CZ20015A3 - Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor, způsob jeho získávání a transformovaná kvasinková buňka - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu pro expresi heterologních proteinů nebo polypeptidů v kvasinkách z kultury transformovaného kvasinkového kmene, který neobsahuje funkční antibiotický rezistentní značkový gen.

Description

OBLAST TECHNIKY

Přítomný vynález se týká exprese proteinů v transformovaných kvasinkových buňkách, DNA konstruktu a vektorů pro použití takovým způsobem a kvasinkových buněk transformovaných s vektory.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Je známé použití transformovaných kvasinkových buněk pro expresi proteinů viz například Evropské patentové přihlášky 0 088 632A, 0 116 201A θ 123 294A, 0 123 544A, 0 163 529A,

123 289A, 0 100 561A, 0 189 998A a 0195 986A, PCT patenty WO 95/01 421, 95/02 059 a WO 90/10 075 a US patent č. 4 546 082.

Obecným charakteristickým rysem výše uvedených způsobů je, že připravený kvasinkový plasmid obsahuje gen pro antibiotický značkovač. Takový značkový gen je vytvořen během počátečních kroků klonování E. coli, kde byl použit pro prověření transformovaných buněk nebo pro udržení plasmidů užívaných jako vektory. Antibiotické značkové geny prý nemají žádný nežádoucí dopad na kulturu transformovaných kvasinkových buněk, a proto je běžnou praxí, nepoužívat žádné kroky vedoucí k deleči takové DNA. Navíc charakterizace plasmidového konstruktu je obyčejně provedena izolací plasmidů z transformovaných kvasinkových buněk a transformace izolovaného plasmidů do E. coli sledovaná antibiotickou selekcí. Pro praktické účely je vhodné udržení antibiotické rezistence značkového genu.

Ačkoliv jak výzkumné laboratoře tak i průmyslová výroba rostlin jsou řízeny velmi přísnými bezpečnostními pravidly, je zde vždy malé riziko, že několik buněk bude náhodou uvolněno do prostředí. Jejich vysoce rafinovaná vlastnost způsobuje, že takové geneticky modifikované mikroorganismy přežijí pouze velmi krátké období a riziko poškození prostředí je extrémně nízké. Toto je samozřejmě důvod, proč takové transformované mikroorganismy jsou schváleny pro použití jak ve výzkumu tak i v celé řadě dalších činností.

Pokud dokonce buňky umírají rychle, plasmidy obsahující rezistentní gen mají stále náhodně sklon být uvolňovány do prostředí, a je zde tedy teoretické riziko zavedení rezistence k antibiotikům v bakteriích, jestliže je plasmid ponechán samovolně.

• · • · ······ ···

2*·· ·· ·· ···· ·· ···

Antibiotika jsou vysoce důležitá při léčbě lidských a zvířecích bakteriálních infekcí. Jakékoliv riziko možné kontaminace prostředí s genem, který uděluje rezistenci vůči antibiotikům by měl být omezen na minimum, pokud je to možné.

Je zde proto potřeba vyvinout více bezpečné způsoby než ty, které jsou používané dosud, to je účel přítomného vynálezu, poskytnout takové zlepšené způsoby.

PODSTATA VYNÁLEZU

Přítomný vynález se týká způsobu exprese heterologních proteinů nebo polypeptidů v kvasinkách, kde kvasinkový transformovaný kmen používaný pro výrobu obsahuje exprimováných vektor, ve kterém antibiotický značkový gen, používaný v počátečních krocích klonování, je nefunkční modifikací in vitro před transformací do kvasničného hostitele. Přítomný vynález se také týká DNA sekvencí a exprimovaných vektorů pro použití takovým způsobem a transformovaných kvasinkových buněk.

Podle jednoho hlediska se přítomný vynález týká rekombinantního kvasinkového exprimovaného vektoru, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci vůči bakteriálním buňkám a obsahujícího genové kódování pro heterologní gen a antibiotický značkový gen, který je nefunkční po in vitro modifikaci.

Podle dalšího hlediska se přítomný vynález týká způsobu pro získání požadovaného polypeptidů Či proteinu, uvedený způsob obsahuje kulturu kvasinkového kmene obsahující vektor, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci k bakteriálním buňkám a obsahujícího genetické kódování pro heterologní gen a antibiotický značkový gen, který je nefunkční po in vitro modifikaci před transformací do kvasinkového hostitele, a izolaci požadovaného produktu z kulturního média.

