CZ2001759A3 - Izoformy enzymu pro větvení škrobu II (SBE -IIA a SBE -IIB) z pšenice - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká obecně rostlinných kompozic škrobu a zaměřuje se na nukleotidové sekvence; polypeptidy jimi kódované; vektory a hostitelské buňky a hostitelské organismy zahrnující jednu nebo více sekvencí; a na způsob změny jedné nebo více charakteristik rostliny; rostlinu s více změněnými charakteristikami; škrob získaný z této rostliny; a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Hlavní vývoj v oblasti cereálií byl v poslední době primárně zaměřen na funkci podjednotek glutenového proteinu a jejich roli v systémech pečení. Tomu ve velké míře napomohl přebytek přirozené různorodosti odrůd z hlediska podjednotek glutenového proteinu.

Naopak, ačkoli se mouky z komerčně pěstované pšenice liší, obsahují přibližně 75 až 85% škrobu; význam škrobu z hlediska pěstování byl opomenut. To je z velké míry způsobeno obtížností měření rozdílů ve struktuře škrobu. Avšak omezené množství studií, které byly provedeny, prokazuje nedostatek přirozených variací mezi různými odrůdami pšenice. Díky rekombinantní DNA a technologiím genového přenosu je nyní možné vytvořit novou variaci in planta, kde je realizovatelným cílem přesně modifikovaná kompozice škrobu v pšenici.

Škrob je hlavním zdrojem uhlíku u rostlin, obsahující 50 % a více sušiny mnoha zásobních částí, například hlíz a semen cereálií. Škrob má široké využití v potravinářství a průmyslu. V mnoha případech je však nezbytné přírodní škrob modifikovat, chemickými nebo fyzikálními způsoby k docílení různých vlastností pro určité aplikace. Produkce škrobů s požadovanými vlastnostmi přímo v rostlině by byla velmi žádoucí, čímž by se odstranila potřeba dalších modifikací. Dosažení tohoto záměru pomocí genetického inženýrství vyžaduje znalost metabolických pochodů biosyntézy škrobu. Zahrnuje charakterizaci genů a kódovaných genových produktů, které katalyzují syntézu škrobu. Znalost regulace biosyntézy škrobu umožňuje „přeprogramování“ biosyntetických pochodů s dosažením škrobu s novými vlastnostmi, které mohou mít nové průmyslové aplikace. Nejvýznamnější vlastnost škrobu je odvozena od schopnosti přirozené granulace ztrátou přirozené struktury a uvolňováním a absorpcí vody za vhodných podmínek, provázená viskozitou a vláknitou strukturou v procesu zvaném želatinace. Želatinace byla definována (W.A. Atwell a kol,,

1988) jako „... rozrušení (přetržení) molekulové struktury škrobu projevující se irreverzibilními změnami ve vlastnostech, jako například granulární bobtnání, přirozené

• · · • » ·

krystalické tání, ztrátou dvojlomu a rozpustnost škrobu. Bod počáteční želatizace a rozmezí, v kterém se objevuje, závisí na koncentraci škrobu, způsobu pozorování, granulovému typu a granulových heterogenitách v místě pozorování“.

Pro úplnou želatinaci škrobu je třeba 14 molekul vody na molekulu bezvodé glukózy, to znamená minimálně 75 % vody. (Donovan, 1979). K želatinaci škrobu většinou dochází zahřátím, ale může k ní též dojít fyzikálním poškozením a některými chaotropními látkami, zejména dimethylsulfoxidem (DMSO), močovinou, chloridem vápenatým, silnou bází a kyselinou.

Různé pochody, ke kterým dochází během želatinace, mohou být sledovány různými metodami včetně dvojlomu, rentgenovou difrakcí, diferenciální skenovací kalorimetrií (DSC), ¹³C NMR. Bobtnání je možné pozorovat různými metodami, zejména deformovateiností.

Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) je destruktivní metoda provázená endotermickým dějem zahříváním granulí, obecně založená na měření teploty a endotermické energie (delta H) vyžadované pro tání nativních krystalů. Teplota želatinace škrobu závisí na obsahu vody vyšším než 75 % (popisovaný jako přebytek vody), ale zvyšuje se při omezeném obsahu vody (Donovan, 1979). Rychlost a rozsah bobtnání granule škrobu je závislá na typu vývoje viskozity vodné suspenze škrobu na zahřívání. Proces bobtnání je proto technologicky nejdůležitější. Viskozita závislá na zahřívání se proto může běžně měřit Brabenderovým amylografem (Brabender je ochranná známka) (Kennedy a Cabalda, 1991) nebo za použití analyzátoru Rapid Visco (Rapid Visco je ochranná známka od Newport Scientific, Australia). Obr. 1 je typickým profilem viskoamylgrafu pro pšeničný škrob, získaným tímto způsobem, vykazující změny u škrobu během pečení a po něm. Protože granule škrobu bobtnají při příjmu vody, v procesu známém jako slepování, jejich fázový objem se zvyšuje za zvýšení viskozity. Počátek slepování je označen jako A na obr. 1. Pík viskozity, označen jako B na obr. 1 je dosažen při maximálním fázovém objemu. Smyk pak způsobí poškození/fragmentaci nabobtnaných molekul způsobující snížení viskozity. Úplná disperze je indikována při C na obr. č. 1. Toto bylo potvrzeno studií oscilační deformovateiností škrobových hmot při různých stavech viskózního profilu (Svegmark a Hermansson, 1990). Průběh viskozity v závislosti na teplotě a pík viskozity je charakteristický pro počátek a respektive průběh bobtnání. Při zchlazení tvoří vytoužené formy amylózy síť v procesu zahrnování znovu spojených molekul nebo jejich návratu do původního stavu, způsobující zvýšení viskozity, jak je uvedeno u D na obr.

1. Zpětná (nebo „set-back“) viskozita je proto určující množství amylózy vytoužené z granul.

Vlastnosti pšeničného škrobu mají široké využití a též využití v nepotravinářských odvětvích (papír, textil, lepidla). V mnoha odvětvích však vlastnosti nejsou optimální a za účelem dosažení požadovaných vlastností se provádějí různé chemické a fyzikální

modifikace. Je možné použít úprav dvou typů vlastností: kontrolované změny želatinace a slepovací teploty; a škrobů, které podléhají méně granulami fragmentaci během slepování než běžné škroby.

V současné době je jediným způsobem změny želatinace a slepovací teploty škrobu použití aditiv, jako například cukrů, polyhydroxysloučenin solí nebo rozsáhlé fyzikální nebo chemické úpravy. Redukce granulární fragmentace během slepování lze dosáhnout rozsáhlou fyzikální úpravou nebo chemicky příčnými vazbami. Tyto postupy jsou nepohodlné a neúčinné. Je proto žádoucí získat rostlinu, produkující škrob, který má tyto výhodné vlastnosti.

Škrob se skládá z dvou hlavních glukózových polysacharidů: amylózy a amylopektinu. Amylóza je obecně lineární polymer obsahující a-1,4 vázané glukózové jednotky, zatímco amylopektin je vysoce rozvětvený polymer obsahující a-1,4 vázanou glukanovou páteř s a-1,6 spojenými glukanovými větvemi. Pšeničný endospermový amylopektin obsahuje přibližně 70 % podílu škrobu, který je v rovnováze s amylózou. Amylopektin se syntetizuje za účasti několika enzymů, včetně rozpustné syntázy škrobu (SSS), enzymů větvících škrob (SBE), enzymů zbavujících škrob větvení (DBE). Fyzikální vlastnosti škrobu mají silný vliv na relativní přebytek amylózy a amylopektinu, a proto hrají SSS, SBE a DBE klíčovou roli ve stanovení množství i kvality škrobu. Jedním způsobem změny struktury je proto modifikace exprese enzymů zahrnutých v biosyntéze škrobu v endospermu za použití transgenních technik.

SBE katalyzuje tvorbu a-1,6 vazeb za tvorby větvících bodů v rozrůstající se molekule škrobu pomocí hydrolýzy a-1,4 vazby s následným připojením uvolněného a-1,4 glukanového řetězce ke stejnému nebo jinému glukosylovému řetězci. Touto reakcí též vzniká nový neredukující konec pro další prodlužování původního a-1,4 vázaného glukanového řetězce.

Bylo popsáno mnoho izoforem enzymu větvícího škrob, biochemicky, z mnoha vzorků včetně kukuřice (Boyer a Preiss, 1978), rýže (Nakamura a kol. , 1992), hrachu (Smith, 1988), brambor (Khoshnoodi a kol., 1993) a pšenice (Morell a kol., 1997). Nedávno byly charkterizovány genomové a cDNA sekvence pro SBE včetně kukuřice (Baba a kol., 1991; Fisher a kol., 1993; Gao a kol., 1997), hrachu (Burton a kol., 1995), brambor (Kossmann a kol., 1991), rýže (Nakamura a Yamanuschi, 1992; Mizuno a kol., 1993), Arabidopsis (Fisher a kol., 1996), kasavy (Salehuzzaman a kol. 1992) a pšenice (Rapellin a kol., 1997, Nair a kol., 1997, Rahman a kol., 1997). Pořadí sekvence těchto SBE je vysoce konzervativní z hlediska aminokyselin a tyto SBE je možné rozdělit do dvou různých skupin, obecně známých jako SBEI a SBEII. Analýza dál ukazuje, že mezi druhy je obecně v pořadí

50% homologie mezi dvěma rodinami, SBEI a SBEII, zatímco větší homologie je často mezi dvěma rodinami dvou druhů.

Kukuřice je nezvyklá v tom, že kukuřičná rodina SBEII zahrnuje dva různé členy, známé jako SBEIIa a SBEIIb. Existují rozdílné názory na to, zda enzymy SBEIIa a lib jsou ve skutečnosti a) kódovány geny dvou různých lokusů a b) zda geny představují různé alely jednoho lokusu. Fisher a kol. (1996) a Gao a kol. (1997) zjistili, že SBEIIa a SBEIIb jsou kódovány různými geny. Nelze však učinit žádný závěr o tom, že obě izoformy existují současně v jednom genotypu kukuřice. DNA klony dvou publikovaných genových sekvencí byly přečištěny z různých genotypů kukuřice a je proto možné, že představují různé alely jednoho lokusu. Závěrem, u kukuřice byly dosud charakterizovány tři různé SBE geny (Baba a kol., 1991; Fisher a kol., 1993; Gao a kol., 1997). SBEI se liší od SBEIIa a SBEIIb ve složení aminokyselin, specificitě k substrátu, kinetických vlastnostech a imunologických reakcích, kdy SBEIIa a SBEIIb jsou v těchto ohledech podobné (Guan a Preiss, 1993; Preiss 1991; Takeda a kol., 1993). Na úrovni aminokyselin vykazuje sekvence přibližně 50% homologii se sekvencemi SBEIIa a SBEIIb, kde SBEIIa a SBEIIb vykazují přibližně 80% vzájemnou homologii.

Před tímto vynálezem byla kukuřice výjimečná obsahem SBEIIa a SBEIIb typů enzymů. Ačkoli má Arabidopsis dva členy rodiny SBEII, podtřída u Arabidopsis zřejmě nepotvrzuje zjištění u kukuřice: zástupci podtřídy Arabidopsis obecně nespadají do kategorií Ha a lib jako sekvence kukuřice. Geny SBEII Arabidoopsis mají podobný stupeň homologie s geny kukuřice SBEII, SBEIIa a SBEIIb, ale tyto podobnosti nejsou dostačující k zařazení genů Arabidopsis do stejných kategorií SBEIIa a SBEIIb jako kukuřici. Tato fakta vskutku potvrzují domněnku, že SBEII geny Arabidopsis nepatří do kategorií Ha a lib u kukuřice. U ječmene byly částečně charakterizovány dvě formy SBEII. Ačkoli byly nazvány SBEIIa a SBEIIb, bylo publikováno jen velmi omezené množství informací o sekvenci (Sun a kol.,

1995) a nebylo možné vyvodit závěr, že tyto formy odpovídají kategoriím Ha a lib u kukuřice. Ve skutečnosti na základě dostupných informací o sekvenci u ječmene zřejmě obě SBEII sekvence (SBEIIa SBEIIb) vykazují vyšší homologii s kukuřičnou SBEIIa než kukuřičnou SBEIIb.

U všech rostlinných druhů, u kterých byly identifikovány a publikovány sekvence SBEII, včetně brambor, hrachu, rýže, kasavy, pšenice a ječmene, nebyly ve srovnání se skupinami SBEIIa a SBEIIb u kukuřice vytvořeny žádné podtřídy rodiny SBE II.

Studie přečištěných SBEI a SBEII ukazují, že tyto izoformy se liší ve specificitě k substrátu s ohledem na délku řetězce a stupeň větvení. U kukuřice vykazuje SBEI a SBEII odlišné větvící aktivity in vitro, kdy SBEI vykazuje vyšší stupeň větvení substrátu amylózy ve srovnání s SBEII a kdy SBEIIa a lib vykazují vyšší stupně větvení než SBEI při reakci se

substrátem amylopektinu (Guan a Preiss, 1993). Kukuřičný SBEI navíc výhodně přemisťuje delší glukanové řetězce (s průměrnou délkou řetězce = 24) než SBEII (s průměrnou délkou řetězce = 21 (Ha) a 22(llb)) (Takeda a kol., 1993). Obdobná zjištění byla popsána u izoforem SBEI a SBEII u pšenice a hrachu (Morell a kol., 1997; Smith, 1988). Mutační studie u kukuřice, rýže a hrachu ukazují, že vysoký počet mutací u amylózy u každého případu se liší v aktivitě větvícího enzymu analogního ke kukuřičnému SBEII (Martin a Smith, 1995; Morell a kol., 1995). Avšak vazba mezi biochemickými výsledky a genetickými důkazy podporujícími rozdílnosti ve funkcích, zůstává nejasná.

Vynález je založen na nečekaném objevu nové třídy genů SBEII u pšenice, zde uváděných jako SBEII-1. Nové genové sekvence SBEII-1 mají silnou podobnost s genem SBEIIb u kukuřice. Geny pšenice SBEII-1 jsou považovány za funkčně ekvivalentní SBEIIb genu kukuřice a podle toho se usuzuje, že manipulace s kukuřičným genem SBEIIb má vliv na vlastnosti škrobu včetně teploty želatinace škrobu, způsobem podobným manipulaci s kukuřičným genem SBEIIb, jak je popsáno v WO 97/22703.

Shrnuto, ačkoli jsou u kukuřice, Arabbidopsis a ječmene známy dvě odlišné sekvence genu SBEII, jak se uvádí výše, nebyl dosud důvod očekávat, že by pšenice vykazovala podobné rozdělení genů SBEII, jak je prokázáno u kukuřice. Dva geny SBEII u Asrabidopsis vykazují rozdílné rozdělení a doposud nebyly dostatečné důkazy pro stanovení, zda dvě sekvence SBEII u ječmene patřily k podtřídě kukuřice. Proto nebyl důvod očekávat, že by pšenice měla dva podobné členy SBEII ve srovnání s kukuřicí. Následně Sun a kol. (1998) publikoval data, která ukazují, že sekvence ječmene jsou skutečně rozděleny podobným způsobem jako sekvence SBEIIa a lib u kukuřice a sekvence SBEII-2 a SBEII-1 u pšenice, zde uvedené.

