CZ2000729A3 - Způsob detekce látek v biologickém vzorku a zařízení k provádění způsobu - Google Patents

Abstract

Způsob se týká detekce fyziologických změn u lidí a jiných savců monitorováním a detekcí změn v koncentraci různých složek krve. Koncentrace analytu se konkrétně určuje imobilizací analytu v médiu s první protilátkou, která má specifickou afinitu k analytu, značením analytu detckovatelnou druhou protilátkou a použitím spektrofotometrických, kolorimetrických a fluorimetrických metod analýzy pro výpočet koncentrace. Zařízeni sestává z reflektačního spektrofotometru s diodou (LED) (155) emitující světlo, časovače (136), fotodetektorů (151, 152), signálového procesoru (150) a prostředku pro přijímání testovacího proužku (110).

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně způsobu a zařízení pro detekci a kvantitativní stanovení analytů v biologických vzorcích.

Konkrétněji se vynález týká způsobu a zařízení pro stanovení hladin hormonů v krvi, včetně bez omezení luteinizačních hormonů (LH), estradiolu, hormonu stimulujícího folikuly (FSH), thyreostimulačního hormonu (TSH) a/nebo progesteronu. Navíc se vynález týká detekce a stanovení endokrinních dysfunkcí u lidí a jiných savců.

Dosavadní stav techniky

Fyziologické změny u lidí a jiných savců jsou často doprovázeny změnami v koncentraci různých krevních složek. Například ovulaci u žen a jiných savců předchází změny plazmatické koncentrace is luteinizačního hormonu (LH) v krvi. V současnosti jsou jediné komerčně dostupné testy používané pro detekci tohoto kolísání založeny na moči. Testy prováděné v moči mají několik nevýhod. Jsou nepohodlné a často nepříjemné a, co je ještě důležitější, nejsou tak přesné jako testy prováděné v krvi. Pro nahromadění detekovatelné koncentrace luteinizačního hormonu v moči musí být hormon uvolněn podvěskem mozkovým, cirkulovat v krvi, být oddělen v ledvinách a nakonec vyloučen. Ukončení těchto procesů může trvat až 12 hodin od skutečné změny v plazmě až do nahromadění dostatečného množství LH v moči. Protože ovulace následuje po změně koncentrace

LH po 12 až 18 hodinách, v době, kdy uživatel „předpovídá její výskyt použitím močového testu, by již mohla probíhat. Toto zpoždění podstatně zmenšuje období plodnosti, které obvykle trvá pouze několik dní a eliminuje možnost použití těchto testů pro antikoncepční účely. Navíc tyto jednotky nezobrazují kvantitativní výsledky; spíše ukazují,

9 • · · · 9 9 · * * «99 999 99 999 9 · 99

-2že koncentrace LH v plazmě je vysoká nebo nízká (normální), což je vlastnost, které tyto metody vylučují z použití u žen, jejíchž maximální koncentrace LH není tak vysoká jako u průměrných žen, na kterých se močové testy kalibrují.

Nejpřesnější způsob detekce změn koncentrace LH je krevní test. Teoreticky může být známa koncentrace LH téměř okamžitě, což maximalizuje reprodukční období ženy. V současnosti jsou však výsledky klinických krevních testů k dispozici teprve po 12 až 24 hodinách a jejich použití vylučuje i vysoká cena (typicky 90 dolarů). Je io proto velmi žádoucí vyvinout metodu a zařízení, které budou detekovat plazmatické koncentrace luteinizačního hormonu a jiných hormonů účastnících se reprodukce u ženy, a které budou mít příznivější cenu a poskytovat včasnější výsledky.

Bazální hladiny estradiolu a FSH v plazmě používají lékaři zabývající se plodností pro stanovení možnosti úspěchu oplodnění in vitro (in vitro fertilization IVF). Bazální koncentrace estradiolu se stanoví třetí den cyklu, kdy by jeho koncentrace měla být na nejnižší úrovni. Studie ukázaly, že jestliže byla koncentrace estradiolu třetí den vyšší než 75 pg/ml, nenastávala žádná úspěšná těhotenství IVF.

Jestliže byla koncentrace estradiolu vyšší než 45 pg/ml a koncentrace hormonu stimulujícího folikuly (FSH) vyšší než 17 IU/l, nenastala také žádná úspěšná těhotenství IVF. Jestliže jsou jak základní koncentrace estradiolu, tak i koncentrace FSH nízké (méně než 46 pg/ml, popřípadě 18 IU/l), potom může být IVF úspěšné z 33,8 % doby. Bylo pozorováno, že bazální hladiny FSH a hladiny estradiolu získané současně třetí den menstruačního cyktu jsou nezbytné testy pro určení rezervy vajíček ve vaječníku u neplotných pacientů. Termín „rezerva vajíček ve vaječníku“ odráží budoucí schopnost vaječníků produkovat životaschopná vajíčka. Primární důvod zvýšení hladin FSH spočívá v tom, že folikuly nedozrávají jako odpověď na hormonální stimulaci podvěskem mozkovým. Výsledkem je, že podvěsek vylučuje větší množství FSH. Nedostatečná odezva potom vede k nepřítomnosti

0 • 0 0 0 0 0 · · · 0 0

0 00 0 0000 • 0« «·· 0· 000 0· 00

- 3 životaschopných vajíček ve vaječnících, což sebou přináší špatnou prognózu pro další těhotenství.