Způsob podle vynálezu bude příznačně obsahovat kulturu kvasinkového kmene obsahujícího kvasinkový exprimovaný plasmid, ve kterém funkční antibiotický značkový gen používaný v počátečních krocích klonování v bakteriích se stává nefunkční po in vitro deleci části značkového genu nebo celého značkového genu před vložením do kvasinkového hostitele, který je použit pro expresi a sekreci požadovaného polypeptidů nebo proteinu.

Delece antibiotického značkového genu je výhodně uskutečněna vložením vhodných restrikčních štěpících míst na každou stranu antibiotického. rezistentního značkového genu, načež značkový gen je odstraněn in vitro přídavkem vhodného restrikčního enzymu.

Přítomný vynález se také týká transformovaných kvasinkových kmenů obsahujících vektor, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci k bakteriálním buňkám a obsahujícího ·· ·· ·· ·· ·· · ···· ···· ···· ··· ·· · · · ·

2f··· ·· ·· ···· ·· ··· genetické kódování pro heterologní gen a antibiotický značkový gen, který je nefunkční po in vitro modifikaci před transformací do kvasinkového hostitele.

Kvasinkovým kmenem je s výhodou kmen Saccharomyces a zvláště kmen Saccharomyces cerevisiae.

Zde používaný výraz „antibiotický značkový gen“ či „ antibiotický rezistentní značkový gen“ znamená gen, který poskytuje fenotypový výběr transformovaných bakteriálních buněk a amplifikace plasmidu.

Nejběžněji používané antibiotické rezistentní značkové geny v E. coli jsou ampicilin (AMP), chloramfenikol, neomycin, kanamycin a tetracyklinové rezistentní značkové geny.

Zde užívaný výraz „nefunkční značkový gen“ znamená, že značkový gen buď chybí nebo je nefunkční, což je způsobeno odstraněním části genu. Výhodnější je, pokud gen chybí úplně.

Zde užívaný výraz „ in vitro modifikace“ znamená modifikační kroky prováděné na vektoru vně buněčného prostředí.

Zde užívaný výraz „neschopný udělit antibiotickou rezistenci vůči bakteriálním buňkám“ znamená, že antibiotické rezistentní geny jsou nefunkční v jakémkoliv organismu, což je způsobeno popsaným genetickým zacházením.

Zde užívaný výraz „ kvasinkový hostitel“ znamená kvasinkový organismus transformovaný nebo transfikovaný exprimovaným plasmidem či vektorem.

Přítomný vynález je dále vysvětlen s odkazy na dodatečné výkresy kde:

obr.l ukazuje exprimovaný plasmid pAK729, který obsahuje gen exprimující insulinový prekursor řízenou expresí TPI promotorové a TPI terminátorové sekvence z S. cerevisiae a signální vedoucí sekvenci obsahující YAP3 signální peptid a syntetický vedoucí peptid LA19. Konstrukce pAK729 je popsána v WO 97/22706. Plasmid také obsahuje AMP-R sekvenci pBR322/pUC13 zahrnující ampicilínový rezistentní gen a počátek DNA replikace v co//.; obr. 2 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,5 plasmidu používaného pro vytvoření kmene NN729,5, u kterého chybí AMP gen před delecí AMP genu;

obr.3 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,6 plasmidu používaného pro vytvoření kmene NN729,6, u kterého chybí AMP gen před delecí AMP genu;

obr.4 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,6-AAMP plasmidu, ve kterém AMP gen chybí; obr. 5 ukazuje plasmidovou mapu pAK729,7 plasmidu používaného pro vytvoření kmene NN729,7, u kterého chybí AMP gen před delecí AMP genu a obr.6 ukazuje plasmidovou mapu plasmidu pKV228 modifikovaného nahrazením EcoRI (9400-Xbal (1403) kódovací sekvence v pAK729 (obr.l) kódovací sekvencí MF„* Arg³⁴GLP-l₍7.37).

Delece in vitro antibiotického značkového genu je uskutečněna buď použitím přístupných restrikčních míst nebo zavedením vhodných restrikčních míst použitím PCR, místní specifickou mutagenezí nebo jinými dobře známými metodami pro zacházení s DNA sekvencemi sledované přidáním vhodných restrikčních enzymů.