Podle vynálezu je použito vysokého stupně sekvenční konzervativnosti mezi několika genovými sekvencemi SBE k navržení oligonukleotidových primerů k sekvencím, které jsou specifické k rodinám SBEI nebo SBEII a použily tyto primery k amplifikaci sekvencí cDNA z vyvíjejícího se endospermu u pšenice.

Když byla tato práce započata, byla publikována jedna dílčí délka SBE cDNA klonu u pšenice (Mousey, 1994). Mnohonásobné sekvenční uspořádání této sekvence SBE s jinými publikovanými sekvencemi SBE z mnoha rostlinných druhů odhalilo mnoho motivů, které byly vysoce konzervativní. Oligonukleotidové primery navržené jako komplementární k těmto motivům se použily ke klonování 3’ dílčí délky cDNA kolonu SBEII u pšenice. Sekvenční uspořádání sekvencí klonu cDNA ukazuje, že klony lze rozdělit do dvou tříd, které jsou označené jako SBEII-1 a SBEII-2, vykazující více než 90% podobnost se členy náležícími jedné třídě, ale pouze 60% podobnost mezi třídami. Srovnání mezi

charakteristickými sekvencemi každé třídy dříve charakterizovaných SBEII klonů pšenice, pWBE6 (Mousley, 1994) a SBEII (Nair a kol., 1997) jednoznačně prokazuje, že každá je homologní se třídou SBEII-2. Klonování pšeničné SBEII-1 cDNA je nové.

Podstata vynálezu

Jsou uvedeny nukleotidové sekvence v podstatě kódující sekvenci aminokyselin uvedenou na obr. 10 (SEQ ID No: 2) nebo funkční ekvivalent uvedené nukleotidové sekvence.

Pojem funkční ekvivalent se používá v souvislosti se zahrnutím těch sekvencí, které se liší v nukleotidové sekvenci, jak je uvedeno na obr. 10 (SEQ ID No: 1), ale které díky degeneraci genetického kódu kódují polypeptid se stejnou nebo převážně stejnou aminokyselinovou sekvencí. Pojem je obecně míněn pro aplikaci u sekvencí, které jsou dostatečně homologní se sekvencí podle vynálezu, které mohou hybridizovat s její komplementární částí za přesných hybridizačních podmínek (například podle popisu v Sambrook a kol., 1989, to znamená promytím 0,1x SSC, 0,5% SDS při 68 °C); tyto ekvivalenty s výhodou zaujímají alespoň 86 %, výhodněji 90 % a nejlépe 95 % sekvenční homologie (to znamená sekvenční podobnosti) se sekvencí podle vynálezu. Sekvenční homologie se s výhodou stanoví za pomocí programu „MEGALIGN“ který je součástí softwaru DNAStar (MEGALIGN a DNAStar jsou ochranné známky). Odborníkům v tomto oboru bude zřejmé, že nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou mít též vhodné použití, pokud se vyskytují jako antimediátorové sekvence. Část funkční sekvence tak též zahrnuje takové sekvence, které mohou hybridizovat za přesných hybridizačních podmínek se sekvencí podle vynálezu (lépe než se zbytkovou sekvencí). Tyto antimediátorové ekvivalenty s výhodou zaujímají 86 %, výhodněji alespoň 90 % a nejlépe 95 % sekvenční homologie komplementární se sekvencí podle vynálezu.

Z jiného hlediska vynález uvádí nukleotidovou sekvenci v podstatě obsahující sekvence B2 uvedené na obr. 3 (SEQ ID No: 3) nebo její funkční ekvivalent.

Z jiného hlediska vynález uvádí nukleotidovou sekvenci v podstatě obsahující sekvence B4 uvedené na obr. 3 (SEQ ID No: 4) nebo její funkční ekvivalent.

Z jiného hlediska vynález uvádí nukleotidovou sekvenci v podstatě obsahující sekvence B10 uvedené na obr. 3 (SEQ ID No: 5) nebo její funkční ekvivalent.

Z jiného hlediska vynález uvádí nukleotidovou sekvenci v podstatě obsahující sekvence B1 uvedené na obr. 3 (SEQ ID No: 6) nebo její funkční ekvivalent.

Z jiného hlediska vynález uvádí nukleotidovou sekvenci v podstatě obsahující sekvence B6 uvedené na obr. 4 (SEQ ID No: 7) nebo její funkční ekvivalent.

··. .

Pojem funkční ekvivalent má z tohoto hlediska stejný obecný význam, jak se uvádí výše, ačkoli ekvivalenty B2, B4, B10 a B6 s výhodou zaujímají alespoň 90 %, výhodněji 95 % sekvenční homologie s odpovídající sekvencí podle vynálezu, zatímco ekvivalenty B1 s výhodou zaujímají 97 % sekvenční homologie se sekvencí podle vynálezu.

Sekvence podle vynálezu jsou součástí genů pšenice SBEII, kde B1 je nová podtřída známé třídy genů SBEII, označovaných jako SBEII-2 s novou podtřídou označovanou jako SBEII-2. Zbývající sekvence všechny patří do zcela nové třídy pšeničných genů SBEII, označovaných jako SBEII-1. Tyto sekvence patří do tří podtříd, uvedených níže.

Nové pšeničné geny SBEII-1 podle vynálezu mají silnou sekvenční homologii s kukuřičným genem SBEIIb. U pšeničných genů SBEIi-1 se předpokládají podobné funkční vlastnosti jako u kukuřičného genu SBEIIb. Na základě toho se předpokládá, že genetické manipulace s pšeničným genem SBEII-1 mohou mít vliv na vlastnosti škrobu vytvořeného rostlinou, včetně teploty želatinace a deformační vlastnosti škrobu, způsobem podobným manipulaci s kukuřičným genem SBEIIb popsané ve WO 97/22703. Obsah WO 97/22703 je zde uveden v odkazech.

Vynález též zahrnuje ve svém rozsahu část kterékoli z výše uvedených sekvencí, zahrnující alespoň 500 párů bází s alespoň 90% sekvenční homologii s odpovídající částí sekvence, od které je odvozena.

Ačkoli kódující sekvence nových pšeničných genů SBEII-1 mají silnou sekvenční homologii s kukuřičnými geny SBEIIb, mají mnohem větší odchylky na 3’ nepřekládaných koncech těchto sekvencí s maximální 31,8% homologii mezi 3’ nepřekládanými sekvencemi pšeničných SBEII-1 a kukuřičných SBEIIb, jak je zřejmé z obr. 8.

Jiné hledisko uvádí nukleotidovou sekvenci v podstatě obsahující sekvence uvedené na obr. 5 (SEQ ID No: 8), obr. 6 (SEQ ID No: 9) nebo obr. 7 (SEQ ID No: 10) nebo její funkční ekvivalent.

Pojem funkční ekvivalent má stejný obecný význam jak se uvádí výše, ale s ekvivalenty s alespoň 32%, s výhodou alespoň 40%, 50%, 60%, 70%, 80% nebo 90% sekvenční homologii se sekvencí odpovídající obr..

Předpokládá se, že tyto 3’ nepřekládané sekvence mohou být využitelné jako kódující i antimediátorové při manipulacích za účelem změny vlastností škrobu ovlivněním exprese SBE u rostlin, jak se uvádí níže.

Sekvence mohou obsahovat další nukleotidy na 5’ nebo 3’ konci. Například, za účelem snadnější exprese sekvence s výhodou zahrnují též ve čtecím rámci startovací kodón ATG a může též kódovat vedoucí sekvenci.

Vynález též uvádí konstrukt nukleové kyseliny zahrnující nukleotidovou sekvenci nebo její část v souladu s vynálezem, s výhodou funkčně spojenou, ve směru kódujícím nebo antimediátorovém k sekvenci promotoru.

V rozsahu vynálezu je aminokyselinová sekvence kódovaná jakoukoli nukleotidovou sekvencí podle vynálezu.

Vynález též uvádí vektory, zejména expresní vektory, zahrnující nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. Vektor běžně obsahuje promotor a jeden nebo více regulačních signálů typu, který je dobře znám odborníkům v tomto oboru. Vynález též zahrnuje opatření transformovaných buněk (tento pojem zahrnuje transdukci a transfekci) vektorem obsahujícím nukleotidovou sekvenci podle vynálezu.

Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být zavedeny do rostlin, zejména do rostlin pšenice, ale není podmínkou a předpokládá se, že tímto je možné ovlivnit expresi SBE u rostliny a takto ovlivnit vlastnosti škrobu, produkovaného rostlinou. Přesněji, použití antimediátorových sekvencí předpokládá snížení nebo potlačení exprese enzymu. Nedávno bylo dokázáno, že u jiných experimentálních systémů k této „kódující supresi“ může též dojít, (například exprese zavedené sekvence funkčně spojené s kódující může neznámým mechanismem interferovat s expresí nativního genu) jak popisují Matzke & Matzke 1995. Kterákoli z metod uvedených Matzke & Matzke 1995 se může teoreticky použít k ovlivnění exprese homologního genu SBE u hostitelského organismu.

Předpokládá se, že antimediátorové metody jsou většinou operabilní tvorbou antimediátorové mRNA, která hybridizuje s mRNA ve smyslu, zabraňující tak translaci do funkčního polypeptidu pravděpodobně degradací hybridu RNA (například Sheehy a kol., 1988; Van der Krol a kol.,). Suprese ve smyslu sekvence vyžaduje homologii mezi zaváděnou sekvencí a cílovým genem, ale přesný mechanismus je nejasný. Je však zřejmé, že v souvislosti s antimedíátorovou i kódující supresi není důležitá ani celá délka nukleotidové sekvence, ani „nativní“ sekvence. S výhodou „účinná část“ použitá v metodě zahrnuje alespoň jednu třetinu celé délky sekvence, ale jednoduchým pokusem a chybou v jiných částech (kratších nebo delších) je možné zjistit, která je funkční s ohledem na změnu vlastností rostliny,

Z dalšího hlediska vynález proto uvádí způsob změny vlastností rostliny, zahrnující zavedení účinné části sekvence podle vynálezu funkčně spojené s vhodným promotorem aktivním u rostliny do této rostliny z účelem ovlivnění exprese genu přítomného v rostlině. Sekvence je zpravidla napojena v opačné orientaci k promotoru. Rostlinou je s výhodou pšenice. Změněné vlastnosti se s výhodou týkají obsahu škrobu a/nebo obsahu škrobu v rostlině (to znamená množství a/nebo typu škrobu přítomného v rostlině). Způsob změny vlastností též s výhodou zahrnuje zavedení jedné nebo více dalších sekvencí, (které mohou • ♦» • · • ·♦· být kódujícími nebo antimediátorovými sekvencemi) funkčně spojených s jedním promotorem (který zajistí přepis sekvencí v podstatě stejnou dobu), nebo mohou být funkčně spojeny se samostatnými promotory (které mohou být nezbytné pro optimální expresi). Samostatné promotory mohou být vzájemně shodné nebo odlišné. Vhodné promotory jsou obecně známy odborníkům v tomto oboru a obsahují konstitutivní nebo inducibilní typy. Příklady zahrnují promotor CMV 35S (například jednoduchou nebo tandemovou repetici) a promotor ubichitinu. Promotor je s výhodou tkáňově specifický. Promotor s výhodou vyvolá expresi funkčně spojené sekvence na základní úrovni pouze v rostlinné tkáni, kde dochází k převážné syntéze škrobu a/nebo jeho skladování.

Sekvence podle vynálezu a případně jedna nebo více dalších sekvencí může být zavedena do rostliny jednou z mnoha obecně známých technik (napříkald transformací zprostředkovanou Agrobacterem). Sekvence jsou nejúčinnější při změně aktivity SBE u pšenice, ale teoreticky by je bylo možné zavést do jakékoli rostliny. Výhodné příklady zahrnují hrách, rajské jablko, kukuřici, ječmen, sladké brambory a kasavu. Rostlina s výhodou obsahuje přirozený gen kódující molekulu SBE, která vykazuje vysokou homologii se zavedenou sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu.

Z jiného hlediska vynález uvádí rostlinnou buňku nebo rostlinu nebo její mladou rostlinu, která byla změněna způsobem uvedeným výše. Potomstvo změněné rostliny se může získat například vegetativním rozmnožením nebo zkřížením změněné rostliny a uchováním získaných semen. Do rozsahu vynálezu také spadají části změněné rostliny, například zásobní části. Podle vynálezu je takto běžně značeno zrno obsahující změněný škrob, uvedené zrno se získalo ze změněné rostliny nebo jejích mladých rostlin. Zrno získané ze změněné rostliny (nebo jejích mladých rostlin) je užitečnou surovinou zejména v určitých průmyslových aplikacích a pro přípravu a/nebo výrobu potravin a může se například použít do pečivá.

V určitém vztahu k pšenici se zde uvádí pšenice nebo její část, která ve své standardní podobě obsahuje funkční gen SBEII-1, ale která byla změněna tak, že exprese polypeptidu SBEII-1 je buď snížena, zvýšena nebo není funkční v buňkách alespoň některé části rostliny. Rostlina může být změněna způsobem uvedeným výše nebo se může vytřídit po běžném vypěstování rostlin s delecí genu SBEII-1, jehož přítomnost nebo nepřítomnost je možné snadno zjistit kontrolou vzorků rostlin pomocí nukleotidové sondy nebo protilátkami specifickými pro gen pšenice nebo respektive genový produkt.

Podle vynálezu se též uvádí škrob extrahovaný z rostlin změněných způsobem uvedeným výše nebo z potomstva těchto rostlin, škrob má změněné vlastnosti ve srovnání se škrobem extrahovaným ze stejných, ale nezměněných rostlin. Vynález dále uvádí způsob výroby změněného škrobu, zahrnující změnu rostliny způsobem uvedeným výše a * · »· · * * · · · · · · • · · · ··· • ····«« • · · · · · ···«·« ·· ··

extrakcí jejího škrobu se změněnými vlastnostmi ve srovnání se škrobem extrahovaným z stejných, ale nezměněných rostlin. Předpokládá se, že použití nukleotidových sekvencí podle vynálezu umožní výrobu škrobů, zejména pšeničných škrobů, s mnoha novými vlastnostmi. Je například možné očekávat, že změněné rostliny se sníženou aktivitou SBEII budou produkovat škrob s relativně vyšším obsahem amylózy a nižším obsahem amylopektinu ve srovnání s nezměněnými rostlinami.

