CZ20021342A3 - Receptorový komplex, buněčný povrchový receptorový komplex a jejich pouľití - Google Patents
Receptorový komplex, buněčný povrchový receptorový komplex a jejich pouľití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021342A3 CZ20021342A3 CZ20021342A CZ20021342A CZ20021342A3 CZ 20021342 A3 CZ20021342 A3 CZ 20021342A3 CZ 20021342 A CZ20021342 A CZ 20021342A CZ 20021342 A CZ20021342 A CZ 20021342A CZ 20021342 A3 CZ20021342 A3 CZ 20021342A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- protein
- pro
- inflammatory
- receptor
- Prior art date
Links
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 182
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims abstract description 119
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 72
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 80
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 72
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 37
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 37
- 102100021145 fMet-Leu-Phe receptor Human genes 0.000 claims description 36
- 101710108492 fMet-Leu-Phe receptor Proteins 0.000 claims description 36
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 32
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 32
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 32
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 31
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 25
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 23
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 claims description 20
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 19
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 12
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 claims description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 11
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 claims description 11
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 10
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 10
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010076288 Formyl peptide receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 102000011652 Formyl peptide receptors Human genes 0.000 claims description 9
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 9
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N leukotriene B4 Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC(O)=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 9
- PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin Chemical group CSCCC(NC=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PJENNOWAVBNNNE-CQJMVLFOSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-formamido-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical group C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 PJENNOWAVBNNNE-CQJMVLFOSA-N 0.000 claims description 7
- 108700042498 N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 239000002820 chemotaxin Substances 0.000 claims description 6
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims 3
- 108700027649 Mitogen-Activated Protein Kinase 3 Proteins 0.000 claims 2
- 102100024192 Mitogen-activated protein kinase 3 Human genes 0.000 claims 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 101000818522 Homo sapiens fMet-Leu-Phe receptor Proteins 0.000 claims 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 abstract description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008211 N-Formylmethionine Leucyl-Phenylalanine Proteins 0.000 description 46
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 16
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 16
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 15
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 15
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 14
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 11
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 11
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 11
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000941598 Homo sapiens Complement C5 Proteins 0.000 description 9
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 7
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 7
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 7
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 6
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 6
- 102100021126 N-formyl peptide receptor 2 Human genes 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 101000818546 Homo sapiens N-formyl peptide receptor 2 Proteins 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 description 5
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 5
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 101001059802 Homo sapiens N-formyl peptide receptor 3 Proteins 0.000 description 4
- -1 N-formylmethionyl Chemical group 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 4
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102100028130 N-formyl peptide receptor 3 Human genes 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 3
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000007606 GTP-Binding Protein gamma Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010007166 GTP-Binding Protein gamma Subunits Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003680 Leukotriene B4 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000093 Leukotriene B4 receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HOPVQBLVLLHWOU-BLVAWXTGSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 HOPVQBLVLLHWOU-BLVAWXTGSA-N 0.000 description 1
- JLTSZENYPMLEDA-HERDVTPGSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-formamido-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)CC)NC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JLTSZENYPMLEDA-HERDVTPGSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 125000000134 2-(methylsulfanyl)ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])SC([H])([H])C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIWODJBCHRADND-UHFFFAOYSA-N 3-anilino-4-[1-[3-(1-imidazolyl)propyl]-3-indolyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C=2C3=CC=CC=C3N(CCCN3C=NC=C3)C=2)=C1NC1=CC=CC=C1 KIWODJBCHRADND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005590 Anaphylatoxin C5a Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010059426 Anaphylatoxin C5a Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100152731 Arabidopsis thaliana TH2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150025690 CA5A gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 102100034013 Gamma-glutamyl phosphate reductase Human genes 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108091006065 Gs proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 101000934996 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010030110 N-formylnorleucyl-leucyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102100024923 Protein kinase C beta type Human genes 0.000 description 1
- 101710094033 Protein kinase C beta type Proteins 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 102100025387 Tyrosine-protein kinase JAK3 Human genes 0.000 description 1
- ZVEZWGWIQAWXLU-MCDZGGTQSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZVEZWGWIQAWXLU-MCDZGGTQSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- JPYQFYIEOUVJDU-UHFFFAOYSA-N beclamide Chemical compound ClCCC(=O)NCC1=CC=CC=C1 JPYQFYIEOUVJDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010019251 cyclosporin H Proteins 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003975 dentin desensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000025 natural resin Substances 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005455 negative regulation of mast cell degranulation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/05—Dipeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/07—Tetrapeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
OBLAST TECHNIKY
Tento vynález se týká receptorů N-formylpeptidů, které se nacházejí na povrchu buněk z periferní krve, a zejména komplexů takových receptorů s činidly, které pozměňují nebo přerušují G-proteinovou signální dráhu, zejména určitých N-formylpeptidů, a způsobů pro pozměnění signálního přenosu díky kostimulace prozánětlivými činidly.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Lidské tělo vyvinulo obranné mechanismy proti bakteriálním infekcím za použití bakteriálně připravených N-formylmethionylpeptidů jako chemoatraktantů pro fagocytózu, zejména neutrofílů a monocytů. Z N-formylpeptidů byl f-Met-Leu-Phe (FMLP) určen jako nejsilnější ve schopnosti posílit fagocytózu a stimulovat uvolnění lysozomálních enzymů neurofily (Showell et al., J. Exp. Med. 143: 1154-1169, 1976). Následně bylo ukázáno, že syntetické tetrapeptidy, zejména f-Met-IIe-Phe-Leu a f-Met-Leu-Phe-Ile, vyvolávají neutrofílní odpověď (Rot et al., Proč. Nati. Acad. Scie. USA 84: 7967-7971, 1987). Účinnost těchto peptidů byla nejprve připisována: (1) formylové skupině na N-konci, (2) methioninovému bočnímu řetězci a (3) leucinovému a fenylalaninovému bočnímu řetězci.
Klonování N-formylpeptidového receptorů (FRP) cDNA, následované zobrazením primární struktury FPR proteinu, poskytlo hlavní průlom v porozumění mechanismu působení N-formylpeptidů (Boulay et al., Biochemistry 29: 11123-11 133, 1990; Boulay et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1 103-1 109, 1990). FPR byl nejprve nalezen na neutrofilech a monocytech, ale následně bylo ukázáno, že je exprimován v lidském mozku, hepatocytech, dendritických buňkách a astrocytech (Lacy et al., J. Neuroimmunol. 61: 71-78, 1995; Sozzani et al., J. Immunol. 155: 3292-3295, 1995). Později byly izolovány dva jiné FPR geny, FPR2 (také známý jako FPRL1 a FPRH1) (Bao et al., Genomics 13: 437-440, 1992; Murphy et al., J. Biol. Chem. 267: 7637-7643, 1992; Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184: 582-589, 1992) a FPRL2 (Bao et al., supra). FPRLl se skládá z 351 aminokyselin a vykazuje 70% shodnost s FPR, ale bylo zjištěno, že má 400 krát nižší afinitu k FMLP (Kd= 1 nM) než původní FPR. FPRL2 vykazuje 56% shodnost s FPR a 83% shodnost s FPRL1. Nicméně na rozdíl od FPRL1, který je exprimován v monocytech i neutrofilech, byla exprese FPRL2 nalezena v monocytech, ale ne v neutrofilech (Durstin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 174-179, 1994).
FPR obsahuje sedm hydrofóbních domén, rozprostírajících se v plasmové membráně, spojených hydrofilními sekvencemi, vystavených buď v extracelulárním prostoru nebo v intracelulárním prostoru (Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12: 593-633, 1994). První a třetí intracelulární smyčky jsou relativně malé, skládající se z 5 a 16 aminokyselin. Karboxylový konec je vystaven do intracelulárního prostoru, zatímco N-konec je vystaven do extracelulárního prostoru. Intracelulární sekvence dále obsahují G-protein vazebnou doménu (doménu nezbytnou pro funkci receptoru, jak je diskutováno níže) a potenciální fosforylační doménu.
Ukazuje se, že FMLP vazebná doména je umístěna na první a třetí extracelulární doméně FPR (Quehenberger et al., J. Biol. Chem. 268: 18167-18175, 1993). Navíc jsou náznaky vzájemně převeditelných stavů FPR, střídající se mezi vysokoafinitním vazebným a nízkoafinitním vazebným stavem pro FMLP vázání (Kermode et al., Biochem. J. 276: 715-723, 1991). G-protein je považován za regulující takové vzájemně převeditelné stavy. FPR samotný, bez asociace s G-proteinem, představuje nízkoafinitní stav, zatímco FPR vázaný na G-protein vykazuje vysokoafinitní vazebný stav. Model dále rozděluje G-protein navázaný na FPR do tří různých stavů, které vysvětlují různé účinky, pozorované s různými peptidy. Stav I představuje nízkoafintní vazebný stav, ve kterém FPR není asociováno s G-proteinem, ale může být převedeno na vysokoafinitní stav stavu II při navázání na G-protein. Stav III je vysokoafinitní přechodný krok, ve kterém receptor váže ligand, zatímco odblokovává Ga podjednotku G-proteinu. Stav IV je přechodný, nízkoafinitní stav, ve kterém zbývající G-proteinové podjednotky (Gp a GY) disociují z receptoru. Disociace G-proteinové jednotky Ga vede k účinější funkci G-proteinu, způsobující buněčnou aktivaci. Podobný model byl navržen Sklářem et al. (J. Biol. Chem. 264: 8483-8486, 1989).
Podle výše uvedeného modelu je účinnost peptidu určena dobou pobytu ve stavu III (Kermode et al., viz. výše). Autoři navrhují, že nejvíce účinné peptidy, jako jsou fMet-Leu-Phe a fMet-Leu-Phe-NHBzl dočasně stabilizují a podporují stav III, který spouští okamžitou degranulační odpověď, ale trvání stavu III poskytuje trvalý signál pro chemotaktické odpovědi, dovolujících maximální migraci. Nižší síla formylovaných peptidů zprostředkovává rychlou přeměnu z vysokoafinitního stavu III na nízkoafinitní ί» « · « ·· · · · · » to · ···« · · · ······· ·· * · · · · · · · stav IV. Ačkoliv počáteční degranulační odpověď ve stavu III je neovlivněná, je chemotaktická signalizační schopnost minimalizována a tak je buněčná migrace omezena. Proto obvykle může být velmi účinný ligand uveden ke způsobení chemotaktických odpovědí vazbou na vysokoafinitní stav FPR, zatímco málo účinný ligand způsobuje degranulační odpověď vazbou na nízkoafinitní stav FPR.
