ES2242969T3 - Vector para la expresion de proteinas con prolongacion n-terminal en celulas de levadura. - Google Patents
Vector para la expresion de proteinas con prolongacion n-terminal en celulas de levadura.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CONSTRUCCIONES DE DNA QUE COMPRENDEN SECUENCIAS QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS DE PROTEINAS EXTENDIDAS EN EL N - TERMINAL, LOS VECTORES QUE LLEVAN DICHOS FRAGMENTOS DE DNA Y LAS CELULAS DE LEVADURA TRANSFORMADAS CON DICHOS VECTORES, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR PROTEINAS HETEROLOGAS EN CELULAS EUCARIOTAS INCLUYENDO LA LEVADURA. LAS CONSTRUCCIONES DE DNA CODIFICAN LA SIGUIENTE ESTRUCTURA: PEPTIDO SEÑAL - PEPTIDO LIDER - EEAEPK POLIPEPTIDO.
Description
Vector para la expresión de proteínas con
prolongación N-terminal en células de levadura.
La presente invención se refiere a polipéptidos
expresados y procesados en una célula eucariótica, preferiblemente
a una célula de levadura, una construcción de ADN que comprende una
secuencia de ADN que codifica estos polipéptidos, vectores que
transportan estos fragmentos de ADN y células incluidas células de
levadura transformadas con los vectores, así como un proceso de
producción de proteínas heterólogas en la levadura.
Los organismos de levadura producen varias
proteínas sintetizadas intracelularmente, pero que tienen una
función exterior a la célula. Se hace referencia a estas proteínas
extracelulares como proteínas segregadas. Estas proteínas
segregadas están expresadas inicialmente dentro de la célula en un
precursor o una preforma que contiene una presecuencia que asegura
la dirección eficaz del producto expresado a través de la membrana
del retículo endoplasmático (ER). La presecuencia, normalmente
denominada péptido señal, es generalmente separada del producto
deseado durante la translocación. Una vez introducida en la vía
secretora, la proteína es transportada al aparato de Golgi. Desde
el Golgi la proteína puede seguir distintos caminos que conducen a
compartimientos como la vacuola celular o la membrana celular, o
puede ser enviada fuera de la célula para ser segregada al medio
externo (Pfeffer, S.R. y Rothman, J.E. Ann.Rev.Biochem.
56 (1987), 829-852.
Se han sugerido diferentes enfoques para la
expresión y secreción en la levadura de proteínas heterólogas a la
levadura. La Publicación Europea Nº. 0088632A describe un proceso
por el cual las proteínas heterólogas a la levadura son expresadas,
procesadas y segregadas para transformar un organismo de levadura
con un vector de expresión que alberga ADN que codifica la proteína
deseada y un péptido señal, preparando un cultivo del organismo
transformado, desarrollando el cultivo y recuperando la proteína del
medio de cultivo. El péptido señal puede ser el péptido señal
propio de la proteína deseada, un péptido señal heterólogo o un
híbrido de un péptido señal nativo y heterólogo.
Un problema encontrado con el uso de péptidos
señal heterólogos a la levadura puede ser que el péptido señal
heterólogo no asegure una translocación y/o seccinamiento eficaz
del polipéptido precursor después del péptido señal.
El MF\alpha1 (factor-\alpha)
de Saccharomyces cerevisiae es sintetizado como una forma
prepro de 165 aminoácidos que comprende un péptido señal con una
longitud de 19 aminoácidos, o prepéptido, seguido de un "líder"
con una longitud de 64 aminoácidos, o propéptido, que comprende
tres sitios de glicosilación enlazados en N seguido de
(LysArg(Asp/Glu,
Ala)_{2-3}factor-\alpha)_{4}
(Kurjan, J. y Herskowitz, I. Cell 30 (1982),
933-943). La parte señal-líder del
preproMF\alpha1 ha sido muy empleada para obtener la síntesis y
secreción de proteínas heterólogas en S. cerevisiae.
El uso de péptidos señal/líder homólogos a la
levadura es conocido a partir de i.a. patente estadounidense Nº.
4,546,082, Publicaciones Europeas Nos. 0116201A, 0123294A,
0123544A, 0163529A, 0123289A y Patente Europea Nº. 0100561 B.
En EP 0123289A se describe la utilización del
precursor del factor-\alpha de S.
cerevisiae mientras que EP 100561 describe la utilización del
PH05 señal de Saccharomyces cerevisiae y la publicación de
PCT No. WO 95/02059 describe la utilización del péptido señal YAP3
para la secreción de proteínas extrañas.
La Patente estadounidense Nº. 4,546,082 y las
Publicaciones Europeas Nos. 0016201A, 0123294A, 0123544A y 0163529A
describen procesos por los cuales el señal-líder
con factor-\alpha (MF\alpha1 o MF\alpha2) de
Saccharomyces cerevisiae se utiliza en el proceso de
secreción de proteínas heterólogas expresadas en la levadura. Se
demostró mediante la fusión de una secuencia de ADN que codifica la
secuencia señal/líder de MF\alpha1 de S. cerevisiae en el
extremo 5' del gen para la secreción de la proteína deseada y el
procesamiento de la proteína deseada.
