CZ2001646A3

CZ2001646A3 - Způsob chromatografického čištění insulinů

Info

Publication number: CZ2001646A3
Application number: CZ2001646A
Authority: CZ
Inventors: Werner Sievers; Richard Bicker; Dieter Desch; Eysmondt Jörg Von; Reinhold Keller; Frank Richard
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2001-09-12
Also published as: JP2002523732A; US6710167B1; BR9913092A; DE19838097A1; CZ300604B6; WO2000011030A3; DK1107988T3; CN1313866A; HUP0103325A3; EP1107988A2; CA2341355C; DE59914580D1; HUP0103325A2; ES2296407T3; ZA200101096B; AU756105B2; RU2222546C2; ATE380827T1; CN1198843C; TR200100634T2

Description

Oblast techniky

Vynález se týká zlepšeného způsobu chromatografického čištění insulinů.

Dosavadní stav techniky

Aby byly splněny extrémně vysoké požadavky na čistotu, vyznačují se postupy výroby insulinů v podstatě vedle enzymatických nebo/a gentechnických způsobů chromatografickými způsoby ,

Pod pojmem insuliny se. zde rozumí insuliny pocházející z přírodních zdrojů nebo rekombinantní insuliny (to znamená exprimované geneticky modifikovanými mikroorganismy) zvířecího nebo lidského původu (například prasečí insulin, hovězí insulin nebo humánní insulin), proinsuliny (například prekursory insulinu, preinsuliny) neJbo deriváty insulinu.

Jako deriváty riváty přírodně se insulinu nebo zvířecích alespoň jednoho přírodně nv nebo/a adicí alespoň organického zbytku odpovídajícího, se vyskytujícího insulinu.

označovány insulinů, které se následující detotiž humánního liší substitucí insulinu jsou vyskytujících insulinů, se vyskytujícího esteru aminokyselijednoho zbytku aminokyseliny nebo/a jinak stejného, přírodně

Humánní insulin je aminokyselin. Tak zvaný B (basický) řetězec z 30 aminokyselin se vyskytuje vždy dva cysteinové můstek (oba řetězce můstky). V a B-řetězce který je řetězec vybudován z 51 sestává z 21, obou řetězců přičemž jsou d i sulfidový cvsteinovými polypeptid,

A (kyselý) zbytků aminokyselin.

cysteinových zbytků, zbytky spolu spojeny přes jsou spolu spojeny dvěma biologicky aktivním humánním insulinu jsou Aspolu spojeny přes dva cysteinové můstky a další • · · · · ♦ • · · · · · · · ·«· ··· · · · · · můstek je v A-řetězci. Následující cvsteinové zbytky jsou spolu spojeny v (biologicky účinném) humánním insulinu:

A7 - All

A7 - B7

A20 - B19

Písmena A nebo B označují příslušné řetězce insulinové aminokyseliny,. číslice označují polohu zbytku aminokyseliny, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného řetězce aminokyseliny.

Výroba rekombinantního insulinu probíháí obvykle ve stupních fermentace a otevření buněk, následovaných proteinchemickými a technologickými výrobními postupy, obvykle chromatografickými procesy čištění produktu.

Gentechnické způsoby umožňují vyrábět lidský proinsulin nebo proinsulin (proinsulin od derivátů insulinu), který má jednu aminosekvenci nebo/a délku řetězce aminokyseliny odlišnou od humánního insulinu, v mikroorganismech. Proinsulinv vyrobené geneticky pozměněnými buňkami Escherichia coli nemají žádné korektně spojené cvsteinové můstky. Způsob získávání, humánního insulinu s korektně spojenými cysteinovými můstky je známý například z EP 0 055 945. Zlepšené způsoby výroby humánního insulinu a derivátů insulinu s korektně spojenými cysteinovými můstky jsou popsány v EP 0 600 372 Al (US 5,473.049) a v EP 0 668 292 A2 (US 5,663.291).