Vynález umožňuje následující: rostlinu (zejména pšenici) změněnou způsobem uvedeným výše, obsahující škrob, který po extrakci z rostliny má zvýšenou želatinaci a/nebo nejvyšší teplotu, podle měření DSC ve srovnání se škrobem extrahovaným z podobné, ale nezměněné rostliny; rostlina (zejména pšenice) změněná způsobem uvedeným výše, obsahující škrob, který po extrakci z rostliny má zvýšenou teplotu želatinace (obvykle zvýšenou alespoň o 3 °C, o 7 °C, alespoň o 12 °C nebo až o 15 °C až 25 °C) podle měření DSC ve srovnání se škrobem extrahovaným z podobné, ale nezměněné rostliny; rostlinu (zejména pšenici) změněnou způsobem uvedeným výše; zejména snížením exprese polypeptidu SBEII-1, obsahující škrob, který má po extrakci z rostliny vyšší poměr amylóza:amylopektin ve srovnání se škrobem extrahovaným z podobné, ale nezměněné rostliny.

Vynález se přesněji týká škrobu získaného z rostliny změněné podle vynálezu, zejména škrobu se zvýšenou teplotou želatinace. Tento škrob je využitelný například pro pečení s některými výhodami v určitých situacích a vynález též uvádí produkty, zejména pečivo, vyrobené za použití tohoto škrobu. Vynález též uvádí škrob extrahovaný z rostliny změněné způsobem podle vynálezu se zvýšeným poměrem amylóza.amylopektin.

Popis obrázků

Vynález je dále popsán na názorných příkladech s odkazy na schémata, kde:

Obr. 1 je graf viskozity v závislosti na čase, zobrazující profil viskozity amylózy u pšenice během pečení a po něm;

Obr. 2 ukazuje údaje o aminokyselinové sekvenci C terminální části různých známých enzymů pro větvení škrobu (SEQ ID Nos: 12 až 25) získané z databáze evropské laboratoře pro molekulární biologii (EMBL) a nové sekvence pšeničného SBEII-1 podle vynálezu (OsbelMALL) (SEQ ID No: 11) z klonu 5A1 se zvýrazněnou konvenční sekvencí.

Obr. 2a je tabulka zbytkové zátěže uvádějící procenta podobnosti a procenta odlišnosti od sekvence uvedené na obr. 2;

Obr. 3 uvádí sekvenci DNA různých rekombinantních klonů (B2, B4, B10, A2, B1, B11) (SEQ ID Nos: 3, 4, 5, 26, 6, 27) obsahující geny enzymu pro větvení škrobu, charakterizující dvě třídy SBE, SBEII-1 a SBE-2, z nichž každá zahrnuje tri podtřídy A, B a C

I ·· • · • ··« se zbytkovými sekvencemi odlišujícími se od obvyklé (převažující) zvýrazněné sekvence (SEQ ID Č.: 53);

Obr. 3a je tabulka zbytkové zátěže uvádějící procenta podobnosti a procenta odlišnosti od sekvence uvedené na obr. 3;

Obr. 4 uvádí předpokládanou aminokyselinovou sekvenci klonu B6 (pšenice SBEII1) (SEQ ID No; 7) a B11 (pšenice SBEII-2) (SEQ ID No: 8) vzhledem k odpovídajícím oblastem SBEIIa (SEQ ID No: 29) kukuřice a aminokyselinové sekvence SBEIIb (SEQ ID Č.: 30), se zbytky odlišujícími se od zvýrazněných sekvencí kukuřice SBEWlIb;

Obr. 4a je tabulka zbytkové zátěže uvádějící procenta podobnosti a procenta odlišnosti od sekvence uvedené na obr. 4;

Obr. 5 uvádí nepřekládanou sekvenci DNA na 3’ konci, klonu B2 (SEQ ID No: 8) SBEII-1 pšenice, podtřída A);

Obr. 6 uvádí nepřekládanou sekvenci DNA na 3’ konci, klonu B10 (SEQ ID No: 9) SBEII-1 pšenice, podtřída B);

Obr. 7 uvádí nepřekládanou sekvenci DNA na 3’ konci, klonu B4 (SEQ ID No: 10) SBEII-1 pšenice, podtřída C);

Obr. 8 uvádí nepřekládanou sekvenci DNA na 3’ konci, klonu B10 (SEQ ID No: 9) B2 (SEQ ID No: 8) a B4 (SEQ ID No: 10) a SBEIIb (ZMSBE2b) (SEQ ID No: 31) kukuřice, kde se zbytkové sekvence odlišují od zvýrazněných sekvencí B10;

Obr. 8a je tabulka zbytkové zátěže uvádějící procenta podobnosti a procenta odlišnosti od sekvence uvedené na obr. 8;

Obr. 9a a 9b uvádějí hybridizaci klonu B1 (SBEII-2) a respektive klonu B2 (SBEII-1) s genomovou DNA štěpenou Hindlll u pšenice „Chinese Spring“ nullizomních-tetrazomních linií;

Obr. 10 uvádí DNA (SEQ ID No:1) a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID No:2) části SBEII-1 klonu 5A1;

Obr. 11 uvádí aminokyselinovou sekvenci SBEII-1 pšenice podle vynálezu, klonu 5AI (Osbell-1ALL)(SEQ ID No:11), SBEI-D2 (SEQ ID No: 32) pšenice, Rahman a kol. 1997 (TASBEID2), SBE1 pšenice, Rapellin a kol 1997(SEQ ID No: 33) (TASBEI) a SBEII-2 pšenice, Nair a kol 1997 (SEQ ID No:34) (SBEII-2 pšenice), jejíž zbytkové sekvence přesně odpovídají převažující (obvyklé) sekvenci (SEQ ID No: 54);

Obr. 11a je tabulka zbytkové zátěže uvádějící procenta podobnosti a procenta odlišnosti od sekvence uvedené na obr. 11;

Obr. 12 uvádí Nothern blott pšeničných zrn sklizených v různých intervalech po odkvětu a zreagovaných se sondami fragmentů SBEII-1 a SBEII-2;

Obr. 13 je restrikční mapa plazmidu pWxGS+;

··· ·» ·· ·· • · · · · • ··· · · • · · · · ·· ·· ·· ·

Obr. 13a uvádí sekvenci (SEQ ID No: 55) promotoru (fragment Hindlll-BamH1) u pWxGS+;

Obr. 14 je restrikční mapa plazmidu pSRWXGUSI;

Obr. 15 je restrikční mapa plazmidu pVTWXGUS2;

Obr. 16 je restrikční mapa plazmidu pPBI-97-2;

Obr. 17 je restrikční mapa plazmidu pSR97-26A-;

Obr. 18 je restrikční mapa plazmidu pSR97-29A-;

Obr. 19 je restrikční mapa plazmidu pSR97-50A-;

Obr. 20 je restrikční mapa plazmidu pSR97-53A-;

Obr. 21 je restrikční mapa plazmidu p97-2C;

Obr. 22 je restrikční mapa plazmidu p97-2CWT 1;

Obr. 23 je restrikční mapa plazmidu pSC98-1;

Obr. 24 je restrikční mapa plazmidu pSC98-2;

Obr. 25 je restrikční mapa plazmidu pUNI;

Obr. 26 uvádí sekvenci DNA fragmentu Nptli Sací u pUNI (SEQ ID No: 35) a

Obr. 27 je restrikční mapa plazmidu pUSN99-1;

Obr. 28 je restrikční mapa plazmidu pUSN99-2;

Obr. 29 je částečná restrikční mapa předpokládané sekvence (SEQ ID No: 52) klonovaného fragmentu p97-U3;

Obr. 30 je restrikční mapa plazmidu pPBI96-36;

Obr. 31 je restrikční mapa plazmidu p97-dUG1;

Obr. 32 je restrikční mapa plazmidu p97-2BdUN1;

Obr. 33 je schématické zobrazení komůrky pro bombardování částic (není v měřítku)

Obr. 34 ukazuje histochemickou lokalizaci exprese Ubi-GUS u semena (obr. A), stonku (obr. B), květu (obr. C) a listové tkáně (obr. D) pšenice transformované plazmidem pAHC25;

Obr. 35 je Southern blot 26 mladých rostlin transformantu BW 119, který byl transformován pAHC25.

Obr. 36 ukazuje histochemickou lokalizaci exprese waxy-GUS ve tkáni endospermu dvou nezávislých transgenních linií pšenice (na obr. A a B) transformovaných plazmidem pWxGS+; a

Obr. 37 je Southern blot genomové DNA domnělých primárních transformantů štěpených Sací a hybridizovaných s 1 kb sondou Sad SBEII-1.

• · ·· ·♦ · · · ·· · · · · · · · ·· • · · · ··· · · · • ········« · • · · « · · ··· ··· ·9· *· ·· ·· ···

Příklady provedení vynálezu:

Amplifikace a charakterizace dvou tříd cDNA klonů SBEII.

Pro izolaci enzymu pro větvení škrobu z pšenice byla navržena metoda klonování založená na PCR za použití konzervativních oblastí v rámci známých klonovaných genových sekvencí. Enzym pro větvení škrobu byl klonován z mnoha rostlinných druhů a obr. 2 uvádí sekvence aminokyselin, získaných z nukleotidové databáze Evropské laboratoře pro molekulární biologii (EMBL) pro různé známé enzymy pro větvení škrobu, jak je uvedno níže:

SBEII-2 pro Tríticum aestivum z pšenice (SEQ ID Č.: 12)

ZM SBE2a (kukuřice) pro Zea mays (SEQ ID Č.: 13)

ZM SBE2b (kukuřice) pro Zea mays (SEQ ID Č.: 14)

SBEIIa z ječmene (SEQ ID Č.. 15)

SBEIIb z ječmene (SEQ ID Č.: 16)

RICBCE3 (enzym typu SBEII z rýže) pro Oryza sativa (SEQ ID Č.: 17)

RICESBE-1/17 (jak je uvedeno výše, včetně tranzitní peptidové sekvence) (SEQ ID

Č.: 18)

PSSBEIGEN (SBEI z hrachu, který je v podstatě sekvencí typu SBEII) pro Pisum sativum (SEQ ID Č.: 19)

STSBE (typ SBEI z rajského jablka) pro Solanum tuberosum (SEQ ID Č.: 20)

TASBEI (SBEI-2 z pšenice) pro Tríticum aestivum (SEQ ID Č.: 21)

TASBEI D2 (SEQ ID Č.: 22)

ZMSBEI (SBEI z kukuřice) pro Zea mays (SEQ ID Č.: 23)

RICBEI (SBEI z rýže) pro Oryza sativa (SEQ ID Č.: 24

PSBEIIGN(SBEII z hrachu, což je v podstatě sekvence typu SBEI) pro Pisum sativum (SEQ ID Č.. 25)

Obr. 2 též uvádí novou sekvenci SBEII-1 pšenice podle vynálezu, označenou jako Osbell -1ALL (SEQ ID č. 11) Sekvence na obr. 2 a též na obr. 3, 4, 8 a 11 byly připraveny za použití Clustalovy metody s PAM 250 tabulky zbytkové zátěže pro aminokyselinové sekvence a tabulky zbytkové zátěže pro sekvence DNA. Vzdálenosti sekvenčních párů exprimovaných jako % podobnosti uvedeny na obr. 2A a 3A, 4A, 8A a 11A jsou stanoveny podle programu „MEGALIGN“ softwaru DNAStar a odpovídají procentům sekvenční homologie, jak je uvedeno výše.

Sekvence uvedeny na obr. 2 ukazují některé domény, které jsou vysoce konzervativní. Jedna z těchto domén, MDKDMYD (SEQ ID č. 36) byla téměř zcela • · ·· ·· * · · · · » · • · · · ··· • · · · · ··· ··· ·· ··

konzervativní a předpokládá se, že tato doména by též byla přítomna u genů pro větvení škrobu u pšenice. Tento motiv byl vybrán pro okligonukleotidový kódující primer (SBEA). 3’RACE PCR byla provedena na endospermu s jedním řetězcem cDNA za použití primerů RoaSBEA. Dvě populace PCR produktů o velikosti přibližně 1kb a 1,2 kb byly klonovány do plazmidového vektoru pT7Blue (Novagen). Plazmidová DNA z 36 domnělých rekombinantních klonů byla přečištěna a velikost inzertu byla stanovena restrikční analýzou. Patnáct klonů obsahujících inzerty o velikosti přibližně 1 kb až 1,2 kb bylo vybráno pro sekvenování.

Sekvence získané pomocí programu „MEGALIGN“ DNAStar ukazují, že 15 vybraných klonů lze rozdělit na základě stupně homologie do dvou různých tříd, které byly označeny jako SBE11-1 a SBEII-2. Třídy SBEII-1 a SBEII-2 je možné dále rozdělit do tří podtříd na základě sekvenčních rozdílů (tabulka 1). Předpokládá se, že rozdělení se pravděpodobně rozšíří až na tři podtřídy, protože pšenice obsahuje tři homologní domény.

Tabulka 1

Třída	Podtřída	Číslo kónu
SBEII-1	A	B2, B5, B6, B7, B12
SBEII-1	B	B10
SBEII-1	C	A1, A13, B4
SBEII-2	A	B11,
SBEII-2	B	B1, B9
SBEII-2	C	A2, C5

Srovnání sekvencí tříd SBEII-1 nebo SBEII-2 ukazuje na 90 až 96,8% podobnost. Naopak, sekvenční podobnost mezi charakteristickými sekvencemi tříd SBEII-1 nebo SBEII2 ukazuje na 58,8 až 60,0% homologii při srovnání jednotlivých oblastí. (Obr. 3 a 3a).

Srovnávaly se navíc charakteristické sekvence tříd SBEII-1 a SBEII-2 s dříve uvedenými klony SBEII u pšenice, pWBE6 (Mousey, 1994) a nedávno publikovaným SBEII ♦ · ·· ·♦ 44

44 · · · · · 4

4 4 4 444 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

444 ··· 44 44 4· 444 (Nair a kol., 1997). Výsledky ukazují, že dříve izolované klony SBEII jsou velmi homologní (>90 %) se třídou SBEII-2 (data nejsou uvedena). Ani dříve publikované sekvence pšenice zřejmě nevykazují vysokou homologii se sekvencí SBEII-1. Izolace a charakterizace tří forem SBEII-1 (SBEII-1, podtřídy A, B & C) je nová. Podtřída SBEII-2 B je též nová, podtřídy A a C odpovídají sekvencím dříve popsaným - Mousley (1994) a respektive Nair a kol. (1997).

Předpokládané aminokyselinové sekvence z charakteristických klonů B6 a B11 sekvencí SBEII-1 a SBEII-2 z pšenice oproti odpovídajícím oblastem aminokyselinových sekvencí SBEIIa a SBEIIb u kukuřice (Obr. 4 a 4a) ukazují, že SBEII-1 sekvence u pšenice (klon B6) je podobnější sekvenci SBEIIb u kukuřice (88,7%) než sekvenci SBEII-2 u pšenice a SBEFIIa sekvenci u kukuřice (82,2 % a 82,6% podobnost) a podobně, že SBEII-2 sekvence u pšenice je podobnější sekvenci SBEIIa u kukuřice (86,9% podobnost) než SBEII-1 sekvenci u pšenice a SBEIIb sekvenci u kukuřice (82,2 % a 81,7% podobnost). Na základě toho se usuzuje, že SBEII-1 u pšenice je vývojově spojena se sekvencí SBEIIb u kukuřice a že odpovídající sekvence pšenice a kukuřice vykazují podobné funkční vlastnosti. Zatímco kódující sekvence klonů B2, B10 a B4 mají silnou sekvenční homologii s SBEIIb genem kukuřice, je větší odlišnost v 3’ nepřekládaných oblastech sekvencí. Obr. 5, 6 a 7 ukazují 3’ nepřekládané sekvence klonů B2, B10 a respektive B4 a obr. 8 srovnává tyto sekvence s odpovídající sekvencí SBEIIb u kukuřice.

Následují předpoklady a příklady uvedené podrobně.

Rostlinný materiál

Odrůda Rialto Tríticum aestivum byla vypěstována ve skleníku za přídavného osvětlení a kontroly teploty při udržování 16 hodinové délky dne při 18 ± 1 °C.

Manipulace s rekombinantní DNA a sekvenování

Provedly se standardní postupy přesně podle Sambrook a kol., (1989). Sekvenování DNA se provedlo na automatickém sekvenátoru ABI a sekvence byly analyzovány pomocí softwaru DNASTAR pro Macintosh.

Izolace RNA pro klonování cDNA «·· ·

RNA se extrahovala z endospermu odrůdy Rialto Triticum aestivum za použití RNA izolačního kitu Purescript (Flowgen) přesně podle doporučení výrobce. Jednoduše, tkáň endospermu se zmrazila v tekutém dusíku a 2 minuty nechala usazovat na jemný prášek za použití dismembrenátoru (Braun Biotech International). Usazená tkáň se před extrakcí uchovala v tekutém dusíku. Přibližně 10 mg usazené tkáně se přeneslo do 1,5 ml centrifugační zkumavky a před mícháním překlápěním a umístěním na led po dobu 10 minut se ke tkáni přidalo 1,2 ml lyzačního pufru. Proteiny a DNA precipitovaly z buněčného lyzátu přídavkem 0,4 ml precipitačního roztoku „protein-DNA“, následovalo míchání převracením a pak centrifugace 13,000 x g při 4 °C po dobu 20 minut. Supernatant se rozdělil do dvou nových 1,5 ml zkumavek z nichž každá obsahovala 600 μΙ izopropanolu. Precipitát RNA se usadil centrifugací při 13,000 x g při 4°C během 10 minut, supernatant se odstranil a usazenina se promyla 70% ethanolem převracením zkumavky. Ethanol se odstranil a usazenina se sušila na vzduchu 15 až 20 minut před resuspendovánřm RNA v 7,5 ml „RNA hybridizačního roztoku“.

Příprava zásobní cDNA z endospermu pšenice

Zásobní cDNA z endospermu pšenice se připravila z celkové RNA, vyextrahované způsobem uvedeným výše za použití reverzní transkriptázy Superscript™ (Life Technologies) přesně podle doporučení výrobce. Jednoduše, pět mikrogramů RNA, 10 pmol RoRiddT17 [AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA (T17)] (SEQ ID č. 37) a sterilní destilovaná voda do reakčního objemu 12 μΙ v 500 μΙ mikrocentrifugační zkumavce se zahřála na 70 °C po dobu 10 minut před rychlým zchlazením v ledu. Obsah zkumavky se rychle zcentrifugoval před přídavkem 4 μΙ 5x First Strand Buffer 2μΙ 0,1 M DDT a 1 μΙ 10 mM dNTP a po zamíchání se inkuboval 2 minuty při 42 °C. Přidal se 1 μΙ Superscript™ a po zamíchání inkubace pokračovala 1 hodinu. Reakce se zastavila 15 minutovým zahříváním na 70 °C. K reakční směsi se přidalo 150 μΙ TwE-, a výsledná zásobní cDNA se použila jako templát pro PCR amplifikací.

PCR amplifikace sekvencí SBEII ze zásobní cDNA z endospermu.

Sekvence SBEII se amplifikovaly ze zásobní cDNA z endospermu za použití primeru Ro [AAGGATCCGTCGACATC] (SEQ ID č. 38), který je komplementární k Ro oblasti primeru RoRidT17 použitého k syntéze zásobní cDNA a specifického primeru SBEII, SBEA [ATGGACAAGGATATGTATGA] (SEQ ID č. 39). SBEA byl navržen jako homologní k

·»· • Φ · ·Φ β· motivu MDKDMYD (SEQ ID č. 36), který je umístěn přibližně ve vzdálenosti 1 kb od 3’ konce kódující sekvence výsledného peptidu. PCR probíhala v 50 μΙ reakci, obsahující 5 μΙ zásobní cDNA, 25 pmol Ro, 50 pmol SBEA, 5 μΙ 5x Taq pufru, 4 μΙ 25 mM Mg²⁺, 0,5 μΙ 20 mM dNTP a 1,25 U Taq polymerázy. Všechny složky reakce se smíchaly, kromě Taq polymerázy, před předehřátím na 94 °C 7 minut a pak chlazením na 75 °C po dobu 5 minut. Zatímco se reakční směsi udržovaly při 75 °C, přidala se Taq polymeráza a po důkladném zamíchání se reakce umístily do termocykléru na (94 °C - 30 sek, 50 °C - 30 sek, 72°C - 1 min) x 30 cyklů, zakončených 10 minutovou extenzí při 72 °C.

Produkty PCR se přečistily extrakcí směsí fenol/chloroform a chloroformem před ligací s pT7 Blue (Novagen) podle doporučení výrobce. Domnělé klony SBE se na začátku charakterizovaly metodami standardního přečištění plazmidové DNA a restrikčním štěpením. Pro sekvenování se vybraly reprezentativní klony tvořící rozmezí inzertů o různých velikostech.

Chromozomální lokalizace genů SBE u pšenice

Pro stanovení sekvencí SBE chromozómových oblastí se použily nullizomnítetrazomní linie pšenice Chinese Spring, jak je popsáno v Sears (1966). Ke stanovení lokace chromozómového raménka se použily ditelozomní linie (Sears, 1966). Další ditelosomní linie Betzes ječmene u pšenice jsou popsány v Islám (1983).

Chromozomální lokalizace dvou rodin sekvencí SBEII (SBEII-1, SBEII-2) se stanovily pomocí sondy pšenice nulli-tetra a ditelozomních zásobních linií s inserty přečištěnými na gelu různých klonů. Obr. 9 a zobrazuje hybridizaci získanou se sondou SBEil-2 (klon B1) na DNA štěpené Hindlll. Euploidní Chinese Spring dává 3 proužky, z nichž jeden chybí v liniích nullizomních pro chromosomy 2A, 2BN a 2D. Stejný blot reagoval znovu se specifickou sondou SBEII-1 (klon B2). Tím vznikl nový odlišný hybridizační profil (obr. 9b), dokazující specificitu použité sondy. Opět chyběl proužek v každé nullizomní linii pro 2A, 2B a 2D. Stejné složení proužků se získalo za použití SBEII-1 klonů B2 a B4. Genové sekvence 1 a 2 podtřídy SBEII tak spadají do skupiny 2 homologních chromozómů pšenice.

K identifikaci lokace těchto genů na raménku se použily ditelozomní přídavné linie (data nejsou uvedena). Toto dokázalo, že sekvence SBEII-1 a SBEII-2 jsou obě umístěny na dlouhém raménku homologní skupiny 2 chromozomů pšenice. Přídavné linie ječmene se použily pro ověření, zda jsou homologní sekvence přítomny u ječmene. Výsledky dokázaly, že sekvence homologní k sekvencím SBEII-1 a SBEII-2 pšenice jsou umístěny na dlouhém raménku chromozomů 2H ječmene.

	•		··	*·	>·
	··	«	r	•	• *	• ·
		•	•	···	•
	•	•	*	• ·	*	9
*>♦	·· ·		·»	« ·	»9

izolace RNA a Nothern blot

Zrna pšenice se sklidila ve vhodných intervalech a zmrazila v tekutém dusíku před pomletím na jemný prášek za použití Braunova Mikrodismembratoru™ nebo paličky a hmoždíře. Celková RNA se vyizolovala za použití kitu RNA queous™ (Ambion lne) podle instrukcí výrobce nebo následujícím postupem. Zmrzlý prášek ze zrna se smíchal s 10X objemem 0,2M Tris-HCI pH9, 0,4M NaCI, 25 mMEDTA, 1% SDS, 1% PVPP, 0,25% odpěňovačem A a 0,1 M DTT. Tato směs se extrahovala dvakrát ekvivalentním objemem směsi fenol/chloroform/izoamylalkohol (25:24:1), nukleová kyselina precipitovala z vodné fáze přídavkem 0,8 objemu izopropanolu a výsledná usazenina se rozpustila v H₂O. RNA pak selektivně precipitovala přídavkem 1 objemu 4M LiCI, inkubovala se přes noc při 4 °C a výsledná usazenina se rozpustila ve sterilní destilované H₂O. 15 μΙ celkové RNA se použilo pro elektroforézu na gelu 1% agarózy, 2.21M formaldehydu, 40 mM MOPS pH 7,0, 10 mM octanu sodném, 1 mM EDTA gelu, v 40 mM MOPS pH7, 1 mM EDTA pufru při napětí 1V/ cm přes noc. Gely se umístily do roztoku ethidiumbromidu ve vodě o koncentraci 50 ng/ml, odbarvily ve vodě za 2 hodiny, vyhodnotily a vyfotily při UV světle. Gely se pak rychle promyly sterilní destilovanou H₂O, pak blotovaly na HyBond N⁺™ (Amersham International), podle standardních postupů (Sambrook a kol., 1989) přes noc. Bloty se oddělily a vysušily na vzduchu před fixací UV při 312 nm po dobu 2 minut.

Izolace sondy a přečištění až 10 pg plazmidů pUN1 a pSR98-29 se rozštěpilo Sst1 (Life Tehcnologies Ltd) podle výrobních instrukcí a získaly se fragmenty o velikosti přibližně 0,8 kb (Nptll) a respektive 1 kb (SBEII-1). 5 až 10 pg plazmidů pVT96-54 se rozštěpilo BamHla získal se fragment SBEII-2 o velikosti přibližně 1,2 kb. Štěpy se použily k elektroforéze na 1% agarózovém gelu s nízkým bodem tání. Genově specifické fragmenty se prověřily a DNA se přečistila za použití gel purifikačního kitu Wizard™ (Promega).

Značení sondy a hybridizace ng odpovídající próby (Waxy promotor kukuřice, Nptll, fragment SBEII-1 nebo SBEII-2 z pšenice) se označilo radioaktivně pomocí systému Rediprime 11™ (Amersham International) za použití a³²PdCTP (Amersham International) podle pokynů výrobce. Bloty hybridizovaly přes noc při 65 °C v 0,6M NaCI, 20 mM Pipes, 0,2% gelu, 0,2% Ficoll 400, 0,2% PVP-360, 10 mM Na₄P₂O₇10H₂O, 0,8% SDS, 0,5 mg/ml denaturované DNA ze spermatu lososa. Promytí po hybridizaci se provádělo v roztoku 30 mM NaCI, 2 mM

NaH₂PO₄.2H₂O, 0,2 mM Na₂EDTA . 2H₂O, 0,1% SDS 7 minut při laboratorní teplotě a pak 10 minut při 65 °C. Filtry se exponovaly na film Kodak BioMax MR™ (Amersham International) při 70 °C. Bloty se promývaly 10 minut při 90 °C v roztoku 15 mM NaCI, 1 mM NaH₂PO₄.2H₂O, 0,1 mM EDTA nebo do nulového pozadí.

Prodloužení sekvence SBEII-1 od 3’ k 5’ konci výsledného peptidu

Využilo se sekvenčních odchylek mezi sekvencemi SBEII-1 a SBEII-2 k navržení SBEII-1 specifického 3’ primeru, Sb4. Primer se použil ve spojení s 5’ specifickým primerem SBEII k rozšíření nové sekvence SBEII-1 na základě PCR.

K rozšíření SBEII-1 3’ sekvence k 5’ konci výsledného peptidu se určila druhá konzervativní doména a navrhl se oligonukleotidový kódující primer AGSBEI. Provedla se PCR amplifikace z jednořetězcové zásobní cDNA endospermu za použití páru primerů AGSBEI-Sb4. Oddělení naamplifikovaných produktů elektroforézou na 1% (hmotnost/objem) agarózovém gelu (data nejsou uvedena) ukázalo, že výsledek reakce dává odlišný proužek o velikosti přibližně 2,2 kb. Pravděpodobné 2,2 kb amplifikační produkty se odseparovaly z gelu, spojily s PT7Blue a transformovaly do odpovídajících buněk Novablue E. co//. Po inkubaci přes noc se devět domnělých rekombinantních klonů vybralo k další analýze. Screening každého z vybraných klonů za použití vektor specifických primerů ukázal, že klony 5A1, 5A2, 5A5 a 5A9 zabudovaly inzerty předpokládané velikosti. Z těchto klonů byl klon 5A1 (který patří do podtřídy C) vybrán pro sekvenování (obr. 10). Aminokyselinová sekvence z obr. 10 odpovídá sekvenci Osbell-1ALL z obr. 2. Avšak ne celá sekvence předpokládaného otevřeného čtecího rámce zahrnuje nukleotidy 44 až 1823 a kóduje 593 aminokyselin peptidu. Na základě podobností s geny kukuřice se předpokládá, že u této sekvence chybí přibližně 230 aminokyselin z předpokládaného celkového počtu 830 aminokyselin. Na základě toho tak částečná sekvence představuje přibližně 70% kódující sekvence. Mnohočetné sekvenční varianty sekvence SBEII-1 s nedávno publikovanou sekvencí SBEII-2 pšenice (Nair a kol., 1997), SBEI (Rapellin a kol., 1997) a SBEI-D2 (Rahman a kol., 1997) ukazují, že sekvenční podobnost SBEII-1 je 69,6%, 31,2% a 46,7% vzhledem k SBEII-2, SBEI a respektive SBEI-D2 (obr. 11 a 11a). Tato skutečnost dokazuje, že sekvence SBEII-1 se liší od publikovaných sekvencí SBE a potvrzuje analýzu uspořádání 3’ sekvence (obr. 3). Zvýšení relativní homologie ve srovnání s výsledkem získaným z 3’ sekvence vyplývá ze skutečnosti, že centrální doména SBE je vysoce konzervativní (Burton a kol., 1995; Gao a kol., 1997). Je však zřejmé, že tato klonovaná sekvence SBEII-1 pšenice je významně odlišná od dříve publikované sekvence SBE pšenice a představuje novou sekvenci.

