CZ2000867A3

CZ2000867A3 - Sekvence DNA kódující ligand Kay, způsob přípravy ligandu Kay a farmaceutický přípravek obsahující tento ligand

Info

Publication number: CZ2000867A3
Application number: CZ2000867A
Authority: CZ
Inventors: Jurg Tschopp
Original assignee: Apotech R & D Sa
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2000-10-11

Abstract

Předkládaný vynález se týká ligandu Kay, nového členu rodiny nádorového nekrotického faktoru (TNF), modifikovaných ligandů Kay a farmaceutických přípravků, které je obsahují, jejich použití pro léčení imunitních reakcí na tkáňový štěp a adenokarcinomu

Description

Sekvence DNA kódující ligand Kay, způsob přípravy ligandu Kay a farmaceutický přípravek obsahující tento ligand

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového ligandu nazvaného Kay, který je členem rodiny nádorového nekrotického faktoru. Tento protein nebo jeho receptory mají protinádorové a/nebo imunoregulační využití. Kromě toho buňky transfekované geny pro tyto nové ligandy se mohou užít v genové terapii pro léčení nádorů, autoimunitních a zánětlivých nemocí nebo dědičných genetických poruch, a také protilátky blokující tyto proteiny mohou mít imunoregulační využití.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, Tumor Necrosis Factor) jsou mediátory hostitelské obranné a imunitní regulace. Členové této proteinové rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu, kdy působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny, které jsou schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů upozorňuje na výskyt těchto molekul vedoucí k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace v cílové tkáni. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 11 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-oc:TNF-R, LT-α/β: Ι,Τ-β-R, FasL:Fas, CD40L.-CD40, CD30L.-CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 a 4-1BBL:4-1BB. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to dokonce • · • · · ·

- 2 i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50%.

Určujícím rysem této rodiny cytokinových receptoru je extracelulární doména bohatá na cystein, která byla objevena při molekulovém klonování dvou různých receptorů TNF^(I). Tato genová rodina kóduje transmembránových proteinů typu I doménou vážící ligand a jednou a cytoplazmatickým úsekem, glykoproteiny s vlastnostmi s extracelulární vazebnou transmembránovou doménou se podílí na aktivaci který buněčných funkcí. Úsek bohatý na cystein, který je současně vazebným úsekem pro ligand, má centrální doménu z hustě spojených disulfidových můstků, která se několikrát opakuje, což závisí na konkrétním členu rodiny. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv jsou i receptory pouze se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami.

Proteiny z rodiny TNF ligandů jsou charakteristické na krátkým úsekem normálně krátkých hydrofilních který často obsahuje několik lysinových nebo argininových zbytků, které zřejmě slouží jako stop-sekvence přenosu. Pak mají transmembránový úsek a extracelulární úsek proměnné délky, který odděluje doménu vázající receptor na C-konci od buněčné membrány. Tento úsek se někdy nazývá stopka. Vazebný úsek C-konce představuje větší část proteinu a často, i když ne vždy, obsahuje glykosylační místa. Tyto geny klasické signální sekvence charakteristické pro svém N-konci aminokyselin, postrádaj í membránové proteiny typu I, spíše odpovídají membránovým proteinům typu II, které mají C-konec zasahující mimo buňku a krátký N-konec zasahující do cytoplazmy. V některých případech, jako jsou TNF a LT-α, se může objevit v průběhu časného opracování proteinu štěpení v úseku stopky a ligand pak existuje především v sekretované formě. Většina ligandů se vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává tak lokalizovaný přenos signálů.

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Struktura TNF a lymfotoxinu alfa (LT-α) je sendvičová, tj. skládají se ze dvou antiparalelních β-skládaných listů s topologií tzv. meandru (Greek key nebo jelly roli¹¹¹’). Odchylka rms mezi zbytky řetězců Ca a β je 0,61 C, což vede k domněnce o vysokém stupni podobnosti jejich molekulární topografie. Strukturálním rysem, který zjevně vyplývá z molekulárních studií CD40L, TNF a LT-α, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomerní komplexy. Oligomerní struktuře je vlastní vytváření vazebných míst pro receptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se vytváří multivalentní ligand. Analýzou krystalové struktury se zkoumala kvarterní struktura CD40L, TNF a LT-α a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervativních pro tyto ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseku kostry struktury β-listu. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou zachovány mezi různými členy celé rodiny. Kvarterní struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně také zůstává podobná.

Členy rodiny TNF mohou být nejlépe popsány jako hlavní přepínače v imunitním- systému pro řízení přežívání buněk a diferenciace. V současnosti jsou známy pouze dva sekretované cytokiny, a sice TNF a LT-α, na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí sekretovaných TNF je všeobecná signalizace poplachu buňkám vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve výstelce cév a v buňkách v místě zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptoru typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné ·

• # • ·

- 4 >··· · · · · · · · • «· · · · · · · * · 3 ·

T-buňky poskytují pomoc zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-buňkám, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt u dobře prozkoumaného systému Pas.

Ligandy TNF je možné rozdělit do třech skupin na základě jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt. V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha buněčných liniích a jejich receptory mají většinou kanonické smrtící” domény. Pravděpodobně ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patřil také do této kategorie. Druhou skupinu tvoří takové ligandy, které spouštějí slabší signál omezený jen na některé buněčné typy. Do této druhé skupiny patří např. TWEAK, ligand CD30 a LTalb2. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k buněčné smrti, když nemají kanonickou smrtící doménu. Nepřítomnost této domény vede k domněnce, že existuje ještě jiný slabší způsob signalizace v mechanismu buněčné smrti. Do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný signál vedoucí k buněčné smrti. Ale pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliferačně na některé typy buněk jako následek indukce diferenciace, jako např. CD40 (Funakoshi et al., 1994).

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době a obsahuje nyní 11 různých signálních drah zahrnujících regulaci imunitního systému. Obecně rozšířené expresní vzorce TWEAK a TRAIL ukazují, že v této rodině existuje značná funkční variabilita, dosud nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým objevem dvou receptoru, které ovlivňují replikační schopnost viru Rousova sarkomu a viru Herpes simplex, a také historicky významnými objevy, že TNF má antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje vějičkové TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Montgomery et al., 1996, Smith 1994, Vassali 1992).

• · · ·

- 5 TNF je mediátor septického šoku a kachexie ' a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk^llv) . Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlivé reakci a v obraně proti

IV) navíc ma bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím zřejmě protinádorovou aktivitu¹⁷¹’. TNF se podílí také na různých autoimunitních chorobách'⁷¹¹’. TNF je vytvářen různými typy buněk, např. jsou to makrofágy, fibroblasty, T-buňky a cytotoxické NK-buňky dva různé receptory, (natural killer) ^(VIII). TNF se váže na z nichž každý působí prostřednictvím odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům TNF^!I/‘' . TNF může existovat jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako volný sekretovaný cytokin¹''’’ .

LT-α má s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory^1X11, ale na rozdíl od TNF je sekretován hlavně aktivovanými T-buňkami a některými β-lymfoblastoidními nádory¹*¹¹¹ . Heteromerní komplex LT-α a LT-β je komplex vázaný na membránu, kde se váže na LT-β receptory'*¹¹¹’. Systém LT (tj. LT s receptorem LT-R) se podílí na vývoji periferních lymfoidních orgánů, neboť genetické narušení LT-β vede k poruchám T- a B-buněk ve slezině a k vymizení lymfatických uzlin^lAlv!. Systém LT-β se také podílí na buněčné smrti u některých linií adenokarcinomových buněk'^AV) .

Fas-L, další člen rodiny TNF, je exprimován přednostně na aktivovaných T-buňkách^1X711. Indukuje smrt buněk nesoucích příslušný receptor, nádorových buněk a buněk infikovaných HIV, a sice mechanismem, který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza'*⁷¹¹’. Kromě toho je známo, že nedostatek Fas nebo Fas-L vede k lymfoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi^1X71111. Fas systém se také podílí na poškození jater v důsledku chronické infekce virové hepatitidy (XIX) a na autoimunitní • · • · · · « ·

odpovědi u pacientů infikovaných . Systém Fas se také účastní destrukce T-buněk u pacientů infikovaných HIV^!XaI).

TRAIL, další člen této rodiny, se zřejmě také podílí na buněčné smrti mnoha různých transformovaných buněčných linií různorodého původu^(XXII).

CD40-L, další člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T-buněk a indukuje regulaci B-buněk nesoucích CD40^<XXIII). Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou nemoci známé jako syndrom hyper-IgM vázané na X^ÍXXIV). Systém CD40 je také spojen s mnoha různými autoimunitními chorobami^(XXV)a CD40-L má také antivirové vlastnosti^1XXVI1 . Ačkoliv se systém CD40 podílí také na záchraně apoptických B buněk'·), u jiných buněk než buněk imunitního systému indukuje apoptózu^iAA'^,IiIi. Mnohé další lymfocytární členy rodiny TNF se podílejí na kostimulaci ^!XAiX).