Podobně může být diagnostikována monitorováním různých hormonů příčina neplodnosti u konkrétních pacientů. Zvýšené hladiny bazálního FSH indikují vyčerpání vaječníků, což poskytuje špatnou prognózu. V jiných případech však není neplodnost spojená s fungováním samotného reprodukčního systému. Například porušení koncentrace thyreostimulačního hormonu (TSH) může způsobit dysfunkci jinak zdravého reprodukčního systému. V případě, že se io zjistí, že problém způsobuje sekundární příčina jako je thyroidní dysfunkce, léčba může být vysoce úspěšná. Méně nákladná metoda pro screening pacientů na funkci štítné žlázy umožní lékařům provádět častější sledování většího počtu neplodných žen.

Další oblastí, kde může být s úspěchem použita ekonomičtější a účinnější metoda detekce a kvantifikace množství různých hormonů jsou defekty luteální fáze, které postihují 1 až 3 % neplodných párů a jednu třetinu žen se spontánním potratem. Luteální fáze období v normálním menstruačním cyklu potom, co ovum praskne, ale před menstruací. Nedostatečná produkce estradiolu, progesteronu, a/nebo

2o LH během této doby zabrání správnému vývoji endometria a ova, což znemožní implantaci. Jestliže lékař zjistí, že vaječníky dostatečně dobře odpovídají (tj. že ještě obsahují životaschopná vajíčka), potom je možno podáváním odpovídajících léků ovlivňovat další endokrinní problémy, jako jsou defekty luteální fáze. Levnější metoda systematického sledování pacientů z hlediska endokrinních problémů tedy umožní zachovat větší počet těhotenství.

Při jakýchkoliv z výše popisovaných hormonálních stanovení vyžaduji vysoké náklady a problematická metodologie, aby neplodné ženy nebo ženy s nižší frekvencí menstruace prodělaly mnoho hormonálních testů, často takových testů, kdy se vzorky odebírají po dobu několika následujících dnů. Proto existuje potřeba získat účinné • 000 a laciné zařízení a způsob, které umožní uživateli získat rychlou a spolehlivou informaci o konkrétním hormonálním stavu uživatele.

• * » · • · 0 0 · 000 00 0 0 »0« 0 000V

000 ··· 0« 000 00 00

-4Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnutí způsobu rychlé analýzy hladin hormonů v krvi, včetně bez omezení luteinizačního hormonu, estradiolu, hormonu stimulujícího folikuly, thyreostimulačního hormonu a/nebo progesteronu, aby bylo možno předpovídat některé fyziologické změny. Příklady těchto fyziologických io změn zahrnují bez omezení určení stavu ovarií a správné funkce reprodukčního systému stejně jako detekci endokrinní příčiny neplodnosti u člověka a samic jiných savců.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí testovacího zařízení pro rychlou detekci analytů v biologickém vzorku, is Konkrétně slouží zařízení podle předkládaného vynálezu pro stanovení hladin různých hormonů v krvi, jako je například estradiol, hormon stimulující folikuly, thyreostimulační hormon a/nebo progesteron u pacienta a pro poskytnutí výsledků uživateli. Zařízení podle předkládaného vynálezu mohou obsluhovat i nezkušení uživatelé a pro

2o získání spolehlivých analytických výsledků je nutný minimální počet operací.

Médium jako je testovací proužek má část analytické matrice obsahující porézní matrici, na které je imobilizována první protilátka, která má specifickou afinitu k analytu. Po aplikaci biologického vzorku na testovací proužek zachytí imobilizované molekuly první protilátky analyt. Po odstranění nenavázaných materiálů se na proužek nanesou molekuly detekovatelné druhé protilátky (tzv. indikátorová molekula, label nebo tag) se specifickou afinitou pro analyt. Po odstranění nenavázaných látek se detekuje množství indikátorové molekuly ♦ ·

- 5 » ·· * « navázané na proužku pomocí monitorovacího zařízení, kde toto množství ukazuje množství analytu přítomného ve vzorku.