La patente EP 206783 expone un sistema para la
secreción de polipéptidos de S. cerevisiae por el cual la
secuencia líder con factor-\alpha ha sido
truncada para eliminar los cuatro péptidos con
factor-\alpha presentes en la secuencia líder
nativa para dejar el propio péptido líder fusionado con un
polipéptido heterólogo por medio del sitio de procesamiento
Lys-Arg-Glu-Ala-Glu
Ala con factor-\alpha. Esta construcción está
indicada para conducir a un proceso eficaz para la producción de
péptidos más pequeños (menos de 50 aminoácidos). Para la secreción
y procesamiento de polipéptidos más grandes, el
factor-\alpha nativo de la secuencia líder ha
sido truncado para dejar uno o dos péptidos con
factor-\alpha entre el péptido líder y el
polipéptido.
Varias proteínas segregadas son dirigidas para
ser expuestas a un sistema de procesamiento proteolítico que puede
seccionar el enlace peptídico en el extremo carboxi de los dos
aminoácidos básicos consecutivos. Esta actividad enzimática está
codificada en S. cerevisiae por el gen KEX 2 (Julius, D.A.
et al., Cell 37 (1984b), 1075). Se necesita el
procesamiento del producto por la proteasa KEX 2 para la secreción
del factor \alpha1 de acoplamiento activo de S. cerevisiae
1 (MF\alpha1 o factor-\alpha) pero no está
implicado en la secreción del factor \alpha de acoplamiento activo
de S. cerevisiae.
La secreción y procesamiento correcto de un
polipéptido destinado a ser segregado se obtiene en algunos casos
cuando se cultiva un organismo de levadura que es transformado con
un vector construido según se indica en las referencias
proporcionadas arriba. En muchos casos, sin embargo, el nivel de
secreción es muy bajo o no hay secreción, o el procesamiento
proteolítico puede ser incorrecto o incompleto. Como se describe en
la publicación de PCT No. WO 90/10075 se cree que se debe, hasta
cierto punto, a una exposición insuficiente del sitio de
procesamiento presente entre el extremo C-terminal
del péptido líder y el extremo N-terminal de la
proteína heteróloga para que se vuelva inaccesible o, al menos,
menos accesible al seccionamiento proteolítico.
WO 90/10075 describe un sistema de expresión de
levadura con procesamiento mejorado de un polipéptido heterólogo
obtenido aportando algunas modificaciones cerca del sitio de
procesamiento en el extremo C-terminal del péptido
líder y/o el extremo N-terminal de un polipéptido
heterólogo fusionado con el péptido líder. De este modo, es posible
obtener un rendimiento más alto de la proteína correctamente
procesada que se puede obtener con construcciones no modificadas
del péptido líder-polipéptido heterólogo. Es el
objetivo de la presente invención el hecho de proporcionar una
nueva modificación del N-terminal de un polipéptido
heterólogo fusionado con el péptido líder asegurando una expresión
y/o procesamiento más eficaz así como una eliminación mejorada in
vitro de la extensión N-terminal de
polipéptidos heterólogos.
La presente invención describe modificaciones del
extremo N-terminal del polipéptido heterólogo
diseñado como extensiones que pueden ser seccionadas por
proteolisis in vitro durante o después de la purificación
del producto de los medios de cultivo.
La presente invención se refiere a una
construcción de ADN que codifica un polipéptido que tiene la
estructura siguiente
péptido señal-péptido
líder-EEAEPK- proteína heteróloga.
Se usa el código convencional de una única letra
para los aminoácidos conforme a las reglas aceptadas (1974) por la
Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB en
toda esta descripción y en las reivindicaciones.
En este contexto, el término "péptido señal"
pretende referirse a una presecuencia que está presente como una
secuencia N-terminal en la forma precursora de una
proteína extracelular expresada en la levadura. La función del
péptido señal es la de permitir que la proteína heteróloga sea
segregada para introducirse en el retículo endoplasmático. El
péptido señal es normalmente seccionado en el transcurso de este
proceso. El péptido señal puede ser heterólogo u homólogo al
organismo de levadura que produce la proteína. Un péptido señal
preferido en esta invención es el péptido señal de proteasa
aspártica 3 de levadura (YAP3) o cualquier derivado análogo
funcional. La YAP 3 ha sido clonada y caracterizada por
Egel-Mitani, M. et al., YEAST, 6, p.
127-137, 1990.
La expresión "péptido líder" pretende
indicar un péptido en forma de una secuencia propeptídica cuya
función es la de permitir que la proteína heteróloga sea segregada
para ser dirigida desde el retículo endoplasmático al aparato de
Golgi y después a una vesícula secretora para su secreción en el
medio, (es decir exportación de la proteína expresada o polipéptido
a través de la membrana celular y pared celular, si la hubiera, o
al menos a través de la membrana celular en el espacio periplásmico
de una célula que tiene una pared celular). Preferiblemente el
péptido líder es el péptido líder LA19 descrito como ID SEC Nº. 5
en la presente.
La expresión "proteína heteróloga" pretende
indicar una proteína o polipéptido que no es producido por el
organismo huésped en la naturaleza, preferiblemente un polipéptido
que no es producido por la levadura en la naturaleza. No obstante,
sería obvio para un experto en la materia el hecho de producir
polipéptidos homólogos, como el glucagón en una célula mamífera, y
dichos polipéptidos están incluidos en el significado de "proteína
heteróloga".