Čtyři modifikované kmeny NN729 byly vytvořeny pro vyhodnocení, zda různé delece v plasmidu ovlivňují výtěžek fermentace insulinového prekursoru nebo kmenové stability během dlouhodobé fermentace (tab.l). Tyto kmeny byly porovnány s původním kmenem NN729 vzhledem k výtěžku fermentace a fermentační stabilitě (tab.2). Navíc tři modifikované kvasinkové kmeny produkující GLP-1 variantu Arg³⁴GLP-1(7-37) vytvořeny pro vyhodnocení, zda různé delece v plasmidu pKV228 obsahujícího AMP gen by mohly ovlivňovat výtěžek fermentace Arg³⁴GLP-l₍7-37) (tab.3).

Plasmidy a kmeny, kde AMP gen a snad okolní sekvence chybí, jsou všechny označeny ,A AMP“.

Modifikované kvasinkové kmeny byly připraveny transformací modifikovaných plasmidů pAK729 nebo pKV228, ve kterých AMP značkový gen a další možné DNA sekvence z původního plasmidu chyběly, do kmenů S. cerevisiae MT663 (E2-7B XE11-36 a/a, AtpiAtpi,pep 4-3/pep 4-3/pep 4-3) nebo ME1719 (MATa/aAyap3..ura3/Ayap3..URA3pep4-3/pep4-3Atpi..LEU2/Átpi..LEU2 eu2/eu2 Áura3/Áura3).

Modifikované plasmidy byly připraveny použitím vhodných restrikčních enzymových míst již přítomných v plasmidu nebo vložením vhodných restrikčních enzymových míst takovým způsobem, že AMP gen může chybět. S modifikovanými plasmidy může být zacházeno in vitro před transformací do S cerevisiae (kmen MT663) takovým způsobem, že AMP gen chybí nebo je nefunkční a následně výslednému kvasinkovému kmenu gen AMP vypadne. Toto možné riziko pro kontaminaci prostředí s AMP genem během použití kvasinkových buněk, je odstraněno. Modifikované plasmidy pAK729 nebo pKV228 jsou štěpeny vhodnými restrikčními enzymy, podrobeny elektroforéze na agaróze, izolovány, znovu ligovány a následně transformovány do příslušných MT663 a ME1719 buněk S. cerevisiae WO 98/01 535.

Protein nebo polypeptid produkovaný způsobem tohoto vynálezu, je kterékoliv heterologní protein nebo polypeptid, který je výhodně tvořen v kvasinkové buňee. Příklady takových proteinů jsou aprotinin, faktor tkáňového inhibitoru nebo další proteázové inhibitory, insulin, insulinový prekursor nebo analoga insulinu, insulin jako růstový faktor I a II, lidský nebo hovězí hormon, interleukin, tkáňový plasminogenový aktivátor, transformační růstový faktor a nebo b, glukagon, glukagon jako peptid 1 (GLP-1), glukagon jako peptid (GLP-2), GRPP, faktor VII, faktor VIII, faktor XIII, růstový faktor krevních destiček a enzymy jako jsou lipázy.

·· 4· • · · • · · · • · · · • · · · · $ ···· ·· »_# „Prekursorem insulinu“ nebo „analog insulinu“ je myšlen jeden polypeptidový řetězec obsahující proinsulin, který je jedním nebo více následnými chemickými a/nebo enzymovými způsoby přeměněn na dvouřetězcovou molekulu insulinu či insulinového analogu majícího správné rozložení třech disulfidových můstků, jak bylo zjištěno v přirozeném lidském insulinu. Insulinové prekursory budou příznačně obsahovat modifikovaný C-peptid nesoucí A a B řetězce insulinu. Navíc s výhodou insulinovému prekursoru chybí B(30) aminokyselinový zbytek. Nejvýhodněji insulinové prekursory jsou ty, které jsou popsány v EP 163 529 a PCT přihláškách 95/00 550 a 95/07 931. Příklady insulinů; jsou lidský insulin, s výhodou des (B30) lidský insulin a prasečí insulin. Výhodné insulinové analogy jsou takové, kde jeden nebo více přirozených aminokyselinových zbytků, s výhodou jeden, dva nebo tři byly nahrazeny jinými kódovatelnými aminokyselinovými zbytky. Tedy v pozici A 21 je u mateřského insulinu místo Asn aminokyselinový zbytek vybraný ze skupiny obsahující Ala, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr nebo Val, zvláště aminokyselinový zbytek obsahující Gly, Ala, Ser nebo Thr. Rovněž v pozici B 28 je u mateřského insulinu místo pro aminokyselinový zbytek vybraný ze skupiny obsahující Asp, Lys atd. a v pozici B 29 je u mateřského insulinu místo Lys aminokyselina Pro.

