CZ2001643A3

CZ2001643A3 - Exprese a export inhibitorů angiogeneze ve formě imunofúzinů

Info

Publication number: CZ2001643A3
Application number: CZ2001643A
Authority: CZ
Inventors: Kin-Ming Lo; Yue Li; Stephen D. Gillies
Original assignee: Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2002-02-13
Also published as: ATE462725T1; RU2240328C2; HUP0103329A2; CZ302303B6; US20130165634A1; NO20010918D0; AU761027B2; PL346703A1; JP2009273478A; HK1042503A1; CN1326467A; CA2339331C; AU5583699A; NO20010918L; WO2000011033A3; EP1107989A2; DK1107989T3; CN100422332C; US20070009538A1; US8703908B2

Description

Oblast techniky

Vynález obecně popisuje přípravky a způsoby využitelné pro produkci a použití fúzních proteinů zahrnujících nějaký inhibitor angiogeneze. Ještě přesněji lze říci, že vynález popisuje přípravky a způsoby využitelné pro produkci a použití fúzních proteinů označovaných jako imunofúziny, kde tyto proteiny zahrnují imunoglobulinovou oblast Fc a nějaký inhibitor angiogeneze.

Dosavadní stav techniky

Byly objeveny dva účinné inhibitory angiogeneze, a to angiostatin (O'Reilly a další, Cell, 79:315, 1994) a endostatin (O'Reilly a další, Cell, 88:277, 1997) a bylo zjištěno, že tyto sloučeniny jsou přirozeně produkovány primárními nádory. Oba zmíněné proteiny jsou specifickými inhibitory proliferace endotheliálních buněk a růst nádorů inhibují tím, že blokují angiogenezi (vytváření nových krevních kapilár vyživujících nádory). Následné studie prokázaly, že tyto inhibitory angiogeneze. nevykazují toxické účinky ani ve vysokých dávkách, a že mohou potlačovat růst metastáz a u primárních nádorů vyvolat regresi do dormantního stavu. Bylo zjištěno, že oba tyto inhibitory jsou proteolytickými fragmenty podstatně větších intaktních molekul. Angiostatin byl identifikován jako fragment plazminogenu a endostatin jako fragment kolagenu XVIII.

• ·

Oba zmíněné proteiny vyvolaly velký zájem v oblasti výzkumu rakoviny, a to vzhledem k jejich schopnosti potlačovat na myším modelu růst mnoha rozdílných typů nádorů bez pozorovatelných nežádoucích vedlejšich.účinků nebo vzniku rezistence. Při tradičně používané chemoterapeutické intervenci dochází k selekci rezistentních klonů buněk a to především v důsledku nestability genomu rakovinných buněk. Cílem terapií využívajících inhibitory angiogeneze však nejsou buňky nádorové, ale normální buňky endotheliální, které podporují růst nádorů. Vzhledem k tomu, že endotheliální buňky jsou geneticky stabilní, je možné, že terapie využívající inhibitory angiogeneze budou vznikem rezistence zatíženy v daleko menší míře. Provedené studie naznačují, že u myší vystavených dlouhodobému terapeutickému působení endostatinu (s antiangiogenním účinkem) nedošlo ke vzniku rezistence vůči této látce. Opakované léčebné cykly s využitím endostatinu vedly u myší k prodloužení doby dormance nádorů a při ukončení terapie nebyla pozorována recidiva onemocnění (Boehm a další, Nátuře, 390:440, 1997).

I přes slibné výsledky experimentů prováděných na myším modelu nebylo možné v expresívních systémech E.coli, bakulovirech, kvasinkách a savčích buňkách připravit v komerčně výhodných množstvích rozpustný, aktivní angiostatin vhodný pro klinické testování. Výsledkem exprese v E.coli byly nerozpustné proteinové agregáty nedefinovatelného složení, které nemohly být použity k injekční aplikaci do organizmu lidí. Jiné postupy, jako například bakulovirový expresívní systém nebo expresívní systémy využívající savčí buňky, produkovaly pouze velmi malá množství rekombinantnich proteinů (O'Reilly a další, Cell, 88:277, 1997).

Nízké výtěžky získané v použitých expresívních systémech mohou být vysvětleny skutečností, že jak endostatin tak angiostatin jsou vnitřními fragmenty mnohem větších proteinů.

Tyto zkrácené proteiny mohou být, v důsledku absence zbytků, které jsou z prekurzorových molekul odštěpeny, nesprávně sbaleny. Angiostatin například obsahuje 26 cysteinových zbytků, které vytvářejí velký počet disulfidových vazeb. Při expresi samotného angiostatinu možná není vytvořeno prostředí optimální pro vznik tohoto velkého počtu disulf idových vazeb. Rekombinantní endostatin produkovaný v E.coli v průběhu dialýzy precipitoval, což je pravděpodobně důsledkem hydrofobicity tohoto proteinu (O'Reilly a další, Cell, 88:277, 1997).

Hlavní překážkou pro použití angiostatinu a endostatinu v jejich současné formě je skutečnost, že k dosaženi požadovaného terapeutického cíle musí být do organizmu po dobu týdnů až měsíců injekčně aplikována relativně velká množství těchto proteinů. U v současnosti používaného myšího modelu je k dosažení optimální účinnosti například nutno aplikovat 20 mg/kg/den endostatinu (Boehm a další, Nátuře, 390:440, 1997). Vezmeme-li v úvahu, že je nezbytné klinické testování endostatinu a angiostatinu, pak je nutné vyvinout způsob produkce velkého množství tohoto materiálu v čistotě vhodné pro klinické použití.

Jedním ze systémů, který byl použit k expresi velkých množství fúzních proteinů v savčích buňkách, je konstrukt DNA kódující signální peptid, imunoglobulinovou oblast Fc a cílový (požadovaný) protein. Fúzní protein kódovaný tímto konstruktem je obvykle označován jako imunofúzin. Mezi cílové proteiny, který byly úspěšně exprimovány ve formě imunofúzinů patří: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, βΙΘ-Η3, receptor pro IgE, PSMA a gpl20. Tyto expresívní konstrukty jsou popsány v přihláškách US 5541087 a 5726044, které jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Hlavním cílem při expresi rekombinantních fúzních proteinů v savčích buňkách bylo pokusit se takové hybridní molekule udělit nějaké nové nebo užitečné vlastnosti jako například umožnit správné sbalení (tj. vytvoření správné terciární a/nebo kvartérní struktury), zvýšit rozpustnost, směrovat cytokin nebo toxin in vivo, umožnit vazbu na receptor pro Fc, fixaci komplementu, vazbu na protein A, prodloužit biologický poločas a zvýšit schopnost přecházet hematoencefalickou bariérou. Příkladem rekombinantních fúzních proteinů produkovaných v savčích buňkách jsou imunokonjugáty cytokinů (Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428, 1992); Gillies a další, Bioconjugate Chemistry, 4:230, 1993), imunoadhesiny (Capon a další, Nátuře, 337:525, 1989) a konjugát nervového růstového faktoru (Friden a další, Science, 339:394, 1993). Každá z následujících publikací je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Jedna stránka popisuje nové sekvence DNA, které usnadňují účinnou produkci a sekreci inhibitorů angiogeneze v savčích hostitelských buňkách. Druhá stránka vynálezu popisuje způsoby léčby savců s využitím nukleových kyselin kódujících, nebo aminokyselinových sekvencí definujících, inhibitory angiogeneze, včetně nepřirozených, biosyntetických nebo jiných uměle vytvořených proteinů jako například proteinů vytvořených racionálním designem.

Popis obrázků na výkresech

Cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu uvedené v předcházejícím i následujícím textu, jakož i vynález sám, mohou být dokonale pochopeny z následujících výhodných provedení vynálezu a přiložených obrázků.

o ·

Obrázky 1A až 1F jsou schématickým znázorněním ukázkových fúzních proteinů inhibitorů angiogeneze zkonstruovaných s využitím údajů uvedených ve vynálezu (viz. příklady 10 až 15). Na obrázcích jsou znázorněny:

Obrázek 1Ά - fúzní protein Fc-doména kringle 1 angiostatinu

Obrázek 1B - fúzní protein Fc-vnitřní část domény kringle 1 angiostatinu

Obrázek 1C - fúzní protein Fc-endostatin-linker GlyServnitřní část domény kringle 1 angiostatinu

Obrázek ID - fúzní protein Fc-endostatin-linker GlySerdoména kringle 1 angiostatinu

Obrázek 1E - fúzní protein Fc-endostatin-linker GlySerangiostatin

Obrázek 1F - fúzní protein angiostatin-Fc-endostatin

Svislé úsečky reprezentují disulfidické vazby (nemusí být přítomny) spojující cysteinové zbytky (C) v pantové oblasti domény Fc.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje přípravky a způsoby využitelné pro produkci a použití fúzních proteinů zahrnujících nějaký inhibitor angiogeneze. Tyto fúzní proteiny mohou usnadnit expresi velkých množství biologicky aktivních proteinových inhibitorů angiogeneze. Tyto proteinové inhibitory angiogeneze mohou být následně z fúzního proteinu odštěpeny a před aplikací do organizmu nějakého savce (například člověka) smíchány s farmaceuticky přijatelným nosičem. Jinou možností je smíchat nukleotidové sekvence kódující, nebo aminokyselinové sekvence definující, fúzní proteiny zahrnující in

4 hibitor angiogeneze s nějakým farmaceuticky přijatelným nosičem a tuto směs aplikovat do organizmu savce.

Jedna stránka vynálezu popisuje molekuly nukleových kyselin, například molekuly DNA nebo RNA, kódující nějaký fúzní protein podle vynálezu. Daná molekula nukleové kyseliny kóduje signální sekvenci, Fc oblast imunoglobulinu a alespoň jeden cílový protein, v této přihlášce označovaný jako proteinový inhibitor angiogeneze, vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu a jejich kombinace. Ve výhodném provedení vynálezu kóduje molekula nukleové kyseliny postupně, ve směru 5' k 3, signální sekvenci, Fc oblast imunoglobulinu a sekvenci cílového proteinu. V jiném výhodném provedení vynálezu kóduje molekula nukleové kyseliny postupně, ve směru 5' k 3', signální sekvenci, sekvenci cílovéhó proteinu a Fc oblast imunoglobulinu.

V jiném výhodném provedení vynálezu zahrnuje Fc oblast imunoglobulinu pantovou oblast imunoglobulinu a výhodně zahrnuje alespoň jednu konstantní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce, například konstantní doménu 2 (CH₂) těžkého řetězce, konstantní doménu 3 (CH₃) těžkého řetězce a volitelně dále konstantní doménu 4 (CH₄) těžkého řetězce. V závislosti na typu použitého imunoglobulinu je tímto vytvořena oblast Fc. Ve výhodnějším provedení vynálezu zahrnuje Fc oblast imunoglobulinu pantovou oblast, doménu CH₂ a doménu CH₃. Za určitých podmínek není v Fc oblasti imunoglobulinu zastoupena alespoň doména CHi. Ačkoliv mohou být Fc oblasti imunoglobulinu odvozeny z jakékoliv třídy imunoglobulinů, například IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, ve výhodných provedeních jsou používány Fc oblasti imunoglobulinu odvozené z třídy IgG.

V jiném výhodném provedení vynálezu může být nukleová kyselina podle vynálezu začleněna do expresívního vektoru schopného replikace a tímto vektorem mohou být následně transfekovány savčí hostitelské buňky. V jiném výhodném provedení vynález popisuje hostitelské buňky nesoucí nukleotidové sekvence podle vynálezu.

Jiná stránka vynálezu popisuje fúzní protein zahrnující Fc oblast imunoglobulinu připojenou, buď přímo peptidovou vazbou nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k cílovému proteinu vybranému ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu a jejich kombinace. Cílový protein může být svým C-koncem připojen k N-konci Fc oblasti imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu je nicméně cílový protein připojen svým N-koncem k C-konci Fc oblasti imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu může fúzní protein podle vynálezu zahrnovat nějaký druhý cílový protein vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu a nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu. U tohoto typu konstruktu mohou být první a druhý cílový protein totožné nebo rozdílné. Ve výhodném provedení vynálezu zmíněný fúzní protein například zahrnuje první cílový protein typu angiostaťinu, Fc oblast imunoglobulinu a druhý cílový protein typu endostatinu. První a druhý cílový protein mohou být vzájemně spojeny buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru. V jiném uspořádání .mohou být oba cílové proteiny připojeny, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k Fc oblasti imunoglobulinu. V tomto případě je první cílový protein připojen k N-konci Fc oblasti imunoglobulinu a druhý cílový protein připojen k C-konci Fc oblasti imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu mohou být dva fúzní proteiny spojeny buď kovalentně, například disulfidovou nebo peptidovou vazbou, nebo nekovalentně, čímž je vytvořen multimerní protein. Ve výhodném provedení jsou tyto dva fúzní proteiny spojeny kovalentně prostřednictvím jedné nebo více disulfidických vazeb mezi postranními řetězci cysteinů, které se ve výhodném provedení nalézají v pantových oblastech imunoglobulinů umístěných v obou řetězcích Fc oblastí imunoglobulinů.

Ve výhodném provedení vynálezu zmíněný cílový protein zahrnuje nějaký fragment plazminogenu o molekulové hmotnosti přibližně 40 kD a volitelně rovněž zahrnuje aminokyselinou sekvenci uvedenou jako SEK. ID. Č.: 3. V jiném provedení vynálezu zmíněný cílový protein zahrnuje nějaký fragment kolagenu XVIII s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako SEK. ID. Č.: 1. Cílovým proteinem může být rovněž nezkrácený angiostatin nebo endostatin nebo jejich biologicky aktivní fragmenty. Zdroj cílového proteinu použitého při vytváření daných fúzních proteinů bude záviset na plánovaném použití tohoto cílového proteinu. Bude-li například cílový protein aplikován lidem, pak by tento cílový protein měl být lidského původu.

Jiná stránka vynálezu popisuje způsoby produkce fúzního proteinu zahrnujícího Fc oblast imunoglobulinů a cílový protein vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu a nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu. Tento způsob zahrnuje následující kroky: (a) vytvoření savčí buňky nesoucí DNA kódující takový fúzní protein buď s nebo bez signální sekvence; a (b) kultivaci takové buňky za účelem produkce zmíněného fúzního proteinu. Tento fúzní protein může být následně sebrán, je-li to nezbytné renaturován, a, s využitím standardních purifikačních technik v současnosti známých, vyčištěn. Za předpokladu, že ve zmíněném fúzním proteinu se mezi Fc oblastí imunoglobulinu a cílovým proteinem nalézá proteolyticky štěpitelná sekvence, pak může být cílový protein z fúzního proteinu s využitím běžně používaných proteolytických enzymů odštěpen a, je-li to nezbytné, před použitím purifikován.

Jiná stránka vynálezu popisuje způsoby léčby savců, například lidí, u kterých je žádoucí provést léčbu využívající inhibitory angiogeneze. Do rozsahu vynálezu například spadá aplikace inhibitorů angiogeneze lidem s nádorovými onemocněními. Léčba s využitím inhibitorů angiogeneze může zpomalit nebo zastavit růst nádorů a za určitých okolností může vyvolat regresi nádorů. Tato léčba může zahrnovat aplikaci inhibitoru angiogeneze do organizmu savce v množství dostačujícím ke zpomalení nebo zastavení růstu nádorů. Inhibitor angiogeneze může být aplikován ve formě fúzního proteinu nebo jako nukleová kyselina, ve výhodném provedení funkčně spojena s nějakým expresívním vektorem, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Vynález popisuje fúzní proteiny, v této přihlášce označované jako imunofúziny, které jsou využitelné k produkci komerčně výhodných množství inhibitorů angiogeneze v čistotě vhodné pro klinické použití. Před použitím mohou být tyto inhibitory angiogeneze z imunofúzních proteinů odštěpeny. Do rozsahu vynálezu nicméně rovněž spadá možnost aplikace imunofúzinů nebo nukleových kyselin kódujících imunofúziny s nějakým inhibitorem angiogeneze do organizmu savců přímo bez odštěpení.

Vynález popisuje fúzní proteiny zahrnující Fc oblast imunoglobulinu a alespoň jeden cílový protein, označovaný v této přihlášce jako inhibitor angiogeneze. Inhibitor angiogeneze je ve výhodném provedení vybrán ze skupiny zahrnuj 1 .··· ·· ··» ’·· ·* ci angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu. Je nicméně rovněž zřejmé, že ve formě fúzních proteinů stejného typu, jaký je popsán v této přihlášce, mohou být exprimovány i jiné polypeptidy schopné inhibovat angiogenezi, a to jak peptidy v současnosti známé tak objevené v budoucnosti.

Na obrázcích 1A až AF je znázorněno šest proteinových konstruktů použitelných při průmyslovém využití vynálezu. Jelikož ve výhodném provedení vynálezu jsou využívány dimerní konstrukty, všechny tyto konstrukty jsou znázorněny ve formě dimerů spojených dvojicí disulfidických vazeb mezi cysteiny přítomnými v jednotlivých podjednotkách. Tyto disulfidové můstky na obrázcích spojují dvě Fc oblasti imunoglobulinů v pantové oblasti, což je charakteristickým znakem nativních forem těchto molekul. I když konstrukty zahrnující pantovou oblast Fc úseku jsou upřednostňovány a jejich použití terapeutických agens je nadějné, do rozsahu vynálezu rovněž spadají i možnosti zesíťováni v jiných místech. Za určitých okolností mohou být rovněž produkovány dimery nebo multimery vhodné pro praktické využití vynálezu, kde tyto dimery nebo multimery jsou spojené nekovalentně, například hydrofobními interakcemi.