La secuencia EEAEPK forma una extensión en el
N-terminal del polipéptido heterólogo. Esta
extensión no sólo aumenta el rendimiento de la fermentación sino
que está protegida contra el procesamiento de la dipeptidil
aminopeptidasa (DPAP A), dando como resultado un
N-terminal homogéneo del polipéptido. La extensión
se construye de tal manera que sea resistente al seccionamiento
proteolítico durante la fermentación de tal manera que el producto
de la proteína heteróloga con extensión N-terminal
puede ser purificado de los medios de cultivo para una maduración
in vitro posterior, p. ej. por tripsina o proteasa I de
Achromobacter lyticus. La eliminación in vitro
deseada de EEAEPK con extensión N-terminal se
consigue fácilmente bien por tripsina o proteasa I de
Achromobacter lyticus supuestamente debido a la flexibilidad
del péptido con extensión N-terminal dando como
resultado un rendimiento mejorado de la proteína heteróloga
madura.
La invención además se refiere a un vector de
expresión recombinante que es capaz de replicarse en una célula
eucariótica, preferiblemente una célula de levadura, y que lleva
una construcción de ADN según la invención. Preferiblemente, la
construcción de ADN comprende un péptido líder sintético,
preferiblemente el péptido líder LA19. Además, la invención se
refiere a la construcción de ADN descrita en la Fig. 1 en la
presente. La invención también se refiere a una célula eucariótica,
preferiblemente una célula de levadura, que es capaz de expresar
una proteína heteróloga y que es transformada con un vector según
la invención.
Además, la invención se refiere a un proceso para
producir una proteína heteróloga en la levadura, que comprende el
cultivo de la cepa de levadura transformada en un medio adecuado
para obtener la expresión y secreción de la proteína heteróloga,
tras lo cual la proteína es aislada del medio.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle con referencia a los dibujos anexos, donde
Fig. 1 muestra el plásmido de expresión pAK729
que contiene genes que expresan los polipéptidos con extensión
N-terminal según la invención, y se usan los
símbolos siguientes:
Promotor-TPI: indica la secuencia
promotora del gen TPI de S. cerevisiae.
2: Indica la región que codifica un péptido
señal/líder (p. ej. del péptido señal YAP3 y péptido líder LA19
junto con el EEAEPK precursor de insulina Ml3 con extensión
N-terminal.
Terminador-TPI: Indica la
secuencia terminadora del gen TPI de S. cerevisiae.
TPI-POMBE: Indica el gen TPI de
S. pombe.
Origen: Indica una secuencia del plásmido de 2
\mu de S. cerevisiae que incluye su origen de la
replicación de ADN en S. cerevisiae.
AMP-R: Secuencia de pBR322/pUC13
que incluye el gen de resistencia de ampicilina y un origen de la
replicación de ADN en E. coli.
SEC ID NO 1. es el ADN y secuencias de
aminoácidos en pAK729 que codifican el péptido señal YAP3
(aminoácido Nº. 1 a través de 21), péptido líder LA19 (aminoácido
Nº. 22 a través de 64), EEAEPK con extensión
N-terminal (aminoácido Nº. 65 a través de 70),
precursor de insulina Ml3
B_{cadena}(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_{cadena}
1-21) (aminoácido Nº. 71 a través de 123).
SEC ID No 2. es el ADN y secuencias de
aminoácidos en pAK733 que codifican el complejo péptido
señal-LA19 líder EEAEPK-Ml1
precursor de insulina del Ejemplo 2.
SEC ID NO 3. es el ADN y secuencias de
aminoácidos en pAK749 que codifican el complejo péptido señal
YAP3-LA19 líder EEAEPK-Ml5 precursor
de insulina del Ejemplo 3.
SEC ID NO 4. es el ADN y secuencias de
aminoácidos en pAK866 que codifican el complejo péptido señal YAP3-
LA19 líder EEAEPK - X14 precursor de insulina del Ejemplo 4.
SEC ID No 5 es la secuencia de ADN con el LA19
líder.
La proteína heteróloga con extensión
N-terminal producida según el método de la
invención puede ser cualquier proteína que puede ser producida
ventajosamente en una célula eucariótica, preferiblemente una célula
de levadura. Ejemplos de estas proteínas son aprotinina, inhibidor
de la vía del factor tisular u otros inhibidores de proteasa, e
insulina o precursores de insulina, análogos de insulina, factor de
crecimiento insulinoide I o II, hormona del crecimiento humana o
bovina, interleuquina, activador del tejido plasminógeno, factor
del crecimiento transfomante a o b, glucagón, péptido de tipo
glucagón 1 (GLP-1), péptido de tipo glucagón 2
(GLP-2), GRPP, factor VII, factor VIII, factor
XIII, factor del crecimiento derivado de las plaquetas, enzimas,
como lipasas, o un análogo funcional de cualquiera de estas
proteínas. En este contexto, el término "análogo funcional"
pretende indicar un polipéptido con una función similar a la
proteína nativa (se pretende que esto sea entendido en relación con
la naturaleza mejor que con el nivel de actividad biológica de la
proteína nativa). El polipéptido puede ser estructuralmente similar
a la proteína nativa y puede ser derivado de la proteína nativa por
adición de uno o más aminoácidos a cada o a ambos extremos C- y
N-terminales de la proteína nativa, por sustitución
de uno o más aminoácidos a uno o varios aminoácidos diferentes
situados en la secuencia de aminoácidos nativa, por eliminación de
uno o más aminoácidos en cada o ambas extremidades de la proteína
nativa o a uno o varios sitios en la secuencia de aminoácidos, o
inserción de uno o más aminoácidos a uno o más sitios de la
secuencia de aminoácidos nativa. Estas modificaciones son conocidas
para varias de las proteínas mencionadas anteriormente.