Obecně lze shrnout, že členy rodiny TNF hrají základní regulační roli v řízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TNF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné, že členy této rodiny mohou poskytnout jedinečné prostředky proti nemocem. Některé ligandy rodiny TNF mohou přímo indukovat apoptotickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata 1997). Aktivace receptoru Fas a zřejmě i TNF a CD30 mohou indukovat buněčnou smrt netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa et al., 1996, Nagata 1997, Sytwu et al., 1996, Zheng et al., 1995). Obecně je známo, že buněčná smrt se spustí po agregaci smrtících domén, které jsou umístěny na cytoplazmatické straně receptorů TNF. Tyto smrtící domény organizují uspořádání různých složek signální transdukce, což nakonec vede k aktivaci celé kaskády (Nagata 1997). Některé receptory postrádají kanonické smrtící domény, např. receptor LTb a CD30 (Browning et al. 1996, Lee • · · ·

- 7 et al., 1996) a přesto mohou indukovat buněčnou smrt, i když podstatně slaběji. Tyto receptory pravděpodobně fungují primárně tak, že indukují buněčnou diferenciaci a buněčná smrt je aberantním důsledkem u některých transformovaných buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi CD30 null se předpokládá smrtící role v negativní selekci v brzlíku (Amakawa et al., 1996). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadován pro udržování a přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba charakterizovat další členy rodiny TNF a poskytnout tak další prostředky k léčení nemocí a ovlivňování imunitního systému.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypetidu zvaného ligand Kay, který v podstatě řeší řadu problémů, vyskytujících se díky omezením a nevýhodám dosavadních řešení známých ze stavu techniky. Původci objevili nový člen cytokinové rodiny TNF a určili sekvenci aminokyselin jak myšího tak i lidského proteinu, včetně příslušných sekvencí DNA kódujících tyto proteiny. Vynález je možné využít pro identifikaci nových přípravků pro diagnózu a léčení mnohých nemocí a stavů, což je dále podrobněji popsáno, a také k získání dalších informací o imunitním systému a pro vlastní ovlivňování imunitního systému a imunitních procesů. Kromě toho se předkládaný vynález také týká indukce buněčné smrti v karcinomech.

Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou popsány podrobněji v následujícím popisu, přitom částečně z popisu vyplynou a částečně je bude možno rozpoznat při využití vynálezu. Cíle vynálezu a jeho výhod lze dosáhnout pomocí přípravků a způsobů, které jsou zvláště zdůrazněny • · · ·

v popisu a v patentových nárocích, a také v průvodních obrázcích.

V souladu s cílem vynálezu, aby bylo dosaženo výhod vynálezu, jak je v popisu a příkladech povedení vynálezu uvedeno, vynález zahrnuje sekvence DNA kódující ligand Kay. Specificky se vynález týká DNA sekvence kódující lidský ligand Kay (tj . sekvence s identifikačním číslem 1). Kromě toho se vynález týká také aminokyselinové sekvence nového ligandu. Aminokyselinová sekvence lidského ligandu Kay je zde uvedena jako sekvence identifikačního čísla 2 (id. č. 2). Kromě toho je zde z části popsána sekvence myšího ligandu Kay uvedena jako sekvence id. č. 3 a protein kódovaný sekvencí id. č. 3 je zde uveden jako sekvence id. č. 4. Další provedení vynálezu se týká sekvencí, které mají alespoň 50% homologii se sekvencí DNA kódující 5'-koncovou vazebnou doménu pro receptor, a přitom hybridizují se sekvencí podle vynálezu nebo jejím fragmentem, a která kóduje ligand Kay mající sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 1 nebo sekvenci id. č. 4.

Některá provedení vynálezu se týkají sekvencí DNA kódující ligand Kay, kde sekvence jsou operativně spojeny se sekvencí kontrolující expresi. Pro použití podle vynálezu je vhodná jakákoliv sekvence pro- kontrolu exprese a vhodná sekvence může být odborníkem snadno vybrána.

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantní DNA, která obsahuje sekvenci DNA kódující ligand Kay nebo jeho fragment, a také hostitelů, kteří mají sekvenci ligandu Kay trvale integrovanou v genomu nebo ji obsahují v podobě episomálního elementu. Podle vynálezu je možné užít jakéhokoliv vhodného hostitele, který může být snadno vybrán odborníkem bez nutnosti nadměrného experimentování.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy v podstatě čistých ligandů Kay, který obsahuj kroky, kdy se kultivuje transformovaný hostitel, a dále se týká β · • · · · * ·

- 9 ligandů Kay v podstatě zbaveného všech živočišných proteinů, které jsou s ním normálně asociovány.

Vynález se také týká ligandů Kay, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2 nebo jeho fragmentů či homologů. V různých provedeních vynálezu sekvence aminokyselin nebo sekvence DNA mohou obsahovat konzervativní inzerce, delece a substituce, jak bude ukázáno dále, nebo mohou obsahovat fragmenty zmíněných sekvencí.

V jiném provedení se předkládaný vynáleze týká rozpustného konstruktu ligandů Kay, který je možné použít pro přímé spuštění farmakologické události zprostředkované ligandem Kay. Taková událost může mít terapeutický účinek při stimulaci rustu, v léčení rakoviny a nádorů nebo v manipulaci s imunitním systémem pro léčení imunologických onemocnění. Rozpustné formy ligandů podle vynálezu mohou být metodami genového inženýrství upraveny tak, aby obsahovaly snadno rozpoznatelnou značku, a tím umožnily identifikaci receptorů pro tyto ligandy.

Další provedení předkládaného vynálezu se týkají protilátek namířených proti ligandů Kay, které mohou být použity např. k léčení rakoviny, nádorů, nebo k ovlivňování imunitního systému při léčení imunologických nemocí.

Ještě další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobů genové terapie pomocí genů pro ligand Kay podle předkládaného vynálezu.

Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu může případně obsahovat také farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans, plnidlo nebo jiné farmaceutické přípravky, a může být podáván jakýmkoliv způsobem známým v oboru.

Jak předcházející stručný přehled tak i následující podrobný popis vynálezu je třeba považovat za vysvětlení vynálezu a za pouhé příklady provedení vynálezu, které slouží k podrobnějšímu vysvětlení předkládaného vynálezu.

« · * « • · · · • ·

Taktéž obrázky, sloužící k lepšímu porozumění vynálezu a tvořící součást popisu vynálezu, jsou určeny k tomu, aby ilustrovaly některá provedení vynálezu a společně s popisem sloužily k vysvětlení principu předkládaného vynálezu.

Popis obrázků

Obr. 1. Srovnání aminokyselinové sekvence lidského a myšího ligandu Kay. Myší sekvence uvedená v horní řádce byla získána přímým klonováním cDNA. Lidská sekvence byla získána složením částečné cDNA se stanovením metodou 5'RACE. Třetí sekvence, uvedená na spodním řádku, ukazuje kanonickou sekvenci.

Obr. 2. Fragment lidské cDNA ligandu Kay (KayL cDNA) byl použit jako sonda k analýze northernovým přenosem RNA z různých lidských tkání. Je vidět, že KayL RNA velikosti 2,4 kb je exprimována zejména ve slezině a lymfocytech periferní krve, tzn. v sekundárních lymfoidních orgánech.

Podrobný popis vynálezu

Popis se bude týkat především podrobného popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká sekvencí DNA, které kódují lidské nebo myší ligandy Kay, jejich fragmenty nebo homology, a dále se týká exprese těchto DNA v hostitelích těmito DNA transformovanými. Vynález se dále týká použití těchto DNA sekvencí a peptidů, které jsou těmito sekvencemi kódovány. Kromě toho se vynález týká jak lidské tak myší aminokyselinové sekvence ligandu Kay, nebo jeho fragmentů či homologů, a dále se týká farmaceutického přípravku obsahujícího tyto sekvence nebo z těchto sekvencí odvozeného.

• * • β • · · »

A. Definice

Termín homologní v tomto textu popisuje podobnost mezi sekvencemi srovnávaných molekul. Pokud je jistá pozice v obou srovnávaných sekvencích obsazena shodnou baží · nebo aminokyselinou, např. jeli stejná pozice v každé ze dvou molekul DNA obsazena adeninem, pak tyto molekuly jsou homologní v dané pozici. Homologie mezi dvěma sekvencemi vyjádřená v procentech je funkce počtu shodných čili homologních pozic, které jsou sdíleny oběma sekvencemi, dělená počtem všech srovnávaných pozic a vynásobená 100. Tak např. jestliže u dvou sekvencí je 6 pozic z 10 shodných neboli homologních, pak tyto sekvence mají 60% homologii. Nebo např. dvě sekvence ATTGCC a TATGGC sdílejí 50% homologii. Obecně se provádí takové srovnání (alignment) tak, že sekvence jsou k sobě navzájem přiloženy, aby poskytly maximální homologii.

Termíny purifikovaný preparát nebo v podstatě čistý preparát polypeptidu slouží k označení polypeptidu, který byl oddělen od ostatních proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se společně přirozeně vyskytuje. Výhodně je purifikovaný polypeptid oddělen také od jiných látek jako např. protilátek nebo matrix, které byly použity pro čištění.

Termín transformovaný hostitel zahrnuje jakéhokoliv hostitele se sekvencí, tj . sekvencí ligand Kay, trvale integrovanou do genomu.