Agonistická aktivita a antagonistická aktivita mohou také být definovány použitím tohoto modelu. Agonista stabilizuje aktivovaný receptorový stav III a stupeň stabilizace je odrazem jeho účinnosti. Antagonista se na druhé straně váže na receptor, ale destabilizuje aktivovaný stav III a inaktivuje receptor. Takový model se neomezuje na FPR.
Dále snížením citlivosti se nazývá, jestliže nastává to, že se ligand váže na receptor a stejný nebo jiný receptor se stává odolným k následující stimulaci stejným nebo jiným ligandem. Tento stav snížené citlivosti se může vytvořit po receptorovém obsazení v normálním průběhu buněčné aktivace, mající za následek destabilizaci stavu III, nebo před receptorovým obsazením, ve kterém stav III není nikdy dosažen. Jestliže odolný stav nebo receptorová inaktivace je indukována jedním stimulem a působí na četné neligandové receptory, je tato situace nazývána heterologní snížení citlivosti.
Nejlépe studovaný N-formylpeptid je f-Met-Leu-Phe (FMLP nebo fMLP). Nicméně účinější peptidy byly určeny s receptory na králičích neutrofilech in vitro, zejména fMet-Leu-Phe-Phe, fMet-Leu-Phe-NHBzl (fMet-Leu-Phe benzylamid) a fNle-Leu-Phe-Tyr (N-formyl-L-norleucyl-Leu-Phe-Tyr) (Kermode et al., viz. výše). Tyto vykazují maximální migraci (řádově 20 až 35 pm) i degranulaci (řádově ED5o 1Ο’Ιθ až 10’11). Více nových studií navrhuje, že neformylované peptidy se mohou také vázat na FPR a mohou působit jako účinné aktivátory neutrofilové funkce. Například Met-Met-Trp-Leu-Leu je účinný pentapeptid a je srovnatelný v aktivitě s FMLP (Chen et al., J. Biol. Chem. 270: 23398-23401, 1995). Přeměna pentapeptidu na N-formylovanou formu, která zesílí jeho účinnost 100 až 500 krát, ukazuje, že N-formylace stále hraje významnou roli v účinnosti peptidu, ačkoliv bioaktivita se nezdá být striktně určená N-formylací.
Jiné modifikace peptidů ukázaly, že některé peptidy mohou být přeměněny na účinné agonisty FPR (Derian et al., Biochemistry 35:1265-1269, 1996; Higgins et al., J. Med. Chem. 39: 1013-1017, 1996). Takové modifikace zahrnují močovinovou substituci aminokoncové skupiny a karbamátové modifikace. Dále změna aminokyselinového • · · * ♦ · · ···· » · ····· ·· « • · ···· r · » «······ ·· #· ·· ♦ · · · složení MLF peptidu ukázala také změnu agonistů na antagonisty FPR, jak určuje uvolnění superoxidového aniontu a neutrofílová adheze na cévní endothelium.
Chemotaxe, stimulovaná N-formylpeptidy přes neutrofily, byla dobře prostudována. I před stimulací N- formylpeptidy se neutrofily přechodně vázaly na P-zóny, exprimované na endothelových buňkách. Aktivace neutrofilů, způsobené N-formylpeptidy, tvořenými v místě zánětu, vede k akumulaci neutrofilů v tomto místě.
N- formylpeptidy regulují L-zóny na neutrofilech a přímo koncentrují neutrofily podél endothelia, následované regulací integrinů na povrchu neutrofilů. Integriny zprostředkované interakce buňka-buňka a buňka-extracelulární matrice a vazba na laminin, fibronectin, victronectin, stejně jako na ICAM (vnitrobuněčnou buněčnou adhezi molekul) a VCAM (vaskulární buněčnou adhezi molekul) byly nalezeny v endotheliu. Při vazbě integrinů na ICAM a VCAM je signál převeden dovnitř neurofilu přes interakci s cytoskeletem. Neutrofily pak odloučí L-zónu a začnou se šířit podél endothelia. Regulace E-zóny a ICA-1 na povrchu endothelových buněk pak zprostředkuje migraci neutrofilů přes endothelium (Luscinskas et al., J. Immunol. 146:
1617-1625, 1991). Při přecházení endothelové bariéry neutrofily migrují k místu zánětu citlivostí ke koncentračnímu gradientu N-formylpeptidu. Při dosahování cíle, který obsahuje vysokou koncentraci peptidu, spouštějí neutrofily antimikrobiální působení.
Stimulované neutrofily rychle aktivují respirační rychlou oxidázu, která katalyzuje vznik superoxidového radikálu O2’. Superoxidový radikál reaguje s dalšími molekulami za vzniku peroxidu vodíku a kyseliny chlorné, oba jsou vysoce reaktivní činidla a jsou proto účinná při zasahování do mikrobiálních funkcí. Degranulace je také účinný prostředek pro destrukci cizích mikrobů. Nicméně degranulace může také poškodit hostitelskou tkáň. Fagocytóza je jiný mechanismus, kterým neutrofily eliminují cizí mikroby. Mnoho těchto funkcí je stimulováno G-proteinem, používající fosfolipázy jako druhých poslů, tři z nich byly charakterizovány.
Fosfolipáza C, PLCp2, tvoří dva druhé posly, 1, 4, 5- ionsitoltrifosforečnan (IP3) a diacylglycerol (DG), βγ podjednotky G-proteinu tvoří v průběhu aktivace FPR aktivovaný PLCp2. IP3 se váže na některé vápenaté kanály pro stimulování uvolnění vápníku z vnitrobuněčných rezerv, mající za následek zvýšení cytosolické koncentrace vápníku, která je pozorována v průběhu stimulace chemoatraktanty. DG, v souladu s uvolňováním vápníku, aktivuje proteinkinázu C (PKC). G-protein, aktivovaný PLC kinázou, byl nedávno popsán v literatuře (Beaven, et al., J. of Immunology 160: 51365 • « ···· ··· ······· ·« «· · · ····
-5144, 1998) jako hlavní cesta pro degranulaci mastocytů v krysích peritoneálních buňkách in vitro, spojené se vzrůstem Ca2+.
Fosfolipáza A2 (PLA2) tvoří arachidonovou kyselinu z fosfolipidů vnitřní strany plasmové membrány. Arachidonová kyselina poskytuje prekurzory pro zánětlivé mediátory, jako jsou leukotrieny a prostaglandiny. PLA2 je aktivována při fosforylaci mitogenaktivovanou protein (MAP) kinázou.
Třetí fosfolipáza je fosfolipáza D (PLD), která tvoří fosfatidovou kyselinu a cholin z fosfatidylcholinu. Fosfatidová kyselina může být zahrnuta v aktivaci respirační rychlé oxidázy mimoto, že hraje roli v produkci DG, která aktivuje PKC. Nicméně aktivace PLD vyžaduje vápník a FMLP nemůže stimulovat PLD ve vápníku zbavených buňkách (Kessels et al., J. Biol. Chem. 266: 23152-23156, 1991). Dále se zdá, že G-protein Arf a G-protein Rho regulují PLD aktivitu (Brown et al., Cell 75: 1137-1144, 1993; Cockcroft et al., Science 263:523-526, 1994; Singer et al., J. Biol. Chem. 270:14944-14950, 1995).
Proteinová fosforylace hraje centrální roli v přenosu signálů, iniciovaném FMLP. Ve fosforylaci proteinů jsou zahrnuty tři hlavní proteinkinázy jako výsledek FMLP stimulace.
Jak je diskutováno výše, PKC je aktivovaná DG, která je tvořena PLC. PKC způsobuje fosforylaci serinových a threoninových zbytků. PKC se skládá ze šesti různých izoforem, tři z nich jsou citlivý k vnitrobuněčnému vápníku (α, β a γ formy) a tří, které nejsou (δ, ε a ζ formy). Neutrofily obsahují α, β a ζ formy, ale ne γ formu. Vápník-závislé a DG-závislé PKC (PKC-β) reaguje na FMLP a forbolesterovou stimulaci přesunem z cytosolu k membráně. Pak fosforyluje množství cytosolických proteinů, jako jsou ty zahrnuté v systému respirační rychlé oxidázy. FMLP také může aktivovat vápník-závislou, DG-závislou a fosfatidylserin-závislou PKC formu, ale jejich funkce je nejasná.
MAP kináza (MAPK) je údajně aktivována βγ podjednotkami G-proteinů aktivitou Ras a Raf. Současná literatura naznačuje zahrnutí vysoce intenzivní Ras signalizace při navozování apoptózy (Bar-Sagi et al., J. Mol. Cell Biol. 19(9): 5892-901, 1999) stejně jako při podpoře adheze endothelových buněk (Fikel et al., ........................). Nyní se předpokládá, že Raf má klíčovou roli v růstových signálech, které zahrnují přežití buněk, růst a diferenciaci (Rapp et al., ...................). Tato kinázová dráha je také stimulována C5a a IL-8 (Buhl et al., J. Biol. Chem. 271: 2832-2838, 1996). MAP kináza způsobuje fosforylaci tyrozinu některých regulatorních proteinů, jako je extracelulární ··*· ··· ···· • · ····· « · · « · «··· · · » ·«····· ·· · · ·* ·«·· signálem regulovanou kináza (ERK)-l. Současná literatura naznačuje, že MAPK cesty jsou odpovědné za produkci cytokinů; nicméně aktivace TH-1 i TH-2 cytokinů, stejně jako jiných prozánětlivých molekul, jako jsou C5a, IL-8 a FMLP, je závislá na G-proteinové signální přeměně, tvořené třemi články.
Fosfatidylinositol 3-kináza (PI3K) je odpovědná za tvorbu PI trifosfátu (PIP3), který je pozorován při simulaci FMLP. Zvýšená hladina PIP3 zřejmě přispívá k aktivaci systému dýchací prudké oxidázy a ke spuštění polymerizace v neutrofilech, která je považována za důležitou při regulaci cytoskeletálních změn a buněčné migraci. Současná literatura (Rankin et al, J. Exp. Med. 188(9): 1621-32, 1998) popsala, že zvýšená hladina PI3 kinázy může také podporovat degranulaci eozinofilů na základě G-proteinové signalizace na základě aktivace IL-5. Dále Sagi et al., Eur. J. Immunol., 1998. 28: 3468-3478 navrhuje, že G-proteinová signalizace použitím prostředních cest PKC a PI3 kináz může IgE aktivovat PCsR receptor pro uvolnění histaminů a jiných prozánětlivých cytokinů, které jsou zahrnuty v alergické hypercitlivosti dýchacích cest. Uckun et al., J. of Biolog. Chemistry, Vol. 274, No. 38, Sep., 1999, pp. 27028-27038 zveřejnil G-signalizaci v JAK3 kinázové cestě přes IgE/FCcRl zesítění, což vede k degranulaci mastocytů. Beaven et al., J. of Immunology, 1998, 160: 5136-5144 zveřejnil, že G-proteinová signalizace přes aktivaci PKC a mající za následek absorbci Ca2+ také vede k sekreci a degranulaci mastocytů. Tak G-protein může být nepostradatelný pro pokračování aktivace FCcRl na IgE antigenní odezvy a odpovídá schopnosti zasahovat do G-proteinové signalizace, může být základní podklad pro pokračování inhibice aktivace FCcR receptoru.