Por "precursor de insulina" o "precursor
de un análogo de insulina" se debe entender un polipéptido
monocatenario, que incluye proinsulina, la cual mediante uno o más
procesos enzimáticos y/o químicos posteriores puede ser convertida
a una insulina bicatenaria o molécula análoga de insulina que tiene
el establecimiento correcto de los tres puentes disulfuro como se
encuentran en la insulina humana natural. Ejemplos de insulinas o
análogos de insulina que pueden ser producidos de esta manera son
insulina humana, preferiblemente insulina humana des(B30),
insulina porcina; y análogos de insulina donde al menos hay un Lys
o Arg, preferiblemente análogos de insulina en los que el
Phe^{B1} ha sido eliminado, análogos de insulina donde la
cadena-A y/o la cadena-B tiene una
extensión N-terminal y análogos de insulina donde la
cadena-A y/o la cadena-B tiene una
extensión C-terminal. Otros análogos de insulina
preferidos son aquellos en los que uno o más de los residuos de
aminoácidos, preferiblemente uno, dos, o tres de éstos, han sido
sustituidos por otro residuo aminoácido codificable. Así en la
posición A21 una insulina madre puede tener un residuo aminoácido
en vez de Asn seleccionado del grupo que comprende Ala, Gln, Glu
Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular un
residuo aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gly, Ala,
Ser, y Thr. Los análogos de insulina pueden también ser modificados
por una combinación de los cambios señalados arriba. Asimismo, en
la posición B28 una insulina madre puede tener un residuo
aminoácido en vez de Pro seleccionado del grupo que comprende Asp,
Lys etc., y en la posición B29 una insulina madre puede tener un
aminoácido Pro en vez de Lys. La expresión "un residuo aminoácido
codificable" según se utiliza en este caso se refiere a un
residuo aminoácido que puede ser codificado por el código genético,
es decir un triplete ("codon") de nucleótidos.
Los precursores de insulina más preferidos son
Ml1,
B(1-29)-A(1-21);
Ml3,
B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)
(p. ej. según se describe en EP 163 529); X14,
B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)
(p. ej según se describe en. publicación de PCT Nº. 95/00550);
B(1-27
Asp-Lys)-A(1-21);
B(1-27-Asp-Lys)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21);
B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)
(p. ej. según se describe en la publicación de PCT Nº. 95/07931);
Ml5,
B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21);
y
B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21).
La construcción de ADN de la invención que
codifica el polipéptido de la invención puede ser preparada
sintéticamente mediante unos métodos estándar establecidos, p. ej.
el método de fosfoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H.
Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, págs.
1859-1869, o el método descrito por Matthes et
al., EMBO Journal 3, 1984, págs.
801-805. Según el método de fosfoamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN
automático, purificado, duplicado y ligado para formar la
construcción de ADN sintética. Una manera habitualmente preferida
de preparar la construcción de ADN es mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), p. ej. según se describe en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, NY, 1989).
La construcción de ADN de la invención puede
también ser de origen genómico o de ADNc, por ejemplo obtenido
mediante la preparación de una genoteca genómica o de ADNc y la
selección de secuencias de ADN que codifican todo o parte del
polipéptido según la invención por hibridación usando sondas de
oligonucleótidos sintéticos conforme a las técnicas estándar (cf.
Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, 1989). En este caso, una secuencia
genómica o de ADNc que codifica un péptido señal y líder puede ser
unida a una secuencia genómica o de ADNc que codifica la proteína
heteróloga, tras lo cual la secuencia de ADN puede ser modificada
en un sitio correspondiente a la secuencia de aminoácidos EEAEPK
del polipéptido, insertando oligonucleótidos sintéticos que
codifican la secuencia de aminoácidos deseada para la recombinación
homóloga según unos procedimientos bien conocidos o preferiblemente
generando la secuencia deseada por PCR usando
oligonucleótidos
adecuados.
adecuados.
Finalmente, la construcción de ADN puede ser de
origen mezclado sintético y genómico, mezclado sintético y de ADNc
o mezclado genómico y de ADNc preparado emparejando fragmentos de
origen sintético, genómico o ADNc (según convenga), los fragmentos
siendo correspondientes a varias partes de toda la construcción de
ADN, conforme a las técnicas estándar. Así, se puede prever que la
secuencia de ADN que codifica la proteína heteróloga puede ser de
origen genómico o de ADNc, mientras que la secuencia que codifica
el péptido señal y líder al igual que la secuencia que codifica el
EEAEPK con extensión N-terminal puede ser preparada
sintéticamente.
En cierto aspecto, la invención se refiere a un
vector de expresión recombinante que es capaz de replicarse en la
levadura y que lleva una construcción de ADN que codifica el
polipéptido definido arriba. El vector de expresión recombinante
puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse en
organismos de levadura. En el vector, la secuencia de ADN que
codifica el polipéptido de la invención debería estar operativamente
conectado a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser
cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en
levadura y puede ser derivada de genes que codifican proteínas sea
homólogas o heterólogas a la levadura. El promotor es
preferiblemente derivado de un gen que codifica una proteína
homóloga a la levadura. Ejemplos de promotores adecuados son
M\alpha1 de Saccharomyces cerevisiae, TPI, promotores de
ADH o PGK.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
de la invención puede también ser operativamente conectada a un
terminador adecuado, p. ej. el terminador TPI (cf. T. Alber y G.