V praxi obsahuje činidlo, kterým je testovací proužek impregnován, jednu nebo více částí testovací matrice, na které se nanáší vzorek, který se potom ponechá pronikat materiálem proužku a postupuje do nebo skrz materiál proužku a do nebo skrz detekční oblast v testovacím proužku. Vynález konkrétně obsahuje specifický test založený na monoklonálních protilátkách ELISA pro detekci hormonů, jako je luteinizační hormon, estradiol, hormon stimulující filikuly, thyreostimulační hormon a/nebo progesteron, buď jednotlivě nebo v kombinaci. Kapka nebo kapky úplné krve se nanesou na aktivní matrici bud přes filtr, nebo přímo. Analyt v krvi, jako je například konkrétní hormon, reaguje a váže se na primární protilátku obsaženou v porézní matrici. Analyt se potom promyje druhou protilátkou is navázanou na indikátor, jako je například chromofor, znovu se opláchne a míra výsledného vyvinutí barvy, která je mírou množství hormonu ve vzorku, se potom měří. Chromofor může být nahrazen různými fluorescenčními nebo luminiscenčními indikátory, pokud může být intenzita fluorescence nebo luminiscence měřena jako indikátor množství analytu ve vzorku krve. Testy většího počtu hormonů se provádějí stejnou metodologií, ale s použitím většího počtu aktivních míst na proužku, přičemž zbarveni vyvinuté v určitém místě ukazuje na přítomnost konkrétníého hormonu. Alternativně slouží jediná aktivní matrice impregnovaná větším počtem primárních protilátek se specifickou afinitou vůči specifickým hormonům jako vazebné místo pro tyto hormony, přičemž pro detekci a kvantifikaci koncentrací hormonů ve vzorku krve se potom použijí chromoforové, fluorescenční nebo luminiscenční indikátory.

Další provedení předkládaného vynálezu se skládá z testu v kapalné fázi s jednou nebo větším počtem cel, při kterém se odebere vzorek úplné krve a tento vzorek se aplikuje ručně nebo automaticky do jedné nebo více cel a provede se specifický test ELISA založený na

V ft* · · ft • · * · ♦ · ftft

-6 • a ft · monoklonálních protilátkách pro luteinizační hormon, estradiol, hormon stimulující folikuly, thyreostimulační hormon a/nebo progesteron, bud jednotlivě nebo v kombinaci. V tomto provedení reagují hormony s primární protilátkou obsaženou v porézní matrici, promyjí se sekundární protilátkou navázanou na chromofor, propláchnou se a míra výsledné vyvinuté barvy, která je úměrná množství hormonu ve vzorku se potom měří. I v tomto případě může být chromofor nahrazen fluorescenčními nebo luminiscenčními indikátory, přičemž se měří intenzita fluorescence nebo luminiscence.

V jediné cele nebo větším počtu cel mohou být prováděny testy většího počtu hormonů. Pokud se používá chromofor, vyvinuté zbarvení může být měřeno vizuálním srovnáním s barevnou tabulkou, ale s výhodou se měří spektrofotometricky, protože vizuální porovnání s barevnou tabulkou je méně přesné a poskytuje pouze hrubé (± 15 %) is přiblížení ke skutečné hladině LH. Intenzita fluorescence a luminiscence se s výhodou stanoví spektrofotometricky.

Další předměty a výhody předkládaného vynálezu budou odborníkům v oboru zřejmější z následujícího podrobného popisu, kde je ukázáno a popsáno výhodné provedení pomocí ilustrace způsobu, o kterém autoři vynálezu předpokládají, že je pro provádění vynálezu nejvhodnější. Jak bude vidět, vynález může mít další rozdílná provedení a jeho některé detaily mohou podléhat modifikacím z několika zřejmých hledisek, aniž by přitom došlo k odchýlení od podstaty vynálezu. Výkresy a popis mají proto být považovány za v podstatě ilustrační a nikoliv za omezující.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A je půdorys testovacího proužku podle podstaty předkládaného vynálezu.

Obr. 1B je průřez testovacím proužkem z boku.

• 4 · 0 • *

-7Obr. 2 je pohled na testovací proužek testu ELISA v kapalné fázi podle podstaty předkládaného vynálezu z boku.

Obr. 3A je půdorys spektrofotometrického zařízení pro zpracování testovacích proužků z obrázků 1A - 1B a obr. 2, který s pracuje na principu odrazivosti.

Obr. 3B je boční pohled na spektrofotometrické zařízení pracující na principu odrazivosti z obr. 3A.

Obr. 4 je blokové schéma zařízení pro zpracování testovacího proužku s pevnou fází z obr. 1A - 1B.

io Obr. 5 je blokové schéma zařízení pro zpracování testovacího proužku s kapalnou fází podle obr. 2.

Příklady provedení vynálezu

Na obr. 1A je ukázán testovací proužek s pevnou fází 20, který obsahuje celkovou analytickou matrici 25 obsahující dvě oblasti: první oblast 30, která má funkci „blanku a druhou oblast 32. Rozumí se, že termín „blank“ má význam běžně používaný v oblasti kolorimetrických a fotometrických analytických metod.