·· · · ··« · · · • · · · ··· * ·

Následují podrobnosti o provedení experimentu.

Sekvence SBEII-1 byly rozšířeny k 5’ konci výsledného peptidu amplifikací ze zásobní cDNA endospermu za použití SBEII-1 specifického primeru Sb4 [TTTTCTTCACAACGCCCTGGG] (SEQ ID č. 40) ve spojení s primerem AGSBEI [TGTTTGGGAGATCTTCCTCCC] (SEQ ID č. 41). AGSBEI byl navržen jako homologní k motivu GVWEIFLP (SEQ ID č. 42), který byl konzervativní ve všech známých sekvencích SBE a je umístěn na 5’ konci sekvence kódující výsledný peptid. PCR proběhla v 50 μΙ reakci obsahující 5μΙ zásobní cDNA, 50 pmol Sb4, 50 pmol SBEA1, 5 μΙ 5xTaq pufru, 4 μΙ 25 mM Mg²⁺, 0,5 μΙ 20 mM dNTP a 1,25U Taq polymerázy. Všechny složky reakce se smíchaly, před PCR reakcí sestávající z 30 cyklů (94 °C - 45 sek, 55 °C - 30 sek, 72 °C 1 min 30 sek) a závěrečné 10 minutové extenze při 72 °C. Amplifikační produkty se oddělily elektroforézou na 1% (hmotnost/objem) agarózovém gelu a specifické amplifikační produkty předpokládané velikosti se odseparovaly z gelu. DNA se eluovala z kousků gelu extrakční sady pro gely QUIAGEN podle doporučení výrobce před ligací s pT7 Blue (Novagen). Ligace se prováděla v 10 μΙ reakci obsahující 7,5 μΙ přečištěného amplifikačního produktu, 1 μΙ 10x ligačního pufru, 1 μΙ pT7Blue a 0,5 μΙ T4 DNA ligázy (Amersham). Reakční složky se dobře promíchaly před inkubací při 4 °C přes noc. Po této inkubaci se polovina ligační reakce použila k transformaci odpovídajících buněk Novablue E.coli (Novagen). Transformované buňky se umístily do LB misek obsahujících X-gal (40 pgml'¹), IPTG (0,1 mM), carbenicillin (100 pgml'¹) a tetracyklin (12,5 pgml·¹) před inkubací přes noc při 37 °C. Domnělé rekombinantní klony se původně testovaly na přítomnost insertu pomocí PCR na koloně za použití vektor specifických primerů T7B a U19. Insert pozitivní klony se testovaly pomocí inzert specifického primeru ve spojení s primerem T7B nebo U19 pro určení orientace insertu v mnohonásobném klonovacím místě před sekvenováním.

Analýza Southern blot

Analýza připravených nuili-tetrazonmích a diteiozomních blotů se prováděla přesně podle popisu v Jack a kol. (1994).

Klony SBEII-1 uvedené výše, se klonovaly do transformačních vektorů pro transformaci pšenice.

Analýza Nothern blot

Nothern bloty se připravily z celkové RNA z vyvíjejících se pšeničných zrn kultivaru Bobwhite. Obr. 12 zobrazuje Nothern blot RNA ze semen pšenice kultivaru Bobwhite vypěstovaných ve skleníku podle popisu a sklizených mezi 5 a 29 dnem po odkvětu. Na blot se použila próba 1 kb Sací fragmentu SBEII-1 a následně (po odstranění) blotu se použil

1,2 kb BamH1 fragment SBEII-2, oba fragmenty byly přečištěny a označeny podle popisu. Obr. 12 A ukazuje gel s RNA obarvenou ethidiumbromidem před Nothern blotem. Obr. B ukazuje výsledky po použití sondy SBEII-1 a obr. C ukazuje výsledky po použití sondy SBEII-2. Ze srovnání obr. B a C jsou zřejmé odlišnosti v intenzitách signálů v různých časových okamžicích. Relativně silnější intenzita se vyskytuje zejména u sondy SBEII-2 po 5. dnu než u sondy SBEII-1, potvrzující tu skutečnost, že transkripční profil SBEII-1 a SBEII-2 jsou odlišné, z čehož zřejmě plyne, že dvě genové rodiny (SBEII-1 a SBE-2) se během vývoje semena exprimují odlišně. Velikost sledovaných transkriptů u SBEII-1 a SBEII-2 je přibližně 3,5 kb. Transkript SBEII-2 je však mírně kratší než transkript SBEII-1.

Plazmidové konstrukty

Pro plazmidové konstrukty se použily standardní postupy molekulární biologie (Sambrook a kol., 1989).

pWxGS+ (obr. 13) obsahující fúzi granulovité vazby genu syntázy genu kukuřičného škrobu (Shure a kol. 1983) s promotorem-GUS-Nos získanou jako výsledek Unileverova výzkumu Sue Wesslera (Univerzita v Georgii, Athény, USA) a je možné jej získat z tohoto zdroje na požádání. Promotor pWxGS+ je přibližně 1,5 kb dlouhý a představuje zkrácenou verzi podobného, ale delšího fragmentu promotoru popsaného v Russel & Fromm (1997). Sekvence promotoru (fragment Hindlll-BamH1) u pWxGS+ je uvedena na obr. 13A (SEQ ID No: 55).

pSRWXGUSI (obr. 14) se vytvoří začleněním spojovníku Sací (d(pCGAGCTCG)OJ (New England Biolabs [NEB] (NEB katalog č. 1044) do oblasti Smál v pWyGS+.

pVTWXGUS2 (obr. 15) se vytvoří začleněním spojovníku BamH1 [d(pCGGGATCCCG)] (SEQ ID No: 43) (katalog NEB č. 1071) do Ecl136ll (isoschizomer Sac 1, který dává tupé konce) oblasti pWxGS+.

Spojovník Sací se včlenil na místo Xbal (které bylo zarovnáno použitím Klenowova fragmentu + dNTp) B6 klonu SBEII-1 v plazmidu pTBIue za účelem tvorby klonu jako meziproduktu. Sekvence SBE se pak přečistila z tohoto klonu jako produktu jako fragment Sad a připojila se na místo Sad pSRWXGUSI nahrazující sekvenci genu GUS za produkce plazmidu pSR96-26 a pSR96-29 představující orientaci proti smyslu a ve smyslu ve směru exprese genu sekvence SBEII-1 promotoru Waxy.

Spojovník BamH1 se včlenil na místě Xbal (které bylo zarovnáno použitím Klenowova fragmentu + dNTp) B11 klonu SBEII-2 v pT7Blue za účelem tvorby klonu jako meziproduktu. Sekvence SBE se pak přečistila z tohoto meziproduktu jako fragment BamH1 a připojila se na místo BamH1 v pVTWXGUS2 nahrazující sekvenci genu GUS za produkce plazmidu pVT96-50 a pVT96-53 představující orientaci proti smyslu a ve smyslu ve směru exprese genu sekvence SBEII-2 promotoru Waxy.

pVT96-54. Spojovník BamH1 se včlenil na místě Xbal (které bylo zarovnáno použitím Klenowova fragmentu + dNTp) B9 klonu SBEII-2 (ekvivalentní klonu B1) v pTBIue za účelem tvorby klonu jako meziproduktu. Sekvence SBEII-2 se pak přečistila z tohoto meziproduktu jako fragment BamH1 a připojila se na místo BamH1 pVTWXGUS2 nahrazující sekvenci genu GUS za produkce plazmidu pVT96-54.

Sekvence Waxy-SBE-NOS v plazmidech pSR-26 a pSR96-29 a pVT96-50 a pVT9653 se přečistily jako fragmenty HindlII/EcoRI a včlenily do místa EcoRI/HindlII plazmidu pPBI-97-2 (známého též jako p97-2) (obr. 16). Plazmid pPOB-97-2 je popsán v evropské přihlášce vynálezu č. 97305694.8 (publikovaném jako WO 99/06570). Pro odstranění signálního znaku genu pro ampicilinovou rezistenci byly navrženy výsledné plazmidy pSR97-26A-(klon B6 (SBEII-1, podtřída A) v antimediátorové orientaci), pSR97-29A-(klon B6 v antimediátorové orientaci), a pSR97-50A (klon B11 (SBEII-2, podtřída A) v antimediátorové orientaci) a pSR97-53A, (klon B11 v kódující orientaci), jak je uvedeno na obr. 17, 18,19 a 20.

p97-2C (obr. 21) se vytvořil štěpením mnohočetného spojovníkového místa Ecl136 II do Smál v plazmidu pPBI97-2 (obr. 16), ligací a výběrem rekombinantů, v kterých se znovu začlenila oblast mnohočetného spojovníkového místa z Smál do Ecl136 v opačné orientaci.

Sekvence Waxy-NOS v pSRWXGUSI se přenesly jako fragment HindlII/EcoRI do místa HindlII/EcoRI plazmidu p97-2C za vzniku plazmidu p97-2CWT1 (obr. 22).

pSC98-1 a pSC98-2. Rozšířený 5A1 klon SBEII-1 k 5’ konci 5A1 v pTBIue (obsahující SBE sekvenci z oblasti od 43 do 2003 bp na obr. 10) se štěpil EcoRI a Xbal a následně se přerušení „spojí“ za použití Klenow polymerázy a dNTP. Výsledný tupě zakončený fragment SBE se přečistil na gelu a spojil s p97-2CWT1 (obr. 22), kde se štěpil pomocí Ecl 13611 a defosforyloval za použití telecí střevní fosfatázy. Výsledné rekombinanty se testovaly restrikční analýzou a identifikovaly se klony obsahující orientaci sekvence SBE (s ohledem na waxy promotor). pSC98-1 (obr. 23) je verze antimediátorová a pSC98-2 (obr. 24) je verze kódující. Následným odstraněním genového markéru pro ampicilin se získaly výsledné plazmidy pSC98-1A a pSC98-2A.

Promotor ubichitinu - Nptll selekční konstrukt: pUN1 pUN1 se připravil následovně:

Spojovník Sací se včlenil na místo Smáli plazmidu pAHC25 (Christensen a Quail

1996) za vzniku plazmidu jako meziproduktu. GUS gen se odstranil z meziproduktu plazmidu štěpením pomocí Sací a následně vlastním připojením a identifikací rekombinantních molekul neobsahujících sekvenci GUS se získal plazmid pPBI95-9. pPBI95-9 se štěpil pomocí EcoRI a následně se identifikovaly připojené rekombinantní molekuly neobsahující sekvenci Ubi-BAR. Výsledný plazmid byl označen jako pPBI96-23. Sekvence Nptli se naamplifikovala jako PCR produkt za použití primerů AG957:5’GATGAGCTCCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGG (SEQ ID č.:44) a AG958:5’GTCGAGGfCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID č.: 45), za použití pPB|BAG3 (Goldsbrough a kol. 1994) jako templátu pro sekvenci Nptli. Amplifikovaný produkt se nakloňoval do místa Sstl v pBluescript (Stratagene) a sekvenoval. Sekvenování ukázalo, že sekvence Nptli byla spíše „mutantní“ forma než standardní typ, jak se očekávalo. „Mutantní“ forma nese záměnu jedné báze, která je „lemována“ unikátními místy Nco1 a Sph1. Klon Bluescript se štěpil Nco1 a Sph1 pro odstranění oblasti obsahující záměnu jedné báze. Dva oligonukleotidy, (Npt1: CCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACC (SEQ ID č.:46) a Npt2: CATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATG) (SEQ ID č.: 47) se vzájemně spojily za tvorby fragmentu Nco1/Sph1. Tento se nakloňoval do Nco1/Sph1 štěpeného klonu Bluescript/Npt11 a výsledný klon se sekvenoval pro potvrzení, že gen již není standardní formou.

Sekvence Nptli se pak přečistily jako fragment Sací a včlenil do místa Sací v pPBI96-23 za vzniku pUN1 (obr. 25). pUN1 zahrnuje standardní typ promotoru ubichitinu (Ubi promotor), který se též považuje za regulační systém ubichitinu (ve zkratce URS). Orientace sekvence fragmentu Nptli v pUN1 byla stanovena restrikční analýzou. Sekvence fragmentu Nptli Sací je uvedena na obr. 26 (SEQ ID č.: 35). pUSN99-1 a pUSN99-2. Sekvence SBEII-1 (klon B6) se přečistila jako fragment Sad z plazmidu pSR96-26 a včlenila na místo Sad v pPBI96-23 za vzniku plazmidů pUSN99-1 a pUSN99-2 (obr. 27 a 28) představující „sense“ a „antisense“ orientace sekvence SBEII-1.

pPBI97-2BdUN1. pPBI92-2BdUN1 (někdy též označována jako p97-2BdUN1) zahrnuje rekonstituovaný regulační systém ubichitinu (následně označovaný jako modifikovaný promotor ubichitinu nebo modifikovaný regulační systém ubichitinu (mURS)), kterému chybí dva překrývající se „konvenční elementy tepelného šoku“ uváděné v EP 0342926 a US 5614399. Modifikovaný promotor ubichitinu se připravil pomocí PCR amplifikace dvou DNA fragmentů za použití genomové DNA jako templátu a následnou ligací dvou fragmentů za vzniku jednoho fragmentu neobsahujícího známou sekvenci • · ♦· ·♦ ·· .

·· ·· ··» ···· • · «···· · < · • ..........

• · ···· ·«· ··· .·· ·· ·· _a.

tepelného šoku (HS). Na místo sekvence HS se včlenila restrikční oblast Kpn1. Použité primery byly navrženy podle sekcence publikované Liu a kol. 1995 (EMBL DNA databáze ZMU29159). K odsranění sekvence HS a nahrazení diagnostickým místem Kpn1 se použil promotor ubichitinu a intronová sekvence amplifikovaná jako dva fragmenty za použití kombinace primerů HS1 + Ubi3-3 a HS2 + Ubi5-2, sekvencí, které jsou uvedeny níže. Primery Ubi5-2 a Ubi3-3 jsou homologní k sekvencím publikovaným Liu a kol., 1995. Primery HS1 a HS2 jsou homologní k sekvencím umístěným přímo na 3’ a 5’ konci dvou překrývajících se oblastí HS v promotoru ubichitinu, jak je popsáno v EP 0342926 a US 5361399. Oba tyto primery mají Kpn1 konec a 5’ konec.