Termín ošetření nebo léčení se zde užívá pro jakékoliv terapeutické ošetření, např. podávání terapeutického činidla nebo látky, např. léku.

Termín v podstatě čistá nukleová kyselina, např. v podstatě čistá DNA, znamená nukleovou kyselinu, která 1) není bezprostředně spojena s jednou nebo dvěma sekvencemi (jedna na 5'-konci a jedna na 3'-konci), např. kódujícími sekvencemi, se kterými sousedí v přirozeně se vyskytujícím genomu příslušného organismu, ze kterého nukleová kyselina pochází, nebo 2) je v podstatě bez sekvencí nukleových kyselin, které se vyskytují v organismu, ze kterého uvedená nukleová kyselina pochází. Tento termín zahrnuje tedy např. rekombinantní DNA vloženou do vektoru, např. do autonomně se replikujícího plazmidu nebo viru, nebo do genomové DNA prokaryotického nebo eukaryotického organismu, nebo která existuje jako samostatná molekula (např. cDNA nebo fragment genomové DNA vytvořený pomocí PCR nebo působením restrikčních endonukleáz) nezávislá na jiných sekvencích DNA. V podstatě čistá DNA také zahrnuje rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího ligand Kay.

Termíny peptidy, proteiny a polypeptidy jsou užívány navzájem zaměnitelným způsobem.

Termín biologicky aktivní je používán ve smyslu mít aktivitu, buďto in vitro nebo in vivo, která se projevuje přímo nebo nepřímo. Tak např. biologicky aktivní fragment ligandu Kay může mít např. 70% homologii aminokyselinové sekvence s aktivním místem ligandů, výhodněji alespoň 80% homologii a nejvýhodněji alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie vzhledem k ligandům- je definována jako procenta aminokyselinových zbytků v příslušné vybrané sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky sekvence ligandu Kay id. č. 2.

Provedení předkládaného vynálezu vyžaduje, pokud není uvedeno jinak, použití technik obvyklých v buněčné biologii, buněčných a tkáňových kulturách, molekulární biologii, transgenní biologii, mikrobiologii, techniku rekombinantní DNA a imunologické metody, které jsou v oboru známé. Tyto techniky jsou popsány v příslušné odborné literatuře.

• · • * · · • ·

B. Sekvence DNA podle vynálezu

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je v podstatě čistá (nebo rekombinantní) nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující ligand Kay, jako je např. sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 1 a/nebo ekvivalenty takových nukleových kyselin. Termín nukleová kyselina zde zahrnuje také fragmenty nebo ekvivalenty, jako jsou např. sekvence kódující funkčně ekvivalentní polypeptidy. Ekvivalentní nukleotidové sekvence mohou obsahovat sekvence, které se liší jednou nebo několika nukleotidovými substitucemi, adicemi nebo delecemi, jako jsou např. alelické varianty, mutace atd., a mohou také obsahovat nukleotidové sekvence, které se liší od sekvence kódující ligand Kay uvedené zde jako sekvence id. č. 1, díky degeneraci genetického kódu.

Předkládaný vynález je popisován obecně vzhledem k sekvencímlidského genu, i když odborníkovi je zřejmé, že se týká i myší sekvence. Lidský protein má, zdá se, všechny charakteristiky rodiny TNF, tj. uspořádání membránového proteinu typu II a konzervativní sekvenční motivy podílející se na uspořádání proteinu do struktury anti-paralelního β-listu, která je typická pro TNF.

Nukleotidové sekvence ligandu Kay je zde uvedena jako sekvence id. č. 1 a aminokyselinová sekvence ligandu Kay je zde uvedena jako sekvence id. č. 2.

Sekvence podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro přípravu série DNA sond, které jsou vhodné pro testování různých sad přirozených nebo syntetických DNA na přítomnost sekvencí příbuzných ligandu Kay nebo jeho fragmentů nebo derivátů. Odborníkovi je zřejmé, že termín ligand Kay se zde užívá v takovém smyslu, že zahrnuje i jeho biologicky aktivní deriváty, fragmenty a homology.

- 14 Sekvence podle předkládaného vynálezu kódující ligand Kay se může využít pro expresi peptidu podle vynálezu v různých prokaryotických nebo eukaryotických hostitelích transformovaných takovými sekvencemi. Peptidy se mohou použít jako protirakovinná nebo imunoregulační činidla. Obecně to znamená, že jedním z kroků aplikace je kultivace hostitele transformovaného molekulou DNA obsahující kódující sekvenci ligandu Kay, operativně spojenou se sekvencí řídící expresi.

Sekvence DNA a rekombinantní molekuly DNA podle předkládaného vynálezu mohou být exprimovány pomocí širokého spektra kombinací hostitel/vektor. Tak např. užitečné vektory mohou obsahovat segmenty chromosomových, jiných než chromosomových, nebo syntetických sekvencí DNA. Expresní vektory podle vynálezu jsou charakteristické tím, že obsahují alespoň jednu expresní kontrolní sekvenci, která je operativně spojena se sekvencí kódující ligand Kay vloženou do vektoru, aby bylo možné regulovat či řídit expresi sekvence DNA.

V rámci každého expresního vektoru se mohou vybrat různá místa pro vložení sekvence ligandu Kay podle předkládaného vynálezu. Místa jsou většinou navržena podle restrikčních endonukleáz, které v příslušném místě štěpí, a tato místa i endonukleázy jsou odborníkovi dobře známy. Odborníkovi je také zřejmé, že vektor pro použití podle předkládaného vynálezu nemusí obsahovat místa pro restrikční endonukleázy pro vložení požadovaného fragmentu DNA. Místo toho může být fragment klonován do vektoru alternativním způsobem. Výběr expresního vektoru, a zejména míst vhodných pro vložení vybraného fragmentu DNA a jeho spojení s expresní kontrolní sekvencí, závisí na mnoha faktorech. K těmto faktorům patří např. velikost proteinu, který má být exprimován, citlivost tohoto proteinu k proteolytické degradaci enzymy hostitelské buňky, počet míst pro příslušný restrikční enzym, kontaminace nebo vazba exprimovaného proteinu proteiny hostitelské buňky, které ·« ··«· ·· ·· jsou těžko odstranitelné v průběhu purifikace apod. Další faktory, které je třeba vzít v úvahu, jsou expresní charakteristiky jako je např. poloha startovacího a ukončovacího kodonu vzhledem k sekvencím vektoru, a další faktory, které jsou odborníkovi zřejmé. Výběr vektoru a vhodných míst pro vložení sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je tedy výsledkem zvážení všech těchto faktorů, přičemž ne všechna řešení jsou stejně účinná pro požadované aplikace. Ale pro odborníka je analýza všech těchto faktorů rutinní záležitostí a výběr vhodného systému pak závisí především na konkrétním použití.

Odborník je snadno schopen vhodně modifikovat expresní kontrolní sekvence tak, aby se získala vyšší úroveň proteinové exprese, např. substitucí kodonů nebo výběrem kodonů určitých zvláštních aminokyselin, které jsou přednostně užívány konkrétním organismem, s cílem zmenšit proteolýzu nebo změnit vzorec glykosylace. Podobně mohou být nahrazeny cysteinové zbytky jinými aminokyselinami, aby se usnadnila produkce nebo uspořádání proteinu, nebo aby se předešlo problémům se stabilitou.

Tudíž ne všechny kombinace hostitel/expresní vektor fungují se stejnou účinností co se týče exprese sekvence DNA podle předkládaného vynálezu. Avšak výběr konkrétní vhodné kombinace hostitel/expresní vektor může být odborníkem snadno proveden. K faktorům, které je třeba vzít v úvahu, patří např. kompatibilita hostitele a vektoru, toxicita proteinů kódovaných sekvencemi DNA vektoru pro hostitele, snadnost izolace požadovaného proteinu, expresní charakteristiky sekvencí DNA a expresních kontrolních sekvencí s nimi operativně spojených, biologická bezpečnost, potřeba energie na uspořádání struktury proteinu, forma proteinu a případně modifikace požadovaného proteinu, které nastávají po expresi.

• · · ·

- 16 Ligand Kay a jeho homology produkované hostiteli transformovanými sekvencemi DNA podle předkládaného vynálezu, stejně jako nativní ligand Kay purifikovaný způsobem podle vynálezu, nebo vytvořený na základě aminokyselinové sekvence podle vynálezu, jsou užitečné pro řadu protirakovinných, protinádorových a imunoregulačních aplikací. Jsou také užitečné v terapii a způsobech týkajících se i jiných nemocí.

Předkládaný vynález se také týká použití sekvencí DNA podle vynálezu pro expresi tohoto ligandu ve zvláštních podmínkách, tj. při genové terapii. Navíc ligand Kay může být exprimován v nádorových buňkách, kde je jeho exprese řízena promotory vhodnými pro tento účel. Taková exprese může posílit protinádorovou imunitní odpověď nebo přímo ovlivnit přežívání nádoru. Ligand podle vynálezu může také ovlivnit přežívání orgánových štěpů tím, že změní lokální imunitní odpověď. V takovém případě by byl sám štěp nebo buňky, které ho obklopují, modifikován genem APRÍL upraveným metodami genového inženýrství.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití izolované nukleové kyseliny kódující ligand Kay pro tzv. antisense terapii. Termín antisense terapie se týká podání nebo vytvoření in sítu oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný ligand Kay, aby tak inhibovaly expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Zmíněná vazba může být konvenční komplementarita párů baží nebo např. V případě vazby na duplexy DNA může jít o vazbu prostřednictvím specifických interakcí v hlavním (velkém) zářezu dvoušroubovicové DNA. Obecně se antisense terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv terapie založená na specifické vazbě oligonukleotidové sekvence.

Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu může být podán např. ve formě expresního plazmidu, který při transkripci v buňce tvoří RNA, která je komplementární k buněčné mRNA kódující ligand Kay nebo alespoň k její části.

Alternativně může být oligonukleotidová sonda oligonukleotidové sondy antisense konstrukt připravená ex vivo.

jsou výhodně také Takové modifikované oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám a jsou proto stabilní in vivo. Příkladem takových molekul nukleových kyselin vhodných jako antisense oligonukleotidy jsou fosforamidátové, fosfothioátové a metylfosfonátové analogy DNA (viz patentové přihlášky U.S. 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775). Kromě toho obecný postup jak konstruovat oligomery vhodné pro antisense terapii byly přehledně uvedeny např. v publikacích Van Der Krol et al., 1988, Biotechniques 6: 958-976 a Stein et al. , 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668, které jsou zde zahrnuty formou odkazu.

C. Ligand Kay a jeho aminokyselinová sekvence

Ligand Kay je, jak bylo již diskutováno výše, členem rodiny TNF. Protein sám, nebo jeho fragmenty či homology, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použití, jak bude podrobněji diskutováno dále.

Ligand Kay se vyskytuje zejména ve slezině a v lymfocytech periferní krve, což významně ukazuje na regulační roli v imunitním systému. Srovnání sekvence ligandu Kay podle vynálezu s ostatními členy lidské rodiny TNF ukazuje značnou strukturní podobnost. Všechny tyto proteiny sdílejí několik úseků konzervativních sekvencí v extracelulární doméně.

Ačkoliv není dosud známa přesná trojrozměrná struktura ligandu podle vynálezu, lze predikovat, že jakožto člen rodiny • · · ·

TNF sdílí určité strukturní charakteristiky s ostatním členy rodiny.

Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu specificky reaguje s receptorem, který dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a způsoby podle předkládaného vynálezu umožňují identifikovat receptory, které specificky reagují s ligandem Kay nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu zahrnují peptidy odvozené z ligandu Kay, které mají schopnost vázat se na jeho receptory. Fragmenty ligandu Kay je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo z obou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidu lze tak připravit expresí mutované DNA.

Polypeptidové fragmenty se mohou také chemicky syntetizovat pomocí konvenční techniky známé jako syntéza na pevné fází užívající biochemického postupu s f-moc nebo t-boc podle Merriffielda. Tak např. peptidy a sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované délky, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadované délky. Příslušné metody jsou podrobněji popsány v následujícím textu.

D. Příprava rozpustných forem ligandu Kay a nádorového ligandu

Rozpustné formy ligandu Kay mohou být velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že ligand Kay podle předkládaného vynálezu je přirozeně sekretován jako rozpustný cytokin, ale pokud tomu tak není, je možné uzpůsobit gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílilo vylučování. Pro přípravu rozpustné sekretované formy APRÍL je třeba odstranit na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky stonku a nahradit je vedoucí sekvencí typu I nebo alternativně vedoucí sekvencí typu II, která umožní účinné proteolytické štěpení v příslušném hostitelském systému. Odborník je schopen měnit rozsah stonkových úseků ponechaných v expresním konstruktu tak, aby se dosáhlo optimálních vazebných vlastnosti k receptoru a sekreční účinnosti. Tak např. zkracováním N-konce lze připravit konstrukty obsahující všechny možné délky stonku, takže vzniknou proteiny, které budou začínat aminokyselinou 81 až 139. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence stonku.

E. Příprava protilátek reagujících s ligandem Kay

Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících s ligandem Kay nebo jeho receptorem. Antiséra typu anti-protein/anti-peptid nebo monoklonální protilátky lze připravit standardními způsoby (viz např. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor press, 1988). Savec jako např. myš, křeček nebo králík, se může imunizovat imunogenní- formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenním, např. tím, že se konjuguje s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy.

Imunogenní část ligandů Kay nebo jeho receptoru může být podána společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat pomocí detekce titru protilátek v plazmě nebo séru. Standardní test ELISA nebo jiné imunotesty se mohou použít s ímunogenem coby antigenem k hodnocení hladin protilátek.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou protilátky imunospecifické pro antigenní determinanty ligandů Kay nebo jeho receptoru, tj. antigenní determinanty polypeptidu se sekvencí id. č. 2, nebo pro blízce příbuzný lidský nebo • · · ·

- 20 savčí, jiný než lidský, homolog (s homologii 70, 80 nebo 90 %, nejvýhodněji s homologii alespoň 95 %) . V ještě dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti-ligand Kay nebo anti-receptor ligandu Kay v podstatě křížově nereagují (tzn. reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně než z 80 % homologní se sekvencí id. č. 2, výhodně méně než z 90 % a nej výhodněji méně než z 95 % homologní se sekvencí id. č. 2. Tím, že v podstatě křížově nereagují se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu menší než 10 %, výhodněji menší než 5 % a ještě výhodněji menší než 1 %, vazebné afinity k proteinu se sekvencí id. č. 2.

Termín protilátka se v tomto textu užívá tak, že zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s ligandem Kay nebo jeho receptory. Protilátky lze fragmentovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou v oboru známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro celé protilátky. Tak např. fragment F(ab')_: je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby se redukovaly disulfidové můstky, čímž vznikne fragment Fab'. K protilátkám podle předkládaného vynálezu dále patří biospecifické a chimérické molekuly, které mají aktivitu namířenou proti ligandu KAy nebo proti jeho receptorů. Takže pro blokování ligandu Kay nebo jeho receptorů je možné využít jak monoklonálních tak polyklonálních protilátek (Ab) namířených proti ligandu Kay, nádorovému ligandu a jejich receptorům, a také protilátkové fragmenty jako např. Fab' nebo F(ab')₂ se mohou užít k zablokování ligandu a jeho receptorů.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-299, 1991). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly et al., patent * · · · · ·

- 21 • · · · · · · · · · • ·· ··· · ··· · ·

U.S. 4 816 567). Chimérické protilátky redukují imunitní odpověď vyvolanou zvířecím protilátkami, když jsou použity v klinických aplikacích pro lidské pacienty.

Kromě toho se mohou syntetizovat rekombinantní humanizované protilátky, rozpoznávající ligand Kay nebo jeho receptor. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná protilátka a odstraní se z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu. Úsek vážící antigen ze zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn úsek vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (tj. mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, a tak snižují pravděpodobnost vyvolání imunitní odpověď u ošetřovaného pacienta.

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také tak, že se připraví chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní domény (CH1, CH2 a CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Tak např. se mohou připravit rekombinantním způsobem protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro antigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J. Exp. Med. 177: 1439-1450, 1993).

Kromě toho lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny tím, že se změní zbytky aminokyselin v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Quenn et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989).

• · · · * ♦

- 22 ·»· * » · 9 9 9 » • · · · · · · · · · » φ

F. Vytváření analogů: Příprava změněných sekvencí DNA a peptidových sekvencí

Analogy ligandu Kay podle vynálezu se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího ligandu v sekvenci aminokyselin, nebo jiným způsobem než aminokyselinovou sekvencí, nebo oběma způsoby. K jiným modifikacím než je modifikace sekvence patří jak in vitro tak in vivo chemická derivatizace ligandu Kay. K těmto nesekvenčním modifikacím patří změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci, přičemž tento výčet není limitující.

K výhodným analogům ligandu Kay patří jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvencí uvedené zde jako sekvence id. č. 2 jednou nebo několika konzervativními substitucemi, delecemi nebo inzercemi aminokyselin, které nenarušují biologickou aktivitu ligandu Kay. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících skupin: valin - glycin, glycin - alanin, valin - isoleucin - leucin, kyselina asparagová -kyselina glutamová, asparagin - glutamin, serin - threonin, lysin arginin a fenylalanin - tyrosin.

Konzervativní záměny aminokyselin jsou přehledně uvedeny v následující tabulce 1.

- 23 ·♦·· •« »» · · • · · · · · » ···· • · · · · · · · * « * · · · ♦ · · 9 · · 0 · · • · · · · · · · · · · · ·· * · · · 0* · · ··

Tab. 1

Konzervativní záměny aminokyselin

Aminokyselinu	Kód	Lze nahradit jakoukoliv z následujících
Alanin	A	D-Ala, Gly, Beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparagová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp,
Kyselina glutamová	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro,-Ala, Asp
Isoleucin	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-Homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Methionin	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
Fenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His Trp, D-Trp, Trans-3,4 nebo 5-fenylprolin, cis-3,4 nebo 5-fenylprolin

- 24 ·* ·· ·♦ ««·· »· »· «··· ·· · t · v · ···· ·» * « · to · • · * · · to · 9 · t 9 t ·

Tab. 1 - pokračování

Aminokyselinu	Kód	Lze nahradit jakoukoliv z následujících
Prolin	P	D-Pro, L-l-thioazolidin-4-karboxylová kyselina, D- nebo L-l-oxazolidin-4- karboxylová kyselina
Serin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	v	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

K užitečným metodám mutageneze patří mutageneze pomocí PCR a saturační mutageneze, které budou podrobněji popsány v následující části. Také je možné vytvořit knihovnu variant náhodných sekvencí aminokyselin pomocí syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí.

