CZ2000907A3 - Monoclonal antibody inducing apoptosis - Google Patents
Monoclonal antibody inducing apoptosis Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000907A3 CZ2000907A3 CZ2000907A CZ2000907A CZ2000907A3 CZ 2000907 A3 CZ2000907 A3 CZ 2000907A3 CZ 2000907 A CZ2000907 A CZ 2000907A CZ 2000907 A CZ2000907 A CZ 2000907A CZ 2000907 A3 CZ2000907 A3 CZ 2000907A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- antibodies
- human
- iap
- případě
- Prior art date
Links
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 36
- 101710098610 Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 31
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000063 antileukemic agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 26
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 5
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 167
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 65
- 101000688216 Homo sapiens Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 39
- 101000616014 Homo sapiens Magnesium transporter protein 1 Proteins 0.000 description 39
- 102000053119 human ALPI Human genes 0.000 description 27
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 27
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 14
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 12
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 9
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 101000868281 Mus musculus Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000688214 Mus musculus Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 101000616015 Mus musculus Magnesium transporter protein 1 Proteins 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010063827 Extramedullary haemopoiesis Diseases 0.000 description 2
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 description 2
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 description 2
- 101100340613 Mus musculus Iap gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000713321 Intracisternal A-particles Species 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002810 primary assay Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012090 serum-supplement Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezujsou protilátky, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a antigeny, které indukují apoptózu krevních buněk sjádrem, které mají lidský protein asociovaný s integrinem. V souladu stímjsoutyto látky použitelnéjako protilátky, které rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinemprojeho odlišení a identifikaci, zatímco také mají účinek indukce apoptózy krevních buněk sjádrem; tyto vlastnosti mohou být použity pro přípravu použitelných terapeutických činidel v oblasti léčby myeloidní leukemie a lymfoidní leukemie.The monoclonal antibodies of the present invention are antibodies that specifically recognize the human protein integrin-associated and antigens that induce apoptosis blood cells with the core having human protein associated with integrin. Accordingly, these substances are useful as such antibodies that recognize the human protein associated with integrinoprocessing and identification while also having the effect of inducing apoptosis of the blood cells by the core; these properties can be used to prepare usable therapeutic agents for the treatment of myeloid leukemia; lymphoid leukemia.
Description
Monoklonálni protilátky, indukující apoptózuMonoclonal antibodies, inducing apoptosis
Oblast technikyTechnical field
Předložený vynález se týká nových monoklonálních protilátek, které mají vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem s proteinem asociovaným s integrinem (Integrin Associated Protein - IAP), stejně jako jejich fragmentů, nízkomolekulárních sloučenin peptidů a hybridomů, dále se týká které produkují monoklonálni protilátky. Nové protilátky jsou použitelné jako terapeutická činidla pro myeloidní leukémii a lymfoidní leukémii.The present invention relates to novel monoclonal antibodies having the property of inducing apoptosis of blood cells with an Integrin Associated Protein (IAP) nucleus as well as fragments thereof, low molecular weight peptide compounds and hybridomas, further comprising monoclonal antibodies. The novel antibodies are useful as therapeutic agents for myeloid leukemia and lymphoid leukemia.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Faktory stimulující kolonie granulocytů, rekombinantní faktor stimulující kolonie (recombinant granulocyte colony-stimulating jako je granulocytů factor rG-CSF), jsou známy podle stavu techniky jako humorální faktory, které stimulují diferenciaci proliferaci granulocytů. Zprávy vycházející z in vivo experimentů na myších prokázaly, že podávání rG-CSF nevede pouze ke zrychlení myelopoézy v kostní dřeni, ale výrazně také ke zvýšení extramedulární hemopoézy ve slezině a k proliferaci všech hemopoetických prekursorových buněk ve slezině, v to počítaje hemopoetické kmenové buňky. Předpokládá se, že v mechanismu takové extramedulární hemopoézy ve slezině stimulace pomocí rG-CSF mění hemopoetické mikroprostředí ve slezině a podporuje její schopnost podporovat hemopoézu, čímž se indukuje hemopoéza.Granulocyte colony stimulating factors, recombinant granulocyte colony-stimulating factors such as granulocyte factor rG-CSF, are known in the art as humoral factors that stimulate differentiation of granulocyte proliferation. Reports based on in vivo experiments in mice have shown that administration of rG-CSF not only leads to an acceleration of bone marrow myelopoiesis but also significantly to an increase in extramedullary haemopoiesis in the spleen and to the proliferation of all haemopoietic precursor cells in the spleen, including haemopoietic stem cells. It is believed that in the mechanism of such extramedullary hemopoiesis in the spleen, stimulation by rG-CSF alters the hemopoietic microenvironment in the spleen and promotes its ability to support hemopoiesis, thereby inducing hemopoiesis.
• · · · · «• · · · ·
Pro vyjasnění hemopoetické funkce sleziny se přihlašovatelé dříve zaměřili na stromální buňky sleziny po opakovaném podávání rG-CSF. Přihlašovatelé se snažili určit, jak je podporována hemopoetická funkce pomocí rG-CSF prostřednictvím stromálních buněk a vytvořili hemopoetickou stromální buněčnou linii (CF-1 buňky) z myší sleziny opakovaným podáváním rG-CSF. Přihlašovatelé také studovali schopnost podporovat hemopoézu u hemopoetických stromálních buněk a potvrdili aktivitu stimulace kolonií in vitro a schopnost podporovat hemopoetické kmenové buňky in vivo [Blood, 80, 1914 (1992)].To clarify the hemopoietic function of the spleen, Applicants previously focused on spleen stromal cells after repeated administration of rG-CSF. Applicants have sought to determine how haemopoietic function is promoted by rG-CSF via stromal cells and established a haemopoietic stromal cell line (CF-1 cells) from mouse spleen by repeated administration of rG-CSF. Applicants have also studied the ability to support haemopoiesis in hemopoietic stromal cells and have confirmed colony stimulation activity in vitro and the ability to support haemopoietic stem cells in vivo [Blood, 80, 1914 (1992)].
I když však byla vytvořena jedna buněčná linie slezinných stromálních buněk (CF-1 buňky) a byly prostudovány jejich cytologické vlastnosti, specifické protilátky, které rozpoznávají povrchové antigeny těchto buněk nebyly nikdy připraveny a ani nebyly žádným způsobem objasněny jejich vlastnosti.However, although one cell line of spleen stromal cells (CF-1 cells) has been established and their cytological properties studied, specific antibodies that recognize the surface antigens of these cells have never been prepared and their properties have not been elucidated in any way.
Vzhledem k výše uvedeným poznatkům, týkajících se slezinných stromálních buněk a výsledků výzkumu, který představuje stav techniky prováděli přihlašovatelé další výzkum s cílem vyvinout specifické protilátky, které by rozpoznávaly slezinné stromální buňky, pracovali na přípravě monoklonálních protilátek použitím výše uvedených slezinných stromálních buněčných linií jako senzibilizačního antigenu a nakonec se jim podařilo získat nové monoklonální protilátky.In view of the above knowledge regarding spleen stromal cells and the results of prior art research, the Applicants conducted further research to develop specific antibodies that would recognize spleen stromal cells, worked on the preparation of monoclonal antibodies using the above spleen stromal cell lines as sensitizing antigen and eventually managed to obtain new monoclonal antibodies.
Přihlašovatelé dále studovali vlastnosti monoklonálních protilátek získaných výše uvedeným způsobem a zjistili, že monoklonální protilátky mají vlastnost indukce myeloidní • · • · · · • · · · · · • · · · · ««··· • · · · · 9 · · · • · · · · ······ — 3 — ···· ·· ·· «· ·· ·· buněčné apoptózy. Tyto monoklonální protilátky byly označeny jako Protilátky BMAP-1 a dále budou označovány tímto způsobem.Applicants have further studied the properties of the monoclonal antibodies obtained as described above and found that the monoclonal antibodies have a myeloid induction property. - 3 - Cell Apoptosis. These monoclonal antibodies have been designated as BMAP-1 Antibodies and will be referred to hereinafter.
Přihlašovatelé dále zkoumali antigen rozpoznávaný protilátkou BMAP-1 a zjistili, že se jedná o myši protein asociovaný s integrinem (myši IAP) (GenBank, Accession Number Z25524) na základě přímého expresního klonování.Applicants further investigated the antigen recognized by the BMAP-1 antibody and found to be a mouse integrin-associated protein (IAP mouse) (GenBank, Accession Number Z25524) by direct expression cloning.
Působení protilátek BMAP-1 bylo studováno pomocí rekombinantních buněk, do kterých byl vložen gen pro myší IAP. Konkrétně byl gen myšího IAP vložen do myších Jurkatových buněk, které neexprimují myší IAP a to konvenčními způsoby pro vytvoření buněčné linie exprimující myší IAP (rekombinantní Jurkatovy buňky) a působení protilátek BMAP-1 na buňky exprimující myší IAP bylo studováno pomocí testu MTS a DNA fragmentace použitím průtokové cytometrie (Japonská patentová přihláška č. HEI 967499).The action of BMAP-1 antibodies was studied using recombinant cells into which the mouse IAP gene was inserted. Specifically, the mouse IAP gene was inserted into mouse Jurkat cells that do not express mouse IAP by conventional methods to generate a cell line expressing mouse IAP (recombinant Jurkat cells) and the effect of BMAP-1 antibodies on mouse IAP expressing cells was studied by MTS assay and DNA fragmentation using flow cytometry (Japanese Patent Application No. HEI 967499).
Na základě těchto výzkumů se předpokládá, že monoklonální protilátky pro antigen lidského proteinu asociovaného s integrinem (human Integrin Associated Protein, který je dále označován jako lidský IAP; aminokyselinová sekvence a sekvence bází, popsané v J. Cell Biol., 123, 485-496, 1993; viz také Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995) by měly mít účinek indukce apoptózy krevních buněk s jádrem, které exprimuji tento antigen (myeloidní buňky a lymfocyty) a přihlašovatelé se pokusili připravit monoklonální protilátky pro antigen představovaný lidským proteinem asociovaným s integrinem a podařilo se jim získat • · · ♦ • · · · · 4 monoklonální protilátky, které indukují apoptózu lidských krevních buněk s jádrem, exprimujících tento antigen.Based on these investigations, it is believed that monoclonal antibodies for the human Integrin Associated Protein antigen, hereinafter referred to as human IAP; the amino acid and base sequences described in J. Cell Biol., 123, 485-496 , 1993; see also Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995) should have the effect of inducing apoptosis of blood cells with a nucleus expressing this antigen (myeloid cells and lymphocytes), and applicants have attempted to produce monoclonal antibodies for antigen presented by human the integrin-associated protein and have been able to obtain 4 monoclonal antibodies that induce apoptosis of human blood cells with a nucleus expressing this antigen.
Jinými slovy jsou předmětem předloženého vynálezu nové monoklonální protilátky, které mají vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s lidským proteinem asociovaným s integrinem (lidský IAP) a jejich fragmenty, stejně tak jako hybridomy, které produkují monoklonální protilátky.In other words, the present invention provides novel monoclonal antibodies having the property of inducing apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) with human integrin-associated protein (human IAP) and fragments thereof, as well as hybridomas that produce monoclonal antibodies.