Primery

HS1: 5-ATTAGGTACCGGACTTGCTCCGCTGTCGGC-3 (SEQ ID č.: 48)

HS2: 5-7A7AGG7ACCGAGGCAGCGACAGAGATGCC -3 (SEQ ID č.: 49)

Ubi5-2: 5-AGCTGAATCCGGCGGCATGGC -3 (SEQ ID č.: 50)

Ubi3-3: 5-TGATAGTCTTGCCAGTCAGGG-3 (SEQ Id č.: 51)

Naamplifikované produkty se klonovaly do pGEM TEasy (Promega) za vzniku plazmidů p97-U1 ap97-U2. Celá délka (přibl. 2kb) modifikovaného promotoru ubichitinu se rekonstruovala subklonováním fragmentu Kpn1 -Sací z p97-U1 do místa Kpn1/Sac v p97U2 za vzniku p97-U3. Částečná restrikční mapa předpokládané sekvence (SEQ ID No: 52) klonovaného fragmentu v p97-U3 je uvedena na obr. 29. (Modifikovaný promotor ubichitinu (nebo mURS) je předmětem evropské přihlášky vynálezu podané tímto přihlašovatelem stejného data jako tato přihláška pod referenčním číslem C1235.01/M). Modifikovaný promotor ubichitinu se přetransformoval jako fragment Pstl z p97-U3 do plazmidů pPBI9636. Plazmid pBI96-36 (obr. 30) obsahuje reportérovou genovou fúzi GUS-Nos pod kontrolou standardního promotoru ubichitinu (odvozeného od pAHC25) v plazmidové páteři pUC. Promotor nahrazuje standardní typ regulačbního systému ubichitinu v pPBI96-36 za vzniku plazmidů p97-dUG1 (obr. 31) jako meziproduktu.

Konstrukce pPBI97-2BdUN1

Sekvence Ubi-Nos v pPBI96-23 byla přenesená jako fragment EcoRI-HindlII do oblastí EcoRI a Hindlll v p97-2B (plazmid p97-2B je popsán v evropské patentové přihlášce ·· ·* » · · ► · · · ·

číslo 97305694,8 publikované jako WO 99/06570) za vzniku plazmidu p97-2BUbiNos. Modifikovaný promotor ubichitinu se přečistil jako fragment Hindlll/Sacl z p97-dUG1 (obr. 31) a přenesl do oblastí Hindlll a Sací v p97-2BUbiNos, nahrazující standardní typ promotoru ubichitinu za vzniku p97-2BdllbiNos. Sekvence Nptll v pUN1 se přečistila jako fragment Sací a přenesla do oblasti Sací v p97-2BdllbiNos za vzniku pPBI97-2BdUN1 (obr. 32). Následným odstraněním markéru pro ampicilinovou rezistenci za použití metody popsané ve WO 99/06570 se získal výsledný plazmid, označený jako p97-2BdUN1A, který se používal pro transformaci u pšenice.

pCaineo pCaiNeo zahrnuje gen Nptll pod kontrolou promotoru CaMV35S a intronu Adh1 u kukuřice. Plazmid popisuje Fromm a kol., 1986.

Transformace pšenice

U transformace pšenice se použily následující plazmidové kombinace („cobombardments“):

Tabulka 2 Plazmidové kombinace použité upři transformačních pokusech u pšenice

Genové konstrukty škrobu	Výběr markerových konstruktů
	PAHC25
pWXGS+	pUN1
pSR97-26A - antimediátorový	pUN1 nebo p97-2BdUN1
pSR97-29A - kódující	p97-2BdUN1 nebo pCaiNeo
pSC98-1A - antimediátorový	p97-2BdUN1
pUSN -1 - kódující	p97-2BdUN1
pUSN-2 antimediátorový	p97-2BdUN1

• ·

pUSN -1 kódující pUSN -2 antimediátorový	pUN1
pSC98-2A -kódující	p97-2BdUN1

Metody zde popsané u transformace pšenice jsou z veiké části založeny na metodách popsaných Barcelem a Lazzerim, 1995.

Zárodek rostliny pšenice jarního kultivaru Bobwhite a zimního kultivaru Florida se pěstoval ve skleníku s 16 hodinovou délkou dne s dodatečným osvětlením pro zajištění minimální světelné intenzity 500 pmol m-²s-¹. Teplota ve skleníku se udržovala při 19 °C+/1 °C během dne a 14 °C+/-1 °C přes noc.

Z vyvíjejících se zrn se získala nezralá embrya. Semena se sklidila a zárodky se kultivovaly po přibližně 12 dnech po odkvětu, když byly zárodky přibližně 1 mm dlouhé. Semena se nejprve promyla v 70% ethanolu 5 minut a pak se vysterilizovala v 10% čistícím roztoku Domestos bleach (Domestos je ochranná známka) 15 minut a následně 6 krát sterilní destilovanou vodou. Po odstranění páteře zárodku se embrya umístila páteří na agarózový gel (Sigma katalog č. A-3301) připravený za použití media MM1. Obecný postup pro přípravu MM1 je uveden v příloze 1 a návody pro různé složky v příloze 2. Zárodky se před bombardováním uchovávaly v temnu dva dny při 24 °C+/-1 °C.

Plazmidy pAHC25, pCAiNeo, pUN1 a p97-2BdUN1 se použily jako selekční markéry v kombinaci s genovým konstruktem škrobu, jak je podrobně popsáno v tabulce 2. pAHC25 (Christensen and Quail 1996) obsahuje chimemí Ubi-BAR gen, který provádí selekci transformantů do fosfinotricinu, aktivní složky v herbicidech BASTA™ a Bialophos (viz Block, M.de. a kol., 1987). Plazmidy pCAiNeo (Fromm a kol., 1986), pUN1 a p97-2BdUN1 obsahují chimemí fúze promotoru genu Nptll a provádí výběr transformantů oproti škále aminoglykozidových antibiotik včetně kanamycinu, neomycinu, geneticinu a paromycinu.

Pro zavedení plazmidů do rostlinných buněk se použilo částečné bombardování. Pro precipitaci plazmidové DNA na povrch 0,6 μΐυ zlatých částic (BIO-RAD katalog číslo 1652262) se použil následující postup: Celkové množství 5 gg plazmidové DNA se přidalo do 50 μΙ suspenze částic zlata, sonifikovaných 1 minutu (@ 10 mg/ml) v 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce. Po rychlém promíchání během tří sekund se přidalo 50 μΙ 0,5M roztoku chloridu vápenatého a 20 μΙ 0,05M roztoku volné báze spermidinu na opačnou stranu víčka mikrocentrifugační zkumavky. Obsah zkumavky se smíchal uzavřením víčka a průnikem chloridu vápenatého a spermidinu na dno zkumavky. Po 3 sekundovém vortexvání se suspenze centrifugovala 5 sekund při 13 000 otáčkách za minutu. Supematant se pak odstranil a pelet se resuspendoval v 150 μΙ absolutního ethanolu. Tento krok vyžadoval setření částic zlata z vnitřní strany zkumavky pomocí špičky

pipety. Následoval další 3 sekundový vortex, vzorek se pak opět centrifugoval a usazenina se rozsuspendovala v celkovém objemu 85 μΙ absolutního ethanolu. Částice se krátce zvortexovaly a sonifikovaly 5 sekund ve vodní lázni sonifikátoru Camlab Trisonic T310 pro zajištění dobré disperze. Alikvot 5 μΙ zlatých částic pokrytých DNA se umístil doprostřed makronosiče (BIO-RAD katalog č. 115-2335) a sušil se 30 minut. Bombardování částic se provedlo za použití komůrky Biolisitc™ PDS-1000/He (BIO-RAD Instruments, Hercules CA), která je schématicky zobrazena na obr. 33, za použití tlaku helia 4478 kPa a 6200 kPa (pojistná membrána: BIO-RAD katalog číslo 165-2327 a 165-2328).

Co se týká obr. 33, zobrazená vakuová komůrka obsahuje plášť 10 vnitřní stěny, který zahrnuje sérii 12 otvorů pro vstup, jako například pro příjem vzorků 14, uvedený na čtvrté úrovni shora pláště. Pojistný disk 16 je nesený v trubici pod tlakem helia 18 blízko horní části zařízení. Nosič 20 v druhé části zařízení 12 shora zařízení nese jednotku 22, která obsahuje zastavovací čidlo a kruhy 24, z nichž 11 kruhů je pod nosičem 20 a 3 až 4 kruhy jsou nad nosičem 20. Makronosič 26 je umístěn v horní části jednotky 22. Přibližná vzdálenost od přerušení disku 16 k makronosiči 26 je 25 mm s přibližnou vzdáleností od makronosiče 26 k zastavujícímu čidlu 7 mm a přibližná vzdálenost od zastavovacího činidla k otvoru pro příjem vzorku 14 je 67 mm. Vzdálenost horní části jednotky 22 je přibližně 21 mm od spodní části zkumavky 18 a spodní jednotka 22 je přibližně 31 mm od horní části vzorku 14.

Nevyvinuté zárodky se bombardovaly mezi 1. a 2. dnem po založení kultury. Pro ozařování se nevyvinuté zárodky seskupily do kruhu o průměru přibližně 1 cm, obsahujícího 20 až 100 embryí, osou do media MM1. Petriho miska (neuvedeno) obsahující tkáň se umístila do komůrky pro příjem vzorku 14, na čtvrtou úroveň shora, jak je znázorněno na obr. 33. Vzduch v komůrce se pak odsál na vakuum 28,5 palců Hg. Makronosič 26 se pak zrychlil vlnami helia za použití membrán, které se protrhly pň tlaku He v tlakové zkumavce 18 dosahující 4478 kPa nebo 6200 kPa. Za 1 hodinu po bombardování se bombardovaná embrya umístila do MM1 media v hustotě 10 embryí na 9 cm a uchovávala se nepřetržitě za tmy a při 24°C po dobu 2-3 týdnů. Během této doby se na bombardovaných embryích vytvořil somatický embryonální krunýř. Po 2-3 týdnech se embrya přenesla do zgelovatělého regeneračního média známého jako R medium a inkubovala při 24°C při 16 hodinové délce světla. Obecný návod pro přípravu média R je uveden v příloze 1. Embrya se přenesla na čerstvé misky v 2-3 týdenních intervalech. Složení regeneračního média se lišilo v závislosti na režimu selekce. U transformantů bombardovaných genem BAR se vypustil roztok 3 aminokyselin a pro selekci se použil roztok PPT (fosfinotricin) o koncentraci 1 mg/l až 3 mg/l během tri 2-3 týdenních transferů pro selekci. Pro selekci transformantů se použil gen Nptll třemi různými způsoby: 1) Geneticin (GIBCO-BRL • · katalogové číslo 10131-019) se včlenil (o koncentraci 50 mg/l) ihned do transferu do regenerovaného média a jeho koncentrace se udržovala na 50 mg/l pro následující přenos do regeneračního média. 2) & 3). Embrya se nejprve přenesla do regeneračního média bez selekce, na 12 dnů a 2-3 týdny a pak se přenesla do média obsahujícího Geneticin o koncentraci 50 mg/l. Po 2-3 pasážích v regeneračním médiu se přenesly do samostatných zkumavek s kulturami, obsahujícími 15 ml regeneračního média o poloviční iontové síle se selekcí 3 mg/l PPT nebo 35 mg/l geneticinu v závislosti na použití genu BAR z genu Nptll u původního bombardování. Po vytvoření kořenů se regenerované rostliny zasadily do půdy ve skleníku.

Izolace genomové DNA a analýza Southern blotu

Analýza Southern blotu primárních transformantů a dceřinných rostlin se prováděla následovně: Zmrazené vysušené listy se rozmělnily pomocí paličky a hmoždíře Kontes™ a genomová DNA se extrahovala podle popisu v Futon a kol., 1995. 5 pg genomové DNA se štěpilo vhodným restrikčním enzymem podle doporučení výrobce a pak proběhla elektroforéza na 1% agarózovém gelu přes noc. Poté se gel vyfotografoval, promyl a blotoval na Hybond N+™ (Amersham International) podle Southern metody za použití standardních postupů (Sambrook a kol., 1989). Po následném blotování se filtry vysušily na vzduchu, pak v pícce 1 až 2 hodiny při 65 °C a zafixovaly UV 2 minuty pň 312 nm.

Příprava próby a značení pro analýzu Southern blotu transforovaného materiálu se provádělo podle popisu výše.

Histochemie GUS se provedla přesně podle popisu Jeffersona (1987).

Vyhodnocení promotoru ubichitinu pro konstitutivní expresi přidružených transgenů.

Plazmid pAHC25 (Christensen a Quail, 1996) se transformoval do pšenice podle popisu v předchozích částech. Transformanty se vybraly na základě rezistence na fosfinotricin. Analýzy Southern blot se prováděly na primárních transformantech pro potvrzení začlenění plazmidové sekvence (data nejsou uvedena). Histochemické analýzy GUS se též provedly a ukázaly, že promotor ubichitinu je schopen zprostředkování vysoké exprese GUS ve tkáních pšenice. Obr. 34 A, B, C & D uvádí histochemické lokalizace exprese GUS u ve tkáni semene, stonku, květenství a listů. Analýzy Southern blot a histochemické analýzy GUS se též prováděly na mladých rostlinách primárních transformantů pro potvrzení, zda použitý transformační systém je schopný tvorby transgenních rostlin, které trvale přenáší včleněné plazmidové sekvence do potomstva rostlin. Obr. 35 ukazuje Southern blot 26 dceřiných rostlin transformantů BW119, který byl • · • ···

transformován pAHC25. V tomto příkladu byla genomová DNA z dceřinných rostlin štěpena restrikčním enzymem Sací a blot byl spojen se sondou o sekvenci kódující gen GUS. Výsledky Southern blot naznačují přítomnost dvou nezávisle segregujících integračních lokusů, z nichž každý obsahuje konkatamery plazmidové sekvence pAHC25.

Vyhodnocení promotoru waxy u kukuřice pro endosperm-specifickou expresi přidružených transgenů.

Plazmidy pWxGS+ a pUN1 se kotransformovaly do pšenice, jak je popsáno dříve. Transformanty se vybraly na základě rezistence na geneticin. Analýza Southern blot se prováděla na primárních transformantech pro potvrzení integrace plazmidových sekvencí (data nejsou uvedena). Histochemické analýzy GUS se prováděly též pro stanovení expresního profilu zprostředkovaného waxy promotorem kukuřice. Většina transformantů, které exprimovaly GUS, vykazovaly expresi specifickou pro tkáň endospermu, dokazující vhodnost tohoto promotoru zprostředkovat endospermovou expresi přidružených transgenů. Obr. 36 A&B ukazují endosperm specifickou expresi GUS v semenech dvou nezávislých transformantů. Nesledovala se exprese GUS v pylových zrnech, jak sledovali Russell a Fromm (1997). Avšak u konstruktu, který použili, použili též včleněný hsp intron 70 kukuřice, který může mít případně kvantitativní i kvalitativní vliv na expresi.

Transformace pšenice pomocí genových konstruktů škrobu.

Různé kombinace konstruktů, podrobně uvedené v tabulce 2, byly kotransformovány do pšenice za použití postupů uvedených v předchozích částech. Transformanty byly vybrány na základě rezistence na geneticin. Primární transformanty byly shledány jako pozitivní na základě analýzy Southern blot. Bloty následně reagovaly se sondou s kódující sekvencí Nptll a sondou kódující oblast SBE. Obr. 37 ukazuje příklad Southern blot, který zahrnuje 22 domnělých transformantů, které byly ko-bombardovány pSR97-29A- nebo pSR97-26A- a pUN1 nebo p97-2BdUN1. Genomová DNA na tomto blotu byla štěpena pomocí Sací. Blot nejprve reagoval se sondou Nptll. Linie označené hvězdičkou odpovídají transformantům, které dávají pozitivní signál se sondou Nptll. Blot uvedený na obr. 37 reagoval se sondou Sací fragmentu SBEII-1. Jako výsledek štěpení Sad se očekává hybridizující proužek SBEII-1 o velikosti 1 kb z plazmidových sekvencí pSR97-29A- i pSR9726A- a intenzita tohoto proužku se liší v závislosti na počtu kopií včleněných plazmidových sekvencí. Jak je zřejmé z obr. 37, objevuje se i několik dalších hybridizujících proužků SBEII-1. Pět z těchto proužků je přítomno ve všech liniích a vedou od hybridizačních po endogenní SBEII-1 sekvence pšenice. Další proužky různých velikostí, které jsou zřejmé u ·· ·« ► · ♦ • · ··· » · · « » · · « ·· ·· většiny linií, dávající hybridizační proužek o velikosti 1 kb, jsou většinou výsledkem integrace, kdy se jedná o více kopií plazmidu linearizovaného v rámci sekvence SBEII-1 o velikosti 1 kb před integrací. V příkladu uvedeném na obr. 37 u 20 Nptll pozitivních rostlin bylo 16 ko-transformovaných sekvencemi SBEII-1, představující 80% účinnost kotransformace.

Diferenciační skenovací kalorimetrie (DSC)

Po zahřátí vodná suspenze škrobu v přebytku vody podlehne kooperativní endotermický přechod, známý jako želatinace, jak se uvádí výše, vedoucí k tání krystalů škrobu. Diferenciální skenovací kolorimetrie (DSC) měří množství energie (tepla), absorbovaného nebo uvolněného vzorkem pň zahřátí, zchlazení nebo udržování při konstantní (izotermické) teplotě. DSC byla široce využita pro studium želatinace a retrogradace škrobu.

Analýzy DSC se prováděly na jednotlivých zrnech nebo pěti zrnech z primárních transformantů vytvořených transformací za použití každé kombinace genového konstruktu (konstruktů) podrobně uvedené v tabulce 2.

Použily se dva různé postupy a metody DSC:

Metoda 1:

Jednotlivé vzorky semen se rozdrtily a rozmělnily pomocí hmoždíře. Zbylé otruby se pak oddělily a vzorky se umístily do 50 pm hliníkových DSC misek. Přidalo se na hmotnost trojnásobné množství vody a misky se vzorky se uzavřely. Analýza se prováděla za použití systému Perkin-Elmer DSC-7 Robotíc™ opatřeném chladičem II™ pro nadstandartní podmínky. Vzorky se zahřívaly od 25 °C do 80 °C při rychlosti zahřívání 5 °C min'¹. Sledovala se entalpie želatinace, zvyšování a nejvyšší dosažené teploty. Termogramy se analyzovaly za použití programů softwaru Perkin-Elmer (Thermal Analysis Software 7). Enthalpie želatinace je vyjádřena v Joulech (J)/gram (g) na vzorek.

Metoda 2

Pět semen jednotlivých primárních transformantů nebo jednoho semeno primárního transformantů se pomlelo za použití mlýnu Cemotec 1090™ Sample Milí. Pomletý vzorek se pak přesil přes síto o velikosti otvorů 250 pm pro oddělení otrub od endospermu. Přibližně 5 mg přesátých vzorků se pak přesně navážilo do 50 μΙ hliníkové DSC mísy. Přidalo se na ·< ·« ·· • · · « · · • · · · · · · • · · · « · ·♦ ·· ·· hmotnost trojnásobné množství vody a mísa se vzorkem se uzavřela. Analýzy se prováděly za použití systému Perkin-Elmer Pyris 1™ DSC opatřeného automatickým dávkovačem vzorků a chladičem IP. Vzorky se zahřívaly od 40 °C do 85 °C při rychlosti zahřívání 10 °C min¹.

Termogramy se analyzovaly za použití softwaru Perkin-Elmer (Pyris Software for Windows v 3.5). Sledovala še enthalpie želatinace, zvýšení teploty, nejvyšší a nejnižší teplota.

Metoda 1 a další série analýz DSC se prováděly na 5 zrnech od primárních transformantů, transformovaných plazmidovou kombinací pSR97-26A-/pUN1, pSR97-26A/p97-2BdllN1 a pSR97-29A-/p97-2BdUN1. Získané výsledky se srovnaly s výsledky získanými z kontrolního materiálu, který se transformoval jedním z Nptll výběrových markerových plazmidů, neobsahujících však žádný „škrobový“ plazmid. Tabulka 3 shrnuje nástup teploty, nejvyšší hodnotu a konečnou hodnotu entalpie u vybraných zásobních vzorků. Většina vzorků vykazovala podobné hodnoty jako kontrolní materiál. Z tabulky 3 je však zřejmé, že nástup teploty, nejvyšší hodnoty a konečné teploty byly vyšší u mnoha trangenních vzorků ve srovnání s kontrolním materiálem. Například, transformant BW326 vykazuje nástup teploty, nejvyšší a konečnou hodnotu teploty 6,7 °C, 4,9 °C a 4,6 °C ve srovnání s kontrolním vzorkem.

Metoda 2 a další série analýz DSC se prováděly na pěti zrnech od primárních transformantů, transformovaných plazmidovou kombinací pSC98-1A-/p97-2BdUN1, pUSN1/p97-2BdUN1, pUSN-2/p97-2BdUN1 a pUSN-1/pUSN-2/pUNI. Získané výsledky se srovnaly s výsledky získanými z kontrolního materiálu, který se transformoval jedním z Nptll výběrových markerových plazmidů, neobsahujících však žádný „škrobový“ plazmid. Tabulka 4 shrnuje nástup teploty, nejvyšší hodnotu, a konečnou hodnotu entalpie u vybraných zásobních vzorků. V mnoha případech je zřejmé, že „škrobový“ transgenní materiál vykazuje nástup teploty, nejvyšší hodnotu a konečnou hodnotu vyšší než u kontrolního materiálu. Například, transformant BW727 vykazuje nástup teploty, nejvyšší a konečnou hodnotu teploty 9,8 °C, 8,7 °C a 9,1 °C ve srovnání s BW kontrolním vzorkem 3 a nástup teploty, nejvyšší a konečnou hodnotu teploty 7,6 °C, 6,8 °C a 7,8 °C ve srovnání s BW kontrolním vzorkem 2.

» · * • · · · · · · • ·· · · ·« ···

Tabulka 3: Výsledky DSC analýz na jednotlivých zm za použití metody 1. Uvedené hodnoty jsou průměrem 2 až 6 jednotlivých vzorků zrn (T_o, T_p a T_f je nástup teploty, nejvyšší a konečná hodnota teploty).

kombinace plazmidu	Linie Kód	TO(°C)	Tp(°C)	Tf(°C)	H(J/g)
BW kontrolní vzorek 1		55,2	59,7	66,5	4,66
pSR97-26A-/pUNl	BW283	57,1	60,4	65,0	2,12
	BW135	57,2	62,1	68,6	4,86
	BW324	57,8	62,1	69,1	5,33
	BW325	58,4	61,8	68,7	3,90
	BW326	61,9	64,6	71,1	2,46
	BW348	60,7	63,4	69,7	3,76
pSR97-26A-/p97-2BdUNl	F227	57,4	61,4	67,3	2,65
pSR97-29A-/p97-2BdUNl	F310	62,1	63,7	69,2	6,75
	F312	59,0	62,3	66,8	1,16
	BW335	56,2	60,8	69,1	4,63
	BW353	59,5	62,7	70,8	3,21
	BW354	55,4	61,7	68,9	4,28
	BW355	57,9	61,5	68,0	3,95
	BW357	55,3	60,6	68,0	3,74
	BW363	56,7	62,5	67,9	1,13
	BW367	59,0	62,5	68,2	2,17
	BW369	57,9	60,9	65,9	1,04
	BW370	53,7	59,4	67,5	6,00
	BW375	57,2	61,5	70,0	4,14
	BW376	54,0	58,1	68,0	3,39
	BW377	53,4	60,9	69,2	2,60
	BW380	54,6	61,6	67,6	2,16
	BW390	56,8	61,2	68,5	1,29
	BW399	57,4	62,7	67,9	1,77
	BW400	60,6	63,6	68,1	0,64
	BW341	51,6	59,0	66,4	1,97

• 4 ·· ·· • «· • · · · · · ·« ·· ··

Tabulka 4: Výsledky analýz 5 zrn za použití metody 2. T_o, T_p a T_f je nástup teploty, nejvyšší a konečná hodnota teploty.

kombinace plazmidu	Linie Kód	TO(°C)	Tp(°C)	Tf(°C)	H(J/g)
F kontrolní vzorek 1		60,1	63,9	68,0	6,30
BW kontrolní vzorek 2		59,3	64,0	68,4	5,94
BW kontrolní vzorek 3		57,08	62,09	67,08	4,28
pSC98-lA-/p97-2BdUNl	BW449	59,3	62,9	67,9	3,95
	BW477	57,7	63,6	70,6	8,30
	F492	62,3	66,4	70,2	7,60
	F494	63,6	67,3	71,0	5,73
	BW511	59,6	63,8	67,2	0,98
	BW518	60,2	64,9	69,2	3,57
	BW519	58,4	63,6	68,5	4,13
	BW527	58,7	63,7	69,0	6,38
	BW549	59,9	64,8	69,3	4,48
	BW550	60,2	64,6	68,9	5,06
	BW552	60,8	62,9	67,9	3,74
	BW553	59,5	63,9	67,5	3,60
	BW555	61,0	66,1	68,2	5,43
	BW557	62,7	66,9	71,0	5,08
	BW559	61,6	65,9	70,8	5,08
	BW563	61,4	65,1	69,4	1,90
	BW564	59,4	64,5	73,2	7,08
	BW576	61,8	65,6	69,3	2,65
	BW587	61,3	65,4	69,4	5,36
	BW614	63,9	67,9	71,8	5,83
	BW618	61,3	65,6	69,7	3,54
	BW583a	58,9	63,7	68,0	3,54
	BW631	61,5	65,6	69,7	4,52
	BW633	61,9	66,0	70,2	5,12

	4	**	»·	44
	··	• ·	4	*	«	44
	•	4	•	444	4	4
	•	4	4	4 4	4	4
• 4	···	4*	44	44	4 4

	BW634a	60,8	64,9	70,2	5,10
	BW637a	62,8	67,2	72,0	5,16
	BW639	61,8	65,1	68,9	2,15
	BW640a	62,2	66,7	71,0	3,23
	BW642	63,2	67,2	70,9	4,90
	BW698	62,9	67,0	70,9	4,48
	BW700a	63,8	67,6	71,2	3,41
	BE524a	59,4	64,3	68,9	4,05
pUSN-l/p97-2BdUNl	BW622	59,0	64,1	68,7	4,32
	BW628	56,2	63,3	66,0	6,09
	BW645	57,5	65,6	69,5	5,97
	BW646	61,6	66,4	67,7	3,99
	BW647	61,3	65,4	69,0	3,47
	BW648	59,8	64,4	68,8	4,65
	BW649	61,3	65,6	70,1	5,07
	BW656	59,9	64,6	69,2	5,38
	BW660	62,0	67,3	71,0	4,23
	BW661	61,5	65,8	69,6	3,88
	BW664	61,1	66,1	70,8	4,81
	BW665	61,6	66,5	69,4	5,25
	BW667	63,0	67,1	70,8	3,91
	BW672	63,0	68,1	71,9	5,43
	BW673A	63,1	67,7	71,6	4,83
	BW675	62,1	66,4	71,3	10,97
	BW676	59,8	67,3	71,2	4,21
	BW678	63,0	66,3	69,3	1,20
	BW680	60,8	65,3	70,1	4,94
	BW701	62,3	67,5	72,2	4,70
	BW706	63,0	67,3	71,3	4,94
	BW707	60,9	65,8	70,0	4,77
	BW708	61,7	65,5	68,8	6,11
	BW726	62,6	67,5	71,3	5,44

	BW755	60,8	65,8	70,6	5,18
	BW702	61,9	67,0	71,0	4,44
	BW756	62,3	66,1	69,7	4,83
pUSN-2/p97-2BdUNl	BW625	62,7	68,2	73,8	4,27
	BW653	60,4	65,3	70,1	6,52
	BW704	60,9	66,2	70,2	4,19
	BW718	61,3	66,9	71,2	4,15
	BW719	62,2	67,2	71,7	5,32
	BW722	64,8	67,5	70,0	2,14
	BW740	63,4	67,9	72,3	5,67
	BW741	62,6	66,9	70,5	5,30
	BW742	64,6	67,9	72,0	6,66
	BW752	62,3	66,3	70,0	4,63
pUSN-l/pUSN-2/pUNl	BW685	62,6	65,5	69,0	2,60
	BW686A	61,9	66,3	70,2	4,45
	BW714	63,0	67,6	71,3	3,53
	BW727	66,9	70,8	76,2	5,19
	BW728	62,0	66,3	70,4	5,70
	BW731	63,3	67,9	73,0	4,90
	BW732	63,5	66,8	70,8	4,11
	BW748	62,1	67,4	71,9	5,38
	BW794	62,8	67,5	71,8	5,17

Příloha 1

Návod pro 2x koncentrované médium MM1

Složka	Objem 2x koncentrovaného zásobního média na 1 litr
Makrosoli MS (10X zásobní roztok)	200 ml
Mikrosoli L (1000x zásobní roztok)	2 ml
FeNaEDTA MS (100x zásobní roztok) [Sigma katalog F-0518]	20 ml
Modifikované Vits MS (x1000)	1 ml
roztok 3 aminokyselin (25x zásobní roztok)	40 ml
myo inositol	0,2 g
(Sigma katalogové číslo 1-3011)
sacharóza	180 g
AgNO3 (20mg/ml zásobní roztok)	1 ml
přidaný po filtrační sterilizaci
Pikloram (1m/ml zásobní roztok)	4 ml
přidaný po filtrační sterilizaci

Následovala filtrační sterilizace a přídavek ekvivalentního objemu 2x agarózového gelu (10g/l)

• · · · • · • · · · • · • · ·· ··

Návod pro 2x koncentrované R médium

Složka	Objem 2x koncentrovaného zásobního média na 1 litr
Makrosoli L7 (10X zásobní roztok)	200 ml
Mikrosoli L (1000x zásobní roztok)	2 ml
FeNaEDTA MS (100x zásobní roztok)	20 ml
Vits/lnositol L2 (200x zásobní roztok)	10 ml
Roztok 3 aminokyselin (25x zásobní roztok)	40 ml
Maltóza	60 g
2,4-D (zásobní roztok 1mg/ml) přidaný po filtrační sterilizaci	200 μΙ
Smíchané cis a trans izomery Zeatin (Melford laboratoře, katalogové číslo Z-0917) (zásobní roztok 5mg/ml) přidaný po filtrační sterilizaci	2 ml

Následovala filtrační sterilizace a přídavek ekvivalentního objemu 2x koncentrovaného agaru (16g/1 litr).