Byli identifikováni někteří antagonisté králičího neutrofilu FPR, ale znaky, které dělají některé molekuly antagonisty, jsou stále nejasné. Bylo ukázáno, že některá butoxykarbonylová analoga FMLP jsou kompetitivně inhibující chemotaktickou peptidem indukovatelnou buněčnou aktivaci, ve které byl BocPLPLP shledán nejúčinnějším (Schiffman et al., FEBS Lett. 117: 1, 1980; Freer et al., Biochemistry 19: 2404, 1980; Kanaho et al., J. Leukocyte Biol. 420, 1990). Bylo také ukázáno, že cyklosporin H, cyklický undekapeptid a analog cyklosporinu A, má antagonistovou aktivitu k formylpeptidovému receptoru (Wenzel-Seifert et al., J. Immunol. 150: 4591 -4599, 1993). Také byl určen přirozeně se vyskytující antagonista formylpeptidového receptoru, z retroviru získaný hexapeptid (Oostendorp et al., J. Immunol. 149: 1010, 1992). Nicméně žádný z těchto antagonistů se neváže na formylpeptidový receptor s vysokou afinitou a nejsou proto prakticky využitelné jako výzkumné prostředky nebo jako protizánětlivé léky.
Zajímavě byla inhibice degranulace mastocytů N- formyl- methionyl- leucyl-fenylalaninem popsána v Inflammation, Vol. 5, No. 1, pp. 13-16 (1981). Bylo tam popsáno, že dva strukturálně odlišné peptidy, např. pepstatin a N- formylmethionyl-leucyl- fenylalanin, inhibují vzrůst cévní permeability v krysí kůži, způsobené nitrokožní injekcí 40/80, séra proti krysímu IgE nebo makromolekulárního aniontového permeabiličního faktoru, izolovaného z telecích plic. Bylo popsáno, že se zdá, že tyto peptidy působí přímo na mastocytech. Mechanismus takové inhibice je nejasný, protože nebyla popsána exprese FPR na mastocytech.
Jasně řečeno je mnoho nezodpovězených otázek co se týká funkce a mechanismu působení FPR. Dále objev, že FPR je exprimován v buňkách, které nejsou leukocyty, jako je mozek a dendridské buňky, naznačuje, že FPR může mít nové funkce v buňkách jiného typu, než bylo objasněno. Tak jsou potřeba další činidla pro inhibici prozánětlivé odpovědi v buňkách, stejně jako způsoby pro studování prozánětlivé odpovědi v buňkách.
PODSTATA VYNÁLEZU
Nyní bylo objeveno, že ošetření lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk modifikačními činidly G-proteinkinázové signální dráhy po stimulaci těchto buněk prozánětlivým činidlem inhibuje obvyklou prozánětlivou odpověď, zejména pokračování prozánětlivých odpovědí, indukovaných prozánětlivými činidly jako jsou, například, C5a, FMPL, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, ÍL-13 a TNFa, nebo FCe receptoru. Změna buněčné produkce G-proteinu inhibuje dráhy přenosu signálů zánětlivé odpovědi, zprostředkované G proteinem. Zejména užitečným modifikačními činidly G-proteinkinázové signální dráhy jsou N-formylmethionyl-leucyl („f-Met-Leu“) peptidy, které mají obecný vzorec f-Met-Leu X, kde sloučenina obecného vzorce X je vybrána ze skupiny, která se skládá z Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe a Phe-Tyr, přednostně f-Met-Leu-Phe-Phe.
Lidské mononukleární buňky nebo polymorfonukleární buňky z periferní krve nebo fixované tkáňové buňky mohou být lymfocyty a granulocyty, přednostně eozinofily, bazofily a aktivované T-buňky a mastocyty.
G-proteinkinázová signální dráha tvoří komplex s povrchovým buněčným receptorem, přednostně formylpeptidovým receptorem („FPR“), který je přítomný na povrchu těch buněk, které, v přítomnosti prozánětlivých činidel, v upřednostňované části inhibují fosforylaci G-proteinové podjednotky γ. Dále inhibici nebo blokováním pokračování fosforylace G-proteinu jsou různé dráhy, závislé na trimerických G-proteinových složkách, blokovány nebo málo regulují odpověď buněk na prozánětlivá činidla.
V upřednostňované části vynálezu, při hladině FCs receptoru (FCzR), toto modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy, v přítomnosti IgE, inhibuje aktivaci FCeR IgE.
V souladu s předkládaným vynálezem jsou prozánětlivá činidla, použitá ke stimulování lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, cytokiny, chemotaxiny nebo mitogeny. Zejména upřednostňovaná prozánětlivá činidla jsou N-formylpeptidy, jako je FMLP, aktivovaný komplementový fragment (C5a), leukotrien B4 (LTB4), destičkový aktivační faktor (PAF) a cytokininy, jako jsou TNFa, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 a IL-13, plus zesítěné antigeny IgE, IgG nebo IgA.
V jiné části předkládaného vynálezu je popsán způsob inhibice prozánětlivé odpovědi lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, způsob, který obsahuje kontakt buňky s modifikačním činidlem G-proteinkinázové signální dráhy a vazbu činidla na receptor na buňce. Prozánětlivá mediátorová buňka může být lymfocyt nebo granulocyt. Přednostně je buňka prvně stimulována prozánětlivým činidlem, jako je jeden z výše uvedených.
V upřednostňované části vynálezu je ligand vázající receptor formylpeptidový receptor. Pokračování blokování G-proteinové aktivace FCsR receptoru poskytuje podobné léčebné výhody.
Předkládaný vynález dále popisuje způsob pro určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy, způsob, který obsahuje kroky:
a) kontakt prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, se známým prozánětlivým mediátorem, vybraným ze skupiny, která se skládá z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů, a vyvolává prozánětlivou odpověď;
b) přidání ke kroku a) kandidáta modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy; a « · «·*· ··· «··«··· ·· · * * * · · · ·
c) detekce poklesu v množství G-proteinkinázy nebo rozpad proteinkinázy na disociovanou v (i) prozánětlivých buňkách, současně kontaktovaných s uvedeným kandidátem na činidlo a uvedeným prozánětlivým mediátorem, porovnaný s (ii) prozánětlivými buňkami, kontaktovanými se samotným prozánětlivým mediátorem. Upřednostňovaná G-proteinkináza je G-protein γ kináza.
V jiné části předkládaného vynálezu je popsán receptor spojený s modifikačním činidlem G-proteinkinázové signální dráhy na povrchu prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, kontaktem prozánětlivých mediátorových buněk s modifikačním činidlem G-proteinkinázové signální dráhy, čímž inhibuje prozánětlivou odpověď.
V další části vynálezu obsahuje způsob pro určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy kroky:
kontaktu prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, s kandidátem modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy; a určení distribuce proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde ve srovnání s buňkami nekontaktovanými kandidátem modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy nebyl rozdíl v množství PLCY, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a G-protein β kináz.
Tak předkládaný vynález také popisuje nový receptorový komplex krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které obsahují povrchový receptor, a modifikačního činidla G-protein signální dráhy, kde, ve srovnání s buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, je distribuce proteinkináz v buňkách taková, že nebyl rozdíl v množství PLCy, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a G-protein β kináz. Přednostně je buněčný povrchový receptor FPR receptor. Sekundární blokování G-proteinové aktivace FCeR receptoru je také upřednostňováno. Stimulace IL-4 krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLCY, PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Ras a G-protein γ kinázy.
··*· * · · ···· • 9 ····· ·· · * ·«··*·«·· · • · · · · · ··· ······· · · «· · · · · · ·
Stimulace IL-6 lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLCy, PI3 (102 Kd), Raf, Pp60 Src, ERK-1 a G-protein a a pokleslo množství PI3 (83 Kd), G-protein β a G-protein γ kináz. Stimulace IL-10 krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PI3 (102 Kd), ERK-1 a G-protein γ a pokleslo množství PLCy, PI3 (83 Kd), Ras a kináz.
Stimulace prozánětlivým činidlem, IL-13, krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLCy, PI3 (102 Kd), PI3 (83 Kd), ERK-1 a Raf a pokleslo množství Ras, Pp60 Src, G-protein a, G-protein β a G-protein γ kináz.
Stimulace prozánětlivým činidlem, C5a, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství Pp60 Src a Raf a pokleslo množství PLCy, PI3 (102 Kd), G-protein a, G-protein β a G-protein γ kináz.
Stimulace prozánětlivým činidlem, TNFa, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrůst množství Raf, Ras a Pp60 Src a pokles množství PLCy, PI3 (83 Kd), protein a, G-protein β a G-protein γ kináz.
• · · · • · · · · · · · · ··»···· ·· · ·· ···»
V souladu s předkládaným vynálezem bylo objeveno, že modifikační činidla G-proteinkinázové signální dráhy inaktivují některé prozánětlivé odpovědi lidských buněk z periferní krve, které byly stimulovány prozánětlivými činidly nebo molekulami. Upřednostňované modifikační činidla G-proteinkinázové signální dráhy se, v souladu s předkládaným vynálezem, mohou vázat na receptory, nalezených na prozánětlivých mediátorových buňkách, jako jsou lymfocyty, zejména aktivované T-buňky, granulocyty, jako jsou eozinofily, bazofily a fixované tkáňové buňky, jako jsou mastocyty.
Při vázání modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy na receptor jsou prozánětlivé odpovědi inhibovány. V souladu s upřednostňovanými částmi předkládaného vynálezu jsou G-proteinové podjednotky α, β a γ modifikovány a také je inhibována jejich fosforylace. Prozánětlivé odpovědi, které mohou být inhibovány činidlo-receptorovým komplexem, je sekrece, degranulace a migrace receptor nesoucích buněk, stejně jako syntéza a sekrece jiných prozánětlivých molekul.
Přednostně modifikační činidla G-proteinkinázové signální dráhy podle předkládaného vynálezu mohou inaktivovat receptor předtím stimulovaný prozánětlivou molekulou, ale nemají vliv na nestimulované buňky. Příklady prozánětlivých činidel, užitečných pro stimulaci buněk, jsou IL-8, N-formylpeptidy, aktivovaný komplementový fragment (C5a), leukotrien B4 (LTB4) a destičkový aktivační faktor (PAF). Přednostně činidlo-receptorový komplex podle předkládaného vynálezu také může znecitlivovat receptor před další stimulací stejným prozánětlivým činidlem nebo různými prozánětlivými činidly.