Uvedené nové monoklonální protilátky jsou použitelné jako terapeutická činidla pro myeloidní leukémii a lymfoidní leukémii.Said novel monoclonal antibodies are useful as therapeutic agents for myeloid leukemia and lymphoid leukemia.
Popsané funkce proteinu asociovaného s integrinem jsou vazba s β řetězcem integrinu ανβ3 podporující vazbu mezi ανβ3 a jeho ligandem vitronektinem (J. Cell. Biol., 123, 485-496 (1993)), dále indukce přítoku Ca2+ do vaskulárního endotelia po adhesi neutrofilů s vaskulárním endoteliem (J. Biol. Chem., 268, 19931-19934 (1993)) a nakonec podpora migrace neutrofilů vaskulárním endoteliem (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 3978-3982 (1995)), ale nebyly publikovány žádné zprávy, které by se týkaly jeho funkce ve vztahu k apoptóze krevních buněk s jádrem.The described functions of the integrin-associated protein are binding to the β chain of the integrin α ν β3 supporting the binding between α ν β 3 and its vitronectin ligand (J. Cell. Biol., 123, 485-496 (1993)), and induction of Ca 2+ influx into the vascular endothelium after adhesion of neutrophils with vascular endothelium (J. Biol. Chem., 268, 19931-19934 (1993)) and finally promoting neutrophil migration by vascular endothelium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3978-3982 ( 1995)), but no reports have been published concerning its function in relation to apoptosis of the blood cells with the nucleus.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu jsou protilátky, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem (human Integrin Associated Protein). Tyto protilátky proto vykazují funkci rozlišování a ·The monoclonal antibodies of the present invention are antibodies that specifically recognize the human Integrin Associated Protein. These antibodies therefore have a function of differentiation and
0··0 ··
identifikace lidského proteinu asociovaného s integrinem.identifying a human integrin-associated protein.
Kromě toho monoklonální protilátky podle 'předloženého vynálezu jsou protilátky, které vykazují vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s lidským proteinem asociovaným s integrinem. Apoptóza je fenomén, ve kterém chromatinová DNA jádra jsou štěpena na nukleosomové jednotky (což je známo jako ladder formation), což vede ke smrti buňky a je také označováno jako buněčná sebevražda.In addition, the monoclonal antibodies of the present invention are antibodies that exhibit the property of inducing apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) with human integrin-associated protein. Apoptosis is a phenomenon in which chromatin DNA nuclei are cleaved into nucleosome units (known as ladder formation), which leads to cell death and is also referred to as cell suicide.
Monoklonální protilátky, o kterých je známo, že indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidních buněk a lymfocytů) zahrnují protilátky proti Fas (Cell, 66; 233-243, 1991), protilátky proti CD43 (Blood, 86, 502-511, 1995) a protilátky proti oblasti Ιαχ třídy HLA (lidské (Human) Leukocytově Asociované antigeny) (Blood, 90, 726-735, 1997), ale vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem protilátkami podle předloženého vynálezu, rozpoznávajícími protein asociovaný s integrinem, nebyla známa. Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu jsou tedy definované jako protilátky, které zahrnují libovolnou monoklonální protilátku, která je schopna specificky rozpoznávat protein asociovaný s integrinem a má vlastnost indukce apoptózy krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s proteinem asociovaným s integrinem.Monoclonal antibodies known to induce apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) include antibodies against Fas (Cell, 66; 233-243, 1991), antibodies against CD43 (Blood, 86, 502-511, 1995) ) and antibodies to the LAα χ region of the HLA class (Human Leukocyte Associated Antigens) (Blood, 90, 726-735, 1997), but the property of inducing apoptosis of blood cells with nucleus by antibodies of the present invention recognizing an integrin-associated protein was not known. Thus, the monoclonal antibodies of the present invention are defined as including any monoclonal antibody that is capable of specifically recognizing an integrin-associated protein and has the property of inducing apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) with an integrin-associated protein.
Protilátky podle předloženého vynálezu nejsou omezeny pouze na protilátky, které indukují apoptózu všech krevních buněk s jádrem.The antibodies of the present invention are not limited to antibodies that induce apoptosis of all nucleus blood cells.
• · · «• · ·
Zahrnují také protilátky, které indukují apoptózu alespoň jednoho typu krevních buněk s jádrem. Konkrétně je v případě myeloidní leukemie dostatečné, aby indukovaly apoptózu alespoň myeloidních buněk.They also include antibodies that induce apoptosis of at least one type of nucleus blood cells. In particular, in the case of myeloid leukemia, it is sufficient to induce apoptosis of at least myeloid cells.
Konkrétněji se předložený vynález týká monoklonálních protilátek, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají protein asociovaný s integrinem (IAP).More particularly, the present invention relates to monoclonal antibodies that induce apoptosis of nucleus blood cells having an integrin-associated protein (IAP).
Předložený vynález se dále týká fragmentů, peptidů a nízkomolekulárních sloučenin monoklonálních protilátek, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají protein asociovaný s integrinem (IAP).The present invention further relates to fragments, peptides, and low molecular weight monoclonal antibody compounds that induce apoptosis of nucleus blood cells having an integrin-associated protein (IAP).
Předložený vynález se ještě dále týká hybridomů, které produkují monoklonální protilátky.The present invention still further relates to hybridomas that produce monoclonal antibodies.
Předložený vynález se ještě dále týká protileukemických činidel, která obsahují látku, která se váže k IAP a podporuje působení IAP pro indukci apoptózy krevních buněk s jádrem.The present invention still further relates to anti-leukemic agents comprising an agent that binds to IAP and promotes the action of IAP to induce apoptosis of nucleus blood cells.
Předložený vynález se ještě dále týká protileukemických činidel, která jsou charakterizována tím, že uvedená látka je monoklonální protilátka.The present invention still further relates to anti-leukemic agents, characterized in that said agent is a monoclonal antibody.
Předložený vynález se ještě dále týká protileukemických činidel, která jsou charakterizována tím, že uvedená látka je fragment, peptid nebo nízkomolekulární sloučenina monoklonální protilátky.The present invention still further relates to anti-leukemic agents, characterized in that said agent is a fragment, peptide or low molecular weight compound of a monoclonal antibody.
• · · · • · · · « · • · · · · · ···· • · · · · · · · · • · · · · ······ — 7 — ···♦ ·· ·· ·· ·· ··· 7 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· ·· ··
Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Obr. 1 vzor vzniklý elektroforézou ukazující pás lidského IAP amplifikovaného pomocí PCR s využitím cDNA připravené z mRNA buněčné linie HL-60. Směrem zleva jsou ukázány markér molekulové hmotnosti (M), lidský IAP (1) a β-aktin (2).Giant. 1 is an electrophoresis pattern showing a human IAP band amplified by PCR using cDNA prepared from HL-60 cell line mRNA. The molecular weight marker (M), human IAP (1) and β-actin (2) are shown to the left.
Obr. 2 je graf ukazující úroveň exprese lidského IAP L1210 buňkami, které exprimovaly lidský IAP, použitím protilátek proti CD47. Pík představuje L1210 buňky transfektované pouze genem pCOSl jako kontrola.Giant. 2 is a graph showing the level of expression of human IAP by L1210 by cells that expressed human IAP using anti-CD47 antibodies. The peak represents L1210 cells transfected only with the pCOS1 gene as a control.
Obr. 3 je další graf ukazující úroveň exprese lidského IAP L1210 buňkami, které exprimovaly lidský IAP, použitím protilátek proti CD47. Pík ukazuje, že exprese lidského IAP určitě vzrostla u L1210 buněk, transfektovaných genem lidského IAP.Giant. 3 is another graph showing the level of expression of human IAP by L1210 by cells that expressed human IAP using anti-CD47 antibodies. The peak shows that expression of human IAP certainly increased in L1210 cells transfected with the human IAP gene.
Obr. 4 je graf ukazující protilátkové titry u imunizované myši. Levý pík představuje neporušené L1210 buňky. Pravý pík představuje L1210 buňky transfektované lidským IAP, ukazující, že sérum myši vystavené buněčné fúzi zřetelně rozpoznává lidský IAP.Giant. 4 is a graph showing antibody titers in immunized mice. The left peak represents intact L1210 cells. The right peak represents L1210 cells transfected with human IAP, showing that the serum of the mouse exposed to cell fusion clearly recognizes human IAP.
Obr. 5 je sloupcový graf ukazující výsledky experimentu inhibice růstu (Jurkatovy buňky) použitím supernatantu kultury hybridomu.Giant. 5 is a bar graph showing the results of a growth inhibition experiment (Jurkat cells) using a hybridoma culture supernatant.
Obr. 6 je sloupcový graf ukazující výsledky experimentu inhibice růstu (ARH77 buňky) použitím supernatantu kultury hybridomu.Giant. 6 is a bar graph showing the results of a growth inhibition experiment (ARH77 cells) using hybridoma culture supernatant.
·· ···· ♦ ♦ ···· ·· ·· • » · · · · ···* ·· · · · ··*· • ···· ·····*·················································
- 8 — ···· ·· ·· ·· ··**··*- 8 - ···················
Obr. 7 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky ' (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro supernatant kultury 8G2 použité jako kontrolní. R1 ukazuje procento (%) apoptózy, které je 7,43%.Giant. 7 is a graph showing the effect of induction of apoptosis by culture supernatant on Jurkat cells' (based on PI labeling) as a result of supernatant of culture 8G2 used as control. R1 shows the percentage (%) of apoptosis which is 7.43%.
Obr. 8 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro 7D2-E3. R1 ukazuje procento (%) apoptózy, které je 9,84%.Giant. 8 is a graph showing the effect of induction of apoptosis by culture supernatant on Jurkat cells (based on PI labeling) resulting for 7D2-E3. R1 shows the percentage (%) of apoptosis which is 9.84%.
Obr. 9 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro 11C8. R1 ukazuje procento (%) apoptózy, které je 15,32%.Giant. 9 is a graph showing the effect of induction of apoptosis by culture supernatant on Jurkat cells (based on PI labeling) resulting for 11C8. R1 shows the percentage (%) of apoptosis which is 15.32%.
Obr. 10 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na Jurkatovy buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro supernatant kultury 8G2 použité jako kontrolní. Ml ukazuje procento (%) apoptózy, které je 6,94%.Giant. 10 is a graph showing the effect of induction of apoptosis by culture supernatant on Jurkat cells (based on PI labeling) as a result of supernatant of culture 8G2 used as control. M1 shows the percentage (%) of apoptosis which is 6.94%.
Obr. 11 je graf ukazující účinek indukce apoptózy supernatantem kultury na HL-60 buňky (na základě označení pomocí PI), který je výsledkem pro 11C8. Ml ukazuje procento (%) apoptózy, které je 12,16%.Giant. 11 is a graph showing the effect of apoptosis induction by culture supernatant on HL-60 cells (based on PI labeling) resulting for 11C8. M1 shows the percentage (%) of apoptosis which is 12.16%.
Obr. 12A je monochromatická mikrofotografie, ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant • · · · · · ·* ···♦ • ♦ ··♦ 9 9 9 9 9Giant. 12A is a monochromatic micrograph showing the results of apoptosis analysis (TUNEL method) in a co-cultured KM-102 and HL-60 cell system using a supernatant 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 99 99 99 kultury 9C5 jako kontrolní, černě nebo hnědě. Označení zelení a zvětšení je lOOx.9999 99 99 99 99 99 cultures of 9C5 as control, black or brown. Marking of greens and magnification is 100x.
