CZ20011794A3 - Antagonistické analogy GH-RH, inhibující IGF-I a II - Google Patents

Antagonistické analogy GH-RH, inhibující IGF-I a II Download PDF

Info

Publication number
CZ20011794A3
CZ20011794A3 CZ20011794A CZ20011794A CZ20011794A3 CZ 20011794 A3 CZ20011794 A3 CZ 20011794A3 CZ 20011794 A CZ20011794 A CZ 20011794A CZ 20011794 A CZ20011794 A CZ 20011794A CZ 20011794 A3 CZ20011794 A3 CZ 20011794A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
arg
peptide
nle
abu
har
Prior art date
Application number
CZ20011794A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew V. Schally
Jozsef Varga
Marta Zarandi
Original Assignee
The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Administrators Of The Tulane Educational Fund filed Critical The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Publication of CZ20011794A3 publication Critical patent/CZ20011794A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A61P5/04—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin for decreasing, blocking or antagonising the activity of the hypothalamic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vynález se týká nových syntetických peptidů, které inhibují uvolňování růstového hormonu z hypofýzy u savců a terapeutických prostředků, obsahujících tyto nové peptidy.
Dosavadní stav techniky
Růstový hormon (GH”) je peptid, který má 191 aminokyselin, a který stimuluje produkci řady různých růstových faktorů, například insulinu podobný růstový faktor I (IGF-I) a tak promotuje růst řady tkání (skelet, připojené tkáně, svaly a vnitřnosti) a fyziologické aktivity (zvýšeni syntézy nukleové kyseliny a proteinu a lipolýzy, ale snížení sekrece močoviny).
Uvolňování GH je kontrolováno uvolňováním inhibičňích faktorů, které jsou vylučovány v hypotalamu. Primárním uvolňovacím faktorem je uvolňovací hormon růstového hormonu (GH-RH); human growth hormone-releasing hormone” neboli lidská forma zmíněného hormonu (hGH-RH”), je peptid, který má 44 aminokyselin. Nové peptidy podle vynálezu se týkají analogů tohoto hGH-RH, které mají pouze zbytky 1 až 29 (hGHRH (1—29)NH2”), t.j., analogů peptidu, který má aminokyselinovou sekvenci:
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile5-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10Arg-Lys-Val-Leu-Gly15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-Met-Ser-Arg29-NH2
GH má souvislost s několika chorobami. Jednou z nemocí, při které se uplatňuje GH, je akromegalie, při které jsou přítomny nadměrné hladiny GH. Tato abnormalita má za následek prodloužený obličej a extremní délku dlouhých kosti, a dá se léčit podáváním antagonistů GH-RH.
Další choroby související s GH jsou diabetická retinopatie a diabetická nefropatie.
Lze předpokládat, že poškození sítnice a ledvin, ke kterému u těchto chorob dochází, a které vede k slepotě a snížené funkci ledvin, způsobuje růstový hormon (GH). Toto poškození se dá zpomalit nebo se mu dá předejít podáváním účinného množství GH-RH antagonisty.
Nicméně, hlavní aplikace antagonistů GH-RH se týkají oblasti rakoviny (A.V. Schally et al, v publikaci Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practice, eds. Bercu, B.B. & Walker, R:F., Dekker, New York, pp. 145-162, 1998). IGF-I a -II jsou potenciální mitogeny pro různé typy rakoviny. Potlačením sekrece GH snižují antagonisté GH-RH syntézu IGF-I v játrech a v jiných tkáních. GH-RH antagonisté také redukují autokrinní a parakrinní produkci IGF-1 a/nebo IGF-II různými nádory. U různých experimentálních rakovin má léčení antagonisty GH-RH za následek redukci IGF-I a -II, doprovázející inhibici růstu nádoru.
Při pokusech o zásah do průběhu těchto a jiných chorob někteří vědci již zkoušeli ovlivnit hladiny GH použitím somatostatinu, jednoho z inhibitorů uvolňování GH. Nicméně, somatostatin, pokud je podáván samotný, nesnižuje hladiny GH ani IGF-I do požadovaného stupně. Pokud je podáván v kombinaci s antagonistou GH-RH, může somatostatin hladiny IGF-I snižovat mnohem více.
• ··
Aby objasnili vztah mezi strukturou GH-RH a jeho aktivitou, nalezli vědci různé modifikace GH-RH, které poskytly syntetická kongenerika se zlepšenými agonistickými nebo antagonistickými vlastnostmi. Z uvedených důvodů bylo již dříve potvrzeno, že fragment GH-RH obsahující zbytky 1 až 29, nebo GH-RH(l-29), představuje minimum sekvencí potřebné pro dosažení biologické aktivity. Tento fragment si podržuje 50 % nebo více účinnosti nativního GH-RH.
Prvním popsaným antagonistou GH-RH byl peptid o složení [Ac-Tyr1, D-Arg2]hGH-RH (1-29) NH2,· který se obecně v literatuře nazývá standardní antagonista. U této látky byla zjištěna schopnost zabránit aktivaci adenylátcyklázy hypofýzy krys působením hGH-RH(1-29)NH2. Stejný peptid blokoval působení GH-RH na jeho receptory v hypofýze a hypotalamu a inhiboval kolísavou sekreci růstového hormonu.
Značné množství patentů a výrobků ve zveřejněné literatuře popisuje analogy GH-RH, které buď působí jako agonisté GH-RH (t.j. působí tak, že stimuluje uvolňování GH) nebo jako antagonisté GH-RH (t.j. působí tak, že inhibuje GH). Většina těchto peptidů je odvozena od peptidové sekvence GH-RH(l-29), se specifickými strukturními modifikacemi, se kterými se počítá jako s látkami, které mají zvýšené agonistické nebo antagonistické vlastnosti.
Tak US patent 4 659 693 popisuje GH-RH antagonistické analogy, které obsahují určité N, N'-dialkyl-omega-guanidino alfa-amino acylové zbytky v poloze 2 sekvence GH-RH(1-29).
Zveřejněná mezinárodní přihláška WO 91/16923 uvádí přehled předchozích pokusů obměnit strukturu hGH-RH modifikaci zahrnovaly:
D-ísomery;
aminokyse1i nové náhradu Tyr1, nahrazení Asn8 sekvenci.
Ala2,
Tyto předchozí Asp3 nebo Asn8 pokusy jejich
Gin nebo
D-Lys; nahrazení
L- nebo
Ser®
D-ser, D-Arg,
Asn, Thr, amfifilní charakter
Pokud u analogů regionu
R2 je a nahrazení
D-Arg, a
Ala s cílem
Gly15 Ala
R8, R9, a podpořit nebo Aib.
R15 jsou je uvedeno shora, výsledkem antagonistická že jsou vhodné k je podle tvrzení aktivita. 0 substituovány, jak citované publikace těchto antagonistických peptidech se uvádí, podávání jako farmaceutické prostředky k léčení stavů, spojených s nadměrnými hladinami GH, například akromegalie.
Antagonistické účinky analogu hGH-RH [Ser9-i|j (CH2-NH) Tyr10]hGH-RH(l-29) ’’ jsou podle US patentu 5 084 555 důsledkem pseudopeptidové vazby (t.j. peptidové vazby redukované na spojení (CH2-NH) ) mezi zbytky R9 a R10. Nicméně antagonistické vlastnosti [Ser9~ú (CH2-NH) -Tyr10] hGH-RH (1-29) ve srovnání se standardním antagonístou [N-Ac-Tyr1, D-Arg2 ]gh-rh (1-29)-nh2, podle uváděných údajů horší.
UŠ patent 5 550 212, a UŠ patentová přihláška 08/642,472, která náleží témuž přihlašovateli jako tento dokument, popisují analogy hGH-RH (1-29) NH2, které mají zvýšené antagonistické vlastnosti a prodlouženou dobu působení. Tyto vlastnosti jsou pravděpodobně výsledkem záměny určitých aminokyselin a acylace aromatických nebo nepolárních kyselin na N-zakončení GH-RH(1-29)NH2 Je třeba poznamenat, že ve shora uvedeném US patentu a ve shora uvedené US patentové přihlášce je R9 vždy Ser, R16 je Gin nebo aminokyselina tvořící laktamový můstek (t.j. Glu), R28 jě ser, Asn, Asp, Ala nebo Abu, a R29 je Agm, Arg-NH2, Arg-OH, Cit-NH2, Cit-OH, HarNH2, Har-OH nebo aminokyselina tvořící laktamový můstek (t.j. Lys nebo Orn).
Podstata vynálezu
Byl vynalezen nový soubor syntetických analogů hGH-RH(1-29)NH2. Tyto analogy inhibují aktivitu endogenního hGH-RH, a proto zabraňují uvolňování růstového hormonu. Silnější inhibiční účinky těchto nových analogů ve srovnání s dříve popsanými je výsledkem záměny určitých aminokyselin.
Konkrétně jsou podstatou vynálezu peptidy vzorců:
X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R13-R16-Leu-R19R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R18-R29-NH2 kde:
X je PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- nebo 2-Npr, nebo Fpr,
R1 je Tyr nebo His,
R2 je D-Arg nebo D-Cit,
R5 je lle nebo Val,
R6 je Phe, Nal nebo Phe(Y), ve kterém Y =F, Cl, Br,
R8 je Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr,
Abu, D-Abu, nebo Aib,
R9 je Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit,
Nle, Tyr (Me), Ser, Ala nebo Aib,
R10 OCH3; je Tyr nebo Phe(Y), ve kterém Y =H, F, Cl, Br, nebo
R12 je Lys, D-Lys, nebo Orn,
R13 je Val nebo Nle,
R14 je Leu nebo Nle,
R15 je Gly, Ala, Abu, Nle nebo Gin,
r16 je Gin nebo Arg,
R18 je Ser nebo Nle,
R19 je Ala nebo Abu,
R21 je Lys nebo Orn,
R22 je Leu, Ala nebo Aib,
R27 je Met. Leu, Nle, Abu, nebo D-Arg,
r28 je Arg, D-Arg, Ser, Asn, Asp, Ala nebo Abu,
r29 je Arg, D-Arg, Har nebo D-Har,
a jejich farmaceuticky přijatelné soli.