Pozorovaný účinek modifikačního činidlo-receptorového komplexu G-proteinkinázové signální dráhy na receptor nesoucích buněk může být použit k identifikování modifikačních činidel G-proteinkinázové signální dráhy. Screening takových činidel může být proveden kontaktem prozánětlivých mediátorových buněk se známým prozánětlivým mediátorem k vyvolání prozánětlivé odpovědi, po které následuje přidání kandidáta na činidlo a detekcí poklesu množství G-proteinkinázy v prozánětlivých buňkách, kontaktovanými současně s kandidátem na činidlo a prozánětlivými molekulami, ve srovnání s množstvím v prozánětlivých mediátorových buňkách, kontaktovanými pouze s prozánětlivými molekulami.
Zejména užitečné modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe. Jiná užitečná činidla mohou být určena běžným testováním za použití jedné z výše uvedených postupů.
Jak je použito zde, prozánětlivé odpovědi zahrnují sekreci nebo degranulaci prozánětlivých mediátorových buněk a týkají se leukotrienů, histaminů a jiných cytokinů. Takové odpovědi také zahrnují infiltraci eozinofilů, bazofilů a mastocytů do zánětlivých tkání jako výsledek chemotaktické adheze, migrace a agregace lymfocytů, eozinofilů, bazofilů, mastocytů a neutrofilů. Cévní permeabilita v místě zánětu a vzrůst produkce IgE, IgG a IgA a jejich samostatných FC receptorů také může být spojováno s protizánětlivými odpověďmi.
Inhibice prozánětlivých odpovědí tak může zahrnovat pokles degranulace a týká se leukotrienů, histaminů a jiných cytokinů prozánětlivých mediátorových buněk nebo úplné zastavení v upřednostňované části, následované vazbou peptid-receptor podle předkládaného vynálezu. Infiltrace a migrace prozánětlivých buněk může také být značně snížena nebo úplně inhibována. Cévní permeabilita v místě zánětu a hladina IgE může být také snížena.
Aby zde popsanému vynálezu mohl být zcela porozuměno, jsou uvedeny následující příklady. Rozumí se, že tyto příklady jsou pouze pro ilustrativní účely a nejsou uvedeny jako omezující tento vynález jakýmkoliv způsobem.
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obr. 1 je graf, ukazující vázání FITC-značeného HK-X (f-Met-Leu-Phe-Phe) na lidské jaderné buňky z periferní krve.
Obr. 2A až 2C jsou bodové grafy FITC-značeného HK-X, vázaného na aktivované lymfocyty. Obr. 2A ukazuje lymfocyty stimulované 6 pg Concanavalinu A (ConA) 24 hodin po umístění v kultuře navíc se 100 nM FITC-značeného HK-X; obr. 2B ukazuje lymfocyty stimulované 6 pg Concanavalinu A (ConA) 120 hodin po umístění v kultuře, ale bez FITC-značeného HK-X; a obr. 2C ukazuje lymfocyty stimulované 6 pg Concanavalinu A (ConA) 120 hodin po umístění v kultuře navíc se 100 nM FITC-značeného HK-X.
Obr. 3A až obr 3B jsou histogramy obsahu DNA lymfocytů z obr. 2A až C. Obr. 3A je histogram buněk z obr. 2A a obr. 3B je histogram buněk z obr. 2B a obr. 2C.
Obr. 4 je autoradiograf 35S-methionylem značených proteinů, získaných z celého lyzátu lidských neutrofilních buněk a různých pryskyřic.
Obr. 5A až obr. 5B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených nosičem (0,3% DMSO), jak byly detekovány monoklonálními ·· ···· ··· ······· ·· · · · · · · · · protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 5A je denzitometrie SDS-PAGE normálních buněk a obr. 5B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených pouze nosičem (DMSO).
Obr. 6A až obr. 6B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených HK-X, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 6A je denzitometrie SDS-PAGE buněk, ošetřených HK-X, a obr. 6B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených pouze HK-X.
Obr. 7A až obr. 7B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených IL-8, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 7A je denzitometrie SDS-PAGE buněk, ošetřených IL-8, a obr. 7B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených pouze IL-8.
Obr. 8A až obr. 8B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených HK-X a IL-8, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 8A je denzitometrie SDS-PAGE buněk, ošetřených HK-X a IL-8, a obr. 8B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených HK-X a IL-8.
Obr. 9A až obr. 9B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, čerstvě odebraných z periferní krve, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 9A je denzitometrie SDS-PAGE čerstvě odebraných buněk a obr. 9B je fotografie SDS-PAGE gelu čerstvě odebraných buněk.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
Příklad 1: Vazba značeného HK-X na jaderné buňky z periferní krve
Byly určeny Kd a Bmax (nasycená vazba) HK-X („f-Met-Leu-Phe-Phe“) na jaderných buňkách z periferní krve. 2x105 buněk ve 100 μΐ roztoku z různých frakcí (monocyty, lymfocyty, granulocyty), připravených gradientovou centrifugám, byly předtím promyty 1% BSA-PBS roztokem, obsahujícím 0,1 % azidu sodného. 100 μΐ následujících molárních koncentrací FITC-značeného HK-X (v 1% BSA-PBS roztoku) bylo přidáno do každé řady zkumavek podle tabulky 1:
• ···· · · · ··· ·· · · · · · · · · tabulka 1
| zkumavka # | FITC-značený HK-X molární koncentrace |
| 1 | 9,06x10'” |
| 2 | 2,71x10’” |
| 3 | 5,43x10'” |
| 4 | 7,25x10’” |
| 5 | 9,06x10'” |
| 6 | 2,71x10’’° |
| 7 | 5,43x10’’° |
| 8 | 7,25x10’’° |
| 9 | 9,06x10’’° |
Zkumavky byly míchány a vortexovány 30 sekund. Zkumavky pak byly dány na 30 minut do 4 až 8 °C. Pak bylo přidáno 100 pl Cal-Lyse, inkubováno 5 minut, nebo bylo přidáno 500 pl 1% formaldehydu. Jestliže byl přidán Cal-Lyse, byl přidán 1 ml vody a inkubovalo se dalších 5 minut. Pak byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem (Coulter Epics Elitě). Výsledky navázání jsou uvedeny na obr. 1. Bmax byl určen jako 47,66 a Kd=l,674 x 10'1θ M. Tak tyto výsledky ukazují, že HK-X se váže na jaderné buňky z periferní krve, jako jsou monocyty, lymfocyty a granulocyty.
Podobnou metodologií bylo také určeno, že HK-X se váže na aktivované T-buňky, mastocyty, eozinofíly a bazofíly, stejně jako je známa vazba na neutrofíly.
Příklad 2: HK-X se váže na aktivované receptory
Lymfocyty z periferní krve byly stimulovány mitogenem Concavalin A (ConA) 24 hodin nebo 120 hodin po umístění do kultury. Buňky pak byly buď vystaveny 100 nM FITC-značenému HK-X nebo vystaveny nebyly. Buňky byly také barveny DAPI pro určení buněčného cyklu. Buňky pak byly analyzovány průtokovou cytometrií. Obr. 2A až 2C ukazují vztah mezi lymfocyty aktivovanými ConA a objevením se vazebných míst pro FITC-značený HK-X. Čtyři kvadranty ukázaly následující charakteristiky: horní levý kvadrant ukazuje buňky s vyšším než ln obsahem DNA a zvýšení množství FITC HK-X vazby nad hladinu pozadí, stanovené použitím profilu v obr. 1;
horní pravý kvadrant ukazuje buňky, které obsahují vyšší než ln obsah DNA a FITC-ligand vazbu vyšší než pozadí;
• · · · · · · ·· ·· · · ···· dolní pravý kvadrant obsahuje buňky, které mají vyšší než ln obsah DNA, ale mají vazbu FITC-ligand nad hladinu pozadí; a spodní levý kvadrant obsahuje buňky s obsahem DNA lna FITC-ligand na hladině pozadí.
Jak je patrné po prohlédnutí obr. 2B a 2C, vystavení rostlinnému lektinu nebo mitogenu stimuluje buňky k započetí buněčného cyklu a expresi vazebných míst pro FITC-značený HK-X. Dlouhá kultivační perioda 120 hodin umožnila větší části buněk započetí buněčného cyklu (srovnej s obr. 2A). Přesnější určení hladiny pozadí endogenní fluorescence bylo získáno úpravou mezí (kvadrantů) použitím buněk, kultivovaných s ConA, ale nebarvených FITC-značeným HK-X (viz. obr. 2B).
Statistická analýza potvrdila kvalitativní pozorování poskytnutím posouzení bodového grafu. Přibližně 25 % buněk na obr. 2C obsahovalo vyšší než ln obsah DNA a byly nad hladinou pozadí FITC-ligand vazby. To je značný rozdíl k počtu buněk v horním pravém kvadrantu na obr. 2A a 2B.
Více formálního posouzení distribuce buněk v různých fázích buněčného cyklu bylo získáno použitím softwarového souboru „MultiCycle“ Phoenix Software, Phoenix, AZ. Tento software rozplétá DNA histogram a staticky analyzuje složky pro stupeň vazby a účinnosti.
Obr. 3A ukazuje stejné vzorky, obsažené na obr. 2A a obr. 3B ukazuje ty, obsažené na obr. 2B a 2C. Jak je patrné z posouzení procenta buněk, které jsou diploidní (>ln obsah Dna), frakce vzrostly z 2,2 % na obr. 2A na 29 % na obr. 2B a 2C.
Tak je zřejmé, že stimulace lidských lymfocytů z periferní krve mitogenem stimuluje duplikaci jejich DNA a současně s tímto procesem expresi vazebných míst pro FITH-značený HK-X. Pouze frakce buněk s obsahem DNA ln nebo v G0/G1 fázi buněčného cyklu ukazují vzrůst expresevazebných míst pro ligand. Na druhé straně všechny buňky s diploidním obsahem DNA (> 1 n) obsahují vazebné místo pro ligand.
Příklad 3: Identifikace a charakterizace HK-X receptorů
Receptory, které váží HK-X a jiné N-formylpeptidy, byly izolovány a určeny z myších peritoneálních mastocytů, lidských polymorfonukleárních a mononukleárních buněčných populací. Dále G-proteinová aktivace FCcR receptorů jako pokračující důsledek vzrůstu PKC, PI3 a uvolnění Ca2+ způsobuje na FCs receptorů G-proteinové ovlivnění ve směru efektor receptor.
