CZ20013986A3

CZ20013986A3 - Tapetum-specifické promotory

Info

Publication number: CZ20013986A3
Application number: CZ20013986A
Authority: CZ
Inventors: Wyatt Paul; Roderick John Scott; Diane Hird; Rachel Hodge
Original assignee: Biogemma Uk Limited
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2002-05-15
Also published as: DE60039511D1; PL362898A1; AU4769600A; HUP0201126A2; WO2000068403A2; EP1183375B1; ES2307508T3; GB9910796D0; CA2373071A1; CA2373071C; ATE401408T1; AU778752C; AU778752B2; HUP0201126A3; US7078587B1; WO2000068403A3; EP1183375A2

Description

Tapetum-specifické promotory

Oblast techniky >

Tento vynález se zabývá aplikací genového inženýrství na rostliny za účelem dosažení samčí sterility.

Dosavadní stav techniky

Produkce hybridů pomocí sexuální hybridizace rodičů s různým genetickým původem je důležitým postupem v moderním zemědělství. V důsledku manifestace vitality hybridů jsou potomci nadřazení rodičům v takových vlastnostech, jako je plodnost a odolnost vůči chorobám. Navíc tam, kde jsou rodiče výrazně homozygotní, výsledný potomek je geneticky velmi podobný, a proto se úroda chová stejným způsobem v takových důležitých vlastnostech, jako je doba klíčení, výška vzrůstu, náchylnost k nemocem, doba kvetu, doba zrání semene atd., což vysoce vylepšuje účinnost managementu úrody. Z těchto důvodů jsou hybridní semena pro farmáře atraktivní.

V přírodě se upřednostňuje samooplodnění u produkce nehybridních potomků. Proto se za účelem produkce hybridního semene bez kontaminace samooplodněným semenem používá křížení za použití různých mechanických, chemických a genetických způsobů, které zabraňují samoopylení. Toho lze dosáhnout několika různými způsoby:

a) mechanickým oddělením nebo chemickou inaktivací orgánů produkujících pyl samičího rodiče dříve než dosáhne zralosti; tato metoda se použila například u kukuřice a u rajčat;

b) použitím cytoplazmaticky podmíněných sterilních samčích (CMS) mutantních rostlin; tato metoda se použila například u řepky olejky a u slunečnice;

c) použitím recesivního jádra samčí sterilní mutantní rostliny;a

d) použitím dominantního jádra samčí sterilní rostliny upravené genetickým inženýrstvím (umělá samčí sterilita nebo také AMS), jak je popsáno například v Mariani a kol., Nátuře 347 737-741 (1990) nebo v Worrall a kol., The Plant Cell 4 759-771 (1992).

Se všemi výše uvedenými způsoby jsou praktické potíže. Mechanická samčí sterilizace je náročná na práci, drahá a náchylná na lidskou chybu, čímž vyvstává problém kvality hybridních semen. Prakticky je to možné pouze u rostlinných druhů, kde je květ dostatečně velký, aby se dal vykleštit ručně; proto toto pro většinu obilovin není prakticky možné. Snaha obejít tuto potíž a snížit náklady vede k použití chemického vyklešťování místo mechanického. Účinnost této techniky velmi závisí na podmínkách prostředí v době postřiku gametocidem a vede k tomu, že producent semene nese každou sezónu značné riziko.

Cytoplazmaticky podmíněná samčí sterilita je velmi praktická, ale její použití je limitováno dostupností vhodné mutantní rostliny u každého konkrétního druhu. Vážným problémem může být ztráta cytoplazmatické genetické diversity, kdy všichni pěstitelé v jejich pěstitelském programu použijí stejnou cytoplazmu, jak se ukázalo v USA na kukuřici v 70. letech.

Použití recesivních jaderných sterilních samčích mutantů není praktické. Protože gen samčí sterility je recesivní, udržování samčí sterilní linie zahrnuje kontrolu 1/4 samčích rostlin ze 3/4 fertilních v samooplodněném pokolení heterozygotní rostliny. Bez úzce spojeného selektivního nebo jednoduše kontrolovatelného signálního genu je to prakticky nemožné.

Použití AMS systémů zajišťuje způsoby, jak předejít problémům spojeným s ostatními způsoby. AMS genové systémy jsou potencionálně universální, pouze jsou limitovány geneticky transformovatelnými druhy. Nezávisí na existenci mutanta, jako u CMS. Udržování samčí sterilní linie se může dosáhnout řízením dominantního genu samčí sterility navázaného na signální gen, což umožňuje výběr AMS rostlin v populaci za izolace 1/2 AMS rostlin. Pro praktické použití je tento signální gen často gen odolný herbicidům.

AMS systémy obecně využívají specifickou tkáňovou expresi, například použitím promotorů / regulačních sekvencí, které řídí expresi do jedné nebo více tkání zapojených ve vývoji samčí sterility. Například tapetum, které je specializovanou vrstvou buněk prašníků, hraje rozhodující roli v zásobování živinami vyvíjejících se mikrospor. Selhání tapeta je příčinou mnoha typů přírodní samčí sterility.

Určité tapetum-specifické geny a jejich promotory byly dříve izolovány z dvouděložných i jednoděložných rostlin. Například WO 92/11379 popisuje pA3 a pA9, které pravděpodobně představují první doposud izolované exprimované tapetum-specifické promotory. Byly také popsány geny jednoděložných rostlin, které jsou podobné A9. Patří sem sekvence s kódovacími úseky, u kterých se předpokládá, že když u nich dojde k translaci, tak kódují protein s homologii A9. Například sem patří • * • · · ·

3····· ·· · ·· « ····«·· ···· € • · · ♦ « · · C »·· » ► ·· ·· » · ·« ···· kukuřičný promotor Msf14 (Wright SY, a kol., Plant J. 1993 (1): 41-9.), který je téměř identický s, a proto je pravděpodobně stejný jako, Ca444 (WO 92/13957); Osg4 z rýže (Tsuchiya a kol., Plant Mol. Biol., 26(6): 1737-46); a LH6 a LH7 z lilie. Navíc je několik jednoděložných tapetum-specifických cDNA nebo promotorů izolovaných z jednoděložných rostlin, které nejsou podobné A9. Patří sem Ca455 a jejich promotor pA55 z kukuřice (WO 92/13957); pE1 a pT72 z rýže (WO 92/13956); a pOSG6B z rýže (Tsuchiya a kol., viz výše).

Nejsou zmínky, že by kterýkoli z těchto promotorů mohl tvořit základ účinného AMS systému u jednoděložných rostlin, za použití výhodného AMS genu sterility jako je PR-glukanáza. Navíc určité promotory jako je pA3 a pA9, ačkoliv jsou účinné u určitých dvouděložných roslin, jako je rajče (WO 97/38116), pokud jsou navázány pouze na PR-glukanázu, produkují nízký výskyt kompletní samčí sterility u jiných dvouděložných rostlin jako je tabák (Worrall a kol., The Plant Cell, 4:759-771 (1992)). V poslední době jsme identifikovali další promotory, které jsou více účinné při vytváření samčích sterilních jedno- a dvouděložných rostlin za použití výhodného genu sterility jako je PR-glukanáza, než ostatní dříve popsané promotory.

Podstata vynálezu

V prvním aspektu tento vynález poskytuje rekombinantní nebo izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nebo sestávající z promotoru, který je:

i) sekvencí pMAC2 promotoru, jak je to vyobrazeno na obr. 7;

ii) sekvencí pMAC20 promotoru, jak je to vyobrazeno na obr. 12;

iii) promotorem řídícím expresi kódovací sekvence, který je podstatně homologický s těmi na obr. 3 nebo obr. 6; nebo iv) sekvence schopná hybridizace za přísně řízených podmínek na kterékoli z i), ii) nebo iii) sekvencí.

Takové promotory jsou tapetum-specifické. To v kontextu tohoto vynálezu znamená, že tyto promotory primárně řídí expresi do tapeta.

V kontextu tohoto vynálezu termín „podstatně homologický“ znamená, že zmíněná sekvence má větší stupeň homologie s kteroukoli sekvencí zde popsanou, než se sekvencemi nukleové kyseliny dosavadního stavu techniky.

Pokud porovnáme sekvence nukleové kyseliny pro účely určení stupně homologie, lze použít programy jako je BESTFIT a GAP (od Wisconsin Package™, • · · ·

Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisc. USA). Například BESTFIT porovnává dvě sekvence a vytváří optimální uspořádání nejpodobnějších segmentů za použití algoritmu od Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482489, 1981). GAP umožňuje uspořádání sekvencí po celé jejich délce a vyhledává optimální uspořádání vkládáním volných míst do kterékoli vhodné sekvence za použití algoritmu od Needleman a Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). V kontextu tohoto vynálezu při diskutování homologie sekvencí nukleové kyseliny se porovnává uspořádání sekvence po celé její délce.

Výhodně mají sekvence s podstatnou homologií alespoň 50% sekvenční homologii, výhodněji alespoň 75% sekvenční homologií a nejvýhodněji alespoň 90% nebo 95% sekvenční homologií se zmíněnými sekvencemi. V některých případech může být sekvenční homologie 99% nebo více.

Odborník v oboru ocení podstatnou věc, že kterákoli sekvence funguje jako promotor a bude řídit expresi primárně do tapeta.

V kontextu tohoto vynálezu vhodné „přísně řízené podmínky“ jsou definovány tak, jak jsou uvedené v Plant Genetic Transformation a Gene Expression: A laboratory manual, Ed. Draper, J. a kol., 1988, Blackwell Scientific Publications, str.252-255, modifikované jako: prehybridizace, hybridizace a praní při 55-65 °C, bez finálního praní (s 0,5X SSC, 0,1% SDS).

Navíc je možné odvodit základní části regulačního enzymu od zde poskytnutých promotorů. Proto tyto části promotorové sekvence, které jsou zodpovědné jak za jejich funkci jako promotor, tak, což je důležitější, za jejich tapetum-specificitu, mohou být izolovány a začleněny do molekul nukleové kyseliny, která ačkoliv nepatří do definicí (i) až (iv) uvedených výše, přesto funguje ve stejném smyslu.

Proto, v druhém aspektu, tento vynález poskytuje rekombinantní nebo izolovanou molekulu nukleové kyseliny, obsahující nebo sestávající z jedné nebo více regulačních částí odvozených od kterékoli ze sekvencí (i) až (iv) schopných řídit expresi v tapetum-specifickém smyslu.

Navíc předpokládaný pMac2 protein vlastní signální peptid, který vybírá protein pro sekreci v endoplazmatickém retikulu (viz příklad 5), což zabraňuje přístupu MAC2 k ribozomúm tapetálních buněk. Odstranění signálního peptidu umožňuje akumulaci MAC2 proteinu v cytosolu a inaktivuje ribozomy, které způsobují smrt buněk. Proto MAC2 protein, kterému chybí signální peptid, může být použit jako ablátor buněk. Proto v dalším aspektu, tento vynález poskytuje rekombinantní nebo izolova• · »· · · ·*· · ·· · · »·· · w · · · · · _ ···«· · · · · * ·

..... ...... .

nou molekulu nukleové kyseliny kódující MAC2 protein bez jeho přirozeného signálního peptidu.

Taková nukleová kyselina lze obdržet prostředky PCR rozšíření sekvence, viz obr. 3, za použití vhodných primerů o sekvenci:

5’ CCCATGGCCTCCACCGCCTATCC 3’

5’ GCCGCGGTAATTACCAGTATCTACTTCC 3’ nebo sekvence, která takto hybridizuje za přísně řízených podmínek. Takové primery tvoří další aspekt tohoto vynálezu.

Je vhodné, je-li molekulou nukleové kyseliny ve výše uvedených aspektech tohoto vynálezu molekula DNA.

Tapetum specifické promotory tohoto vynálezu mají použití v AMS systémech. Proto se mohou použít pro řízení exprese různých DNA sekvencí sterility, které kódují RNA proteiny nebo polypeptidy, které způsobují selhání mechanismů produkujících životaschopné samčí gamety. Je výhodných několik tříd a jednotlivých příkladů sekvencí samčí sterility.

Například DNA samčí sterility může kódovat lytický enzym. Lytický enzym může způsobovat lyži jedné nebo více biologicky důležitých molekul jako jsou makromolekuly obsahující nukleovou kyselinu, protein (nebo glykoprotein), uhlovodík a za určitých podmínek tuk.

Ribonukleáza Qako je Rnáza T1) a barnáza jsou příklady enzymů, které způsobují lyži RNA. Glukanáza je příkladem enzymu, který způsobuje lyži uhlovodíku. Enzym kaláza (3-(1,3)-glukanáza) je přirozeně produkována v prašnících, kde má funkci uvolňovat mladé mikrospory z ochranného obalu polyglukanu (kalóza) položeného před meiózou. Výskyt enzymové aktivity je postupně regulován tak, aby se shodoval se správným stupněm vývoje mikrospory.

Jednou výhodou použití glukanázy jako DNA samčí sterility je, že je méně náchylná k potencionálním problémům ektopické exprese. Za určitých okolních podmínek nebo na určitém stupni vývoje je možné, že transgeny budou v malých hladinách exprimovány ektopicky. Tato exprese může být způsobena aktivací genů a promotorů obklopujících transgen nebo expresí transaktivátorů, které se váží v okolí transgenu (poziční efekt). Nelze předpokládat, zda jednotlivý transgen bude ektopicky aktivovaný za daných okolních podmínek nebo za daného stupně vývoje, takže genomická sekvence obklopující každý transgen může být jedinečná. Takto to bude, dokud stávající transformační technologie budou vést k nepředvídatelné inte• · • · · · • · β ····· ··· ·· t• · · · · ·· · · · · «· · · · · * · ·· «··· graci transgenu do genomu. Takové problémy nepředvídatelné exprese transgenu jsou celkem vážné u vysoce aktivních buněčně nespecifických cytotoxických transgenů jako je barnáza. Uvádělo se, že jeden barnázový protein může způsobit buněčnou smrt. Zkoumání širokého pole barnázových transformantů eliminuje většinu transformantů, u kterých se taková ektopická exprese vyskytuje. Přesto je toto zkoumání pracné a je zde vždy možnost, že podmínky způsobující ektopickou expresi se nevyskytnou před uvedením rostlinné linie na trh.

Tento problém ektopické exprese barnázy se může minimalizovat „konstitutivní“ expresí inhibitoru barnázy, barstaru, tak, že je exprimován ve všech typech buněk bez ohledu na typ cílové buňky (např. tapetum prašníků). Přesto konstitutivní exprese barstaru může být nežádoucí, jelikož všechny jedlé části rostliny nyní obsahují protein barstar. Také ne všechny typy buněk mohou mít dostatečně chráněnou expresi barstaru.

Glukanáza a barnáza představují výhodná provedení lytického enzymu pro použití s molekulami nukleové kyseliny tohoto vynálezu.

Další výhodou je, že PR glukanázový systém je více „přirozený“, než systém barnázový. Předčasná exprese PR-glukanázy napodobuje nebo fenokopíruje přirozený samčí sterilní čirok a mutanty petúnií (Worrall a kol., (1992) Plant Cell. 4, 759771).

DNA samčí sterility nemusí kódovat lytický enzym. Další příklady DNA samčí sterility kódují enzymy, které katalyzují syntézu fytohormonů, jako je izopentyl transferáza, která je zapojena do syntézy cytokininu a jednoho nebo více enzymů zapojených do syntézy auxinu. Další příklad DNA samčí sterility kóduje RNA enzym (známý jako ribozym) schopný vysoce specifického štěpení dané cílové sekvence (Haseloff and Gerlach, Nátuře 334 585-591 (1988)).

Jiné DNA samčí sterility obsahují antimediátorové sekvence. Zavedení kódovacího úseku genu v obráceném směru oproti směru, který lze najít v přírodě, může vést k poklesu regulace genu a tudíž k produkci nižšího množství, nebo k vůbec žádnému produktu genu. RNA přepsaná z antimediátorové DNA je schopná se navázat na mediátorovou RNA, která má sekvenci, kterou lze normálně najít v buňce, čímž ruší její funkci.

Pro antimediátorovou DNA není rozhodující, jestli je přepsaná pouze když se tvoří transkript o přirozeném směru. Antimediátorová RNA se bude obyčejně vázat jen pokud je přítomen antikódující komplementární řetězec, a tak bude mít toxický účinek jenom pokud se přepíše antikódující řetězec.

V dalším aspektu tento vynález poskytuje sadu primerů vhodných pro PCR rozšíření úseku promotoru MAC2 genu kukuřice o následující sekvenci:

3' GGTCGACTTGGAATAATTTAAGTTGT 5’

3' GATCACCATGGTACTACTCCAC 5' nebo o sekvenci, která takto hybridizuje za přísně řízených podmínek.

Použité primery lze použít pro rozšíření promotoru z kukuřičné genomické DNA. Odborník to ocení přesto, že ty samé primery mohou být použity pro PCR rozšíření z jiných jednoděložných rostlin jako je rýže, pšenice a lilie.

DNA podle tohoto vynálezu může být ve formě vektoru. Takové vektory tvoří další aspekt tohoto vynálezu. Vektor může být například plazmid, kosmid nebo fág. Vektory často obsahují jeden nebo více selektivních signálních genů, které umožňují selekci transfektovaných nebo transformovaných buněk a umožňují selekci buněk přechovávajících vektory se zabudovanou heterologní DNA. Mezi příklady takového signálního genu patří antibioticky rezistentní geny (EP-A-0242246) a glukuronidázu (GUS) exprimující geny (EP-A-0344029). Exprese signálního genu je výhodně řízena druhým promotorem, který dovoluje expresi v buňkách jiných než je tapetum, proto umožňuje selekci buněk nebo tkáně obsahující signální gen v kterémkoli stupni regenerace rostliny. Výhodný druhý promotor je odvozen od genu, který kóduje 35S podjednotku viru mozaiky květáku (CaMV) obalového proteinu. Nicméně lze použít jakýkoli vhodný druhý promotor.

Klonovací vektory mohou být zavedeny do E. Coli nebo jiného vhodného hostitele, který umožňuje jejich manipulaci. Sekvence nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu může být zavedena do buněk rostlin jakýmkoli vhodným způsobem. Proto podle dalšího aspektu tohoto vynálezu, je poskytnuta rostlinná buňka obsahující molekulu nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu. Výhodně je tato rostlinná buňka transgenní.

Nukleové kyselina se může přetransformovat do rostlinných buněk za použití neaktivovaného Ti-plasmid vektoru a za přenosu agrobakterií způsoby běžnými v oboru, například tak, jak je popsáno v EP-A-0117618 a EP-A-0270822. Alternativně může být zavedena cizí nukleová kyselina přímo do rostlinných buněk za použití zdroje částic. Tento způsob může být výhodný např. pokud cílová rostlina je jednoděložná.

·· tt· · · · · · · ·· «· • * Μ ·· · ·«»· ····· tttt · «« ·

Celá rostlina může být regenerována z jedné transformované rostlinné buňky. Proto v dalším aspektu tento vynález poskytuje transgenní rostliny (nebo jejich části, jako rozmnožovací materiál, který také může být transgenní) obsahující sekvence nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu. Regeneraci lze provést známými metodami. Když transformovaná rostlina kvete, lze vidět, že je samčí pohlaví sterilní tím, že není schopná produkovat životaschopný pyl. Tam, kde je pyl produkován, lze potvrdit, že není životaschopný tím, že nezpůsobí tvorbu semene u cílové rostliny.

V posledních aspektech tento vynález poskytuje:

(a) použití molekul nukleové kyseliny tohoto vynálezu při transformaci hostitelské buňky, výhodně buňky rostlinné, a nejvýhodněji buňky jednoděložné rostliny; a (b) použití molekul nukleové kyseliny tohoto vynálezu při produkci samčí sterilní rostliny.

Výhodné znaky pro každý aspekt jsou takové, jako pro kterýkoli jiný aspekt mutatis mutandis.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález teď bude popsán pomocí následujících příkladů, které by neměly být konstruovány tak, že by nějakým způsobem limitovaly rozsah tohoto vynálezu. Příklady popisují přiložené obrázky, kde:

Obr.1 - znázorňuje RT-PCR data pro Mac2. Zdroj kukuřičné RNA použitý v každé reakci je uveden pod gelem. -RT reakce jsou kontrolní reakce bez reverzní transkriptázy. +RT reakce obsahují reverzní transkriptázu. Je zaveden 1 kb Ladder (Gibco BRL) jako signální gen velikosti DNA na kterékoli straně pruhů obsahujících RT-PCR produkty.

Obr.2 - znázorňuje in šitu data pro Mac2. Části samčího kvetu se sondovaly pomocí značeného antikódujícího Mac2 jako kontroly (A) nebo značeného kódujícího Mac2 (B). Tapetum lze pozorovat jako silně označené (černé kruhy) jen antikódujíci sondou.

Obr.3 - znázorňuje sekvenci Mac2 cDNA. Předpokládaná sekvence aminových kyselin proteinu Mac2 je znázorněna pod sekvencí DNA. Primery použité pro TAIL-PCR jsou znázorněny nad sekvencí cDNA.

• · · · • · · · * · • ···· · · · ·

Obr.4 - znázorňuje seřazení Mac2 s typem 1-RIPy. Vstupní kódy do genové banky pro sekvence jsou: kukuřičný RIP3 (M83926), ječmenný RIP1 (M62905, M36990) a pšeničný tritin (D13795).

Obr.5 - znázorňuje RT-PCR data pro Mac20. Zdroj kukuřičné RNA pro každou reakci je dán pod gelem. -RT reakce jsou kontrolní reakce bez reverzní transkriptázy. +RT reakce obsahují reverzní transkriptázu. Je zaveden 1 kb Ladder (Gibco BRL) jako signální gen velikosti DNA na kterékoli straně pruhů obsahujících RT-PCR produkty.

Obr.6 - znázorňuje sekvenci Mac20 cDNA. Předpokládaná sekvence aminových kyselin proteinu Mac20 je znázorněna pod sekvencí DNA.

Obr.7 - znázorňuje TAIL-PCR sekvenci Mac2T-3. AD1 a Mac2T3 primery použité na PCR této sekvence jsou znázorněny nad sekvencí DNA. Rozdíly nukleotidů v porovnání Mac2T-1 a jiných TAIL-PCR produktů jsou znázorněny pod sekvencí DNA (- = chybějící nukleotid). Sekvence aminokyselin předpokládaného Mac2 peptidu je znázorněna pod sekvencí DNA: Sekvence primerů použitých na PCR promotoru jsou znázorněny ve spodní části nad TAIL-PCR sekvencí. Dva rozdíly v sekvenci u PCR produktu v porovnání se sekvencemi TAIL-PCR jsou znázorněny nad sekvencí TAIL-PCR.

Obr.8 - je schématický diagram pMac2-GUSbin

Obr.9A - znázorňuje schématický diagram pMac2-barnázového binu. Obrázky 9B-D znázorňují úzké průřezy pMac2-barnázových prašníků tabáku, jak jsou vidět pod světelným mikroskopem. Obr.9B znázorňuje samotný pylový váček z divokého druhu rostliny; obr.9C znázorňuje jeden pylový váček rostliny nesoucí strukturu Mac2-barnázy; a obr.9D znázorňuje pohled o malém zvětšení na úsek prašníků Mac2-barnázové rostliny, u které všechny čtyři pylové váčky jsou viditelně zborcené.

Obr. 10A - znázorňuje schématický diagram pMac2-PR-glukanázového binu. Obrázky 10B a 10C znázorňují fluorescenční mikrosnímek čtveřice mikrospor jak divokého, tak transformovaného tabáku, při obarvení kalózy anilinovou modří. Obr. 10D a E znázorňují rastrovací elektronové mikrosnímky tabákových mikrospor/pylu jak od divoké, tak i transformované rostliny.

Obr. 11 - znázorňuje A) část DNA sekvence pMac2 ukazující, kde se váží ÁMac2F a AMac2R primery; a B) schématický diagram pA9-AMac2.

Obr.12 - znázorňuje pMac20 genomickou sekvenci s předpokládanou Mac20 peptidovou sekvencí znázorněnou pod DNA sekvencí.

• « • · » *

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace kukuřičných cDNA představující transkripty tapetum-specifických genů exprimovaných před uvolněním mikrospor

U většiny druhů rostlin je stádium mikrosporogeneze v prasnicích silně korelující s délkou květních pupenů a prašníků (Scott a kol. (1991) Plant Mol Biol. 17, 195207). Mikroskopická analýza prašníků kukuřice druhu A188 stanovila následující korelaci mezi délkou prašníků a vývojovou fází: 0 - 2 mm = před stádiem tetrád. 2 4 mm = tetrády, uvolnění mikrospor a volné mikrospory. 4 - 6 mm = volné mikrospory.

Aby se použil samčí systém sterility na základě předčasné degradace kalózy (P-(1,3)-vázaný glukan) vytvořené při meióze, je nutné izolovat promotor genu, který je vysoce exprimován během vývojové fáze, kdy kalóza obklopuje mikrosporocyty, mikrosporocyty podstupující meiózu a tetrády. Proto je nezbytně nutné, aby se tento promotor exprimoval před uvolněním mikrospor (MR). Promotor by měl také být exprimován v tapetu a/nebo v mikrosporocytech. Takové promotory jsou samozřejmě potenciálně užitečné v systémech samčí sterility, které nejsou založeny na předčasné degradaci callózy.

Následně se oddělilo a analyzovalo 100 mg prašníků, které obsahují mikrosporocyty před uvolněním mikrospor (<MR), ze samčích květů kukuřice druhu A188, a izolovalo se 13 pg celé RNA za použití Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Použilo se 840 ng celé RNA pro konstrukci cDNA knihovny v Lambda gt11 za použití Capfinder PCR kit (Clonetech) podle instrukcí výrobce.

Abychom zajistili sondy pro diferenční prozkoumání této <MR cDNA knihovny, připravila se cDNA z <MR prašníků, 0 - 2 mm prašníků, A9-barnázového prašníků a RNA semenné rostliny a byly označeny DIG za použití DIG-High Prime kit (Boehringer Mannheim). Tato cDNA se použila pro zkoumání destiček z knihovny podle způsobů poskytnutých Dig User's Guide od Boehringer Mannheim. Nejdřív byla diferenčně zkoumána <MR cDNA knihovna s kukuřičnými semennými rostlinami a <MR prašníkovými sondami. 42 destiček, které potencionálně představovaly kódy spéciπ • 4 ·· · · ···· ·· · · «·· · · · ··«· ····· · · · · · · fické pro prašník, bylo přezkoumáno oproti semenné rostlině, prašníku, a také znovu oproti A9-barnázovým prašníkovým sondám (transformace kukuřice chimérickým genem A9-barnázy (Paul a kol., Plant Molecular Biology 19 611-622 (1992)), což vedlo k samčím sterilním rostlinám v důsledku ablace tapeta prašníků. Proto pokud destička představuje kód exprimovaný do tapeta prašníků, hybridizační signál by neměl být přítomen, nebo by měl být redukován. Toto druhé zkoumání ukázalo, že 26 destiček představovalo kódy přítomné v RNA fertilního prašníku, ale nepřítomné v semenné rostlině ani v barnázové RNA prašníku.

cDNA se zpracovalo pomocí PCR z Lambda gt11, znovu nakloňovalo do pGEM-T (Promega) a určila se DNA sekvence. Tato analýza ukázala, že těchto 26 cDNA sestávalo z 8 skupin. Byly namodelovány dva primery ke každé z 8 skupin a použilo se RT-PCR pro determinaci prostorového uspořádání exprese a k ověření prostorové exprese klonů. RNA použitá v této analýze byla z <MR, A9 barnázy, 0 - 2 mm, 2 - 4 mm a 4 - 6 mm prašníků. Při tomto zkoumání se vybraly dva klony, Mac2 a Mac20, které potencionálně představují silně exprimované tapetum-specifické a/nebo mikrosporocyty-specifické geny exprimované před vypuštěním mikrospor.

i) Mac2

Tato cDNA byla representována osmkrát v 26 cDNA, což vyplývá z druhého zkoumání. RT-PCR data (obr.1) ukazují početné zastoupení Mac2 mRNA v 0 - 2 mm prašnících, také je přítomna v nižším množství ve starších prašnících (2-4 mm), které jsou výrazně po uvolnění mikrospor, ale není přítomna ve starších 4 - 6 mm prašnících. Překvapivě je také Mac2 mRNA přítomna v A9-barnázových prašnících (obr.1, pruh 8), kde je tapetum ablatováno.

Byla provedena in šitu analýza segmentovaných prašníků na základě popisu v Boehringer Mannheim Non-Radioactive In Šitu Hybridisation Manual. Byly vyseknuty 15μιη a 30pm segmenty pomocí kryostatu (Shandon). RNA sondy byly označeny pomocí DIG RNA značkovací sady (Boehringer Mannheim) podle instrukcí výrobce a hybridizace proběhla přes noc při 42 °C. Výsledky (obr.2) ukazují, že Mac2 mRNA je přítomná v tapetu kukuřičných prašníků a není přítomná ve stěně prašníků. Jestliže Mac2 je tapetum-specifické, zjištění, že Mac2 mRNA je také přítomná v A9-barnázových prašnících, ukazuje, že v kukuřici je exprimován Arabidopsis thaliana A9-tape• * • · « · • · · ·· · ··«· ····· ·· · ·· « tum-specifický promotor po výskytu Mac2 mRNA. Toto naznačuje, že promotor Mac2 bude exprimován dříve než promotor pA9, a proto bude nadřazený při předčasné expresi p-(1,3)-glukanázy.

DNA sekvenční analýza ukazuje, že nejdelší Mac2 cDNA předpokládané kóduje 297 aminokyselinový protein s předpokládaným signálním peptidem předpovídaným programem Signál P (Neilson a kol., (1997) Protein engineering 10 1,6) (obr.3). Databázové vyhledávání ukazuje, že Mac2 předpokládaný protein vykazuje nízkou homologii s typem 1-ribosom inaktivujícím proteinům (RIP) z kukuřice, pšenice a ječmene, které jsou exprimovány v semenech (obr.4). Nejlepší homologie je s Kukuřičným RIP3 se 17% identitou na proteinové úrovni (Clustal V score of 14,1). Southern analýza ukázala, že Mac2 cDNA hybridizuje ve 3 nebo 4 pásech v kukuřičné genomické DNA vyseknuté pomocí EcoRI. Hybridizace probíhala při 65 °C za použití Digoxigeninem-označené Mac2 sondy, jak je popsáno v Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Methods in Molecular Biology Vol.28 (1994) Ed. Isaac PG Humana Press lne.

(ii) Mac20

Tato cDNA byla jednou zastoupena v 26 cDNA vzniklých ze sekundárního zkoumání. RT-PCR data (obr.5) ukazují Mac2 mRNA početně zastoupenou v 0 2 mm prašnících, je také přítomna ve velmi sníženém množství ve starších prašnících (2 - 4 mm), které jsou do velké míry po uvolnění mikrospor, ale chybí ve starších 4 - 6 mm prašnících. Slabý signál je také přítomen v A9-barnázových prašnících (obr.5, pruh 8), což opět indikuje, že Mac20 mRNA může být exprimována před aktivitou pA9 v kukuřici.

Sekvencování ukazuje, že Mac20 cDNA předpokládané kóduje 103 aminokyselinový protein s předpokládaným signálním peptidem předpokládaným programem Signál P (Neilson a kol., (1997) Protein engineering 10 1,6) (obr.6). Mac20 DNA sekvence a domnělý protein Mac20 nevykazují žádné výrazné zmínky v DNA a proteinových databázích. Southern analýza ukázala, že Mac20 cDNA hybridizuje v asi 5 pásmech v kukuřici BamHI a pomocí EcoRI-vyseknuté genomické DNA a 3 pásmy v Hindlll-vyseknuté pšeničné genomické DNA. Hybridizace probíhala při 65 °C za použití Digoxigeninem-označené sondy tak, jak je popsáno v Protocols for • · • · • · · «

Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Methods in Molecular Biology Vol. 28 (1994) Ed. Isaac PG Humana Press lne.

Příklad 2

Izolace a charakterizace úseku promotoru kukuřičného genu Mac2

TAIL-PCR se použilo pro izolaci sekvence 5' z genu Mac2 z kukuřičné genomické DNA. TAIL-PCR se provedlo metodou podle Liu a kol., Plant Journal 8 457463 (1995). Byly sestaveny tři Mac2 specifické primery:

Mac2t1 (5-AGT CAT CAA TGG CTA TGG CCA G-3'), která se váže na pozicích 343-322 bp Mac2 cDNA (obr. 3); Mac2t2 (5'-CGT ATC TTT GCA TGA CCT CTT GG-3'), která se váže na 232-210 bp (obr. 3) a Mac2t3 (5’-GTG GAG GTG CAA AAC AGC AGG T-3'), která se váže na 103-82 bp (obr. 3). Tyto primery byly individuálně použity s degenerativním primerem AD1 (5'-NTCGASTWTSGWGTT-3') ve třech kolech PCR začínající kombinaci AD1 s většinou 3' Mac2 primeru a končící AD1 s většinou 5' Mac2 primeru.

1,3 kb TAIL-PCR produkty byly klonovány do pGEM-T. 2 klony, Mac2T-1 a Mac2T-3, byly kompletně sekvenovány a 6 klonů Mac2T-2/4/6/7/8/9 bylo částečně sekvenováno. Obdržené konvenční sekvence obsahují nejistoty na pěti pozicích: 86bp (T nebo C), 347bp (zbytky 7 nebo 8 A), 555bp (zbytky 8 nebo 9 A), 665bp (G nebo A) a na 754bp (G nebo A) (obr.7). Z této sekvence byly sestaveny dva primery (obr.7) pomocí PCR z 1,2kb úseku předpokládaného promotoru z kukuřičné genomické DNA:

3' GGTCGACTTGGAATAATTTAAGTTGT 5’ = nový Mac2P5'

3' GATCACCATGGTACTACTCCAC 5' = mAC2p3'N

5' primer zavedl Sal lokalizaci a 3' primer Ncol lokalizaci (okolo iniciačního ATG kodónu předpokládaného Mac2 proteinu) pro usnadnění následného klonování. PCR produkty byly klonovány do pGEM-T (Promega) a sekvenovány. Klon, který obsahuje sekvenci nejvíce podobnou konvenční TAIL-PCR sekvenci, byl pojmenován pMac2Prom. Tato sekvence byla identická s TAIL-PCR konvenční sekvencí, kromě záměny T za C na pozici 762bp a zrušení T zbytku na pozici 893bp (obr.7).

• · • · • · · · • ·

Pro charakterizaci prostorové a temporální exprese vzorce řízené 1,2kb Mac2 promotorovým úsekem (pMac2) byl tento úsek spojen s referentním genem β-glukuronidázou (Jefferson a kol., EMBO J 6 3901 (1987)) a transformován do tabáku a kukuřice. Fragment Sall pMac2 se vyseknul z pMac2Prom a klonoval do Sall lokalizace v pBluescript KS+ (Stratagen), tvořící pKSMac2Prom, takže Ncol lokalizace v pMac2 byla sousedící s lokalizací Xhol v pBluescript KS+. Fragment Ncol-Xhol obsahující GUS intron+CaMV polyadenylační sekvenci, byl klonován z pDH68 (WO 99/13089) mezi Ncol a Xhol lokalizacemi v pKSMac2Prom tvořící pMac2-GUS. Úsek pMac2-GUS-CaMVpolyA byl poté vyseknut z pMac2-GUS jako Hindlll, Xhol fragment a klonován mezi lokalizace Hindlll, Sall binárního vektoru pBin19 (Bevan MW, (1984) Nucleic Acid Research 12, 8711-8721) tvořící pMac2-GUS bin (obr.8).

pMac2-GUSbin byl transferován do agrobakteriálního kmene LBA4404 a transformován do N. tabacum za použití agrobakteriální techniky na základě listů. Transformované rostliny N. tabacum vykazují GUS expresi v tapetu prašníků. Exprese začíná před uvolněním mikrospor.

pMac2-GUS byl také transformován do kukuřice za použití standardního způsobu bombardování částicemi. Transformované kukuřičné rostliny vykazují GUS expresi v prašnících o délce 0 - 2 mm s lokalizací exprese do tapeta. Exprese pMac2GUS v tapetu kukuřice je mnohem silnější než později pozorovaná exprese u pA3GUS, pA6-GUS a pA9-GUS transformované kukuřice. Toto ukazuje, že pMac2 je nadřazený v kukuřici před A.thaliana promotory A3 (WO 92/1179), A9 (WO 92/1179) a A6 (WO 93/02197) pro aplikace, které vyžadují výraznou expresi do tapeta.

Příklad 3

Stavba chimérického pMac2-barnázového genu a jeho exprese v transgenních rostlinách

Pro demonstraci prospěšnosti pMac2 promotoru v produkci samčích sterilních rostlin a pro další charakterizaci prostorové a temporální pMac2 exprese vzorce, byl pMac2 spojen s ribonukleázbarnázou (Hartley, RW J.Mol.Biol (1988) 202, 913-915). Fragment Sall, Ncol 1224bp Mac2 promotoru byl vyseknut z pMac2Prom a klonován mezi lokalizace Sall a Ncol v pWP127 (Paul a kol., Plant Molecular Biology 19 611622 (1992)). Výsledný plasmid (pMac2-barnázy) byl stráven Sstl a EcoRV a pMac2• ·· · • · • · • · · · barnáza-CaMVpolyA chimérický gen byl transferován do Sstl, Smál lokalizací binárního vektoru pBin19 za tvorby pMac2-barnázového binu (obr.9).

pMac2-barnázový bin byl transferován do agrobakteriálního kmene LBA4404 a transformován do N. tabacum. Transformované rostliny N. tabacum jsou fenotypicky divokým druhem, kromě samčí sterility způsobené ablací tapeta. Obr.9 ukazuje výsledky mikroskopické analýzy prašníků divokého druhu transformovaných rostlin tabáku. U divokého druhu (obr.9B) je vidět, že pylové váčky mají dobře vyvinuté tapetum (obr. 9B, T) a mikrospory ve stádiu tetrád (obr.9B, M). Přesto u transformovaných rostlin je pylový váček zborcený a chybí mu jednoznačně ohraničené tapetum a mikrospory (obr.9C). Tato rostlina byla samčí sterilní, ale samičí fertilní.

pMac2-barnáza byla také transformována do kukuřice za použití standardní metody bombardování částicemi. Všech 8 transformovaných rostlin byly transformované rostliny kukuřice a byly fenotypicky divoké druhy, kromě samčí sterility způsobené ablací tapeta.

Příklad 4

Stavba chimérického pMac2-PR-glukanázového genu a jeho exprese v transgenních rostlinách

Za účelem vytvoření samčích sterilních rostlin předčasným rozpuštěním kalózy byl pMac2 spojen s PR glukanázovým genem (Worrall a kol., (1992) Plant Cell. 4, 759-771). Fragment Sáli, Ncol 1224bp Mac2 promotoru byl vyseknut z pMac2Prom a klonován mezi lokalizace Sáli a Ncol v pDW80PR (Worrall a kol., (1992) Plant Cell. 4, 759-771). Výsledný plasmid (pMac2-PRG) byl stráven Sstl a EcoRV a pMac2-PR Glukanáza-CaMVpolyA chimérický gen byl transferován do Sstl, Smál- štěpu pBinl 9 tvořící pMac2-PRG bin (obr. 10).

pMac2-PRG bin byl transferován do agrobakteriálního kmene LBA4404 a transformován do N. tabacum. Transformované N. tabacum rostliny jsou fenotypicky divoké druhy, kromě jejich samčí sterility. Výsledky mikroskopického zkoumání prašníků z transformovaných rostlin jsou ukázány na obr.10. U divokého druhu (obr.lOB) jsou tetrády prašníků separovány a mají obvyklou morfologii. Každá tetráda má vysoce fluoreskující kalózové přepážky a kalózové vnější stěny. Naproti tomu tetrády extrudované z prašníků transformovaných rostlin jsou nahromaděné pospolu, jak lze • © • · · · · · ···· ····« ·· · ·· · usoudit z fluorescence indukované anilinovou modří. Tetrádám chybí jak kallózové přepážky, tak i vnější stěny (obr.lOC).

Rastrovací elektronové mikrosnímky tabákových mikrospor/pylu jak od divokého druhu, tak od pMAC2-PR glukanázových rostlin jsou ukázané na obrázcích 10D a E, v tomto pořadí. U divokého druhu lze vidět, že má dobře vyvinutá pylová zrníčka s uniformní morfologií, každé zrníčko je separované a kulaté s hladkou pylovou stěnou s častými malými dírkami. Naproti tomu mikrospory transformovaných rostlin jsou velmi nepravidelné a zdá se, že jsou spojené dohromady v malých shlucích.

Silně snížené hladiny kalózy obklopující buňky procházející meiózou a obklopující tetrády, vedou k následné smrti mikrospor a k samčí sterilitě. Častost naprosté samčí sterility byla mnohem větší, než pozorovaná za použití pA9-PR glukanázy (Worrall a kol., viz výše). Cytologicky se fenotyp spojených tetrád podobá fenotypu pA9-PR glukanázových v rajčeti. U takovýchto druhů tvoří pA9-PR glukanáza vysokou častost naprosté sterility.

pMac2-PRG byl transformován v kukuřici za použití standardního způsobu bombardování částicemi. Transformované rostliny kukuřice jsou fenotypicky divoké druhy, kromě samčí sterility způsobené sníženou hladinou callózy v prašnících před vypuštěním mikrospor.

Příklad 5

Exprese modifikovaného Mac2 proteinu v transgenních rostlinách

Předpokládaný Mac2 protein vykazuje homologii s typem 1-RIP (příklad 1). Přítomnost signálního peptidu v Mac2 proteinu jej zaměřuje k sekreci do endoplasmatického retikula, čímž se předchází přístupu Mac2 do ribozomů tapetálních buněk. Oddělení tohoto signálního peptidu dovoluje Mac2 proteinu se akumulovat v cytosolu a inaktivaci ribozomů způsobujících smrt buněk. Proto Mac2 protein bez signálního peptidu (AMac2) je obecně užitečný jako buněčný ablátor a poskytuje rostlinnou odvozenou alternativu k bakteriálnímu barnázovému proteinu. Pro demonstraci užitečnosti tohoto modifikovaného Mac2 proteinu se používá tvorby samčích sterilních rostlin pomocí ablace tapetálních buněk. Tapetum-specifické promotory, které by mohly být použitelné, obsahují samotný pMac2 nebo promotory izolované z i7 ; : j··» · : *· · ϊ i ·* ···· ···· · « · •« · · ·· ·· ·· ····

Arabidopsis jako je pA9 (Paul a kol., Plant Molecular Biology 19 611-622 (1992)).

Spojení pA9-AMac2 je postaveno následovně. Následující primery byly použity pro

PCR Mac2 úseky kódující Mac2 protein, kterému chybí signální peptid (obr.11 A):

5' CCCATGGCCTCCACCGCCTATCC 3' ÁMac2F a

5' GCCGCGGTAATTACCAGTATCTACTTCC 3' ÁMac2R

843bp produkt PCR byl stráven Ncol a SstlI a klonován mezi Ncol a SstlI lokalizacemi p WP112 (WO 92/11379) tvořící pA9-AMac2 (obr. 11b). pA9-AMac2CaMV polyA úsek v pA9-AMac2 byl vyseknut jako Hindlll, EcoRV fragment a klonován mezi Hindlll a Smál lokalizace v pBin19 tvořící pA9-AMac2bin.

PA9-ÁMac2bin byl transferován do agrobakteriálního kmene LBA4404 a transformován do N. tabacum. Transformované N. tabacum rostliny jsou fenotypicky divoké druhy, kromě jejich samčí sterility způsobené ablací tapeta.

PA9-AMac2 byl také transformován v kukuřici za použití standardního způsobu bombardování částicemi. Transformované kukuřičné rostliny jsou fenotypicky divoké druhy, kromě jejich samčí sterility způsobené ablací tapeta.

Příklad 6

Izolace a charakterizace promotorového úseku kukuřičného genu Mac20

Pro izolaci promotorového úseku genu Mac20 se použila inverzní PCR (IPCR). Kukuřičná genomická DNA se strávila pomocí Balí, která se v Mac20 štěpí a recirkuluje s T4 DNA ligázou. Divergentní primerové páry, které se váží uvnitř Mac20, byly použity pro obdržení Mac20 fragmentu pomocí PCR. Sekvencování (obr. 12) ukázalo, že tento fragment byl v oblasti překryvu z 96 % identický s Mac20. Analýza RT-PCR s primery specifickými pro kódovací úseky IPCR Mac20 genu ukázala, že IPCR Mac20 gen má stejnou temporální a prostorovou expresi vzorce jako gen Mac2. Potom lze obdržet delší promotorový úsek z kukuřičné genomické DNA pomocí TAIL PCR v podstatě tak, jak je popsáno v příkladu 2.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rekombinantní nebo izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nebo sestávající z promotoru, který je:

(i) sekvencí pMAC2 promotoru, jak je znázorněna na obrázku 7;

(ii) sekvencí pMAC20 promotoru, jak je znázorněna na obrázku 12;

(iii) promotor řídící expresi kódující sekvence, která je v podstatě homologická se sekvencemi znázorněnými na obrázku 3 nebo obrázku 6; nebo (iv) sekvence schopná hybridizace za přísně řízených podmínek na kteroukoli z (i), (ii) nebo (iii) sekvencí.
2. Rekombinantní nebo izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nebo sestávající z jedné nebo z více regulačních částí odvozených z kterékoli ze sekvencí (i) až (iv) schopných řízení exprese tapetum-specifickým způsobem.
3. Rekombinantní nebo izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující MAC2 protein, kterému chybí jeho přirozený signální peptid.
4. Dvojice primerů o sekvenci:
5' CCCATGGCCTCCACCGCCTATCC 3'

5' GCCGCGGTAATTACCAGTATCTACTTCC 3' nebo sekvence, která na tyto sekvence hybridizuje za přísně řízených podmínek.

5. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, která je molekulou DNA.
6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, 2 nebo 5, která dále obsahuje nukleovou kyselinu, jejíž následná exprese má za následek samčí sterilitu rostliny.
7. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, kde nukleová kyselina samčí sterility kóduje lytický enzym.

«4 ·· • · · • · · ·· ·· ··*·
8. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 7, kde lytický enzym je glukanáza nebo barnáza.
9. Nukleová kyselina podle nároku 8, kde glukanáza je PR-glukanáza.
10. Dvojice primerů o sekvenci:

3' GGTCGACTTGGAATAATTTAAGTTGT 5'

3' GATCACCATGGTACTACTCCAC 5' nebo o sekvenci, která na tyto sekvence hybridizuje za přísně řízených podmínek.
11. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 3 nebo nároků 5 až 9.
12. Hostitelská buňka transformovaná pomocí vektroru podle nároku 11.
13. Hostitelská buňka podle nároku 12, která je buňkou rostlinnou.
14. Hostitelská buňka podle nároku 13, která je buňkou jednoděložné rostliny.
15. Rostlina obsahující jednu nebo více rostlinných buněk podle nároku 13 nebo nároku 14.
16. Použití molekuly nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 při transformaci hostitelské buňky, výhodně rostlinné buňky a výhodněji buňky jednoděložné rostliny.
17. Použití molekuly nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 při produkci samčí sterilní rostliny.
18. Použití podle nároku 17, kde samčí sterilní rostlina je jednoděložná, jako je kukuřice, rýže, lilie nebo pšenice.