Výraz „kódovatelný aminokyselinový zbytek“ zde použitý označuje aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem tj. triplet (kodón) nukleotidů.

Používané DNA konstrukty jsou připraveny synteticky stanovené standardními způsoby tj. např. fosfoamidovým způsobem popsaným S. L. Beaucagem a Μ. H. Caruthersem, v Tetrahedron Letters 22, 1981, 1895 až 18966 nebo způsobem popsaným Matthesem a kol. vEMBO J. 3, 1984, 801 až 805. Podle fosfoamidového způsobu jsou oligonukleotidy syntetizovány např. v automatickém DNA syntetizátoru, purifikovány, zdvojnásobeny a ligovány do formy syntetického DNA konstruktu. Běžně výhodným způsobem přípravy DNA konstruktu je polymerásová řetězcová reakce (PCR) např. jak je popsána Sambrookem a kol. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1989.

DNA kód pro požadovaný protein je také genomického nebo cDNA původu např. získaný přípravou genomické nebo cDNA knihovny a prověřením DNA sekvencí kódujících celé polypeptidy nebo část těchto polypeptidů nebo. vynález hybridizací používající syntetické oligonukleotidové sondy podle standardních metod (Sambrook a kol., Molecular Cloning:

A Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor, 1989).

Konečně DNA kódující požadovaný protein je směs syntetická a genomická, syntetická a cDNA nebo směs genomická a cDNA původu připravená připojováním fragmentů syntetických, • ·

·· ·· ·· • · · · · • · · · · · ······ ·· • · · · · · ···· ·· ·· · ··· genomických nebo cDNA původu do kruhu (jak je výhodné), fragmenty odpovídající různým částem úplného DNA konstruktu podle standardních metod.

Rekombinantní exprimovaný vektor je autonomně replikovatelný vektor tj. vektor, který existuje jako extrachromosomální jednotka jehož replikace je nezávislou chromosomální replikací tj. plasmid, extrachromosomální prvek, minichromosom nebo umělý chromosom. Vektor obsahuje kterýkoliv prostředky pro zajištění vlastní replikace. Jinak vektor je ten, který po zavedení do hostitelské buňky, je součástí genomu a je replikovatelný společně s chromosomy, jejíchž je součástí. Vektorový systém je samotný vektor nebo plasmid nebo dva či více vektorů nebo plasmidů, kteří společně obsahují celkovou DNA zabudovanou do genomu hostitelské buňky nebo transpozonu.

Rekombinantní exprimovaný vektor bude obsahovat DNA sekvence kódující požadovaný protein nebo polypeptid spojený s vhodnou promotorovou sekvencí. Promotor je kterákoliv DNA sekvence, která vykazuje transkripční aktivitu v kvasinkách a je odvozeny z genů kódujících v kvasinkách proteiny buď homologní nebo heterologní. Promotor je s výhodou odvozen z genu kódujícího v kvasinkách homologní protein. Příklady vhodných promotorů jsou Saccharomyces cerevisiae Μαΐ, TPI, ADH nebo PGK promotory.

Sekvence DNA kódující požadovaný protein nebo polypeptid je také připojena k vhodnému terminátoru tj. TPI terminátor (T. Alber a G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, 419 až 434).

Rekombinantní exprimovaný vektor tohoto vynálezu bude také obsahovat DNA sekvenci umožňující replikaci vektoru v kvasinkách. Příklady takových sekvencí jsou kvasinkový plasmidový 2 μ replikační geny REP 1 až 3 a počátek replikace. Vektor může také obsahovat selektivní značkovač tj. Schižosaccharomycespompě TPI gen popsaný P. R. Russelem, Gene 40, 1985, 125 až 130.

Konečně exprimovaný vektor bude s výhodou obsahovat signální/vedoucí sekvenci k zabezpečení sekrece požadovaného proteinu nebo polypeptidů v kulturním mediu. Signální sekvence je DNA sekvence, která kóduje polypeptid („ sekreční peptid“), který jako součást většího polypeptidů, jemuž udává směr při jeho sekreci buňkou, ve které je syntetizován. Větší polypeptid je běžně štěpen, čímž dochází k odstranění sekrečního peptidu během průchodu sekreční cestou.