···* ··· ·*·· * · «··· · ♦ · ·· ···· » · · ··· ···· ·· ·· ·· ·*··
Buňky, které váží HK-X, zahrnují mastocyty, bazofily a eozinofily, jak je zřejmé ze změny biologické reaktivity po vystavení HK-X a vazbou fluorescenčně nebo radioaktivně značeného HK-X. Receptory pro HK-X nebyly identifikovány. Na druhé straně neutrofily na povrchu exprimují formylpeptidové receptory. Nicméně zdá se, že krevní lymfocyty a monocyty váží HK-X méně než neutrofily.
podrobné materiály a postupy:
1. Izolace buněk - Krysí peritoneální mastocyty byly izolovány infúzí 35 ml Tyrodova roztoku do dutiny pobřišniční znecitlivěných myší. Krysy pak byly utraceny injekcí nadměrné dávky znecitlivujícího prostředku. Peritoneální buňky byly odebrány, umístěny do 15 ml centrifugačních zkumavek. Buňky byly odstředěny při 250 g za 10 min. při pokojové teplotě.
Lidské mononukleární a polymorfonukleární buňky z periferní krve byly izolovány z periferní krve, získané od obvyklých dárců. Krev byla shromážděna v heparinu. Různé buněčné typy byly izolovány centrifugací přes Ficoll-Hypaque při 500 g 60 minut při pokojové teplotě. Každá frakce byla odebrána, samostatně shromážděna a promyta lx RPMI 1640 s antibiotiky.
2. Metabolické značení buněk 35S-methioninem - Buňky byly upraveny na 1 x 107 na ml methionin neobsahujícím RPMI 1640 médiem a umístěny přes noc v 37 °C v přítomnosti 5 % CO2.
3. Odebrání buněk a příprava izolovaných membrán - Buňky byly promyty 3x v PBS a postupně lyžovány sonikací v Hepes pufru, pH 7,2, obsahujícím 0,3% NP40 a proteinázový inhibiční koktejl. Výsledný buněčný preparát byl odstředěn při 600 g za 10 minut a supernatant byl odebrán pro další analýzy.
4. Chromatografické rozdělení různých buněčných proteinů na sefaróze a sefaróze HK-X - Buněčný přípravek prošel přes kolonu sefarózové nesubstituované pryskyřice nebo sefarózové HK-X pryskyřice a byl rozdělen na dvě části, A a B.
Alikvot A: prošel přes HK-X substituovanou sefarózovou kolonu. Kolony byly promyty a pak eluovány pufrem, obsahujícím HK-X (5 mg/ml) a pak 0,1 M glycinem, pH 2,5. Alikvot B byl vázán na HK-X substituovanou kolonu v přítomnosti rozpustného HK-X a proteiny byly eluovány. Každá frakce byla zakoncentrována a lyofilizována.
Postup, provedený v tomto kroku, zahrnuje navázání HK-X na sefarózovou pryskyřici za vzniku HK-X substituované pryskyřice. Před vystavením HK-X substituované pryskyřice prošla směs značených buněčných proteinů přes pryskyřici nesubstituovanou HK-X pro odstranění proteinových typů, které reagují s přírodní pryskyřicí. Tak když • 4 · » · ♦ * · · · « « « ·»··· · ♦ · • ········» ·
F F · · · · ··· ··· ««·· ·· ·· ·· ·»· buněčné proteiny, zahrnující receptorové proteiny, prošly přes HK-X substituovanou pryskyřici ve vhodném iontovém prostředí, receptorové proteiny (pro HL-X receptor) se mezi ostatními proteiny pevně vázaly s HK-X. Pryskyřice byla promyta mírným činidlem, jako je fosfátový pufr s neutrálním pH, pro odstranění navázaných proteinů s nízkou afinitou. Později byla pryskyřice vystavena přebytku volného HK-X pro kompetitivní eluci receptorových proteinů, vázaných na pryskyřici. Radioaktivní proteiny, uvolněné v každém z těchto kroků, byly zakoncentrovány a analyzovány na
12% SDS-PAGE systému, jak je podrobně popsáno v následujícím kroku.
5. 12% SDS-PAGE - Do každé dráhy gelu bylo aplikováno 25 μΐ radioaktivního buněčného přípravku, obsahujícím 250 cpm až 2000 cpm radioaktivity. Gel běžel při 90
V a 30 mA až bylo získáno dobré rozlišení barevných standardů. Standardy byly fosforyláza b (MH=94 000); hovězí sérový albumin (MH=68 000); ovalbumin (MH=43 000); uhličitá anhydráza (MH=30 000); a sojový trypsinový inhibitor (MH=21 000).
6. Odhad molekulové hmotnosti rozdělených radioaktivních proteinů - Pro standardy a pro každou molekulovou hmotnost, vizualizovanou na gelu, byly vypočítány relativní mobility. Byl sestrojen graf logaritmů molekulových hmotností standardů proti relativní mobilitě každého standardu. Data byla vložena do PRISM softwaru a molekulové hmotnosti neznámých proteinů byly odhadnuty podle programu standardních křivek. Výsledky byly srovnány s FPR receptorovými proteiny, publikovanými v literatuře (Goetzl et al., Biochemistry 20; 5717-5722, 1981).
Obr. 4 ukazuje výsledek vzorového pokusu. Všechny proteiny, přítomné v buněčném lyzátu, jsou ukázány v dráze A. V dráze B ukazuje nenavázaná látka ze sefarózové kolony bez HK-X substituce vzor distribuce proteinových bendů, podobný celému buněčnému lyzátu. Dráha C obsahuje předeluované látky. Dráha D je slepá dráha.
V dráze E jsou přítomny tři proteinové bendy, jestliže kolona byla eluována v přítomnosti 1 mg HK-X (kompetitor). Molekulové hmotnosti jsou odhadnuty na ~94 000, ~68 000 a ~40 000 Daltonů. Tyto pokusné podmínky potvrdily specifitu navázání. Srovnání relativní početnosti bendů, eluovaných v tomto pokuse, s těmi popsanými Goetzlem et al., odhalily zajímavé odlišnosti (viz. tabulka 2). Prozkoumání normalizovaných částí receptorů odhalilo značnou odlišnost v distribuci tří druhů, získaných z FMLP kolony (Goetzl) a z HK-X kolony (tento příklad). 68 Kd druh byl dominantní druh, získaný Goetzlem et al. z FMLP afinitní kolony, zatímco 40 Kd druh byl převládajícím druhem, získaným z HK-X afinitní kolony.
«·
9 * · • * ♦ ·» a 9 · >
• - *· ♦ · · · • « » tabulka 2 odlišnosti publikovaných formyl receptorů, získaných z FMLP-sefarózy a získaných z HK-X sefarózy
| molekulová | # celkových | část celkové | část | celkové | normalizované | |
| hmotnost | zbytků, | receptorové | receptorové | části | ||
| obsahujících | populace FMLP | populace HK-X | receptorových | |||
| methionin | proteinů | |||||
| FMLP | HK-X | |||||
| 94 000 | 14 | 15 | 26 | 1,07 | 1,8 | |
| 68 000 | 11 | 80 | 28 | 7,27 | 2,54 | |
| 40 000 | 4 | 5 | 41 | 1,25 | 10,25 |
Z radiografu na obrázku 4 je zřejmé, že tři molekulární druhy byly eluovány z peritoneálních mastocytů přídavkem 1 mg HK-X. Spočítané molekulové hmotnosti těchto proteinů souhlasily molekulovými hmotnostmi, uvedenými Goetzlem et al. Molekulové hmotnosti proteinů, získané po kompetici s HK-X nebo kyselinou z krysích peritoneálních mastocytů a neutrofilů byly stejné jako ty popsané Goetzlem et al. pro lidské neutrofily.
Ačkoliv celkový střední počet zbytků methioninu ve 40 Kd molekule je 5,1, měl vyšší intenzitu radiografického obrázku než oba 68 000 a 94 000 druhy, které obsahují 11 a 14 zbytků na molekulu. V tomto příkladě byl určen relativní nadbytek každého získaného druhu proteinu biosyntetickým radioznačením 35S-methioninu. Relativní části, získané afmitní chromatografií, byly určeny integrací ploch pod křivkami autoradiografů. Goetzl naměřil relativní nadbytek každého druhu proteinu určením proteinu chemickými způsoby. Proto pro přesnější srovnání distribuce proteinů, získanými dvěma studiemi, byly distribuční hodnoty normalizovány vydělením relativního nadbytku každého druhu počtem methioninových zbytků. Tento poměr koriguje možné odchylky v hodnotách, způsobené různými metodologiemi. Korigované poměry odhalily ohromě odlišné navázání a/nebo získaný profil mezi hodnotami, uvedenými Goetzlem, a hodnotami, získanými v tomto příkladě. Jedna možnost je, že detergent disocioval receptorový komplex, vázaný na FMLP-substituovanou sefarózu, selektivním způsobem jiným od toho na HK-X substituované sefaróze.
«· ·» ·* ·· *· • ··· ···· • ·«#·· · «, · • « · «V « · « # » • · * * » · · · • · · »« ·· · · · · · ·
Stručně, v tomto příkladě byl HK-X použit pro selektivní získání vazebných proteinů v buněčném lyzátu, získaném po proteinovém značení 35S-methioninem in vitro. Byly izolovány tři typy molekulových hmotností, což souhlasí s dřívějšími publikacemi na velikost peptidů, asociovaných s FMLP receptorovým komplexem.
Bylo také ukázáno technikami použitými v tomto příkladě, že se HK-X váže na receptory na lidských mnohojaderných a mononukleárních buněk, zejména aktivovaných T-buněk, mastocytů, eozinofilů a bazofilů.
