CZ2000907A3 - Monoklonální protilátka indukující apoptózu - Google Patents
Monoklonální protilátka indukující apoptózu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000907A3 CZ2000907A3 CZ2000907A CZ2000907A CZ2000907A3 CZ 2000907 A3 CZ2000907 A3 CZ 2000907A3 CZ 2000907 A CZ2000907 A CZ 2000907A CZ 2000907 A CZ2000907 A CZ 2000907A CZ 2000907 A3 CZ2000907 A3 CZ 2000907A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- antibodies
- human
- iap
- případě
- Prior art date
Links
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 36
- 101710098610 Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 31
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000063 antileukemic agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 26
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 5
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 167
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 65
- 101000688216 Homo sapiens Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 39
- 101000616014 Homo sapiens Magnesium transporter protein 1 Proteins 0.000 description 39
- 102000053119 human ALPI Human genes 0.000 description 27
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 27
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 14
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 12
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 9
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 101000868281 Mus musculus Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000688214 Mus musculus Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 101000616015 Mus musculus Magnesium transporter protein 1 Proteins 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010063827 Extramedullary haemopoiesis Diseases 0.000 description 2
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 description 2
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 description 2
- 101100340613 Mus musculus Iap gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000713321 Intracisternal A-particles Species 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002810 primary assay Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012090 serum-supplement Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezujsou
protilátky, které specificky rozpoznávají lidský protein
asociovaný s integrinem a antigeny, které indukují apoptózu
krevních buněk sjádrem, které mají lidský protein asociovaný
s integrinem. V souladu stímjsoutyto látky použitelnéjako
protilátky, které rozpoznávají lidský protein asociovaný
s integrinemprojeho odlišení a identifikaci, zatímco také mají
účinek indukce apoptózy krevních buněk sjádrem; tyto
vlastnosti mohou být použity pro přípravu použitelných
terapeutických činidel v oblasti léčby myeloidní leukemie a
lymfoidní leukemie.
Description
Monoklonálni protilátky, indukující apoptózu
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nových monoklonálních protilátek, které mají vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem s proteinem asociovaným s integrinem (Integrin Associated Protein - IAP), stejně jako jejich fragmentů, nízkomolekulárních sloučenin peptidů a hybridomů, dále se týká které produkují monoklonálni protilátky. Nové protilátky jsou použitelné jako terapeutická činidla pro myeloidní leukémii a lymfoidní leukémii.
Dosavadní stav techniky
Faktory stimulující kolonie granulocytů, rekombinantní faktor stimulující kolonie (recombinant granulocyte colony-stimulating jako je granulocytů factor rG-CSF), jsou známy podle stavu techniky jako humorální faktory, které stimulují diferenciaci proliferaci granulocytů. Zprávy vycházející z in vivo experimentů na myších prokázaly, že podávání rG-CSF nevede pouze ke zrychlení myelopoézy v kostní dřeni, ale výrazně také ke zvýšení extramedulární hemopoézy ve slezině a k proliferaci všech hemopoetických prekursorových buněk ve slezině, v to počítaje hemopoetické kmenové buňky. Předpokládá se, že v mechanismu takové extramedulární hemopoézy ve slezině stimulace pomocí rG-CSF mění hemopoetické mikroprostředí ve slezině a podporuje její schopnost podporovat hemopoézu, čímž se indukuje hemopoéza.
• · · · · «
Pro vyjasnění hemopoetické funkce sleziny se přihlašovatelé dříve zaměřili na stromální buňky sleziny po opakovaném podávání rG-CSF. Přihlašovatelé se snažili určit, jak je podporována hemopoetická funkce pomocí rG-CSF prostřednictvím stromálních buněk a vytvořili hemopoetickou stromální buněčnou linii (CF-1 buňky) z myší sleziny opakovaným podáváním rG-CSF. Přihlašovatelé také studovali schopnost podporovat hemopoézu u hemopoetických stromálních buněk a potvrdili aktivitu stimulace kolonií in vitro a schopnost podporovat hemopoetické kmenové buňky in vivo [Blood, 80, 1914 (1992)].
I když však byla vytvořena jedna buněčná linie slezinných stromálních buněk (CF-1 buňky) a byly prostudovány jejich cytologické vlastnosti, specifické protilátky, které rozpoznávají povrchové antigeny těchto buněk nebyly nikdy připraveny a ani nebyly žádným způsobem objasněny jejich vlastnosti.
Vzhledem k výše uvedeným poznatkům, týkajících se slezinných stromálních buněk a výsledků výzkumu, který představuje stav techniky prováděli přihlašovatelé další výzkum s cílem vyvinout specifické protilátky, které by rozpoznávaly slezinné stromální buňky, pracovali na přípravě monoklonálních protilátek použitím výše uvedených slezinných stromálních buněčných linií jako senzibilizačního antigenu a nakonec se jim podařilo získat nové monoklonální protilátky.
Přihlašovatelé dále studovali vlastnosti monoklonálních protilátek získaných výše uvedeným způsobem a zjistili, že monoklonální protilátky mají vlastnost indukce myeloidní • · • · · · • · · · · · • · · · · ««··· • · · · · 9 · · · • · · · · ······ — 3 — ···· ·· ·· «· ·· ·· buněčné apoptózy. Tyto monoklonální protilátky byly označeny jako Protilátky BMAP-1 a dále budou označovány tímto způsobem.
Přihlašovatelé dále zkoumali antigen rozpoznávaný protilátkou BMAP-1 a zjistili, že se jedná o myši protein asociovaný s integrinem (myši IAP) (GenBank, Accession Number Z25524) na základě přímého expresního klonování.
Působení protilátek BMAP-1 bylo studováno pomocí rekombinantních buněk, do kterých byl vložen gen pro myší IAP. Konkrétně byl gen myšího IAP vložen do myších Jurkatových buněk, které neexprimují myší IAP a to konvenčními způsoby pro vytvoření buněčné linie exprimující myší IAP (rekombinantní Jurkatovy buňky) a působení protilátek BMAP-1 na buňky exprimující myší IAP bylo studováno pomocí testu MTS a DNA fragmentace použitím průtokové cytometrie (Japonská patentová přihláška č. HEI 967499).
Na základě těchto výzkumů se předpokládá, že monoklonální protilátky pro antigen lidského proteinu asociovaného s integrinem (human Integrin Associated Protein, který je dále označován jako lidský IAP; aminokyselinová sekvence a sekvence bází, popsané v J. Cell Biol., 123, 485-496, 1993; viz také Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995) by měly mít účinek indukce apoptózy krevních buněk s jádrem, které exprimuji tento antigen (myeloidní buňky a lymfocyty) a přihlašovatelé se pokusili připravit monoklonální protilátky pro antigen představovaný lidským proteinem asociovaným s integrinem a podařilo se jim získat • · · ♦ • · · · · 4 monoklonální protilátky, které indukují apoptózu lidských krevních buněk s jádrem, exprimujících tento antigen.