Druhá oblast 32 je oblast matrice reakčních činidel. Oblast 32 obsahuje první protilátku v porézní nereaktivni nosné matrici 46. Takové matrice se běžně používají v oboru pro vázání nukleových kyselin a proteinů. Příklady materiálů pro vhodné nosné matrice jsou nitrocelulóza a nylon. Jestliže je nosnou matricí 46 nitrocelulóza, protilátky mohou být na nosnou matrici přímo imobilizovány, aniž by bylo nutno používat chemických činidel. Pro jiné matrice se však může imobilizace provádět v oboru známými způsoby, jako je působení bromkyanem a karbonyldiimidazolem.

První protilátka se volí ze skupiny monoklonálních protilátek, polyklonálních protilátek a jejich fragmentů. Ve výhodném provedení je ··· φ φ φφφ · φ φ φ φ φφφφ «Φφφφ* φ · φ φ « · φ · φ φφφ φφφ ΦΦ ·« *· ·

-8molekulou první protilátky monoklonální protilátka. Konkrétní volba protilátky bude závislá na detekovaném analytu. Například pro detekci luteinizačního hormonu (LH) mohou být na nosnou matrici 46 imobilizovány protilátky specifické vůči LH.

Pro účely odstranění nenavázaných látek z nosné matrice 46 se používá omývacího prostředku ve formě mokrého absorpčního stírátka (wipe). Toto stírátko je s výhodou vyrobeno z netkaného materiálu. Stírátko se namočí vhodným roztokem. Stírátka mohou být namočena předem nebo mohou být namočena v průběhu analýzy. Například pro io účely blokování mohou být stírátka namočena do některého pufru obsahujícího dobře známé blokovací prostředky. Mezi vhodné pufry patří fosfát, tris, glycin apod., obecně s molaritou 0,1 až 3,0. Vhodnými blokovacími prostředky jsou bez omezení bovinní sérový albumin, zředěné sérum, odtučněné sušené mléko a kasein. Stírátka namočená do omývacího roztoku se zde označují jako omývací stírátka a stírátka namočená do blokovacího roztoku se zde označují jako blokovací stírátka.

Druhá protilátka má také afinitu k analytu, s výhodou k rozdílnému epitopu než první protilátka. Druhá protilátka je zvolena ze

2o skupiny monoklonálních protilátek, polyklonálních protilátek a jejich fragmentů. Ve výhodném provedení je druhá protilátka monoklonální protilátka proti epitopu rozdílnému od epitopu pro první protilátku.

Druhá protilátka je značena detekovatelnou molekulou nebo komplexem. Vhodné detekovatelně indikátory jsou například chromofory a fluorescenční molekuly a komplexy. Fluorescenčně značené protilátky proti specifickým analytům jsou komerčně dostupné nebo mohou být připraveny v oboru známými způsoby. Soupravy pro fluorescenční značení protilátek jsou komerčně dostupné (například molekulární sondy firmy Pierce).

Výhodné je skladovat druhou protilátku v oddíle chráněném před světlem. Roztok druhé protilátky může být dodán ve formě kapaliny • ··· • ♦ φ φ » φφ»*·* « φφφ ···»· • ΦΦ «·· ·· ··· «φ φ»

-9nebo jako mokré stírátko podobné omývacím a blokovacím stírátkům.

Vhodný oddíl pro skladování roztoku značené protilátky je aplikační trubička zabalená do fólie nebo tmavě zbarvená trubička. Mokrá stírátka se vhodně balí do fólií.

Pro detekci přítomnosti analytu v biologickém vzorku se na testovací proužek 20 nanese malé množství vzorku, například kapka krve, a ponechá se reagovat po dostatečně dlouhou dobu (přibližně 30 s až několik minut). Pro snížení nespecifické vazby může být analytická matrice 25 otřena před nanesením vzorku blokovacím io stírátkem. Pro jemné otření nenavázaných látek se použije omývací stírátko. Navíc může být pro omezení nespecifické vazby také použito blokovací stírátko. Po odstranění nenavázaných látek se analytická materice 25 otře stírátkem obsahujícím značenou druhou protilátku. Po vhodné inkubaci se analytická matrice znovu otře omývacím a/nebo blokovacím stírátkem a testovací proužek 20 se vloží do analytického zařízení k analýze.

Jako konkrétní příklad obsahuje v jednom provedení předkládaného vynálezu druhá oblast 32 specifickou anti-humánní monoklonální protilátku (první protilátka) nebo sadu protilátek navázaných na druhou oblast 32 analytické matrice 25. Specifické vlastnosti každého druhu protilátek závisí na testovaném analytu. Vzorek úplné krve od pacienta se získá napíchnutím prstu nebo jiným standardním způsobem. Kapička (kapičky) krve se nanesou běžnými prostředky na analytickou matrici 25, kde se buněčný materiál přítomný v krvi odfiltruje odstranitelným filtrem 40 překrývajícím druhou oblast 32. Sérum, které pronikne filtrem 40. se ponechá reagovat s první protilátkou navázanou na druhou oblast 32 a ponechá se působit na první oblast 30, která obsahuje blokovaný substrát bez protilátek. Filtr 40 se potom odstraní a reaktivní místo 46 se omyje pro odstranění nezreagovaného antigenu. Potom se nanese sekundární protilátka značená detekovatelným komplexem, jako je chromofor, fluorescenční nebo luminiscenční komplex specifický pro první • «« * · 9 · 9 9 · 9 9 « · · · 9 9 9 9 9 9 ··· 9·9 99 99 «9