Příloha 2

Návod pro použití složek pro přípravu média MM1 a R média

Mikrosoly L (1000x zásobní roztok)

	na 100 ml
MnSO4.7H2O	1,34 g
H3BO3	0,5 g
ZnSO4.7 H2O	0,75 g
Kl	75 mg
Na2Mo04.2H2O	25 mg
CuSO4.5H2O	2,5 mg
CoCI2.6H2O	2,5 mg

Následovala filtrační sterilizace přes membránový filtr o velikosti otvorů 22 gm. Skladování při 4 °C.

Makrosoly MS (10x zásobní roztok)

	na 1 litr
NH4NO3	16,5 g
KNO3	19,0 g
KH2PO4	17 g
MgSO4. 7H2O	3,7 g
CaCI2.2H2O	4,4 g

NB: Rozpustit CaCI₂ před smícháním s jinými složkami

NB: Připravit KH₂PO₄ samostatně ve sterilizované H₂O a přidat zbytek. Roztok skladovat po autoklávování při 4 °C.

Modifikované MS Vits (1000x zásobní roztok)

	na 100 ml
Thiamin HCI	100 mg
Pyridoxin HCI	50 mg
Kyselina nikotinová	50 mg

Roztok skladovat v 10 ml alikvotech při -20 °C.

Roztok 3 aminokyselin (25x zásobní roztok)

	na 1 litr
L-glutamin	18,75 g
L-prolin	3,75 g
L-asparagin	2,5 g

Roztok skladovat ve 40 ml alikvotech při -20 °C.

• · · ·· ·· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··

Makrosoly L7 (10x zásobní roztok)

	na 1 litr
nh4no3	2,5 g
kno3	15,0 g
kh2po4	2,0 g
MgSO4.7H2O	3,5 g
CaCI2.2H2O	4,5 g

NB: Rozpustit CaCI₂ před smícháním s jinými složkami

NB: Připravit KH₂PO₄ samostatně v 50 ml H₂Oa přidat zbytek. Roztok skladovat po autoklávování při 4 °C.

Vits/lnositol (200x zásobní roztok)

200x zásobní roztok	na 100 ml
Inositol	4,0 g
Thiamin HCI	0,2 g
Pyridoxin HCI	0,02 g
Kyselina nikotinová	0,02 g
Ca - panthothenát	0,02 g
Kyselina askorbová	0,02 g

Roztok skladovat ve 40 ml alikvotech při -20 °C.

Odkazy

Atwell, W.A., Hood, L.F., Lineback, D.R., Varriano-Marston, E., and Zobel, H.F. (1988). The terminology and methodology associated with basic starch penomena. Cereal Foods World 33, 306-311.

Baba, T., Kimura, K., Mizuno, K., Etoh, H., Ishida, Y., Shida, O., and Arai, Y. (1991). Sequence conservation of the catalytic regions of amylolytic enzymes in maize branching enzyme-l. Biochem. Biophys. Res. Comm. 181(1): 87-94.

Barcelo P., and Lazzeri, P. (1995). Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues. Methods in Molecular Biology - Plant Gene Transfer and Expression Protocols (vol 49), 113-123. Jones H [ed] Humana Press lne., Totowa, NJ.

Block, M.de etal. (1987). EMBO J 6:2513-2518

Boyer, C.D. and Priess, J. (1978). Multiple forms of (1-4)- -D-Glucan, (1-4)- -D-Glucan 6glycosyl transferase from developing Zea mays L. kernals. Carbohydrate Res 61:321-334.

Burton, R.A., Bewley, J.D., Smith, A.M., Bhattacharyya, M.K., Tatge, H., Ring, S., Bull, V., Hamilton, W.D.O., and Martin, C. (1995). Starch branching enzymes belonging to distinct enzyme families are differentially expressed during pea embryo development. Plant J 7:113

Christensen, A.H., and Quail, P.H. (1996). Transgenic research, 5:213-218.

Donovan, J.W. (1979). Phase transitions of the stareh-water systém. Biopolym. 18, 263275.

Fisher, D.K., Boyer, C.D., and Hannah, L.C. (1993). Starch branching enzyme II from maize endosperm. Plant Physiol. 102:1045-1046.

Fisher, D.K., Gao, M., Kim, K-N., Boyer, C.D., and Guiltinan, M.J. (1996). Two dosely related cDNAs eneoding starch branching enzyme from Arabidopis thaliana. Plant Mol. Biol. 30:97-108

·· · · * · · φ φ φ·· • φ · ·

Fromm ΜΕ, Taylor LP & Walbot V. (1986). Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nátuře 319: 791-793,

Fulton, T.M., Chunwongse, J., and Tanksley, S.D. (1995). Miniprep Protocol for Extraction of DNA from Tomato and other Herbaceous Plants, Planí Molecular Biology Reportér, 13 (3), pages 225-227.

Gao, M., Fisher, D.K., Kim, K-N., Shannon, J.C., and Guiltinan, M.J. (1997). Independent genetic control of maize starch-branching enzymes Ha and lib: Isolation and characterisation of a Sbe2a cDNA. Plant Physiol. 114: 69-78.

Gaun, H.P., and Preiss, J. (1993). Differentiation of the properties of the branching isoenzymes from maize (Zea mays). Plant Physiol. 102:1269-1273.

Goldsbrough AP, Belzile F, Yoder JI (1994). Complementation of the tomato anthocyanin without (aw) mutant using the dihydroflavonol 4-reductase gene. Plant Physiology 105, 491-496.

Islám, A.K.M.R. (1983). Ditelosomic additions of barley chromosomes to wheat. In Proč. 6th Int. Wheat Genet. Symp. 233-238. Kyoto, Japan.

Jack, P.L., Dimitrijevic, T.A.F., and Mayes S. (1994) Assessment of nuclear, mitochondrial and chloroplast RFLP markers in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) Theor. Appl. Genet. 90:643-649.

Jefferson RA (1987). Assaying chimaeric genes in plants: The GUS gene fusion systém. Plant Molecular Biology Reportér 5 (4) 387-405.

Kennedy, J.F. and Cabalda, V.M.B. (1991). Bioactive carbohydrates in food. Chemistry in Britain, November, 1017-1019, 1026.

Khoshnoodi, J., Ek, B., Rask, L., and Larsson, H. (1993). Characterisation of the 97 and 103kDa forms of starch branching enzyme from potato tubers. FEBS 332 (1,2):132-138.

Kossmann, J., Visser, R.G.F., Muller-Rober, B., Willmitzer, L., and Sonnewald, U. (1991). Cloning and expression anaylsis of a potato cDNA that encodes branching enzyme: evidence for co-expression of starch biosynthetic genes. Mol. Gren. Genet 230: 39-44.

·· ·· · ·. . .

• · · ♦ ·♦· · · · • ·····»..» , * · *······ ··· ....... ·· ...

Liu et al (1995). Biochem Cell Biol 73: 19-30.

Martin, C., and Smith, A.M. (1995). Starch biosynthesis. PlantCell 7:971-985.

Matzke & Matzke (1995). Plant Physiol. 107, 679-685.

Mizuno, K., Kawasaki, T., Shimada, H., Satoh, H., Kobayashi, E., Okumura, S., Arai, Y., and Baba, T. (1993). Alteration of the structural properties of starch components by the lack of an isoform of starch branching enzyme in rice seeds. J.Biol. Chem. 268(25): 19084-19091.

Morell, M.K., Rahman, S., Abrahams, S.L., and Appels, R. (1995). The biochemistry and molecular biology of starch synthesis in cereals. Auist.J. Plant Physiol. 22: 647-660.

Morell, M., Blennow, A., Kosar-Hashemi, B., and Samuel, M.S. (1997). Differential expression and properties of starch branching enzyme isoforms in developing wheat endosperm. Plant Physiol. 113:201-208.

Mousley, C.G. (1994). PhD Thesis, Wye College, University of London.

Nair, R.B., Baga, M., Scoles, G.J., Kartha, K.K., and Chibbar, R.N. (1997). Isolation, characterisation and expression analysis of a starch branching enzyme II cDNA from wheat. Plant Sci. 122:153-163.

Nakamura, Y., Takeichi, T., Kawaguchi, K., and Yamanouchi, H. (1992). Purification of two forms of starch branching enzyme (Q-enzyme) from developing rice endosperm. Physiol. Plant 84: 329-335.

Nakamura, Y., and Yamanouchi, H. (1992). Nucleotide sequence of a cDNA encoding starch-branching enzyme, or Q-enzyme I, from rice endosperm. Plant Physiol. 99:12651266.

Preiss, J. (1991). Biology and molecular biology of starch synthesis and regulation. In Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 7:59-114.

Rahman, S., Abrahams, S., Abbott, D., Mukai, Y., Samuel, M., Morrell, M., and Appels, R. (1997). A complex arrangement of genes at a starch branching enzyme I locus in the Dgenome donor of wheat. Genome 40:465-474.

• · • ··· • · 4 • · 4

Rapellin, A et al 1997. Isolation of a starch branching enzyme I cDNA from a wheat endosperm library. EMBL database accession Y12320.

Russell, D.A. and Fromm, M.E. (1977). Tissue-specifíc expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Research 6: 157-168.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.

Salehuzzaman, S.N.I.M., Jacobsen, E., and Visser, R.G.F. (1992). Cloning, partial sequencing and expression of a cDNA coding for branching enzyme in cassava. Plant Mol. Biol. 20:809-819.

Sears, E.R. (1966). In Chromosome manipulations and plant genetics Edited by R. Riley and K.R. Lavis, Oliverand Boyd, Edinburgh. pp29-45.

Sheehy eř a/ (1988) PNAS 85, 9905-8809.

Smith, A.M. (1988). Major differences in isoforms of starch-branching enzyme between developing embryos of round- and wrinkled-seeded peas (Pisum sativum L.). Planta 175:270-279.

Shure, M etal1983. Cell 35: 225-233.

Sun, C., Sathish, P., Deiber, A., and Jansson, C. (1995). Multiple starch branching enzymes in barley endosperm. In Photosynthesis from light to biosphere. P. Mathis (ed.) Vol. V:317-320.

Sun, C., Sathish, P., Ahlandsberg, S., and Jansson, C. (1998). The two genes encoding starch-branching enzymes Ha and lib are differentially expressed in Barley. Plant Physiol. 118:37-49 (earliest electronic publication dáte 10th September 1998).

Svegmark, K. and Hermansson, A-M. (1990). Shear induced changes in the viscoelastic behaviour of heattreated potato starch dispersions. Carboyd. Polym. 13, 29-45.

Takeda, Y., Gaun, H.P., and Preiss, J. (1993). Branching of amylose by the branching isoenzymes of maize endosperm. Carbohydrate Res. 240:252-263.

Van der Krol et al, Mol Gen. Genet. 220, 204-212.

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Nukleotidová sekvence kódující v podstatě aminokyselinovou sekvenci na obr. 10 (SEQ ID č.: 2) nebo funkční ekvivalent nukleotidové sekvence.
2. 2. Nukleotidová sekvence obsahující v podstatě sekvenci B2 na obr. 3 (SEQ Id č.: 3) nebo její funkční ekvivalent
3. 3. Nukleotidová sekvence obsahující v podstatě sekvenci B4 na obr. 3 (SEQ ID č.: 4) nebo její funkční ekvivalent.
4. 4. Nukleotidová sekvence obsahující v podstatě sekvenci B10 na obr. 3 (SEQ ID č.: 5) nebo její funkční ekvivalent.
5. 5. Nukleotidová sekvence obsahující v podstatě sekvenci B1 na obr. 3 (SEQ ID č.: 6) nebo její funkční ekvivalent.
6. 6. Nukleotidová sekvence obsahující v podstatě sekvenci B6 na obr. 4 (SEQ ID No: 7) nebo její funkční ekvivalent.
7. 7. Část nukleotidové sekvence podle kteréhokoli nároku 1 až 6, obsahující alespoň 500 párů bází a s alespoň 90% sekvenční homologii s odpovídající části sekvence, od které je odvozena.
8. 8. Nukleotidová sekvence obsahující v podstatě sekvenci na obr. 5 (SEQ ID č.: 8), obr. 6 (SEQ ID č.: 9) nebo obr. 7 (SEQ ID č.: 10) nebo její funkční ekvivalent.
9. 9. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.
10. 10. Konstrukt podle nároku 9, kde sekvence jsou funkčně spojeny v kódující nebo antimediátorové orientaci k promotorové sekvenci.
11. 11. Expresní vektor obsahující konstrukt podle nároku 9 nebo 10.

    *« · fc • Φ·Φ • φ

    4 « • · • · • · · ·« ··
12. 12. Hostitelská buňka, do které byla zavedena sekvence, konstrukt nebo vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 11.
13. 13. Aminokyselinová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.
14. 14. Způsob změny vlastností rostliny, vyznačující se tím, že se do rostliny zavede nukleotidová sekvence podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, přičemž je funkčně spojena s vhodným promotorem aktivním v rostlině za účelem ovlivnění exprese genu přítomného v rostlině.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že je sekvence připojena v antimediátorové orientaci k promotoru.
16. 16. Způsob podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že rostlinou je pšenice.
17. 17. Způsob podle nároku 14, 15 nebo 16, vyznačující se tím, že se změněná charakteristika týká obsahu škrobu a/nebo složení škrobu v rostlině.
18. 18. Rostlina nebo rostlinná buňka, s charakteristikou změněnou způsobem podle kteréhokoli z nároků 14 až 17 nebo jejích mladých rostlin nebo částí této rostliny.
19. 19. Rostlina nebo její buňka, mladá rostlina nebo její část podle nároku 18, kde rostlinou je pšenice.
20. 20. Zásobní část rostliny podle nároku 18 nebo 19.
21. 21. Rostlina nebo její buňka, mladá rostlina nebo její část podle nároků 18 až 20, obsahující škrob se zvýšenou želatinaci a/nebo maximem teploty podle měření pomocí DCS ve srovnání se škrobem podobné, ale nezměněné rostliny.
22. 22. Škrob získatelný nebo získaný z rostliny podle kteréhokolii z nároků 18 až 21.

    * · · · · « · • · · · Μ· * ······ • · · * · · ··· ««« ««

    4 4
23. 23. Způsob tvorby změněného škrobu, zahrnující změněnou rostlinu způsobem podle kteréhokoli z nároků 14 až 17 a izolaci škrobu se změněnými vlastnostmi ve srovnání se škrobem vyizolovaným z podobné, ale nezměněné rostliny.
24. 24. Použití škrobu podle nároku 22 v přípravě potravin, zejména pečivá.
25. 25. Potraviny, zejména pečivo, obsahující škrob podle nárokem 22.