Kawasaki,J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, págs.
419-434).
El vector de expresión recombinante de la
invención comprende una secuencia de ADN que permite que el vector
se replique en la levadura. Ejemplos de estas secuencias son los
genes de replicación REP1-3 de 2 \mu del plásmido
de levadura y el origen de la replicación. El vector puede también
comprender un marcador seleccionable, p. ej. el gen TPI de
Schizosaccharomyces pompe según se describe por P.R. Russell,
Gene 40, 1985, págs. 125-130.
Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican para el polipéptido de la
invención, el promotor y el terminador, respectivamente, y para
insertarlas en vectores de levadura adecuados que contengan la
información necesaria para la replicación de levadura, son
conocidos por los expertos en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook
et al., op.cit.). Se entenderá que el vector puede ser
construido sea preparando primero una construcción de ADN que
contenga toda la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido
de la invención y posteriormente insertando este fragmento en un
vector de expresión adecuado, o insertando secuencialmente
fragmentos de ADN que contengan información genética para los
elementos individuales (como la proteína señal, líder u heteróloga)
seguido de la ligadura.
El organismo de levadura o la célula huésped
eucariótica usada en el proceso de la invención puede ser cualquier
organismo de levadura adecuado que, en el cultivo, produce grandes
cantidades de la proteína heteróloga o polipéptido en cuestión.
Ejemplos de organismos de levadura adecuados pueden ser cepas
seleccionadas de las especies de levadura de Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe,
Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia
lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum
sp., y Geotrichum fermentans, preferiblemente las
especies de levadura de Saccharomyces cerevisiae. Se
considera que es obvio para el experto en la materia la selección
de cualquier otra célula eucariótica, como células de los géneros de
Aspergillus, Streptomyces, células de insectos o una célula
de mamíferos, como el organismo huésped.
La transformación de las células de levadura
puede por ejemplo ser realizada mediante la formación de
protoplastos seguido de la transformación según un modo conocido
per se. El medio usado para cultivar las células puede ser
cualquier medio convencional adecuado para el desarrollo de
organismos de levadura. La proteína heteróloga segregada, de la
cual una proporción significante estará presente en el medio según
una forma correctamente procesada, puede ser recuperada del medio
mediante procedimientos convencionales que incluyen la separación
de las células de levadura del medio por centrifugación o
filtración, precipitación de los componentes proteínicos del
sobrenadante o filtrado mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio,
seguido de la purificación mediante una variedad de procedimientos
cromatográficos, p. ej. cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad, o similares. Cuando la proteína es
segregada al espacio periplásmico, las células son interrumpidas
enzimáticamente o mecánicamente.
Después de la secreción al medio de cultivo o el
espacio periplásmico, la proteína puede ser sometida a varios
procedimientos para eliminar el EEAEPK de la secuencia.
Se ha hallado que la extensión está fijada de
forma estable a la proteína heteróloga durante la fermentación,
protegiendo el N- terminal de la proteína heteróloga contra la
actividad proteolítica de las proteasas de levadura como DPAP. La
presencia de una extensión N-terminal en la proteína
heteróloga puede también servir como protección del grupo amino
N-terminal de la proteína heteróloga durante la
elaboración química de la proteína, es decir puede servir como
sustituto para un grupo de protección BOC o similar. En estos casos
el EEAEPK de la secuencia de aminoácidos puede ser eliminado de la
proteína heteróloga recuperada mediante una enzima proteolítica que
es específica para un aminoácido básico (es decir K (Lys)) de tal
manera que la extensión del terminal sea seccionada en el K.
Ejemplos de estas enzimas proteolíticas son tripsina o proteasa I
de Achromobacter lyticus.
La presente invención está descrita con más
detalle en los ejemplos siguientes que no están de ninguna manera
destinados a limitar el objetivo de la invención como se
reivindica.
Un gen sintético que codifica para la extensión
N-terminal del precursor de insulina
EEAEPK-ML3 con extensión N-terminal
fue construido usando la Reacción en Cadena por Polimerasa
(PCR).
Los 2 oligonucleótidos siguientes fueron
sintetizados:
- #672 5' -TCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAACCAAAGTTCGTT-3'
- #2785 5' -AATTTATTTTACATAACACTAG-3'
Los oligonucleótidos fueron sintetizados usando
un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems Modelo 380A)
usando la química de fosfoamidita y reactivos comercialmente
disponibles (Beaucage, S.L. y Caruthers, M.H., Tetrahedron letters
22 (1981) 1859-1869).
La siguiente PCR fue realizada usando la ADN Pwo
Polimerasa (Boehringer Mannheim Gmbh, Sandhoefter Strasse 116,
Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante y la
mezcla de PCR fue cubierta con 100 \mul de aceite mineral (Sigma
Chemical Co., St. Louis MO, EEUU).
5 \mul de oligonucleótido #672 (50 pmol)
5 \mul de oligonucleótido #2785 (50 pmol)
10 \mul de tampón 10X PCR
8 \mul de mezcla dNTP
0.5 \mul de enzima Pwo
0.5 \mul de plásmido pAK680 como molde (0.2
\mug de ADN)
71 \mul de agua dest.