PCR mutageneze

Při mutagenezi pomocí PCR se využívá malá přesnost Taq polymerázy k zavedení náhodných mutací do klonovaného fragmentu DNA (Leung et al., Technique 1: 11-15, 1989) . Je to velmi účinná a přitom velmi rychlá metoda pro vnesení náhodných mutací. Úsek DNA, který má být mutován, se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v podmínkách, které snižují přesnost Taq polymerázy, např. jestliže je poměr dGTP/dATP přibližně roven 5 a přidá se Mn²⁺ do reakční směsi pro PCR. Celá sada amplifikovaných fragmentů se pak klonuje do vhodných vektorů a vytvoří se tak knihovna náhodných mutant.

•Φ t··· ·· ·· l · · · · · <

► · ·· · · · » · · · · · · ► · · · · · » 4 ·· ·« ·· ·* i e« i • · · 4 *· ··

- 25 Saturační mutageneze

Saturační mutageneze dovoluje rychlé vnesení velkého počtu mutací typu substituce jedné baze do klonovaného fragmentu DNA (Mayers et al., Science 229:242, 1985). Tato technika zahrnuje vytvoření mutací, např. chemickým ošetřením nebo ozářením jednořetězcové DNA in vitro, a pak syntézu komplementárního řetězce DNA. Frekvence mutací může být ovlivněna silou působícího účinku a v podstatě lze dosáhnout substituce všech možných baží. Jelikož celý tento proces nezahrnuje žádnou genetickou selekci mutovaných fragmentů, získají se tak fragmenty jak s neutrálními substitucemi, tak náhodně mutované fragmenty DNA, ze kterých se mohou připravit proteiny se změněnou funkcí. Distribuce bodových mutací není přitom nijak ovlivněna vzhledem ke konzervativním sekvenčním prvkům.

Degenerované oligonukleotidy

Knihovnu homologů je možné připravit pomocí sady degenerovaných oligonukleotidů. Chemická syntéza degenerovaných sekvencí se může provést na zařízení pro automatickou syntézu DNA, a syntetické geny se pak vloží (ligují) do vhodného expresního vektoru. Syntéza degenerovaných oligonukleotidů je způsob v oboru dobře známý^(XXX) a tento způsob byl již využit pro cílený vývoj jiných proteinů^(XXXI).

Způsoby nenáhodné neboli cílené mutageneze se mohou využít pro přípravu specifických sekvencí nebo mutací v určitých specifických úsecích. Tyto způsoby vytvoření variant, které obsahují se mohou využít pro delece, inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků ve známé aminokyselinové sekvenci proteinu. Místa mutací se mohou individuálně nebo v sériích např. tak, že se substituují konzervativní aminokyseliny a pak radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích 2) deletují se (odstraní) cílové zbytky a 3) inzerují se modifikovat

1) nejdříve se provádějí • · · · • · ···· · · · · · · · • « · · ·· · · · · ·

- 26 (vloží) zbytky stejné nebo jiné třídy do sousedství příslušného místa, nebo se kombinují všechny uvedené způsoby 1 až 3.

Mutageneze nahrazováním alaninem

Mutageneze nahrazováním alaninem (alanin scanning) je metoda vhodná pro identifikaci určitých zbytků nebo úseků požadovaných proteinů, která jsou výhodnými místy nebo doménami pro mutagenezi (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085,

1989). Při této metodě se identifikují zbytky, nebo skupiny zbytků (např. nabité aminokyselinové zbytky jako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí se neutrální nebo negativní aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem). Tyto náhrady aminokyselin mohou ovlivnit interakci aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buňky. Domény, u kterých se projeví funkční citlivost na substituce, se mohou dále zpřesňovat vnášením dalších změn nebo změnami již substituovaných míst. Takže zatímco místo pro vložení variace aminokyselinové sekvence je předem určeno, povaha mutace sama o sobě předem určena není. Tak např. pro optimalizaci účinnosti mutace v určitém místě je možné provést nahrazovací mutagenezi alaninem nebo náhodnou mutagenezi na cílovém kodonu nebo úseku a exprimovat varianty podjednotek požadovaného proteinu, a ty pak testovat na optimální kombinaci a požadovanou aktivitu.

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy je metoda vhodná pro přípravu substitučních, delečních a inzerčních variant DNA (viz např. Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Požadovaná DNA může být změněna tím, že hybridizuje s oligonukleotidem, který obsahuje mutaci DNA templátu, kde templátem je jednořetězcová forma plazmidu nebo bakteriofágu obsahující nezměněnou nebo nativní sekvenci DNA pro požadovaný protein. Po hybridizace se použije DNA polymeráza pro syntézu * · • · · ·

celého komplementárního řetězce, takže templát pak obsahuje vložený oligonukleotidový primer a tudíž kóduje vybrané změny v DNA pro daný protein. Obecně se užívají oligonukleotidy velikosti nejméně 25 nukleotidů. Optimální oligonukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidů, které jsou plně komplementární k templátu na obou stranách od nukleotidu (případně nukleotidů) kódujícího mutaci. To zajistí, že oligonukleotid bude správně hybridizovat s jednořetězcavou templátovou DNA. Oligonukleotidy lze snadno syntetizovat způsoby známými v oboru (viz např. Crea et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 5765, 1978).

Kazetová mutageneze

Dalším způsobem, jak připravit varianty, je kazetová mutageneze, která je založená na technice, kterou popsali Wells et al. (Gene 34: 315, 1985) .

(nebo jiný vektor), který která má být

Výchozím materiálem je plazmid obsahuje DNA pro proteinovou mutována. Nejdříve je třeba podj ednotku, identifikovat kodon (případně kodony), které mají být v proteinové podjednotce mutovány. Je třeba, aby na každé straně od mutovaného místa bylo jedinečné místo pro restrikční endonukleázu. Pokud takové restrikční místo neexistuje, je třeba ho v požadované -lokalizaci vytvořit pomocí výše popsané mutageneze zprostředkované oligonukleotidem. Poté, co do plazmidu byly vložena restrikční místa, plazmid se v těchto místech naštěpí, a tedy linearizuje. Pak se standardním způsobem syntetizuje dvouřetězcový oligonukleotid, který kóduje sekvenci DNA mezi dvěma požadovanou mutaci. Každý samostatně a syntetizován standardním a obsahuje řetězec je restrikčními místy oligonukleotidový pak spolu hybridizují zase způsobem v oboru známým. Tento dvouřetězcový oligonukleotid je nazýván kazetou. Kazeta je přitom navržena tak, aby obsahovala 3'-konec a 5'-konec kompatibilní s konci linearizovaného plazmidu, takže může být přímo do plazmidu

A · • · · · • 9

- 28 ligována. Plazmid pak obsahuje mutovanou sekvenci DNA požadovaného proteinu.

Kombinační mutageneze

Pro vytvoření mutací je také možné použít kombinační mutagenezi. Např. aminokyselinové sekvence skupiny homologních nebo jinak příbuzných proteinových sekvencí se přiřadí (uspořádají), a sice výhodně tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Všechny sekvence, které se objeví v dané pozici u všech uspořádaných sekvencí se vyberou a vytvoří se z nich degenerovaná sada kombinačních sekvencí. Kombinační mutagenezi se vytvoří velmi různorodá knihovna variant na úrovni nukleových kyselin. Tak např. směs syntetických oligonukleotidů se enzymaticky liguje do genových sekvencí tak, že degenerovaná sada potenciálních sekvencí je exprimovatelná jako individuální peptidy, nebo alternativně, jako sada delších fúzních proteinů obsahujících sadu degenerovaných sekvencí.

Různé techniky jsou v oboru známé pro screening produktů vytvářených mutovanými geny. Techniky pro screening velkých genových knihoven často zahrnují klonování knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných buněk výslednou knihovnou vektorů, a expresi genů v podmínkách, kde detekce požadované aktivity, t j . v tomto případě vazbu na ligand Kay nebo jeho receptor, umožňuje relativně snadnou izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Každá z technik popisovaných v následujících odstavcích je vhodná k vysoce účinnému a vysokokapacitnímu testování velkého počtu sekvencí vytvářených např. technikami náhodné mutageneze.