Příklad 4: Převod signálu a mechanismus působení
Leukocyty odpovídají na velké množství chemoatraktantů a jiných prozánětlivých mediátorů. Některé mediátory způsobují chemotaxi, aktivaci enzymového systému a týkají se patologických účinných mediátorů. Typické N-formylpeptidy (jeden prototyp-FMLP), aktivovaný komplementový fragment (C5a), leukotrien B4 (LTB4), destičkový aktivační faktor (PAF) a některé chemotaktické cytokiny (jako je IL-8), jsou velmi dobře rozpoznávaná chemotaktická a prozánětlivá činidla. Tyto činidla se váží na G-protein-spřažené receptory (GPCR) s následným vyvoláním vícenásobného signálního převodu, zprostředkovaného proteinkinázovými systémy. Kaskády, mající za následek začátek procesů, jsou komplexní a návazné, jsou přece odpovědné za celkové chování všech jaderných buněk. Programová buněčná smrt (apoptóza), tvorba imunitní odpovědi, odstranění samostatně rozpoznávajících T buněk a kontrola syntézy mimobuněěné matrice je jenom malá část příkladů působení převodních drah signálů. Proteinkinázy byly identifikovány pro jejich schopnost přenosu fosfátové skupiny z fosfátového donoru na aminokyselinový akceptor, umístěný v proteinu. Obvykle je donor γ fosfát ATP. Tři hlavní akceptorové aminozbytky v proteinech jsou tyrosin, serin a threonin. V 1999 bylo přes 115 proteinových kináz určeno a popsáno v literatuře. Chování buněk při odpovědi na stimulaci FMLP je v literatuře dobře popsáno (Prosnitz et al., Pharmacol. Ther. 74: 73-102, 1997). FMLP, vázající se na fagocyty, stimuluje fosforylaci, která upravuje buněčné funkce. FMLP a jiné chemoatraktanta stimulují fosfatidylinositol 3-kinázu (P13K), která střídavě aktivuje proteinkinázu (PKC). V neutrofilech FMLP navázání způsobuje fosforylaci extracelulární regulující kinázy, (ERK-1), která náleží do obecné rodiny kináz, nazývaných mitogen-aktivujících proteinkináz (MAP kináz). Někteří členové MAP kinázové rodiny jsou: Raf-1 a Ras. Členové proteinkinázových rodin se obvykle liší v molekulové hmotnosti až tak, že mohou být rozlišeny jeden od druhého SDS-PAGE technologií. Dále fosfotyrozinové
ř » · • « • » # · * fc · » « « * » a · · » · proteiny mohou být detekovány z celé škály intracelulárních proteinů monoklonálními protilátkami, které rozpoznávají pouze fosfotyrozinový epitop (Ross et al., Nátuře (London) 294: 654, 1981; Frackleton et al., Mol. Cell Biol. 3: 1343, 1983).
Změny v proteinkinázách, způsobené přídavkem HK-X k lidským mononukleárním a polymorfonukleárních buňkám z periferní krve, byly analyzovány, aby objasnily mechanismus působení HK-X. HK-X byl přidán samotný a s přídavkem FMLP nebo IL-8, které jsou známé chemotaktika a prozánětlivá činidla.
podrobné materiály a postupy:
1. Izolace buněk - lidské mononukleární a polymorfonukleárních buňky z periferní krve byly izolovány z periferní krve, získané od obvyklých dárců. Krev byla shromážděna v heparinu. Různé buněčné typy byly izolovány centrifugací přes Ficoll-Hypaque při 500 g během 60 minut při pokojové teplotě. Každá frakce byla odebrána, uložena odděleně a promyta lx RPMI 1640 s antibiotiky.
2. Kultivace a ošetření buněk - 107 buněk na ml média bylo dáno do 37 °C na 30 minut před přídavkem stimulantů, aby se umožnilo dosáhnout buňkám stejného stavu poolu fosforylovaných proteinů. Pak byly přidány následující stimulanty do každého ml buněk:
A. 100 μΐ nosiče (0,3% roztok DMSO v médiu).
B. 100 μΐ HK-X, obsahující 20 μg HK-X.
C. 100 μΐ FMLP, obsahující 0,1 μg FMLP
D. 100 μΐ IL-8, obsahující 0,1 μg IL-8 (rekombinantní lidský IL-8)
E. 100 μΐ HK-X, obsahující 20 μg HK-X plus 100 μΐ FMLP, obsahující 0,1 pg
FMLP
F. 100 μΐ HK-X, obsahující 20 pg HK-X plus 100 μΐ IL-8, obsahující 0,1 pg IL-8
G. buněčné kultivační médium bez nějakého stimulantu.
Buňky byly inkubovány dalších 30 min při 37 °C v 5 % CO2.
3. Odebrání buněk a SDS-PAGE analýza - Buňky byly odstředěny při 250 g během 5 min při pokojové teplotě. Supernatant byl odstraněn a bylo přidáno 25 μΐ 2x startovního SDS-PAGE pufru. Pelety byly povařeny 15 minut a odstředěny při 10 000 g během 5 min. Malé vzorky byly odebrány na gelovou elektroforézu na 12% akrylamidovém gelu.
4. Imunoblotová detekce fosfoproteinů - Proteiny byly přeneseny na nylonovou membránu při 13 V během 30 minut a následně blokovány 1% BSA 12 hodin. Protilátka ·· »·
99 99
9 9 9 9 ^ 9*99 · 9 * 999 * · • 9 · · ·' : » · · * · * 9 » 9 9 9 9 » 999 999 > ·· *»· »· ···· konjugovaná s HRP v 0,3% BSA byla přidána na 60 min. Membrány byly promyty, upevněny a fotografovány.
5. Analýza dat - Fotografie byly dodány do profesiální laboratoře a pro každý gel byla udělána negativní kopie za použití vysoce kontrastního a slabězrnícího filmu. Následné fotografie byly naskenovány při 600 dpi a byla provedena densitometrická analýza použitím Image Pro Plus softwaru, SPSS. Pro každý bend byly vypočítány molekulové hmotnosti.
Aby se standardizovalo množství buněčných proteinů, aplikovaných do každé dráhy SDS-PAGE, bylo použito pro ošetření stejné množství buněk a přibližně stejný objem vzorku, aplikovaný do každé dráhy. Na obr. 5 až 9 jsou ukázány chemiluminiscenční obrazce fosfoproteinů, detekovaných monoklonální antifosfotyrosinovou protilátkou. Negativ chemiluminiscenčních obrázků byl vyroben profesionálním fotografem, aby se získal vysoký stupeň rozlišení bendů a intenzita, odpovídající chemiluminiscenci. Například na obr. 5A proteinkináza, přítomná v buňkách, vystavených nosiči po dobu 30 minut, odhalila 9 jednoznačných proteinových typů, jak ukazují píky na densitometrické analýze gelu. Pro zřetelnost byly píky na densitometrické analýze také označeny stejnými šipkami. (Začátek gelu je na pravé straně gelu, kde se nacházejí největší molekulové hmotnosti).
Na obr. 6 jsou zobrazeny proteinkinázy buněk, odpovídajících na HK-X. Byl detekován zřejmý vzrůst v molekulových hmotnostech přibližně 83 Kd, který nebyl pozorován v jiných ošetřeních. Nápadné rozdíly byly pozorovány po současném ošetření buněk 20 pg HK-X a 0,1 pg IL-8 a 20 pg HK-X a 0,1 pg FMLP (data nejsou ukázána). Menší molekulová hmotnost se ukázala značně snížená (levá větší část gelu). Toto snížení je kvantitativně odraženo v ploše píků. Tato plocha je v densitometrickém sledování ukázána horizontálními dvouhlavými šipkami. Obsah a distribuce proteinkinázy v Čerstvých mononukleárních buňkách je ukázána na obr. 9. Distribuce kináz těchto buněk je nápadně podobná buňkám, ošetřených nosičem (obr. 5) a buňkám, ošetřených HK-X (obr. 6). Charakter kinázové odpovědi na stimulaci samotným FMLP a stimulaci HK-X plus FMLP nejsou ukázány. Nicméně charakter každé z nich byly v podstatě shodný s pozorováním samotné IL-8 a HK-X plus IL-8.
Charakter a distribuce proteinkináz pro polymorfonukleární buňky z periferní krve byl v podstatě stejný jako pro mononukleární buňky. Základní rozdíl mezi dvěma buněčnými typy byl ten, že mononukleární buňky byly více metabolicky aktivní než polymorfonukleární buňky.
Použitím densitometrického analytického přístupu byla vypočítaná plocha píku pro každou molekulovou hmotnost. Tak bylo vypočítáno kvantitativní určení každé kinázy jako procenta celkového kinázového obsahu. Dále molekulová hmotnost známých kináz byla srovnána s těmi vypočítanými z relativního migračního (Rf) výpočtu v tomto pokuse.
Tak mohlýbýt identifikovány kinázy v této studii.
Tabulka 3 ukazuje kvantitativní změnu v distribuci proteinkináz z lidských buněk z periferní krve po vystavení HK-X.
tabulka 3
| proteinkináza | molekulová hmotnost | % změny s HK-X |
| PLCy | 150 Kd | NC |
| PI3 | 102 Kd | +57 |
| PI3 | 83 Kd | +55 |
| Raf | 65-68 Kd | -42 |
| Pp60 Src | 62 Kd | NC |
| G-protein a | 56 Kd | -49 |
| ERK-1 | 44-49 Kd | NC |
| G-protein β | 33-35 Kd | -25 |
| Ras | 21 Kd | -32 |
| G-protein γ | 9 Kd | NC |
Tabulka 4 ukazuje kvantitativní množství G-protein γ kinázy v různých pokusech, které potvrzuje a rozšiřuje předcházející kvalitativní data. Ačkoliv se pokusilo o použití stejného počtu buněk pro každé ošetření a přibližně stejné množství získaných intracelulárních proteinů bylo aplikováno do každé dráhy, celkové množství kináz se lišilo, jak je vidět na pozorovaných plochách.
• · · · tabulka 4 přehled proteinkináz z buněk z periferní krve po vystavení HK-X a IL-8 a FMLP
| protein-kináza | MH (kD) | nosič | HK-X samotný | FMLP samotný | IL-8 samotný | HK-X + FMLP | HK-X 4“ IL-8 | čerstvé normální buňky |
| G-protein γ | 9 | 10 | 11,4 | 10,1 | 14,8 | 2,7 | 3,4 | 11,9 |
| celková plocha | 164,413 | 246,023 | 189,169 | 170,985 | 98,097 | 128,937 | 176,442 |
Tabulka 5 ilustruje výsledky jiného pokusu, který ukazuje změnu v distribuci proteinkináz z lidských buněk z periferní krve po expozici HK-X ve srovnání s kostimulačním vystavením (1) HK-X a (2) fMLP nebo IL-8.