-10protilátku nebo pro počáteční antigen. Proužek 20 se potom opláchne pro odstranění nenavázané druhé protilátky. Intenzita zbarvení, fluorescence nebo luminiscence je pak ukazatelem množství chromoforu, fluorescenčního, luminiscenčního nebo jiného indikátoru imobilizovaného na testovacím proužku 20 a měření této intenzity je tedy také ukazatelem množství hormonu obsaženého v kapičce (kapičkách) krve.

Testovací destička 10 pro test ELISA v kapalné fázi podle předkládaného vynálezu je ukázána na obr. 2. Testovací destička 10 io obsahuje cely na kapalinu 12, z nichž jedna je označena jako referenční cela nebo blank 14 a jedna nebo více dalších cel je označeno jako testovací cely 16. Cely 12 jsou pokryty odstranitelným filtrem 4L V jednom provedení obsahuje každá cela 16 specifickou anti-humánní monoklonální protilátku, tedy první protilátku, navázanou na stěny cely. Vzorek úplné krve od pacienta se získá napíchnutím prstu nebo jiným standardním způsobem. Kapička (kapičky) krve se do každé cely nanášejí běžnými prostředky a buněčná hmota v krvi se odfiltruje odstranitelným filtrem 4Ί. Sérum, které pronikne filtrem 4Ί, se ponechá reagovat s první protilátkou navázanou na stěny cel 16 a ponechá se také ve styku s celou blanku 14 obsahující blokovaný substrát bez první protilátky. Filtr 40 se potom odstraní a cely se promyjí pro odstranění nezreagovaného materiálu. Do všech cel se nanese sekundární protilátka specifická pro konjugovanou první primární protilátku nebo pro počáteční analytznačená chromoforem, fluorescenčním nebo luminiscenčním komplexem. Cely se potom opláchnou pro odstranění nezkombinovaného sekundárního komplexu a měří se intenzita zbarvení, fluorescence nebo luminiscence. Intenzita zbarvení, fluorescence nebo luminiscence je ukazatelem množství chromoforového, fluorescenčního nebo luminiscenčního komplexu přítomných v testovacím proužku, které je zase ukazatelem množství analytu v kapičce (kapičkách) krve.

• ftftft • ftftftft • * * · · · • · · · ft • ftftftft · ftftft

- 11 • ftft · • ftft · • ftft « • · ftft

Intenzita zbarvení ve každém z provedení podle vynálezu může být měřena porovnáním s barevnou tabulkou pro zjištění koncentrace požadovaného analytu v krvi. Výhodným zařízením pro měření intenzity zbarvení a tím pro stanovení množství hormonu ve vzorku je však zařízení 100 ukázané na obr. 3A a 3B. Zařízení 100 je s výhodou přenosný ruční reflektanční spektrofotometr, který má přijmout a “odečíst“ vyvolaný proužek (tj. stanovit množství hormonu reprezentované intenzitou vyvinuté barvy), zobrazit výsledky pro operátora a zaznamenat výsledky do paměťového zařízení.

io Ve výhodném provedení ukázaném na obr. 3A - 3B a 4 zahrnuje zařízení 100 reflektanční spektrofotometr, který obsahuje diodu emitující světlo (LED) 155 (znázorněná na obr. 4), která vyzařuje světelný paprsek 170 (zobrazený na obr. 4), přičemž světelný paprsek 170 obsahuje první paprsek 171 a druhý paprsek 173. Zařízení 100 může také obsahovat časovač 136 a vypínač pro zapínání a vypínání diody LED 155. Ve výhodném provedení vynálezu je světelný paprsek 170 monochromatický paprsek. Když se testovací proužek vloží do prostředku pro přijímání testovacího proužku 110 zařízení 100, světelné paprsky 171 a 173 dopadají na oblasti 30 a 32 testovacího proužku. První oblast 30 odráží první světelný paprsek 171 jako odražený paprsek 172, druhá oblast 32 odráží druhý světelný paprsek 173 iako odražený paprsek 174. Odražené světelné paprsky 172 a 174 jsou přijímány fotodetektory 151. popřípadě 152. jak je ukázáno na obr, 4. Protože první oblast 30 je oblast blanku bez navázaného chromoforu, nedojde po dopadu prvního světelného paprsku 171 na první oblast 30 k žádné detekovatelné změně intenzity a intenzita odraženého paprsku 172 detekovaného fotodetektorem 151 nebude detekovatelné odlišná od intenzity prvního paprsku 171. Chromofor obsažený ve druhé oblasti 32 bude absorbovat alespoň určité