Vynález dále poskytuje možnost připravovat mimetika pro redukci proteinových vazebných domén polypeptidu podle vynálezu nebo jeho receptoru, např. peptidová činidla nebo činidla jiné povahy než peptidy. Peptidová mimetika jsou schopna narušit vazbu ligandu Kay a jeho receptoru. Kritické zbytky ligandu Kay « « • ·

- 29 účastnící se procesu molekulového rozpoznávání receptorového polypeptidu nebo příslušného následného intracelulárního proteinu v signální dráze, mohou být určeny a použity pro přípravu peptidových mimetik ligandu Kay nebo jeho receptoru, která kompetitivně nebo nekompetitivně inhibují vazbu ligand Kay a jeho receptoru (viz např. Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene protein, patentové přihlášky EP 412 762 A a EP 831 080 A, které jsou zahrnuty formou odkazu).

G. Farmaceutické přípravky

Tím, že předkládaný vynález poskytuje purifikované a rekombinantní ligandy Kay, poskytuje také metodu testování, kterou je možné užít pro testování kandidátů léčiv, která jsou funkčně buďto agonisty nebo antagonisty normální buněčné funkce, v tomto případě ligandu Kay nebo jeho receptoru. V jednom provedení předkládaného vynálezu se pomocí takového testu hodnotí schopnost sloučeniny modulovat vazbu mezi ligandem Kay a jeho receptorem. Odborníkovi je zřejmé, že je možné vytvářet různé varianty testů podle předkládaného vynálezu.

V mnoha programech pro screening léků, které se užívají k testování celé knihovny sloučenin nebo přírodních extraktů, jsou požadovány metody s velkou účinností a kapacitou zpracovaných vzorků, aby bylo možné maximalizovat počet sloučenin otestovaných za jednotku času. Testy, které se provádějí na bezbuněčném systému, jako jsou např. purifikované nebo semipurifikované proteiny, jsou často výhodné jako testy pro tzv. primární screening, který dovoluje rychlý vývoj těchto sloučenin, neboť umožňuje relativné snadnou detekci změn molekulového cíle, ke které dochází působením testované sloučeniny. Avšak toxické působení na buňky a/nebo biologická dostupnost testované sloučeniny mohou zůstat v takovém in vitro systému bez povšimnutí, neboť test je primárně zaměřen na působení léčiva na molekulový cíl, kde se projevuje změnou vazebné afinity k jiným proteinům nebo změnami enzymatických vlastností molekulového cíle.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství ligandů Kay nebo jeho receptoru, nebo jejich fragmentů nebo mimetik, a případně obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky.

Vynález se tudíž také týká způsobů léčení rakoviny a způsobů stimulace, nebo v určitých případech naopak inhibice, imunitního systému, nebo jeho částí, které spočívají v podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo jejích farmaceuticky přijatelných solí nebo derivátů. Přitom odborníkovi je zřejmé, že sloučeniny a způsoby podle vynálezu se mohou kombinovat s řadou dalších terapií.

Přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány pro různé způsoby podávání, včetně systémového, topického nebo lokálního podávání. Pro systémové podávání je výhodné podávání injekční, včetně intramuskulární, intravenózní, intraperitoneální a subkutánní injekce, přičemž přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován jako vodný roztok, výhodně ve fyziologicky kompatibilním pufru jako je např. Hankův nebo Ringerův roztok. Kromě toho přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován v pevné formě pro případné rozpuštění nebo resuspendování bezprostředně před použitím. Předkládaný vynález se také týká lyofilizovaných forem přípravku.

Přípravek podle předkládaného vynálezu se může podávat také perorálním, transmukosálním nebo transdermálním způsobem. V přípravku pro transmukosální nebo transdermální podávání se použijí vhodné látky usnadňující penetraci (penetranty) vzhledem k bariéře, kterou je nutno překonat. Takové penetranty • · · · • ·

- 31 jsou v oboru známy a patří k nim např. pro transmukosální podávání soli žlučové kyseliny, deriváty kyseliny fusidové a detergenty. Transmukosální podávání lze provádět buď nosní aerodisperzí (sprejem) nebo pomocí čípků. Pro perorální podávání je přípravek formulován v obvyklé lékové formě vhodné pro perorální podávání jako jsou kapsle, tablety a tonika. Pro topické podávání může být přípravek ve formě mastí, mazání, gelů nebo krémů, jak je v oboru všeobecně známo.

Přípravky podle vynálezu jsou výhodně v jednotkové dávkové formě a podávají se jedenkrát nebo vícekrát denně. Množství aktivní látky podané buď v jedné dávce nebo v průběhu léčení je závislé na mnoha různých faktorech. Tak např. na věku a velikosti subjektu, závažnosti a průběhu onemocnění, které se léčí, způsobu a formě podávání, a samozřejmě na úsudku ošetřujícího lékaře. Avšak účinná dávka je v rozmezí 0,005 až 5 mg/kg/den, výhodně 0,05 až 0,5 mg/kg/den. Odborník sám posoudí, kdy mohou být prospěšné nižší či vyšší dávky.

Genové konstrukty podle předkládaného vynálezu se mohou použít také jako součást protokolu genové terapie pro přenos nukleových kyselin kódujících buďto agonistické nebo antagonistické formy polypeptidu ligandu Kay.

Expresní konstrukty ligandu Kay podle vynálezu se mohou podávat prostřednictvím jakéhokoliv biologicky účinného nosiče, např. jakéhokoliv farmaceutického přípravku schopného účinně přenést in vivo gen pro ligand Kay podle vynálezu do buňky. Tento přístup znamená vložit gen do virového vektoru, který může přímo transfekovat buňku, nebo podat plazmidovou DNA, pomocí např. liposomů, nebo nějakého vnitrobuněčného nosiče, anebo se může jednat o přímou injekci genového konstruktu. Výhodnou metodou je přenos pomocí virového vektoru.

Farmaceutický přípravek s genovým konstruktem pro genovou terapii se skládá v podstatě ze systému pro přenos genů a vhodného ředidla, nebo se může jednat o matrix umožňující • ·

- 32 pomalé uvolňování, do které je systém přenášející gen zapuštěn. Alternativně, pokud celý systém pro přenos genů může být připraven intaktní z rekombinantních buněk, např. jako retrovirový vektor, farmaceutický přípravek pak obsahuje jednu nebo několik buněk, které produkují systém pro přenos genů.

Kromě použití pro terapii se oligomery podle předkládaného vynálezu mohou použít jako diagnostické reagencie pro detekci přítomnosti či absence cílové DNA, RNA nebo sekvencí aminokyselin, ke kterým se specificky váží. Jiným aspektem předkládaného vynálezu je použití pro hodnocení chemické sloučeniny z hlediska její schopnosti reagovat, tj. např. vázat se či jinak fyzikálně asociovat, s ligandem Kay nebo jeho fragmenty. Způsob obsahuje kontaktování chemické látky s ligandem Kay a hodnocení schopnosti látky reagovat s ligandem Kay. Kromě toho ligand Kay podle předkládaného vynálezu se může použít v metodách pro hodnocení přirozeně se vyskytujících ligandů Kay nebo receptorů ligandu KAy, a také pro hodnocení chemických látek, které se asociují nebo váží s receptory ligandu Kay.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob hodnocení chemické látky z hlediska její schopnosti modulovat interakci mezi ligandem Kay a jeho receptorem. Tento způsob obsahuje smíchání ligandu Kay a receptorů ligandu Kay v podmínkách, kde taková dvojice je schopna interakce, pak přidání chemické látky, která se testuje, a detekci vytvoření a nebo naopak rozpadu komplexu. Taková modulující činidla se mohou dále hodnotit testy in vitro např. testováním jejich aktivity v bezbuněčném systému, případně ošetřením buněk těmito činidly nebo podáváním těchto činidel zvířatům a následným hodnocením účinků.

Λ · • · · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace receptoru vázajícího ligand Kay

Pro identifikaci a klonování receptorů byly použity ligandy rodiny TNF. Pomocí popsaných sekvencí ligandu Kay bylo možné fúzovat 5'-konec extracelulární domény, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, k markerové nebo značkovací sekvenci a pak přidat vedoucí sekvenci, která podporuje sekreci ligandu v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad takového postupu byl popsán v práci Browning et al. (JBC 271: 8618-8626, 1996), kdy ligand LT-β byl sekretován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké značkovací sekvenci peptidu myc s extracelulární doménou LT-β. Sekvence VCAM byla použita proto, aby napomohla sekreci molekuly LT-β, která je normálně vázána na membránu. Sekretovaný protein si ponechával značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižovala jeho schopnost vázat se na receptor. Takový sekretovaný protein se pak exprimoval buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS nebo v podobném systému, např. vektorech odvozených od EBNA, systému hmyzí buňky a bakuloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného ligandu se využil nepurifikovaný buněčný supernatant.

Buňky exprimující receptor bylo možné identifikovat tím, že se exponovaly označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak identifikovaly pomocí průtokové cytometrie FACS, když se myc označil protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a pak fykoerytrinem (nebo obdobnou značkou) značeným anti-myším imunoglobulinem. Buňky pozitivní ve FACS se snadno identifikovali a sloužily pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této RNA se pak připravila standardním postupem expresní • · · · • ·

- 34 knihovna a byla rozdělena do podskupin (pools). Tyto podskupiny klonů se pak transfekovaly do vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované buňky s receptorem se identifikovala pomocí mikroskopického vyšetření poté, co se navázaný myc peptid označil anti-myším imunoglobulinem označeným enzymem, např. galaktosidázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikovala pozitivní podskupina klonů, zmenšovala se velikost podskupin dokud nebyla identifikována cDNA kódující receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto s myším nebo lidským ligandem Kay, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptoru.