Jinými slovy jsou předmětem předloženého vynálezu nové monoklonální protilátky, které mají vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s lidským proteinem asociovaným s integrinem (lidský IAP) a jejich fragmenty, stejně tak jako hybridomy, které produkují monoklonální protilátky.
Uvedené nové monoklonální protilátky jsou použitelné jako terapeutická činidla pro myeloidní leukémii a lymfoidní leukémii.
Popsané funkce proteinu asociovaného s integrinem jsou vazba s β řetězcem integrinu ανβ3 podporující vazbu mezi ανβ3 a jeho ligandem vitronektinem (J. Cell. Biol., 123, 485-496 (1993)), dále indukce přítoku Ca2+ do vaskulárního endotelia po adhesi neutrofilů s vaskulárním endoteliem (J. Biol. Chem., 268, 19931-19934 (1993)) a nakonec podpora migrace neutrofilů vaskulárním endoteliem (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 3978-3982 (1995)), ale nebyly publikovány žádné zprávy, které by se týkaly jeho funkce ve vztahu k apoptóze krevních buněk s jádrem.
Podstata vynálezu
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu jsou protilátky, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem (human Integrin Associated Protein). Tyto protilátky proto vykazují funkci rozlišování a ·
0··
identifikace lidského proteinu asociovaného s integrinem.
Kromě toho monoklonální protilátky podle 'předloženého vynálezu jsou protilátky, které vykazují vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s lidským proteinem asociovaným s integrinem. Apoptóza je fenomén, ve kterém chromatinová DNA jádra jsou štěpena na nukleosomové jednotky (což je známo jako ladder formation), což vede ke smrti buňky a je také označováno jako buněčná sebevražda.
Monoklonální protilátky, o kterých je známo, že indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidních buněk a lymfocytů) zahrnují protilátky proti Fas (Cell, 66; 233-243, 1991), protilátky proti CD43 (Blood, 86, 502-511, 1995) a protilátky proti oblasti Ιαχ třídy HLA (lidské (Human) Leukocytově Asociované antigeny) (Blood, 90, 726-735, 1997), ale vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem protilátkami podle předloženého vynálezu, rozpoznávajícími protein asociovaný s integrinem, nebyla známa. Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu jsou tedy definované jako protilátky, které zahrnují libovolnou monoklonální protilátku, která je schopna specificky rozpoznávat protein asociovaný s integrinem a má vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s proteinem asociovaným s integrinem.
Protilátky podle předloženého vynálezu nejsou omezeny pouze na protilátky, které indukují apoptózu všech krevních buněk s jádrem.
• · · «
Zahrnují také protilátky, které indukují apoptózu alespoň jednoho typu krevních buněk s jádrem. Konkrétně je v případě myeloidní leukemie dostatečné, aby indukovaly apoptózu alespoň myeloidních buněk.
Konkrétněji se předložený vynález týká monoklonálních protilátek, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají protein asociovaný s integrinem (IAP).
Předložený vynález se dále týká fragmentů, peptidů a nízkomolekulárních sloučenin monoklonálních protilátek, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají protein asociovaný s integrinem (IAP).
Předložený vynález se ještě dále týká hybridomů, které produkují monoklonální protilátky.
Předložený vynález se ještě dále týká protileukemických činidel, která obsahují látku, která se váže k IAP a podporuje působení IAP pro indukci apoptózy krevních buněk s jádrem.
Předložený vynález se ještě dále týká protileukemických činidel, která jsou charakterizována tím, že uvedená látka je monoklonální protilátka.
Předložený vynález se ještě dále týká protileukemických činidel, která jsou charakterizována tím, že uvedená látka je fragment, peptid nebo nízkomolekulární sloučenina monoklonální protilátky.
• · · · • · · · « · • · · · · · ···· • · · · · · · · · • · · · · ······ — 7 — ···♦ ·· ·· ·· ·· ··
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 vzor vzniklý elektroforézou ukazující pás lidského IAP amplifikovaného pomocí PCR s využitím cDNA připravené z mRNA buněčné linie HL-60. Směrem zleva jsou ukázány markér molekulové hmotnosti (M), lidský IAP (1) a β-aktin (2).
Obr. 2 je graf ukazující úroveň exprese lidského IAP L1210 buňkami, které exprimovaly lidský IAP, použitím protilátek proti CD47. Pík představuje L1210 buňky transfektované pouze genem pCOSl jako kontrola.
Obr. 3 je další graf ukazující úroveň exprese lidského IAP L1210 buňkami, které exprimovaly lidský IAP, použitím protilátek proti CD47. Pík ukazuje, že exprese lidského IAP určitě vzrostla u L1210 buněk, transfektovaných genem lidského IAP.
Obr. 4 je graf ukazující protilátkové titry u imunizované myši. Levý pík představuje neporušené L1210 buňky. Pravý pík představuje L1210 buňky transfektované lidským IAP, ukazující, že sérum myši vystavené buněčné fúzi zřetelně rozpoznává lidský IAP.
Obr. 5 je sloupcový graf ukazující výsledky experimentu inhibice růstu (Jurkatovy buňky) použitím supernatantu kultury hybridomu.
Obr. 6 je sloupcový graf ukazující výsledky experimentu inhibice růstu (ARH77 buňky) použitím supernatantu kultury hybridomu.
·· ···· ♦ ♦ ···· ·· ·· • » · · · · ···* ·· · · · ··*· • ···· ·····*
- 8 — ···· ·· ·· ·· ··**··*
Obr. 7 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky ' (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro supernatant kultury 8G2 použité jako kontrolní. R1 ukazuje procento (%) apoptózy, které je 7,43%.
Obr. 8 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro 7D2-E3. R1 ukazuje procento (%) apoptózy, které je 9,84%.
Obr. 9 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro 11C8. R1 ukazuje procento (%) apoptózy, které je 15,32%.
Obr. 10 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro supernatant kultury 8G2 použité jako kontrolní. Ml ukazuje procento (%) apoptózy, které je 6,94%.
Obr. 11 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na HL-60 buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro 11C8. Ml ukazuje procento (%) apoptózy, které je 12,16%.
Obr. 12A je monochromatická mikrofotografie, ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant • · · · · · ·* ···♦ • ♦ ··♦ 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 99 99 99 kultury 9C5 jako kontrolní, černě nebo hnědě. Označení zelení a zvětšení je lOOx.
Apoptotické buňky jsou označeny jádra bylo provedeno methylovou
Obr. 12B je barevná mikrofotografie, ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant kultury 9C5 jako kontrolní. Apoptotické buňky jsou označeny černě nebo hnědě. Označení jádra bylo provedeno methylovou zelení a zvětšení je lOOx.