3o množství světla ze světelného paprsku 173 a proto se bude intenzita odraženého paprsku 174 detekovaného fotodetektorem 152 lišit od intenzity odraženého paprsku 172. Napětí \Λ a V₂, výstupní napětí ··· ♦ 00* 0 0 0 » • · * · 0 0 * 0 0 0 0 • 0 00 0 · 0 « »

0· ♦·· ·0 0*0 0· «0

- 12 fotodetektorů 151 a 152, se přivádějí do signálového procesoru 150. Signálový procesor 150 využívá rozdílu mezi napětími a V2 pro výpočet koncentrace analytu ve vzorku. Ve výhodném provedení odečítá signálový procesor 150 napětí Ví odpovídající oblasti blanku od napětí V₂ odpovídajícího signálu reakční oblasti a potom porovná rozdíl se standardní napěťovou křivkou představující hladiny hormonu. Signálový procesor 150 může obsahovat prostředky pro uchovávání informací a dat, jak je v oboru běžně známo. Koncentrace analytu se zobrazuje v okénku displeje 135, kterým je ve výhodném provedení displej z tekutých krystalů (LCD).

Dalším provedením předkládaného vynálezu, ve kterém sekundární protilátka obsahuje fluorescenční/luminiscenční komplex (indikátor) je provedení ukázané na obr. 5. Světelný zdroj 255 vytváří světelný paprsek 270, který může být buď monochromatický nebo 15 může jít o širokopásmové záření. Ve výhodném provedení je záření širokopásmové, které je filtrováno filtračním prostředkem 257 pro specifickou vlnovou délku světla - excitační vlnovou délku pro daný fluorescenční indikátor. Světelný paprsek 270 obsahuje první světelný paprsek 271 dopadající na první oblast 30 testovacího proužku a druhý paprsek 273 dopadající na druhou oblast 32 růžku. Fluorescenční indikátor obsažený ve druhé oblasti 32 fluoreskuje jako odpověď na excitaci způsobenou druhým paprskem 273, přičemž vyzařuje světelný paprsek 274 s rozdílnou (delší) vlnovou délkou. Vlnová délka světelného paprsku 272 odraženého první oblastí 30 není ovlivňována přítomností fluorescenčního indikátoru, protože první oblast 32 je oblast blanku, ve které není fluorescenční materiál přítomen. Fotodetektory 151 a 152 detekují světelné paprsky 272 a 273, které jsou filtrovány na požadovanou vlnovou délku fluorescence filtračním prostředkem 256. Filtry 256 a 257 jsou zvoleny tak, aby odpovídaly konkrétním požadovaným vlnovým délkám. Pro každý vzorek testovaný zařízením podle předkládaného vynálezu se zvolí příslušné filtry 256 a 257, které se použijí v zařízení.

· ·· 9 9 99* 9 9 * 9 * 9**9 999 **9 • 9 · 9 « 9 ·

999 999 9* 999 *9 9·

- 13Filtrace vlnových délek excitačního a fluorescenčního emisního záření se provádí filtračním prostředkem dobře známým odborníkům v oboru. Alternativně může být detekováno fotodetektory 151 a 153 nefiltrované emitované světlo a vlnová délka a údaje o amplitudě mohou být určeny procesorem 150 pomocí standardních prostředků pro zpracování signálů známých odborníkům v oboru.

Vícenásobné testy je možno provádět bud pro provedení zobrazené na obrázcích 1A - 1B nebo provedení znázorněné na obr. 2 alespoň dvěma způsoby: (i) použitím testovacího proužku s pouze io jednou aktivní oblastí, kde na jednu aktivní oblast je možno testovat pouze jeden hormon, nebo (ii) použitím jedné nebo více aktivních oblastí na proužek, přičemž v některé nebo ve všech aktivních oblastech se testuje větší počet hormonů. Pro násobné proužky, které mají stejnou excitační a emisní vlnovou délku mohou být nezbytné vícenásobné zdroje 255 nebo fotodetektory 152. Pohyblivost zdroje 255, fotodetektoru 152 nebo testovacího proužku 20 mohou tyto požadavky na vícenásobnost odstranit. Pro testování většího počtu hormonů v dané aktivní matrici je možno použít většího počtu excitačních filtrů 257 a/nebo větší počet emisních filtrů 156 pro

2o postupné testování hormonů s různými fluorescenčními indikátory. Alternativně může používat procesor 150 prostředky pro zpracování signálu pro zjištění frekvence a spektrálního složení světla detekovaného fotodetektorem. Prostředky pro zpracování signálu budou odborníkům v oboru dobře známy.