Jelikož jsou homodimerní konstrukty důležitými modelovými konstrukty vynálezu, jsou tyto konstrukty znázorněny Obrázku 1. Je zřejmé, že heterodimerní konstrukty jsou rovněž využitelné, ale odborníci vědí, že takové konstrukty je často velmi obtížné purifikovat. Mohou být nicméně vytvořeny konstrukty zahrnující směs homodimerů a heterodimerů, kde tyto konstrukty jsou využitelné k inhibici angiogeneze u nej různějšich druhů savců, včetně člověka. Jeden řetězec heterodimerní struktury může například zahrnovat endostatin a druhý například angiostatin.

Obrázek 1A znázorňuje dimerní konstrukt připravený postupem uvedeným v přikladu 10. Každá monomerni jednotka tohoto dimeru zahrnuje Fc oblast imunoglobulinu (1) včetně pantové oblasti, domény 0¾ a domény CH₃. Přímo k C-konci Fc oblasti (1) je připojena první doména kringle angiostatinu (2) , a to jak její vnitřní tak vnější část. Obrázek 1B, ilustrující další provedení vynálezu (viz. příklad 11), zahrnuje Fc oblast totožnou s Fc oblastí na obrázku 1A, k jejímuž C-konci je tentokrát připojena pouze vnitřní část první doména kringle angiostatinu (3.) . Obrázky 1C až 1F ilustrují různé modelové proteinové konstrukty podle vynálezu. V těchto konstruktech je cílovým proteinem kombinace inhibitorů angiogeneze v tandemovém uspořádání a spojená linkerem. V konstruktu znázorněném na obrázku 1C zahrnuje cílový protein nezkrácený endostatin (4), polypeptidový linker (5) a vnitřní část první domény kringle angiostatinu (3) . Obrázek ID znázorňuje protein zahrnující Fc oblast totožnou s Fc oblastí na obrázku 1A a cílový protein zahrnující nezkrácený endostatin (4), polypeptidový linker (5) a celou první doménu kringle angiostatinu (jak vnitřní tak vnější část) (2). Konstrukt ilustrovaný obrázkem 1E se od konstruktu na obrázku ID liší tím, že na C-konci celého konstruktu je umístěn nezkrácený řetězec angiostatinu (7).

Ačkoliv obrázky 1A až 1F reprezentují konstrukty typu Fc-X, kde X je cílový protein, do rozsahu vynálezu rovněž spadají konstrukty typu X-Fc, které jsou použitelné při průmyslovém využití vynálezu. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají proteiny podle vynálezu popsané vzorcem X-Fc-X, kde X mohou označovat totožné nebo odlišné cílové proteiny. Obrázek 1F ilustruje takový konstrukt, který ve směru od Dokonce k C-konci zahrnuje nezkrácený lidský angiostatin (7), Fc oblast lidského imunoglobulinu (6) včetně pantové oblasti a nezkrácenou doménu lidského endostatinu (4).

• 9 ·· • · · ·

• 99

Termín inhibitor angiogeneze označuje jakoukoliv molekulu, které potlačuje nebo inhibuje tvorbu nových krevních kapilár v organizmu savců. Při léčbě rakoviny inhibitory angiogeneze potlačují nebo inhibují tvorbu nových krevních kapilár v nebo na nádorech, výhodně pak v nebo na pevných nádorech. Výhodně využitelné inhibitory angiogeneze mohou být identifikovány pomocí nejrůznějších stanovení v současnosti známých a používaných. Mezi taková stanovení patří například sledování proliferace bovinních endotheliálních buněk tvořících kapiláry, stanovení na kuřecích chorioalantoických membránách (CAM) nebo stanovení na myší rohovce. V současnosti je nicméně s výhodou používáno stanovení CAM (viz. například O'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a 0'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.). Stručně řečeno, z oplodněných bílých vajec (3 dny po oplození) jsou vyjmuta embrya spolu s nepoškozených žloutkem a tato jsou umístěna na Petriho misky. Po třídenní inkubaci při 37°C v atmosféře 3% CO2 je na chorioalantoickou membránu každého z embryí umístěn disk z methylcelulózy obsahující předpokládaný inhibitor angiogeneze. Po přibližně 48 hodinové inkubaci jsou chorioalantoické membrány pozorovány pod mikroskopem a jsou zde sledovány známky inhibice angiogeneze.

Příkladem inhibitorů angiogeneze výhodně používaných při praktickém využití vynálezu jsou angiostatin (O'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a přihlášky US 5733876, 5837682 a 5885795) a endostatin (O'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; a přihláška US 5854205). Jak již bylo zmíněno v předchozím textu, angiostatin i endostatin jsou specifickými inhibitory proliferace endotheliálních buněk a jsou schopny inhibovat růst nádorů tím, že blokují angioge nezi, což je tvorba nových krevních kapilár vyživujících nádory.

Angiostatin byl identifikován jako proteolytický fragment plasminogenu (O'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a přihlášky US 5733876, 5837682 a 5885795; tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Přesněji řečeno, angiostatin je vnitřní fragment plasminogenu o velikosti 38 kDa zahrnující alespoň tři domény kringle plazminogenu. Endostatin byl identifikován jako proteolytický fragment kolagenu XVIII (O'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Přesněji řečeno, endostatin je C-koncový fragment kolagenu XVIII o velikosti 20 kDa. Termíny angiostatin a endostatin označují nejenom nezkrácené proteiny, ale rovněž jejich varianty a biologicky aktivní fragmenty a rovněž biologicky aktivní fragmenty plasminogenu, respektive kolagenu XVIII. Jako biologicky aktivní fragmenty angiostatinu jsou označovány jakékoliv proteinové fragmenty plasminogenu nebo angiostatinu, které při stanovení CAM vykazují alespoň 30%, ve výhodném provedení alespoň 70% a nejvýhodněji pak přinejmenším 90% biologické aktivity nezkráceného angiostatinu. Jako biologicky aktivní fragmenty endostatinu jsou označovány jakékoliv proteinové fragmenty kolagenu XVIII nebo endostatinu, které při stanovení CMA vykazují alespoň 30%, ve výhodném provedení alespoň 70% a nejvýhodněji pak přinejmenším 90% biologické aktivity nezkráceného endostatinu.

Termín varianty zahrnuje druhové a alelické varianty, jakož i další přirozeně se vyskytující nebo nepřirozené varianty, například varianty vytvořené genovými manipulacemi, kde tyto varianty vykazují přinejmenším 70% podobnost nebo 60% identitu, výhodněji pak 75% podobnost nebo 65% identitu a nejvýhodněji alespoň 80% podobnost nebo 70% identitu s přirozeně se vyskytujícími sekvencemi endostatinu nebo angiostatinu popsanými v této přihlášce.

Skutečnost, zda-li daný polypeptid vykazuje vzhledem k referenčnímu polypeptidu požadované procento podobnosti nebo identity, je stanovena srovnáním (alignmentem) aminokyselinové sekvence testovaného polypeptidu s aminokyselinovou sekvencí referenčního polypeptidu s využitím dynamického algoritmu popsaného v publikaci Smith a Waterman, J.

Mol. Biol., 147:195 až 197, 1981 v kombinaci se substituční maticí BLOSUM62 popsanou na obrázku 2 v publikaci Henikoff a Henikoff, Aminoacid substitution matrices from protein blocks, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:10915 až 10919, 1992. Pro potřeby této přihlášky je vložení mezery do sekvence penalizováno hodnotou -12 a prodloužení mezery pak hodnotou -4. Počítačové programy provádějící srovnávání sekvencí (alignment) s využitím algoritmu Smith-Waterman 'a matice BLOSUM62 jako například programový balík GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, England) jsou komerčně dostupné a odborníky často využívané.

Jakmile je provedeno srovnání kandidátní sekvence se sekvencí referenční, může být spočteno procento podobnosti. U jednotlivých aminokyselin je postupně srovnávána jejich vzájemná podobnost. Je-li v matici BLOSUM62 hodnota dvou vzájemně si přiřazených aminokyselin nulová nebo záporná, pak skóre pro tuto dvojici je nula; v.jiném případě je skóre pro tuto dvojici 1,0. Prvotní neupravené skóre podobnosti je poté součtem hodnot podobnosti pro jednotlivé dvojice aminokyselin. Neupravené skóre je následně normalizováno dělením počtem aminokyselin, v kratší ze srovnávaných sekvencí. Toto normalizované skóre odpovídá procentu podobnosti. Procento identity je počítáno obdobně. Vzájemně si přiřazené aminokyseliny jsou postupně srovnávány. Jestliže dvě ♦ 9

··	99 ·	9
9 9	9	•	99	• 9
•	··		•	9
•	•	• 9	•	9
9	9	•	9	9
9999	• 9		999	• 9

9··

99 •9 •99 ·9 ♦ 9 vzájemně si přiřazené aminokyseliny nejsou totožné, pak hodnota identity je nulová; v opačném případě je hodnota identity rovna 1,0. Prvotní neupravené skóre identity je součtem hodnot identit aminokyselinových párů. Neupravené skóre je následně normalizováno dělením počtem aminokyselin v kratší ze srovnávaných sekvencí. Toto normalizované skóre odpovídá procentu identity. Při výpočtu procenta identity nebo podobnosti jsou inzerce a delece ignorovány. Ve stejném duchu nejsou v těchto výpočtech rovněž zahrnuty penalizace za vložení/prodloužení mezery, ačkoliv tyto jsou použity při počátečním srovnání sekvencí (alignmentu).

Cílové proteiny popsané v přihlášce jsou exprimovány ve formě fúzních proteinů s Fc oblastí nějakého imunoglobulinu. Je známo, že každá konstantní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce se skládá ze čtyř nebo pěti domén. Tyto domény jsou označovány následovně: CHi-pantová oblast-CH2CH3-(-CH₄). Sekvence DNA jednotlivých domén těžkých řetězců vykazují zkříženou homologii mezi jednotlivými třídami imunoglobulinů. Doména CH2 imunoglobulinu IgG je například homologní s doménou CH2 imunoglobulinu IgA a IgD a s doménou CH3 imunoglobulinů IgM a IgE.

Termín Fc oblast imunoglobulinu označuje C-koncovou část konstantní oblasti imunoglobulinového řetězce, výhodněji pak konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část. Fc oblast může například zahrnovat: 1) doménu CHi, doménu CH₂ a doménu CH₃, 2) doménu CHi a doménu CH₂, 3) doménu CHi a doménu CH₃, 4) doménu CH₂ a doménu CH₃nebo 5) kombinaci dvou nebo více domén a pantové oblasti imunoglobulinu. Ve výhodném provedeni vynálezu zahrnuje Fc oblast v konstruktu DNA alespoň pantovou oblast imunoglobulinu, doménu CH₂ a doménu CH₃ a ve výhodném provedení postrádá alespoň doménu CHi.

• 4

Ve výhodném provedení vynálezu jsou jako zdroj konstantních částí těžkých řetězců využívány ímunoglobuliny typu IgG (Igy) (podtřídy 1, 2, 3 nebo 4). Mohou být nicméně rovněž použity jiné imunoglobulinové třídy jakými jsou IgA (Iga), IgD (Ig5), IgE (Ige) a IgM (Igu). Volba vhodné konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu je detailně diskutována v přihláškách US 5541087 a 5726044. Předpokládá se, že odborníci budou schopni zvolit vhodné sekvence konstantních oblastí těžkých řetězců imunoglobulinů z dostupných imunoglobulinových tříd a subtypů tak, aby bylo dosaženo požadovaného výsledku. Část konstruktu DNA kódující Fc oblast imunoglobulinu ve výhodném provedení zahrnuje alespoň část pantové oblasti a rovněž alespoň část domény CH3 odvozené z Fcy nebo homologních domén v imunoglobulinech typu IgA, IgD, IgE nebo IgM.

V závislosti na způsobu využití mohou být použity rovněž geny kódující konstantní oblasti z jiných živočišných druhů, například myší nebo potkanů. Oblast Fc, použitá jako fúzní partner v konstruktu DNA kódující imunofúzin, může být obecně odvozena z jakéhokoliv druhu savce. Je-li nežádoucí vyvolat v hostitelské buňce nebo organizmu imunitní odpověď vůči použité Fc oblasti, pak tato oblast může být odvozena ze stejného druhu k jakému náleží hostitelská buňka nebo živočich. Je-li například hostitelská buňka lidského původu nebo je-li hostitelem člověk, pak je použita lidská oblast Fc; obdobně je použita myší oblast Fc v případech, kdy je hostitelským živočichem myš. Využitelné jsou rovněž substituční nebo deleční mutanty oblastí F.c, kde je v doménách konstantní oblasti odstraněn nebo nahrazen jeden nebo více aminokyselinových zbytků. Jedním z příkladů je zavedení aminokyselinových substitucí v doméně CH₂, čímž je vytvořen mutant se sníženou afinitou vůči receptorům pro Fc (Cole a další, J. Immunol., 159:3613, 1997). Odborník bude ♦ ·· · · · ·

9 · · · · ♦ ♦ ·2 « α · 9 9 9 99 »**· ·· ··· ··* ····♦ s využitím metod molekulární biologie schopen takové konstrukty snadno připravit.

Použití lidských Fcyl jako oblastí Fc s sebou nese řadu výhod. Bude-li například fúzní protein inhibitor angiogeneze-Fc využit jako biologický léčivý přípravek, pak doména Fcyl může v tomto proteinu vykonávat určité efektorové funkce. Mezi tyto efektorové funkce patří biologické aktivity jako například fixace komplementu, buněčná toxicita vyvolaná protilátkou, přechod přes placentu a prodloužení biologického poločasu v krevním oběhu.' Doména Fc rovněž umožňuje detekci metodou ELISA s využitím protilátek proti Fc a purifikaci s využitím vazby na protein A z mikroorganizmu Staphylococcus aureus (protein A). Při některých aplikacích je nicméně žádoucí odstranit určité efektorové funkce oblasti Fc, jako například vazbu na receptory pro Fc nebo fixaci komplementu.

V případě imunofúzinů s inhibitorem angiogeneze je jednou z funkcí oblasti Fc usnadnit správné sbalení daného inhibitoru angiogeneze tak, aby byl vytvořen aktivní inhibitor angiogeneze, a zvýšit rozpustnost aktivních částí fúzního proteinu a to přinejmenším v extracelulárním médiu. Jelikož oblast Fc je hydrofilní, pak její imunofúziny s inhibitory angiogeneze jsou, na rozdíl například od rekombinantniho endostatinu produkovaného v E.coli, rovněž snadno rozpustné (O'Reilly, Cell, 88:277, 1997). Ve všech příkladech uvedených v této přihlášce bylo dosaženo vysoké hladiny produkce imunofúzinů. Imunofúziny s inhibitory angiogeneze byly obvykle sekretovány do média v koncentracích přibližně 30 až 100 pg/ml a mohly být snadno purifikovány chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A (protein A-Sepharóza). Imunofúziny s inhibitory angiogeneze mohou být rovněž rozštěpeny a dále purifikovány s využitím standardních purifikačních postupů využívajících například

499 9 •· · ··· • · ·· • ♦ · ·♦ • · 99 • 999 99 «·♦ heparin-Sepharózu, lysin-Sepharózu nebo nějaký způsob afinitní purifikace.

Mimo vysokých hladin exprese se fúzní proteiny podle vynálezu rovněž vyznačují delšími biologickými poločasy v krevním oběhu a to pravděpodobně v důsledku jejich větších molekulových hmotností. Biologický poločas fúzního proteinu lidský Fc-lidský angiostatin v krevním oběhu myší je například 33 hodin. Biologický poločas lidského angiostatinu je pro srovnání pouze 4 až 6 hodin (O'Reilly a další, Nátuře Medicine, 2:689, 1996). Předpokládá se, že angiostatin s molekulovou hmotností 40 kDa a endostatin s molekulovou hmotností 20 kDa jsou dostatečně malé, aby mohly být odstraněny filtrací v ledvinách. Naproti tomu dimerní formy Fc-angiostatin a Fc-endostatin mají molekulové hmotnosti 145 kDa, respektive 100 kDa, a to proto, že ke dvěma molekulám' angiostatinu nebo dvěma molekulám endostatinu jsou připojeny dvě oblasti Fc imunoglobulinu. Tyto dvoj vazné .. struktury mohou vykazovat vyšší vazebné afinity k receptorům pro angiostatin nebo endostatin. Je-li inhibiční aktivita angiogeneze zprostředkovaná receptorem, pak fúzní proteiny s oblastí Fc jsou při potlačení růstu nádorů potenciálně daleko účinnější než samotný monovalentní angiostatin nebo endostatin. Mimo to, jestliže angiostatin a/nebo endostatin patři do skupiny dimerních proteinových ligandů, pak připojená oblast Fc vnutí angiostatinu nebo endostatinu takové prostorové uspořádání, že dimerizace bude probíhat intramolekulárně, dimerizační rovnováha bude posunuta směrem k tvorbě dimeru a tím dojde k zesílení vazby na příslušný receptor. Standardními rekombinantními technikami manipulace DNA můžou být rovněž na vhodná místa monomerů umístěny cysteinové zbytky a vytvořením kovalentní disulfidické vazby může být dimer stabilizován.