Odborníkovi je zřejmé, že je možné provést různé modifikace přípravků APRÍL podle předkládaného vynálezu v rámci vynálezecké myšlenky vynálezu. Předkládaný vynález proto zahrnuje i takové modifikace a variace, pokud spadají do předmětu vynálezu vymezeného následujícími nároky, nebo pokud jde o ekvivalentní řešení.

SEZNAM SEKVENCÍ

Sekvence id. č. 1

1	TGCCAAGCCC	TGCCATGTAG
51	CAGGAAATGA	TCCATTCCCT
101	CAAAGTTCAA	GTAGTGATAT
151	CCTTACTTCT	TGCCTTAAGA
201	TTTCCATCCT	CCCACGGAAG
251	GGAAAGCTGC	TGGCTGCAAC
301	CACGGTGGTG	TCTTTCTACC
351	GCCTCCGGGC	AGAGCTGCAG
401	GCAGGAGCCC	CCAAGGCCGG
451	ACTGAAAATC	TTTGAACCAC
501	ACAGCAGAAA	TAAGCGTGCC
551	GACTGCTTGC	AACTGATTGC
601	ATCTTACACA	TTTGTTCCAT
651	TAGAAGAAAA	AGAGAATAAA
701	ATATATGGTC	AGGTTTTATA
751	AATTCAGAGG	AAGAAGGTCC
801	CTTTGTTTCG	ATGTATTCAA
851	TGCTATTCAG	CTGGCATTGC
901	TGCAATACCA	AGAGAAAATG
951	TTTTTGGTGC	ATTGAAACTG
1001	ATTTTCCTCC	CTTTCTCTGT
1051	TA

TGCACGCAGG ACATCAACAA ACACAGATAA GTGGTCACTT ATTCTAAAGG CCCCAACCTT GGATGACTCC ACAGAAAGGG AGCAGTCACG AAAGAGAAGA AATGAAACTG AAGGAGTGTG GAAAGCCCCT CTGTCCGATC CTCCAAAGAC CTTGCTGCTG GCACTGCTGT CTTGCTGCCT AGGTGGCCGC CCTGCAAGGG GACCTGGCCA GGCCACCACG CGGAGAAGCT GCCAGCAGGA CCTGGAGGAA GCTCCAGCTG TCACCGCGGG CAGCTCCAGG AGAAGGCAAC TCCAGTCAGA GTTCAGGGTC CAGAAGAAAC AGTCACTCAA AGACAGTGAA ACACCAACTA TACAAAAAGG GGCTTCTCAG CTTTAAAAGG GGAAGTGCCC ATATTGGTCA AAGAAACTGG TTACTTTTTT TACTGATAAG ACCTACGCCA TGGGACATCT ATGTCTTTGG GGATGAATTG AGTCTGGTGA AATATGCCTG AAACACTACC CAATAATTCC AAAACTGGAA GAAGGAGATG AACTCCAACT CACAAATATC ACTGGATGGA GATGTCACAT CTGTGACCTA CTTACACCAT GTCTGTAGCT ACCTCTAAGA AGAAAGAATC TAACTGAAAA

Sekvence id. č. 2

MDDSTEREQS RLTSCLKKRE 51 TLLLALLSCC LTWSFYQVA 101 GLEEAPAVTA GLKIFEPPAP 151 ADSETPTIQK GSYTFVPWLL 201 YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF 251 AKLEEGDELQ LAIPRENAQI

EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI SFKRGSALEE KENKILVKET GYFFIYGQVL GDELSLVTLF RCIQNMPETL PNNSCYSAGI SLDGDVTFFG ALKLL • · » · · ·

9

- 36 Sekvence id. č. 3

GTGGTCACTT ACTCCAAAGG CCTAGACCTT CAAAGTGCTC CTCGTGGAAT 51 GGATGAGTCT GCAAAGACCC TGCCACCACC GTGCCTCTGT TTTTGCTCCG 101 AGAAAGGAGA AGATATGAAA GTGGGATATG ATCCCATCAC TCCGCAGAAG 151 GAGGAGGGTG CCTGGTTTGG GATCTGCAGG GATGGAAGGC TGCTGGCTGC 201 TACCCTCCTG CTGGCCCTGT TGTCCAGCAG TTTCACAGCG ATGTCCTTGT 251 ACCAGTTGGC TGCCTTGCAA GCAGACCTGA TGAACCTGCG CATGGAGCTG 301 CAGAGCTACC GAGGTTCAGC AACACCAGCC GCCGCGGGTG CTCCAGAGTT 351 GACCGCTGGA GTCAAACTCC TGACACCGGC AGCTCCTCGA CCCCACAACT 401 CCAGCCGCGG CCACAGGAAC AGACGCGCTT TCCAGGGACC AGAGGAAACA 451 GAACAAGATG TAGACCTCTC AGCTCCTCCT GCACCATGCC TGCCTGGATG 501 CCGCCATTCT CAACATGATG ATAATGGAAT GAACCTCAGA AACAGAACTT 551 ACACATTTGT TCCATGGCTT CTCAGCTTTA AAAGAGGAAA TGCCTTGGAG 601 GAGAAAGAGA ACAAAATAGT GGTGAGGCAA ACAGGCTATT TCTTCATCTA 651 CAGCCAGGTT CTATACACGG ACCCCATCTT TGCTATGGGT CATGTCATCC 701 AGAGGAAGAA AGTACACGTC TTTGGGGACG AGCTGAGCCT GGTGACCCTG 751 TTCCGATGTA TTCAGAATAT GCCCAAAACA CTGCCCAACA ATTCCTGCTA 801 CTCGGCTGGC ATCGCGAGGC TGGAAGAAGG AGATGAGATT CAGCTTGCAA 851 TTCCTCGGGA GAATGCACAG ATTTCACGCA ACGGAGACGA CACCTTCTTT 901 GGTGCCCTAA AACTGCTGTA ACTCACTTGC TGGAGTGCGT GATCCCCTTC 951 CCTCGTCTTC TCTGTACCTC CGAGGGAGAA ACAGACGACT GGAAAAACTA 1001 AAAGATGGGG AAAGCCGTCA GCGAAAGTTT TCTCGTGACC CGTTGAATCT 1051 GATCCAAACC AGGAAATATA ACAGACAGCC ACAACCGAAG TGTGCCATGT 1101 GAGTTATGAG AAACGGAGCC CGCGCTCAGA AAGACCGGAT GAGGAAGACC 1151 GTTTTCTCCA GTCCTTTGCC AACACGCACC GCAACCTTGC TTTTTGCCTT

1201 GGGTGACACA TGTTCAGAAT GCAGGGAGAT TTCCTTGTTT TGCGATTTGC 1251 CATGAGAAGA GGGCCCACAA CTGCAGGTCA CTGAAGCATT CACGCTAAGT 1301 CTCAGGATTT ACTCTCCCTT CTCATGCTAA GTACACACAC GCTCTTTTCC 1351 AGGTAACTAC TATGGGATAC TATGGAAAGG TTGTTTGTTT TTAAATCTAG 1401 AAGTCTTGAA CTGGCAATAG ACAAAAATCC TTATAAATTC AAGTGTAAAA 1451 TAAACTTAAT TAAAAAGGTT TAAGTGTG

Sekvence id. č. 4

MDESAKTLPP PCLCFCSEKG EDMKVGYDPI TPQKEEGAWF GICRDGRLLA 51 ATLLLALLSS SFTAMSLYQL AALQADLMNL RMELQSYRGS ATPAAAGAPE 101 LTAGVKLLTP AAPRPHNSSR GHRNRRAFQG PEETEQDVDL SAPPAPCLPG 151 CRHSQHDDNG MNLRNRTYTF VPWLLSFKRG NALEEKENKI WRQTGYFFI 201 YSQVLYTDPI FAMGHVIQRK KVHVFGDELS LVTLFRCIQN MPKTLPNNSC

251 YSAGIARLEE GDEIQLAIPR ENAQISRNGD DTFFGALKLL • · · ·

Citovaná literatura

i. Smith et al. 1990; Kohno et al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.

ii. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.

iii. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A.

Waage, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

iv. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).

v. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in

Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in

Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 371 (1992).

vi. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).

vii. D. A. Fox, Am. J. Med..99. 82 (1995).

viii. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol., 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).

ix. L. A. Tartaglia et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88,9292 (1991); L.A. Tartaglia and D. V. Goeddel, Immunol, Today. 13, 151 (1992).

x. B. Luettig et al., J. Immunol.. 143,4034 (1989); M. Kriegler et al., Cell. 53,45 (1988).

xi. C. F. Ware et al., in Pathways for Cvtolvsis. G. M. Grifflths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p 175-218 (1995).

xii. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol..6.407 (1988).

xiii. P.D. Crowe et al.. Science. 264.707 (1994). (J. Browning et al.. Cell. 72. 847 (1993); J. Browning et al., J. Immunol.. 154, 33 (1995).

xiv. P. De Togni et al., Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol.. 155, 1685 (1995).

xv. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol.,143.1859 (1989); J. Browning et al., J. Exp. Med..183. 867 (1996).

xvi. T. Suda et al., J. Immunol., 154, 3806 (1995)(T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806(1995).

xvii. B.C. Trauth et al., Science. 245,301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med., 169,1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science, 267,1449 (1995); M. H. Falk et al.. Blood, 79. 3300 (1992).

xviii.F. Rieux-Laucat et al., Science, 268,1347 (1995); T. Takahashi et al., Cell, 76,969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nátuře, 356, 314 (1992).

xix. P. R. Galle and al., J. Exp. Med., 182, 1223 (1995).

xx. F. Silvestris and al., Clin. Immunol. Immunopathol.. 75, 197 (1995).

xxi. P.D. Katsikis et al., J. Exp. Med.,181. 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol..7Q. 199 (1996).

xxii. S. Wiley et al., Immunity. 3, 673 (1995).

xxiii. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett., 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood, 83,2787(1994).

xxiv. R. C. Allen et al., Science. 259, 990 (1993).

xxv. L. Biancone et al., Kidney-Int.,48.458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol., 154,1470(1995).

xxvi. J. Ruby and al., Nátuře Medicine. 1,437 (1995).

xxvii. Z. Wang et al., J. Immunol.. 155, 3722 (1995); A. M. Cleary and al., J. Immunol.. 155.3329 (1995).

xxviii. S. Hess and H. Engelman, J. Exp. Med.. 183. 159 (1996).

xxix. R. G. Goodwin et al, Cell, 73,447 (1993); Goodwin et al, Eur. J. Immunol., 23,2631 (1993); C. A. Smithet al.. Cell, 73, 1349(1993).

xxx. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proč 3rd Cleveland Svmpos, Macromolecules. ed. AG Walton, Amsterdam; Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

• · · · • 9

- 39 xxxi. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346, and 5,096,815.

33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand. J. Immunol. 155:4147-4154,1995.

34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Moři, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.

35. R. Amakawa, A. Hákem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84:551-562, 1996.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bomand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosismediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor and fas (apo-l/CD95). Immunity 6: 79-88,1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFR-related protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosissarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87:845-855,1996.

38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33-kDa glycóprotein are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma. J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.

39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffíths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26, 1996.

40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W. Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negative selection of thymocytes. Immunity 5:617-627, 1996.

41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20:465-470,1995.

- 40 42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouše macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim, Biophvs. Res. Comm. 209: 1076-1081, 1995.

43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Gentz, J. Ni and V.M. Dixit. Signál transduction by DR3 a deathdomain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274: 990992, 1996.

44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7,1994.

45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S.

Kwon and T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on Ml2 B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181: 985-992, 1995.

46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol. 158: 1756-1762, 1997.

47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its ligand gp39. Ann. Rev. Immunol. 14: 591-617, 1996.

48. H.J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R.J. Armitage, C.A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell lineš. Blood 83:2045-56, 1994.

49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Nátuře 384: 372-375, 1996.

51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cell hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J. Exp, Med. 183: 669-674, 1996.

- 41 » · · ·

52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87: 427-436, 1996.

53. S.Nagata. Apoptosis by death factor. Cell 88:355-365,1997.

54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem. 1996.

55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell 76: 95962, 1994.

56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol, 3: 81-88, 1994.

57. E.Strueber and W. Strober. The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T cell independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989, 1996.

58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunitv 5: 17-30, 1996.

59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10:411-452,1992.

60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nátuře 377:348-351,1995.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sekvence DNA kódující ligand Kay nebo její fragment.
2. Sekvence DNA kódující ligand Kay, která je tvořena v podstatě sekvencí id. č. 1 nebo sekvencí id. č. 3.
3. Sekvence DNA tvořená v podstatě sekvencí id. č. 1 nebo sekvencí id. č. 3, která kóduje polypeptid, tvořený v postatě sekvencí id. č. 2 nebo sekvencí id. č. 4.
4. Sekvence DNA, která hybridizuje alespoň s fragmentem sekvence id. č. 1 nebo id. č. 3, přičemž fragment obsahuje souvislý úsek alespoň 20 po sobě jdoucích baží a DNA sekvence kóduje polypeptid alespoň z 30 % homologní s aktivním místem ligand Kay.
5. Sekvence DNA podle nároku 2, která je tvořena v podstatě sekvencí id. č. 1 nebo id. č. 3 s konzervativními substitucemi, alteracemi nebo delecemi.
6. Rekombinantní molekula DNA obsahující sekvenci kódující ligand Kay, kterážto sekvence je operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí.
7. Molekula podle nároku 6, která obsahuje sekvenci id. č. 1 nebo sekvenci id. č. 3.
8. Jednobuněčný hostitel transformovaný molekulou rekombinantní DNA podle nároku 6 nebo 7.

• * • · · · · · · · · · · • ·· ··· · ··· ·· ·

- 43 9. Sekvence DNA kódující ligand Kay, který má aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 nebo id. č. 4.

10. Způsob přípravy v podstatě čistého ligandu Kay vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se kultivuje jednobuněčný hostitel podle nároku 8.

11. Ligand Kay v podstatě zbavený živočišných proteinů, se kterými je normálně asociován.

12. Ligand Kay podle nároku 11 tvořený v podstatě sekvencí id. č. 2 nebo sekvencí id. č. 4.

13. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství ligandu Kay nebo jeho aktivního fragmentu a farmaceuticky přijatelný nosič.

14. Způsob prevence nebo redukce vážnosti autoimunitní nemoci vyznačující se tím, že obsahuje krok podání terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku podle nároku 13.

15. Farmaceutický přípravek podle nároku 13 vyznačující se tím, že ligand Kay nebo jeho aktivní fragment obsahuje sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4 nebo jejich biologicky aktivní fragment.

16. Způsob prevence nebo redukce míry autoimunitní reakce na tkáňový štěp vyznačující se tím, že obsahuje krok podání terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku podle nároku 13.
9 « * · · ·

17. Způsob stimulace imunitního systému vyznačuj ící se t 13. i m, že obsahuje krok podání přípravku podle nároku 18. Způsob potlačení imunitního systému vyznačuj ící

se tím, že obsahuje krok podání účinného množství farmaceutického přípravku podle nároku 13.

19. Způsob léčení rakoviny vyznačující se tím, že obsahuje krok podání účinného množství farmaceutického přípravku podle nároku 13.

20. Způsob identifikace receptoru pro ligand Kay vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) se poskytne ligand Kay nebo jeho fragment,

b) ligand Kay nebo jeho fragment se označí detekovatelnou značkou,

c) provede se screening sloučenin, aby se detekovaly receptory, které se váží na detekovatelně označený ligand Kay z kroku b)

21. Rozpustný biologicky aktivní fragment ligand Kay podle nároku 11.

22. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je kódována DNA vybranou ze skupiny obsahující:

a) sekvenci DNA obsahující sekvenci id. č. 1 nebo id. č. 3

b) sekvenci DNA, která hybridizuje s DNA definovanou v a) a která kóduje polypeptid alespoň ze 40 % homologní s ligandem Kay podle nároku 12.

- 45 ·· *·

I · · 1

I * · 4

23. Protilátkový nebo s jeho fragmenty. preparát, receptorem který nebo je reaktivní s ligandem Kay j ej ich biolo gicky aktivními 24. Protilátkový preparát podle nároku 23, který obsahuj e monoklonální protilátku.

25. Způsob přípravy protilátkového preparátu reaktivního s ligandem Kay nebo s jeho receptorem vyznačuj ící se t i m, že obsahuje krok, kdy se organismus imunizuje ligandem Kay nebo jeho receptorem nebo jejich antigenním fragmentem.

26. Antisense nukleová kyselina proti ligandu Kay, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny hybridizující alespoň s částí sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 3.

27. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový preparát podle nároku 24.

28. Způsob exprese genu v buňce savce vyznačuj ící se t í m, že obsahuje kroky, kdy:

a) gen kódující ligand Kay se vnese do buňky,

b) buňka se ponechá žít v takových podmínkách, že gen se exprimuje v savci.

29. Způsob léčení nemocí spojených s ligandem Kay u savců vyznačující se tím, že

a) do buňky se vnese terapeuticky účinné množství vektoru obsahujícího gen kódující ligand Kay, a

b) gen se exprimuje v buňce savce.

·· ·· *· « · * « · · • · · · · « * • · · · α · · • · » · · · ·

9· ·» 9 · 9· • r ·· ·· *» ► · · ( » · * I

30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že savec je člověk.

31. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že vektor je virus.

32. Způsob indukce buněčné smrti vyznačující se tím, že obsahuje podání činidla schopného rušit vazbu ligandu Kay na jeho receptor.

33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že dále obsahuje podání interferonu-γ.

34. Způsob léčení, potlačení nebo změnění imunitní reakce zahrnující signální dráhu mezi ligandem Kay a jeho receptorem vyznačující se tím, že obsahuje krok podání účinného množství činidla schopného rušit vazbu mezi ligandem Kay a jeho receptorem.

Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že imunitní reakce zahrnuje buňky lidského adenokarcinomu.