Zařízení 100 může obsahovat zapisovač na magnetické karty (zobrazený na obr. 4 a 5 jako 160) pro uchovávání výstupu signálového procesoru 150 spolu s informací o datu a čase nebo vyjímatelnou magnetickou kartu (zobrazeno na obr. 4 a 5 jako 161). Vyjímatelná magnetická karta 161 se vkládá do prostředku pro přijímání magnetické karty 120, aby bylo možno provést operace čtení a zápisu. Pro stejný účel může být u zařízení 100 použit pružný disk.

»»» · 0 9 · · 0 * • 000 0 0 000 0 0 0 0 · · · 0 0*0000

0 00 0 0000

0«0 00· 00 000 00 00

- 14 Zařízení 100 může obsahovat vypínač ON/OFF 130, prostředek

132 pro inicializaci vyvolání a zobrazení údajů uložených na magnetické kartě nebo v paměti signálového procesoru, prostředek

133 pro vysouvání magnetické karty a prostředek displeje 135 pro 5 zobrazení analytických výsledků a informací o datu a čase.

Předpokládá se, že výše uvedené informace o výhodných provedeních struktury podle předkládaného vynálezu a o popisu její činnosti představují pouze jedno nebo dvě nejlepší provedení pro uskutečnění vynálezu. Odborníkům v oboru budou pravděpodobně po io přečtení popisu výhodných provedení a přiložených nároků a výkresů zřejmé další úpravy a variace vynálezu. Tyto modifikace a obměny spadají rovněž do rozsahu předkládaného vynálezu.

Claims (25)

1. Zařízení pro detekci přítomnosti alespoň jednoho analytu

5 v biologickém vzorku, vyznačující se tím, ž e obsahuje:

zdroj vytvářející světelný paprsek s jednou nebo více předem určenými vlastnostmi, přičemž světelný paprsek dopadá v určitém úhlu na biologický vzorek;

io detektor odpovědný za přijímání světelného paprsku šířícího se v určitém úhlu z biologického vzorku do detektoru, kde přijatý světelný paprsek má jednu nebo více intenzitních vlastností rozdílných od jedné nebo více předem určených vlastností dopadajícího světelného paprsku, kde rozdíl mezi vlastnostmi

15 dopadajícího světelného paprsku a přijímaného světelného paprsku je způsoben přítomností biologického vzorku; a procesor využívající rozdílu mezi vlastnostmi dopadajícího světelného paprsku a přijímaného světelného paprsku pro detekci přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém

20 vzorku.

2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje displej komunikující s procesorem a zobrazující přítomnost analytu v biologickém vzorku.

3. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje paměťové zařízení komunikující s procesorem a uchovávající informace o přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém vzorku.

« 000 • 0 0 0 0 0*0000 • 0 0 0 0 0 0 «· ··· ·00 00 000 «· ««

- 16

4. Zařízení podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e paměťovým zařízením je vyjímatelná magnetická karta nebo disk.

5. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje první filtr umístěný mezi zdrojem a biologickým vzorkem, kde první filtr slouží pro poskytnutí dopadajícího světelného paprsku s jednou nebo více předem io určenými vlastnostmi, a druhý filtr umístěný mezi biologickým vzorkem a detektorem, kde druhý filtr slouží pro poskytnutí změněného světelného paprsku přijímaného detektorem.

6. Zařízení podle nároku 5, vyznačující se tím,

15 že biologický vzorek obsahuje fluorescenční látku.

7. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e předem určenou vlaastností je vlnová délka dopadajícího světelného paprsku.

8. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e přijímaný světelný paprsek má odlišnou vlnovou délku od vlnové délky dopadajícího světelného paprsku.

25 9. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e biologický vzorek obsahuje chromofor.

-- * V 0 0 « ··· · » *»* « 0 0 0 • 0 ♦ · 0 000 00* • 0 00 0 0000 ·· ··· ·· <00 00 >0

- πιο. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e předem určenými vlastnostmi jsou intenzita a vlnová délka dopadajícího světelného paprsku.

s 11. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e přijímaný světelný paprsek má rozdílnou intenzitu od dopadajícího světelného paprsku.

12. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, io že analyt je zvolen ze skupiny luteinizační hormon, estradiol,

FSH, TSH, progesteron a jejich kombinace.