*

44««

4

444

44 •94444 ·· • · • 4 • 4 •

• 4 4

Termín multivalentní označuje rekombinantní molekulu, která zahrnuje dvě nebo více biologicky aktivních částí. Proteinové fragmenty vytvářející multivalentní molekulu mohou být spojeny polypeptidovým řetězcem, který spojuje jednotlivé části, aniž by při tom docházelo k posunu čtecího rámce, a umožňuje všem těmto částem fungovat nezávisle..

Termín bivalentní označuje multivalentní rekombinantní molekulu, která ve fúzním konstruktu podle vynálezu zahrnuje dva cílové proteiny, například molekulu Fc-X, kde část X je nezávisle zvolená ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin nebo jejich varianty. Jelikož k imunoglobulinové oblasti Fc jsou připojeny dvě části X (oblast Fc je obvykle dimer fragmentů těžkých řetězců zahrnující přinejmenším část pantové oblasti a domény CH₃ a volitelně doménu CH2) , tato molekula je bivalentní (viz. například obr. 1A). Jestliže může být fúzní konstrukt podle vynálezu popsán vzorcem Fc-X-X, pak výsledná dimerní molekula Fc je tetravalentní. Zmíněné dva proteiny vytvářející molekulu Fc-X-X mohou být spojeny peptidovým linkerem. Zdánlivá vazebná afinita mezi bivalentní molekulou a recepťorem může být vyšší než u molekuly monovalentni. Jestliže se například jedna endostatinová část fúzního proteinu Fc-endostatin váže na receptor na povrchu buněk s určitou afinitou, pak druhá endostatinová část téhož fúzního proteinu Fc-endostatin se může na receptor na téže buňce vázat s výrazně vyšší afinitou (zdánlivou afinitou). Tato skutečnost je způsobena fyzickým přiblížením druhé endostatinové části k příslušnému receptoru po navázání první endostatinové části. V případech vazby protilátky na antigen je zdánlivá afinita zvýšena přinejmenším 10000-krát.

Termíny multimerní a multimer označují stabilní spojení (asociaci) dvou nebo více polypeptidových řetězců. Tyto řetězce mohou být spojeny buď kovalentně, například di19 *

• · • 9 •9·· 99 •· ♦ ♦·

9♦

999 sulfidickou vazbou, nebo nekovalentně, například hydrofobními interakcemi. Termín multimer zahrnuje jak homomultimery, kde jsou všechny polypeptidy totožné, tak heteromultimery, v nichž jsou polypeptidy rozdílné.

Termín dimerní (molekula) je specifickým typem multimerní molekuly, v níž jsou dva proteinové polypeptidové řetězce spojeny kovalentní nebo nekovalentní vazbou. Mělo by být zřejmé, že imunoglobulinová oblast Fc (fragment Fc) je obvykle dimer fragmentů těžkých řetězců zahrnující přinejmenším část pantové oblasti a domény CH₃ a volitelně doménu CH₂. Je známo množství proteinových ligandů, které se na příslušné receptory vážou ve formě dimerů. Jestliže proteinový ligand X dimeruje přirozeně, pak část X v molekule Fc-X bude dimerovat daleko snadněji, protože dimerizace je koncentračně závislá. Fyzické přiblížení dvou molekul X spojených asociovanými imunoglobulinovými oblastmi Fc způsobí, že dimerizace bude probíhat intramolekulárně, dimerizační rovnováha bude posunuta směrem k tvorbě dimeru a tím dojde k zesílení vazby na příslušný receptor.

Je pochopitelné, že v přihlášce jsou k vytváření fúzních proteinů s oblastí Fc, použitelných při průmyslovém využiti vynálezu, používány metody práce s rekombinantní DNA. Fúzní konstrukty s oblastí Fc jsou ve výhodném provedení konstruovány na úrovni DNA a takto připravené DNA jsou'integrovány do expresívních vektorů a exprimovány. Tímto způsobem jsou připravovány imunofúziny. Termín vektor označuje jakoukoliv nukleovou kyselinu obsahující nukleotidové sekvence, které mohou být inkorporovány do hostitelské buňky, a zde rekombinovat s nebo se integrovat do genomu takové buňky nebo se replikovat autozomně ve formě epižomu. Mezi takové vektory patří lineární nukleové kyseliny, plazmidy, fágmidy, kosmidy, vektory na bázi RNA, virové vektory a podobně. Příkladem virových vektorů jsou retroviry, adenoviry a viry

4«·· • · · · · • ·· ·· · • ·· • ·· ·9 • ·« * · · ·· ♦ ♦ · ♦ • · ♦ · « ··· ·· asociované s adenoviry. Termíny genová exprese, exprese genu nebo exprese cílového proteinu zahrnují transkripci sekvence DNA, translaci příslušného transkriptu mRNA a sekreci fúzního proteinu s oblastí Fc.

Výhodně používaný expresívním vektorem je expresívní vektor pdCs (Lo a další, Protein Engineering, 11:495 až 500, 1998; tato citace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.). V tomto vektoru je k transkripci genu Fc-X využíván posilovač transkripce/promotor z lidského cytomegaloviru a polyadenylační signál SV40. Sekvence posilovače transkripce a promotoru lidského cytomegaloviru byly odvozeny z nukleotidů -601 až +7 v sekvenci popsané v publikaci Boshart a další, Cell, 41:521, 1985; tato citace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Tento vektor rovněž jako selekční markér obsahuje gen pro mutantní dihydrofolát reduktázu (Simonsen a Levinson, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:2495, 1983; tato citace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu).

Vhodné hostitelské buňky mohou být transformovány nebo transfekovány sekvencemi DNA podle vynálezu a využity k expresi a sekreci cílového proteinu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou jako hostitelské buňky využívány imortalizované hybridomové buňky, buňky myelomu NS/0, buňky 293, buňky z ovárií čínského křečka, buňky HeLa a buňky COS.

Fúzní proteiny podle vynálezu jsou ve výhodném provedení konstruovány tradičními metodami práce s rekombinantní DNA. Tyto fúzní proteiny jsou ve výhodném provedení produkovány expresí molekuly DNA kódující signální sekvenci, oblast Fc imunoglobulinu a nějaký cílový protein (v této přihlášce rovněž označován jako inhibitor angiogeneze) v hostitelských buňkách. Ve výhodném provedení tyto konstrukty, ve směru od 5' ke 3', kóduji signální sekvenci, oblast Fc imunoglobulinu a příslušný cílový protein. Alternativně mohou tyto konstrukty, ve směru od 5' ke 3', kódovat signální sekvenci, příslušný cílový protein a oblast Fc imunoglobulinu .

Termín signální sekvence, signální peptid označuje peptidovou sekvenci, která umožňuje sekreci fúzního proteinu imunoglobulinu a inhibitoru angiogeneze, a která je následně od tohoto imunofúzinu odštěpena. Signální sekvencí je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci zahajující transport proteinu přes membránu endoplazmatického retikula. Mezi signální sekvence využitelné ve vynálezu patří signální sekvence z lehkých řetězců protilátek, například protilátky 14.18 (Gillies a další, J. of Immunol. Meth., 125:191 až 202, 1989), signální sekvence z těžkých řetězců protilátek, například signální sekvence z těžkého řetězce protilátky MOPC141 (Sakano a další, Nátuře, 286:5774, 1980) a jakékoliv jiné signální sekvence v současnosti známé (viz. například Watson, Nucleic Acid Res., 12:5145, 1984). Každá z těchto citací je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Signální sekvence jsou v současnosti dobře charakterizovány a obvykle zahrnují 16 až 30 aminokyselin; mohou nicméně zahrnovat více nebo méně aminokyselin. Typický signální peptid zahrnuje tři oblasti: Bazickou N-koncovou oblast, střední hydrofobní oblast a polárnější C-koncovou oblast. Střední hydrofobní oblast zahrnuje 4 až 12 hydrofobních aminokyselinových zbytků, které při transportu nascentního polypeptidu ukotvují signální peptid ve dvojvrstvě lipidové membrány. Následně je signální peptid obvykle v lumen endoplazmatického retikula odštěpen enzymy označovanými jako signální peptidázy. Místa potenciálního štěpení jsou obvyk22

··		··
• ·		•	··
•		··
•	•	• €
9	•	•
····		··	··>

• ·· ·
·· •	• · • ·	·· •
•	• · ·	•
•	• <	•
···	··	·« ·

le definována pravidlem (-3, -1). Typický signální peptid má tedy v oblasti -1 až -3 obvykle malé neutrální aminokyselinové zbytky a nevyskytuje se zde prolin. Příslušná signální peptidáza rozštěpí signální peptid mezi aminokyselinami -1 a +1. Signální sekvence (kódovaná příslušným úsekem DNA) může být tedy od N-konce imunofúzinu v průběhu sekrece odštěpena. Výsledkem pak je sekrece imunofúzinu zahrnujícího oblast Fc a cílový protein. Detailní popis signálních sekvencí je uveden v publikaci von Heijne, Nucleic Acid Res., 14:4683, 1986, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Odborníkům je zřejmé, že volba signální sekvence vhodné pro použití ve vynálezu může vyžadovat provedeni několika rutinních experimentů, jako například určení schopnosti použité signální sekvence řídit sekreci připojeného imunofúzinu a rovněž stanovení optimální konfigurace, genomové DNA nebo cDNA, této sekvence k dosažení účinné sekrece imunofúzinů. Odborník je rovněž schopen na základě pravidel popsaných v publikaci von Heijne (citace uvedena výše) vytvořit syntetický signální peptid a standardními experimenty stanovit jeho účinnost. Signální sekvence může být rovněž označována jako signální peptid, vedoucí peptid nebo vedoucí sekvence.

Konstrukt vzniklý připojením signální sekvence k imunoglobulinové oblasti Fc je někdy v přihlášce označován jako sekretorní kazeta. Příkladem sekretorní kazety použitelné při průmyslovém využití vynálezu je polynukleotid kódující, ve směru od 5' k 3', gen pro signální sekvenci lehkého imunoglobulinového řetězce a gen pro oblast Fcyl lidského imunoglobulinu yl. Oblast Fcyl genu pro lidský imunoglobulin yl ve výhodném provedení zahrnuje alespoň část pantové oblasti a část domény CH₃ nebo alternativně alespoň část pantové oblasti a část domény 0¾ a domény CH₃. DNA kódující sekretorni kazetu se může nacházet v konfiguraci genomové DNA nebo cDNA.

V jiném provedení vynálezu je mezi sekvence kódující sekretorní kazetu a inhibitor angiogeneze vložena sekvence DNA kódující proteolyticky štěpitelné místo. Toto místo umožňuje proteolytické štěpení kódovaného fúzního proteinu a tudíž oddělení domény Fc od inhibitoru angiogeneze. Termín proteolyticky štěpitelné místo označuje aminokyselinové sekvence, které jsou přednostně štěpeny proteolytickými enzymy nebo jinými látkami schopnými proteolýzy. Výhodně využívaná proteolyticky štěpitelná místa zahrnují aminokyselinové sekvence, které jsou rozpoznávány proteolytickými enzymy jako například trypsinem, plasminem nebo enterokinázou K. Je známo množství dvojic štěpitelné místo/proteolytické agens. Viz. například přihláška US 5726044, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Je-li cílovým proteinem prekurzorová molekula angiostatinu, endostatinu nebo nějaké z jejich aktivních variant, pak požadovaný proteinový produkt může být štěpen endogenními proteolytickými enzymy jako například elastinem nebo plasminem nebo urokinázou.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají fúzní proteiny obsahující různé kombinace rekombinantního angiostatinu nebo endostatinu nebo jejich fragmentů, které mohou být připraveny ve velkých množstvích. I přes prokazatelnou účinnost při potlačování růstu nádorů není mechanizmus, kterým angiostatin a endostatin blokují angiogenezi, dokonale pochopen. Angiostatin zahrnuje několik domén typu kringle a endostatin obsahuje různé strukturní motivy, z nichž každý může být odpovědný za nebo přispívající k vazbě na proteiny endotheliálních buněk a antioangiogenní aktivitu. Do rozsahu vynálezu tudíž spadají cílové proteiny, které jsou bio24

• · logicky aktivními fragmenty angiostatinu, jako například kringle 1, kringle 2, kringle 3 a jejich kombinace, a biologicky aktivní fragmenty endostatinu, které vykazují aktivity fyziologicky podobné přirozeně se vyskytujícím nezkráceným molekulám angiostatinu nebo endostatinu.

Další provedení vynálezu popisuje bifunkční hybridní konstrukty inhibitorů angiogeneze. Termín bifunkční hybridní molekula označuje protein vytvořený kombinací dvou proteinových podjednotek, kde tyto dvě podjednotky mohou pocházet z odlišných proteinů. Každá z těchto proteinových podjednotek má svou nezávislou funkci a v dané hybridní molekule mohou být funkce těchto dvou podjednotek aditivní nebo synergické. Tyto funkční hybridní proteiny by umožnily prozkoumat synergické účinky angiostatinu a endostatinu na živočišných modelech. Ve výhodném provedeni zahrnují bifunkční hybridy alespoň dva rozdílné inhibitory angiogeneze tandemově spojné přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru. Ve výhodném provedení vynálezu například cílová sekvence kóduje alespoň část angiostatinu připojenou ve stejném čtecím rámci k části endostatinu a jak angiostatinová tak endostatinová doména vykazují anti-angiogenní aktivitu nebo inhibici angiogeneze. Tyto dvě jednotky mohou být spojeny polypeptidovým linkerem.

Termín polypeptidový linker označuje nějakou peptidovou sekvenci, která může spojovat dva proteiny nebo nějaký protein a oblast Fc. Polypeptidový linker ve výhodném provedení zahrnuje větší množství aminokyselin jakými jsou například glycin a/nebo serin. Ve výhodném provedení zahrnuje polypeptidový linker sérii peptidů obsahujících glycin a serin v počtu přibližně 10 až 15 zbytků. Viz. například přihláška US 5258698, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Je nicméně zřejmé, že optimální délka linkeru a optimální ami ·· nokyselinové složení mohou být určeny standardními experimenty.

Bylo zjištěno, že expresí různých částí angiostatinu ve fúzi s oblastí Fc je možné dosáhnout vysokých hladin exprese. Důvodem je pravděpodobně skutečnost, že část Fc funguje jako nosič usnadňující správné sbalení polypeptidu na Ckonci. Oblast Fc může být navíc glykosylována a při fyziologické hodnotě pH je vysoce nabitá a tudíž usnadňuje solubilizaci hydrofobních proteinů.

Vynález rovněž popisuje způsoby produkce fúznich proteinů oblasti Fc a angiostatinu a endostatinu z jiných živočišných druhů. Fúzní proteiny s inhibitory angiogeneze z jiných druhů než člověk jsou vhodné pro preklinické studie inhibitorů angiogeneze, jelikož před testováním na lidech musí být účinnost a toxicita proteinových léčiv testována na živočišných modelech. Lidské proteinové sekvence nemusí na myších modelech fungovat, jelikož tyto proteiny mohou vyvolávat imunitní reakci a/nebo vykazovat odlišné farmakokinetické parametry, čímž by docházelo ke zkreslení výsledků. Ekvivalentní myší proteiny jsou tudíž pro testovaní na myších modelech nej lepší náhražkou proteinů lidských.

Srovnáni rozpustných fúznich proteinů huFchuAngiostatin, huFc-huEndostatin, muFc-muAngiostatin a muFc-muEndostatin s totožnými nerozpustnými proteiny produkovanými v expresívním systému E.coli bylo provedeno na standardním myším modelu Lewisova karcinomu plic (O'Reilly a další, Cell, 88:277, 1997). Rozpustné fúzní proteiny byly při potlačení růstu nádorů v modelu Lewisova karcinomu plic výrazně účinnější než odpovídající proteiny produkované v E.coli. Laboratorní myši jsou navíc inbredni a nádory se nevytvářejí spontánně, ale jejich tvorba je indukována. Účinnost na myších modelech tudíž nemusí korelovat s předpokládanou účinností vůči lidským nádorům. Preklinické stu die prováděné na psech. poskytnou o účinnosti těchto inhibitorů angiogeneze na spontánně vytvořené nádory daleko přesnější informace, jelikož existuje velké množství přirozeně se vyskytujících, spontánně vytvořených nádorů v organizmu psů. Způsoby produkce fúzních proteinů myší (mu) Fc-mu angiostatin, muFc-muEndostatin a psí (ca) Fc-ca angiostatin, caFc-caEndostatin podle vynálezu usnadní preklinické studie inhibitorů angiogeneze jak na myších, tak na psích systémech .

Vynález popisuje způsoby léčby potíží zprostředkovaných/doprovázených nefyziologickou angiogenezí a to aplikací DNA, RNA nebo proteinů podle vynálezu. Mezi patologické stavy doprovázené nefyziologickou angiogenezí patří například: pevné nádory, leukémie., metastázy, benigní nádory včetně hemangiomů, neurofibromů, trachomů a pyrogenních granulomů; revmatická arthritida; lupénka; poškození zrakového aparátu (diabetická retinopatie, retinopatie způsobená předčasných narozením, degenerace makuly, odvržení štěpu rohovky, neovaskulární glaukom), retrolentální fibroplazie, rubeosis iridis, Osler-Webberův syndrom; angiogeneze na srdečním svalu; neovaskularizace atherosklerotických plátů; teleangiektazie; angiofibromy kloubů hemofiliků; a granulace poranění; a nadměrná nebo abnormální stimulace endotheliálnich buněk, srůst střev, artheroskleróza, sklerodermální a hypertrofované jizvy, tj. keloidy.

Konstrukty DNA popsané v této přihlášce mohou být využitelné při genových terapiích, při nichž je gen pro angiostatin nebo endostatin zaveden do buněk jedním z mnoha způsobů, kdy například nativní DNA je spojena s promotorem nebo DNA ve virovém vektoru. Jakmile je tato DNA zavedena do buňky, gen pro angiostatin a/nebo endostatin nebo gen pro fragmenty těchto molekul je exprimován a příslušný protein je produkován in vivo a může vykonávat svou normální

biologickou funkci. Zavedení konstruktu DNA podle vynálezu do hostitelské buňky má za následek vysokou hladinu exprese příslušného fúzního proteinu. Fúzní proteiny podle vynálezu mohou být rovněž využitelné při léčbě potíží zprostředkovaných/doprovázených nefyziologickou angiogenezí a mohou vykazovat, ve srovnání s nativními inhibitory angiogeneze nebo jinými rekombinantními inhibitory angiogeneze, vyšší účinnost a to vzhledem ke skutečnosti, že imunofúzní proteiny s inhibitory angiogeneze podle vynálezu mají delší biologický poločas než samotné nativní inhibitory angiogeneze nebo jiné rekombinantni inhibitory angiogeneze. Bivalentní a dimerní formy podle vynálezu by, vzhledem k jejich bivalentní a dimerní struktuře, měly mít vyšší vazebnou afinitu. Bifunkční hybridní molekuly podle vynálezu mohou vykazovat vyšší klinickou účinnost, a to vzhledem k možným synergickým účinkům dvou odlišných inhibitorů angiogeneze spojených oblastí Fc nebo flexibilním polypeptidovým linkerem.

Přípravky podle vynálezu mohou být do organizmu živočichů .aplikovány jakýmkoliv vhodným způsobem, přímo (například lokálně injekcí, implantátem nebo místní aplikací na postiženou tkáň) nebo systemicky (například parenterálně nebo orálně). Je-li přípravek aplikován parenterálně, například intravenózně, subkutánně, do oka, intraperitoneálně, intramuskulárně, na tkáň tváře, rektálně, vaginálně, intraorbitálně, intracerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intravetrikulárně, intrathekálně, intracisternálně, intrakapsulárně, intranazálně nebo prostřednictvím aerosolu, pak ve výhodném provedení část tohoto přípravku zahrnuje vodnou suspenzi nebo roztok nebo suspenzi nebo roztok v jiné fyziologicky přijatelné kapalině. Použitý nosič nebo vehikulum jsou tudíž fyziologicky přijatelné, takže s výjimkou umožnění aplikace daného přípravku do organizmu pa28

cienta, tyto složky žádným nežádoucím způsobem neovlivňuji rovnováhu elektrolytů a/nebo objem v organizmu pacienta. Kapalné médium pro použitou sloučeninu může tudíž například zahrnovat fyziologický roztok (například 9,85% vodný roztok NaCl, 0,15 M, pH 7,0 až 7,4).

Ve výhodném provedení je na jednu aplikaci použito množství imunofúzinu v intervalu 50 ng/m² až 1 g/m², výhodněji pak 5 pg/m² až 200 mg/m² a nej výhodněji 0,1 mg/m² až 50 mg/m². Ve výhodném provedení je na jednu aplikaci použito množství nukleové kyseliny kódující imunofúzin v intervalu 1 pg/m² až 10 mg/m², výhodněji pak 20 pg/m² až 10 mg/m² a nejvýhodněji 400 pg/m² až 4 mg/m². Je zřejmé, že optimální způsoby aplikace a dávkování mohou být stanoveny na základě výsledků standardních experimentů v současnosti známých.

Příklady provedení vynálezu ' Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které ovšem nelimitují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Exprese huFc-huEndostatin

Lidský endostatin byl exprimován ve formě fúzního proteinu lidský Fc-lidský endostatin postupem popsaným v publikaci Lo a další, Protein Engineering, 11:495 až 500, 1998. Symbol Fc označuje Fc fragment lidského imunoglobulinu gama (sekvence DNA je uvedena jako SEK. ID. Č.: 1; aminokyselinová sekvence pak jako SEK. ID. Č.: 2). cDNA kódující endostatin (SEK. ID. Č.: 3; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 4) byla polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) upravena tak, aby mohla být exprimována jako fúzní protein Fc-Endo. Použitými přímými primery byl buď

9

primer 5'-CCCCGGGTAAACACAGCCACCGCGACTTCC (SEK. ID. Č.: 5; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 6) nebo primer 5'-CAAGCTTCACAGCCACCGCGACTTCC (SEK. ID. Č.: 7; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 8), kde sekvenci kódující N-konec endostatinu předcházely sekvence rozpoznávané restrikční endonukleázou Xmal, respektive Hindlll. Primer obsahující místo Xmal upravoval cDNA pro endostatin tak, aby mohla být zaligována do místa Xmal na konci domény CH₃ v oblasti IgGFc. Primer obsahující místo HindlII upravoval cDNA pro endostatin tak, aby mohla být zaligována do místa HindlII ve vektoru pdCs-Fc(D₄K) . Tento vektor obsahuje sekvenci Asp4-Lys rozpoznávanou enterokinázou (LaVallie a další, J. Biol. Chem., 268:23311 až 23317, 1993). Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATG (SEK. ID. Č.: 9), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčnim místem Xhol. Produkty amplifikované PCR byly klonovány a osekvenovány a fragment ohraničený restrikčními místy Xmal-Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-Fc štěpeného stejnou dvojicí enzymů. Obdobně byl fragment ohraničený restrikčními místy HindlII/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-huFc(D₄K) štěpeného stejnou dvojicí enzymů. Stabilní klony exprimující Fc-endo nebo Fc (D₄K)-endostatin byly získány elektroporací buněk NS/0 a následnou selekcí v kultivačním médiu obsahujícím 100 nM methotrexát. Exprese proteinů byla testována metodou ELISA využívající protilátky proti lidskému Fc (Příklad 3) a potvrzena SDS-PAGE, kde byl pozorován proteinový produkt o velikosti přibližně 52 kDa. Klony produkující největší množství proteinu byly subklonovány limitním ředěním.

Příklad 2

• · 9 ·* ·

9· ·· • · · •999 ···

Kultivace buněk a transfekce

Transientní transfekce byly provedeny tak, že příslušný plazmid byl do lidských ledvinných buněk 293 zaveden koprecipitaci plazmidové DNA s fosforečnanem vápenatým (Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) nebo lipofekcí s využitím Lipofectaminu Plus (Life Technologies, Gaithesburg, MD) postupem doporučeným výrobcem.

Stabilně transfekované klony byly připraveny elektroporací plazmidové DNA do buněk myšího myelomu NS/0. Buňky NS/0 byly kultivovány v Eaglově médiu modifikovaném podle Dulbecca doplněném 10% fetálním telecím sérem. Přibližně 5 x 10⁵ buněk bylo jednou promyto PBS a rozsuspendováno v 0,5 ml PBS. S takto připravenými buňkami bylo následně v elektroporačni kyvetě Gene Pulser (vzdálenost elektrod 0,4 cm, BioRad, Hercules CA) po dobu 10 minut při 0°C inkubováno deset mikrogramů linearizované plazmidové DNA. Elektroporace byla provedena elektroporátorem Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) s nastaveními 0,25V a 500 pF. Buňky byly ponechány 10 minut na ledu a poté rozsuspendovány v kultivačním médiu a vysety na 96-ti jamkové destičky. Stabilně transfekované klony byly selektovány kultivací v médiu obsahujícím 100 nM methotrexát (MTX), který byl do média přidán dva dny po transfekcí. Selekční médium bylo měněno každé tři dny a klony rezistentní vůči methotrexátu se začaly objevovat za 2 až 3 týdny. Klony exprimující požadovaný protein byly identifikovány metodou ELISA s využitím protilátek proti Fc. Klony produkující velká množství rekombinantnich proteinů byly izolovány a namnoženy v kultivačním médiu obsahujícím 100 nM MTX.

Příklad 3

ELISA

Koncentrace proteinových produktů v supernatantech po kultivaci klonů rezistentních vůči MTX a v jiných testovaných vzorcích byly stanovovány třemi odlišnými metodami ELISA. Obsah proteinů zahrnujících lidský Fc byl stanovován metodou ELISA využívající protilátky proti lidskému Fc (huFc). Obsah proteinů zahrnujících myší Fc a psí Fc byl stanovován metodou ELISA využívající protilátky proti myšímu Fc (muFc), respektive psímu Fc (caFc). Postup ELISA využívající protilátky proti lidskému Fc je detailněji popsán v dalším textu.

A. Potahování destiček

96-ti jamkové destičky (Nunc-Immuno plate MaxiSorp™, Nalge Nunc International, Rochester, NY) byly potaženy AffiniPure Goat anti-Human IgG (H4-L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 pg/ml v PBS v objemu 100 μΐ/jamka. Potažené destičky byly zakryty a inkubovány při 4°C přes noc. Následně byly destičky 4-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS a blokovány roztokem 1% BSA/1% kozí sérum v PBS v objemu 200 μΐ/jamka. Blokování probíhalo 2 hodiny při 37°C, destičky byly následně 4-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS a vysušeny poklepem na suché papírové ručníky.

B. Inkubace s testovaným vzorkem a sekundární protilátkou

Testované vzorky byly na vhodnou koncentraci zředěny vzorkovým pufrem obsahujícím 1% BSA/1% kozí sérum/0,05% Tween v PBS. S využitím chimérické protilátky (s lidským Fc) o známé koncentraci byla vytvořena standardní křivka. Standardní křivka byla vytvořena tak, že byla připravena

• 4 · · ⁹ ···· 44 444 ··· ředěni standardu ve vzorkovém pufru v intervalu 125 ng/ml až 3,9 ng/ml. Zředěné vzorky a standardy byly naneseny na destičky v objemu 100 μΐ/jamka a destičky byly následně inkubovány po dobu 2 hodináři 37 °C. Po inkubaci byly destičky 8-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS. Následně bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ sekundární protilátky proti lidskému IgG konjugované s křenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v ředění přibližně 1:120000 ve vzorkovém pufru. Přesné ředění sekundární protilátky musí být stanoveno pro každou šarži protilátky proti lidskému IgG konjugované s HRP. Po dvouhodinové inkubaci při 37°C byly destičky 8-krát promyty 0,05% Tweenem v PBS.

C. Barvení

Roztok substrátu byl připraven rozpuštěním 30 mg (1 tableta) o-fenylendiamin dihydrochloridu (OPD) v 15 ml. pufru o složení 0,025M kyselina citrónová/0,05 M Na2HPC>4, pH 5, s čerstvě přidaným 0,03% H2O2. Do každé jamky na destičce bylo přidáno 100 μΐ tohoto substrátu. Barevná reakce probíhala v temnu 30 minut při pokojové teplotě. Trvání barevné reakce může být měněno v závislosti na variabilitě v potažení destiček, variabilitě sekundárních protilátek atp. Barevná reakce byla ukončena přídavkem 4N H2SO4 v objemu 100 μΐ/jamka. Absorbance byla detekována na čtečce destiček s nastavením odečítajícím od hodnot naměřených při vlnové délce 490 nm pozadí při vlnové délce 650 nm.

Stanoveni ELISA využívající protilátky proti muFc bylo podobné pouze s tou výjimkou, že jako primární protilátka byla použita AffiniPure Goat anti-murine IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 μς/ml v PBS v objemu 100 μΐ/jamka; a jako sekundární protilátka, použitá v ředění 1 ku 5000, pak protilátka proti ♦ · · ♦ · · · • · · • · ♦ * • · · ·« ··· myšímu IgG (Fcy) konjugovaná s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Obdobně při stanovení ELISA využívající protilátky proti caFc byly destičky potaženy AffiniPure rabbit anti-dog IgG, specifické vůči Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 pg/ml v PBS v objemu 100 μΐ/jamka; a jako sekundární protilátka, použitá v ředění 1 ku 5000, pak protilátka proti psímu IgG (specifická vůči Fc) konjugovaná s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA).

Příklad 4

Exprese huFc-huAngiostatin

Lidský angiostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 10; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 11) byl exprimován ve formě fúzního proteinu lidský Fclidský angiostatin (huFc-huAngio) způsobem v podstatě identickým postupu uvedenému v Příkladu 1. cDNA kódující angiostatin (SEK. ID. Č.: 3) byla metodou PCR upravena tak, aby mohla být exprimována ve vektorech pdCs-huFc nebo pdCshuFc(D₄K) . Použitými přímými primery byl buď primer 5'CCCCGGGTAAGAAAGTGTATCTCTCAGAG (SEK. ID. Č.: 12; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 13) nebo primer 5^ZCCCCAAGCTTAAAGTGTATCTCTCAGAG (SEK. ID. Č.: 14; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 15), kde sekvenci kódující N-konec angiostatinu předcházely sekvence rozpoznávané restrikční endonukleázou Xmal, respektive HindlII. Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCCCTCGAGCTACGCTTCTGTTCCTGAGCA (SEK. ID. Č.: 16), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec angiostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol. Produkty amplifikované PCR byly klonovány, a osekvenovány a fragment ohraničený restrikčními místy Xmal-Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-Fc štěpeného stejnou dvojicí enzymů. Obdobně byl fragment ohraničený restrikčními místy HindlII/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-huFc(D₄K) . Stabilní klony NS/0 exprimující huFc-huAngio nebo huFc (D₄K)-huAngio byly selektovány a exprese testována postupy popsanými v příkladech 2 a 3.

Příklad 5

Exprese muFc-muEndostatin

Myší endostaťin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 17; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 18) a myší Fc (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 19; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 20) byly exprimovány ve formě fúzního proteinu myší Fc-myší endostatin (muFc-muEndo) způsobem v podstatě identickým postupu uvedeném v Příkladu 1. cDNA kódující endostatin (SEK. ID. Č.: 4) byla metodou PCR upravena tak, aby mohla být exprimována ve vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Použitým přímým primerembyl primer 5'-CCCCAAGCTTCATACTCATCAGGACTTTC (SEK. ID. Č.: 21; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 22), kde sekvenci kódující N-konec endostatinu předcházela sekvence rozpoznávaná restrikční endonukleázou HindlII. Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCCCTCGAGCTATTTGGAGAAAGAGGTC (SEK. ID. Č.: 23), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol. Produkt amplifikovaný PCR byl osekvenován a fragment kódující endostatin a ohraničený restrikčními místy HindlII/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Stabilní klony NS/0 exprimující muFc(D₄K)muEndo byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti muFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3.

Přiklad 6

Exprese muFc-muAngiostatin

Myši angiostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 24; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č. : 25) byl exprimován ve- formě fúzniho proteinu myší Fc-myší angiostatin (muFc-muAngio) způsobem v podstatě identickým postupu uvedeném v Příkladu 1. cDNA kódující angiostatin (SEK. ID. Č.: 6) byla metodou PCR upravena tak, aby mohla být exprimována ve vektoru pdCs-Fc (D₄K) . Použitým přímým primerem byl primer 5'CCCCAAGCTTGTGTATCTGTCAGAATGTAAGCCCTCCTGTCTCTGAGCA (SEK. ID. Č.: 26; kódované aminokyseliny uvedeny jako SEK. ID. Č.: 27), kde sekvenci kódující N-konec angiostatinu předcházela sekvence rozpoznávaná restrikční endonukleázou HindlII. Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCCCTCGAGCTACCCTCCTGTCTCTGAGCA (SEK. ID. Č.: 28), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec angiostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol (CTCGAG). Produkt amplífikovaný PCR byl osekvenován a fragment kódující angiostatin a ohraničený restrikčními místy HindlII/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Stabilní klony NS/0 exprimující muFc(D₄K)muAngio byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti muFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3.

Příklad 7

Exprese psího Fc (caFc)

K izolaci mRNA byly využity monocyty z periferní krve psů. Po syntéze prvního řetězce cDNA s využitím reverzní transkriptázy a oligo(dT) byl psí Fc (Kazuhiko a další, JN 19920408.94-A1, 1992) amplifikován přístupem PCR. Použitým • 9 přímým primerem byl primer 5'-CCTTAAGCGAAAATGGAAGAGTTCCTCGC (SEK. ID. Č.: 29; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 30), kde sekvenci kódující pantovou oblast psího Fc předcházela sekvence rozpoznávaná restrikční endonukleázou AflII. Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCTCGAGTCATTTACCCGGGGAATGGGAGAGGGATTTCTG (SEK. ID. Č. : 31), který za kodon pro ukončení translace (antikodon TCA) v sekvenci psího Fc zavádí restrikční místo Xhol. Tento reverzní primer rovněž do sekvence zavedl tichou mutaci, kterou bylo vzniklo restrikční místo Xmal usnadňující konstrukci vektoru pdCs-caFc (D₄K) tím, že bude využito linkeruadaptoru a ligace konstruktů DNA kódujících psí endostatin a angiostatin. Expresívní vektor pdCs-caFc byl zkonstruován způsobem podobných postupu při konstrukci vektoru pdCs-huFc (Lo a další, Protein Engineering, 11:495, 1998). Fragment kódující psi Fc a ohraničený restrikčními místy AflII-XhoI byl ligován s fragmentem Xbal-AflII kódujícím signální peptid pro lehký řetězec a vektorem pdCs, štěpeným restrikčními endonukleázami Xbal-Xhol. Takto připravený expresívní vektor pdCs-caFc byl následně využit k transfekci buněk 293. Přibližně tři dny po transfekci byl supernatant purifikován chromatografií na Sepharóze s navázaných proteinem A. Exprese psího Fc (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 32; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 33) byla potvrzena SDS-PAGE a následným Western blotem využívajícím králičí protilátku proti psímu IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA).

Příklad 8

Exprese caFc-caEndostatin

K sekvenci kódující psí endostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 34; aminokyselinová sekvence uvedena jako

SEK. ID. Č.: 35) byla metodou PCR přidána místa HindlII/XhoI tak, aby získaný fragment mohl být exprimován ve formě fúzního proteinu s Fc (postup je v podstatě totožný s postupem popsaným v příkladu 5). Na 3' konci byl metodou PCR za kodon kódující C-koncový lysin zaveden stop kodon a restrikční místo Notl. Na 5' konci již bylo přítomno restrikční místo DralII využitelné pro další klonování. Chemickou syntézou byl připraven oligonukleotidový duplex ohraničený kohézními konci HindlII a DralII a tento duplex byl použit k ligaci s restrikčním fragmentem DralII/XhoI kódujícím zbylou část cDNA psího endostatinu. Použitý duplex má následující sekvenci:

HindlII

5'-AGCTTCACACCCACCAGGACTTCCAGCCGGTGCTGCACCTG (SEK. ID. Č. : 36)

AGTGTGGGTGGTCCTGAAGGTCGGCCACGACGTG-5' (SEK, ID. Č.: 38)

DralII

První CAC triplet kóduje N-koncový histidinový zbytek psího endostatinu. Fragment HindlII/Xhol, kódující nezkrácený psí endostatin, může být tudíž zaligován do expresívního vektoru pdCs-caFc štěpeného restrikčními enzymy HindlII/XhoI (viz. Příklad 7). Stabilní klony NS/0 exprimující caFc-caEndo byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti caFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3. Proteinový produkt byl analyzován SDS-PAGE a exprese byla potvrzena Western blotem.

Příklad 9

Exprese caFc-caAngiostatin cDNA kódující nezkrácený psí angiostatin (sekvence DNA uvedena jako SEK. ID. Č.: 39; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 40) byla pro expresi ve formě fúzní ho proteinu s caFc upravena způsobem v podstatě identickým s postupy uvedenými v předchozích příkladech. Stručně vzato, na 3 konci byl metodou PCR za kodon kódující C-koncový lysin zaveden stop kodon a restrikční místo Notl. Místem Notl bylo nahrazeno místo Xhol, protože toto místo (Xhol) je rovněž přítomno uvnitř sekvence cDNA kódující psí angiostatin. Na 5' konci bylo, ve stejném čtecím rámci, před sekvenci kódující N-konec angiostatinu, zavedeno restrikční místo HindlII. Fragment HindiII/NotI, kódující nezkrácený psí angiostatin, byl následně zaligován do expresívního vektoru pdCs-caFc štěpeného restrikčními enzymy HindlII/Notl (zde bylo místo Notl zavedeno v místě Xhol ligací linkeru). Stabilní klony NS/0 exprimující caFc-caAngio byly selektovány a exprese testována (ELISA s využitím protilátek proti caFc) postupy popsanými v příkladech 2 a 3. Proteinový produkt byl analyzován SDS-PAGE a exprese byla potvrzena Western blotem.

Příklad 10

Exprese muFc-muKl z muAngio

Angiostatin zahrnuje první čtyři z pěti domén kringle přítomných v plazminogenu. Za účelem stanovení, zda-li je za pozorovanou anti-angiogenní aktivitu angiostatinu zodpovědná jakákoliv z domén kringle nebo několik domén kringle, je možné exprimovat každou doménu kringle samostatně nebo kombinace těchto domén. Aby bylo možné prokázat vhodnost oblasti Fc jako fúzního partnera, byla nejprve následujícím způsobem exprimována první doména kringle myšího angiostatinu (Kl). První doména kringle myšího angiostatinu je ukončena aminokyselinovým zbytkem Glu-87 (SEK. ID. Č.: 25). V sekvenci cDNA je na této pozici vhodné restrikční místo Nsil; tedy, po rozštěpeni cDNA restrikční endonukleázou Nsil byl čtyř nukleotidový 3'-přesah odstraněn polymerázou

T4, čímž byl vytvořen tupý konec. Ligací palindromového linkeru TGACTCGAGTCA (SEK. ID. Č.: 41) byl po směru transkripce za triplet GAA kódující Glu-87 vložen stop kodon (TGA) následovaný restrikčním místem Xhol. Fragment HindlII/XhoI kódující tento zkrácený angiostatin, tj. pouze první doménu kringle, byl následně zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Analýza exprese prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 11

Exprese muFc-vnitřní K1 z muAngio

Každá doména kringle obsahuje několik smyček, a to včetně vnější a vnitřní smyčky. V první doméně kringle myšího angiostatinu je vnitřní smyčka definována aminokyselinovými zbytky Cys55 a Cys79, které spoluvytvářejí disulfidovou vazbu v základně smyčky. Aminokyselinový zbytek Cys67 ve vnitřní smyčce vytváří další disulfidovou vazbu s cysteinovým zbytkem z vnější smyčky, čímž vzniká struktura kringle. Za účelem zjištění, zda-li vnitřní smyčka vykazuje antiangiogenní aktivitu, byl následujícím postupem exprimován fúzní protein muFc-vnitřní K1 (kringle 1). Metodou PCR, využívající jako templát fragment DNA kódující první doménu kringle a mutagenní primer o sekvenci 5'GGGCCTTGGAGCTACACTACA (SEK. ID. Č.: 42; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 43), byl triplet TGC kódující Cys65 zaměněn za triplet AGC kódující serin. Tato mutageneze zajišťuje, že Cys67 nebude vytvářet disulfidickou vazbu v případě, když bude vnitřní smyčka domény kringle 1 exprimována bez smyčky vnější. K zavedení restrikčního místa HindlII (ve stejném čtecím rámci) okamžitě na 5' konec kodonu pro Ser45 (AGT) . byl použit přímý primer o sek věnci 5'-GCGGATCCAAGCTTAGTACACATCCCAATGAGGG (SEK. ID. Č.: 44; aminokyselinová sekvence uvedena jako SEK. ID. Č.: 45) . Okamžitě proti směru transkripce před místo HindlII bylo zavedeno místo BamHI. Toto místo BamHI je užitečné pro ligaci do místa BamHI na konci flexibilního linkeru Ser-Gly (viz. Příklad 12). Fragment DNA ohraničený restrikčními . místy HindlII/Xhol a v myším angiostatínu kódující aminokyselinové zbytky Ser43 až Glu87 byl zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Analýza exprese muFc-vnitřní K1 prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 12

Exprese muFc-muEndo-GlySer linker-vnitřní K1 z muAngio Hybridní molekula muFc-muEndo-vnitřní K1 zahrnuje část muFc-muEndo připojenou k vnitřní smyčce první domény kringle myšího angiostatínu prostřednictvím polypeptidového linkeru obsahujícího glycinové a serinové zbytky. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem.

Na 3' konci cDNA kódující myší endostatin je restrikční místo BspHI. Flexibilní linker glycinových a serinových aminokyselinových zbytků byl na C-konec myšího endostatinu připojen tak, že fragment HindlII/BspHI o velikosti 540-bp kódující endostatin byl ligován s dvojvláknovou strukturou (duplexem) vytvořenou z oligonukleotidů popsaných sekvencemi SEK. ID. Č.: 46 a SEK. ID. Č.: 48. Aminokyselinová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí SEK. ID. Č.: 46 je uvedena jako sekvence SEK. ID. Č.: 47.

Fragment HindlII/BamHI kódující myší endostatin a linker Gly-Ser byl subklonován do standardního klonovacího vektoru. Místo BamHI bylo následně využito k zaklonování fragmentu BamHI/XhoI kódujícího vnitřní K1 z Příkladu 11. Takto

připravený fragment HindlII/Xhol kódující muEndoGlySer linker-vnitřní K1 byl zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Analýza exprese muFc-muEndoGlySer linker-vnitřní K1 prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 13

Exprese muFc-muEndo-GlySer linker-Kl z muAngio

Hybridní molekula muFc-muEndo-Kl zahrnuje část muFcmuEndo připojenou k první doméně kringle myšího angiostatinu prostřednictvím polypeptidového linkeru obsahujícího glycinové a serinové zbytky. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem.

K ligaci BamHI konce fragmentu ohraničeného restrikčními místy HindlII/BamHI kódujícího muEndo-GlySer linker (Příklad 12) k fragmentu HindlII/Xhol kódujícímu doménu kringlel myšího angiostatinu (Příklad 10) byl využit následující adaptor:

BamHI

5' GATCCTCAGGCC	(SEK. (SEK.	ID. Č. : 4 9) ID. Č.: 50)
	GAGTCCGGTCGA HindlII
Tento	adaptor obsahuje	kohezní	konec HindlII	', který ale
po ligaci	restrikční místo	HindlII	zruší. Takto	připravený

fragment HindlII/Xhol kódující muEndo-GlySer linker-Kl byl zaligován do expresívního vektoru pdCs-muFc(D₄K) . Analýza exprese muFc-muEndo-GlySer linker-Kl prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila • ·· · vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

. Příklad 14

Exprese muFc-muEndo-GlySer linker-muAngio

Hybridní molekula muFc-muEndo-GlySer linker-muAngio zahrnuje část muFc-muEndo připojenou k myšímu angiostatinu prostřednictvím polypeptidového linkeru obsahujícího glycinové a serinové zbytky. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem. Prostřednictvím adaptoru popsaného v Příkladu 13 byl BamHI konec fragmentu ohraničeného restrikčnimi místy HindlII/BamHI kódujícího muEndoGlySer linker (Příklad 12) připojen k fragmentu HindlII/XhoI kódujícímu myší angiostatin. Takto připravený fragment HindlII/Xhol kódující muFc-muEndo-GlySer linkermuAngio byl zaligován do expresivního vektoru pdCsmuFc(D₄K). Analýza exprese muFc-muEndo-GlySer linker-muAngio prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 15

Exprese huAngio-huFc-huEndo

Hybridní molekula huAngio-huFc-huEndo obsahuje lidský angiostatin připojený peptidovou vazbou k huFc-huEndo. Tento konstrukt DNA byl sestaven následujícím způsobem. Nejprve byl metodou PCR připraven fragment HindlII/Xhol kódující lidský angiostatin bez stop kodonu. Za kodonem pro poslední aminokyselinový zbytek angiostatinu okamžitě následovala sekvence CTCGAG rozpoznávaná restrikčním enzymem Xhol. S využitím adaptoru Af111/HindIII' byl 5' konec (s místem HindlII) tohoto fragmentu ligován s fragmentem Xbal/AflII kódujícímu signální peptid lehkého řetězce (Lo a další,

• ·

Protein Engineering, 11:495, 1998). Sekvence použitého adaptoru Af111/HindIII' je následující:

AflII

5' TTAAGCGGCC (SEK. ID. Č.: 51)

CGCGGGTCGA (SEK. ID. Č.: 52)

HindlII'

Tento adaptor obsahuje kohezní konec HindlII', který ale po ligaci restrikční místo HindlII zruší. Místo Xhol na 3' konci bylo prostřednictvím adaptoru Xhol'/AflII ligováno do místa AflII z fragmentu AflII/XhoI kódujícího huFc-huEndo. Sekvence použitého adaptoru XhoI'/AflII je následující:

Xhol'

5'TCGACTCCGGC (SEK. ID. Č.: 53)

GAGGCCGAATT (SEK. ID. Č. : 54)

AflII

Tento adaptor obsahuje kohezní konec Xhol', který ale po ligaci restrikční místo Xhol zruší. Takto připravený fragment Xbal/Xhol kódující signální peptid-lidský angiostatinhuFc-lidský endostatin byl zaligován do expresívního vektoru pdCs. Analýza exprese rekombinantního proteinu prováděná metodou ELISA s využitím protilátek proti muFc a SDS-PAGE potvrdila vysokou hladinu exprese jak u tranzientně, tak u stabilně transfekovaných buněk.

Příklad 16

Farmakokinětiká

V jedné sérii farmakokinetických experimentů bylo myším C57/BL6 s implantovanými nádory Lewisova karcinomu plic o objemu 100 až 200 mm³ do ocasní žíly injikováno 720 pg huFc44

huAngio na jednu myš. Objem nádorů a dávka huFc-huAngio byly zvoleny tak, aby napodobovaly protokol popsaný v publikaci O'Reilly a další, Nátuře Medicíně, 2:689, 1996. 1/2, 1, 2, 4, 8, 24 a 48 hodin po injekci byly myším retrorbitálně odebírány vzorky krve. Tyto vzorky byly analyzovány metodou ELISA s využitím protilátek proti huFc a Western blotem. Bylo zjištěno, že huFc-huAngio má v organizmu myši biologický poločas přibližně 32 hodin a analýza metodou Western blot prokázala, že více než 90% huFc-huAngio zůstává v krevním oběhu v intaktní formě.

Tyto farmakokinetické studie byly rovněž opakovány s využitím myší Swiss bez nádorů a při použití dávek 200 pg/myš. V tomto případě byl biologický poločas huFc-huAngio v organizmu myší přibližně 33 hodin.

Předkládaný vynález může být, bez odchýlení se od své podstaty nebo základních charakteristik, aplikován i jinými než popsanými způsoby. Příklady provedení vynálezu uvedené v předchozích textu by tudíž měly být považovány za toliko ilustrativní a ne jakýmkoliv způsobem limitující rozsah vynálezu. Rozsah vynálezu je tudíž definován především připojenými patentovými nároky a ne uvedeným popisem a veškeré změny, které jsou ekvivalentní údajům popsaným patentovými nároky spadají rovněž do rozsahu vynálezu.

SEZNAM SEKVENCÍ <110>

<120>

Lo, Kin-Ming

Li, Yue

Gillies, Stephen D

Exprese a export inhibitorů angiogeneze ve formě imunofúzinů

<130>	LEX-006PC
<140> <141>
<150> <151>	US 60/09788 1998-08-25
<160>	54
<170>	Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 696 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (.1) . . (696) <223> Fragment Fc lidského imunoglobulinu typu gama <400> 1

gag Glu 1

ccc aaa tet

tet Ser 5

gac Asp

aaa Lys

act Thr

cac aca

tgc Cys

cca ccg

tgč Cys

cca Pro 15

gca Ala ·

48

Pro Lys

Ser

His

Thr 10

Pro

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

96

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

i aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tec

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

144

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

192

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

50

55

60

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

cag

240

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

tac

aac

age

a cg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

288

Tyr

Asn

Šer

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

85

90

95

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

336

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

100

105

110

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

384

• · ·« » » * · *

Leu

Pro

Ala 115

Pro

Ile

Glu Lys

Thr 120

Ile Ser Lys Ala

Lys 125

Gly

Gin

Pro

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tea

cgg

gag

atg

acc

432·

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Met

Thr

130

135.

140

aag

aac

Cag

gtc

ágc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

age

480

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser '

145

150

155

160

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

tac

528

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

165

.170

175

aag

acc

a cg

cct

ccc.

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ctc

tat

57 6

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

age

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

age

agg

tgg

cag

ggg

aac

gtc

ttc

624

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

tea

tgc

tec

gtg

atg

cat

gág

get

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

672

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

age

ctc

tec

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

696

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

225

230

<210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Glu 1

Pro

Lys

Ser

Ser 5

Asp

Lys

Thr

His

Thr 10

Cys

Pro

Cys

Pro 15

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu 20

Gly

Pro

Ser

Val 25

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 30

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 35

Leu

Met

Ile

Ser

Arg 40

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 45

Cys

Val

Asp. Val 50

Ser

His·

Glu

Asp 55

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 60

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp 65

Gly

Val

Glu

Val

His 70

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 75

Pro

Arg

Glu

Gin 80

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 85

Arg

Val

Val·

Ser

Val 90

Leu

Thr

Val

Leu

His 95

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 100

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 105

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 110

Lys

Ala

• ·

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

• ·

• · · · J.ys jGly ÍGIr

«· · ř^r<?