Tabulky 6 a 7 ilustrují výsledky dalšího pokusu, který ukazuje změnu v distribuci proteinkináz z lidských buněk z periferní krve po expozici HK-X ve srovnání s kostimulačním vystavením (1) HK-X a (2) Ca5, TNFa, IL-4, IL-6, IL-10 nebo IL-13.
tabulka 5 přehled určení a distribuce tyrozinových proteinkináz v buňkách z periferní krve procent distribuce-----------------------------------
| protein- | molekulová | nosič.. | IHK-X HK-X HK-X + | éerst\é |
| kina/d | 1 váhá | ““Sý ,LJ | ‘ i* normální. biÉfcv ·. ’ - | |
| PI3 kináza | 102 Kd | 14 4 | ||
| PI3 kináza | 83 Kd | I··!! | •7,7 íVjM.ý'; 10,4 | 4;í'' |
| 65 až 68 Kd | •7,8 8,9 | lili· | ||
| Ras | 21 Kd | i | ,12,7 11,3 | |
| ΡρύΟ Sre | 62 Kd | !5 8’8 | *3S. 4 | |
| 1 RK-1 | 44 až 49 Kd | Mil | ’·6’9 8·6 | 8,5' |
| G-protein a | 56 Kd | Β» | 6,3 7,'StV ; 8,2 | 12,3 |
| G-protein β | 33 až 35 Kd | 7 53 | 9,3.-‘ · | |
| G-protein γ | 9 Kd | 11111 | 1X4 22 ϊ - M | lL9f |
tabulka 6 přehled určení a distribuce tyrozinových proteinkináz v buňkách z periferní krve procent distribuce-----------------------------------
| protein- kináza | molekulová váhá | C5a plus HK-X | TNFa plus HK-X | IL-4 plus HK-X | HK-X |
| PLCy | 150 Kd | 2,2 | 2,4 | 7,7 | 4*2 |
| PÍ 3 kináza | 102 Kd | 2,7 | 3,1 | 6,0 | 1B1B· |
| PI3 kináza | 83 Kd | 6,9 | 5,5 | 7,7 | |
| Rař | 65 až 68 Kd | 6,4 | 5,7 | 3,1 | |
| Ras | 21 Kd | 16,5 | 20,9 | 9,9 | a·· |
| PpbO Stc | 62 Kd | 5,8 | 7,4 | 4,5 | |
| ERK-1 | 44 až 49 Kd | 6,5 | 5,9 | 6,4 | |
| G-protein α | 56 Kd | 5,5 | 6,3 | 7,9 | |
| G-protein β | 33 až 35 Kd | 6,2 | 6,2 | 8,0 | |
| (i-protein y | 9 Kd | o | 1Λ | 9,4 |
tabulka 7 přehled určení a distribuce tyrozinových proteinkináz v buňkách z periferní krve procent distribuce----------------- --------------
| protein- | molekulová | IL-6 plus | IL-10 plus | IL-13 plus | nosíc |
| kináza | váhá | HK-X | HK-X | HK-X | |
| . PLGy. | 150 Kd | 5,0 | 3,8 | 11,2 | 5.8 |
| PI 3 kináza | 102 Kd | 3,5 | 3,4 | 13,3 | |
| PI 3 kina/a | 83 Kd | 4,3 | 5,7 | 7,2 | SBI8 |
| 65 až 68 Kd | 6,7 | 2,6 | 5,7 | ||
| Ras | 21 Kd | 17,6 | 15,8 | 9,8 | |
| Pp60 Src | 62 Kd | 6,7 | 4,7 | 4,4 | Μ |
| ERK-1 | 44 až 49 Kd | 8,9 | 8,8 | 6,9 | |
| G-protein α | 56 Kd | 8,7 | 8,1 | 4,9 | |
| G-protein β | 33 až 35 Kd | 6,6 | 8,5 | 5,2 | lllllB |
| G-protein y | 9 Kd | £4 | iLi | X4 | 6J |
V průběhu stimulace buněk, zaměřené na receptory formylpeptidů, nastává množství důležitých jevů. Ty zahrnují:
• ·
A. Po navázání FMLP nebo jiného analogu FPR interaguje s G-proteinovým poolem, což je společné jiným chemoatraktantovým receptorům, jako jsou LTB4 a C5a receptory (Jacobs et al., J. Leukoc. Biol. 57: 679-686, 1995; McLeish et al., Mol. Pharm. 36: 384-390).
B. Následující stimulací FMLP nebo jinými chemoatraktanty se buňky staly odolné vůči další nebo následné odezvě na stejné nebo jiné chemoatraktanty. Jestliže je odolnost nebo inaktivace receptorů indukována jedním stimulantem a působí na četné receptory bez ligandu, je tato situace heterologní snížení citlivosti. Spekulovalo se, že tato forma snížení citlivosti může pocházet od fosforylace receptorů bez ligandu pokračováním aktivovaných kináz, jako s FCsR receptorem·
C. IL-8, C5a a FMLP snižují citlivost svým receptorům navzájem. Tyto studie byly rozšířeny o zahrnutí PAF a LTB4 receptorů. Mechanismy, kterým může být tento proces zahájen, zahrnují fosforylaci PKC. Nicméně FPR neobsahuje intracelulární domény, schopné být fosforylovány PKC, ale zdá se, že je za to odpovědná jiná kináza.
D. Snížení citlivosti pokračováním FPR odpovědí nastává při absenci FPR fosforylace.
Samotné ošetření HK-X specificky nesnižuje regulaci kináz. G-protein γ kináza byla selektivně a významně snížena po současné stimulaci mononukleárních buněk HK-X a IL-8 nebo HK-X a FMLP. Tyto pozorování naznačují následující mechanismus účinku HK-X, který je popsán níže.
HK-X a účinné prozánětlivé molekuly, jako je IL-8 a FMLP, mohou být přítomny společně. Nastává snížení regulace jedné části z trimerického G-proteinkomplexu. Přesněji byla za podmínek ustáleného stavu snížena G-protein γ fosforylace. Proto se HK-X v přítomnosti IL-8 nebo FMLP zdá, že iniciuje snížení citlivosti receptorů tak, že buď přímo nebo nepřímo inhibuje fosforylaci G-protein γ podjednotky.
Z dat, zveřejněných zde a v dřívějších sděleních, může být utvořeno množství závěrů. Jsou to:
1. HK-X vykazuje specifítu pro buňky schopné odpovědi na prozánětlivé stimuly, zprostředkované specifickými pro zánětlivými receptory.
2. Jestliže HK-X je udržováno v systému v průběhu prozánětlivých jevů, může HK-X udržovat snížení citlivosti silně reagujících buněk.
3. Použitím in vitro kultivačního systému, jak je popsáno v této zprávě, mohou být pro citlivost k účinku HK-X vybrány jiné cílové buňky a jiné prozánětlivé mediátory.
• · ♦ · · · · ···· • · ····· · · · • · ···· ··· ······· ·· ·· ·* ····
Může být tak použita jednoduchá cesta k rychlému prověření potenciálních léčebných účinků a ke stanovení vytyčení léčby.
Částečně se jeví, že léčebná účinnost HK-X je způsobena díky snížení citlivosti prozánětlivých mediátorových receptorů. Pokračování tohoto jevu je zprostředkováno inaktivací prozánětlivých buněk a provedeno buď přímo nebo nepřímo inhibici fosforylace G-protein γ podjednotky.
Předkládaný vynález byl popsán v detailech, které zahrnují jeho upřednostňované části. Nicméně uznává se, že odborníci v oboru ho mohou pozměňovat a zlepšovat v duchu a rozsahu vynálezu, jak je vyložen v nárocích.
• ·
Claims (35)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Receptorový komplex, vyznačuj ící se tím, že obsahuje modifikační činidlo Gproteinkinázové signální dráhy a buněčný povrchový receptor lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleámích nukleráních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, které byly stimulovány prozánětlivým činidlem.
- 2. Receptorový komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že lidské mononukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z lymfocytů a monocytů nebo polymorfonukleámí buňky jsou vybrány z eozinofilů a bazofilů.
- 3. Receptorový komplex podle nároku 1,vyznačující se tím, že fixované tkáňové buňky jsou vybrány z mastocytů, dentritických buněk, astrocytů a makrofágů.
- 4. Receptorový komplex podle nároku 1,vyznačující se tím, že modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu.
- 5. Receptorový komplex podle nároku 1,vyznačující se tím, že modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe.
- 6. Receptorový komplex podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že prozánětlivé činidlo je vybráno z cytokinů, chemokinů, chemotaxinů a mitogenů.
- 7. Receptorový komplex podle nároku 1, vy zn a č u j í c í se t í m, že prozánětlivé činidlo je vybráňo z fMLP, aktivovaného, komplementárního fragmentu, leukotrienu B4 a destičkového aktivačního faktoru nebo IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 a TNFa.
- 8. Způsob určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy, vyznačující se t í m, že způsob obsahuje kroky:a) kontakt prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, se známým prozánětlivým mediátorem, vybraným ze skupiny, která se skládá z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů, a vyvolává prozánětlivou odpověď;• ·b) přidání ke kroku a) kandidáta modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy;ac) detekce poklesu nebo vzrůstu množství regulující G-proteikinázy v (i) prozánětlivých mediátorových buňkách, současně kontaktovaných s uvedeným kandidátem na činidlo a uvedeným prozánětlivým mediátorem, porovnaný s (ii) prozánětlivými mediátorovými buňkami, kontaktovanými se samotným prozánětlivým meditátorem.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že prozánětlivé činidlo je vybráno z fMLP, aktivovaného komplementárního fragmentu, leukotrienu B4 a destičkového aktivačního faktoru nebo IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 a TNFa.
- 10. Buněčný povrchový receptorový komplex, ,vyznačuj ící se tím, že obsahuje modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy navázané na receptor na povrchu prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, čímž je zajištěna inhibice prozánětlivé buněčné odpovědi na prozánětlivé činidlo.
- 11. Způsob určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy, vyznačující se t i m, že uvedený způsob obsahuje kroky:kontakt prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, s kandidátem modifikačního činidla G-proteinové signální dráhy; a určení distribuce proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde ve srovnání s buňkami nekontaktovanými kandidátem modifikačního činidla Gproteinové signální dráhy nebyl rozdíl v množství PLCy, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a Gprotein β kináz.
- 12. Buněčný povrchový receptorový komplex, vyznačující se tím, že obsahuje: buněčný povrchový receptor lidských mononukleráních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve a modifikační činidlo G-proteinové signální dráhy, • · · · kde ve srovnání s buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, je distribuce proteinkináz v buňkách taková, že není rozdíl v množství PLCY, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a G-protein β kináz.
- 13. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, že buněčný povrchový receptor je FPR receptor.
- 14. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, že stimulace IL-4 lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLCY, PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Ras a G-protein γ kinázy.
- 15. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, vyznačující se tím, že stimulace prozánětlivým činidlem IL-13 lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLCY, PI3 (113 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, Pp60 Src, G-protein a a G-protein β kináz.
- 16. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, vyznačující se tím, že stimulace prozánětlivým činidlem, C5a, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PI3 (83 Kd) a Raf a pokleslo množství PLCY, PI3 (113 Kd), G-protein a a G-protein β kináz.
- 17. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, že stimulace prozánětlivým činidlem, TNFa, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které • « • · • · nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství Raf, ERK.-1, Ras, G-protein ot, G-protein β a G-protein γ kináz a pokleslo množství PLCY, PI3 (113 Kd) a PpóOSrc kináz.