Signální sekreční sekvence kóduje kterýkoliv signální peptid, který zajišťuje vhodný směr přenášeného polypeptidů během sekrece buňkou. Signální peptid je přirozeně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční část nebo je peptidem syntetickým. Používané signální peptidy pró kvasinkové hostitelské buňky jsou ziškáriy z genů pro S. cerevisiae a-faktor a invertáza ze • · ··· ·· ···· ···’········ ······ ··· «· ·· ·<*·· «· ··«

S. cerevisiae, signální peptid myší slinné amylázy (O. Hagenbuchle a kok, Nátuře 289, 1981, 643 až 646), modifikovaná karboxypeptidázový signální peptid (L. A. Valis a kol., Cell 48, 1987, 887 až 897), kvasinkový signální peptid BAR 1 (WO 87/02 670) nebo kvasinkový signální peptid aspartátová proteáza 3 (YAP 3) (M. Egel-Mitani a kol., Yeast 6, 1990, 127 až 137).

Pro vhodnou sekreci v kvasinkách, sekvence kódující vedoucí peptid je také vložena ve stejném směru se signální sekvencí a proti směru DNA sekvence kódující polypeptid. Funkcí vedoucího peptidu je umožnění exprese polypeptidu přímo z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečních váčků pro sekreci do kulturního média (tj. přesun polypeptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň přes buněčnou membránu do periplazmatického prostoru v kvasinkových buňkách). Vedoucí peptid znamená kvasinkový vedoucí faktor (jeho použití je popsáno v US 4 546 082, EP 16 201, EP 123 296, EP 123 544 EP 163 529). Další možností je, že vedoucí peptid znamená syntetický vedoucí peptid, který je vedoucím peptidem, jež nebyl nalezen v přírodě. Syntetické vedoucí peptidy jsou vytvořeny tak, jak je popsáno v WO 89/02 463 nebo WO 92/11 378 a Kjeldsanem a kol., v Protein Expression and Purifícation 9, 1997, 331 až 336.

Výraz „vedoucí peptid“ je chápána jako peptid ve formě propeptidové sekvence, jejíž funkcí je umožnit sekreci heterologního proteinu z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečních váčků pro sekreci do kulturního média (tj. přesun přenášeného proteinu nebo polypeptidu přes buněčnou membránu a buněčnou stěnu, pokud je přítomna, nebo alespoň přes buněčnou membránu do periplazmatického prostoru buňky mající buněčnou stěnu).

Postupy používané pro ligaci DNA sekvencí, kódujících požadovaný protein či polypeptid, promotor nebo terminátor, a jejich vložení do vhodných kvasinkových vektorů obsahujících informace nutné pro replikaci v kvasinkách, jsou dobře známé pro odborníky (např. Sambrook a kol.). Usuzuje se, že vektor je vytvořen buď přípravou DNA konstruktu obsahujícího vloženou DNA sekvenci kódující polypeptid tohoto vynálezu a následně vložení této části do vhodného exprimovaného vektoru nebo sekvenčně vloženými DNA fragmenty obsahujícími genetickou informaci pro individuální prvky ( takové jako signální, vedoucí nebo heterologní protein) pomocí ligace.

Kvasinkový organismus používaný ve způsobu tohoto vynálezu je kterýkoliv vhodný kvasinkový organismus, který při kultivaci produkuje dostatečná množství požadovaného proteinu nebo polypeptidu. Příklady vhodných kvasinkových organismů jsou kmeny vybrané z kvasinkových druhů Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, ·· «· ·* *· ·· · v · · · · * * · · • · · ·· · ·©· .·©·<}·© ···· t ····©· · · · §··......... ·· ···

Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., a Geotrichum fermentans, s výhodou kvasinkové druhy Saccharomyces serevisiae.

Transformace kvasinkových buněk je např. účinná utvářením protoplastu, který je vytvořen transformací způsobem „per se“. Médium používané pro kultivaci buněk je kterékoliv vhodné médium vhodné pro růst kvasinkových organismů. Sekreční heterologní protein, významná část, která bude přítomna v médiu ve správně vytvořené formě, je získána z média vhodnými postupy zahrnujícími separaci kvasinkových buněk z média centrifugací nebo filtrací, precipitací bílkovinných složek supernatantu nebo filtrací pomocí sole tj. síranu amonného, používaného při purifikaci při různých chromatografických metodách tj. iontová rozdělovači chromatografie, afínitní chromatografie apod. Pokud je protein sekretován do periplazmatického prostoru, buňky jsou narušeny enzymaticky nebo mechanicky.

Požadovaný protein nebo peptid je přenášen a sekretován jako N-terminální prodloužený fúzní protein jak je popsáno v WO 97/22 706. N-terminální prodloužení je pak odstraněno ze získaného proteinu in vitro buď chemickým nebo enzymovým štěpením, jak je dobře známo v technice. Je výhodné vést štěpení použitím enzymu. Příklady takových enzymů jsou trypsin nebo proteáza I z Achromobacter lyticus.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Přítomný vynález je dále podrobně popsán v následujících příkladech, které nemají v úmyslu v žádném směru omezovat rozsah vynálezu jak je nárokováno.

Příklad 1

Kvasinkový plasmid pAK729 vytvořený pro expresi insulinového prekursoru (N-koncové prodloužení B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulinového prekursoru, viz WO97/22 706) obsahuje dva ApaLI enzymová restrikční místa ApaLI (4477) a ApaLI (5723) (viz obr. 1)..

Tato restrikční místa jsou umístěna na každé straně AMP značkového genu. Odstranění 1246 nukleotidů mezi dvěmi ApaLI místy vpAK729 odstraní AMP značkový gen a nějakou doplňkovou plasmidovou DNA pocházející z E.coli.

Plasmid pAK729, který byl štěpen restrikčním enzymen ApaLI, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk

S. cerevisiae (MT663, viz EP BO 163 529) poskytující transformační ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ.

Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ a DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou deleci. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ.

Kvasinkový kmen ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru by 1 stanoven RP-HPLC.

Příklad 2

Enzymová restrikční místa Xhol (5676) a Xhol (5720) byla zavedena do pAK729 PCR. Vybrané DNA sekvence výsledného plasmidu pAK729,5 byly následně potvrzeny. Restrikční plasmidovou mapu pAK 729,5 ukazuje obr.2. DNA fragment mezi restrikčními enzymovými místy Xhol (5676) a Xhol (5720) mohou být odstraněna z plasmidu pAK729,5 deleci 44 nukleotidů umístěných u AMP genu.

Plasmid pAK729,5, který byl štěpen s restrikčním enzymen Xhol, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk S. cerevisiae MT663 poskytujících transformační ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ. Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ a DNA sekvence byly potvrzeny PCR sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou deleci. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ, Delece 44 nukleotidů v ρΑΚ729,5-ΔΑΜΡ se ukazuje být účinná jako úplná delece AMP genu vzhledem ke zničení β-laktamázové aktivity.

Kvasinkový kmen ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru byl stanoven RP-HPLC.

Příklad 3

Enzymové restrikční místo AatlI (4982) bylo zavedeno do pAK729 PCR. Vybrané DNA sekvence výsledného plasmidu pAK729,6 byly následně potvrzený. Restrikční plasmidovou mapu pAK 729,6 ukazuje obr. 3.V pAK729,6 DNA fragmentu mezi restrikčními enzymovými místy AatlI (4982)a AatlI (5978) mohou chybět odstraněním 996 nukleotidů z plasmidu. To odstraní AMP gen a promotor.

• ·

Plasmid pAK729,6 který byl štěpen sDNA restrikčním enzymen AatlI, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk 5. cerevisiae MT663. Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ a DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou delecí. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene NN729,6-AAMP. Plasmidu ρΑΚ729,6-ΔΑΜΡ chybí AMP gen, jak je ukázáno na obr.4. Kvasinkový kmen ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru byl stanoven RP-HPLC.

Příklad 4

Nové enzymové restrikční místo AatlI (3801) v plasmidu pAK729,7 bylo zavedeno do původního plasmidu pAK729 PCR. Vybrané DNA sekvence plasmidu pAK729 byly následně potvrzeny. V pAK729,6 DNA fragmentu mezi restrikčními enzymovými místy AatlI (3801) a AatlI (5978) mohou chybět odstraněním 2177 nukleotidů z exprimovaného plasmidu. Plasmid pAK729,7 byl navržen tak, že jak AMP gen tak i E. coli počátek replikace mohou chybět. Restrikční plasmidovou mapu pAK 729,7 ukazuje obr. 5.

Plasmid pAK729,7, který byl štěpen s DNA restrikčním enzymen AatlI, byl podroben elektroforéze na agaróze, izolován, znovu ligován a následně transformován do příslušných buněk S. cerevisiae MT663. Modifikovaný exprimovaný plasmid byl znovu izolován z kvasničného kmene NN729,7-AAMP a DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou delecí. Rovněž DNA sekvence kódující insulinový prekursor byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasničného kmene NN729,7-AAMP. Kvasinkový kmen NN729,7-AAMP byl kultivován v YPD mediu při 30 °C po dobu 72 hodin. Výtěžek fermentace insulinového prekursoru byl stanoven RP-HPLC.

Tabulka 1

Charakterizace kmenů NN729 v pAK729 plasmidech s nefukčními nebo chybějícím AMP genem • ·

Kmen	Plasmid	Modifikace	Delece nukleotidů
ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ	ρΑΚ729,1- Δ AMP	Delece sekvence mezi ApaLZ (4477) a ApaLI (5723)	1246
ΝΝ729,5-ΔΑΜΡ	ρΑΚ729,5- ΔΑΜΡ	Delece sekvence mezi Xhola (5676) a Xhol (5720)	44
ΝΝ729,6-ΔΑΜΡ	ρΑΚ729,6- ΔΑΜΡ	Delece sekvence mezi AatlI (5978) a AatII(4982)	996
ΝΝ729,7-ΔΑΜΡ	ρΑΚ729,7- ΔΑΜΡ	Delece sekvence mezi AatlI (5978) a AatlI (3801)	2177

Nové ΝΝ729-ΔΑΜΡ kmeny byly porovnány s původním kmenem NN729 vzhledem k fermentačnímu výtěžku insulinového prekurzoru (tab. 2).

Tabulka 2

Výtěžek fermentace ΝΝ729,1-ΔΑΜΡ kmenů transformovaných s plasmidy s nefunkčním nebo chybějícím AMP genem

Kmen	Výtěžek insulinového prekurzoru
NN729	100%
NN729,1	122%
NN729,5	110%
NN729,6	112%
NN729,7	107%

Z výše uvedeného vyplývá, že kvasničné kmeny obsahující exprimovaný gen s částečně či plně chybějícím AMP genem, který slouží jako značkovač, exprimujé od 10 % do 20 % více insulinového prekursoru porovnáním s původním kvasničním kmenem obsahujícím exprimovaný plasmid, který obsahuje AMP gen.

• · · · * · · «·· • ·* · ♦ · · «

Příklad 5

Arg³⁴GLP-1(7-37) exprese v kvasinkách užitím plasmidů snefukčním nebo chybějícím AMP rezistentním genem.

EcoRI (940)-Xbal 91403) sekvence pAK729 konstruktů kódujících LA19X5 MI3, vy světlených v obr. 1 až obr. 5, byly nahrazeny MF_a*-Arg³⁴GLP-1(7-37) kódovací sekvencí pro tento příklad (obr. 6). Modifikace MF«1 peptidu umístěného před vedoucím peptidem (Kurjan&Herskowitz, Cell 30, 1982, 933), ve kterém Leu v pozici 82 a Asp v pozici 83 byly nahrazeny Met a Ala, zavádějící Ncol Štěpící místo v DNA bylo použito v těchto konstruktech. Jako vedoucí sekvence byla označena MFJ* (Kjeldsen a kol., 1996). MFJ signální a MF«l*vedoucí peptidová sekvence zahrnuje Kex2p rozpoznávací motif obsahující dvě báze (Lys-Arg), který odděluje vedoucí sekvenci od kódovací pro Arg³⁴GLP-1(7-37)· Peptid Arg³⁴GLP-l (7-37) je variantou lidského peptidu GLP-1(7-37) (S. Mojsov a kol., J.Chem. 261, 1986, 11880 až 11889), kde přirozený aminokyselinový zbytek v pozici 34 je nahrazen Arg zbytkem.

Tři Arg³⁴GLP-1(7.37) exprimované plasmidy byly vytvořeny s AMP s rezistentními genovými divergencemi, jak je popsáno pro NN729,1 (př. 1), NN729,5 (př.2) a NN729,6 (př.3) a následně transformovaný do příslušných ME1719 (viz WO98/01 535) buněk S. cerevisiae dávající kvasničné transformanty YES2076, YES2079 a YES2085.

Hostitelský kmen, který byl použit pro expresi Arg³⁴GLP-1(7-37), je diploidní kmen, v jehož fenotypu chybí dvě aspartyl proteázy, tj. (1) kvasničná aspartyl proteáza 3 (YAP3), která štěpí Cterminální stranu mono-, a dibazických aminokyselinových zbytků (Egel-Mitani a kol., YEAST 6, 1990, 127 až 137) a (2) vakuolární proteáza A odpovědná za aktivací jiných proteáz jako proteázy B, karboxypeptidázy Y, aminopeptidázy I, RNázy, alkalické fosofatázy, kyselé trehalázy a exopolyfosfatázy. Navíc, triosafosfát isomerázový gen (TPI) byl vyjmut, jehož fenotyp umožňuje využít glukózu v těchto transformantech, které rostou na medium obsahujícím glukózu. Genetickým pozadím ME1719 je MATa/a Dyap3..ura3/Dyap3..URA3 pep4-3/pep4-3 tpi. ,LEU2/Dtpi. LEU2 Ieu2/leu2 Dura3/Dura3.

Modifikované exprimované plasmidy pKV301, pKV304 a pKV307 byly znovu izolovány z kvasinkových kmenů á DNA sekvence byly potvrzeny PCR metodou sledující nedostatečné klonování DNA oblasti charakterizovanou delecí. Rovněž DNA sekvence kódující Arg³⁴GLP-1(7-37) byly potvrzeny na plasmidové DNA izolované z kvasinkových kmenů. Tabulka 3 ukazuje srovnání modifíkovanách a nemodifikovaných kmenů.

Tabulka 3

Charakterizace YES kmenů na plasmidech s nefunkčním nebo chybějícím AMP rezistentním genem pro expresi Arg³⁴GLP-l₍7-37).

Kmen	Plasmid	Modifikace	Delece nukleotidů	Porovnání Arg34GLP-1(7-37) výtěžků
YES 1757	pKV228	Žádná	0	100%
YES2076	pKV301	Delece sekvence mezi ApaLI(4456) a ApaLI (5702)	1246	119%
YES2079	pKV307	Delece sekvence mezi Xhol (5655) a Xhol (5699)	44	113 %
YES2085	pKV304	Delece sekvence mezi AatII(5957) a AatlI (4961)	996	136 %

Výtěžky fermentace byly porovnávány z 5 ml množství v YPD mediu po dobu 72 hodin při 30 °C. Výtěžky byly stanoveny HPLC.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   ΊΟ#/

   1. Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor, který není schopný udělit antibiotickou rezistenci bakteriálním buňkám obsahující genetické kódování pro heterologní gen a antibiotický rezistentní značkový gen, který je nefunkční modifikací in vitro.
2. 2. Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor podle nároku 1, kde antibiotický značkový gen je AMP gen.
3. 3. Způsob získání požadovaného polypeptidů nebo proteinu vyznačující se tím, že zahrnuje kulturu kvasinkového kmene obsahujícího vektor podle nároků 1 až 2 za vhodných podmínek a izolace je získán požadovaný výrobek z kulturního média.
4. 4. Způsob získání požadovaného polypeptidů nebo proteinu obsahujícího za vhodných podmínek kulturu kvasinkového kmene obsahujícího kvasinkový exprimovaný plasmid vyznačující se tím, že funkční antibiotický značkový gen používaný v počátečních krocích klonování v bakteriích je nefunkční in vitro delecí části nebo celého značkového genu před vložením do kvasinkového hostitele.
5. 5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že obsahuje vložení vhodných restrikčních míst v okolí antibiotického rezistentního značkového genu a delecí značkového genu přidáním vhodných restrikčních enzymů in vitro
6. 6. Způsob podle nároku 3 až 5, vyznačující se tím, že kvasinkový kmen je kmen Saccharomyces, s výhodou kmen Saccharomyces cerevisiae.
7. 7. Transformovaná kvasinková buňka, kde obsahuje vektor podle nároků 1 až 2.
8. 8. Transformovaná kvasinková buňka podle nároku 7, kde je kmen Saccharomyces, s výhodou kmen Saccharomyces cerevisiae.