Mezi výhodná provedení patří peptidy, ve kterých X je PhAc, IndAc nebo Nac, R1 je Tyr nebo His, R2 je D-Arg, R5 je lle, R6 je Phe(pCl), R8 je Asn nebo Abu. R9 je Arg nebo Har,
Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, nebo Tyr (Me), R10 je Tyr nebo Tyr(Me), R12 je Lys, R13 je Val nebo Nle, R14 je Leu nebo Nle, R15 je Abu, Ala, nebo Nle, R16 je Gin nebo Arg, R18 je Ser nebo Nle, R19 je Ala nebo Abu, R21 je Lys, R27 je Nle nebo D-Arg, R28 je D-Arg, Arg, nebo Ser, R29 je D-Arg, Har nebo D-Har.
Je třeba poznamenat, že aminokyselinové zbytky od 30 do 44 v nativní molekule GH-RH nejsou pro účinek rozhodující, ani není jejich přítomnost kritická. Proto se ukazuje, že přidání některých nebo všech těchto dalších aminokyselinových zbytků k C-zakončení hGH-RH(1-29)-NH2 analogů podle vynálezu není příčinou zvýšení účinku těchto analogů jako GH-RH antagonistů. Pokud jsou některé z těchto aminokyselin, nebo všechny, navázány na C-zakončení hGH-RH(1-29)-NH2 analogů, mohou to být aminokyselinové zbytky stejné, jako jsou zbytky 30 až 44 v nativní hGH-RH sekvenci nebo odpovídající ekvivalenty.
Syntetické metody.
Syntetické peptidy se připraví vhodnou metodou, jako jsou exklusivní techniky pro syntézu v pevné fázi, techniky pro syntézu v parciálně v pevné fázi, metodou kondenzace fragmentů klasickou syntézou v kapalné fázi.
Pokud se syntetizují analogy podle vynálezu metodou v pevné fázi, zbytek na C-zakončeni (zde R29) se vhodně napojuje (ukotví) na inertní pevný podklad (pryskyřici) zatímco chránící skupiny jsou navázány na jeho alfa amino skupinu (a, pokud je to žádoucí, na jeho funkční skupinu postranního řetězce). Po ukončení tohoto kroku se alfa amino chránící skupina ze zakotveného aminokyselinového zbytku odstraní a přidá se další aminokyselinový zbytek - R28, který má alfa aminoskupinu (stejně jako funkční skupinu postranního řetězce) vhodně chráněnou, a tak se postupuje dále. Chránící skupiny N-zakončení se odstraňují vždy po přidání dalšího zbytku, ale chránící skupiny postranních řetězců se zatím neodstraňuji. Po navázání všech požadovaných aminokyselin v požadovaném pořadí se peptid. odštěpí z podkladu a odštěpí se od peptidu všechny chránící skupiny postranních řetězců za podmínek, které jsou minimálně destruktivní vůči členům sekvence. Pak následuje opatrné přečištění a pečlivé potvrzení syntetického produktu, aby byla potvrzena struktura získané ho produktu a její shodnost se strukturou požadovanou.
V průběhu kopulacního kroku je zejména výhodné chránit alfa aminoskupiny aminokyselin pomocí chránící skupiny, citlivé na kyseliny nebo na zásady. Takové chránící skupiny by měly mít vlastnosti, které zajišťují stabilitu v podmínkách, kdy se tvoří peptidová vazba, ale jsou snadno odstranitelné bez destrukce rostoucího peptidového řetězce a bez racemizace žádného z chirálních center, v jeho struktuře obsažených. Vhodnými chránící skupiny alfa aminoskupin jsou Boc a Fmoc.
Použití látek podle vynálezu k léčení
Peptidy, antagonistické k hGH-RH nebo soli těchto peptidů, se dají formulovat do farmaceutických dávkových forem, obsahujících účinná množství látky podle vynálezu a podávat lidem nebo zvířatům pro terapeutické nebo diagnostické účely. Peptidy se mohou použít ke snížení hladin GH a k léčení stavů spojených s přebytkem GH, • ···· ··· ·♦ například diabetické retinopatie, nefropatie a akromegalie. Jsou také vyřešeny způsoby léčení těchto chorob podáváním přípravku podle vynálezu jedincům, kteří takové léčení potřebují. Hlavní použití antagonistů GH-RH jsou nicméně, na poli rakoviny, například u lidí rakoviny prsu, plic, tlustého střeva, mozku, pankreatu a prostaty, kde jsou přítomny receptory pro IGF-I nebo IGF-II.
Stručný popis obrázků na přiložených výkresech
Obrázek I je graf změn objemu nádorů MXT rakoviny struku myši v průběhu léčení určitými GH-RH antagonisty v závislosti na době léčení ve dnech.
Obrázek II je graf změn objemu nádorů MDA-MB-468 lidské rakoviny prsu u plemene holých myší v průběhu léčení určitými antagonisty GH-RH v závislosti na době léčení ve dnech.
Obrázek III je graf změn objemu HT-29 lidských rakovinných nádorů tlustého střeva u holých myší během léčení určitými GH-RH antagonisty v závislosti na dnech léčení.
Obrázek IV je graf závislosti objemu U87MG lidských glioblastomů u holých myší během léčení GH-RH antagonistou na dnech léčení.
Obrázek V je graf změn objemu nádorů rakoviny PC-3 lidské prostaty na holých myších během léčení určitými GH-RH antagonisty v závislosti na dnech léčení.
Podrobný popis výhodného provedení A.
Zkratky
Pro definici peptidu je použito názvosloví IUPAC-IUB (Commissioner on Biochemical Nomenclature), přičemž, v souladu se zavedenou praxí, aminoskupina na N-zakončení se zobrazuje vlevo a karboxylová skupina na C-zakončení se zobrazuje napravo. Termín přírodní aminokyselina, jak je zde používán, znamená jednu z obecných, v přírodě se vyskytujících L-aminokyselin, které se vyskytují v přírodních proteinech. Tedy se jedná zejména o následující aminokyseliny: Gly, Ala, Val, Leu, lle, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Pokud má zbytek přírodní aminokyselin isomerní formy, je to L-forma aminokyseliny, pokud není uvedeno jinak.
Mezi GH-RH antagonisty patří také nekódované aminokyseliny nebo aminokyselinové analogy.
(Nekódované nebo ne-kódované aminokyseliny jsou ty aminokyseliny, které se nevyskytují mezi 20 přírodními aminokyselinami, nalézajícími se v přírodních peptidech) Mezi nekódované aminokyseliny nebo analogy aminokyselin, které mohou být použity jako hGH-RH antagonistické peptidy jsou následující: termínem Abu je míněna kyselina alfa aminomáselná, termínem Aib je míněna kyselina alfa aminoisomáselná, termínem Har je míněn homoarginin, termínem Nal je míněn 2-naftylalanin, termínem Nle” je míněn norleucin a termínem Orn je míněn ornitin. Pokud mají tyto nekódované aminokyseliny nebo analogy aminokyselin isomerní formy, jedná se při použití • ·♦·· · ·· ·· • 9 99 • · ·· • · · ·· • · ·· uvedených zkratek vždy o L-formu příslušné aminokyseliny, pokud není uvedeno jinak.
Použité zkratky mají tyto významy:
Abu a-aminomáselná acid
Ac
AcOH = kyselina octová
Ac2O
Aib = kyselina a-aminoisomáselná
Boc = terč, butyloxykarbonyl
Bom = benzyloxymethyl
2BrZ = 2-brombenzyloxykarbonyl cHx = cyklohexyl
Cit
2C1Z = citrulin (kyselina 2-amino-5-ureidovalerová) = 2-chlorbenzyloxykarbonyl
DCM = dichlormethan
DIC = N,Ν'-diisopropylkarbodiimid · ·· • · · ·· • 9 9· · ·♦ ·
DIEA = diisopropylethylamin
DMF = dimethylformamid
Fmoc = fluorenylmethyloxykarbonyl
Fpr = 3-fenylpropionyl
GH = růstový hormon
GH-RH = hormon uvolňující růstový hormon
Har = homoarginin
HBTU = 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát
hGH-RH = lidský GH-RH
HOBt = 1-hydroxybenzotriazol
HPLC = vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Ibu = isobutyryl
IndAc = indol-3-acetyl
MBHA = para-methylbenzhydrylamin
MeOH = methanol
MeCN = acetonitril
9 *· « • 9 9
• · 4 · • · · • 9 · 9 9
* · • · • *
• · · • · • • 9 ·
• 9 9 ♦
«<· · ♦ ·<· 9« ·· 9 99
Nac = 1-naftylacetyl
Nal = 2-naftylalanin
NMM = N-methylmorfolin
Npr = naftylpropionyl
PAM = fenylacetamidomethyl
Phe(pCl) = para-chlorfenylalanin
PhAc = fenylacetyl
rGH-RH = krysí GH-RH
RP-HPLC = HPLC na reverzní fázi
TFA = kyselina trifluoroctová
Tos = para-toluensulfonyl
Tyr(Me) = tyrosin methylether
Z = benzyloxykarbonyl
B. Analogy GH-RH
Analogy hGH-RH podle vynálezu byly navrženy tak, aby zvyšovaly afinitu peptidů k receptoru, měly lepší metabolickou stabilitu a maximalizovanou amfifilní sekundární strukturu molekuly. Mnohé z těchto analogů působí velmi efektivní a dlouho přetrvávající inhibici uvolňování GH stimulovaného hGH-RH(1-29)NH2 in vitro a in vivo.