Un total de 12 ciclos fueron realizados, un ciclo
fue a 94 C durante 45 seg.; 40 C durante 1 min; 72 C durante 1.5
min. la mezcla de PCR fue luego cargada en un gel de agarosa al
2.5% y la electroforesis fue realizada usando técnicas estándar
(Sambrook J, Fritsch El y Maniatis T, Molecular cloning, Cold
Spring harbour laboratory press, 1989). El fragmento de ADN
resultante fue cortado del gel de agarosa y aislado mediante el
Gene Clean Kit (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038,
EEUU) según las instrucciones del fabricante.
El fragmento de ADN purificado por PCR fue
disuelto en 14 \mul de agua y un tampón de endonucleasas de
restricción y cortadas con las endonucleasas de restricción NcoI y
XbaI según técnicas estándar (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T,
Molecular cloning, Cold spring Harbour laboratory press, 1989). El
fragmento de ADN NcoI-XbaI en 209 pares de base de
nucleótidos fue sometido a electroforesis de agarosa y purificado
usando el Gene Clean Kit como se describe.
El plásmido pAK721 (ver Fig. 1) fue cortado con
las endonucleasas de restricción BgIII y XbaI y el fragmento del
vector de 10849 pares de bases de nucleótidos fue aislado usando el
Gene Clean Kit como se describe. El plásmido pAK721 fue cortado con
las endonucleasas de restricción BgIII y NcoI y el fragmento de ADN
de 160 pares de bases de nucleótidos fue aislado usando el Gene
Clean Kit como se describe. Los tres fragmentos de ADN fueron
ligados entre sí usando T4 ADN ligasa y condiciones estándar
(Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T, Molecular cloning, Cold spring
Harbour laboratory press, 1989). La mezcla de ligadura fue luego
transformada en una cepa competente de E. coli (R -, M+)
seguido de la selección con resistencia de ampicilina.
El plásmido del E. coli resultante fue
aislado usando técnicas estándar (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis
T, Molecular cloning, Cold spring Harbour laboratory press, 1989),
y controlado para su inserción con endonucleasas de restricción
apropiadas es decir Nco I y XbaI. El plásmido seleccionado fue
mostrado por el análisis de la secuencia de ADN (Sequenasa, U.S.
Biochemical Corp, EEUU) para codificar la secuencia de ADN correcta
para el ADN precursor de insulina EEAEPK-Ml3 y ser
insertado después del ADN que codifica el ADN del LA19 líder
sintético. El plásmido fue denominado pAK729.
La secuencia de ADN que codifica el complejo
péptido señal YAP3-LA19 líder
EEAEPK-precursor de insulina Ml3 está mostrada en
SEC ID Nº. 1.
El plásmido pAK721 fue transformado en la cepa
MT663 de S. cerevisiae como se describe en PCT/DK95/00250 y
la cepa resultante fue denominada yAK721.
El plásmido de expresión de levadura pAK729 es
del tipo C-POT (ver Fig. 1) y es similar al
descrito en WO EP 171 142, que contiene el gen de triosa fosfato
isomerasa (POT) de pombe de Schizosaccharomyces para la
selección plásmida y estabilización en S. cerevisiae. pAK729
también contiene el promotor y terminador de triosa fosfato
isomerasa de S. cerevisiae. El promotor y terminador son
similares a los descritos en el plásmido pKFN1003 (descrito en WO
90/100075) así como todas las secuencias del plásmido excepto la
secuencia entre el fragmento EcoRIXbaI que codifica el péptido
señal YAP3-péptido líder
LA19-EEAEPK-Ml3 precursor de
insulina.
Un gen sintético que codifica para la extensión
N-terminal del precursor de insulina
EEAEPK-Ml1 con extensión N-terminal
fue construido combinando varios fragmentos de ADN que codifican el
líder y el precursor de la extensión y de insulina.
El plásmido pAK721 (ver Fig. 1) fue cortado con
las endonucleasas de restricción BgIII y XbaI y el fragmento del
vector de 10849 pares de base de nucleótidos fue aislado usando el
Gene Clean Kit como se describe.
El plásmido pAK730 fue cortado con las
endonucleasas de restricción HindIII y XbaI y el fragmento de ADN
de 131 pares de base de nucleótidos aislado usando el Gene Clean
Kit como se describe.
El plásmido pAK729 fue cortado con las
endonucleasas de restricción BgIII y HindIII y el fragmento de ADN
de 229 nucleótido fue aislado según el modo descrito
anteriormente.
Los tres fragmentos de ADN fueron ligados entre
sí usando T4 ADN ligasa y condiciones estándar (Sambrook J, Fritsch
EF y Maniatis T, Molecular cloning, Cold spring Harbour laboratory
press, 1989). La mezcla de ligadura fue luego transformada en una
cepa competente de E. coli (R-, M+) seguido de selección con
resistencia de ampicilina. El plásmido del E. coli resultante
fue aislado usando técnicas estándar (Sambrook J, Fritsch EL y
Maniatis T, clonación molecular, Molecular cloning, Cold spring
Harbour laboratory press, 1989), y controlado para su inserción con
endonucleasas de restricción apropiadas. El plásmido seleccionado
fue mostrado por el análisis de la secuencia de ADN (Sequenasa,
U.S. Biochemical Corp., USA) para codificar la secuencia de ADN
correcta para el ADN precursor de insulina
EEAEPK-Ml1 y ser insertado después del ADN que
codifica el líder LA19 sintético y el ADN de extensión. El plásmido
fue denominado pAK733.