Proinsulin vyrobený geneticky modifikovanými mikroorganismy, prekurzor insulinu, se nejdříve izoluje z buněk, korektně se složí a pak se enzymaticky přemění na humánní insulin. Štěpná směs, vzniklá při enzymatických peptizačních procesech, obsahuje vedie nežádoucích vedlejších produktů také cennou látku jakož i nežádoucí doprovodné látky podobné insulinu, které se od cenného produktu neliší zřetelně ani molekulovou hmotností ani jinými fyzikálními vlastnostmi, což značně ztěžuje dělení a čištění právě ve velkoprovozním měřítku.

·· ·· ·· ·♦ *· · • ·· · · · · · · · · · *·· · · * ·· · ··· · · · · · · ··*· ·· ·· ···· ·· ···

Provozně technické postupy pro vyčištění jsou různé, za setou zařazené chromatografické způsoby (například adsorpční chromatografie, ionexová chromatografie, vysokotlaká chromatografie s obrácenými fázemi nebo jejich kombinace), částečně ve více stupních s různými nosnými materiály, zčásti s navazující krystalizací, přičemž se vlastní vyčištění dosahuje chromatografií. K oddělení doprovodných látek podobných insulinu dochází přitom na iontoměničích nebo na nosičích na bázi silikagelu s obrácenými fázemi.

Konečné oddělení nejmenších nečistot jako poslední stupeň čištění se obvykle provádí v oblasti vysokého tlaku pomocí chromatografie na silikagelu s obrácenými fázemi (RP-HPLC = Reversed Phase High Pressure Liguid Chromatography = vysokotlaká kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi).

Pod pojmem silikagel s obrácenými fázemi (to znamená li— pofilně modifikovaný, tedy hvdrofóbní silikagel) se rozumí křemičitanový materiál, na který byla nanesena hvdrofóbní vrstva. Pro hvdrofóbní vrstvu se použijí například alkany s délkou řetězce o 3 až 20 atomech uhlíku, zejména o 4 až 18 atomech uhlíku. Velikosti zrn leží v rozmezí 10 až 50 pm, velikosti pórů v rozmezí 50 až 300 . 10'¹⁰ m.

Jako příklady chromatografických způsobů, které používají podle stavu techniky silikagelv s obrácenými fázemi (lipofilně modifikované silikagelv), je možno jmenovat postupy podle EP 0 547 544 Ά2 (US 5,621.073) nebo EP 0 474 213 AI (US 5,245,008). Podle stavu techniky mohou být splněny vysoké požadavky na čistotu insulinů, které mají být vyrobeny, pouze použitím silikagelů s obrácenými fázemi. Použití silikagelu s obrácenými fázemi však má značné nevýhody.

Silikagely s obrácenými fázemi jsou v rozmezí od pH 2 do pH 10 stabilní. Při chromatografi i fermentačních produktů se získají vždy vvsokomolekulární vedlejší produkty, které ·* ·· ·· • « · · * « · · · · ··· · » · ·t • 4 · · · 4 4 «·« ···· 44 44 ···· *·· jsou nevýhodně absorbovány a obvyklou elucí nemohou být desorbovánv. Vedlejší produkty se časem obohacují na silikagelu s obrácenými fázemi (hovoří se o stárnutí adsorbčního. prostředku). Regenerace, popřípadě čištění na místě (ClP-cleaning in plače) se většinou daří jen promýváním zředěným louhem sodným. Tím se při každém postupu CIP rozruší část silikagelu s obrácenými fázemi, jehož stálé nahrazování je velmi nákladné. Dále existuje pro insuliny na silikagelech denaturační nebezpečí.

Je známa řada pokusů, jak nahradít silikagely s obrácenými fázemi na bázi silikátů. Pokusy s materiálem s obrácenými fázemi na bázi oxidu hlinitého nebo oxidu titaničitého (oba materiály nejsou zcela pH-stabi lni ,. ale alespoň stabilnější nežli silikagel) ukázaly, že dělení je pouze nedostatečné a že požadované specifikace, popřípadě čistoty nelze dosáhnout.

Další nutnou vlastností chromatografických materiálů je jejich stabilita vůči tlaku. Pod pojmem polymerní chromatog·rafické materiály stabilní vůči tlaku se rozumí částice (které se mohou vyskytovat v nejrůznějších formách, jako ve formě tyčinek, ve formě zlomků nebo s výhodou v kulové formě a s výhodou mají průměr mezi 10 a 35 pm) organických polymerů, jejichž deformace pod tlakem (až 7 MPa) je jen malá. Materiál vyskytující se v chromatografické koloně musí byt tak dobře naplněn, aby nebyly přítomné žádné dutiny (kvalita plnění rozhoduje o výsledku dělení). K plnění kolon jsou v zásadě známé dvě rozdílné techniky, které mohou být použity i v kombinaci. Existuje metoda, pomocí níž se pomocí pístu (většinou hydraulicky ovládaného) náplň stlačí (DAC = Direct Axial Compression - přímé axiální stlačení), popřípadě se kolona hydrodynamicky naplní pomoc í vysokotlakého čerpadla, to znamená suspenze kapaliny a částic se do kolony vtačí. V obou případech ukazuje praxe, že na průřez kolony musí působit tlaky až 7 MPa, aby částice mohly být naplněny pokud možno hustě a bez vznikajících dutin.

·· ·· ·· ·· ·· • · > · · 9 · · 9 · • · · «· « ·· • · · · · · · ·· « • · · · · t «· ···· *· ·· ···· «·

Mnohé částice organických polymerů nejsou stabilní na tlak a deformují se působením tlaku natolik, že se z kuliček stanou ploché destičky, které se překrývají a zamezují průtoku náplní. Naproti tomu jsou siikagely s obrácenými fázemi samy o sobě podstatně tvrdší a téměř se působením tlaku nedeformuj í .

Podstata vynálezu

Vynález si klade za úkol poskytnout způsob chromatografického čištění insulinů na vhodných chromatografických materiálech. které by byly stabilní vůči tlaku a byly by použitelné v celém rozsahu pH od 1 do 14, čímž by se dosahoval tak vysoký dělící výkon, že k docílení potřebné čistoty insulinu při současném zvýšení výtěžku by byl místo obvyklých dvou nebo více po sobě zařazených chromatografických stupňů podle dosavadního stavu techniky zapotřebí pouze jediný dělící stupeň .

Tento úkol je vyřešen způsobem chromatografického čiš-? tění insulinů, který spočívá v tom, že se použije jako stacionární fáze organický polymerní chromatografický materiál stabilní vůči tlaku, mobilní fáze obsahuje nejméně jedno s vodou mísitelné organické rozpouštědlo a nejméně jeden pufr a hodnota pH činí 7 až 11.

Neočekávaně bylo zjištěno, že se chromatografií v rozmezí pH od 7 do 11, tedy v bazickém rozmezí, dosáhne velmi dobrého rozdělení na organických polymerních chromatografických materiálech. Hodnota pH činí s výhodou 9 až 10.

Zvláštní výhoda způsobu podle vyná.lezu spočívá v tom, že v tomto bazickém rozmezí pH je potlačena tvorba amidoinsu1 i nu, vedlejšího produktu, který obvykle vzniká v kyselém prostředí a který se podle specifikací insulinových přípravků musí oddělit na velmi malá zbytková množství.

·· · ··· ·· ···

Mobilní fáze, které se použijí pro eluci, obsahují organická rozpouštědla mísitelná s vodou, jako například alkoholy, které obsahují 1 až 4 atomy uhlíku, ketony, methvlacetát nebo acetonitril. Výhodné jsou alkoholy jako například 1-propanol nebo 2-propanol (n- nebo iso-propanol), methanol nebo ethanol. Koncentrace organických rozpouštědel mísitelných s vodou činí 1 až 90 % objemových, s výhodou 10 až 50 % obj emových.

Mobilní fáze obsahují dále pufr, aby se hodnota pH elučního prostředku udržela na konstantní hodnotě. Vhodné puf ry jsou například fosfáty, alkalické soli nebo soli alkalických zemin, jako citrát sodný nebo acetát draselný, citrát amonný, acetát amonný, síran amonný nebo chlorid amonný.

Nastavení hodnoty pH se dosahuje přídavkem kyseliny solné nebo louhu sodného.

Eluce může být provedena isokraticky, to znamená s. konstantní koncentrací pufrů nebo s konstantním podílem organického rozpouštědla nebo s výhodou s lineárním gradientem,, tedy se zvýšováním podílu rozpouštědla.

Průměrná velikost částic organického polymerního chro— matografického materiálu by měla činit s výhodou 5 až 300 pm, s výhodou 10 až 50 pm. Čím menší je velikost částic, tím ostřejší a lepší bude dělení. Ovšem stabilita vůči tlaku je u menších částic menší.

Insulin Je relativně malý polypeptid (molekulová hmotnost přibližně 6000) a může bez problémů difundovat do pórů o průměru 10 nm (žádná stérická zábrana). Materiály s malými průměry pórů jsou vhodnější, protože specifický povrch a tím adsorpční kapacita je větší. Průměrná velikost pórů organického polymerního chromatografického materiálu stabilního vůči tlaku činí účelně 5 až 500 nm, s výhodou 10 až 50 nm.

Pro způsob podle vynálezu jsou zvláště vhodné organ i cké polvmerní chromatografické materiály stabilní vůči působení tlaku, které jsou s výhodou tvořeny polystyrendivinvlbenzenem nebo polymethakrvlátem. Příklady obchodně běžných organických polymerních chromatografickych materiálů, stabilních vůči tlaku, které mohou být použity při způsobu podle vynálezu, jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

Obchodně běžné chromatografické materiály

Výrobce	Obchodní název	Materiál	Nej menší velikost částic (pm)	Průměr pórů (nm)
TosoHaas	Amberchrome^R	PMA	35	100
Pharmacia	Source^R	StDVB	15	100
Perseptive	Poros^R	StDVB	10	200
Mi tsubi shi	CHP2 0	StDVB	35	100
	P^R
Biosepra	RPCPolvBio^R	StDVB	10	30
Macherey	Nucleogel^R	StDVB	20	10
+ Nagel
Polymer La	- PLRP^R	StDVB	10-15	10
boratori es

PMA = polymethakrylát StDVB = styrendivinylbenzen

Způsob podle vynálezu se hodí pro analytickou, pro semipreparativní a zejména pro preparativní chromatografi i. Pod pojmem preparativní chromatografie se rozumí výroba čistých produktů v technickém měřítku.

Aby byla docílena čistota potřebná pro insulinové přípravky, je třeba předřadit chromatografi i s obrácenými fázemi, například podle EP 0 547 544 A2 (US 5,621.073) něho EP

474 213 Al (US 5,245.008), nejméně jednu další chromatografii s obráceným fázemi nebo latexovou chromatografií a popřípadě krystal izační operaci. Při způsobu podle vynálezu se dosahuje stejného účinku s jednostupňovou chromatografií na polymerním nosiči. Způsobem podle vynálezu se tedy celkový výtěžek při výrobě insulinu podstatně zlepšuje, protože spojením více stupňů procesu do jednoho stupně odpadají ztráty na výtěžku.

Způsob podle vynálezu se hodí k chromatografickéhmu čištění všech insulinů podle shora uvedené definice, totiž insulinů pocházejících z přírodních zdrojů nebo rekombinantních insulinů (tj. exprimovaných geneticky modifikovanými mikroorganismy), insulinů zvířecího nebo lidského původu (například prasečího insulinu., hovězího insulinu nebo humánního insulinu), proinsulinů (například prekurzorů insulinu, preinsuinů) nebo insulinových derivátů, přičemž se pod pojmem insulinové deriváty rozumí deriváty přírodně se vyskytujících insulinů, totiž humánních insulinů nebo zvířecích insulinů, které se liší substitucí alespoň jednoho zbytku přírodně se vyskytující aminokyseliny nebo/a adicí nejméně jednoho zbytku aminokyseliny nebo/a organického zbytku odpovídajícího, jinak stejného přírodně se vyskytujícího insulinu.