Apoptotické buňky jsou označeny jádra bylo provedeno methylovouApoptotic cells are labeled nuclei were made methyl
Obr. 12B je barevná mikrofotografie, ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant kultury 9C5 jako kontrolní. Apoptotické buňky jsou označeny černě nebo hnědě. Označení jádra bylo provedeno methylovou zelení a zvětšení je lOOx.Giant. 12B is a color photomicrograph showing the results of apoptosis analysis (TUNEL method) in a co-cultured KM-102 and HL-60 cell system using 9C5 culture supernatant as a control. Apoptotic cells are marked in black or brown. The nucleus was labeled with methyl green and the magnification is 100x.
Obr. 13A je monochromatická mikrofotografie ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant kultury 11C8. Jsou vidět TUNEL-positivnější buňky než na Obr. 12. Apoptotické buňky jsou označeny černě nebo hnědě. Označení jádra bylo provedeno methylovou zelení a zvětšení je lOOx.Giant. 13A is a monochromatic micrograph showing the results of apoptosis analysis (TUNEL method) in a co-cultured KM-102 and HL-60 cell system using 11C8 culture supernatant. TUNEL-more positive cells are seen than in FIG. 12. Apoptotic cells are marked in black or brown. The nucleus was labeled with methyl green and the magnification is 100x.
Obr. 13B je barevná mikrofotografie ukazující výsledky analýzy apoptózy (methoda TUNEL) v kokultivovaném systému buněk KM-102 a HL-60, používající supernatant kultury 11C8. Jsou vidět TUNEL-positivnější buňky než na Obr. 12. Apoptotické buňky jsou označeny černě nebo hnědě. Označení jádra bylo provedeno methylovou zelení a zvětšení je lOOx.Giant. 13B is a color photomicrograph showing the results of apoptosis analysis (TUNEL method) in a co-cultured KM-102 and HL-60 cell system using 11C8 culture supernatant. TUNEL-more positive cells are seen than in FIG. 12. Apoptotic cells are marked in black or brown. The nucleus was labeled with methyl green and the magnification is 100x.
Obr. 14 vzor vzniklý elektroforézou, ukazující výsledky SDSPAGE analýzy IgG purifikovaného z hybridomových linií 7D2-E3 a 11C8. Znázorněny jsou markéry molekulové hmotnosti (M, M'), myší IgG (autentický vzorek) za neredukujících podmínek (1), 7D2-53 (2), 11C8 (3), myší IgG (autentický vzorek) za • · ··· ·Giant. 14 is an electrophoresis pattern showing the results of SDSPAGE analysis of IgG purified from hybridoma lines 7D2-E3 and 11C8. Molecular weight markers (M, M '), murine IgG (authentic sample) under non-reducing conditions (1), 7D2-53 (2), 11C8 (3), murine IgG (authentic sample) for • · ··· ·
-10• · 4 4 • · 4-10 • · 4 4 • · 4
4 4 44 4 4
4444 444444 44
4 44 redukujících podmínek (4), 7D2-E3 (5) a 11C8 (6).44 reducing conditions (4), 7D2-E3 (5), and 11C8 (6).
Obr. 15 ukazuje výsledky analýzy exprese CD47 průtokovou cytometrií použitím buněk HL-60.Giant. 15 shows the results of CD47 expression analysis by flow cytometry using HL-60 cells.
Obr. 16 ukazuje výsledky analýzy exprese CD47 průtokovou cytometrií použitím Jurkatových buněk.Giant. 16 shows the results of flow cytometry analysis of CD47 expression using Jurkat cells.
Obr. 17 ukazuje výsledky pro mlgG (10 μς/ιηΐ) jako kontrolu pro důkaz jeho účinku indukce apoptózy na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP (L1210-hIAP) (inkubace po 72 hodin).Giant. 17 shows the results for mlgG (10 μς / ιηΐ) as a control to demonstrate its effect of inducing apoptosis on L1210 cells transfected with the human IAP gene (L1210-hIAP) (incubation for 72 hours).
Obr. 18 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-1 (10 pg/ml) na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP (inkubace po 72 hodin).Giant. 18 shows the effect of induction of apoptosis in MABL-1 (10 µg / ml) on L1210 cells transfected with the human IAP gene (incubation for 72 hours).
Obr. 19 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-2 (10 μς/ml) na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP (inkubace po 72 hodin).Giant. 19 shows the effect of induction of apoptosis in MABL-2 (10 μς / ml) on L1210 cells transfected with the human IAP gene (incubation for 72 hours).
Obr. 20 ukazuje výsledky pro mlgG (10 gg/ml) jako kontrolu pro důkaz jeho účinku indukce apoptózy na Jurkatovy buňky (inkubace po 48 hodin).Giant. 20 shows the results for mlgG (10 gg / ml) as a control to demonstrate its effect of inducing apoptosis on Jurkat cells (incubation for 48 hours).
Obr. 21 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-1 (10 μς/ml) na Jurkatovy buňky (inkubace po 48 hodin).Giant. 21 shows the effect of induction of apoptosis in MABL-1 (10 μς / ml) on Jurkat cells (incubation for 48 hours).
Obr. 22 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-2 (10 gg/ml) na Jurkatovy buňky (inkubace po 48 hodin).Giant. 22 shows the effect of induction of apoptosis in MABL-2 (10 gg / ml) on Jurkat cells (incubation for 48 hours).
♦ · »··· ·· ·«·· ·· H. »H H H..... H
9 · · · · ···* • · · · · 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 — 2. 1 — 9999 99 99 99 99 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 - 1. 1 - 9999 99 99 99 99 99
Obr. 23 ukazuje výsledky pro mlgG (10 μ9/πι1) jako kontrolu pro důkaz jeho účinku indukce apoptózy na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP, který do nich byl vložen (L1210-hIAP) (inkubace po 72 hodin).Giant. 23 shows the results for mlgG (10 µ9 / πι1) as a control to demonstrate its effect of inducing apoptosis on L1210 cells transfected with the human IAP gene inserted (L1210-hIAP) (incubation for 72 hours).
Obr. 24 ukazuje účinek indukce apoptózy u MABL-2 Fab fragmentů (10 gg/ml) na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP.Giant. 24 shows the effect of apoptosis induction in MABL-2 Fab fragments (10 gg / ml) on L1210 cells transfected with the human IAP gene.
Obr. 25 je vzor vzniklý SDS elektroforézou u Fab fragmentů MABL-2 protilátek.Giant. 25 is a pattern generated by SDS electrophoresis of Fab fragments of MABL-2 antibodies.
Obr. 26 ukazuje zřetelně prodlouženou dobu přežíváni po zpracování pomocí MABL-2.Giant. 26 shows a markedly prolonged survival time after MABL-2 treatment.
Obr. 27 ukazuje výsledky testu ELISA pro Příklad 5(2).Giant. 27 shows ELISA results for Example 5 (2).
Obr. 28 ukazuje zřetelně prodlouženou dobu přežívání po zpracování pomocí F(ab')2 fragmentů MABL-2.Giant. 28 shows a markedly prolonged survival time after treatment with F (ab ') 2 fragments of MABL-2.
Obr. 29 je vzor vzniklý SDS elektroforézou u F(ab')2 fragmentů protilátky MABL-1 a protilátky MABL-2.Giant. 29 is a pattern generated by SDS electrophoresis of F (ab ') 2 fragments of MABL-1 and MABL-2.
Obr. 30 ukazuje, že hladiny lidského IgG v myším séru byly významně sníženy u skupiny ošetřené pomocí MABL-1 a MABL-2, což dokazuje protinádorové účinky těchto protilátek.Giant. 30 shows that human IgG levels in mouse serum were significantly reduced in the MABL-1 and MABL-2 treated groups, demonstrating the anti-tumor effects of these antibodies.
Výhodná provedení předloženého vynálezuPreferred embodiments of the present invention
Příprava monoklonální protilátky • * ··· · ·» «·«· • · · · · · · e » • · · · · ··«··· • · · · · · · ···· ···· #· ·· »> ·· «»Preparation of Monoclonal Antibody Monoclonal Antibody Preparation of Monoclonal Antibody # · ··
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu mohou být obecně připraveny následujícím způsobem. Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu mohou být například připraveny použitím lidského proteinu asociovaného s integrinem jako senzibilizačního antigenu, imunizací zvířat antigenem imunizačními metodami známými ze stavu techniky, provedením buněčné fúze způsoby známými ze stavu techniky a klonováním způsoby klonování známými ze stavu techniky.The monoclonal antibodies of the present invention can generally be prepared as follows. For example, the monoclonal antibodies of the present invention can be prepared using human integrin-associated protein as a sensitizing antigen, immunizing animals with antigen by prior art immunization methods, performing cell fusion by methods known in the art, and cloning by known cloning methods.
Konkrétněji je výhodným způsobem přípravy monoklonálních protilátek podle předloženého vynálezu například způsob, ve kterém rekombinantní buňky myší leukemické buněčné linie L1210, které exprimují lidský protein asociovaný s integrinem, jsou použity jako senzibilizační antigen, plasmové buňky (imunocyty) savce imunizované senzibilizačním antigenem jsou fúzovány s buňkami myelomu savce jako je například myš, výsledné fúzované buňky (hybridomy) jsou klonovány, klony produkující protilátky podle předloženého vynálezu, které rozpoznávají výše uvedenou buněčnou linii, jsou vybrány z výsledných klonů a kultivovány a jsou získány cílové protilátky.More specifically, a preferred method of preparing the monoclonal antibodies of the present invention is, for example, a method in which recombinant cells of murine leukemia cell line L1210 that express a human integrin-associated protein are used as a sensitizing antigen, the plasma cells (immunocytes) of mammals immunized with the sensitizing antigen a mammal myeloma such as a mouse, the resulting fused cells (hybridomas) are cloned, the antibody producing clones of the present invention that recognize the above cell line are selected from the resulting clones, and cultured to obtain the target antibodies.
Výše uvedený způsob je pouze jedním možným příkladem provedení předloženého vynálezu a například senzibilizační antigen není omezen na výše uvedené L1210 rekombinantní buňky, ale může jím být například lidský protein asociovaný s integrinem (IAP) sám o sobě nebo lidský IAP v rozpustné podobě; cílové monoklonální protilátky, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) mohou být připraveny stejným způsobem jako v • · φThe above method is only one possible example of an embodiment of the present invention and, for example, the sensitizing antigen is not limited to the aforementioned L1210 recombinant cells, but may be, for example, human integrin-associated protein (IAP) per se or human IAP in soluble form; Target monoclonal antibodies that induce apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) can be prepared in the same way as in • · φ
-13r« • Φ φφφφ • ·-13r «• Φ φφφφ · ·
• · « φφφ φ • · φφφ • 9 99 • φφφφ • φφφφ φφφ · φ φ φ «φφφ φ φφ φφ případě rekombinantních buněk L1210 uvedených výše.99 případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě případě
Může také být použita metoda vystavení na fágu, využívající cDNA knihovnu pro protilátku pro přípravu cílové monoklonální protilátky.A phage display method using an antibody cDNA library to prepare a target monoclonal antibody can also be used.