La secuencia de ADN que codifica el complejo
péptido señal YAP3-LA19 líder EEAEPK- Ml1 precursor
de insulina está mostrada en SEC ID NO 2.
El plásmido pAK733 fue transformado en la cepa
MT663 de S. cerevisiae como se describe en PCT/DK95/00250 y
la cepa resultante fue denominada yAK733. El plásmido de expresión
de levadura pAK733 es del tipo C-POT (ver Fig. 1) y
es similar a aquel descrito en WO EP 171 142, que contiene el gen
triosa fosfato isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces pombe
para selección plásmida y estabilización en S.cerevisiae.
pAK733 también contiene el promotor y terminador de triosa fosfato
isomerasa de S. cerevisiae. El promotor y terminador son
similares a estos descritos en el plásmido pKFN1003 (descritos en
WO 90/100075) como son todas las secuencias en el plásmido excepto
la secuencia entre el fragmento de codificación
EcoRI-XbaI que codifica el péptido
señal-LA19 líder -EEAEPK- Ml1 precursor de
insulina.
Se construyó un gen sintético que codifica para
el precursor de insulina EEAEPK-Ml5 con extensión
N-terminal fue construido combinando varios
fragmentos de ADN que codifican el líder y la extensión y el
precursor de insulina.
El plásmido pAK743 fue cortado con las
endonucleasas de restricción BgIII y NheI y el fragmento del vector
de 10757 pares de base de nucleótidos fue aislado usando el Gene
Clean Kit como se describe.
El plásmido pAK405 fue cortado con las
endonucleasas de restricción HindIII y NheI y el fragmento de ADN
de 238 pares de base de nucleótidos fue aislado usando el Gene
Clean Kit como se describe.
El plásmido pAK729 fue cortado con las
endonucleasas de restricción BgIII y HindIII y el fragmento de ADN
de 229 nucleótidos fue aislado según el modo descrito
anteriormente.
Los tres fragmentos de ADN fueron ligados entre
sí usando T4 ADN ligasa y condiciones estándar (Sambrook J, Fritsch
EF y Maniatis T, Molecular cloning, Cold spring Harbour laboratory
press, 1989). La mezcla de ligadura fue luego transformada en una
cepa competente de E. coli (R-, M+) seguido de la selección
con resistencia de ampicilina. El plásmido del E. coli
resultante fue aislado usando técnicas estándar (Sambrook J,
Fritsch EL y Maniatis T, Molecular cloning, Cold spring Harbour
laboratory press, 1989), y controlado para su inserción con
endonucleasas de restricción apropiadas. El plásmido seleccionado
fue mostrado por el análisis de la secuencia de ADN (Sequenase,
U.S. Biochemical Corp., EEUU) para codificar la secuencia de ADN
correcta para el ADN precursor de insulina
EEAEPK-Ml5 e insertarse después del ADN que
codifica el LA19 líder sintético y la extensión de ADN. El plásmido
fue denominado pAK749.
La secuencia de ADN que codifica el complejo
péptido señal YAP3-LA19
líder-EEAEPK-Ml5 precursor de
insulina está mostrada en la SEC ID No 3.
El plásmido pAK749 fue transformado en la cepa
MT663 de S. cerevisiae como se describe en PCT/DK95/00250 y
la cepa resultante fue denominada yAK749. El plásmido de expresión
de levadura pAK749 es del tipo C-POT (ver Fig. 1) y
es similar a aquellos descritos en WO EP 171 142, que contiene el
gen triosa fosfato isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces
pombe para la selección del plásmido y estabilización en
S.cerevisiae. pAK749 también contiene el promotor y
terminador de triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae. El
promotor y terminador son similares a aquellos descritos en el
plásmido pKFN1003 (descrito en WO 90/100075) como son todas las
secuencias del plásmido excepto la secuencia entre el fragmento
EcoRI-XbaI que codifica el péptido señal
YAP3-LA19
líder-EEAEPK-Ml5 precursor de
insulina.
Un gen sintético que codifica para la extensión
N-terminal del precursor de insulina
EEAEPK-X14 con extensión N-terminal
fue construido combinando varios fragmentos de ADN que codifican el
líder y la extensión y el precursor de insulina X14.
El plásmido pAK743 fue cortado con las
endonucleasas de restricción BgIII y NheI y el fragmento del vector
de 10757 pares de base de nucleótidos fue aislado usando el Gene
Clean Kit como se describe.
El plásmido pAK602 fue cortado con las
endonucleasas de restricción HindIII y NheI y el fragmento de ADN
de 232 pares de base de nucleótidos fue aislado usando el Gene
Clean Kit como se describe.
El plásmido pAK729 fue cortado con las
endonucleasas de restricción BgIII y HindIII y el fragmento de ADN
de 229 pares de base de nucleótidos fue aislado según el modo
descrito anteriormente.
Los tres fragmentos de ADN fueron ligados entre
sí usando T4 ADN ligasa y condiciones estándar (Sambrook J, Fritsch
EF y Maniatis T, Molecular cloning, Cold spring Harbour laboratory
press, 1989). La mezcla de ligadura fue luego transformada en una
cepa (R-,M+) competente de E. coli seguido de la selección
con resistencia de ampicilina. El plásmido de E. coli
resultante fue aislado usando técnicas estándar (Sambrook J,
Fritsch EL y Maniatis T, Molecular cloning, Cold spring Harbour
laboratory press, 1989), y controlado para su inserción con
endonucleasas de restricción apropiadas. El plásmido seleccionado
fue mostrado por el análisis de la secuencia de ADN (Sequenase,
U.S. Biochemical Corp., EEUU) para codificar la secuencia de ADN
correcta para el ADN precursor de insulina
EEAEPK-X14 e insertarse después del ADN que
codifica el LA19 líder sintético y la extensión de ADN. El plásmido
fue denominado pAK866.
La secuencia de ADN que codifica el complejo
péptido señal YAP3-LA19 líder
EEAEPK-X14 precursor de insulina está mostrada en la
SEC ID Nº. 4.
El plásmido pAK866 fue transformado en la cepa
MT663 de S. cerevisiae como se describe en PCT/DK95/00250 y
la cepa resultante fue denominada yAK866. El plásmido de expresión
de levadura pAK866 es del tipo C-POT (ver Fig. 1) y
es similar a los descritos en WO EP 171 142, que contiene el gen
triosa fosfato isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces pombe
para la selección plásmida y estabilización en S.cerevisiae.
pAK866 también contiene el promotor y terminador de triosa fosfato
isomerasa de S. cerevisiae. El promotor y terminador son
similares a aquellos descritos en el plásmido pKFN1003 (descrito en
WO 90/100075) así como todas las secuencias del plásmido excepto la
secuencia entre el fragmento EcoRI-XbaI que codifica
para el péptido señal YAP3-LA19
líder-EEAEPK-X14 precursor de
insulina.
\newpage
SEC ID NO 5, LA19 líder
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- longitud: 43 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- tipo de molécula: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- descripción de secuencia: SEC ID NO:67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr
Ser Val Asn Leu Met}
\sac{Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn
Thr Thr Leu Ala Leu}
\sac{Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Met Ala Lys
Arg}
Claims (14)
1. Una construcción de ADN que codifica un
polipéptido que tiene la siguiente estructura péptido
señal-péptido
líder-EEAEPK-proteína
heteróloga.
2. Una construcción de ADN según la
reivindicación precedente, donde el péptido señal es el péptido
señal de la proteasa aspártica 3 de levadura (YAP3) o un derivado
análogo funcional.
3. Una construcción del ADN según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde el péptido líder es un
péptido líder sintético, preferiblemente el péptido líder LA19 de
SEC ID NO 5 según la presente invención.
4. Una construcción de ADN según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde la proteína heteróloga está
seleccionada del grupo que se compone de aprotinina, inhibidor de
la vía del factor tisular u otros inhibidores de proteasa, e
insulina o precursores de insulina, análogos de insulina, factor de
crecimiento insulinoide I o II, hormona del crecimiento humana o
bovina, interleuquina, activador del plasminógeno tisular, factor
de crecimiento transformante a o b, glucagón, péptido del tipo
glucagón 1 (GLP-1), péptido del tipo glucagón 2
(GLP-2), GRPP, factor VII, factor VIII, factor
XIII, derivado del factor de crecimiento de las plaquetas, enzimas,
como lipasas, o un análogo funcional de cualquiera de estas
proteínas.
5. Una construcción de ADN según la
reivindicación 4, donde la proteína heteróloga es insulina o un
precursor de insulina, preferiblemente seleccionada del grupo que
se compone de Ml1,
B(1-29)-A(1-21);
ML3,
B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21);
X14,
B(1-27-Asp-Lys)
Ala-Ala-Lys-A(1-21);
B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21);
Ml5,
B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21);
y
B(1-29)-Ser-Asp
Asp-Ala-Arg-A(1-21).
6. Una construcción de ADN según la
reivindicación 4, donde la proteína heteróloga es insulina o un
precursor de insulina, preferiblemente el precursor de insulina
ML3, o un derivado análogo funcional.
7. La construcción de ADN descrito en la SEC ID
Nº. 1, 2, 3, o 4 de la presente.
8. Un vector de expresión recombinante que es
capaz de replicarse en una célula eucariótica y que lleva una
construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes.
9. Un vector de expresión recombinante que es
capaz de replicarse en levadura y que lleva una construcción de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una célula de levadura que es capaz de
expresar una proteína heteróloga y que es transformada con un
vector según la reivindicación 9.
11. Una célula de levadura según la
reivindicación 10 seleccionada de las especies Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe,
Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia
lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum
sp., y Geotrichum fermentans, preferiblemente de
Saccharomyces cerevisiae.
12. Un proceso para producir una proteína
heteróloga, que comprende el cultivo de una célula de levadura
según la reivindicación 10 o 11 en un medio adecuado para obtener
la expresión y la secreción de la proteína heteróloga, tras lo cual
la proteína es aislada del medio de cultivo.
13. Un proceso según la reivindicación 12, donde
el EEAEPK de la secuencia de aminoácidos es eliminado de la
proteína heteróloga recuperada mediante un proceso que comprende el
tratamiento con una enzima proteolítica que es específica para un
aminoácido básico.
14. Un proceso según la reivindicación 13, donde
la enzima proteolítica está seleccionada del grupo que se compone
de tripsina y proteasa I de Achromobacter lyticus.
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