Jako příklady pro takové insuliny je možno jmenovat humánní insulin, hovězí insulin, prasečí insulin, insuliny podle EP 0 368 187 (US 5,656.722), například Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-humánní insulin, insuliny podle EP 0 821 006 (ZA 97/6645) nebo insuliny popsané v EP 0 547 544 Al (US 5, 621.073), EP 0 474 213 Al (US 5,245.008), EP 0 600 372 Al (US 5,473.049) nebo v EP 0 668 292 (US 5,663.291) (písmena A a B představují příslušný řetězec aminokyseliny insulinu, číslo znamená polohu zbytku přírodně se vyskytující aminokyseliny, který je nahrazen zbytkem aminokyseliny uvedené před závorkou.)

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Obměny hodnoty pH

V příkladu 1 byly provedeny pokusy na semipreparativní koloně o rozměrech 10 mm v průměru a 120 mm délky, která byla naplněna PLRP 10-15 pm 100A (Polymer Laboratoř i es ) . Účelem bylo vyčistit předčištěný insulin, který měl čistotu 95 % (podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu) tak, aby jeho čistota byla větší 98,5 %.

Požadované množství bylo tak nastaveno, aby zatížení polymerního chromatografického materiálu činilo 6 g/litr (objem kolony). Pufr a mobilní fáze jsou směsi vody a propanolu s 0,05 m amoniumacetátu a 0,1 m glycinu, které byly upraveny pomocí NaOH na příslušnou hodnotu pH. Rychlost prázdné kolony činila 150 cm/hodina. Byly nastaveny tři hodnoty pH 3,5 - pH 6,8 - pH 9. Fluát byl jímán po frakcích.

V tabulce 2 jsou znázorněny výsledky. Pouze při pH 9 se. dosahují čistoty přes 98 % a tím se splňují specifikace. Jednoznačně je zřejmé, že čištění insulinu na polymerních chromatografických materiálech vykazuje účinnost pouze v bazickém prostředí.

« « ···· «··· · · · • · · · · · · ·

Tabulka 2

Čistota a koncentrace insulinu při různých hodnotách pH s polymerním chromatografickým materiálem PLRP-S 10-15 100

	pH 3,5	PH	6,8	pH	9
Frakce	č i stota	konc .	č i stota	konc .	č i stota	konc .
	(%)^x	(mg/ml)	(%)^x	(mg/ml)	(%)^x	(mg/ml)
1			95,22	0,236	92,74	0,565
2	96,74	0,449	94,68	0,196	96,70	1,310
3	96,69	0,690	94,84	0,274	98,59	1,362
4	97,43	1,020	95,38	0,454	99,54	2,020
5	97,39	1,240	96,84	1,120	98,99	2,230
6	97,14	1,330	97,95	2,236	99,24	1,730
7	96,07 .	1,250	97,82	3,140	98,80	1,340
8	94,94	1,120	97,64	3,120	98,46	1,200
9	93,30	0,974	97,12	2,080	97,28	0,960

^xpodle plochy odpovídajícího píku chromatogramu

Příklad 2

Stabilita vůči tlaku a naplnění kolony

Chromatografická kolona (Prochrom^R LC50 , o průměru 50 mm) byla naplněna DáC (Direct Axial Compression) - Technik. Chromatografický materiál (stacionární fáze) byl dodán v 100¾ methanolu a naplněn do kolony, při různých rychlostech průtoku byla změřena ztráta tlaku 11%-ní směsí n-propanolu. Tlak pístu chromatografické kolony se pohyboval mezi 5 a 8 MPa.

Zkoušeny byly následující i c ké materiály:

PLRP-S 10-15 100^R (Polymer Laboratoř i es)

Source^R 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)

Kromasil^R 13-120 (Akzo Nobel)

Materiály mají přibližně stejný průměr částic (sférické částice). PLRP^R a Source^R jsou polymery, Kromasil^R je vysokoy hodnotný RP-silikagel.

Tabulka 3

Ztráta tlaku v MPa/cm směsi propan/voda

	Tlak pístu 0,5 MPa	Tlak pístu 2 MPa	Tlak pístu 4 MPa	Tlak pístu 8 MPa
cm/h	PLRP^R	Source^R	PLRP^R	Source^R	PLRP^r	Source^R	Kromas i1^R
50	0,31	0,40	0,32	0,85	0,50	3,33	0,5
100	0,62	0,80	0,72	1,85	1,08	6,33	1,0
150	1,00	1,50	1,04	3,14	1,67	9,33	1,6

Specifická ztráta tlaku 0,1 MPa/cm znamená pokles tlaku 3 MPa v 30 cm vysoké náplni, což je v technické chromatografii obvyklé.

Příklad 3

Čištění humánního insulinu v preparátivním měřítku

Dále isou popsány celkem 3 příklady, ve kterých je humánní insulin čištěn v technické koloně, která je podle principu DAC plněna posuvným pístem. Je použita kolona Prochrom^R, typ LC50. Pro všechny pokusy má náplň stejný průměr 50 mm, délku kolony 110 až 120 mm.

• · ♦ · · ·· · · ··· ··· · · · · · · ······ ···· · ··· · · · · · · ···· · · · · ···· · · · · ·

Humánní insulin o čistotě 95 % (podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu) hy měl být přiveden na čistotu větší 98,5 %.

Byly použity tři chromatografické nosiče:

PLRP-S 10-15 100^R (Polymer Laboratoř i es)

Source^R 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)

Kromasil^R 13-120 (Akzo Nobel)

Jak je již popsáno v příkladu 2, jsou PLRP a Source^Tpolymerní materiály, kdežto Kromasil” je vysoce hodnotný nosič na bázi RP-si 1 ikagelu.

Pufr a mobilní fáze odpovídají údajům v příkladu 1. Náplň je uvedena v gramech humánního insulinu na litr objemu kolony. Jako výtěžek se rozumí podíl eluátu, kteý má čistotu větší 98,5 %.

Tabulka 4

Výtěžek při preparátivním čištění humánního insulinu

Nosič	Náplň	PH	Tlak pístu	Výtěžek
PLRP-S 10-15 100^R	6 g/1 BV	9	4 mPa	60 %
Source^R 15 RPC	6 g/1 BV	9	2,5 MPa	73 %
Kromasil^R C4 13-120	6 g/1 BV	3,5	8 MPa	68 %

V tabulce 4 jsou proti sobě postaveny docílené výtěžky. Hodnoty od 60 do 70 % jsou pro délku kolony asi 12 cm překvapivě dobré. Rozhodující rozdíl mezi stavem techniky (čištění si1ikagelovým nosičem, zde Kromasilem^R) a chromatografií s polymerním nosičem je rozdíl pH. Pouze při hodnotě pH 9 ♦ ·

jsou dosažitelné tak vysoké výtěžky.

Příklad 4

Čištění jednorázového insulinu v preparativním měřítku

V tomto příkladu měl být vyčištěn jednorázový insulin (Fast-Acting-Insulin). Příklad má kromě toho demonstrovat, že jako výchozí materiály pro tuto chromatografickou operaci jsou přípustné i horší kvality. Podle stavu techniky se konečné čištění insulinu obvykle provádí ve dvou chromatografických stupních. Pokud se konečný stupeň naplní přímo špatným, to znamená silně znečištěným materiálem, není již možno dosáhnout požadovaných čistot a současně vysokých výtěžků.

S překvapením bylo nyní zjištěno, že zkoušený polymerní materiál tuto čistotu dosahuje v jediném chromatografickém stupni, což je umožněno malým průměrem částic od 10 do 15 pm a vynikajícími adsorpčními vlastnostmi.

Byly provedeny čtyři pokusy s následujícími výchozímistavy:

75	%^x	č i stoty
85		čistoty
89		čistoty
93		č i stoty

^xpodle plochy odpovídajícího píku chromatogramu

V tabulce 5 isou uvedeny jednotlivé výtěžky (ti. příslušný podíl použitého insulinu, který byl eluován s čistotou větší 98,5 %). Pokud výchozí stav byl pouze 75 %, nedocílí se nikdy čistota přes 98,5 %. Čistota je v oblasti pouze 93,0 %.

Pokud však výchozí stav je přes 85 %, dosáhnou se spo lehlivě požadované hodnoty vyšší 98,5 %, při výtěžcích mezi

3 80 %·

Preparativní podmínky byly popsány v příkladu 1. Všechny pokusy byly provedeny v koloně Prochrome^R typ LC50 o průměru 50 mm a o výšce náplně 12 cm. Náplň byla vždy 6 g/1 BV, hody nota pH byla upravena na 9 a tlak pístu byl 3,5 MPa.

Tabulka 5

Čištění jednorázových insulinů různé jakosti

Nosič	Čistota výchozího stavu v %^x	Výtěžek (čistota vyš
ší 98,5	%^x )
PLRP-S	10-15	100^R	75 %	0	%
PLRP-S	10-15	100^R	8 5 %	64	%
PLRP-S	10-15	100^R	89 %	73	%
PLRP-S	10-15	100^R	93 %	73	%

^xpodle plochy odpovídajícího píku chromatogramu

Z tabulky 5 je dobře vidět, jak v závislosti na jakosti výchozího stavu přibývá výtěžek chromatografie. Pokusy ukazují jednoznačně, že čištění v jediném stupni je bezpečně možné .

?|/ UM~£lf6

PATENTOVÉ

Způsob chromatografického čištění insulinů, vyznačující se tím že se jako stacionární fáze použije organický polymemí chromatografický materiál stabilní na tlak,mobilní fáze obsahuje nejméně jedno s vodou mísitelné rozpouštědlo nejméně jeden pufr a pH má hodnotu 7 až

Claims

Znůsob podle nároku že pH má hodnotu 9 až

1 v y z Ώ. 3 Č U

Cl s a 1 koho 1,

Σ p u s o b podle nároků 1 že organické rozpouštědlo mísitelné který obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.

i í c

VOdOU je

4 . Způsob podle nároku 3, v V u znač u i í c í s e t í m že alkohol je 1-propanol nebe i 2-propanol. c Způsob podle nároku 3, v V J. znač u i í c í ' S 8 t í m že alkohol je ethanol. 6 . Způsob podle nároku 3, v v Λ znač u í í c í S 8 t. í m že alkohol je methanol. 7 . Způsob podls nároku 2, v y znač U l í c i S 8 t í m že organické rozpouštěj 1 o W í s i t. e 1 n é s vodou j e ton . Způsob podle nároku 2, v y znač u i í c í S 8 t í ω že organické rozpouštědl o mísitelné s vodou je met- hylacetát 9 . Způsob podle nároku 2, v v u znač u j í c í S 8

• · tím , že organické rozpouštědlo mísitelné s vodou je acetoni tri 1.

10. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačující se tím , že koncentrace organického rozpouštědla mísitelného s vodou v mobilní fázi činí 1 až 90 obj. %.

11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j ící se tím , že koncentrace organického rozpouštědla misi- telného s vodou v mobilní fázi činí 10 až 50 obj. %.

12. Způsob podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím , že eluce probíhá isokraticky.

13. Způsob podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím , že eluce probíhá s lineárně stoupajícím gradientem podílu organického rozpouštědla mísitelného s vodou.

14. Způsob podle nároků 1 až 13, vyznač u jící se tím , že organický polymerní chromatograficky materiál stabilní na tlak má průměrnou velikost částic 5 až 300 pm..

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím , že průměrná velikost částic činí 10 až 50 pm.

16. Způsob podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím , že průměrná velikost pórů organického polymerního chromatografického materiálu stabilního na tlak činí 5 až 500 nm.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím , že průměrná velikost pórů činí 10 až 50 nm.

18. Způsob podle nároků 1 až 17, vyznačuj ící se tím , že organicky polymerní chromatografický materiál stabilní na tlak je tvořen polymethakrylátem.

• ·

19. Způsob podle nároků 1 až 17, vyznačuj ící se tím , že organický polymerní chromatografický materiál stabilní na tlak je tvořen polvstyrendivinvlbenzenem.