Volba savců, kteří mají být imunizováni senzibilizačním antigenem ve způsobu přípravy monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu není zvláštním způsobem omezena, ale tito savci by měli být výhodně zvoleni s uvážením jejich slučitelnosti s myelomovými buňkami použitými pro buněčnou fúzi, přičemž myši, krysy, křečci a podobně jsou obecně vhodní.The choice of mammals to be immunized with the sensitizing antigen in the method for preparing the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited, but these mammals should preferably be selected considering their compatibility with myeloma cells used for cell fusion, wherein mice, rats, hamsters and the like are generally suitable.
Imunizace se výhodně provádí standardními způsoby. Například se rekombinantní buňky L1210 exprimující lidský protein asociovaný s integrinem podávají zvířeti intraperitoneální injekcí a podobně.Immunization is preferably carried out by standard methods. For example, recombinant L1210 cells expressing a human integrin-associated protein are administered to an animal by intraperitoneal injection and the like.
Konkrétněji se zvířeti výhodně podává odpovídající zředění nebo suspenze s PBS nebo fyziologickým roztokem několikrát v desetidenních intervalech. Používané imunocyty jsou výhodně slezinné buňky extrahované po konečném podávání buněk.More specifically, the animal is preferably administered a corresponding dilution or suspension with PBS or saline several times at 10-day intervals. The immunocytes used are preferably spleen cells extracted after final administration of the cells.
Savčí myelomové buňky používané jako rodičovské buňky pro fúzi s imunocyty mohou být libovolné z řady buněčných linií známý ze stavu techniky, například P3 (P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548 (1978)], P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell, 8, 405-415 (1976)], Sp2/0-Agl4 [Nátuře, 276, 269-270 (1978)], FO [J.Mammalian myeloma cells used as parent cells for fusion with immunocytes may be any of a number of cell lines known in the art, for example P3 (P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548 (1978)], P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell 8: 405-415 (1976)], Sp2 / 0-Ag14 [Nature, 276, 269-270 (1978)], FO [J.
• · · ·• · · ·
-14Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)] a R210 [Nátuře, 277, 131-133 (1979)].-14Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)] and R210 [Nature, 277, 131-133 (1979)].
Buněčná fúze mezi imunocyty a myelomovými buňkami může být provedena v zásadě obvyklými způsoby, jako je například způsob, který popsali Milstein a kol. [Methods Enzymol., 73, 3-46 (1981)].Cell fusion between immunocytes and myeloma cells can be performed using essentially conventional methods, such as those described by Milstein et al. [Methods Enzymol., 73: 3-46 (1981)].
Konkrétněji se buněčná fúze provádí například ve společném nutričním médiu v přítomnosti promotoru fúze. Například může být jako promotor fúze použit polyethylenglykol (PEG), Sendai virus (HVJ) a podobně a je-li to požadováno, je možno použít adjuvans jako je dimethylsulfoxid, který se vhodným způsobem přidá pro zvýšení účinnosti fúze. Imunocyty s používají výhodně v množství představujícím 1-10 násobek počtu myelomových buněk. Médium použité pro buněčnou fúzi může být například RPMI-1640 médium, MEM médium a podobně, které je vhodné pro růst myelomových buněčných linií nebo jiné médium běžně používané pro takovou kultivaci buněk a může být také použito v kombinaci se sérovým suplementem jako je fetální hovězí sérum (FBS).More specifically, the cell fusion is performed, for example, in a common nutrient medium in the presence of a fusion promoter. For example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), and the like can be used as the fusion promoter and, if desired, an adjuvant such as dimethylsulfoxide can be used, which is added appropriately to increase fusion efficiency. Immunocytes are preferably used in an amount of 1-10 times the number of myeloma cells. The medium used for cell fusion may be, for example, RPMI-1640 medium, MEM medium, and the like which is suitable for the growth of myeloma cell lines or other medium commonly used for such cell culture and may also be used in combination with a serum supplement such as fetal bovine serum. (FBS).
Buněčná fúze se provádí důkladným promícháním předepsaných množství imunocytů a myelomových buněk v médiu, přidáním roztoku PEG předehřátého na teplotu zhruba 37 °C, přičemž PEG má střední molekulovou hmotnost přibližně 1000-6000, například do média obvykle s koncentrací okolo 30-60% (hmotnost/objem) a mícháním. Potom se postupně přidá vhodné médium a supernatant získaný centrifugací se odebere. Tato procedura se opakuje pro vytvoření cílových hybridomů.The cell fusion is performed by thoroughly mixing prescribed amounts of immunocytes and myeloma cells in the medium, adding a PEG solution preheated to about 37 ° C, the PEG having an average molecular weight of about 1000-6000, for example, into a medium usually at a concentration of about 30-60% (v / v) and stirring. The appropriate medium is then added sequentially and the supernatant obtained by centrifugation is collected. This procedure is repeated to create target hybridomas.
• · · · • · · ·• · · · · · · · · · · ·
99
Hybridomy se vybírají kultivací v obvyklém selekčním médiu jako je HAT médium (médium obsahující hypoxanthin, aminoptetin a thymidin). Kultivace v HAT médiu se pokračuje po dostatečnou dobu, aby byla dosažena smrt všech buněk jiných než jsou cílové hybridomy (všechny nefúzované buňky), což je obvykle od několika dní do několika týdnů. Potom je použita obvyklá metoda limitujícího zředění pro třídění a monoklonování hybridomů produkujících cílové protilátky.Hybridomas are selected by culturing in a conventional selection medium such as HAT medium (hypoxanthine, aminoptetin and thymidine containing medium). Cultivation in HAT medium is continued for a sufficient period of time to achieve death of all cells other than the target hybridomas (all unfused cells), which is usually from a few days to several weeks. The conventional limiting dilution method is then used to sort and monoclon the hybridomas producing the target antibodies.
Hybridomy připravené tímto způsobem, které produkují monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu, mohou být subkultivovány v běžném médiu a mohou být umístěny pro dlouhodobé uchovávání do tekutého dusíku.Hybridomas prepared in this manner that produce the monoclonal antibodies of the present invention can be subcultured in conventional media and placed for long-term storage in liquid nitrogen.
Pro získání monoklonálních protilátek podle předloženého vynálezu z hybridomů může být použit libovolný vhodný způsob, jako jsou způsoby, kdy hybridomy mohou být kultivovány využívajíce standardní metody a protilátky mohou být získány ze supernatantů kultur; nebo alternativně jako jsou způsoby, kdy hybridomy mohou být podávány slučitelnému savci pro proliferaci a potom protilátky mohou být získány z jeho břišních tekutin. První z uvedených způsobů je vhodný pro získání vysoce čistých protilátek, zatímco druhý způsob je vhodnější pro hromadnou výrobu protilátek.Any suitable method can be used to obtain the monoclonal antibodies of the present invention from hybridomas, such as methods wherein hybridomas can be cultured using standard methods and antibodies can be obtained from culture supernatants; or alternatively, such as methods wherein the hybridomas can be administered to a compatible mammal for proliferation and then the antibodies can be obtained from its abdominal fluids. The first method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the second method is more suitable for mass production of antibodies.
Protilátky získané výše uvedenými způsoby mohou být vysoce purifikovány použitím standardních purifikačních způsobů jako je vysolování, gelová filtrace, afinitní chromatografie a podobně.Antibodies obtained by the above methods can be highly purified using standard purification methods such as salting-out, gel filtration, affinity chromatography and the like.
Fragmenty monoklonálních protilátekMonoclonal antibody fragments
99
9 · 9 • 9 9 ·9 · 9
99
-16» 999 9 99*99« • 9 «999 · 9 · 4 »999 99 «9 99 99-16 999 999 9 99 * 99 • • 9 999 999 · 9 · 4 9 999 99 9 9 99 99
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu mohou být úplné protilátky jak byly popsány výše a nebo jejich fragmenty. To znamená, že jimi mohou být libovolné fragmenty monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) , které mají lidský protein asociovaný s integrinem. Takové fragmenty zahrnují Fab, F(ab')2, Fab' a podobně. Tyto fragmenty mohou být připraveny natrávením enzymem jako je papain, pepsin, ficin a podobně. Vlastnosti takto získaných fragmentů mohou být potvrzeny stejným způsobem, jako bylo popsáno výše.The monoclonal antibodies of the present invention may be complete antibodies as described above or fragments thereof. That is, they may be any monoclonal antibody fragments of the present invention that specifically recognize human integrin-associated protein and induce apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) having human integrin-associated protein. Such fragments include Fab, F (ab ') 2 , Fab' and the like. These fragments can be prepared by digestion with an enzyme such as papain, pepsin, ficin and the like. The properties of the fragments thus obtained can be confirmed in the same manner as described above.
Peptidy a nízkomolekulární sloučeniny, které mají stejné funkce jako monoklonální protilátkyPeptides and low molecular weight compounds having the same functions as monoclonal antibodies
Monoklonální protilátky popsané výše, které rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a indukují apoptózu krevních buněk s jádrem také zahrnují peptidy a nízkomolekulární sloučeniny, které také rozpoznávají IAP a indukují apoptózu krevních buněk s jádrem.The monoclonal antibodies described above that recognize human integrin-associated protein and induce apoptosis of nucleus blood cells also include peptides and low molecular weight compounds that also recognize IAP and induce apoptosis of nucleus blood cells.
Vlastnosti monoklonálních protilátek podle předloženého vynálezuProperties of the monoclonal antibodies of the present invention
Jak bude konkrétně popsáno v následujících Příkladech, monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem.As specifically described in the following Examples, the monoclonal antibodies of the present invention specifically recognize human integrin-associated protein.
• · • · · · • · · · fr ·• · fr · fr ·
-17Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu také indukují apoptózu krevních buněk s jádrem (myeloidní buňky a lymfocyty) s lidským proteinem asociovaným s integrinem.The monoclonal antibodies of the present invention also induce apoptosis of nucleus blood cells (myeloid cells and lymphocytes) with human integrin-associated protein.
Tyto vlastnosti mohou být využity pro získání užitečných terapeutických činidel v oblasti léčby myeloidní leukemie a lymfoidní leukemie.These properties can be utilized to provide useful therapeutic agents in the field of treating myeloid leukemia and lymphoid leukemia.
Je proto zřejmé, že zahrnuj ících předloženého rozpoznávání který použití vynálezu, antigenů, buněk s jádrem, pro odlišení využití jedinečných jako terapeutických konstrukce specifických systémů monoklonálních protilátek podle jako protilátek pro specifické způsobuje apoptózu krevních a identifikaci antigenů nebo vlastností monoklonálních protilátek činidel pro myeloidní leukémii a lymfoidní leukémii, stejně tak jako jakákoli modifikace a použití takových systémů spadají také do rozsahu předmětu předloženého vynálezu, pokud mohou být prováděny aplikací standardních method, které jsou zřejmé odborníkům.It is therefore apparent that including the present recognition which uses of the invention, antigens, nuclei, to differentiate the use of unique as therapeutic constructs of specific monoclonal antibody systems according to as specific antibodies causes blood apoptosis and identification of antigens or monoclonal antibody properties of myeloid leukemia agents and lymphoid leukemia, as well as any modification and use of such systems, are also within the scope of the present invention, as long as they can be performed using standard methods known to those skilled in the art.
Protileukemická činidlaAnti-leukemic agents
Protileukemické činidlo podle předloženého vynálezu je založeno na faktu, že působení IAP je podporováno vazbou protilátky nebo podobné látky podle předloženého vynálezu, a i když neexistují žádná konkrétní omezení dávkování protilátky podle předloženého vynálezu, pohybuje se dávkování výhodně v rozmezí od 5 μg do 500 mg/kg.The anti-leukemic agent of the present invention is based on the fact that the action of IAP is promoted by binding of the antibody or the like of the present invention, and although there are no particular dosage limits of the antibody of the present invention, the dosage is preferably in the range of 5 µg to 500 mg / kg. .
Příklady provedení vynálezu • · · · ·DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
-18• · · · · ···· • · · · · ······ • · · ···· 0 · « · ···· ·· ·· «· ·· ··-18 · · · ···· · · · · ····· · · · ··· 0 · «· ············
Předložený vynález bude nyní detailněji objasněn prostřednictvím následujících příkladů; předložený vynález však není těmito příklady žádným způsobem omezen.The present invention will now be explained in more detail by means of the following examples; however, the present invention is not limited in any way by these examples.
Příklad 1 (Příprava monoklonální protilátky) (1) Senzibilizační antigen a způsob imunizaceExample 1 (Preparation of monoclonal antibody) (1) Sensitizing antigen and method of immunization
Antigenová senzibilizace byla docílena použitím rekombinantní buněčné linie jako senzibilizačního antigenu; byly to L1210 buňky transfektované genem lidského IAP a vysoce exprimovaly produkt. L1210 se získá z DBA od myši odvozené leukemické buněčné linie (ATCC No. CCL-219, J. Nati. Cancer Inst. 10:179-192, 1949).Antigen sensitization was achieved using a recombinant cell line as a sensitizing antigen; they were L1210 cells transfected with the human IAP gene and highly expressed the product. L1210 is obtained from DBA from a mouse derived leukemia cell line (ATCC No. CCL-219, J. Natl. Cancer Inst. 10: 179-192, 1949).
Gen lidského IAP byl amplifikován pomocí PCR používajíce jako primer sekvenci specifickou pro lidský IAP (přímý primer: GCAAGCTTATGTGGCCCCTGGTAGCG, reverzní primer: GCGGCCGCTCAGTTATTCCTAGGAGG) a cDNA připravené z mRNA buněčné linie HL-60 (Klontech Laboratories, lne.) jako templátu (Obr. 1).The human IAP gene was amplified by PCR using the human IAP-specific sequence as a primer (forward primer: GCAAGCTTATGTGGCCCCTGGTAGCG, reverse primer: GCGGCCGCTCAGTTATTCCTAGGAGG) and cDNA prepared from HL-60 cell line mRNA (Clontech Laboratories, Ill., Fig. 1). .
PCR produkt byl subklonován do klonovacího vektoru pGEM-T (Promega Corporation) a použit pro transformaci E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a po potvrzení nucleotidové sekvence insertu DNA použitím DNA sekvenceru (373A DNA Sequencer, dodávaná společností ABI), byl subklonován expresivním vektorem pCOSl.The PCR product was subcloned into the pGEM-T cloning vector (Promega Corporation) and used to transform E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and after confirming the nucleotide sequence of the DNA insert using a DNA sequencer (373A DNA Sequencer, supplied by ABI) was subcloned by the expression vector pCOS1.
Expresivní vektor pCOSl je derivát pEF-BOS (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990) a je to vektor získaný • · • · · · • · · ·The expression vector pCOS1 is a derivative of pEF-BOS (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990), and is a vector obtained.
-19subklonováním genu odolnosti proti neomycinu použitím lidského elongačního faktoru la jako promotoru/posilovače. Tento expresivní vektor se subklonovaným lidským IAP byl použit pro vložení do L1210 buněčné linie s DMRIE-C (GIBCO/BRL), selekce byla provedena pomocí Geneticinu (konečná koncentrace 1 mg/ml, dodávaný GIBCO/BRL) a L1210 buňky se vloženým genem byly klonovány způsobem limitujícího zředění.-19 by cloning the neomycin resistance gene using human elongation factor 1a as promoter / enhancer. This expression vector with subcloned human IAP was used for insertion into the L1210 cell line with DMRIE-C (GIBCO / BRL), selection was made with Geneticin (final concentration 1 mg / ml, supplied by GIBCO / BRL) and L1210 cells with the inserted gene were cloned by limiting dilution.
Exprese antigenu získaných klonů byla zkoumána pomocí protilátek proti CD47, rozpoznávajících lidský IAP (PharMingen) a klony s vysokou úrovní exprese byly zvoleny jako antigenem senzibilizované buňky (Obr. 2, 3) . Pro kultivaci rekombinantních buněk L1210 bylo jako médium zvoleno 10% fetální hovězí sérum (FBS, dodávané společností Moregate lne.) a Iscove-ovo modifikované Dulbeccovo médium (IMDM) (GIBCO/BRL) a buňky byly subkultivovány v 5% CO2 inkubátoru při teplotě 37 °C.Antigen expression of the obtained clones was screened using anti-CD47 antibodies recognizing human IAP (PharMingen) and clones with high expression levels were selected as antigen-sensitized cells (Fig. 2, 3). For culture of recombinant L1210 cells, 10% fetal bovine serum (FBS, supplied by Moregate Inc) and Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) (GIBCO / BRL) were selected as the medium and the cells were subcultured in a 5% CO 2 incubator at temperature. Deň: 32 ° C.
Použitá imunizovaná zvířata byly myši DBA/2 (chov Charles River, Japan), které byly ze stejného kmene jako L1210 buňky. Genem lidského proteinu asociovaného s integrinem (IAP) transfektované L1210 buňky, použité pro senzibilizaci antigenem, byly inkubovány po přibližně 30 minut s mitomycinem C (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) při koncentraci 200 gg/ml a po zastavení růstu buňky byl mitomycin C důkladně vymyt před vytvořením suspenze v PBS.The immunized animals used were DBA / 2 mice (Charles River breeding, Japan) that were from the same strain as L1210 cells. The human integrin-associated protein (IAP) gene of transfected L1210 cells, used for antigen sensitization, was incubated for approximately 30 minutes with mitomycin C (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) at a concentration of 200 gg / ml and mitomycin was stopped after cell growth Wash thoroughly before slurrying in PBS.
Buňky byly intraperitoneálně injektovány myši třikrát v intervalech zhruba 10 dní, pokaždé přibližně 5 x 106 buněk. Po provedení třetí imunizace byla odebrána krev z očního • · · » • · · ·Cells were injected intraperitoneally into mice three times at intervals of about 10 days, each time with approximately 5 x 10 6 cells. After the third immunization, blood was collected from the eye.
-20důlku, sérum bylo zředěno padesátinásobně pomocí PBS obsahujícího 1% BSA a vazba mezi zředěným sérem a rekombinantními L1210 buňkami použitými pro šenzibilizaci antigenem byla potvrzena pomocí FACScan (Becton Dickinson and Company) (Obr. 4); myš, která měla nejlepší antisérovou aktivitu byla vystavena posilovači imunizaci intraperitoneální injekcí 1 x 107 buněk 5 dní po čtvrté imunizaci. Čtyři dny po závěrečné imunizaci byla myš usmrcena a její slezina byla extrahována.-20 well, serum was diluted 50-fold with PBS containing 1% BSA, and binding between the diluted serum and recombinant L1210 cells used for antigen sensitization was confirmed by FACScan (Becton Dickinson and Company) (Fig. 4); mice that had the best antiserum activity were challenged with intraperitoneal injection of 1 x 10 7 cells 5 days after the fourth immunization. Four days after the final immunization, the mouse was sacrificed and its spleen was extracted.
(2) Buněčná fúze(2) Cell fusion
Po nařezání sleziny extrahované z myši na tenké plátky byly disociované slezinné buňky centrifugovány a potom suspendovány v médiu INDM, ponechány vyplavat a důkladně promývány. Odděleně byla kultivována myší myelomová buněčná linie P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)] v médiu IMDM obsahujícím 10 % fetální hovězí sérum (FBS, dodané společností Moregate lne.) a po podobném promytí v IMDM médium bylo 1 x 107 buněk umístěno do centrifugační zkumavky ve směsi s 5 x 107 buňkami sleziny a vystaveno buněčné fúzi standardním způsobem [Clin. Exp. Immunol., 42, 458-462 (1980)], používajíce polyethylenglykol 4000 (Nakarai Chemical Co., Ltd.).After slicing the spleen extracted from the mouse into thin slices, the dissociated spleen cells were centrifuged and then suspended in INDM medium, allowed to wash and thoroughly washed. Separately, the P3-U1 murine myeloma cell line [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)] was cultured in IMDM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, supplied by Moregate Inc) and after a similar wash in IMDM medium was plated in 1 x 10 7 cells in a centrifuge tube mixed with 5 x 10 7 spleen cells and subjected to cell fusion in a standard manner [Clin. Exp. Immunol., 42, 458-462 (1980)], using polyethylene glycol 4000 (Nakarai Chemical Co., Ltd.).
Výsledné fúzované buňky byly potom suspendovány v IMDM médiu obsahujícím 10% FBS a činidlo stimulující růst fúzovaných buněk (BM-Condimed Hl, dodávaný společností Boehringer Mannheim Biochemicals) a rozděleny do 96-jamkových destiček pro kultivaci při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5% CO2. Následující den byly buňky umístěny do HAT selekčního média ♦ · • · · · • » · · • » • · · · · · » · · • · * · « 9 9 9 99 9 a potom do 10% FBS/IMDM média obsahujícího činidlo stimulující růst a kultivace pokračovala za trvalého růstu.The resulting fused cells were then suspended in IMDM medium containing 10% FBS and fusion cell growth stimulating agent (BM-Condimed H1, supplied by Boehringer Mannheim Biochemicals) and dispensed into 96-well plates at 37 ° C in a 5% incubator. CO2. The next day, the cells were placed in HAT selection medium and then in 10% FBS / IMDM medium containing growth stimulating agent and cultivation continued with sustained growth.
Pro ověření účinku supernatantové kultury těchto fúzovaných buněk na leukemické buněčné linie bylo médium pro fúzované buňky nahrazeno IMDM médiem obsahujícím 10 % FBS a kultivace pokračovala za trvalého růstu.To verify the effect of the supernatant culture of these fused cells on leukemic cell lines, the fused cell medium was replaced with IMDM medium containing 10% FBS and the culture was continued under steady growth.
(3) Třídění(3) Sorting
Za použití supernatantu kultury výše uvedených fúzovaných buněk bylo provedeno následující třídění.The following sorting was performed using the culture supernatant of the above fused cells.
[1] Primární třídění[1] Primary classification
Buňky myší slezinné stromální buněčné linie (CF-1 buňky) transfektované genem lidského proteinu asociovaného s integrinem (IAP) (rekombinantní buňky do kterých byl subklonován stejný plasmid jako plasmid použitý pro přípravu L1210 buněk exprimujících lidský IAP použitý pro senzibilizaci antigenem) byly naočkovány na 96-jamkovou destičku s 1 x 104 buňkami na jamku a kultivovány přes noc a potom fixovány pomocí 2% PLP (periodát-lysinparaformaldehyd) pro přípravu ELISA destičky. Po promytí byla destička vystavena blokování po 1 hodinu při pokojové teplotě použitím 1% roztoku BSA a po dalším promývání bylo přidáno 50 μΐ supernatantu kultury každého hybridomů pro inkubaci při teplotě okolí po dobu jedné hodiny.Mouse spleen stromal cell line (CF-1 cells) transfected with human integrin-associated protein (IAP) gene (recombinant cells into which the same plasmid was subcloned as the plasmid used to prepare L1210 cells expressing human IAP used for antigen sensitization) were seeded at 96 A well plate with 1 x 10 4 cells per well and cultured overnight and then fixed with 2% PLP (periodate-lysinparaformaldehyde) to prepare an ELISA plate. After washing, the plate was subjected to blocking for 1 hour at room temperature using 1% BSA solution and after further washing, 50 μΐ of the culture supernatant of each hybridoma was added for incubation at ambient temperature for one hour.