115

120

• ♦ ·· ·

• · • ·

125, J » *« ·

• ·

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Šer

Arg

Glu Glu Met

Thr

130

135

140

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe Tyr Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu Asn Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe Phe Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly Asn Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr Thr Gin

Lys

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

225

230

<210> 3 <211> 549 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(549) <223> endostatin <400> 3

cac agc His Ser 1

cac cgc His Arg

gac ttc cag ccg gtg

ctc cac

ctg gtt gcg

ctc Leu 15

aac Asn

48

Asp 5

Phe Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

agc

ccc

ctg

tca

ggč

ggc

atg

cgg

ggc

atc

cgc

ggg

gcc

gac

ttc

cag

96

Ser

Pro

Leu

Ser

Gly

Met

Arg

Gly

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

tgc

ttc

cag

gcg

cgg

gcc

gtg

ggg

ctg

gcg

ggc

acc

ttc

cgc

gcc

144

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

ttc

ctg

tcc

tcg

cgc

ctg

cag

gac

ctg

tac

agc

atc

gtg

cgc

cgt

gcc

192

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Ala

50

55

60

gac

cgc

gca

gcc

gtg

ccc

atc

gtc

aac

ctc

aag

gac

gag

ctg

ttt

240

Asp

Arg

Ala

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu.

Phe

65

70

75

80

ccc

agc

tgg

gag

gct

ctg

ttc

tca

ggc

tet

gag

ggt

ccg

ctg

aag

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Pro

Leu

Lys

Pro

85

90

95

·· ·« • · 4 4

4 4«

• ·*

·· • ·

• • 4 •

• 4 · • · · ·

•

• •

• · · • ·

• •

ggg

gca

cgc

atc

ttc

tcc

ttt

gac

ggc

aag

gaV*<ftc**ctg

c*ác

• · ccc

ttt

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Lys

Asp Val Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

acc

tgg

ccc

cag

aag

agc

gtg

tgg

cat

ggc

tcg gac ccc

aac

ggg

cgc

384

Thr

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser Asp Pro

Asn

Gly

Arg

115

120

125

agg

ctg

acc

gag

agc

tac

tgt

gag

acg

tgg

cgg acg gag

gct

ccc

tcg

432

Arg

Leu

Thr

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg Thr Glu

Ala

Pro

Ser

130

135

140

gcc

acg

ggc

cag

gcc

tcc

tcg

ctg

.ggg

ggc agg ctc

ctg

ggg

cag

480

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Gly

Gly Arg Leu

Leu

Gly

Gin

145

150

155

160

agt

gcc

gcg

agc

tgc

cat

cac

gcc

tac

atc

gtg ctc tgc

att

gag

aac

528

*

Ser

Ala

Ser

Cys

His

Ala

Tyr

Ile

Val Leu Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

,

agc

ttc

atg

act

gcc

tcc

aag

549

Ser

Phe

Met

Thr

Ala

Ser

Lys

180

<210>	4
<211>	183
<212>	PRT .
<213>	Homo sapiens
<400>	4

1 His 1

Ser His

Arg

Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val

Ala Leu Asn 15

5

10

Ser

Pro

Leu

Ser

Gly

Met

Arg

Gly

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Ala

50

55

60

Asp

Arg

Ala

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Phe

65

70

75

80

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Pro

Leu

Lys

Pro

I

85

90

95

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Lys

Asp

Val

Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

Thr

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Asn

Gly

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Thr

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Ala

Pro

Ser

130

135

140

Ala 145

Thr'Gly

Gin

Ala

Ser 150

Ser

Leu

Leu Gly

Gly Arg 155

Leu

Gly

Gin 160

Ser

Ala Ala

Ser

Čys 165

His

Ala

Tyr Ile 170

Val Leu

Cys

Ile

Glu 175

Asn

Ser

Phe Met

Thr

Ala

Ser

Lys

180 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro lidský Fc-Endo <220>

<221> CDS <222> (3)..(29) <400> 5 cc ccg ggt aaa cac agc cac cgc gac ttc c 30

Pro Gly Lys His Ser His Arg Asp Phe ' 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 6

Pro Gly Lys His Ser His Arg Aso Phe

5 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221> CDS <222> (2) . .(25) <400> 7' c aag ctt cac agc cac cgc gac ttc c Lys Leu His Ser His Arg Asp Phe 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence

<400> 8
Lys Leu His 1	Ser His Arg Asp Phe 5

<210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro lidský FcEndo <400> 9 cctcgagcta cttggaggca gtcatg <210> 10 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1) . . (1089) <223> angiostatin <400> 10

aaa Lys 1

gtg tat

ctc tea Leu Ser 5

gag tgcaag act ggg aat gga aag aac

tac Tyr 15

aga Arg

48

Val

Tyr

Glu Cys Lys

Thr

Gly 10

Asn

Gly

Lys

Asn

ggg

acg

atg

tcc

aaa

aca

aaa

aat

ggc

atc

acc'

tgt

caa.

aaa

tgg

agt

96

Gly

Thr

Met

Ser

Lys

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

20

25

30

tcc

act

tet

ccc

cac

aga

cct

aga

ttc

tea

cct

gct

aca

cac

ccc

tea

144

Ser

Thr

Ser

Pro

His

Arg

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

35

40

45

gag

gga

ctg

gag

aac

tac

tgc

agg

aat

cca

gac

aac

gat

ccg

cag

192

Glu

Gly Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

50

55

60

ggg

ccc

tgg

tgc

tat

act

gat

cca

gaa

aag

aga

tat

gac

tac

tgc

240

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

65

70

75

80

gac

att

ctt

gag

tgt

gaa

gag

gaa

tgt

atg

cát

tgc

agt

gga

gaa

aac

288

Asp

Tle

Leu

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

85

90

95

tat

gac

ggc

aaa

att

tcc

aag

acc

atg

tet

gga

ctg

gaa

tgc

cag

gcc

336

Tyr

Asp

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

100

105

110

tgg gac tet

cag age cca

cac get

cat His

gga Gly

tac Tyr

att cct Ile Pro 125

tec Ser

aaa Lys

ttt Phe

384

Trp

Asp

Ser 115

Gin

Ser Pro

His

Ala 120

cca

aac

aag

aac

ctg

aag

aat

tac

tgt

cgt

aac

ccc

gat

agg

gag

432

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg

Glu

130

135

140

ctg

cgg

cct

tgg

tgt

ttc

acc

gac

ccc

aac

aag

ege

tgg

gaa

ctt

480

Leu

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

145

150

155

160

tgc

gac

.atc

ccc

ege

tgc

aca

cct

cca

tet

ggt

ccc

acc

528

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr

165

170

175

tac

cag

tgt

ctg

aag

gga

aca

ggt

gaa

aac

tat

ege

ggg

aat

gtg

get

576

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn

Val.

Ala

180'

185

190

gtt

acc

gtt

tec

ggg

cac

acc

tgt

cag

cac

tgg

agt

gca- ^fcag

acc

cct

624

Val

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

195

200

205

cac

aca

cat

aac

agg

aca

cca

gaa

aac

ttc

ccc

tgc

aaa

aat

ttg

gat

672

His

Thr

His

Asn

Arg.Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

210

215

220

gaa

aac

tac

tgc

ege

aat

cct

gac

gga

aaa

agg

gcc

cca

tgg

tgc

cat

720

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly-Lys

Arg

Ala

Pro

Trp

cys

His '

225

230

235

240

aca

acc

aac

age

caa

gtg

,^cgg

tgg

gag

tac

tgt

aag

ata

ccg

tec

tgt

768

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

245

250

255

gac

tec

cca

gta

tec

acg

gaa

caa

ttg

get

ccc

aca

gca

cca

cct

816

Asp

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr

Ala

Přo

Pro

260

265

270

gag

cta

acc

cct

gtg

gtc

cag

gac

tgc

tac

cat

ggt

gat

gga

cag

age

864

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

275

280

285

tac

ega

ggc

aca

tec

acc

aca

gga

aag

tgt

cag

tet

912

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

290

295

300

tgg

tea

tet

atg

aca

cca

cac

cgg

cac

cag.

aag

acc

cca

gaa

aac

tac

960

Trp

Ser

Meť

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr

305

310

315

320

cca

aat

get

ggc

ctg

aca

atg

aac

tac

tgc

agg

aat

cca

gat

gcc

gat

1008

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp'

325

330

335

aaa

ggc

ccc

tgg

tgt

ttt

acc

aca

gac

ccc

age

gtc

agg

tgg

gag

tac

1056

1089

Lys Gly Pro Trp 340

Cys

Phe

Thr Thr

Asp Pro Ser Val Arg Trp

Glu

Tyr

345

350

tgc

aac

ctg

aaa

tgc

tea

gga

aca

gaa

gcg

Cys

Asn

Leu

Lys

Cys

Ser

Gly

Thr

Glu

Ala

355

360

<210>

11

<211>

343

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

11

Lys

Val

Tyr

Leu

Ser

Glu

Cys

Lys

Thr

Gly

Asn

Gly

Lys

Asn

Tyr

Arg

1

5

10

15

Gly

Thr

Met

Ser

Lys

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

20

25

30

Ser

Thr

Ser

Pro

His

Arg

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

35

40

45

Glu

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

50

55

60

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

65

70

75

80

Asp

lije

Leu

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

85

90

95

Tyr Asp

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

100

105

110

Trp

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

115

120

125

Pro

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg

Glu

130

135

140

•

Leu

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

*

145

150

155

160

Cys

Asp

Ile

Pro'

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr

165

170

175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn

Val

Ala

180

185

190

Val

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

195

200

205

His

Thr

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

210

215

220

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Lys

Arg

Ala

Pro

Trp

Cys

His

225

230

235

240

44

• 4

• 4 X ··

4«· • ·

4 * O

4 4 • 4

·. ·

4 4

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cýs Jly4 lleÍPro^Ser

·_Λ ·

245

250

··*·

··

*·* ”555

Asp

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr Ala Pro

Pro

260

265

270

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp Gly Gin

Ser

275

280

285

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Lys

Lys Cys Gin

Ser

290

295

300

Trp

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

Lys

Thr

Pro Glu Asn

Tyr

305

310

315

320

Pro

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro Asp Ala

Asp

325

330

335

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg Trp Glu

Tyr

340

345

350

Cys

Asn

Leu

Lys

Cys

Ser

Gly

Thr

Glu

Ala

355

360

··

4»* · <210>

<211>

<212>

<213>

DNA

Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence:

Přímý primer pro lidský Fc-Angio <220>

<221>

CDS

<222>	(2) . . (	29)
<4 00>	12
	cc ccg	ggt aag aaa	gtg	tat ctc
	Pro	Gly Lys Lys	Val	Tyr Leu
	1		5
<210>	13
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Uměle	připravená	sekvence
<400>	13

tca Ser gag Glu

Pro Gly Lys Lys Val Tyr Leu Ser Glu 1 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220> ....

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro lidský Fc Angio <220>

<221> CDS <222> (2)..(28) <400> 14 c ccc

Pro aag

Lys ctt

Leu aaa

Lys gtg Val tat

Tyr ctc

Leu tea Ser gag Glu <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 15

Pro Lys Leu Lys Val Tyr Leu Ser Glu

5 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro lidský FcAngio <400> 16 cccctcgagc tačgcttctg ttcctgagca

<210>	17
<21í>	552
<212>	DNA
<213>	Mus	musculus
<220>
<221>	CDS
<222>	(1) ·	..(552)
<223>	endostatin
<400>	17

cat His 1

act Thr

cat His

cag Gin

gac ttt

cag Gin

cca gtg Pro Val

ctc cac ctg

gtg gcá ctg

aac Asn

Asp 5

Phe

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

.Leu 15

acc

ccc

ctg

tet

gga

ggc

atg

cgt

ggt

atc

cgt

gga

gca

gat

ttc

cag

Thr

Pro

Leu

Ser

Gly

Met

Arg

Gly

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp

Phe

Gin

20

25

30

tgc

ttc

cag

caa

gcc

ega

gcc

gtg

ggg

ctg

tcg

ggc

acc

ttc

cgg

get

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

ttc Phe

ctg tcc

tet agg ctg

cag Gin 55

gat Asp

ctc Leu

• 9 taÝ Tyr

• · • · • · • · • • · · agc Ser

• • • • 9 9 atc Ile 60

• • · • • • • · 9 gtg Val

9 • 9 9 9 9 9 99 cgc Arg

• • • · • • cgt Arg

• · · • 9 9 9 9 · • 99 9 gct Ala

192

Leu 50

Ser

Arg

Leu

gac

cgg

ggg

tet

gtg

ccc

atc

gtc

aac

ctg

aag

gac

gag

gtg

cta

tet

240

Asp Arg

Gly

Ser

Val

Pro

Ile

Val

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Val

Leu

Ser

65

70

75

80

ccc

agc

tgg

gac

tcc

ctg

ttt

tet

ggc

tcc

cag

ggt

caa

gtg

caa

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Asp

Ser

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Gin

Gly

Gin

Val

Gin

Pro

85

90

95

ggg

gcc

cgc

atc

ttt

tet

ttt

gac

ggc

aga

gat

gtc

ctg

aga

cac

cca

336

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp

Val

Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

gcc

tgg

ccg

cag

aag

agc

gta

tgg

cac

ggc

tcg

gac

ccc

agt

ggg

cgg

384

Ala

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Arg

115

120

125

agg

ctg

atg

gag

agt

tac

tgt

gag

aca

tgg

ega

act

gaa

act

ggg

432

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr

Glu

Thr

Gly

130

135

140

gct

aca

ggt

cag

gcc

tcc

tcc.

ctg

tea

ggc

agg

ctc

ctg

gaa

cag

480

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ser

Gly

Arg

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

aaa

gct

gcg

agc

tgc

cac

aac

agc

tac

atc

gtc

ctg

tgc

att

gag

aat

528

Lys

Ala

Ser

Cys

His

Asn

Ser

Tyr

Ile

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

agc

ttc

atg

acc

tet

ttc

tcc

aaa

552

Ser

Phe

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180

<210> 18 <211> 184 <212>.PRT <213> Mus musculus

<400> 18 His 1

Thr

His

Gin

Asp 5

Phe

Gin

Pro

Val

Leu 10

His

Leu

Val

Ala

Leu 15

Asn

Thr

Pro

Leu

Ser 20

Gly. Gly

Met

Arg'

Gly 25

Ile

Arg

Gly

Ala

Asp 30

Phe

Gin

4

Cys

Phe

Gin 35

Gin

Ala

Arg

Ala

Val 40

Gly

Leu

Ser

Gly

Thr 45

Phe

Arg

Ala

i

Phe

Leu 50

Ser

Arg

Leu

Gin 55

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile 60

Val

Arg

Ala

Asp 65

Arg

Gly

Ser

Val

Pro 70

Ile

Val

Asn

Leu

Lys 75

Asp

Glu

Val

Leu

Ser 80

•

·· ·· • · ·

• • ·

•

• · •

• · · • · · ·

• •

• • ·

• •

Pro

Ser

Trp

Asp

Ser

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser,

Glji.VaJZjGln'

85

90

95

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp Val

Leu

Arg

His

Pro

100

105

110

Ala

Trp

Pro

Gin

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser Asp

Pro

Ser

Gly

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Met

Glu

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg Thr

Glu

Thr

Gly

130

135

140

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ser

Gly Arg

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

Lys

Ala

Ser

Cys

His

Asn

Ser

Tyr

Ile

Val Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165

170

175

Ser

Phe

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180

<210> 19 <211> 699 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1) . .(699) <223> Fc <400> 19

gag Glu 1

ccc aga ggg Pro Arg Gly

ccc aca

atc Ile

aag Lys

ccc tgt

cct Pro

cca tgc

aaa Lys

tgc Cys 15

cca Pro

48

Pro 5

Thr

Pro

Cys 10

Pro

Cys

gca

cct

aac

ctc

ttg

ggt

gga

cca

tcc

gtc

ttc

atc

ttc

cct

cca

aag

96

Ala

Pro

Asn

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Lys

20

25

30

atc

aag

gat

gta

ctc

atg

atc

tcc

ctg

age

ccc

ata

gtc

aca

tgt

gtg

144

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Met

Ile

Ser

Leu

Ser

Pro

Ile

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

gtg

gat

gtg

age

gag

gat

gac

cca

gat

gtc

cag

atc

age

tgg

ttt

192

Val

Asp

Val

Ser

Glu Asp

Asp

Pro

Asp

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

' 50

55

60

gtg

aac

gtg

gaa

gta

cac

aca

gct

cag

aca

caa

acc

cat

aga

gag

240

Val

Asn

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

Gin

Thr

Gin

Thr

His

Arg

Glu

65

70

75

80

gat

tac

aac

agt

act

ctc

cgg

gtg

gtc

agt

gcc

ctc

ccc

atc

cag

cac

288

Asp

Tyr

Asn

Ser

Thr

Leu

Arg

Val

Ser

Ala

Leu

Pro

Ile

Gin

His

85

90

95

cag

gac

tgg

atg

agt

ggc

aag

gag

ttc

aaa

tgc

aag

gtc

aac

aaa

336

Gin

Asp

Trp

Met

Ser

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Cys

Lys

Val

Asn

Lys

100 105 110

gac Asp

ctc Leu

cca gcg ccc

atc gag

aga acc atc

tca Ser

aaa Lys

ccc Pro 125

aaa Lys

ggg Gly

tca Ser

384

Pro Ala 115

Pro

Ile

Glu

Arg 120

Thr

Ile

gta

aga

gct cca

cag.

gta

tat

gtc

ttg

cct

cca

gaa

gag

atg

432

Val

Arg

Ala Pro

Gin

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Glu

Met

130

135

140.

act

aag

aaa cag

gtc

act

ctg

acc

tgc

atg

gtc

aca

gac

ttc

atg

cct

4 80

Thr

Lys

Lys Gin

Val

Thr

Leu

Thr

Cys

Met

Val

Thr

Asp

Phe

Met

Pro

145

150

155

160

gaa

gac

att tac

gtg..