Obr. 13A je monochromatická mikrofotografie ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant kultury 11C8. Jsou vidět TUNEL-positivnější buňky než na Obr. 12. Apoptotické buňky jsou označeny černě nebo hnědě. Označení jádra bylo provedeno methylovou zelení a zvětšení je lOOx.
Obr. 13B je barevná mikrofotografie ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant kultury 11C8. Jsou vidět TUNEL-positivnější buňky než na Obr. 12. Apoptotické buňky jsou označeny černě nebo hnědě. Označení jádra bylo provedeno methylovou zelení a zvětšení je lOOx.
Obr. 14 vzor vzniklý elektroforézou, ukazující výsledky SDSPAGE analýzy IgG purifikovaného z hybridomových linií 7D2-E3 a 11C8. Znázorněny jsou markéry molekulové hmotnosti (M, M'), myší IgG (autentický vzorek) za neredukujících podmínek (1), 7D2-53 (2), 11C8 (3), myší IgG (autentický vzorek) za • · ··· ·
-10• · 4 4 • · 4
4 4 4
4444 44
4 44 redukujících podmínek (4), 7D2-E3 (5) a 11C8 (6).
Obr. 15 ukazuje výsledky analýzy exprese CD47 průtokovou cytometrií použitím buněk HL-60.
Obr. 16 ukazuje výsledky analýzy exprese CD47 průtokovou cytometrií použitím Jurkatových buněk.
Obr. 17 ukazuje výsledky pro mlgG (10 μς/ιηΐ) jako kontrolu pro důkaz jeho účinku indukce apoptózy na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP (L1210-hIAP) (inkubace po 72 hodin).
Obr. 18 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-1 (10 pg/ml) na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP (inkubace po 72 hodin).
Obr. 19 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-2 (10 μς/ml) na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP (inkubace po 72 hodin).
Obr. 20 ukazuje výsledky pro mlgG (10 gg/ml) jako kontrolu pro důkaz jeho účinku indukce apoptózy na Jurkatovy buňky (inkubace po 48 hodin).
Obr. 21 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-1 (10 μς/ml) na Jurkatovy buňky (inkubace po 48 hodin).
Obr. 22 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-2 (10 gg/ml) na Jurkatovy buňky (inkubace po 48 hodin).
♦ · »··· ·· ·«·· ·· H
9 · · · · ···* • · · · · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 — 2. 1 — 9999 99 99 99 99 99
Obr. 23 ukazuje výsledky pro mlgG (10 μ9/πι1) jako kontrolu pro důkaz jeho účinku indukce apoptózy na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP, který do nich byl vložen (L1210-hIAP) (inkubace po 72 hodin).
Obr. 24 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-2 Fab fragmentů (10 gg/ml) na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP.
Obr. 25 je vzor vzniklý SDS elektroforézou u Fab fragmentů MABL-2 protilátek.
Obr. 26 ukazuje zřetelně prodlouženou dobu přežíváni po zpracování pomocí MABL-2.
Obr. 27 ukazuje výsledky testu ELISA pro Příklad 5(2).
Obr. 28 ukazuje zřetelně prodlouženou dobu přežívání po zpracování pomocí F(ab')2 fragmentů MABL-2.
Obr. 29 je vzor vzniklý SDS elektroforézou u F(ab')2 fragmentů protilátky MABL-1 a protilátky MABL-2.
Obr. 30 ukazuje, že hladiny lidského IgG v myším séru byly významně sníženy u skupiny ošetřené pomocí MABL-1 a MABL-2, což dokazuje protinádorové účinky těchto protilátek.
Výhodná provedení předloženého vynálezu
Příprava monoklonální protilátky • * ··· · ·» «·«· • · · · · · · e » • · · · · ··«··· • · · · · · · ···· ···· #· ·· »> ·· «»
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu mohou být obecně připraveny následujícím způsobem. Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu mohou být například připraveny použitím lidského proteinu asociovaného s integrinem jako senzibilizačního antigenu, imunizací zvířat antigenem imunizačními metodami známými ze stavu techniky, provedením buněčné fúze způsoby známými ze stavu techniky a klonováním způsoby klonování známými ze stavu techniky.
Konkrétněji je výhodným způsobem přípravy monoklonálních protilátek podle předloženého vynálezu například způsob, ve kterém rekombinantní buňky myší leukemické buněčné linie L1210, které exprimují lidský protein asociovaný s integrinem, jsou použity jako senzibilizační antigen, plasmové buňky (imunocyty) savce imunizované senzibilizačním antigenem jsou fúzovány s buňkami myelomu savce jako je například myš, výsledné fúzované buňky (hybridomy) jsou klonovány, klony produkující protilátky podle předloženého vynálezu, které rozpoznávají výše uvedenou buněčnou linii, jsou vybrány z výsledných klonů a kultivovány a jsou získány cílové protilátky.
Výše uvedený způsob je pouze jedním možným příkladem provedení předloženého vynálezu a například senzibilizační antigen není omezen na výše uvedené L1210 rekombinantní buňky, ale může jím být například lidský protein asociovaný s integrinem (IAP) sám o sobě nebo lidský IAP v rozpustné podobě; cílové monoklonální protilátky, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) mohou být připraveny stejným způsobem jako v • · φ
-13r« • Φ φφφφ • ·
• · « φφφ φ • · φφφ • 9 99 • φφφφ • φφφφ φφφ · φ φ φ «φφφ φ φφ φφ případě rekombinantních buněk L1210 uvedených výše.
Může také být použita metoda vystavení na fágu, využívající cDNA knihovnu pro protilátku pro přípravu cílové monoklonální protilátky.
Volba savců, kteří mají být imunizováni senzibilizačním antigenem ve způsobu přípravy monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu není zvláštním způsobem omezena, ale tito savci by měli být výhodně zvoleni s uvážením jejich slučitelnosti s myelomovými buňkami použitými pro buněčnou fúzi, přičemž myši, krysy, křečci a podobně jsou obecně vhodní.
Imunizace se výhodně provádí standardními způsoby. Například se rekombinantní buňky L1210 exprimující lidský protein asociovaný s integrinem podávají zvířeti intraperitoneální injekcí a podobně.
Konkrétněji se zvířeti výhodně podává odpovídající zředění nebo suspenze s PBS nebo fyziologickým roztokem několikrát v desetidenních intervalech. Používané imunocyty jsou výhodně slezinné buňky extrahované po konečném podávání buněk.
Savčí myelomové buňky používané jako rodičovské buňky pro fúzi s imunocyty mohou být libovolné z řady buněčných linií známý ze stavu techniky, například P3 (P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548 (1978)], P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell, 8, 405-415 (1976)], Sp2/0-Agl4 [Nátuře, 276, 269-270 (1978)], FO [J.
• · · ·
-14Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)] a R210 [Nátuře, 277, 131-133 (1979)].
Buněčná fúze mezi imunocyty a myelomovými buňkami může být provedena v zásadě obvyklými způsoby, jako je například způsob, který popsali Milstein a kol. [Methods Enzymol., 73, 3-46 (1981)].
Konkrétněji se buněčná fúze provádí například ve společném nutričním médiu v přítomnosti promotoru fúze. Například může být jako promotor fúze použit polyethylenglykol (PEG), Sendai virus (HVJ) a podobně a je-li to požadováno, je možno použít adjuvans jako je dimethylsulfoxid, který se vhodným způsobem přidá pro zvýšení účinnosti fúze. Imunocyty s používají výhodně v množství představujícím 1-10 násobek počtu myelomových buněk. Médium použité pro buněčnou fúzi může být například RPMI-1640 médium, MEM médium a podobně, které je vhodné pro růst myelomových buněčných linií nebo jiné médium běžně používané pro takovou kultivaci buněk a může být také použito v kombinaci se sérovým suplementem jako je fetální hovězí sérum (FBS).
Buněčná fúze se provádí důkladným promícháním předepsaných množství imunocytů a myelomových buněk v médiu, přidáním roztoku PEG předehřátého na teplotu zhruba 37 °C, přičemž PEG má střední molekulovou hmotnost přibližně 1000-6000, například do média obvykle s koncentrací okolo 30-60% (hmotnost/objem) a mícháním. Potom se postupně přidá vhodné médium a supernatant získaný centrifugací se odebere. Tato procedura se opakuje pro vytvoření cílových hybridomů.
• · · · • · · ·
9
Hybridomy se vybírají kultivací v obvyklém selekčním médiu jako je HAT médium (médium obsahující hypoxanthin, aminoptetin a thymidin). Kultivace v HAT médiu se pokračuje po dostatečnou dobu, aby byla dosažena smrt všech buněk jiných než jsou cílové hybridomy (všechny nefúzované buňky), což je obvykle od několika dní do několika týdnů. Potom je použita obvyklá metoda limitujícího zředění pro třídění a monoklonování hybridomů produkujících cílové protilátky.
Hybridomy připravené tímto způsobem, které produkují monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu, mohou být subkultivovány v běžném médiu a mohou být umístěny pro dlouhodobé uchovávání do tekutého dusíku.
Pro získání monoklonálních protilátek podle předloženého vynálezu z hybridomů může být použit libovolný vhodný způsob, jako jsou způsoby, kdy hybridomy mohou být kultivovány využívajíce standardní metody a protilátky mohou být získány ze supernatantů kultur; nebo alternativně jako jsou způsoby, kdy hybridomy mohou být podávány slučitelnému savci pro proliferaci a potom protilátky mohou být získány z jeho břišních tekutin. První z uvedených způsobů je vhodný pro získání vysoce čistých protilátek, zatímco druhý způsob je vhodnější pro hromadnou výrobu protilátek.
Protilátky získané výše uvedenými způsoby mohou být vysoce purifikovány použitím standardních purifikačních způsobů jako je vysolování, gelová filtrace, afinitní chromatografie a podobně.
Fragmenty monoklonálních protilátek
9
9 · 9 • 9 9 ·
9
-16» 999 9 99*99« • 9 «999 · 9 · 4 »999 99 «9 99 99
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu mohou být úplné protilátky jak byly popsány výše a nebo jejich fragmenty. To znamená, že jimi mohou být libovolné fragmenty monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) , které mají lidský protein asociovaný s integrinem. Takové fragmenty zahrnují Fab, F(ab')2, Fab' a podobně. Tyto fragmenty mohou být připraveny natrávením enzymem jako je papain, pepsin, ficin a podobně. Vlastnosti takto získaných fragmentů mohou být potvrzeny stejným způsobem, jako bylo popsáno výše.
Peptidy a nízkomolekulární sloučeniny, které mají stejné funkce jako monoklonální protilátky
Monoklonální protilátky popsané výše, které rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a indukují apoptózu krevních buněk s jádrem také zahrnují peptidy a nízkomolekulární sloučeniny, které také rozpoznávají IAP a indukují apoptózu krevních buněk s jádrem.
Vlastnosti monoklonálních protilátek podle předloženého vynálezu
Jak bude konkrétně popsáno v následujících Příkladech, monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem.
• · • · · · • · · · fr ·
-17Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu také indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s lidským proteinem asociovaným s integrinem.
Tyto vlastnosti mohou být využity pro získání užitečných terapeutických činidel v oblasti léčby myeloidní leukemie a lymfoidní leukemie.
Je proto zřejmé, že zahrnuj ících předloženého rozpoznávání který použití vynálezu, antigenů, buněk s jádrem, pro odlišení využití jedinečných jako terapeutických konstrukce specifických systémů monoklonálních protilátek podle jako protilátek pro specifické způsobuje apoptózu krevních a identifikaci antigenů nebo vlastností monoklonálních protilátek činidel pro myeloidní leukémii a lymfoidní leukémii, stejně tak jako jakákoli modifikace a použití takových systémů spadají také do rozsahu předmětu předloženého vynálezu, pokud mohou být prováděny aplikací standardních method, které jsou zřejmé odborníkům.
Protileukemická činidla
Protileukemické činidlo podle předloženého vynálezu je založeno na faktu, že působení IAP je podporováno vazbou protilátky nebo podobné látky podle předloženého vynálezu, a i když neexistují žádná konkrétní omezení dávkování protilátky podle předloženého vynálezu, pohybuje se dávkování výhodně v rozmezí od 5 μg do 500 mg/kg.
Příklady provedení vynálezu • · · · ·
-18• · · · · ···· • · · · · ······ • · · ···· 0 · « · ···· ·· ·· «· ·· ··
Předložený vynález bude nyní detailněji objasněn prostřednictvím následujících příkladů; předložený vynález však není těmito příklady žádným způsobem omezen.
Příklad 1 (Příprava monoklonální protilátky) (1) Senzibilizační antigen a způsob imunizace
Antigenová senzibilizace byla docílena použitím rekombinantní buněčné linie jako senzibilizačního antigenu; byly to L1210 buňky transfektované genem lidského IAP a vysoce exprimovaly produkt. L1210 se získá z DBA od myši odvozené leukemické buněčné linie (ATCC No. CCL-219, J. Nati. Cancer Inst. 10:179-192, 1949).
Gen lidského IAP byl amplifikován pomocí PCR používajíce jako primer sekvenci specifickou pro lidský IAP (přímý primer: GCAAGCTTATGTGGCCCCTGGTAGCG, reverzní primer: GCGGCCGCTCAGTTATTCCTAGGAGG) a cDNA připravené z mRNA buněčné linie HL-60 (Klontech Laboratories, lne.) jako templátu (Obr. 1).
PCR produkt byl subklonován do klonovacího vektoru pGEM-T (Promega Corporation) a použit pro transformaci E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a po potvrzení nucleotidové sekvence insertu DNA použitím DNA sekvenceru (373A DNA Sequencer, dodávaná společností ABI), byl subklonován expresivním vektorem pCOSl.
Expresivní vektor pCOSl je derivát pEF-BOS (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990) a je to vektor získaný • · • · · · • · · ·
-19subklonováním genu odolnosti proti neomycinu použitím lidského elongačního faktoru la jako promotoru/posilovače. Tento expresivní vektor se subklonovaným lidským IAP byl použit pro vložení do L1210 buněčné linie s DMRIE-C (GIBCO/BRL), selekce byla provedena pomocí Geneticinu (konečná koncentrace 1 mg/ml, dodávaný GIBCO/BRL) a L1210 buňky se vloženým genem byly klonovány způsobem limitujícího zředění.
Exprese antigenu získaných klonů byla zkoumána pomocí protilátek proti CD47, rozpoznávajících lidský IAP (PharMingen) a klony s vysokou úrovní exprese byly zvoleny jako antigenem senzibilizované buňky (Obr. 2, 3) . Pro kultivaci rekombinantních buněk L1210 bylo jako médium zvoleno 10% fetální hovězí sérum (FBS, dodávané společností Moregate lne.) a Iscove-ovo modifikované Dulbeccovo médium (IMDM) (GIBCO/BRL) a buňky byly subkultivovány v 5% CO2 inkubátoru při teplotě 37 °C.
Použitá imunizovaná zvířata byly myši DBA/2 (chov Charles River, Japan), které byly ze stejného kmene jako L1210 buňky. Genem lidského proteinu asociovaného s integrinem (IAP) transfektované L1210 buňky, použité pro senzibilizaci antigenem, byly inkubovány po přibližně 30 minut s mitomycinem C (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) při koncentraci 200 gg/ml a po zastavení růstu buňky byl mitomycin C důkladně vymyt před vytvořením suspenze v PBS.
Buňky byly intraperitoneálně injektovány myši třikrát v intervalech zhruba 10 dní, pokaždé přibližně 5 x 106 buněk. Po provedení třetí imunizace byla odebrána krev z očního • · · » • · · ·
-20důlku, sérum bylo zředěno padesátinásobně pomocí PBS obsahujícího 1% BSA a vazba mezi zředěným sérem a rekombinantními L1210 buňkami použitými pro šenzibilizaci antigenem byla potvrzena pomocí FACScan (Becton Dickinson and Company) (Obr. 4); myš, která měla nejlepší antisérovou aktivitu byla vystavena posilovači imunizaci intraperitoneální injekcí 1 x 107 buněk 5 dní po čtvrté imunizaci. Čtyři dny po závěrečné imunizaci byla myš usmrcena a její slezina byla extrahována.
(2) Buněčná fúze
Po nařezání sleziny extrahované z myši na tenké plátky byly disociované slezinné buňky centrifugovány a potom suspendovány v médiu INDM, ponechány vyplavat a důkladně promývány. Odděleně byla kultivována myší myelomová buněčná linie P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)] v médiu IMDM obsahujícím 10 % fetální hovězí sérum (FBS, dodané společností Moregate lne.) a po podobném promytí v IMDM médium bylo 1 x 107 buněk umístěno do centrifugační zkumavky ve směsi s 5 x 107 buňkami sleziny a vystaveno buněčné fúzi standardním způsobem [Clin. Exp. Immunol., 42, 458-462 (1980)], používajíce polyethylenglykol 4000 (Nakarai Chemical Co., Ltd.).
Výsledné fúzované buňky byly potom suspendovány v IMDM médiu obsahujícím 10% FBS a činidlo stimulující růst fúzovaných buněk (BM-Condimed Hl, dodávaný společností Boehringer Mannheim Biochemicals) a rozděleny do 96-jamkových destiček pro kultivaci při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5% CO2. Následující den byly buňky umístěny do HAT selekčního média ♦ · • · · · • » · · • » • · · · · · » · · • · * · « 9 9 9 99 9 a potom do 10% FBS/IMDM média obsahujícího činidlo stimulující růst a kultivace pokračovala za trvalého růstu.
Pro ověření účinku supernatantové kultury těchto fúzovaných buněk na leukemické buněčné linie bylo médium pro fúzované buňky nahrazeno IMDM médiem obsahujícím 10 % FBS a kultivace pokračovala za trvalého růstu.
(3) Třídění
Za použití supernatantu kultury výše uvedených fúzovaných buněk bylo provedeno následující třídění.
[1] Primární třídění
Buňky myší slezinné stromální buněčné linie (CF-1 buňky) transfektované genem lidského proteinu asociovaného s integrinem (IAP) (rekombinantní buňky do kterých byl subklonován stejný plasmid jako plasmid použitý pro přípravu L1210 buněk exprimujících lidský IAP použitý pro senzibilizaci antigenem) byly naočkovány na 96-jamkovou destičku s 1 x 104 buňkami na jamku a kultivovány přes noc a potom fixovány pomocí 2% PLP (periodát-lysinparaformaldehyd) pro přípravu ELISA destičky. Po promytí byla destička vystavena blokování po 1 hodinu při pokojové teplotě použitím 1% roztoku BSA a po dalším promývání bylo přidáno 50 μΐ supernatantu kultury každého hybridomů pro inkubaci při teplotě okolí po dobu jedné hodiny.
Po promývání byl přidán proti-myší IgG+A+M (H+L) (Zymed Laboratories lne.) označený alkalickou fosfatázou před • · 4 · • 4 4 4 ·
-22• 4 4 «4 4 4 inkubací při teplotě okolí po dobu 1 hodiny. Po promytí byl přidán substrát SIGMA 104 (Sigma-Aldrich Corporation) pro získání konečné koncentrace 1 mg/ml, inkubace pokračovala při teplotě okolí a specifická aktivita byla měřena čtečkou mikrodestiček (Model 3550, dodávaný společností BioRad Laboratories Inc.).
Jako výsledek byl potvrzen výskyt hybridomů v 2089 jamkách z celkových 2880 jamek, do kterých byly naočkovány hybridomy, s 187 jamkami pozitivními v primárním třídění. 50 μΐ každého myšího IgGl jako negativní kontrola a protilátka proti lidským CD47 (BD PharMingen) jako pozitivní kontrola byly přidány v koncentraci 3 μ9/ιη1, před inkubací při teplotě okolí po dobu 1 hodiny.
[2] Sekundární třídění
Klony ohodnocené jako pozitivní v primárním třídění byly podrobeny ELISA systému využívajícímu CF-1 buňky exprimující lidský protein asociovaný s integrinem (IAP), přičemž negativní kontrolou byly CF-1 buňky transfektované pouze expresivním vektorem pCOSl, s cílem určit, zda protilátky produkované hybridomy skutečně specificky rozpoznávají lidský IAP.
Jako výsledek bylo jako pozitivní potvrzeno 21 ze 187 jamek, které byly shledány jako pozitivní v primárním třídění. Tabulka 1 ukazuje specifickou vazbu lidského IAP s 7D2 a 11C8 jako representativní příklady a to jako absorbci v testu ELISA.
• ·
-23• · · · · · • ···· ··» ···· · · ·· « · » ♦ (Tabulka 1) ELISA analýza specifické vazby hybridomového supernatantu kultur s lidským IAP
Tabulka 1
| Surová data | PBS | ahCD47 3 μg/ml | 7D2 | 11C8 |
| CFl-pCOSl | 0,185 | 0,160 | 0,189 | 0,149 |
| CFl-hlAP- 55-8 | 0, 192 | 0,456 | 0, 568 | 0,812 |
| Odečteno | PBS | ahCD47 3 μg/ml | 7D2 | 11C8 |
| Specifická vazba | 0,007 | 0,296 | 0,379 | 0, 663 |
[3] Terciální třídění
Klony považované za pozitivní v sekundárním třídění byly vystaveny testu inhibice růstu používajícího Jurkatovy buňky (lidská lymfatická linie T buněk) a ARH77 buňky (lidská myelomová buněčná linie) . 100 μΐ Jurkatových buněk v 5 x 103 buňkách na jamku a ARV77 buňky s 1 x 104 buněk na jamku byly naočkovány do každé jamky 96-jamkové destičky a do buněčných suspenzí bylo přidáno 5 nebo 10 μΐ supernatantu kultury hybridomových klonů. Po kultivaci po dobu přibližně 2 dny byl počty buněk měřeny pomocí testu MTS. Jako kontrola bylo přidáno 5 nebo 10 μΐ každého IMDM média obsahujícího 10 % FBS a supernatanty kultur klonů, které byly negativní v primárním testování (8G2 a 9CS) .
• · • ·· · • · · ·
-24Obr. 5 a 6 znázorňují výsledky testu inhibice růstu pro čtyři reprezentativní klony, 11C8, 7D2-E3 (sůbklon 7D2), 13F1 a 2F12.
(4) Vlastnosti protilátek [11 Imunoglobulinové typy supernatantů kultur 11C8, 7D2-E3, 13F1 a 2F12 byly prozkoumány použitím ELISA systému.
Konkrétně byly CF-1 buňky exprimující lidský protein asociovaný s integrinem (IAP)naočkovány do 96-jamkové destičky pro přípravu ELISA destičky a potom bylo přidáno 50 μΐ každého supernatantu kultury, alkalickou fosfatázou označené protilátky proti myšímu IgG (Zymed Laboratories lne.) nebo protilátky proti myšímu IgM (Biosource Intl., Inc.) byly ponechány reagovat jako sekundární protilátky a aktivita byla měřena mikrodestičkovou čtečkou. Jako výsledek bylo potvrzeno, že 11C8 a 7D2-E3 jsou IgG, zatímco 13F1 a 2F12 byly potvrzeny jako IgM.
[2] DNA fragmentace dvou klonů 11C8 a 7D2-E3 ze čtyř výše popsaných klonů byly analyzovány průtokovou cytometrií (FACScan, dodávaný společností Becton, Dickinson and Company) použitím Jurkatových buněk a HL-60 buněk. Jurkatovy buňky byly použity pro 11C8 a 7D2-E3 a HL-60 buňky byly použity pro 11C8.
Jurkatovy buňky a HL-60 buňky byly naočkovány do 12-jamkové destičky v množství 4 x 104 buněk na jamku/2 ml a bylo přidáno 200 μΐ supernatantů kultur 7D2-E3 a 11C8. Buňky byly frfrfrfr
-25fr fr* · · · · fr • ··· frfrfrfr • frfr fr frfr· ·· fr • fr frfrfr fr frfrfrfr frfr frfr frfr frfr frfr kultivovány po dobu 2 dní a měřeny. Jako kontrola byly přidány supernatanty kultur 8G2 ve stejných objemech. Buňky byly odebrány z kultivačních destiček a buněčný pelet byl fixován za 200 x g po dobu 60 minut při teplotě 4 °C v 2 ml ledového 70% ethanolu. Buňky byly potom centrifugovány, promývány v 1 mi PBS a resuspendovány v 0,5 ml PBS. Do 0,5 ml vzorku buněk bylo přidáno 0,5 ml RNAsy (Typ I-A, SigmaAldrich Corporation, St. Louis, MO, USA; 1 mg/ml v PBS) a byly míchány tři minuty v 1 ml propidiumjodidovém roztoku (PI, Sigma, 100 pg/ml v PBS). Smíchané buňky byly inkubovány po dobu 60 minut v temné komoře při teplotě 37 °C a potom uchovávány v temné komoře při teplotě 4 °C a měřeny průtokovou cytometrií.
Jak je znázorněno na Obr. 7-9 a 10-11, supernatanty kultur 7D2-E3 a 11C8 zvyšují podíl buněčné apoptózy Jurkatových buněk a supernatant kultury 11C8 zvyšuje podíl buněčné apoptózy buněk HL-60.
[3] Supernatanty kultur 11C8 byly použity pro kokultivaci systému s HL-60 buňkami použitím buněk vyživující vrstvy lidského myeloidu stromální buněčné linie KM102 pro určení, zda tyto supernatanty kultur indukují apoptózu buněk HL-60.
Konkrétně byly buňky RM102 naočkovány na 2-dvoujamkovou destičku Lab-Tek Chamber Slide (Nalge Nunc Intl. Corporation) a ponechány dorůst do subkonfluentního stavu, 1 x 105 buněk HL-60 bylo naočkováno a kultivováno po dobu přibližně jednoho dne a potom byly odebrány nepřipojené buňky HL-60.
-26Současně byly přidány výše uvedené supernatanty kultur pro dosažení konečné koncentrace 10% a buňky byly kultivovány po dobu 2 dní. Po ukončení kultivace byly buňky 'fixovány 10% formalinem a HL-60 buňky indukované do apoptózy byly detekovány metodou TUNEL (ApopTag Plus dodávaný společností Oncor lne.). Jak je znázorněno na Obr. 12 a 13, supernatant kultury 11C8 zvyšoval více apoptózu buněk HL-60 něž supernatant kultury 9C5, což byl supernatant kultury nereakčního hybridomového klonu lidského IAP použitý jako kontrola.
(5) Purifikace protilátek
Pro čištění protilátek vytvořených hybridomy byly buněčné linie těch klonů hybridomových linií 7D2-E3 a 11C8, které produkovaly IgG, intraperitoneálně injektované myši BALB/c/AnNCrj, které byl podáván přistaň (samec, dodaný společností Charles River, Japan) postupujíce standardním způsobem. Po několika týdnech byly odebrány vytvořené břišní tekutiny a protilátky byly separovány a čištěny standardními způsoby. Konkrétně byly protilátky purifikovány ze získaných břišních tekutin plastovou kolonou Polos Protein A (Perceptive Biosystems lne.) a dialyzovány s PBS (Dulbecco lne.) a pásy byly potvrzeny pomocí analýzy SDS-PAGE. Jak je znázorněno na Obr. 14, elektroforéza používající autentický vzorek myšího IgG (Cappel lne.) jako kontroly potvrdila pásy pro IgG u klonů 7D2-E3 a 11C8 ve stejných polohách jako vykazoval autentický vzorek myšího IgG, a to jak za neredukujících, tak i za redukujících podmínek.
V tomto příkladu byly L1210 buňky exprimující lidský protein • 9
-27• 99 9 *9 9 9 9 9 9 9 9 · » 9 9 9 9 ·»9· • 9 9 9 * «99 99 9
99 9999 9999
9999 99 99 99 99 99 asociovaný s integrinem (IAP) použity jako senzibilizační antigen pro ilustrativní účely, ale je také možno připravovat monoklonální protilátky stejným způsobem používajíce jiné buňky exprimující lidský IAP nebo lidský IAP samotný a připravovat monoklonální protilátky z knihovny protilátek použitím způsobu vystavení na fágu; předložený vynález není omezen na výše uvedené monoklonální protilátky, ale zahrnuje všechny monoklonální protilátky, které mají podobné vlastnosti a všechny hybridomy, které vytvářejí tyto monoklonální protilátky.
Kromě toho předložený vynález uvedených monoklonálních protilátek také zahrnuje humanizované protilátky, lidské protilátky, chimérické protilátky, protilátky s jediným řetězcem, primatizované protilátky a fragmenty protilátek, získané natrávením protilátek různými enzymy (papain, pepsin, ficin a podobně).
Hybridomy podle předloženého vynálezu produkující monoklonální protilátky proti lidskému proteinu asociovaného s integrinem (IAP) jsou nové fúzované buňky vytvořené z DBA myších slezinných buněk a myší myelomové buněčné linie P3-U1 jako rodičovské buňky; protilátky proti IAP (myší hybridom 11C8-F8 (subklon 11C8), označené jako MABL-1) byly uloženy jako FERM BP-6100 a protilátky proti IAP (myší hybridom 7D2E3 (subklon 7D2), označené jako MABL-2) byly uloženy jako FERM BP-6101 dne 1. září 1997 v Národním institutu pro biologické vědy a humánní technologie, Úřad pro průmyslovou vědu a technologii, Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu na adrese 1-3 Migashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, který pracuje jako veřejný depozitář
-28·· ·# • ♦ 9 · · « 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 • ···♦ ·*···· • ·· ···· 9 9 9 9
9999 99 99 99 99 99 mikroorganismů.
Příklad 2 (Identifikace podtříd MABL-1 a MABL-2 protilátek)
Pro identifikaci podtříd MABL-1 a MABL-2 protilátek získaných způsobem, který byl uveden výše, bylo 500 μΐ každých ze vzorků MABL-1 a MABL-2 upravených na 100 ng/ml umístěno na Isotyping Kit (Stratagene), a tím byla protilátka MABL-1 určena jako IgGl, κ a MABL-2 byla určena jako IgG2a, κ.
Příklad 3 (Lidské leukemické buňky exprimující lidský IAP)
Exprese IAP v různých lidských leukemických buněčných liniích byla detekována průtokovou cytometrií s protilátkami proti CD47, rozpoznávajícími lidský IAP (komerčně dostupný produkt). Tato protilátka byla použita pro detekci, protože se předpokládá, že lidský IAP je identický s CD47 (Biochem. J., 304, 525-530, 1994). Použité buněčné linie byly
Jurkatovy buňky a HL-60 buňky (K562 buňky, ARH77 buňky, Ráji buňky a CMK buňky). Buňky byly použity v koncentraci 2 x 105 buněk na vzorek, protilátka proti CD47 byla inkubována s buňkami v konečné koncentraci 5 μg/ml a použitá sekundární protilátka byla protilátka proti myšímu IgG označená pomocí FITC (Becton Dickinson and Company). Myší IgGl protilátka (Zymed Laboratories lne.) byla použita jako kontrola. Výsledky průtokové cytometrie, které jsou uvedeny na Obr. 15 (HL-60) a Obr. 16 (Jurkat) potvrdily, že obě buněčné linie exprimovaly IAP.
·» *««· • ·* ·
9 9 « • · · 9
9 9 9
9 9 9
99
Příklad 4 (Apoptotický účinek in vitro) (1) Účinek indukce apoptózy protilátek MABL-1 ' a MABL-2 na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP, Jurkatovy buňky a HL-60 buňky byl zkoumán použitím Annexinu-V (Boehringer Mannheim). Výsledky analýzy používající AnnexinV jsou znázorněny na Obr. 17-22, kde skvrny v levé dolní oblasti znázorňují živé buňky, skvrny v pravé dolní oblasti znázorňují apoptotické buňky a skvrny v pravé horní oblasti znázorňují nekrotické buňky. Použité protilátky byly myší IgG (Zymed Laboratories lne.) jako kontrola a MABL-1 a MABL2 v koncentraci 10 pg/ml, a poté, co bylo 4 x 103 buněk L1210 transfektováno genem lidského IAP, byly inkubovány po dobu 72 hodin a 6 x 104 Jurkatových buněk bylo inkubováno po dobu 48 hodin, byly buňky analyzovány užívajíce Annexin-V. Byla pozorována smrt buněk, jak je znázorněno na Obr. 17-22. V případě buněk HL-60 bylo použito 10 pg/ml MABL-1 a analýza využívající Annexin-V s 1 x 105 buňkami také prokázala buněčnou smrt.
(2) Byl zkoumán účinek indukce apoptózy Fab fragmentů protilátky MABL-2 na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP. Konkrétně byly L1210 buňky transfektované genem lidského IAP kultivovány v koncentraci 4 x 103 buňky a byly použity Fab fragmenty protilátky MABL-2 a myší IgG jako kontrola a to v koncentraci 10 ng/ml. Buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin a měřeny Annexinem-V. Jako výsledek byl pozorován značný rozsah buněčné smrti (Obr. 23, 24). Fab fragmenty protilátky MABL-2 použité pro experiment byly získány natrávením protilátky papainem (Pierce Laboratories, lne.) a jejich purifikací. Fab fragmenty protilátky MABL-2
-30«· Φ · · · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 99 99 99 byly analyzovány pomocí SDS elektroforézy (Obr. 25).