Následující provedení jsou specificky výhodné, neboť mají dobrou biologickou účinnost:
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28
Har29] hGH-RH ( 1-29)NH2 = Peptid 1
[IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28
Har29] hGH-RH ( 1-29)NH2 = Peptid 2
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me) 10, Abu15, Nle27
D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 - Peptid 3
[PhAcO, D-Arg2 , Phe(pCl)6 , Har9 , Abu15, , Nle27, D-Arg28
Har29] hGH-RH ( 1-29)NH2, = Peptid 4,
[NAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28
Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 5 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27,
D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 6 [PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, DArg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 7 [NAc°, His1 D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Hare9]hGH-RH(1-29)NH2 = Peptid 8 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg29] hGH= Peptid 9
RH(1-29)NH2 • ·
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Arg16 , Nle27, D-Arg29] hGH-
RH(1- 29)NH2 = Peptid 10
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle27 , D-Arg 28, Har29)hGH-
RH(1- 29)NH2 = Peptid 11
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle9, Abu15, , Nle27, D-Arg29] hGH-
RH (1- 29)NH2 = Peptid 12
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl) 6, Nle 13, Nle14, Abu15, Nle27,
D-Arg 29)hGH- RH(1-29)NH2 = Peptid 13
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl )6, Nle15, Nle27, D-Arg29) hGH-
RH(1-29)NH2 = Peptid 14 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle18, Nle27, D-Arg29] hGHRH (1-29) NH2 = Peptid 15 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg29] hCH-RH (1-2 9) NH2 = Peptid 16 [ PhAc0, D-Arg2, Phe (pCl) 6, D-Arg29) hGH-RH (1-2 9) NH2 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6,
D-Arg29] hGH-RH (1-2 9) NH2 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6,
D-Arg29) hGH-RH (1-29) NH, [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Arg29] hGH-RH (1-2 9) NH2
Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, = Peptid 17
D-Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, = Peptid 18
Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27, Arg28, = Peptid 19
Tyr(Me)9, Abu15, D-Arg27, Arg28, = Peptid 20 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6,
D-Arg29] hGH-RH (1-29)NH2
Abu15, D-Arg27, Arg28, = Peptid 21 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, D-Arg27,
Arg28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 22 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Abu8, Tyr(Me)10, Abu15, DArg27, Arg28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 23
[PhAc0, Har2'9] hGH-RH i D-Arg2, ;i-29jNH2 Phe (pCl)6, Lys9, Abu15, Nle27, D-Arg28, = Peptid 24
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH i ;i-29)NH2 = Peptid 25
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH i [1-29)NH2 = Peptid 26
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH i [1-29) NH2 = Peptid 27
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Lys9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH i [1-29)NH2 = Peptid 28
[PhAc0, D-Arg2, Phe (pCl)6, D-Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH i (1-29)NH2 = Peptid 29
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH i (1-29)NH2 = Peptid 30
• 4 ·
Šest velmi výhodných provedení má vzorce:
PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9Tyr10-Arg11“Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20Lys21-Leu22-Leu23-GIn24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 = Peptid 1
IndAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu:l4-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg2C)Lys21-Leu22-Leu23-GIn24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Hare29-NH2 = Peptid 2
PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Har9Tyr (Me) :L0-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser8-Ala19-Arg20
Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27- D-Arg28-Har29-NH2 = Peptid 3
PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9Tyr (Me) 10-Argu-Lys12-Val13-Leu14-At>u15-Gln16-Leu17-Ser18-AlaL9Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-GIn24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 = Peptid 6
PhAc°-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-l\bu16-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20Lys21-Leu22-Leu23-GIn24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 = Peptid 7
Nac°-His1-D-Arq2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20Lys21-Leu22-Leu23-GIn24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 = Peptid 8 • · · ··· ·· · «·· · ·· · « · ««· • · ·····♦ • · * ······ · • · ······ ··· ···· ··· «4 ·· ···
Podle dobře zavedené konvence lze tyto peptidy zkráceně pojmenovat takto:
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 1 [IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 2 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27,
D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 3 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27,
D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29)NH2 = Peptid 6 [PhAc0, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, DArg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2 = Peptid 7 [Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 8
C. Způsoby přípravy
1. Přehled syntéz
Peptidy exkluzivní se syntetizují vhodnými metodami, techniky syntézy v pevné fázi, parciálně syntézu v pevné fázi, využíváj ící fragmentů nebo klasickou syntézou v roztoku, fázi jako jsou techniky kondenzací
Tak techniky exkluzivní syntézy v pevné v knihách Solid Phase Peptid Syntéza, Young, Pierce Chem. Company, Rockford,.
a M. Bodanszky, Principles of Peptid Syntéza, Springer j sou například uvedeny
J.M.
111,
Stewart a J.D.
1984 (2.
Verlag, 1984. Peptidy antagonistické hGH-RH se výhodně připraví s použitím syntézy v pevné fázi, tak, jak jsou tyto syntézy obecně popsány v publikaci Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85 p. 2149 (1963), nicméně lze použít i jiné ekvivalentní chemické syntézy známé v oboru, jak bylo již zmíněno.
Syntéza se provádí s aminokyselinami, které jsou chráněny na alfa aminoskupině. Výhodně se pro chránění aminoskupin používají chránící skupiny uretanového typu (Boc nebo Fmoc). Výhodná chránící skupina je Boc.
Při syntéze v pevné fázi se k podkladu, tvořenému polymerní pryskyřicí chemicky navazuje N-alfa-chráněná aminokyselinová skupina, která vytvoří na C-zakončení finálního peptidu aminoacylovou skupinu. Po ukončení kopulační reakce se skupina chránící alfa aminoskupinu selektivně odstraňuje a pokračuje se dalšími kopulačními reakcemi na aminozakončení, výhodně s použitím 50% TFA v DCM, když N-alfa-chránící skupina je Boc. Ostatní aminokyseliny s podobně Boc-chráněnými alfa aminoskupinami se postupně kopulují na volnou aminoskupinu předchozí aminokyseliny na pryskyřici, až se získá potřebná peptidová sekvence. Vzhledem k tomu, že aminokyselinové zbytky se kopulují na alfa aminoskupinu zbytku na C-zakončení, růst syntetického hGH-RH analogu peptidu začíná na C-zakončení a pokračuje směrem k Nzakončeni. Když se získá požadovaná sekvence, peptid se na Nzakončení acyluje a odštěpí se od polymerního podkladu.
Každá chráněná aminokyselina se používá v přebytku (2,5 nebo 3 ekvivalenty) a kopulační reakce se obvykle provádějí v DCM, DMF nebo v jejich směsích. Rozsah provedených kopulačních reakcí je ve všech stádiích monitorován **· ···· ·Φ· ·· ·· ··· ninhydrinovou reakcí. V těch případech, kdy se zjistí neúplná kopulace, provede se opakované nebo se před nakopulováním další aminokyseliny a před odstraněním chránící skupiny na alfa aminoskupině provede capping acetylací nezreagované aminoskupiny.
Typický syntézní cyklus je znázorněn v tabulce I:
Tabulka I
Protokol typického syntézního cyklu s Boc-strategií:
Krok________________Činidlo________________Doba mícháni (min)
1. Odstranění 50% TFA v DCM5+25 chrán. skupiny DCM lázeň1
2-propanolová lázeň1
2. Neutralizace 5% DIEA v DCM1
DCM lázeň1
MeOH lázeň1 % DIEA v DCM3
MeOH lázeň1
DCM lázeň (3 krát)1-1
3. Kopulace 3 ekviv. Boc-aminokyseliny v DCM nebo DMF + 3 ekviv. DIC nebo předem připravený
HOBt ester Boc-aminokyseliny 60
MeOH lázeň2
DCM lázeň2
4. Acetylace Ac20 v DCM (30%) 10 + 20 (pokud je nutná) MeOH lázeň (3 krát)2
DCM lázeň (3 krát)2
Po ukončení syntézy se může provést odštěpení peptidu od pryskyřice pomocí postupů, které jsou v chemii peptidů dobře známé.
Některé aminokyselinové zbytky peptidů mají postranní řetězce s funkčními skupinami, které jsou schopny reagovat s reakčními činidly, používanými při kopulaci nebo při odstraňování chránících skupin, pokud jsou takové skupiny na postranních řetězcích přítomny, navazují se na ně vhodné chránící skupiny, aby se zabránilo nežádoucím chemickým reakcím, syntéze takové projevujícím se peptidů. Při volbě reaktivní během reakcí, používaných při konkrétní chránící skupiny pro řetězcích platí skupina si výhodně podmínek kopulace být stabilní za následující obecná zachovává chránící skupiny na postranních pravidla: (a) vlastnosti a chránící není za štěpena, (b) chránící skupina by měla podmínek odstraňování chránící skupiny z alfa aminoskupiny při každém kroku syntézy, (c) chránící skupina na postranním řetězci musí být po ukončení syntézy požadované sekvence aminokyselin odstranitelná, a to za podmínek, které nebudou výsledný peptidový řetězec nežádoucím způsobem měnit.
Reaktivní funkční skupiny na postranním řetězci se výhodně chrání následovně: benzyl se používá pro chránění Thr a Ser; 2-brombenzyloxykarbonyl se používá pro chránění Tyr; p-toluensulfonyl nebo nitroskupina se používají pro chránění Arg a Har; 2-chlorbenzyloxykarbonyl nebo fluorenylmethyloxykarbonyl se používají pro chránění Lys, Orn; benzyloxymethyl se používá pro chránění His; a cyklohexyl nebo fluorenylmethyl se používají pro chránění Asp a Glu. Skupiny Asn a Gin na postranních řetězcích se ponechávají nechráněné.
3. Postupná kopulace zbytků aminokyselin na polymerní podklad hGH-RH antagonistické peptidy se dají v pevné fázi syntetizovat na různých podkladových polymerech, t.j. může jít o pryskyřice MBHA, Merrifield, PAM nebo Wang. Pokud
N-alfa-Boc-chráněné aminokyseliny
MBHA.
se k syntéze používají výhodnou pryskyřicí podkladové pevné C-zakončením.
fáze je od r
V tomto případě se odštěpením získají peptidy s amidováným
C-terminální
Nejprve se naváže neutralizovanou MBHA pryskyřici, a pak dalších aminokyselin. Každá chráněná kopuluje v asi a trojnásobném molárním volné aminoskupiny, rostoucího peptidu.
kterými disponuje
Kopulace se může aminokyselina na se provádí kopulace aminokyselina se přebytku, počítáno na pryskyřice k navázáni provádět v prostředí (1:1) nebo v DMF nebo v CH2CI2 samotných.
jako je DMF : CH2C12
Výběr vhodného kopulačního činidla je pro odborníka schůdný. Konkrétně jsou vhodná kopulační činidla N,N’-diisopropylkarbodiimid (DIC) nebo HBTU ve směsi Úspěšnost každé kopulační reakce v každém stupni se s monitoruje ninhydrinovou reakcí. V případě, kdy se neúplná kopulace, tak se buď kopulace opakuje, nebo se nezreagované aminoskupiny, navázané na pryskyřici, před odstraněním chránící skupiny na alfa aminoskupině acetylují působením AC2O/DCM.
v oboru jako je s HOBt.
výhodou zjisti
Finální acylace N-zakončení peptidu se stejným způsobem jako předešlá kopulace, s tím rozdílem, že se místo aminokyseliny použije vhodná karboxylová kyselina.
·· · ·· ·· ·
9 99 9 ·····
9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 99
99 9 99 99 9· 9 99
4. Odstranění peptidu z podkladového polymeru.
Když se syntéza ukončí, peptid se z podkladové fáze odštěpí. Odstranění peptidu z pryskyřice se provádí působením činidla jako je kapalný fluorovodík, který také odštěpuje všechny zbývající chránící skupiny na postranních řetězcích.
Je také vhodné působit na vysušenou chráněnou pryskyřici s navázaným peptidem působit směsí, sestávající z 1,0 ml m-kresolu a 10 ml bezvodého fluorovodíku na gram pryskyřice s navázaným peptidem, a to po dobu 60 minut při 0°C, čímž se odštěpí peptid od pryskyřice a zároveň se odstraní všechny chránící skupiny z postranních řetězců. Po odstranění fluorovodíku proudem dusíku a zavedením vakua se volné peptidy vysráží éterem, zfiltrují, promyjí éterem a ethylacetátem, extrahují 50% kyselinou octovou a lyofilizují.
5. Čištění
Čištění surových peptidů se může provést postupy, které jsou v chemii peptidů dostatečně známy. Například lze čištění peptidu provést pomocí MacRabbit HPLC systému (dodává Rainin Instrument Co. Inc., Woburn, MA) s použitím fotometru Knauer UV Photometer a zaznamenávacího zařízení Kipp and Zonen BD40 Recorder s pomocí kolony s reverzní fází Vydac 218TP5010 (10 x 250 mm, plněné silikagelem C18, který má velikost pórů 300 Á a velikost částic 5 μπι) (výrobce The Separations Group Inc., Hesperia, CA). Kolona je promývána a systémem rozpouštědel, sestávajícím z (A) 0,1% vodného TFA a (B) 0,1% TFA v 70% vodném MeCN s použitím lineární gradientově eluce (například 30-55% B v průběhu 120 min) . Eluent se monitoruje při 220 nm a frakce jsou analyzovány . ·« · ·· ·» · *· · * »· ♦ ♦ ♦ · «· • · »··♦·· • · » ······ · ·* »····· ·♦· ♦»·· ··· ·» ·· ··· pomoci analytické HPLC metody, přičemž se používá zařízení pro kapalinovou chromatografii Hewlett-Packard, Model HP-1090. Pak se frakce spojí, aby se dosáhlo maximální čistoty. Analytická HPLC se provádí na koloně s reverzní fází Vydac 218TP52 (2 x 250 mm, C18, 300 Á, 5 pm) přičemž se používá isokratická eluce systémem rozpouštědel, který sestává ze složek (A) a (B), které jsou definovány shora. Píky se sledují při 220 a 280 nm. Peptidy se posuzují jako v podstatě čisté při čistotě > 95 % podle výsledků analytické HPLC. Očekávané složení aminokyselin se také potvrzuje analýzou aminokyselin.
D. Farmaceutické prostředky
Peptidy podle vynálezu se mohou podávat ve formě farmaceuticky přijatelných, netoxických solí, jako jsou například adiční soli s kyselinami. Ilustrativními příklady takových adičních solí s kyselinami jsou hydro chlorid, hydro bromid, síran, fosforečnan, fumarát, glukonát, tanát, maleát, octan, citronan, benzoát, jantaran, alginát, pamoát, malát, askorbát, vinan a podobně. Zejména jsou výhodní antagonisté ve formě solí s nízkou rozpustností, například pamoáty a podobně. Tyto soli vykazují dlouhodobou účinnost.
Sloučeniny podle vynálezu se podávají lidem nebo zvířatům s.c., i.m. nebo i.v.; intranasálně nebo plicní inhalací nebo ve formě schránek (například mikrotobolky, mikrogranule nebo jako implantáty tvaru válečkovitých tyčinek) vytvořené z biodegradovatelného vhodného polymeru (jako je D,L-laktid-koglykolid), přičemž dříve uvedené dvě schránky jsou výhodné. Jiné ekvivalentní formy, vhodné k podávání účinných látek podle vynálezu, jsou součástí • 4444 • 4 4 4 4
44 • 4 ·· 4 vynálezu a spadají do jeho rozsahu, vstřikování ze zásobníku, kapání, s prodloužením účinku jako Podáváni je možné provádět injekčním nosiči, fyziologickém známém v oboru.
t.j., kontinuální infúzním čerpadlem a jsou mikrokapsule a podobně, jakémkoliv fyziologicky při roztoku nebo v jiném nosiči formy se
Peptidy se s výhodou intramuskulárně, subkutánně nebo nějakého farmaceuticky přijatelného slaný roztok. Alternativně intranasální sprej
Jednou ze podávají parenterálně, intravenózně s použitím nosiče jako je isotonický zásobníku polymeru, se peptidy mohou podávat jako s vhodným nosičem nebo plicní inhalací, vhodných cest podávání je forma, která využívá nebo schránky z vhodného biodegradovatelného například poly-D,L-laktid-koglykolid ve formě mikrokapsulí, mikrogranulí nebo cylindrických implantátů, obsahujících dispergované antagonistické sloučeniny.
Množství peptidu, které je potřebné, závisí na způsobu podávání a zamýšlený cíl. Obecně vzato, dávky se pohybují zhruba v rozmezí mezi 1-100 gg/kg tělesné hmotnosti hostitele denně.
E. Terapeutická použití antagonistů GH-RH hGH-RH antagonisté se mohou používat při léčení stavů a chorob, způsobených přebytkem růstového hormonu, například akromegalie, které se manifestuje abnormálním prodloužením kostí tváře a extremními proporcemi. Antagonisté GH-RH se také dají použít k léčení diabetické nefropatie (obvyklá příčina slepoty při cukrovce) a diabetické retinopatie, což jsou choroby, při kterých se předpokládá, že poškození očí a ledvin je způsobeno růstovým hormonem (GH).
Antagonisté hGH-RH se navrhují tak, aby blokovaly navazování GH-RH, a tudíž i jeho účinek který stimuluje sekreci GH, jenž zase stimuluje produkci IGF-1. Antagonisté GH-RH se mohou podávat samostatně nebo společně se somatostatinovými analogy, což je kombinace, která úplněji snižuje hladiny IGF-I. Je výhodné podávat spíše antagonisty GH-RH než somatostatin vzhledem ke skutečnosti, že GH-RH antagonisté se mohou použít v situacích, kdy cílová místa nemají somatostatinové receptory.
Nicméně hlavní cenné aplikace GH-RH antagonistů jsou v oblasti léčení rakoviny. To je založeno na následujících zjištěních: GH-RH antagonisté se volí tak, aby blokovaly navazování, a tudíž i působení GH-RH, který stimuluje sekreci GH, který zase stimuluje produkci růstového faktoru I (IGFI), který je podobný inzulínu, a který je také nazýván somatomedin-C. Vliv IGF-I (sómatomedin-C) při rakovině prsu, prostaty, střeva, nádorech kostí o jiných malignitách je dobře zjištěn, a somatostatinové analogy samotné adekvátně hladiny GH a IGF-I nepotlačují. Pro dobrou inhibici růstu nádoru se vyžaduje úplné potlačení hladiny IGF-I nebo sekrece. Autokrinní produkce IGF-I různými nádory se může také podrobit testování měřením GH-RH a pak se může řízeně inhibovat pomocí antagonistů GH-RH. Antagonisté GH-RH mohou také inhibovat produkci IGF-I. Podrobnější teoretické pozadí aplikací GH-RH na poli onkologie (rakoviny) je následující: Receptory pro IGF-I jsou přítomny v primárním nádoru rakoviny prsu u lidí, u rakoviny prostaty, plic, tlustého střeva, mozku, pankreatu a v nádorech ledvinových buněk.
Ukazuje se, že přítomnost receptorů IGF-I v těchto nádorech je spojena s maligní transformací a proliferací
těchto rakovinných nádorů. IGF-1 může působit jako endokrinní, parakrinní nebo autokrinní růstový faktor na různé druhy lidské rakoviny, takže růst těchto novotvarů je závislý na IGF-I. Antagonisté GH-RH by mohly snížením sekrece GH zmenšit produkci IGF-I. Jelikož IGF-I stimuluje růst těchto různých neoplasmat (rakovinných nádorů), snížení hladiny IGF-I v krevním oběhu by mělo vést k inhibici růstu nádoru. Je možné, že antagonisté GH-RH by také mohly snížit parakrinní nebo autokrinní produkci IGF-I v nádorech, což by také vedlo k inhibici proliferace rakoviny. Tyto výhledy jsou v souladu s moderními představami klinické onkologie. Antagonisté GH-RH by se mohly podávat samostatně nebo spolu s somatostatinovými analogy a takovou kombinací by se mohlo dosáhnout úplnější snížení hladin IGF-I, lepší eliminace hladin IGF-I v tkáni, například u lidských osteosarkomů, a stejně tak u rakoviny prsu, střeva, prostaty a nemalobuněčné plicní rakoviny (non-SCLC).
Výhoda antagonistů GH-RH oproti analogům somatostatinu je založena na faktu, že antagonisté GH-RH mohou být užívány pro potlačení růstu takových nádorů, které nemají somatostatinové receptory, například lidských osteogenních sarkomů.
Již bylo prokázáno, že antagonistické analogy GH-RH potlačují in vivo růst různých nádorů. Tento účinek je zprostředkováván zejména inhibici skeletu GHRH-GH-IGF-I, nicméně u mnoha nádorů se také uplatňuje vliv na autokrinní/parakrinní proliferaci IGF-II. Interference s touto autokrinní růst-stimulující cestou představuje možnost nového přístupu k potlačování nádorů. Antagonistické analogy GH-RH, MZ-4-71 { (Ibu°, Tyr1, D-Arg2, Abu15, Nle27)hGH-RH (1-28) Agm} a MZ-5-156 { [PhAc0, D-Arg2, Abu15, Nle27] hGH-RH (1-28 ) Agm}
výrazně inhibovaly rychlost proliferace tkáňových kultur buněk rakoviny prsu (MDA-MB-4,68; ZR-75-1), prostaty (PC-3 a DU-145) a pankreatu (MiaPaCa-2, SW-1990 a Capan-2) in vitro, jak bylo prokázáno kolorimetricky a [3H]-thymidinovými testy inkorporace, redukovaly expresi IGF-II mRNA v buňkách a snižovaly koncentraci IGF-II, vylučovaného do kultivačního prostředí. Se stejnými antagonisty GH-RH se dosáhlo podobných výsledků in vivo (inhibice proliferace a snížení produkce IGF-II) v nádorech prostaty (PC-3, DU-145), ledvinovém adenokarcinomu (Caki-I) a nemalobuněčném____plicnim karcinomu (H157). Tato zjištění naznačují, že antagonistické analogy GH-RH mohou inhibovat růst nádoru nikoliv pouhou inhibicí skeletu GHRH-GH-IGF-I, ale také snížením produkce IGF-II v určitých nádorových buňkách, což vede k přerušení jejich autokrinní regulační cesty.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je popsán pomocí následujících příkladů, které jsou uvedeny pouze pro ilustrační účely. V příkladech jsou všechny opticky aktivní chráněné aminokyseliny v konfiguraci L-, pokud není v konkrétním případě uvedeno jinak.
Následující příklady dokládají vhodné způsoby syntézy nových antagonistů GH-RH metodou syntézy v pevné fázi.
PŘÍKLAD I
PhAc°-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21Leu22-Leu23-GIn24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 = (Peptid 1 ) • ·♦·· ·· ♦ · ·
99999 • · 9 ··
9 9 99
99999
Zkrácené označení:
{[PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9,
Har29] hGH-RH (1-29) NH2}
Abu15, Nle27,
D-Arg28,
Syntéza se provádí pro syntézu peptidů postupných v pevné krocích pomocí fázi. Stručně, vybavení para(MBHA) methylbenzhydrylaminová
California) (720 mg, 0,50
CH2C12 a promyje podle protokolu, mmol) se pryskyřice neutralizuje popsaného v % DIEA v tabulce I.
Roztok Boc-Har(N02)-OH (500 mg, 1,5 mmol) v DMF-CH2C12 (1:1) se protřepe s neutralizovanou pryskyřicí a DIC (235 μΐ, mmol) v ručním zařízení pro kopulační
1,5 syntézu peptidů v pevné fázi 1 hod. Po ukončení ninhydrinový test, 50% TFA v CH2C12 odstraní se neutralizuje pak buduje po následujících čímž se na pryskyřice pomocí 5% takovýchto chráněných pryskyřici
Boc-Nle-OH,
Boc-Ile-OH, reakce se provede negativní se chránící skupina působením s navázaným požadovaným článkem
DIEA v CH2C12. Peptidový řetězec se kopulačních krocích s použitím aminokyselin v získá peptid:
požadovaném pořadí,
Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-Gln-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc-Abu-OH,
Boc-Arg(Tos)OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Asp(OcHx)-OH,
Boc-D-Arg(Tos)-OH,
Tyto chráněné aminokyselinové zbytky (také obecně dostupné od Bachem Co.) jsou shora popsány v souladu s dobře zavedenou konvencí označování aminokyselinových členů v peptidech. Vhodná chránící skupina pro funkční skupinu postranního řetězce určité konkrétní aminokyseliny je uvedena v závorce a OH skupiny ve shora uvedených vzorcích znamenají, že na zbytku je volné karboxylové zakončení.
Chráněná aminokyselina (1,5 mmol každé aminokyseliny) se kopuluje pomocí DIC (235 μΐ, 1,5 mmol), kromě Boc-Asn-OH a Boc-Gln-OH, které se kopulují pomocí svých předem připravených HOBt esterů. Po odstraněné Na-Boc chránící skupiny z Tyr1 se peptid acyluje fenyloctovou kyselinou (PhAc) (272 mg, 2 mmol) pomocí DIC(313 μΐ, 2 mmol).
Za účelem odštěpení peptidu od pryskyřice a odstranění chránících skupin se sušená pryskyřice s navázaným peptidem (2,18 g) míchá s 2 ml m-kresolu a 20 ml fluorovodíku (HF) při 0°C po dobu 1 hodiny. Po odpaření HF pod vakuem se zbytek promyje suchým diethyléterem a ethylacetátem. Odštěpený peptid zbavený chránících skupin se rozpustí v 50% kyselině octové a oddělí se od pryskyřice filtrací. Po rozpuštění ve vodě lyofilizaci se získá 1,51 g surového produktu.
Surový peptid se analyzuje pomocí HPLC (kapalný chromatograf Hewlett-Packard Model HP-1090 s kolonou s reverzní fází Vydac 218TP52 (2 x 250 mm, plněná silikagelem C18, velikost pórů 300 Á, velikost zrn 5 μιη) (The Separations Group lne., Hesperia, CA) a elucí s lineárním gradientem (například, 40-70% B) s použitím systému rozpouštědel sestávajícího z (A) 0,1% vodný TFA a (B) 0,1% TFA v 70% vodném MeCN. 500 mg surového peptidu se rozpustí v AcOH/H20, míchá, zfiltruje a nanese na ODS kolonu Beckman Ultraprep (21,2 x 150 mm, plněnou silikagelem C18, s velikostí pórů 300 Á a velikostí zrn 10 μπι) . Kolona se eluuje systémem popsaným shora s použitím lineárního gradientu (například, 30-55% B v průběhu 120 minut); průtok kolonou = 6 ml/min.
• « · ♦· • · · · ♦· • · · ·· ·· β· 9··
Eluent se monitoruje při 220 nm a frakce se zkoumají analytickou HPLC. Frakce s čistotou požadovaného produktu nad 95 % se spojí a lyofilizují, což poskytne 98 mg čistého produktu. Analytická HPLC se provádí na koloně s reversní fází Vydac C18, popsané shora s použitím isokratické eluce systémem rozpouštědel, popsaným shora při rychlosti průtoku 0,2 ml/min. Píky se monitorují při 220 a 280 nm. „Produkt se hodnotí jako v podstatě ( > 95 %) čistý pomocí analytické HPLC. Molekulová hmotnost se kontroluje elektro-rozprašovací hmotnostní spektrometrií a složení aminokyselin, které se očekává, se potvrdí analýzou aminokyselin.
PŘÍKLAD II
PhAc°-Tyr1-D-Arg1-Asp3-Ala4-Ile5-Phe (pCl) 6-Thr7-Asn8-Har9Tyr (Me) 10-Arg1:L-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19Arg10-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2 ( = Peptid 3)
Zkrácený název:
{ [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, DArg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2}
Syntéza se provádí v jednotlivých krocích pomocí ručního zařízení pro syntézu peptidu v pevné fázi. Stručně, paramethylbenzhydrylaminová (MBHA) pryskyřice (Šachem, California) (100 mg, 0, 070 mmol) se neutralizuje 5% DIEA v CH2C12 a promývá se v lázních podle protokolu, popsaného v tabulce I. Roztok Boc-Har (N02) -OH (83 mg, 0,25 mmol) v DMFCH2C12 (1:1) se 1 hodinu protřepává s neutralizovanou pryskyřicí a s DIC (44 μΐ, 0,275 mmol) v ručním zařízení na syntézu peptidů v pevné fázi. Po ukončení kopulační reakce se provede negativní
• S Φ · 4«
«· · * ·· · • 9 • • ·
> · • · • • · •
9 · '» • · * • · • •
• · Φ · • • • •
·· · H1· 4· * *·
ninhydrinový test, odstraní se chránící skupiny působením 50%
TFA v CH2CÍ2 a pryskyřice s navázaným polotovarem se neutralizuje působením 5% DIEA v CH2CI2. . Pomocí takových kroků se dále po krocích buduje peptid s použitím následujících aminokyselin v uvedeném pořadí, čímž se získá požadovaná peptidová sekvence:
Boc-D-Arg(Tos)-OH,
Boc-Nle-OH,
Boc-Ile-OH,
Boc-Asp(OcHx)-OH,
Boc-Gln-OH,
Boc-Leu-OH,
Boc Leu-OH,
Boc-Lys(2C1Z)-OH,
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Ala-OH,
Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH,
Boc-Gln-OH,
Boc-Abu-OH,
Boc Leu OH, Boc-Val-OH, Boc-Lys(2C1Z)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Tyr(Me)-OH, Boc-Har(NO2)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe(pCl)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx)-OH, Boc-D-Arg(Tos)OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH.
Tyto chráněné aminokyselinové zbytky (také obecně dostupné od Bacilem Co.) jsou shora nazvány v souladu s dobře zavedenou a přijatou konvencí. Vhodná chránící skupina pro funkční skupinu na postranním řetězci konkrétních aminokyselin je vždy uvedena v závorkách. OH skupiny ve shora uvedených vzorcích znamená, že příslušné zbytky obsahují volná karboxylová zakončení.
Chráněné aminokyseliny (každá v množství 0,25 mmol) se kopulují pomocí DIC (44 μΐ, 0,275 mmol) s výjimkou Boc-Asn-OH a Boc-Gln-OH, které se kopulují pomocí svých HOBt esterů. Po odstranění N“-Boc chránící skupiny z Tyr1 se peptid acyluje fenyloctovou kyselinou (PhAc) (54 mg, 0,4 mmol) s pomocí DIC (70 μΐ, 0,44 mmol).
Za účelem odštěpení peptidu od pryskyřice a odstranění chránících skupin se sušená pryskyřice s navázaným peptidem (206 mg) míchá s 0,5 ml m-kresolu a 5 ml fluorovodíku (HF) při 0°C po dobu 1 hodiny. Po odpaření HF pod vakuem se zbytek • · · · · · · · ··· ···· ··· ·· ·· ··* promyje suchým diethyléterem a ethylacetátem. Odštěpený peptid zbavený chránících skupin se rozpustí v 50% kyselině octové a oddělí se od pryskyřice filtrací. Po rozpuštění ve vodě lyofilizaci se získá 112 g surového produktu.
Surový peptid se analyzuje pomoci HPLC (kapalný chromatograf Hewlett-Packard Model HP-1090 s kolonou s reverzní fází Vydac 218TP52 (2 x 250 mm, plněná silikagelem C18, velikost pórů 300 Á, velikost zrn 5 μη) (The Separations Group lne., Hesperia, CA) a elucí s lineárním gradientem (například, 40-70% B) s použitím systému rozpouštědel sestávajícího z (A) 0,1% vodný TFA a (B) 0,1% TFA v 70% vodném MeCN. 500 mg surového peptidu se rozpustí v AcOH/H2O, míchá, zfiltruje a nanese na ODS kolonu Beckman Ultraprep (21,2 x 150 mm, plněnou silikagelem C18, s velikostí pórů 300 Á a velikostí zrn 10 μη) . Kolona se eluuje systémem popsaným shora s použitím lineárního gradientu (například, 30-55% B v průběhu 120 minut); průtok kolonou = 6 ml/min. Eluent se monitoruje při 220 nm a frakce se zkoumají analytickou HPLC. Frakce s čistotou požadovaného produktu nad 95 % se spojí a lyofilizují, což poskytne 98 mg čistého produktu. Analytická HPLC se provádí na koloně s reversní fází Vydac C18, popsané shora s použitím isokratické eluce systémem rozpouštědel, popsaným shora při rychlosti průtoku 0,2 ml/min. Píky se monitorují při 220 a 280 nm. Produkt se hodnotí jako v podstatě ( > 95 %) čistý pomocí analytické HPLC. Molekulová hmotnost se kontroluje elektro-rozprašovací hmotnostní spektrometrií a složení aminokyselin, které se očekává, se potvrdí analýzou aminokyselin.
Peptid 2 a Peptidy 4 až 30 se syntetizuji stejným způsobem jako Peptid 1 a Peptid 3, jen s tím rozdílem, že tyto peptidy obsahují jiné substituenty, čímž se získaly:
(IndAc0, D-Arg2, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 Phe(pCl)5, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, = Peptid 2
[PhAc0, D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 = Peptid 4.
(Nac°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 = Peptid 5
[PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me) 10, Abu15, Nle27,
D-Arg28, Har29] hGH-RH ( 1-29)NH, = Peptid 6
[PhAc0, His1 D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29)NH2 = Peptid 7 (Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28,
Har29] hGH-RH (1-2 9)NH2 = Peptid 8 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg29]hGHRH (1-29)NH2 = Peptid 9 (PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Arg16, Nle27, D-Arg29] hGHRH(1-29)NH2 = Peptid 10 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGHRH (1-29)NH2 Peptid 11 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle9, Abu15, Nle27; D-Arg29]hGHRH(1-29)NH2 = Peptid 12 • « • ·· [PhA°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Nle13, Nle14, Abu15, Nle27, DArg29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 28 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, D-Orn9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-2 9 )NH2 = Peptid 29 [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 30 .
PŘÍKLAD III
Biologická účinnost
Peptidy podle vynálezu byly testovány metodami in vitro a in vivo, aby se stanovila jejich schopnost inhibovat hGHRH (1-29)NH2 indukované uvolňování růstového hormonu.
Ovlivnění silné stimulace systému hypofýzy u krys.
Analogy byly testovány in vitro testem, který je již popsán (S. Vigh a A.V. Schally, Peptides 5:241-347, 1984) s modifikací, která je také popsána (Z. Rekasi a A.V. Schally, P.N.A.S. 90:2146-2149, 1993).
Stručně, buňky se preinkubují s peptidy na 9 minut (3 ml) při různých koncentracích. Ihned po inkubaci se podává 3 minuty 1 nM hGHRH (1-29) NH2 (lml) [odezva nulté minuty]. Aby se stanovila doba přetrvání antagonistického účinku daného analogu podá se 1 nM hGHRH(1-29)NH2 , a to 30, 60, 90 a 120 minut později, přičemž doba podávání je 3 minuty (odezvy ze 30, 60, 90 a 120 minut). Síťově se vyhodnotí integrální !
hodnoty každé odezvy GH. Odezvy GH se pak porovnají s původní odezvou GH, vyvolanou 1 nM GH-RH(1-29]NH2 a vyjádří se v procentech této hodnoty. Účinek nových antagonistů se porovnává s účinkem [Ac-Tyr1,D-Arg2] hGH-RH (1-29) NH2, neboli s tzv. Standardním antagonistou.
Radioimunoanalýza růstového hormonu.
Hodnoty krysího GH v alikvotních nerozpuštěných a rozpuštěných vzorcích, ovlivněných testovanou látkou, byly měřeny radioimunotestem s dvojí protilátkou s použitím materiálů, které dodává National Hormone a Pituitary Program, Baltimore, Maryland. Výsledky RIA (radioimmunoassay) byly zpracovány počítačovým programem, vyvinutým v našem institutu (zveřejněno v publikaci: V. Csernus a A.V. Schally, v Neuroendocrine Research Methods; Harwood Academie (Greenstein, B.D. ed., London, pp. 71-109, 1991), včleněné zde tímto odkazem do popisu vynálezu. Test průkaznosti rozdílu mezi hodnotami byl 15% a infra-test byl pod 10%.
Test vazby na GH-RH.
Za účelem hodnocení schopnosti a síly
- - o - vazby antagonistů
GHRH na cílové receptory za různých podmínek byl zvláštní citlivý radioreceptorový vyvinut test na vazbu (G.
Halmos,
A. V. Schally et al., Receptor publikace, která se tímto včleňuje Tento test je založen [His1,Nle27]hGH-RH (1-32)NH2 na membrány hypofýzy. Jódované -32)NH2 se připravují metodou et al., Biochemistry X9:114-123, 1963), což je která se tímto včleňuje do popisu tohoto vynálezu.
3, 87-97, 1993), což je do popisu tohoto vynálezu.
vazbě značeného na homogenizáty krysí anteriorní deriváty [His1,Nle27] hGH-RH- (1chloraminu-T (F.C.
Greenwood publikace,
K přípravě • 9 * ·* « 9· • · · • · 999999 · · plemene vazbami
Sprague-Dawley se membrán se používají hypofýzy krys (250-300 g). Pro ověžení nasycení homogenizáty inkubují s nejméně 6 koncentracemi [His1,125I~Tyr10, Nle27] hGH-RH (1-32) NH2 v koncentracích v rozmezí 0,005 až 0,35 nM v přítomnosti nebo v nepřítomnosti přebytku neznačeného peptidu (1 pM) .
Peleta se pak podrobí vyhodnoceni na počítači gama částic. Afinity jednotlivých testovaných antagonistických peptidu se pak stanoví v konkurenčních navazovacích experimentech. Finální afinity k vazbě jsou odhadnuty podle Ki (disociační konstanta komplexu inhibitor-receptor) a jsou vyhodnoceny podle počítačových programů Ligand PC a McPherson od Munsona a Rodbarda (P.J. Munson a D. Rodbard, Anal. Biochem. 107. 220-239, 1980). Relativní afinity ve srovnání s [Ac-Tyr1,D-Arg2]hGH-RH(l-29)NH2, Standardním antagonistou, jsou vypočteny jako poměr Kx testovaného antagonisty GH-RH ku ΚΣ Standardního antagonisty.
Testy In Vivo.
GH-RH antagonistický efekt analogů byl testován na mladých samcích krys plemene Sprague-Dawley (200-250 g) . V každém experimentu bylo použitu 5 skupin po 7 zvířatech. Sloučeniny (80 pg/kg) a GH-RH(1-29)NH2 (3 pg/kg) byly rozpuštěny v 5,5% manitolu a podány intravenózně do krční žíly krys při anestézii nembutalem. Doba mezi jednotlivými dávkami antagonisty GH-RH se u jednotlivých skupin poněkud liší, a to podle následujícího popisu. První skupina zvířat obdržela injekce GH-RH 5 min po podání antagonisty; u druhé, třetí a čtvrté skupiny zvířat byly intervaly mezi injekcí antagonisty a injekcí GH-RH roven 15, 30, a 60 minut.
Kontrolní skupině bylo místo antagonistů podáno injekčně samotné rozpouštědlo, načež po 5 minutách následovala injekce
GH-RH.
Před podáním antagonisty byly na GH RIA odebrány 0,4 mililitrové krevní vzorky (krevO), a další vzorky byly odebrány 5 minut po injekci GH-RH (krevl”). GH odezvy u každé skupiny byla vypočtena jako: rGH = (GHkrevl/GHSkrevo) , (tedy průměr ± střední odchylka). Relativní inhibice odezvy GH response (%) u každé skupiny, které byla podána testovaná látka, byla vypočtena jako: lOOx (rGH0štřeno -1) / (rGHkontroia -1).
Výsledky in vitro.
Výsledky antagonistických aktivit, testovaných in vitro na ovlivněném hormonálním systému hypofýzy u krys a test vazby jsou sumarizovány v tabulce II a tabulce III. Jak může být vidět z těchto dat, substituce přítomné v molekulách způsobily ve srovnání se standardním antagonistou obrovský nárůst počtu vázaných receptorů a inhibici uvolňování GH in vitro. Nejúčinnější antagonista in vitro, Peptid 1, způsoboval za podmínek standardního testu úplnou inhibici GHRH indukovaného GH uvolňování po dobu 90 min. První známka obnovení schopnosti odpovědi na GH-RH byla detekována až po 120 minutách od podání tohoto analogu.
Tabulka II
Inhibice uvolňováni GH v přesyceném systému krysí hypofýzy
Antagonista Dávka (nM) Inhibice uvolňování GH (%)
0 min 30 min 60 min 90 min 120 min
Standardní antagonista 100 62,1 2,5 19
Peptid 1 30 100 100 100 100 94
Peptid 2 30 100 100 100 100 91
Peptid 3 30 85 98 91 92 87
Peptid 4 30 83 86 80 79 68
Peptid 5 30 79 77 59 58 50
Peptid 6 30 93 93 97 95 90
Peptid 7 30 97 92 82 77 65
Peptid 8 30 100 100 98 97 90
Peptid 9 30 91 87 79 72 59
Peptid 10 30 75 69 46 24 22
Peptid 11 30 96 89 80 56 42
Peptid 12 30 68 75 48 52 52
Peptid 16 30 65 87 83 56 65
Peptid 19 30 58 47 59 23 39
Tabulka III
Hodnoty Ki a relativní afinity (R.A.) antagonistů hGH-RH
Peptid Ki (nM) R.A.
Standard 2, 94 1
Peptid 1 0,044 67
Peptid 2 0, 046 64
Peptid 3 0,068 43
Peptid 4 0, 087 34
Peptid 5 0, 036 82
Peptid 9 0,058 51
Peptid 10 0,107 27
Peptid 11 0,071 41
Peptid 12 0,070 42
Peptid 16 0,070 42
Výsledky in vivo
Tabulka IV ukazuje odezvy hladiny GH v séru a jeijich relativní inhibice u krys, ošetřených předem antagonisty GH-RH. Všechny testované analogy (Peptid 1, Peptid 2, Peptid 3, Peptid 4, Peptid 8. Peptid 9, Peptid 11 a peptid 16) způsobovaly: silnou a dlouho přetrvávající inhibici uvolňování GH, stimulovaného hGH-RH (1-2 9 )NH2. Peptid 1 a Peptid 2 mají nej silnější účinek v krátké době, inhibují odezvu GH v 95 % a 91 %, když se podají 5 min před aplikací hGH-RH(1-29)NH2. Účinnost těchto dvou peptidů trvá nejméně 30 minut. Na druhé straně Peptid 11 a Peptid 3, které jsou o něco méně účinné v krátké době, účinkují extrémně dlouho: jejich účinnost přetrvává nejméně 60 min.
Tabulka IV
Odezva hladiny GH v krevním séru a relativní inhibice této odezvy u krys, které byly různou dobu před podáním hGH-RH(1-29)NH2 ošetřeny GH-RH antagonistou
Antagonista Časový interval Odezva Relativní
(min) GH ± Δ inhibice %
5 1,13 ± 0,13 95
15 1,87 ± 0,13 68
Peptid 1 30 1,97 ± 0,16 64
60 3,89 ± 0,65 8
kontrola 3,68 ± 0,78 0
5 1,40 ± 0,29 91
15 3,45 ± 0,13 45
Peptid 2 30 3,64 ± 0,71 41
60 5,41 ± 1,35 2
kontrola 5,47 ± 0,97 0
5 3,01 ± 0,41 68
15 3,63 ± 0,80 61
Peptid 3 30 4,89 ± 0,95 41
60 5,36 ± 0,63 34
kontrola 7,65 ± 0,66 0
5 3,08 ± 0,58 82
15 7,73 ± 1,12 43
Peptid 4 30 12,00 ± 2,54 7
60 11,88 ± 0,90 8
kontrola 12,82 ± 1,38 0
Pokračováni tabulky IV:
Antagonista Časový interval Odezva GH ± Δ Relativní
(min) inhibice %
5 2,3 ± 0,3 74
15 3,6 ± 0,4 46
Peptid 8 30 5,5 ± 0,6 8
60 5,8 + 0,7 1
kontrola 5,8 ± 0,5 0
5 2,75 ± 0,75 75
Peptid 9 15 3,85 ± 0,50 59
30 3,34 ± 0,30 67
60 7,32 ± 1,16 10
5 5,15 ± 1,11 84
15 13,64 + 1,41 50
Peptid 11 30 16,04 + 4,36 40
60 16,61 ± 6,02 38
kontrola 26,17 ± 3,92 0
5 2,89 ± 0,65 77
15 3,44 + 0,62 70
Peptid 16 30 5,24 ± 1,36 48
60 9,19 ± 1,89 0
kontrola 9,13 ± 1,69 0
Výsledky
Peptid 1 a Peptid 3 měly podobně silnou inhibiční účinnost na MXT rakovinu struku u myší. Léčení MZ-5-156 také mělo za následek znatelnou inhibici růstu nádoru, ale jeho účinek byl slabší než u Peptidu 1 nebo Peptidu 3 (viz Tabulka V a Obrázek I).
9
Tabulka V
Vliv podáváni antagonistů GH-RH na MXT nádory struku u myší
Skupina Objem nádoru (mm3) Hmotnost nádoru (mg) Počet přežívajících myší
den 14 den 18
1. Kontrola 4051 ± 1007 7040 ± 646 7269 ± 292 5
2. MZ-5-156 2717 ± 773 5368 + 408* 4885 ± 480* 4
3. Peptid 1 denně injekce 2924 ± 654 4373 ± 381** 6964 ± 676 6
4. Peptid 3 denně injekce 1902 ± 349** 3465 ± 607** 5266 + 906 8
5. Peptid 1 čerpadlem 1329 ± 327** 3403 ± 584** 4810 ± 645* 7
6. Peptid 3 čerpadlem 1688 ± 220** 4272 ± 295** 5939 + 453 8
*p < 0,05 **p < 0,01
Vliv antagonistů GH-RH na štěpy MDA-MB-468 lidské rakoviny prsu na holých myších
Holé myši, nesoucí MDA-MB-468 hormonově-nezávislé štěpy lidské rakoviny prsu byly rozděleny do skupin po 10 zvířatech. Ošetřené skupiny obdržely denně jednu s.c. injekci 20 pg antagonisty GH-RH. Jedna skupina byla ošetřena Peptidem 1, druhá skupina byla pro srovnání ošetřena MZ-5-156. Kontrolní skupině bylo podáno injekčně vehikulum (t.j rozpouštědlo). Ošetřování pokračovalo 5 týdnů. Nádory byly měřeny jednou týdně a byl vypočítáván objem nádorů. Myši byly na konci experimentu usmrceny a byla stanovena hmotnost nádorů.
Výsledky
Oba peptidy vykazovaly průkazný inhibiční účinek na nádorové štěpy MDA-MB-468. Ve skupině, ošetřované injekcemi Peptidu 1, došlo během experimentu u 4 nádorů k trvalé regresi. Podobně způsoboval regresi 3 nádorů MZ-5-156. Po 5 týdnech léčení se tyto rakovinné nádory zmenšily na malé zbytky tkáně podoby jizev. Histologické zhodnocení těchto tkání potvrdilo nediferencované epitelové nádory s extenzívní nekrózou a pouze velmi úzkou marginální linii živé nádorové tkáně. V kontrastu s tím všechny nádory u kontrolních zvířat se rovnoměrně vyvíjely. Finální objem nádoru a jeho hmotnost u léčené skupiny byly signifikantně sníženy (viz tabulka VI a obrázek II), přičemž Peptid 1 měl silnější účinek.
Tabulka VI
Účinek působeni antagonistů GH-RH na štěpy MDA-MB-468 lidské rakoviny prsu na holých myších
Skupina Finální objem nádoru (mm3) Hmotnost nádoru (mg) Počet zmenšených nádorů
Kontrola 477,5 ± 41,2 440,7 ± 37,7 0
Peptid 1 82,4 + 29,1 64,0 ± 28,7 4
MZ-5-156 104,4 ± 32,2 77,7 ± 31,7 3
*p<0,05 **p<0,01
Účinek antagonistů GH-RH na štěpy HT-29 lidské rakoviny tlustého střeva na holých myších.
Štěpy HT-29 rakoviny lidského tlustého střeva byly transplantovány s.c. na samce holých myší. Po 19 dnech od • * transplantace byly myši rozděleny do skupin po 10 zvířatech a bylo zahájeno ošetřování. Myši obdržely denně jednu injekci s.c. různých antagonistů GH-RH v dávce 20 pg denně po dobu 6 týdnů. Nádory byly měřeny regulárně a ze získaných rozměrů byl vypočten objem nádoru. Na konci experimentu byly myši usmrceny a byly stanoveny hmotnosti nádorů.
Výsledky
Peptid 1 a MZ-5-156 měly stejně silný inhibiční účinek na HT-29 rakovinu lidského tlustého střeva. Léčení Peptidem 9 mělo za následek malé, ale ještě průkazné snížení růstu nádoru. Peptid 11 a MZ-471 myly pouze malý a neprůkazný účinek. (Výsledky jsou shrnuty v tabulce VII a na obrázku III).
Tabulka VII
Vliv ošetřování antagonisty GH-RH na štěpy HT-29 lidské rakoviny tlustého střeva na holých myších
Skupina Finální objem nádoru (mm3) Hmotnost nádoru (mg)
Kontrola 2117 ± 751 2364 ± 835
MZ-4-71 1953 ± 400 2189 ± 458
MZ-5-156 908 ± 195* 1012 ± 174*
Peptid 11 1663 ± 610 1849 + 681
Peptid 9 1194 + 506* 1383 ± 576*
Peptid 1 890 + 322* 1354 ± 480*
*p <0,05
Účinek antagonisty GH-RH (Peptidů 1) na štěpy U87MG lidského glioblastomu u holých myši
Myším byly implantovány s.c. U87MG glioblastomy a když dosáhly rostoucí nádory objemu přibližně 70 mm3 byly myši nahodile rozděleny od 2 experimentálních skupin. Jedna skupina byla ošetřována Peptidem 1 jednou denně s.c. injekcemi 20 pg po dobu 28 dní, zatímco druhá skupina sloužila jako kontrola.
Výsledky
Ošetření Peptidem 1 inhibovalo po 4 týdnech léčení růst nádorů ze 77 % ve srovnání s kontrolní skupinou, (viz Tabulka VIII a Obrázek IV).
Tabulka VIII
Vliv ošetřování antagonistou GH-RH (Peptidem 1) na štěpy
U87MG lidského glioblastomu na holých myších
Skupina Objem nádoru na konci pokusu (mm3) Hmotnost nádoru (g)
Kontrola 3425 ± 723 4,7 ± 1,3
Peptid 1 817 ± 323** 1,4 ± 0,7**
**p < 0,01 « · · • « · ·
44
Vliv antagonistů GH-RH na štěpy PC-3 rakoviny lidské prostaty na holých myších
Samcům holých myší byly oboustranně implantovány s.c. 3 mm3 kousky PC-3 tkáně hormonálně-nezávislého nádoru lidské rakoviny. Když dosáhly nádory objemu přibližně 40-50 mm3 byly myši rozděleny do 3 experimentálních skupin. První a druhá skupina byly ošetřovány Peptidem 3 a MZ-5-156, a to jednou s.c. injekční dávkou of 20 gg denně po dobu 21 dní, zatímco třetí skupina sloužila jako kontrola. Objem nádorů byl měřen po týdenních intervalech, hmotnost nádorů byly změřena na konci experimentu.
Výsledky
Oba GH-RH antagonisté inhibovaly růst PC-3 nádorů (viz tabulka IX a obrázek V). Peptid 3 projevoval silnější inhibici růstu (65% inhibice objem nádoru a 62% inhibice hmotnosti) než MZ-5-156 (52% a 46%).
Tabulka IX
Vliv ošetřování antagonisty GH-RH na štěpy rakovinných nádorů PC-3 lidské prostaty na holých myších
Skupina Finální objem nádoru (mm3) Hmotnost nádoru (mg)
Kontrola 307,9 ± 64,5 191,8 ± 42,6
Peptid 3 107,9 + 12,5* 73,7 ± 11,9*
MZ-5-156 148,9 ± 41 104,3 ± 27,2
p < 0,05
4 ♦· ·♦· *4 4· 9 · 9 999
44····
9 9*9*9·
4 4 · 4 ·· • 444 ··· ·· ·· 999
ΡΡ ΡΟΟΊ -/W

Claims (11)

1. Peptid vybraný ze skupiny, která má vzorce:
X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Ash-Ile-R27-R28-R29-NH2 kde X je PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- nebo 2-Npr nebo Fpr,
R1 je Tyr nebo His,
R2 je D-Arg nebo D-Cit, R5 je lle nebo Val,
R6 je Phe, Nal nebo Phe(Y), ve kterém Y = F, C, Br,
R8 je Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Sec, DThr, Abu, D-Abu, nebo Aib,
R9 je Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, Tyr (Me), Sec, Ala nebo Aib,
R10 je Tyr nebo Phe(Y), ve kterém Y = H, F, Cl, Br nebo OCH3, R12 je Lys, D-Lys nebo Orn,
R13 je Val nebo Nle,
R14 je Leu nebo Nle,
R15 je Gly, Ala, Abu, Nle nebo Gin,
R15 je Gin nebo Arg,
R18 je Ser nebo Nle,
R19 je Ala nebo Abu,
R21 je Lys nebo Orn,
R22 je Leu, Ala nebo Aib,
R27 je Met, Leu, Nle, Abu nebo D-Arg,
R28 je Arg, D-Arg, Ser, Asn, Asp, Ala nebo Abu, R29 je
Arg, D-Arg, Har nebo D-Har, a jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
2. Sloučenina podle nároku 1, vybraná ze souboru, který sestává z
[PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Acg9, Abu15, Nle27, D-Arg28 Har29]hGH -RH(l-29) NH2 = Peptid 1 [IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28 Har29]hGH -RH(129)NH2 = Peptid 2 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me) 10, Abu 1S, Nle27 D-Arg28, : Har29] hGHRH (1-29)NH2 = Peptid 3 [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me) 10, Abu 15, Nle27 D-Arg28, Har29] hGHRH (1-29)NH2 - Peptid 6
- Peptid 7 [PhAc°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-2 9) NH2 to to to ·· ·♦ to· ·· • · ·· • · · 9· • to ·♦ toto t
♦ [Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (129) NH2 = Peptid 8
3. Sloučenina podle nároku 1, který má vzorec [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 1
4. Sloučenina podle nároku 1, který má vzorec [IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 2
5. Sloučenina podle nároku 1, který má vzorec [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10 *, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 3
6. Sloučenina podle nároku 1, který má vzorec [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 6
7. Sloučenina podle nároku 1, který má vzorec [PhAc°, His1, DArg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29)NH2 = Peptid 7
8. Sloučenina podle nároku 1, který má vzorec [Nac°, His1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 = Peptid 8
9. Způsob snižování nadměrných hladin GH u pacienta, který to potřebuje, při kterém se tomuto pacientovi podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
»·* « · ♦ ♦ · · ··♦♦ ·· · · · · ·· • · ···«·· • · · ♦ ····· · * · »♦···· ··· ···· ··· ·· ♦· ···
10. Způsob léčení pacienta, který má rakovinu nesoucí receptory na IGF-I nebo -II, při kterém se tomuto pacientovi podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
11. Způsob inhibice hladin IGF-II v nádorech (rakovině) a exprese mRNA pro IGF-II v těchto nádorech, při kterém se pacientovi podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
• ♦♦ > ♦ · • · • ·« ·> ♦ · ·· · • * »t • · • · i • · · • · · · · · • · · · · ·· ··
1/5
Protinádorový účinek GH-RH antagonistů Peptidu 1, Peptidu 3 a MZ-5-156 na prsní rakovinu MXT u myší
CZ20011794A 1998-11-25 1999-11-23 Antagonistické analogy GH-RH, inhibující IGF-I a II CZ20011794A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/199,381 US6057422A (en) 1998-11-25 1998-11-25 Antagonistic analogs of GH-RH inhibiting IGF-I and -II

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20011794A3 true CZ20011794A3 (cs) 2002-02-13

Family

ID=22737273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011794A CZ20011794A3 (cs) 1998-11-25 1999-11-23 Antagonistické analogy GH-RH, inhibující IGF-I a II

Country Status (28)

Country Link
US (2) US6057422A (cs)
EP (1) EP1133522B1 (cs)
JP (1) JP2002530432A (cs)
KR (1) KR100629013B1 (cs)
CN (1) CN100422211C (cs)
AR (1) AR022392A1 (cs)
AT (1) ATE332310T1 (cs)
AU (1) AU757222B2 (cs)
BG (1) BG65137B1 (cs)
BR (1) BR9915512A (cs)
CA (1) CA2351665C (cs)
CO (1) CO5180565A1 (cs)
CZ (1) CZ20011794A3 (cs)
DE (1) DE69932255T2 (cs)
DK (1) DK1133522T3 (cs)
ES (1) ES2264279T3 (cs)
HU (1) HUP0105094A3 (cs)
IL (1) IL142899A0 (cs)
NO (1) NO20012489L (cs)
NZ (1) NZ511307A (cs)
PL (1) PL197471B1 (cs)
PT (1) PT1133522E (cs)
RU (1) RU2235099C2 (cs)
SK (1) SK7252001A3 (cs)
TR (1) TR200101492T2 (cs)
TW (1) TW585873B (cs)
UA (1) UA68407C2 (cs)
WO (1) WO2000031136A1 (cs)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2454135A1 (en) * 2001-07-12 2003-01-23 Exelixis, Inc. Gpcs as modifiers of the irrtk and p21 pathways and methods of use
US20040121407A1 (en) * 2002-09-06 2004-06-24 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Regulation of the growth hormone/IGF-1 axis
KR20050071498A (ko) * 2002-09-18 2005-07-07 상트르 오스피딸리에 드 루니버시떼 드 몬트리알 성장 호르몬 방출 호르몬 유사체
TW200517400A (en) * 2003-08-05 2005-06-01 Univ Tulane Antagonistic analogs of GH-RH (2003)
CA2718146C (en) * 2008-03-28 2016-09-20 The University Of Miami Novel n- and c-terminal substituted antagonistic analogs of gh-rh
US8691942B2 (en) 2008-03-28 2014-04-08 University Of Miami N- and C- terminal substituted antagonistic analogs of GH-RH
CN102083451A (zh) 2008-06-12 2011-06-01 赛恩泰新公司 癌症的抑制
CA2727082C (en) 2008-06-12 2019-02-26 Syntaxin Limited Fusion proteins for use in suppression of acromegaly
GB0820970D0 (en) 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
US8227421B2 (en) * 2009-09-17 2012-07-24 University Of Miami Fluorinated GHRH antagonists
KR20140027284A (ko) 2011-04-21 2014-03-06 쎄러테크놀로지스 인코포레이티드 성장 호르몬 방출 인자(grf) 유사체 및 이의 용도
US9079974B2 (en) * 2011-12-21 2015-07-14 The University Of Miami GH-RH analogs with potent agonistic effects
WO2014100816A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 University Of Miami Ghrh agonists for islet cell transplantation and function and the treatment of diabetes
US9855312B2 (en) 2012-12-21 2018-01-02 University Of Miami GHRH agonists for the treatment of ischemic disorders
WO2016077620A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Treatment of hormonal disorders of growth
CA3129405A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Growth hormone-releasing hormone antagonists and uses thereof
CN114126653B (zh) 2019-07-18 2024-02-20 迈阿密大学 用于治疗结节病的方法的ghrh拮抗剂

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4659693A (en) * 1984-04-30 1987-04-21 Syntex (U.S.A.) Inc. N,N'-dialkyl substituted guanidino amino acyl residue substituted GRF-analog peptides
CA2082059A1 (en) * 1990-05-04 1991-11-05 David H. Coy Synthetic grf analogs
RU2119800C1 (ru) * 1990-11-14 1998-10-10 Дзе Апджон Компани Аналог пептида фактора гормона роста (фгр), способ стимулирования секреции гормона роста и композиция для стимулирования секреции
US5550212A (en) * 1993-12-17 1996-08-27 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Analogues of hGH-RH(1-29)NH2 having antagonistic activity
US5942489A (en) * 1996-05-03 1999-08-24 The Administrators Of The Tulane Educational Fund HGH-RH(1-29)NH2 analogues having antagonistic activity

Also Published As

Publication number Publication date
CA2351665A1 (en) 2000-06-02
US7026281B1 (en) 2006-04-11
NZ511307A (en) 2005-01-28
CN1328570A (zh) 2001-12-26
PT1133522E (pt) 2006-11-30
PL349877A1 (en) 2002-09-23
BG105638A (en) 2002-01-31
UA68407C2 (en) 2004-08-16
WO2000031136A1 (en) 2000-06-02
IL142899A0 (en) 2002-04-21
CA2351665C (en) 2008-09-02
KR20010101079A (ko) 2001-11-14
TR200101492T2 (tr) 2001-11-21
DE69932255T2 (de) 2007-05-31
WO2000031136A9 (en) 2001-07-19
DE69932255D1 (de) 2006-08-17
RU2235099C2 (ru) 2004-08-27
ATE332310T1 (de) 2006-07-15
TW585873B (en) 2004-05-01
HK1036461A1 (en) 2002-01-04
HUP0105094A3 (en) 2002-05-28
AR022392A1 (es) 2002-09-04
DK1133522T3 (da) 2006-11-06
HUP0105094A2 (hu) 2002-04-29
SK7252001A3 (en) 2002-02-05
NO20012489L (no) 2001-07-04
BR9915512A (pt) 2001-08-07
BG65137B1 (bg) 2007-03-30
US6057422A (en) 2000-05-02
CO5180565A1 (es) 2002-07-30
PL197471B1 (pl) 2008-04-30
NO20012489D0 (no) 2001-05-21
JP2002530432A (ja) 2002-09-17
KR100629013B1 (ko) 2006-09-26
ES2264279T3 (es) 2006-12-16
AU757222B2 (en) 2003-02-06
EP1133522A1 (en) 2001-09-19
CN100422211C (zh) 2008-10-01
AU2029100A (en) 2000-06-13
EP1133522B1 (en) 2006-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0914340B1 (en) hGH-RH(1-29)NH2 ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY
US7026281B1 (en) Antagonistic analogs of GH-RH inhibiting IGF-I and -II
RU2335506C2 (ru) Пептидные аналоги gh-rh с антагонистическим действием, способ снижения уровня gh, способ снижения уровня igf-i и igf-ii, применение для ингибирования роста раковых клеток, фармакологически приемлемая композиция (варианты)
WO1997042223A9 (en) hGH-RH(1-29)NH2 ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY
EP2288374B1 (en) Novel n-and c-terminal substituted antagonistic analogs of human gh-rh
EP2478011A1 (en) Fluorinated ghrh antagonists
EP0734396B1 (en) ANALOGUES OF hGH-RH (1-29)NH2 HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY
US9260504B2 (en) N- and C-terminal substituted antagonistic analogs of GH-RH
HK1036461B (en) Antagonistic analogs of gh-rh inhibiting igf-i and -ii