13. Souprava pro detekci přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém vzorku, vyznačující se tím,

15 že obsahuje:

médium obsahující analytickou matrici s reakční oblastí, na kterou se nanáší biologický vzorek, přičemž reakční oblast obsahuje imobilizovanou první protilátku se specifickou afinitou k analytu;

20 detekovatelnou druhou protilátku s detekovatelným indikátorem, kde druhá protilátka má specifickou afinitu k analytu; a zařízení pro detekci přítomnosti analytu v biologickém vzorku, kde toto zařízení obsahuje:

25 zdroj vytvářející světelný paprsek s jednou nebo více předem určenými vlastnostmi, přičemž světelný paprsek dopadá v určitém úhlu na biologický vzorek;

detektor odpovědný za přijímání světelného paprsku šířícího se v určitém úhlu z biologického vzorku do • 444

--- * » w » • 4 * 4 4 4 • *4*4 444*44 • 4 4» 4··44

444 444 ·· «44 »4 ««

- 18detektoru, kde přijatý světelný paprsek má jednu nebo více vlastností intenzity rozdílných od jedné nebo více předem určených vlastností dopadajícího světelného paprsku, kde rozdíl mezi vlastnostmi dopadajícího s světelného paprsku a přijímaného světelného paprsku je způsoben přítomností biologického vzorku; a procesor využívající rozdílu mezi vlastnostmi dopadajícího světelného paprsku a přijímaného světelného paprsku pro detekci přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém w vzorku.

14. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e první protilátka je zvolena ze skupiny monoklonální protilátka, polyklonální protilátka a jejich fragmenty.

15. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e druhá protilátka je zvolena ze skupiny monoklonální protilátka, polyklonální protilátka a jejich fragmenty.

20 16. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e první protilátka a druhá protilátka jsou monoklonální protilátky a první protilátka a druhá protilátka se vážou na různé epitopy analytu.

25 17. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e detekovatelný indikátor druhé protilátky je fluorescenční komplex nebo molekula.

• ·· · · ··· · 0 0 0 » 0·0» 0 0 0 0 · 0 0 0 00 0 0·«·

000 000 00 000 *» ··

-1918. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e detekovatelný indikátor druhé protilátky je chromofor.

19. Souprava podle nároku 17, vyznačující se tím,

5 ž e fluorescenční komplex nebo molekula je zvolena ze skupiny fluorescein, rhodamin, barvivo texas red a jejich kombinací.

20. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, io že analyt je zvolen ze skupiny luteinizační hormon, estradiol,

FSH, TSH, progesteron a jejich kombinací.

21. Souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e médium je proužek.

22. Způsob detekce přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém vzorku, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

poskytnutí světelného paprsku dopadajícího v určitém úhlu na 20 biologický vzorek, přičemž světelný paprsek má alespoň jednu předem určenou vlastnost;

vystavení biologického vzorku působení dopadajícího světelného paprsku takovým způsobem, že se dopadající světelný paprsek převádí na přijímaný světelný paprsek

25 postupující mezi biologickým vzorkem a detektorem, přičemž přijímaný světelný paprsek má alespoň jednu intenzitní vlastnost rozdílnou od dopadajícího světelného paprsku; detekci přijímaného světelného paprsku detektorem; a » ··· φ · · * · · » · φ φ φ φ φφφ φφφφφ φφφ ··· ΦΦ φφ· ·· «φ

- 20 využití rozdílu alespoň jedné vlastnosti dopadajícího světelného paprsku a přijímaného světelného paprsku pro poskytnutí údaje o přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém vzorku.

23. Způsob detekce přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém vzorku, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

poskytnutí média obsahujícího analytickou matrici s reakční io oblastí, přičemž reakční oblast obsahuje imobilizovanou první protilátku se specifickou afinitou k analytu;

nanesení biologického vzorku do reakční oblasti;

nanesení detekovatelně druhé protilátky s detekovatelným indikátorem do reakční oblasti, kde druhá protilátka má

15 specifickou afinitu k analytu;

osvětlení reakční oblasti dopadajícím světelným paprskem v určitém úhlu, přičemž tento paprsek má alespoň jednu předem určenou vlastnost;

detekci přijímaného světelného paprsku, který je výsledkem 20 změny alespoň jedné intenzitní vlastnosti dopadajícího světelného paprsku způsobené detekovatelným indikátorem; a využití rozdílu mezi alespoň jednou vlastností dopadajícího světelného paprsku a přijímaného světelného paprsku pro detekci přítomnosti alespoň jednoho analytu v biologickém

25 vzorku.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e první protilátka je zvolena ze skupiny monoklonální protilátka, polyklonální protilátka a jejich fragmenty.

• ··· · · ··· · · · · • ♦ · φ » *·»··« • · · · φφφφφ ·· φφφ φ* φφφ φφ φφ

-21

25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e druhá protilátka je zvolena ze skupiny monoklonální protilátka, polyklonální protilátka ajejich fragmenty.

5

26. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e první protilátka a druhá protilátka jsou monoklonální protilátky a první protilátka a druhá protilátka se vážou na různé epitopy analytu.

io

27. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e detekovatelný indikátor druhé protilátky je fluorescenční komplex nebo molekula.

28. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e detekovatelný indikátor druhé protilátky je chromofor.

29. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, ž e fluorescenční komplex nebo molekula je zvolena ze skupiny fluorescein, rhodamin, barvivo texas red a jejich

2o kombinací.

30. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e analyt je zvolen ze skupiny luteinizační hormon, estradiol, FSH, TSH, progesteron ajejich kombinací.

31. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e médium je proužek.