Příklad 5 (Studium apoptózy in vivo) (1) Látková účinnost MABL-1 a MABL-2 (úplný IgG)
KPMM2 buňky exprimující lidský IAP (lidská myelomová buněčná linie) byly transplantovány SCID myši a v den 10 po transplantaci byly podány MABL-1 a MABL-2 (úplný IgG) jedinou intravenózní injekcí v dávkách 5 μg na jednu myš respektive 50 μg na jednu myš (n=5) ; v den 28 po transplantaci KPMM2 byly úrovně lidského IgG odvozeného od KPMM2 měřeny testem ELISA a bylo potvrzeno zmizení. Byla také studována doba přežívání. Výsledky ukázaly výrazné potlačení úrovní lidského IgG v krvi u skupiny ošetřené pomocí MABL-1 a MABL-2, což representovalo protinádorový účinek (Obr. 30) . Bylo také prokázáno, že se doba přežívání také významným způsobem prodloužila (Obr. 26).
(2) Látková účinnost MABL-1 a MABL-2 (F(ab')2)
F(ab')2 fragmenty, připravené natrávením protilátek MABL-1 a MABL-2 pepsinem a purifikace pomocí Proteinu A (Pierce Laboratories, lne.) byly použity pro studium protinádorového účinku bez cytotoxického účinku způsobovaného oblastmi Fc. Konkrétně byly buňky RPMM2 exprimující lidský IAP (lidská myelomová buněčná linie) transplantovány do SCID myši a F(ab’)2 fragmenty protilátek MABL-1 a MABL-2 byly intravenózně podávány skupinám v dávkách 100 μg na jednu myš v den 6 a den 10 po transplantaci a skupinám v dávkách 10 a 30 μg na jednu myš v den 6, 8 a 10 po transplantaci; úrovně lidského IgG odvozené od KPMM2 byly měřeny metodou ELISA v •9 9 99 9
9 9 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Ol 9 99 9999 9 999
ΌΙ*“ 9999 99 99 99 99 99 den 30 po transplantaci (Obr. 27) . Byla také zkoumána doba přežívání až do 90 dní po transplantaci. Jako výsledek bylo zjištěno výrazné potlačení úrovní lidského IgG v krvi u skupin ošetřených protilátkami MABL-1 a MABL-2, což přestavovalo protinádorový účinek. Doba přežívání se také výrazně prodloužila (Obr. 28). Obr. 29 znázorňuje vzor vytvořený SDS elektroforézou pro F(ab')2 fragmenty protilátky MABL-1 a protilátky MABL-2.
Průmyslová využitelnost
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu jsou protilátky, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a antigeny, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají lidský protein asociovaný s integrinem. V souladu s tím jsou tyto protilátky použitelné jako protilátky, které rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem pro jeho odlišení a identifikaci a přitom mají také účinek indukce apoptózy krevních buněk s jádrem; tyto vlastnosti mohou být použity pro přípravu terapeutických činidel v oblasti léčby myeloidní leukemie a lymfoidní leukemie.
Claims (6)
1. Monoklonální protilátka indukující apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají protein asociovaný s integrinem (IAP).
2. Fragment, peptid nebo nízkomolekulární sloučenina monoklonální protilátky, která indukuje apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají protein asociovaný s integrinem (IAP) .
3. Hybridom, který produkuje monoklonální protilátku podle nároku 1.
4. Protileukemické činidlo, zahrnující látku, která se váže k IAP a stimuluje účinek IAP pro indukci apoptózy krevních buněk s jádrem.
5. Protileukemické činidlo podle nároku 4, ve kterém uvedená látka je monoklonální protilátka.
6. Protileukemické činidlo podle nároku 4, ve kterém uvedená látka je fragment, peptid nebo nízkomolekulární sloučenina monoklonální protilátky.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000907A CZ2000907A3 (cs) | 1998-09-11 | 1998-09-11 | Monoklonální protilátka indukující apoptózu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000907A CZ2000907A3 (cs) | 1998-09-11 | 1998-09-11 | Monoklonální protilátka indukující apoptózu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000907A3 true CZ2000907A3 (cs) | 2000-08-16 |
Family
ID=5469923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000907A CZ2000907A3 (cs) | 1998-09-11 | 1998-09-11 | Monoklonální protilátka indukující apoptózu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2000907A3 (cs) |
-
1998
- 1998-09-11 CZ CZ2000907A patent/CZ2000907A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2212413C2 (ru) | Моноклональное антитело, полученное с помощью интегринассоциированного белка, его фрагмент fab, fab' или f(ab')2, гибридома, продуцирующая моноклональное антитело (вариант), антилейкемическое средство | |
| US7531643B2 (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| US20250051451A1 (en) | Anti-b7-h3 monoclonal antibody and use thereof in cell therapy | |
| KR100919915B1 (ko) | Ｎｋｇ２ｄ의 조절 | |
| AU2007312437C1 (en) | Method for generating active antibodies against a resistance antigen, antibodies obtained by said method and their uses | |
| KR20170075778A (ko) | 항-tim-3 항체 | |
| PL181783B1 (pl) | Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwcial posiadajacych wlasciwosc powodowania apoptozy PL PL PL PL PL PL PL | |
| CN115969997B (zh) | 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用 | |
| JP2023546743A (ja) | 抗ｃｄ７３抗体及びその使用 | |
| WO2020056790A1 (zh) | 特异结合人及猴cd38抗原的单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| TWI449710B (zh) | A monoclonal antibody having an immunosuppressive activity or an antigen-binding fragment thereof | |
| EP1801208A1 (en) | Anti-a33 antibody | |
| KR101783907B1 (ko) | ＣＤ66ｃ에 대한 항체와 화학치료제를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물 | |
| CA2282631A1 (en) | Lymphocyte activation inhibitors | |
| JP3568398B2 (ja) | アポトーシスを誘起するモノクローナル抗体 | |
| CN115873111B (zh) | 一种cldn18.2抗体及其应用 | |
| CZ2000907A3 (cs) | Monoklonální protilátka indukující apoptózu | |
| HK1030785A (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| RU2803460C2 (ru) | Гуманизированное антитело против pd-1 и его применение | |
| CZ290424B6 (cs) | Monoklonální protilátka a hybridom ji produkující | |
| CN117567612A (zh) | 一种cldn18.2抗体及其应用 | |
| CN117567617A (zh) | 一种cldn18.2抗体及其应用 | |
| HK1030954A (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| HK1108916A (en) | Anti-a33 antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |