o 1 igonuk1eotid 02, vyznačující se t í m, že obsahuje 15 až 39 nukleotidů a je schopen za mírných nebo přísných podmínek hybridizace s konsensuální signální sekvencí charakteristickou pro amidované po 1ypepti dové hormony, přičemž daná sekvence má vzorec 2 1-22-23-24-25-26-27, ve kterém 21 představuje nuk 1eoti dovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo je 21 potlačen, 22 a 23 představují dva tri nuk 1eotidy, které kódují pro Leu, 24 a 25 představují dva tri nuk 1eotidy, které kódují pro kterékoli dvě aminokyseliny, 26 představuje trinukleotid, který kóduje pro Leu a 27 představuje nukleotidovou sekvenci 1 až 12 nukleotidů nebo je 27 potlačen.

15. Skupinu o 1 igonuk1eotidů OX podle kteréhokoliv z nároků

16. 2působ identifikace peptidového prekursorů mající amidovaný C~terminá1 ový konec, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující postupné stupně:

~ získání banky DNA,

- hybridizaci jednoho nebo více oligonukleotidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 s danou DNA bankou,

- identifikaci DNA sekvence nebo sekvencí dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eotidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 a

- identifikaci v této sekvenci nebo sekvencích jednoho nebo více peptidových prekursorů s možným amidovaným C-~termi ná 1 ovým koncem.

17. 2působ podle nároku 16, vyznačující se t í m, že hybridizační stupeň používá kombinator iá1 ní knihovnu podle nároku 15.

18. Způsob identifikace peptidového prekursorů majícího amidovaný C—terminá1ový konec vyznačuj í cí ho se t í m, že zahrnuje následující postupné stupně:

- získání banky DNA,

- použití techniky PCR pro amplifikaci fragmentu, o který je zájem, pomocí skupiny oligonukleotidů podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 a jiné skupiny oligonukleotidů

podle nároku 14,

- identifikace DNA sekvence nebo sekvencí dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eotidem podle kterékokoli z nároků 1 až 7 a

- identifikace v této sekvenci nebo sekvencích jednoho nebo více peptidových prekursorů s možným amidovaným C-terminá1ovým koncem.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se t í m, že amplifikační stupeň používá kombinatoriá1 ní knihovny podle nároku 15.

20. Způsob pro identifikaci peptidového prekursoru, mající amidovaný C~terminá1 ový konec, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující stupně:

- získání banky DNA,

- použití techniky PCR pro amplifikaci fragmentu, o který je zájem, pomocí skupiny o 1 igonuk1eotidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 7,

- identifikace DNA sekvence nebo sekvencí dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eotidem podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 a ~ identifikace v této sekvenci nebo sekvencích jednoho nebo více peptidových prekursorů s možným amidovaným C-terminá1ovým koncem.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačuj í cí

t í m, že amplifikační stupeň používá kombinatoriá1 ní knihovnu podle nároku 15 ..

22. Způsob identifikace po 1ypepti dového prekursoru majícího amidovaný C-terminá1ový konec, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující stupně:

™ získání banky DNA,

- použití techniky PCR pro amplífikaci fragmentu, o který je zájem, pomocí o 1 igonuk1eotidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 a jiného jednořetězcového o 1 igonukleotidu schopného, za mírných nebo přísných podmínek, hybridizace s universální konsensuální sekvencí, která je obsažena v sekvenci plasmidového vektoru, ve kterém je cDNA dané DNA banky klonována, jako jsou primery T3 , T7, KS, SK, M13 a Reverse,

- identifikace DNA sekvence dané banky, která hybridizuje s o 1 igonuk1eotidem podle kteréhokoli z nároků 1 a ž 7 a ~ identifikace v této sekvenci jednoho nebo více peptidových prekursorů s možným amidovaným C-terminá1 ovým koncem.

23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se t í m, že amplífikační stupeň používá kombinatoriá1 ní knihovnu podle nároku 15.

24. Způsob podle kteréhokoli z nároků 16 až 23, vyznačující se t í m, že DNA banka je cDNA banka.

25. Způsob podle kteréhokoli z nároků 16 až 24, vyznačující se t í m, že jednořetězový o 1 igonuk1eotid může být zjištěn pomocí značkovacího činidla, jako je ³²P nebo di goxi gen i n.