gag

tgg

acc

aac

ggg

aaa

aca

gag

cta

aac

528

Glu

Asp

Ile Tyr

Val

Glu

Trp

Thr

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Leu

Asn

165

170

175

tac

aag

aac act

gaa

cca

gtc

ctg

gac

tet

gat

ggt

tet

tac

ttc

atg

576

Tyr

Lys

Asn Thr

Glu

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

Met

180

185

190

tac

agc

aag ctg

aga

gtg

gaa

aag

aac

tgg

gtg

gaa

aga

aat

agc

624

Tyr

Ser

Lys Leu

Arg

Val

Glu

Lys

Asn

Trp

Val

Glu

Arg'

Asn

Ser

195

200

205

tac

tcc

tgt tca

gtg

gtc

cac

gag

ggt

ctg

cac

aat

cac

acg

act

672

Tyr

Ser

Cys Ser

Val

His

Glu

Gly

Leu

His

Asn

His

Thr

210

215

220

aag

agc

ttc tcc

cgg

acc

ccg

ggt

aaa

699

Lys

Ser

Phe Ser

Arg

Thr

Pro

Gly

Lys

225

230

<210> 20 <211> 233 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 20
Glu Pro Arg 1	Gly	Pro 5	Thr	Ile	Lys
Ala	Pro	Asn	Leu 20	Leu	Gly Gly	Pro
Ile	Lys	Asp.Val 35	Leu	Met	Ile	Ser 40
Val	Val 50	Asp	Val	Ser	Glu	Asp 55	Asp
Val 65	Asn	Asn	Val	Glu	Val 70	His	Thr
Asp	Tyr	Asn	Ser	Thr 85	Leu	Arg	Val

Pro	Cys 10	Pro	Pro	Cys	Lys	Cys 15	Pro
Ser 25	Val	Phe	Ile	Phe	Pro 30	Pro	Lys
Leu	Ser	Pro	Ile	Val 45	Thr	Cys	Val
Pro	Asp	Val	Gin 60	Ile	Ser	Trp	Phe
Ala	Gin	Thr 75	Gin	Thr	His	Arg	Glu 80
Val	Ser- 90	Ala	Leu	Pro	Ile	Gin 95	His

Gin Asp Trp Met

Ser

Gly Lys

Glu

Phe 105

• • Lys • • ·

• · • · jfye* • · ·

• • j>ys •

• • · Va§L • · ·

• • · Asji 110·

♦ • Asji •

• · • · · ií/s : • · ·

100

Asp

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Pro

Lys

Gly

Ser

115

120

125

Val

Arg

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Glu

Met

130

135

140

Thr

Lys

Gin

Val

Thr

Leu

Thr

Cys

Met

Val

Thr

Asp

Phe

Met

Pro

145

150

155

160

Glu

Asp

Ile

Tyr

Val

Glu

Trp

Thr

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Leu

Asn

165

.170

175

Tyr

Lys

Asn

Thr

Glu

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

Met

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Arg

Val

Glu

Lys

Asn

Trp

Val

Glu

Arg

Asn

Ser

195

200

205

Tyr

Ser

Cys

Ser

Val

His

Glu

Gly

Leu

His

Asn

His

Thr

210

215

220

Lys

Ser

Phe

Ser

Arg

Thr

Pro

Gly

Lys

225 230 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro myší Fc-Endo <220>

<221> CDS <222> (2)..(28) <400> 21 c ccc aag ctt cat Pro Lys Leu His 1 act cat cag gac ttt c

Thr His Gin Asp Phe <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 22

Pro Lys Leu His.Thr His Gin Asp Phe ' 5 <210> 23 <211> 28' <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro myší Fc-Endo <400> 23 cccctcgagc tatttggaga aagaggtc <210> 24 <211> 1086 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(1086) <223> angiostatin <400> 24

* 1

gtg tat Val Tyr 1

ctg tea Leu Ser

gaa tgt aag acc ggc atc ggc aac ggc tac aga

gga Gly

48

Glu 5

Cys Lys

Thr Gly

Ile 10

Gly

Asn

Gly Tyr

Arg 15

acc

atg

tcc

agg

a ca

aag

agt

ggt

gtt

gcc

tgt

caa

aag

tgg

ggt

gcc

96

Thr

Met

Ser

Arg

Thr

Lys

Ser

Gly

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp. Gly

Ala

20

25

30

acg

ttc

ccc

cac

gta

ccc

aac

tac

tet

ccc

agt

aca

cat

ccc

aat

gag

144

Thr

Phe

Pro

His

Val

Pro

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Thr

His

Pro

Asn

Glu

35

40

45

gga

cta

gaa

gag

aac

tac

tgt

agg

aac

cca

gac

aat

gat

.gaa

caa

ggg

192

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Gin

Gly

50

55

60

cct

tgg

tgc

tac

act

aca

gat

ccg

gac

aag

aga

tat

gac

tac

tgc

aac

240

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn

⁶⁵

70

75

80

att

cct

gaa

tgt

gaa

gag

gaa

tgc

atg

tac

tgc

agt

gga

gaa

aag

tat

288

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys

Tyr

85

90

95

gag

ggc

aaa

atc

tcc

aag

acc

atg

tet

gga

ctt

gac

tgc

cag

gcc

tgg

336

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin

Ala.

Trp

100

105

110

gat

tet

cag

agc

cca

cat

get

cat

gga

tac

atc

cct

gcc

aaa

ttt

cca

384

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe

Pro

i

115

120

125

·

agc

aag

aac

ctg

aag

atg

aat

tat

tgc

cac

aac

cct

gac

ggg

gag

cca

432

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

His

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

agg

ccc

tgg

tgc

ttc

aca

gac

ccc

acc

aaa

ege

tgg

gaa

tac

tgt

480

Arg 145

Pro

Trp Cys

Phe

Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu

Tyr

Cys 160

150

155

gac

atc

ccc

ege

tgc

aca

ccc

ccg

ccc

cca

ccc

age

cca

acc

tac

528

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

caa

tgt

ctg

aaa

gga

aga

ggt

gaa.

aat

tac

ega

ggg

acc

gtg

tet

gtc

576

Gin Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn.

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

180

185

190

acc

gtg

tet

ggg

aaa

acc

tgt

cag

ege

tgg

agt

gag

caa

acc

cct

cat

624

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

agg

cac

aac

agg

aca

cca

gaa

aat

ttc

ccc

tgc

aaa

aat

ctg

gaa

gag

672

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

210

215

220

aac

tac

tgc

cgg

aac

cca

gat

gga

gaa

act

gct

ccc

tgg

tgc

tat

acc

720

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

act

gac

age

cag

ctg

agg

tgg

gag

tac

tgt

gag

att

cca

tcc

tgc

gag

768

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu .

245

250

255

tcc

tca

gca

tca

cca

gac

cag

tca

gat

tcc

tca

gtt

cca

gag

816

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Val

Pro

Glu

260

265

27Q

caa

aca

cct

gtg

gtc

cag

gaa

tgc

tac

cag

age

gat

ggg

cag

age

tat

864

Gin

Thr

Pro

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

275

280

285

cgg

ggt

aca

tcg

tcc

act

acc

atc

aca

ggg

aag

tgc

cag

tcc

tgg

912

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp

290

295

300

gca

gct

atg

ttt

cca

cac

agg

cat

tcg

aag

acc

cca

gag

aac

ttc

cca

960

Ala

Met

Phe

Pro

His

Arg

His

Ser

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

305

310

315

320

gat

gct

ggc

ttg

gag

atg

aac

tac

tgc

agg

aac

ccg

gat

ggt

gac

aag

1008

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Lys

325

330

335

ggc

cct

tgg

tgc

tac

ačc

act

gac

ccg

age

gtc

agg.

tgg

gaa

tac

tgc

1056

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

' Glu

Tyr

Cys

340

345

350

aac

ctg

aag

cgg

tgc

tca

gag

aca

gga

ggg

1086

Asn

Leu

Lys

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr

Gly

355 360

<210> 25 <211> 362, <212> PRT' <213> Mus musculus <400> 25

Val 1

Tyr Leu Ser

Glu 5

Cys Lys Thr Gly Ile 10

Gly

Asn Gly

Tyr

Arg Gly 15

Thr

Met

Ser

Arg

Thr

Lys-

Ser

Gly

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Gly

Ala·

20

25

30

Thr

Phe

Pro

His

Val

Pro

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Thr

His

Pro

Asn

Glu

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Gin

Gly

50

55

60

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

75

80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys.

Tyr

85

90

⁹⁵

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp·

100

105

•110

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe

Pro

115

120

125

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

His

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

Arg

Pro

Třp

Cys

Phe

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

145

150

155

160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

180

185

190

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

210

215

220

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

24.0

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

245

250

255

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Val

Pro

Glu

260

265

270

Gin

Thr

Pro

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

275

280

285

Arg

Gly

Thr

Ser

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp

290

295

300

Ala 305

Ala

Met

Phe

Pro

His 310

Arg

His

Ser

Lys

Thr 315

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro 320

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu 325

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg 330

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp .335

Lys

Gly

Pro

Trp

Cys 340

Tyr

Thr

Asp

Pro 345

Ser

Val

Arg

Trp

Glu 350

Tyr

Cys

Asn

Leu

Lys 355

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr 360

Gly

<210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro myší Fc-Angio <220>

<221> CDS <222> (2) . . (49) <400> 26 c ccc aag ctt gtg tat ctg tca gaa tgt aag Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 27

Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys 15 10 <210> 28 <211> 30 f <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro myši Fc-Angio <400> 28 cccctcgagc taccctcctg tctctgagca 30 ·« • · <210> 29 <211> 29 <212> DNA ¹ <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Přímý primer pro psí Fc <220>

<221> CDS <222> (3)..(29) <400> 29 cc tta agc gaa aat gga aga gtt cct cgc

Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg

5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 30

Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg

5 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Reverzní primer pro psí Fc <400> 31 cctcgagtca tttacccggg gaatgggaga gggatttctg 40 <210> 32 <211> 702 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS

<222>	(1) .	. (702
<223>	Fc
<400>	32

gaa Glu 1

aat Asn

gga Gly

aga Arg

gtt cct

cgc Arg

cca Pro

cct Pro

gat tgt Asp Cys 10

ccc aaa

tgc Cys

cca Pro 15

gcc Ala

48

Val 5

Pro

Lys

cct

gaa

atg

ctg

gga

ggg

cct

tcg

gtc

ttc

atc

ttt

ccc

ccg

aaa

ccc

96

Pro

Glu

Met

Leu

Gly Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

aag

gac

acc

ctc

ttg

att

gcc

ega

aca

cct

gag

gtc

aca

tgt

gtg

144

• •

• · • · • • · • · • · ·

·· • ·« • · • • ·

• • · • • • • · «

• • · • • • • · ·

• • • · • 1

• · • · · • · • · • · »· ···

Lys

Asp

Thr

Leu

Ile

Ala

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

gtg

gat

ctg

gga

cca

gaa

gac

cct

gag

gtg

cag

atc

agc

tgg

ttc

gtg

192

Val

Asp

Leu

Gly

Pro

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

Val

50

55

60

gac

ggt

aag

cag

atg

caa

aca

gcc

aag

act

cag

cct

cgt

gag

cag

240

Asp

Gly

Lys

Gin

Met

Gin

Thr

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

ttc

aat

ggc

acc

tac

cgt

gtg

gtc

agt

gtc

ctc

ccc

att

ggg

cac

cag

288

Phe

Asn

Gly

Thr

Tyr Arg

Val

Ser

Val

Leu

Pro

Ile

Gly

His

Gin

85

90

95

gac

tgg

ctc

aag

ggg

aag

cag

ttc

acg

tgc

aaa

gtc

aac

aaa

gcc

336

Asp

Trp

Leu

Lys

Gly

Lys

Gin

Phe

Thr

Cys

Lys

Val

Asn

Lys

Ala

100

105

110

ctc

cca

tcc

ccg

atc

gag

agg

acc

atc

tcc

aag

gcc

aga

ggg

cag

gcc

384

Leu

Pro

Ser

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Arg

Gly

Gin

Ala

115

120

125

cat

cag

ccc

agt

gtg

tat

gtc

ctg

ccg

cca

tcc

cgg

gag

ttg

agc

432

His

Gin

Pro

Ser

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Leu

Ser

130

135

140

aag

aac

aca

gtc

agc

ttg

aca

tgc

ctg

atc

aaa

gac

ttc

cca

cct

480

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Ile

Lys

Asp

Phe

Pro

145

150

155

160

gac

att

gat

gtg

gag

tgg

cag

agc

aat

gga

cag

gag

čet

gag

agc

528

Asp

Ile

Asp

Val

Glu

Trp

Gin

Ser

Asn

Gly

Gin

Glu

Pro

Glu

Ser

165

170

175

aag

tac

cgc

acg

acc

ccg

ccc

cag

ctg

gac

gag

gac

ggg

tcc

tac

ttc

576

Lys

Tyr

Arg

Thr

Pro

Gin

Leu

Asp

Glu

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

180

185

190

ctg

tac

agc

aag

ctc

tet

gtg

gac

aag

agc,

cgc

tgg

cag

cgg

gga

gac

624

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Arg

Gly

Asp

195

200

205

acc

ttc

ata

tgt

gcg

gtg

atg

cat

gaa

get

cta

cac

aac

cac

tac

aca

672

Thr

Phe

Ile

Cys

Ala

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

210

215

220

cag

aaa

tcc

ctc

tcc

cat

tet

ccg

ggt

aaa

702

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

225

230

i <210> 33 <211> 234 <212> PRT <213> Canis familiaris <4.00> 33

Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala

1 .

5

10

15

Pro

Glu

Met

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

Lys

Asp

Thr

Leu

Ile

Ala

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

.45

*

Val

Asp

Leu

Gly

Pro

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Ile

Ser

Trp

Phe

Val

50

' 55

60

Asp

Gly

Lys

Gin

Met

Gin

Thr

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

Phe

Asn

Gly

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Pro

Ile

Gly

His

Gin

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Lys

Gly

Lys

Gin

Phe

Thr

Cys

Lys

Val

Asn

Lys

Ala

100

105

110

Leu

Pro

Ser

Pro

Ile

Glu

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Arg

Gly

Gin

Ala

115

120

125

His

Gin

Pro

Ser

Val

Tyr

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Leu

Ser

130

135

140

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Ile

Lys

Asp

Phe

Pro

145

150

155

160

Asp

Ile

Asp

Val

Glu

Trp

Gin

Ser

Asn

Gly

Gin

Glu

,,Pro

Glu

Ser

.165

170

175

Lys

Tyr

Arg

Thr

Pro

Gin

Leu

Asp

Glu

Asp

Gly

Ser

Tyr

Phe

180

185

190

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Arg

Gly

Asp

195

200

205

Thr

Phe

Ile

Cys

Ala

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

210

215

220

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

225 230 <210> 34 <211> 552 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(552) <223> Endostatin <400> 34

cac

acc

cac

cag

gac

ttc

cag

ccg

gtg

ctg

cac

ctg

gtg

gcc

ctg

aac

48

His

Thr

His

Gin

Asp

Phe

Gin

Pro

Val

Leu

His

Leu

Val

Ala

Leu

Asn

1

5

10

15

agc ccg cag ccg ggc ggc atg

ega ggc atc

cgg Arg

gga gcg Gly Ala

gac ttc Asp Phe 30

cag Gin

96

Ser Pro Gin Pro

Gly

Met

Arg

Gly Ile 25

20

tgc

ttc

cag

gcg

cgc

gcc

gcg

ggg

ctg

gcc

ggc

acc

ttc

cgg

gcc

144

Cys

Phe

Gin

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

Thr

Phe

Arg

Ala

35

40

45

ttc

ctg

tcg

cgg

ctg

cag

gac

ctc

tac

agc

atc

gtg

cgc

gcc

192

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Arg

Ala

50

55

60

gac

cgc

acc

ggg

gtg

ccc

gtc

aac

ctc

agg

gac

gag

gtg

ctc

ttc

240

Asp

Arg

Thr

Gly

Val

Pro

Val

Asn

Leu

Arg

Asp

Glu

Val

Leu

Phe

65

70

75

80

ccc

agc

tgg

gag

gcc

tta

ttc

tcg

ggc

tcc

gag

ggc

cag

ctg

aag

ccc

288

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Gin

Leu

Lys

Pro

85

90

95

ggg

gcc

cgc

atc

ttc

tet

ttc

gac

ggc

aga

gat

gtc

ctg

cag ,cac

ccc

336

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp

Val

Leu

Gin

His

Pro

100

105

110

gcc

tgg

ccc

cgg

aag

agc

gtg

tgg

cac

ggc

tcc

gac

ccc

agc

ggg

cgc

384

Ala

Trp

Pro

Arg

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Arg

115

120

125

cgc ctg acc gac

agc.tac tgc gag

acg tgg Thr Trp

cgg acg gag gcc ccg gcg

432

Arg Leu Thr

Asp

Ser Tyr Cys 135

Glu

Arg

Thr Glu Ala 140

Pro

Ala

130 .

gcc

acc

ggg

cag

gcg

tcg

ctg

gcg

ggc

agg

ctg

gag

cag

480

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

Arg

Leu

Glu

Gin

145

150

155

160

gag

gcc

gcg

agc

tgc

cgc

cac

gcc

ttc

gtg

ctc

tgc

atc

gag

aac

528

Glu

Ala

Ser

Cys

Arg

His

Ala

Phe

Val

Leu

Cys

Ile

Glu

Asn

165 170 175 agc gtc atg acc tcc ttc tcc aag

Ser Val Met Thr Ser Phe Ser Lys

180

552 <210> 35 <211> 184 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 35

His 1	Thr	His	Gin	Asp 5	Phe	Gin
Ser	Pro	Gin	Pro 20	Gly	Gly	Met
Cys	Phe	Gin	Gin	Ala	Arg	Ala

Pro	Val	Leu 10	His	Leu	Val	Ala	Leu 15	Asn
Arg	Gly 25	Ile	Arg	Gly	Ala	Asp 30	Phe	Gin
Ala	Gly	Leu	Ala	Gly	Thr	Phe	Arg	Ala

4 · « ·

·« • ·

4» · *

• · * *

• • · •

• «

»· • ·

• • *

• · · * 4

9 •

• ····

• · »·

«« · ·

• ··

♦ <*> ·

35

40

45

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Asp

Leu

Tyr

Ser

Ile Val

Arg Arg

Ala

50

55

60

Asp

Arg

Thr Gly

Val

Pro

Val

Asn

Leu

Arg

Asp Glu

Val Leu

Phe

65

70

75

80

Pro

Ser

Trp

Glu

Ala

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly Gin

Leu Lys

Pro

85

90

95

Gly

Ala

Arg

Ile

Phe

Ser

Phe

Asp

Gly

Arg

Asp

Val Leu

Gin His

Pro

100

105

110

Ala

Trp

Pro

Arg

Lys

Ser

Val

Trp

His

Gly

Ser

Asp Pro

Ser Gly

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Thr

Asp

Ser

Tyr

Cys

Glu

Thr

Trp

Arg

Thr Glu

Ala Pro

Ala

130

135

140

Ala

Thr

Gly

Gin

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

Arg Leu

Leu Glu

Gin

145

150

155

160

Glu

Ala

Ser

Cys

Arg

His

Ala

Phe

Val

Leu Cys

Ile Glu

Asn

165

170

.· 175

Ser

Val

Met

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

180 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker HindlII/Drall-I: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (3)..(41) <400> 36 ag ctt cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg

Leu His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu

5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 37

Leu His Thr His Gin Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu

10 <210> 38 <211> 34 <212> DNA

<213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvencelinker HindlII/DralII: spodní řetězec <400> 38 gtgcagcacc ggctggaagt cctggtgggt gtga <210> 39 <211> 1077 <212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(1077) <223> Angiostatin <400> 39

ata tat ctt

tea Ser

gag tgc aag

act gga

aat Asn 10

ggg aaa acc

tac agg Tyr Arg 15

ggg Gly

48

Ile 1

Tyr Leu

Glu Cys 5

Lys

Thr

Gly

Lys Thr

acc

atg

gcc

aaa

acg

aag

aat

gat

gtt

gcc

tgt

caa

aaa

tgg

agt

gac

96

Thr

Met

Ala

Lys

Thr

Lys

Asn

Asp

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Asp

20

25

30

aat

tet

ccg

cac

aaa

cct

aac

tat

acg

cct

gag

aag

cac

ccc

ttg

gag

144

Asn

Ser

Pro

His

Lys

Pro

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Lys

His

Pro

Leu

Glu

35

40

45

ggg

ctg

gag

aac

tat

tgc

agg

aac.

cct

gac

aac

gac

gag

aac

ggg

192

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Asn

Gly

50

55

60

ccc

tgg

tgc

tac

acc

aca

aac

cca

gac

gtg

agg

ttc

gac

tac

tgc

aac

240

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asn

Pro

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

75

80

att

cca

gaa

tgt

gaa

gag

gaa

tgt

atg

cat

tgc

agt

ggg

gaa

aat

tat

288

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90.

95

gag

ggc

aaa

att

tcc

aag

aca

aag

tet

gga

ctc

gag

tgc

caa

gcc

tgg

336

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

aac

tet

caa

acc

cca

cat

gct

cat

gga

tat

att

cct

tcc

aaa

ttt

cca

384

Asn

Ser

Gin

Thr

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

agc

aag

aac

ttg

aag

atg

aat

tac

tgc

cgt

aac

cct

gat

ggg

gag

ccc

432

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

• ·

	cgc Arg 145	cca tgg tgt	ttc Phe	acc Thr 150
Pro	Trp	Cys
	gac	att	ccc	cgc	tgt	.aca
	Asp	Ile	Pro	Arg	Cys 165	Thr
	cag	tgt	ctg	aag	ggc	aga
	Gin	Cys	Leu	Lys 180	Gly Arg
	act	gtc	tet	gga	cat	aca
	Thr	Val	Ser 195	Gly	His	Thr
	aag	cac	aac	agg	acc	cca
	Lys	His 210	.Asn	Arg	Thr	Pro
	aac	tac	tgt	cgc	aac	cct
	Asn 225	Tyr	Cys	Arg	Asn	Pro 230
	acc	aac	agt	gag	gtg	agg
	Thr	Asn	Ser	Glu	Val 245	Arg
	tcc	tet	cca	ata	acc	aca
	Ser	Ser	Pro	Ile 260	Thr	Thr.
	cct	gaa	caa	act	cct	gtg
	Pro	Glu	Gin 275	Thr	Pro	Val
	agt	tat	ega	ggc	aca	tea
	Ser	Tyr 290	Arg Gly	Thr	Ser
	tet	tgg	tea	tet	atg	aca
-	Ser 305	Trp	Ser	Ser	Met	Thr 310
	! ttc	ccg	gag	get	ggc	ctg
	Phe	Pro	Glu	Ala	Gly 325	Leu
	' gac	aaa	agc	cct	tgg	tgt
	Asp	Lys	Ser	Pro 340	Trp	Cys
	' ttc	tgt	aac	ttg	aga	aaa
	Phe	Cys	Asn 355	Leu	Arg	Lys

atg Met	gat Asp	ccc Pro	aac aaa	cgc Arg	tgg gaa ttc tgt	480
Asn	Lys 155	Trp	Glu	Phe Cys 160
aca	cca	cca	ccc	cct	tcg	ggc	cca	acg	tac	528
Thr	Pro	Pro	Pro	Pro	Ser	Gly	Pro	Thr	Tyr
			170					• 175
ggg	gag	agc	tac	ega	ggg	aag	gtg	tcc	gtc	576
Gly	Glu	Ser	Tyr	Arg	Gly	Lys	Val	Ser	Val
		185					190
tgt	cag	cac	.tgg	agt	gaa	cag	acc	cct	cac	624
Cys	Gin	His	Trp	Ser	Glu	Gin	Thr	Pro	His
	200					205
gaa	aac	ttc	cct	tgc	aaa	aat	ttg	gat	gaa	672
Glu	Asn	Phe	Pro	Cys	Lys	Asn	Leu	Asp	Glu
215					220
gat	gga	gaa	aca	get	cca	tgg	tgc	tac	aca	720
Asp	Gly	Glu	Thr	Ala	Pro	Trp	Cys	Tyr	Thr
				235					240
tgg	gaa	cac	tgc	cag	att	ccg	tcc	tgt	gag	768
Trp	Glu	His	Cys	Gin	Ile	. -Pro	Ser	Cys	Glu
			250					255'
gaa	tat	ttg	gat	gcc	cca	get	tea	gtg	cca	816
Glu	Tyr	Leu	Asp. Ala	Pro	Ala	Ser	Val	Pro
		265					270
gtc	cag	gag	tgc	tac	cac	ggc	aat	ggg	cag	864
Val	Gin	Glu	Cys	Tyr	His	Gly	Asn	Gly	Gin
	280					285
tcc	act	act	atc	aca	gga	aga	aaa	tgt	cag	912
Ser	Thr	Thr	Ile	Thr	Gly Arg	Lys	Cys	Gin
295					300
cca	cac	ega	cat	gag	aag	acc	cca	gaa	cac	960
Pro	His	Arg	His	Glu	Lys	Thr	Pro	Glu	His
				315					320
aca	atg	aac	tac	tgc	agg	aat	ccc	gac	gcc	1008
Thr	Met	Asn	Tyr	Cys	Arg	Asn	Pro	Asp	Ala
			330					335
tac	acc	acc	gac	ccc	tet	gtg	cgc	tgg	gag	1056
Tyr	Thr	Thr	Asp	Pro	Ser	Val	Arg	Trp	Glu
		345					350
tgc										1077
Cys

ΊΟ <210> 40 <211> 359 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 40

Ile 1

Tyr

Leu

Ser Glu Cys 5

Lys Thr

Gly Asn Gly Lys 10

Thr Tyr

Arg 15

Gly

Thr

Met

Ala

Lys

Thr

Lys

Ásn

Asp

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Asp

20

25

λ

30

Asn

Ser

Pro

His

Lys

Pro

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Lys

His

Pro

Leu

Glu

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Asn

Gly

50

55

60

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Asn

Pro

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

75

80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90

95

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

Asn

Ser

Gin

Thr

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125.

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu.

Pro

130

135

140

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Met

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys

145

150

155

160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Pro

Ser

Gly

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly Arg

Gly

Glu

Ser

Tyr

Arg

Gly

Lys

Val

Ser

Val

180

185

190

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

Lys

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

210

215

220

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

Thr

Asn

Ser

Glu

Val

Arg

Trp

Glu

His

Cys

Gin

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

245

250

255

Ser

Pro

Ile

Thr

Glu

Tyr

Leu

Asp

Ala

Pro

Ala

Ser

Val

Pro

260

265

270

Pro

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

His

Gly

Asn

.Gly

Gin

275

280

285

Ser

Tyr

Arg

Gly

Thr Ser

Ser

Thr

Ile

Thr

Gly

Arg

Lys

Cys

Gin

290

295

300

Ser

Trp

Ser

Met Thr

Pro

His

Arg

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

His

305

310

315

320

Phe

Pro

Glu

Ala

Gly. Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

325 ·

330

335

Asp

Lys

Ser

Pro

Trp Cys

Tyr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

340

345

350

Phe

Cys

Asn

Leu

Arg Lys

Cys

355 <210> 41 <211> 12 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: palindromový linker, kde je stop kodon TGA následován restrikčním místem Xhol <400> 41 tgactcgagt ca 12 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: mutagenní primer pro myší angiostatin <220>

<221> CDS <222> (1)..(21) <400> 42 ggg cct tgg age tac act aca,

Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr'

5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> .43

Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr

5 ♦ · <210> 44 <211> 34 <212> DNA ’ <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer použitý k zavedeni místa HindlII do myšího angiostatinu <220>

<221> CDS <222> (9)..(32) <400> 44 gcggatcc aag ctt agt aca cat ccc aat gag gg 34

Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu

5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 45

Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu

5 <210> 46 <211> 59 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BspHI/BamHI: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (2)..(58) <400> 46 c atg acc tet ttc tcc aaa tcg agc ggg ggc agc ggg ggc gga ggc agc 4 9 Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 ggc ggg ggc g 59

Gly Gly Gly <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <400> 47

Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser ¹ 5 10 ' 15

Gly Gly Gly

<210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BspHI/BamHI: spodní řetězec ,<400> 48 gatccgcccc cgccgctgcc tccgcccccg ctgcccccgc tcgatttgga gaaagaggt 59 <210> 49 <211> 12 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BamHI/HindlII: horní řetězec ....

<220>

<221> CDS <222> (3)..(11) <400> 49 ga tcc tca ggc c

Ser Ser Gly '

<210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker BamHI/HindlII: spodní řetězec <400> 50 agctggčctg ag <210> 51 <211> 10 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker AflII/HindlII: horní řetězec <220>

<221> CDS

<400> 51 tta agc ggc c

Leu Ser Gly <210> 52 <211> 10 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker AflII/HindlII: spodní řetězec <400> 52 agctgggcgc <210> 53 <211> 11 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker Xhol/AflII: horní řetězec <220>

<221> CDS <222> (3)..(11) <400> 53 tc gac tcc ggc Asp Ser Gly 1 <210> 54 <211> 11 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: linker Xhol/AflII: spodní řetězec <400> 54' ttaagccgga g

• ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Molekula DNA kódující fúzní protein zahrnující:

(a) signální sekvenci;

(b) oblast Fc imunoglobulinu; a (c) sekvenci cílového proteinu vybranou ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu a jejich kombinace.
2. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná signální sekvence, zmíněná oblast Fc imunoglobulinu a zmíněná sekvence cílového proteinu jsou kódovány postupně ve směru 5' k
3' .

3. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná signální sekvence, zmíněná sekvence cílového proteinu a zmíněná oblast Fc imunoglobulinu jsou kódovány postupně ve směru 5' k
4. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná oblast Fc imunoglobulinu zahrnuje pantovou oblast imunoglobulinu.
5. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná oblast Fc imunoglobulinu zahrnuje pantovou oblast imunoglobulinu a doménu konstantní části těžkého řetězce imunoglobulinu.
6. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná oblast Fc imunoglobulinu zahrnuje pantovou oblast a doménu CH₃.
7. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná oblast Fc imunoglobulinu postrádá přinejmenším doménu CHi.
8. Molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná oblast Fc imunoglobulinu kóduje alespoň část imunoglobulinu typu gama.
9. Replikující se expresívní vektor k transfekci savčích buněk vyznačující se tím, že tento vektor obsahuje DNA podle nároku 1.
10. Savčí buňky vyznačující se tím, že tyto buňky obsahují DNA podle nároku 1.
11. Fúzní protein vyznačující se tím, že tento protein obsahuje Fc oblast imunoglobulinu a nějaký cílový protein vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu a jejich kombinace.
12. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že zmíněný fragment plazminogenu má molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEK. ID. Č.: 3.
13. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že zmíněný cílový protein zahrnuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEK. ID. Č.: 3.
14. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že zmíněný fragment kolagenu XVIII zahrnuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEK. ID. Č.:
15. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ici se tím, že zmíněný cílový protein zahrnuje alespoň dvě molekuly vybrané ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu a nějaký fragment kolagenu XVIII, kde zmíněné dvě molekuly jsou spojeny peptidovým linkerem.
16. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že zmíněný cílový protein je připojen k N-konci zmíněné oblasti Fc imunoglobulinu.
17. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že zmíněný cílový protein je připojen k C-konci zmíněné oblasti Fc imunoglobulinu.
18. Multimerní protein vyznačující se tím, že tento protein zahrnuje přinejmenším dva fúzní proteiny podle nároku 11 spojené disulfidickou vazbou .
19. Multimerní protein podle nároku 18 vyznačující se tím, .že cílovým proteinem v alespoň jednom ze zmíněných fúzních proteinů je angiostatin a cílovým proteinem v alespoň jednom ze zmíněných fúzních proteinů je endostatin.
20. Multimerní protein podle nároku 18 vyznačující se tím, že cílovým proteinem v obou fúzních proteinech je angiostatin.
21. Multimerní • · · • · · ··· protein podle nároku 18 vyznačující se tím, že cílovým proteinem v obou fúzních proteinech je endostatin.
22. Fúzní protein podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že tento protein dále obsahuje druhý cílový protein vybraný ze skupiny zahrnující angiostatin, endostatin, nějaký fragment plazminogenu s aktivitou angiostatinu, nějaký fragment kolagenu XVIII s aktivitou endostatinu.
23. Fúzní protein podle nároku 22 vyznačuj ící se tím, že zmíněný druhý cílový protein je k prvnímu cílovému proteinu připojen polypeptidovým linkerem.
24. Fúzní protein podle nároku 22 vyznačuj ící se tím, že zmíněný první cílový protein je připojen k N-konci zmíněné oblasti Fc imunoglobulinu a zmíněný druhý cílový protein je připojen k C-konci zmíněné oblasti Fc imunoglobulinu.
25. Multimerní fúzní protein vyznačující se tím, že tento protein zahrnuje alespoň dva fúzní proteiny podle nároku 11, kde tyto fúzní proteiny jsou spojeny polypeptidovou vazbou.
26. Způsob produkce fúzního proteinu vyznačuj ící se tím, že tento způsob zahrnuje:

a) vytvoření savčí buňky podle nároku 11; a

b) kultivaci této savčí buňky za účelem produkce zmíněného fúzního proteinu.
27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje další krok, kterým je sesbírání zmíněného fúzního proteinu.
28. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje další krok, kterým je odštěpení zmíněné oblasti Fc imunoglobulinů od zmíněného cílového proteinu.
29. Způsob léčby zdravotních obtíží způsobených angiogenezí vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání DNA podle nároku.1 do organizmu savce, u kterého je žádoucí aplikovat nějaký inhibitor angiogeneze .
30. Způsob léčby zdravotních obtíží způsobených angiogenezí vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání vektoru podle nároku 9 do organizmu savce, u kterého je žádoucí aplikovat nějaký inhibitor angiogeneze .
31. Způsob léčby zdravotních obtíží, které mohou být zmírněny podáním angiostatinu nebo endostatinu, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání účinného množství fúzního proteinu podle nároku 11 do organizmu savce trpícího zmíněnou zdravotní obtíží.