- 18. Použití modifikačního činidla pro přípravu léčiva pro inhibici prozánětlivé odpovědi lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleámích buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, jestliže jsou v kontaktu s prozánětlivým činidlem.
- 19. Použití podle nároku 1, ve kterém lidské mononukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z lymfocytů a monocytů nebo polymorfonukleární buňky jsou vybrány z granulocytů.
- 20. Použití podle nároku 1, ve kterém lidské mononukleámí nebo polymorfonukleární buňky z periferní krve jsou vybrány z eozinofilů, bazofilů a aktivovaných T-buněk.
- 21. Použití podle nároku 1, ve kterém fixované tkáňové buňky jsou vybrány z mastocytů, dentritických buněk, astrocytů nebo makrofágů.
- 22. Použití podle nároku 1, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybráno z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů.
- 23. Použití podle nároku 1, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybráno z fMLP, aktivovaného komplementárního fragmentu, leukotrienu B4, destičkového aktivačního faktoru, IL-4, IL6, IL-8, IL-10, IL-13 aTNFa.
- 24. Použití podle nároku 1, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je peptid f-Met-Leu.
- 25. Použití podle nároku 1, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe.
- 26. Použití komplexu buněčného povrchového receptoru s modifikačním činidlem Gproteinové signální dráhy pro přípravu léčiva pro inhibici prozánětlivé odpovědi lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, jestliže jsou v kontaktu s prozánětlivým činidlem.
- 27. Použití podle nároku 26, ve kterém buněčný povrchový receptor je formylpeptidový receptor.
- 28. Použití podle nároku 26, ve kterém prozánětlivá odpověď zahrnuje inhibici následných receptorů, kde přívodní receptor je FC receptor, což je receptor pro činidlo, vybrané z imunoglobulinů, cytokinů, vybraných ze skupiny, která se skládá z IL-4, IL-6, IL-8, IL10, IL-13 a TNFa nebo chemokinů, vybraných ze skupiny, která se skládá z C5a, FMLP, PAF, LTB4.
- 29. Použití podle nároku 26, ve kterém lidské mononukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z lymfocytů a monocytů nebo polymorfonukleámí buňky jsou vybrány z eozinofilů a bazofilů.
- 30. Použití podle nároku 26, ve kterém lidské mononukleámí nebo polymorfonukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z eozinofilů, bazofilů a aktivovaných T-buněk.
- 31. Použití podle nároku 26, ve kterém fixované tkáňové buňky jsou vybrány z mastocytů, dentritických buněk, astrocytů nebo makrofágů.
- 32. Použití podle nároku 26, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybráno z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů.
- 33. Použití podle nároku 26, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybránoz fMLP, aktivovaného komplementárního fragmentu, leukotrienu B4, destičkového aktivačního faktoru, IL-4, IL6, IL-8, IL-10, IL-13 aTNFa.
- 34. Použití podle nároku 26, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu.
- 35. Použití podle nároku 26, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15967799P | 1999-10-15 | 1999-10-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021342A3 true CZ20021342A3 (cs) | 2003-01-15 |
Family
ID=22573520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021342A CZ20021342A3 (cs) | 1999-10-15 | 2000-10-12 | Receptorový komplex, buněčný povrchový receptorový komplex a jejich pouľití |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1222199A4 (cs) |
| JP (1) | JP2004507441A (cs) |
| KR (1) | KR20020057972A (cs) |
| CN (1) | CN100497374C (cs) |
| AU (1) | AU8014200A (cs) |
| BR (1) | BR0014742A (cs) |
| CA (1) | CA2387559A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20021342A3 (cs) |
| EA (1) | EA200200451A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0203688A2 (cs) |
| IL (1) | IL149125A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02003782A (cs) |
| NO (1) | NO20021732L (cs) |
| PL (1) | PL356096A1 (cs) |
| WO (1) | WO2001029069A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200202937B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8680059B2 (en) | 1998-05-20 | 2014-03-25 | Biotempt B.V. | Oligopeptide acetate and formulations thereof |
| EP1138692A1 (en) | 2000-03-29 | 2001-10-04 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator |
| US6844315B2 (en) | 1998-05-20 | 2005-01-18 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Immunoregulator |
| US20030220258A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-11-27 | Robbert Benner | Treatment of ischemic events |
| US7358330B2 (en) | 2001-03-29 | 2008-04-15 | Biotempt B.V. | Immunoregulatory compositions |
| USRE43279E1 (en) | 2000-03-29 | 2012-03-27 | Biotemp B.V. | Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration |
| EP1300418A1 (en) * | 2001-10-04 | 2003-04-09 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Gene regulation by oligopeptides |
| US7560433B2 (en) | 2001-12-21 | 2009-07-14 | Biotempt B.V. | Treatment of multiple sclerosis (MS) |
| US7786084B2 (en) | 2001-12-21 | 2010-08-31 | Biotempt B.V. | Treatment of burns |
| US20070116687A1 (en) * | 2003-05-13 | 2007-05-24 | Medvet Science Pty, Ltd. | Method of modulating cellular transmigration and agents for use therein |
| WO2007004869A2 (en) | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Biotempt B.V. | Treatment of tumors |
| EP1864692A1 (en) | 2006-06-07 | 2007-12-12 | Biotempt B.V. | Use of peptides for the control of radiation injury |
| WO2011036308A1 (en) * | 2009-09-28 | 2011-03-31 | Theramab Gmbh | Method for preclinical testing of immunomodulatory drugs |
| CN115466306B (zh) * | 2022-01-25 | 2025-06-27 | 香港中文大学（深圳） | 一种靶向细胞膜表面甲酰肽受体的多肽、药物组合物及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999025372A1 (en) * | 1997-11-13 | 1999-05-27 | Histatek, Llc | Small peptides and methods for treatment of asthma and inflammation |
-
2000
- 2000-10-12 PL PL00356096A patent/PL356096A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-10-12 HU HU0203688A patent/HUP0203688A2/hu unknown
- 2000-10-12 KR KR1020027004714A patent/KR20020057972A/ko not_active Ceased
- 2000-10-12 JP JP2001531867A patent/JP2004507441A/ja active Pending
- 2000-10-12 MX MXPA02003782A patent/MXPA02003782A/es not_active Application Discontinuation
- 2000-10-12 EP EP00970817A patent/EP1222199A4/en not_active Withdrawn
- 2000-10-12 IL IL14912500A patent/IL149125A0/xx unknown
- 2000-10-12 CZ CZ20021342A patent/CZ20021342A3/cs unknown
- 2000-10-12 EA EA200200451A patent/EA200200451A1/ru unknown
- 2000-10-12 AU AU80142/00A patent/AU8014200A/en not_active Abandoned
- 2000-10-12 CA CA002387559A patent/CA2387559A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-12 BR BR0014742-7A patent/BR0014742A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-10-12 CN CNB008156867A patent/CN100497374C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-12 WO PCT/US2000/028183 patent/WO2001029069A1/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-04-12 NO NO20021732A patent/NO20021732L/no not_active Application Discontinuation
- 2002-04-15 ZA ZA200202937A patent/ZA200202937B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL356096A1 (en) | 2004-06-14 |
| KR20020057972A (ko) | 2002-07-12 |
| MXPA02003782A (es) | 2002-12-13 |
| EA200200451A1 (ru) | 2002-10-31 |
| EP1222199A1 (en) | 2002-07-17 |
| WO2001029069A1 (en) | 2001-04-26 |
| NO20021732L (no) | 2002-06-12 |
| EP1222199A4 (en) | 2003-03-12 |
| CA2387559A1 (en) | 2001-04-26 |
| JP2004507441A (ja) | 2004-03-11 |
| CN100497374C (zh) | 2009-06-10 |
| HUP0203688A2 (hu) | 2003-02-28 |
| CN1633447A (zh) | 2005-06-29 |
| ZA200202937B (en) | 2003-09-23 |
| NO20021732D0 (no) | 2002-04-12 |
| BR0014742A (pt) | 2002-08-27 |
| IL149125A0 (en) | 2002-11-10 |
| AU8014200A (en) | 2001-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Postlethwaite et al. | Stimulation of fibroblast chemotaxis by human recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and a synthetic TNF-alpha 31-68 peptide. | |
| US7566767B2 (en) | Synthetic peptides and methods of use for autoimmune disease therapies | |
| US5698518A (en) | Method for regulating inflammation and tumor growth with calmodulin, calmodulin analogues or calmodulin antagonists | |
| Bursten et al. | Acylation of monocyte and glomerular mesangial cell proteins. Myristyl acylation of the interleukin 1 precursors. | |
| AU773350B2 (en) | Methods and compositions for modulating an immune response | |
| PT719331E (pt) | Eotaxina-citocina quimiotáctica de eosinófilos | |
| JP2004507441A (ja) | Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質とｎ−ホルミルペプチド受容体との複合体 | |
| JP3127996B2 (ja) | 合成老化細胞抗原 | |
| US7569229B2 (en) | Monocyte locomotion inhibitory factor | |
| Wu et al. | On the identity of the major postsynaptic density protein. | |
| Rosenbaum et al. | Monocyte chemotactic activity induced by intravitreal endotoxin. | |
| JP4071830B2 (ja) | 免疫グロブリン受容体相互作用の阻害剤を含んでいる医薬組成物 | |
| Xu et al. | The effects of intrathecal galanin message-associated peptide (GMAP) on the flexor reflex in rats | |
| WO1996011700A1 (en) | Reduction of mammalian neoplasms with phospholipase a2 activatiing substances | |
| WO1993011784A1 (en) | Methods for inhibition or stimulation of the inflammatory response | |
| Rita et al. | Effects of synthetic peptides on the inflammatory response and their therapeutic potential | |
| WO2007096388A1 (en) | Polypeptides, pharmaceutical compositions and methods for the prevention and the therapeutic treatment of inflammatory disorders | |
| US20030050249A1 (en) | Complexes of alpha-6 integrin subunits with small peptides and methods for treating indications resulting from modulation of integrin-mediated responses by altering signal transduction | |
| JP3025002B2 (ja) | Ｄｎａ、ポリペプチド、抗体、およびそれらの用途 | |
| JP2002509080A (ja) | グラモストラ・スパチュラタの毒から得られる鎮痛性ペプチドおよびその使用 | |
| AU2001264892A1 (en) | Modulaton of alpha-6 integrin-mediated responses | |
| WO1998020347A1 (en) | Assay for lipopolysaccharide antagonists | |
| Finkielstein et al. | Characterization of the cDNA corresponding to a phosphofrotein (p43) intermediary in the action of acth. | |
| Nagaune et al. | Cell Growth Regulatory Peptides from Bovine Casein | |
| JPH08511941A (ja) | ヒト細胞接着性タンパク質ａａｍｐ‐１及びその利用 |