Po promývání byl přidán proti-myší IgG+A+M (H+L) (Zymed Laboratories lne.) označený alkalickou fosfatázou před • · 4 · • 4 4 4 ·After washing, alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG + A + M (H + L) (Zymed Laboratories Inc.) Was added prior to washing.
-22• 4 4 «4 4 4 inkubací při teplotě okolí po dobu 1 hodiny. Po promytí byl přidán substrát SIGMA 104 (Sigma-Aldrich Corporation) pro získání konečné koncentrace 1 mg/ml, inkubace pokračovala při teplotě okolí a specifická aktivita byla měřena čtečkou mikrodestiček (Model 3550, dodávaný společností BioRad Laboratories Inc.).-22 • 4 4 4 4 4 4 incubations at ambient temperature for 1 hour. After washing, SIGMA 104 substrate (Sigma-Aldrich Corporation) was added to obtain a final concentration of 1 mg / ml, incubation was continued at ambient temperature and specific activity was measured with a microplate reader (Model 3550, supplied by BioRad Laboratories Inc.).
Jako výsledek byl potvrzen výskyt hybridomů v 2089 jamkách z celkových 2880 jamek, do kterých byly naočkovány hybridomy, s 187 jamkami pozitivními v primárním třídění. 50 μΐ každého myšího IgGl jako negativní kontrola a protilátka proti lidským CD47 (BD PharMingen) jako pozitivní kontrola byly přidány v koncentraci 3 μ9/ιη1, před inkubací při teplotě okolí po dobu 1 hodiny.As a result, the occurrence of hybridomas in 2089 wells out of a total of 2880 wells inoculated with hybridomas, with 187 wells positive in primary sorting, was confirmed. 50 μΐ of each mouse IgG1 as a negative control and anti-human CD47 antibody (BD PharMingen) as a positive control were added at a concentration of 3 μ9 / η1, before incubation at ambient temperature for 1 hour.
[2] Sekundární třídění[2] Secondary classification
Klony ohodnocené jako pozitivní v primárním třídění byly podrobeny ELISA systému využívajícímu CF-1 buňky exprimující lidský protein asociovaný s integrinem (IAP), přičemž negativní kontrolou byly CF-1 buňky transfektované pouze expresivním vektorem pCOSl, s cílem určit, zda protilátky produkované hybridomy skutečně specificky rozpoznávají lidský IAP.Clones rated positive in primary screening were subjected to an ELISA system using CF-1 cells expressing human integrin-associated protein (IAP), with negative control being CF-1 cells transfected with only the pCOS1 expression vector to determine whether the antibodies produced by hybridomas actually did specifically recognize the human IAP.
Jako výsledek bylo jako pozitivní potvrzeno 21 ze 187 jamek, které byly shledány jako pozitivní v primárním třídění. Tabulka 1 ukazuje specifickou vazbu lidského IAP s 7D2 a 11C8 jako representativní příklady a to jako absorbci v testu ELISA.As a result, 21 of 187 wells were found to be positive and found to be positive in the primary screen. Table 1 shows the specific binding of human IAPs to 7D2 and 11C8 as representative examples as absorption by ELISA.
• ·• ·
-23• · · · · · • ···· ··» ···· · · ·· « · » ♦ (Tabulka 1) ELISA analýza specifické vazby hybridomového supernatantu kultur s lidským IAP(Table 1) ELISA analysis of the specific binding of hybridoma supernatant to human IAP cultures
Tabulka 1Table 1
[3] Terciální třídění[3] Tertiary classification
Klony považované za pozitivní v sekundárním třídění byly vystaveny testu inhibice růstu používajícího Jurkatovy buňky (lidská lymfatická linie T buněk) a ARH77 buňky (lidská myelomová buněčná linie) . 100 μΐ Jurkatových buněk v 5 x 103 buňkách na jamku a ARV77 buňky s 1 x 104 buněk na jamku byly naočkovány do každé jamky 96-jamkové destičky a do buněčných suspenzí bylo přidáno 5 nebo 10 μΐ supernatantu kultury hybridomových klonů. Po kultivaci po dobu přibližně 2 dny byl počty buněk měřeny pomocí testu MTS. Jako kontrola bylo přidáno 5 nebo 10 μΐ každého IMDM média obsahujícího 10 % FBS a supernatanty kultur klonů, které byly negativní v primárním testování (8G2 a 9CS) .Clones considered positive in the secondary screening were subjected to a growth inhibition assay using Jurkat cells (human T cell lymph line) and ARH77 cells (human myeloma cell line). 100 μΐ of Jurkat cells in 5 x 10 3 cells per well and ARV77 cells with 1 x 10 4 cells per well were seeded into each well of a 96-well plate and 5 or 10 μΐ of culture supernatant of hybridoma clones was added to the cell suspensions. After cultivation for approximately 2 days, cell counts were measured using the MTS assay. As a control, 5 or 10 μΐ of each IMDM medium containing 10% FBS and culture supernatants of clones that were negative in the primary assay (8G2 and 9CS) were added.
• · • ·· · • · · ·• · · · · · · · · · · ·
-24Obr. 5 a 6 znázorňují výsledky testu inhibice růstu pro čtyři reprezentativní klony, 11C8, 7D2-E3 (sůbklon 7D2), 13F1 a 2F12.-24Fig. 5 and 6 show the results of the growth inhibition assay for four representative clones, 11C8, 7D2-E3 (7D2 clone), 13F1 and 2F12.
(4) Vlastnosti protilátek [11 Imunoglobulinové typy supernatantů kultur 11C8, 7D2-E3, 13F1 a 2F12 byly prozkoumány použitím ELISA systému.(4) Antibody Properties [11] Immunoglobulin types of culture supernatants of 11C8, 7D2-E3, 13F1 and 2F12 were examined using an ELISA system.
Konkrétně byly CF-1 buňky exprimující lidský protein asociovaný s integrinem (IAP)naočkovány do 96-jamkové destičky pro přípravu ELISA destičky a potom bylo přidáno 50 μΐ každého supernatantu kultury, alkalickou fosfatázou označené protilátky proti myšímu IgG (Zymed Laboratories lne.) nebo protilátky proti myšímu IgM (Biosource Intl., Inc.) byly ponechány reagovat jako sekundární protilátky a aktivita byla měřena mikrodestičkovou čtečkou. Jako výsledek bylo potvrzeno, že 11C8 a 7D2-E3 jsou IgG, zatímco 13F1 a 2F12 byly potvrzeny jako IgM.Specifically, CF-1 cells expressing human integrin-associated protein (IAP) were seeded into a 96-well ELISA plate preparation and then 50 μΐ of each culture supernatant, alkaline phosphatase labeled anti-mouse IgG antibody (Zymed Laboratories Inc) or antibody was added. against mouse IgM (Biosource Intl., Inc.) were allowed to react as secondary antibodies and activity was measured by a microplate reader. As a result, it was confirmed that 11C8 and 7D2-E3 were IgG, whereas 13F1 and 2F12 were confirmed as IgM.
[2] DNA fragmentace dvou klonů 11C8 a 7D2-E3 ze čtyř výše popsaných klonů byly analyzovány průtokovou cytometrií (FACScan, dodávaný společností Becton, Dickinson and Company) použitím Jurkatových buněk a HL-60 buněk. Jurkatovy buňky byly použity pro 11C8 a 7D2-E3 a HL-60 buňky byly použity pro 11C8.[2] DNA fragmentation of two clones 11C8 and 7D2-E3 from the four clones described above were analyzed by flow cytometry (FACScan, supplied by Becton, Dickinson and Company) using Jurkat cells and HL-60 cells. Jurkat cells were used for 11C8 and 7D2-E3 and HL-60 cells were used for 11C8.
Jurkatovy buňky a HL-60 buňky byly naočkovány do 12-jamkové destičky v množství 4 x 104 buněk na jamku/2 ml a bylo přidáno 200 μΐ supernatantů kultur 7D2-E3 a 11C8. Buňky byly frfrfrfrJurkat cells and HL-60 cells were seeded into a 12-well plate at 4 x 10 4 cells per well / 2 ml and 200 µL of culture supernatants of 7D2-E3 and 11C8 were added. The cells were frfrfrfr
-25fr fr* · · · · fr • ··· frfrfrfr • frfr fr frfr· ·· fr • fr frfrfr fr frfrfrfr frfr frfr frfr frfr frfr kultivovány po dobu 2 dní a měřeny. Jako kontrola byly přidány supernatanty kultur 8G2 ve stejných objemech. Buňky byly odebrány z kultivačních destiček a buněčný pelet byl fixován za 200 x g po dobu 60 minut při teplotě 4 °C v 2 ml ledového 70% ethanolu. Buňky byly potom centrifugovány, promývány v 1 mi PBS a resuspendovány v 0,5 ml PBS. Do 0,5 ml vzorku buněk bylo přidáno 0,5 ml RNAsy (Typ I-A, SigmaAldrich Corporation, St. Louis, MO, USA; 1 mg/ml v PBS) a byly míchány tři minuty v 1 ml propidiumjodidovém roztoku (PI, Sigma, 100 pg/ml v PBS). Smíchané buňky byly inkubovány po dobu 60 minut v temné komoře při teplotě 37 °C a potom uchovávány v temné komoře při teplotě 4 °C a měřeny průtokovou cytometrií.-25fr fr frfrfrfr frfr fr frfr fr frfrfr fr frfrfrfr frfr frfr frfr frfr cultured for 2 days and measured. Supernatants of 8G2 cultures in equal volumes were added as a control. Cells were removed from the culture plates and the cell pellet was fixed at 200 x g for 60 minutes at 4 ° C in 2 ml of ice cold 70% ethanol. The cells were then centrifuged, washed in 1 ml PBS and resuspended in 0.5 ml PBS. 0.5 ml of RNAse (Type IA, SigmaAldrich Corporation, St. Louis, MO, USA; 1 mg / ml in PBS) was added to a 0.5 ml cell sample and mixed for 3 minutes in 1 ml propidium iodide solution (PI, Sigma). , 100 µg / ml in PBS). Mixed cells were incubated for 60 minutes in a dark chamber at 37 ° C and then stored in a dark chamber at 4 ° C and measured by flow cytometry.
Jak je znázorněno na Obr. 7-9 a 10-11, supernatanty kultur 7D2-E3 a 11C8 zvyšují podíl buněčné apoptózy Jurkatových buněk a supernatant kultury 11C8 zvyšuje podíl buněčné apoptózy buněk HL-60.As shown in FIG. 7-9 and 10-11, supernatants of 7D2-E3 and 11C8 cultures increase the proportion of cell apoptosis of Jurkat cells, and supernatant of 11C8 culture increases the proportion of cell apoptosis of HL-60 cells.
[3] Supernatanty kultur 11C8 byly použity pro kokultivaci systému s HL-60 buňkami použitím buněk vyživující vrstvy lidského myeloidu stromální buněčné linie KM102 pro určení, zda tyto supernatanty kultur indukují apoptózu buněk HL-60.[3] 11C8 culture supernatants were used to co-cultivate a HL-60 cell system using cells fed a layer of human myeloid stromal cell line KM102 to determine whether these culture supernatants induce apoptosis of HL-60 cells.
Konkrétně byly buňky RM102 naočkovány na 2-dvoujamkovou destičku Lab-Tek Chamber Slide (Nalge Nunc Intl. Corporation) a ponechány dorůst do subkonfluentního stavu, 1 x 105 buněk HL-60 bylo naočkováno a kultivováno po dobu přibližně jednoho dne a potom byly odebrány nepřipojené buňky HL-60.Specifically, RM102 cells were seeded in a 2-well Lab-Tek Chamber Slide (Nalge Nunc Intl. Corporation) and allowed to grow to a subconfluent state, 1 x 10 5 HL-60 cells were seeded and cultured for approximately one day and then harvested. unattached HL-60 cells.
-26Současně byly přidány výše uvedené supernatanty kultur pro dosažení konečné koncentrace 10% a buňky byly kultivovány po dobu 2 dní. Po ukončení kultivace byly buňky 'fixovány 10% formalinem a HL-60 buňky indukované do apoptózy byly detekovány metodou TUNEL (ApopTag Plus dodávaný společností Oncor lne.). Jak je znázorněno na Obr. 12 a 13, supernatant kultury 11C8 zvyšoval více apoptózu buněk HL-60 něž supernatant kultury 9C5, což byl supernatant kultury nereakčního hybridomového klonu lidského IAP použitý jako kontrola.The above culture supernatants were added simultaneously to reach a final concentration of 10% and the cells were cultured for 2 days. After cultivation, cells were fixed with 10% formalin and HL-60 cells induced into apoptosis were detected by TUNEL (ApopTag Plus supplied by Oncor Inc). As shown in FIG. 12 and 13, the culture supernatant of 11C8 increased more apoptosis of HL-60 cells than the culture supernatant of 9C5, which was the culture supernatant of the non-reactive human IAP hybridoma clone used as a control.
(5) Purifikace protilátek(5) Purification of antibodies
Pro čištění protilátek vytvořených hybridomy byly buněčné linie těch klonů hybridomových linií 7D2-E3 a 11C8, které produkovaly IgG, intraperitoneálně injektované myši BALB/c/AnNCrj, které byl podáván přistaň (samec, dodaný společností Charles River, Japan) postupujíce standardním způsobem. Po několika týdnech byly odebrány vytvořené břišní tekutiny a protilátky byly separovány a čištěny standardními způsoby. Konkrétně byly protilátky purifikovány ze získaných břišních tekutin plastovou kolonou Polos Protein A (Perceptive Biosystems lne.) a dialyzovány s PBS (Dulbecco lne.) a pásy byly potvrzeny pomocí analýzy SDS-PAGE. Jak je znázorněno na Obr. 14, elektroforéza používající autentický vzorek myšího IgG (Cappel lne.) jako kontroly potvrdila pásy pro IgG u klonů 7D2-E3 a 11C8 ve stejných polohách jako vykazoval autentický vzorek myšího IgG, a to jak za neredukujících, tak i za redukujících podmínek.To purify antibodies produced by hybridomas, the cell lines of those IgG producing clones of the hybridoma lines 7D2-E3 and 11C8 were intraperitoneally injected BALB / c / AnNCrj mice that were delivered to the landing (male, supplied by Charles River, Japan) following standard procedures. After a few weeks, the formed abdominal fluids were collected and antibodies were separated and purified by standard methods. Specifically, the antibodies were purified from the obtained abdominal fluids by a plastic column of Polos Protein A (Perceptive Biosystems Inc) and dialyzed with PBS (Dulbecco Inc) and the bands were confirmed by SDS-PAGE analysis. As shown in FIG. 14, electrophoresis using an authentic mouse IgG sample (Cappel Inc) as controls confirmed the IgG bands of clones 7D2-E3 and 11C8 at the same positions as the authentic mouse IgG sample, both under non-reducing and reducing conditions.
V tomto příkladu byly L1210 buňky exprimující lidský protein • 9In this example, L1210 cells were expressing human protein • 9
-27• 99 9 *9 9 9 9 9 9 9 9 · » 9 9 9 9 ·»9· • 9 9 9 * «99 99 9-27 • 99 9 * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 9
99 9999 999999,999,999
9999 99 99 99 99 99 asociovaný s integrinem (IAP) použity jako senzibilizační antigen pro ilustrativní účely, ale je také možno připravovat monoklonální protilátky stejným způsobem používajíce jiné buňky exprimující lidský IAP nebo lidský IAP samotný a připravovat monoklonální protilátky z knihovny protilátek použitím způsobu vystavení na fágu; předložený vynález není omezen na výše uvedené monoklonální protilátky, ale zahrnuje všechny monoklonální protilátky, které mají podobné vlastnosti a všechny hybridomy, které vytvářejí tyto monoklonální protilátky.9999 99 99 99 99 99 integrin-associated (IAP) used as a sensitizing antigen for illustrative purposes, but it is also possible to prepare monoclonal antibodies in the same way using other cells expressing human IAP or human IAP alone and to prepare monoclonal antibodies from the antibody library using phage; the present invention is not limited to the aforementioned monoclonal antibodies, but encompasses all monoclonal antibodies having similar properties and all hybridomas that produce these monoclonal antibodies.
Kromě toho předložený vynález uvedených monoklonálních protilátek také zahrnuje humanizované protilátky, lidské protilátky, chimérické protilátky, protilátky s jediným řetězcem, primatizované protilátky a fragmenty protilátek, získané natrávením protilátek různými enzymy (papain, pepsin, ficin a podobně).In addition, the present invention of said monoclonal antibodies also includes humanized antibodies, human antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, primatized antibodies and antibody fragments obtained by digesting the antibodies with various enzymes (papain, pepsin, ficin and the like).
Hybridomy podle předloženého vynálezu produkující monoklonální protilátky proti lidskému proteinu asociovaného s integrinem (IAP) jsou nové fúzované buňky vytvořené z DBA myších slezinných buněk a myší myelomové buněčné linie P3-U1 jako rodičovské buňky; protilátky proti IAP (myší hybridom 11C8-F8 (subklon 11C8), označené jako MABL-1) byly uloženy jako FERM BP-6100 a protilátky proti IAP (myší hybridom 7D2E3 (subklon 7D2), označené jako MABL-2) byly uloženy jako FERM BP-6101 dne 1. září 1997 v Národním institutu pro biologické vědy a humánní technologie, Úřad pro průmyslovou vědu a technologii, Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu na adrese 1-3 Migashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, který pracuje jako veřejný depozitářThe hybridomas of the present invention producing monoclonal antibodies against human integrin-associated protein (IAP) are new fused cells generated from DBA mouse spleen cells and mouse myeloma cell line P3-U1 as parent cells; anti-IAP antibodies (mouse hybridoma 11C8-F8 (subclone 11C8), designated MABL-1) were deposited as FERM BP-6100 and antibodies against IAP (mouse hybridoma 7D2E3 (subclone 7D2), designated MABL-2) were deposited as FERM BP-6101 on September 1, 1997 at the National Institute of Life Sciences and Human Technology, Office of Industrial Science and Technology, Ministry of Foreign Trade and Industry at 1-3 Migashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, who works as a public depository
-28·· ·# • ♦ 9 · · « 9 9 9 9-28 ·· · # 9 9 · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 • ···♦ ·*···· • ·· ···· 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 99 99 99 mikroorganismů.9999 99 99 99 99 99 microorganisms.
Příklad 2 (Identifikace podtříd MABL-1 a MABL-2 protilátek)Example 2 (Identification of MABL-1 and MABL-2 antibody subclasses)
Pro identifikaci podtříd MABL-1 a MABL-2 protilátek získaných způsobem, který byl uveden výše, bylo 500 μΐ každých ze vzorků MABL-1 a MABL-2 upravených na 100 ng/ml umístěno na Isotyping Kit (Stratagene), a tím byla protilátka MABL-1 určena jako IgGl, κ a MABL-2 byla určena jako IgG2a, κ.To identify the subclasses of MABL-1 and MABL-2 antibodies obtained as described above, 500 μΐ of each of the 100 ng / ml MABL-1 and MABL-2 samples were placed on the Isotyping Kit (Stratagene) and thereby the antibody MABL-1 determined as IgG1, κ and MABL-2 determined as IgG2a, κ.
Příklad 3 (Lidské leukemické buňky exprimující lidský IAP)Example 3 (Human leukemia cells expressing human IAP)
Exprese IAP v různých lidských leukemických buněčných liniích byla detekována průtokovou cytometrií s protilátkami proti CD47, rozpoznávajícími lidský IAP (komerčně dostupný produkt). Tato protilátka byla použita pro detekci, protože se předpokládá, že lidský IAP je identický s CD47 (Biochem. J., 304, 525-530, 1994). Použité buněčné linie bylyExpression of IAPs in various human leukemic cell lines was detected by flow cytometry with anti-CD47 antibodies recognizing human IAP (a commercially available product). This antibody was used for detection because human IAP is believed to be identical to CD47 (Biochem. J., 304, 525-530, 1994). The cell lines used were
Jurkatovy buňky a HL-60 buňky (K562 buňky, ARH77 buňky, Ráji buňky a CMK buňky). Buňky byly použity v koncentraci 2 x 105 buněk na vzorek, protilátka proti CD47 byla inkubována s buňkami v konečné koncentraci 5 μg/ml a použitá sekundární protilátka byla protilátka proti myšímu IgG označená pomocí FITC (Becton Dickinson and Company). Myší IgGl protilátka (Zymed Laboratories lne.) byla použita jako kontrola. Výsledky průtokové cytometrie, které jsou uvedeny na Obr. 15 (HL-60) a Obr. 16 (Jurkat) potvrdily, že obě buněčné linie exprimovaly IAP.Jurkat cells and HL-60 cells (K562 cells, ARH77 cells, Paradise cells and CMK cells). Cells were used at a concentration of 2 x 10 5 cells per sample, anti-CD47 antibody was incubated with cells at a final concentration of 5 µg / ml, and the secondary antibody used was FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Becton Dickinson and Company). Mouse IgG1 antibody (Zymed Laboratories Inc) was used as a control. The flow cytometry results shown in FIG. 15 (HL-60) and FIG. 16 (Jurkat) confirmed that both cell lines expressed IAP.
·» *««· • ·* ·· »« • •
9 9 « • · · 99 9
9 9 99 9 9
9 9 99 9 9
9999
Příklad 4 (Apoptotický účinek in vitro) (1) Účinek indukce apoptózy protilátek MABL-1 ' a MABL-2 na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP, Jurkatovy buňky a HL-60 buňky byl zkoumán použitím Annexinu-V (Boehringer Mannheim). Výsledky analýzy používající AnnexinV jsou znázorněny na Obr. 17-22, kde skvrny v levé dolní oblasti znázorňují živé buňky, skvrny v pravé dolní oblasti znázorňují apoptotické buňky a skvrny v pravé horní oblasti znázorňují nekrotické buňky. Použité protilátky byly myší IgG (Zymed Laboratories lne.) jako kontrola a MABL-1 a MABL2 v koncentraci 10 pg/ml, a poté, co bylo 4 x 103 buněk L1210 transfektováno genem lidského IAP, byly inkubovány po dobu 72 hodin a 6 x 104 Jurkatových buněk bylo inkubováno po dobu 48 hodin, byly buňky analyzovány užívajíce Annexin-V. Byla pozorována smrt buněk, jak je znázorněno na Obr. 17-22. V případě buněk HL-60 bylo použito 10 pg/ml MABL-1 a analýza využívající Annexin-V s 1 x 105 buňkami také prokázala buněčnou smrt.Example 4 (In vitro apoptotic effect) (1) The effect of inducing apoptosis of MABL-1 'and MABL-2 on L1210 cells transfected with the human IAP gene, Jurkat cell and HL-60 cell was examined using Annexin-V (Boehringer Mannheim). The results of the analysis using AnnexinV are shown in FIG. 17-22, where spots in the lower left region represent living cells, spots in the lower right region represent apoptotic cells, and spots in the upper right region represent necrotic cells. The antibodies used were mouse IgG (Zymed Laboratories Inc) as a control and MABL-1 and MABL2 at a concentration of 10 µg / ml, and after 4 x 10 3 L1210 cells were transfected with the human IAP gene, they were incubated for 72 hours and 6 hours. x 10 4 Jurkat cells were incubated for 48 hours, cells were analyzed using Annexin-V. Cell death was observed as shown in FIG. 17-22. For HL-60 cells, 10 µg / ml MABL-1 was used, and Annexin-V analysis with 1 x 10 5 cells also showed cell death.
(2) Byl zkoumán účinek indukce apoptózy Fab fragmentů protilátky MABL-2 na L1210 buňky transfektované genem lidského IAP. Konkrétně byly L1210 buňky transfektované genem lidského IAP kultivovány v koncentraci 4 x 103 buňky a byly použity Fab fragmenty protilátky MABL-2 a myší IgG jako kontrola a to v koncentraci 10 ng/ml. Buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin a měřeny Annexinem-V. Jako výsledek byl pozorován značný rozsah buněčné smrti (Obr. 23, 24). Fab fragmenty protilátky MABL-2 použité pro experiment byly získány natrávením protilátky papainem (Pierce Laboratories, lne.) a jejich purifikací. Fab fragmenty protilátky MABL-2(2) The effect of inducing apoptosis of Fab fragments of the MABL-2 antibody on L1210 cells transfected with the human IAP gene was examined. Specifically, L1210 cells transfected with the human IAP gene were cultured at 4 x 10 3 cells and Fab fragments of MABL-2 antibody and mouse IgG were used as a control at a concentration of 10 ng / ml. Cells were incubated for 72 hours and measured with Annexin-V. As a result, a considerable extent of cell death was observed (Fig. 23, 24). Fab fragments of the MABL-2 antibody used for the experiment were obtained by digesting the antibody with papain (Pierce Laboratories, Inc) and purifying them. Fab fragments of the MABL-2 antibody
-30«· Φ · · · 9 9 9 9-30 · · Φ · · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 99 99 99 byly analyzovány pomocí SDS elektroforézy (Obr. 25).9999 99 99 99 99 99 were analyzed by SDS electrophoresis (Fig. 25).
Příklad 5 (Studium apoptózy in vivo) (1) Látková účinnost MABL-1 a MABL-2 (úplný IgG)Example 5 (In vivo apoptosis study) (1) Matter efficacy of MABL-1 and MABL-2 (total IgG)
KPMM2 buňky exprimující lidský IAP (lidská myelomová buněčná linie) byly transplantovány SCID myši a v den 10 po transplantaci byly podány MABL-1 a MABL-2 (úplný IgG) jedinou intravenózní injekcí v dávkách 5 μg na jednu myš respektive 50 μg na jednu myš (n=5) ; v den 28 po transplantaci KPMM2 byly úrovně lidského IgG odvozeného od KPMM2 měřeny testem ELISA a bylo potvrzeno zmizení. Byla také studována doba přežívání. Výsledky ukázaly výrazné potlačení úrovní lidského IgG v krvi u skupiny ošetřené pomocí MABL-1 a MABL-2, což representovalo protinádorový účinek (Obr. 30) . Bylo také prokázáno, že se doba přežívání také významným způsobem prodloužila (Obr. 26).KPMM2 cells expressing human IAP (human myeloma cell line) were transplanted into SCID mice and MABL-1 and MABL-2 (complete IgG) were administered on day 10 post-transplant by a single intravenous injection at doses of 5 µg per mouse and 50 µg per mouse respectively. (n = 5); at day 28 after KPMM2 transplantation, KPMM2-derived human IgG levels were measured by ELISA and confirmed disappearance. Survival time was also studied. The results showed significant suppression of human IgG levels in the blood in the MABL-1 and MABL-2 treated groups, which represented an anti-tumor effect (Fig. 30). It was also shown that the survival time was also significantly prolonged (Fig. 26).
(2) Látková účinnost MABL-1 a MABL-2 (F(ab')2)(2) Substance efficacy of MABL-1 and MABL-2 (F (ab ') 2 )
F(ab')2 fragmenty, připravené natrávením protilátek MABL-1 a MABL-2 pepsinem a purifikace pomocí Proteinu A (Pierce Laboratories, lne.) byly použity pro studium protinádorového účinku bez cytotoxického účinku způsobovaného oblastmi Fc. Konkrétně byly buňky RPMM2 exprimující lidský IAP (lidská myelomová buněčná linie) transplantovány do SCID myši a F(ab’)2 fragmenty protilátek MABL-1 a MABL-2 byly intravenózně podávány skupinám v dávkách 100 μg na jednu myš v den 6 a den 10 po transplantaci a skupinám v dávkách 10 a 30 μg na jednu myš v den 6, 8 a 10 po transplantaci; úrovně lidského IgG odvozené od KPMM2 byly měřeny metodou ELISA v •9 9 99 9F (ab ') 2 fragments, prepared by digesting the MABL-1 and MABL-2 antibodies with pepsin, and Protein A purification (Pierce Laboratories, Inc) were used to study the anti-tumor effect without cytotoxic effect caused by Fc regions. Specifically, RPMM2 cells expressing human IAP (human myeloma cell line) were transplanted into SCID mice and F (ab ') 2 antibody fragments MABL-1 and MABL-2 were intravenously administered to groups of 100 µg per mouse on day 6 and day 10 after transplantation and the 10 and 30 µg groups per mouse on days 6, 8 and 10 after transplantation; KPMM2-derived human IgG levels were measured by ELISA at 9 9 99 9
9 9 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9
Ol 9 99 9999 9 999Ol 9 99 9999 9 999
ΌΙ*“ 9999 99 99 99 99 99 den 30 po transplantaci (Obr. 27) . Byla také zkoumána doba přežívání až do 90 dní po transplantaci. Jako výsledek bylo zjištěno výrazné potlačení úrovní lidského IgG v krvi u skupin ošetřených protilátkami MABL-1 a MABL-2, což přestavovalo protinádorový účinek. Doba přežívání se také výrazně prodloužila (Obr. 28). Obr. 29 znázorňuje vzor vytvořený SDS elektroforézou pro F(ab')2 fragmenty protilátky MABL-1 a protilátky MABL-2.999 * “9999 99 99 99 99 99 day 30 after transplantation (Fig. 27). Survival time of up to 90 days after transplantation was also examined. As a result, significant suppression of human IgG levels in the blood was found in the MABL-1 and MABL-2 treated groups, which represented an anti-tumor effect. Survival time also increased significantly (Fig. 28). Giant. 29 shows a pattern generated by SDS electrophoresis for F (ab ') 2 fragments of MABL-1 and MABL-2.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu jsou protilátky, které specificky rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem a antigeny, které indukují apoptózu krevních buněk s jádrem, které mají lidský protein asociovaný s integrinem. V souladu s tím jsou tyto protilátky použitelné jako protilátky, které rozpoznávají lidský protein asociovaný s integrinem pro jeho odlišení a identifikaci a přitom mají také účinek indukce apoptózy krevních buněk s jádrem; tyto vlastnosti mohou být použity pro přípravu terapeutických činidel v oblasti léčby myeloidní leukemie a lymfoidní leukemie.The monoclonal antibodies of the present invention are antibodies that specifically recognize human integrin-associated protein and antigens that induce apoptosis of nucleus blood cells having a human integrin-associated protein. Accordingly, these antibodies are useful as antibodies that recognize a human integrin-associated protein for its differentiation and identification, while also having the effect of inducing apoptosis of the nucleus of blood cells; these properties can be used to prepare therapeutic agents in the field of treating myeloid leukemia and lymphoid leukemia.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000907A CZ2000907A3 (en) | 1998-09-11 | 1998-09-11 | Monoclonal antibody inducing apoptosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000907A CZ2000907A3 (en) | 1998-09-11 | 1998-09-11 | Monoclonal antibody inducing apoptosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000907A3 true CZ2000907A3 (en) | 2000-08-16 |
Family
ID=5469923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000907A CZ2000907A3 (en) | 1998-09-11 | 1998-09-11 | Monoclonal antibody inducing apoptosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2000907A3 (en) |
-
1998
- 1998-09-11 CZ CZ2000907A patent/CZ2000907A3/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2212413C2 (en) | Monoclonal antibody prepared using integrin-associated protein, its fragment fab, fab' or f(ab')2, hybridoma producing monoclonal antibody (variant), antileukemic agent | |
| US7531643B2 (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| US20250051451A1 (en) | Anti-b7-h3 monoclonal antibody and use thereof in cell therapy | |
| RU2177805C2 (en) | Agent used in treatment of lymphatic tissue tumors | |
| KR100919915B1 (en) | Modulation of nkg2d | |
| AU2007312437C1 (en) | Method for generating active antibodies against a resistance antigen, antibodies obtained by said method and their uses | |
| PL181783B1 (en) | Method for the production of monoclonal antibodies having the property of causing apoptosis PL PL PL PL PL PL PL | |
| JP2023546743A (en) | Anti-CD73 antibody and its use | |
| TWI449710B (en) | A monoclonal antibody having an immunosuppressive activity or an antigen-binding fragment thereof | |
| EP1801208A1 (en) | Anti-a33 antibody | |
| CN115873111B (en) | CLDN18.2 antibody and application thereof | |
| KR101783907B1 (en) | composition for preventing or treating lung cancer comprising antibody against CD66c and chemical drug | |
| AU718463B2 (en) | Inhibitor of lymphocyte activation | |
| CN1326565C (en) | Enhancer of Lymphocytic Tumor Antibodies | |
| JP3568398B2 (en) | Monoclonal antibodies that induce apoptosis | |
| CZ2000907A3 (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| HK1030785A (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| RU2803460C2 (en) | Humanized antibody against pd-1 and its use | |
| CZ290424B6 (en) | Monoclonal antibody and hybridoma producing thereof | |
| CN117567612A (en) | A kind of CLDN18.2 antibody and its application | |
| CN117567617A (en) | CLDN18.2 antibody and application thereof | |
| HK1030954A (en) | Monoclonal antibody inducing apoptosis | |
| HK1108916A (en) | Anti-a33 antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |