PT719331E - Eotaxina-citocina quimiotáctica de eosinófilos - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "EOTAXINA=CITOCINA QUIMIOTÁCTICA DE EOSINÓFILOS" A presente invenção refere-se a uma citocina quimiotáctica. A acumulação de leucócitos eosinófilos é uma propriedade caracteristica de reacções alérgicas mediadas por IgE, tais como asma alérgica, renite e eczema. A acumulação de eosinófilos também ocorre em asma não alérgica. A broncoconstrição imediata em resposta a um estimulo provocador no asmático envolve a activação de mastócitos e a libertação de mediadores de constrição. Isto é seguido, após várias horas em alguns indivíduos, por uma resposta broncoconstritora tardia, associada a um influxo massivo de eosinófilos (1). A provocação repetida resulta em inflamação crónica nas vias respiratórias e uma marcada hiper-capacidade de resposta aos mediadores de constrição. A magnitude tanto da resposta tardia como da hiper-capacidade de resposta crónica está correlacionada com os números de eosinófilos presentes no pulmão (2,3). A presente invenção proporciona uma proteína quimioatractiva capaz de atrair eosinófilos e de induzir a acumulação de eosinófilos e/ou a activação in vitro e in vivo. A proteína quimioatractiva da presente invenção é designada "eotaxina".
Em maior detalhe, de acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionada uma proteína quimioatractiva isolada, capaz de atrair eosinófilos e de induzir a acumulação de eosinófilos e/ou a activação in vitro e in vivo e que não 1 apresente substancialmente nenhum efeito de atracção de neutrófilos in vivo, consistindo em, ou compreendendo, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 40% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°. 1, ou um fragmento da referida proteína quimioatractiva, que retém as suas actividades biológicas.
As eotaxinas são proteínas do ramo C-C do factor 4 das plaquetas de citocinas quimiotácticas. No ramo C-C da superfamília do factor 4 das plaquetas das citocinas quimiotácticas, ou quimiocinas, certos membros possuem a propriedade de atrair eosinófilos in vitro e alguns podem induzir a acumulação de eosinófilos in vivo. Por exemplo, as quimiocinas RANTES e ΜΙΡ-Ια atraem eosinófilos in vitro, enquanto que MCP-1 e MIP-Ιβ não o fazem. ("RANTES" significa Regulado após Activação em células T Normais Expressas e Secretadas, "MIP" significa Proteína Inflamatória de Macrófago, e "MCP" significa Proteína Quimioatractiva de Monócito.)
As citocinas que ocorrem naturalmente na superfamília do factor 4 de plaquetas de citocinas quimiotácticas podem possuir marcada inter a sequência de aminoácidos da proteína, e na modificação de hidratos de carbono da proteína, embora retendo as mesmas propriedades funcionais características. Podem ocorrer variações semelhantes na estrutura nas citocinas obtidas a partir de indivíduos diferentes dentro da mesma espécie. Muitas quimiocinas no ramo C-C da superfamília do factor 4 das plaquetas mostram promiscuidade de ligação ao receptor e a capacidade de diferentes quimiocinas para se ligarem ao mesmo receptor não está necessariamente dependente de um grau elevado de homologia ao nível dos aminoácidos. Consequentemente, são geralmente esperadas tanto variações inter-espécie como intra- 2 espécie no comprimento da proteína, sequência de aminoácidos e modificações de hidratos de carbono, para as eotaxinas. A capacidade para atrair eosinófilos e para induzir a acumulação de eosinófilos e/ou activação in vitro e in vivo é uma propriedade característica das eotaxinas. Além disso, as eotaxinas não apresentam geralmente substancialmente nenhum efeito atractivo para os neutrófilos in vivo. 0 efeito quimioatractivo de eosinófilos pode ser um efeito inter-espécie, por exemplo, a eotaxina de porquinho da índia parece ser potente na indução de quimiotaxia de eosinófilos humanos in vitro.
Uma eotaxina pode ser obtida a partir de um fluido corporal apropriado, por exemplo um fluido de lavagem broncoalveolar, obtido de um sujeito humano ou não humano, particularmente um sujeito alérgico após uma exposição a um alergénio, quer induzido experimentalmente ou de ocorrência natural. Outras fontes de eotaxinas são, por exemplo, fluidos de exsudado inflamatório e culturas in vitro de macrófagos, linfócitos, neutrófilos, mastócitos, células epiteliais das vias respiratórias, células de tecido conjuntivo, células endoteliais vasculares e os próprios eosinófilos.
Por exemplo, uma eotaxina pode ser obtida a partir de um porquinho da índia sensibilizado após exposição a alergénio. Os modelos de porquinho da índia são úteis, na medida em que partilham muitas caracteristicas comuns com a resposta asmática no homem. A eotaxina que se pode obter do fluido de lavagem broncoalveolar de um porquinho da índia sensibilizado por purificação por HPLC sequencial possui geralmente um peso molecular no intervalo de 6-16 kDa. (Como indicado acima, as variações de peso molecular intra-espécie desta ordem de 3 grandeza são observadas em membros da superfamília do factor 4 de plaquetas).
Assim, de acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionado um processo para a produção de uma proteína quimioatractiva da presente invenção que compreende isolar uma fracção do fluido de lavagem broncoalveolar, ou um exsudado inflamatório obtido de um animal humano ou não humano exposto a um estímulo provocador, em que a referida fracção demonstra actividade quimioatractiva para eosinófilos in vitro e in vivo e que não apresenta substancialmente nenhum efeito atractivo para neutrófilos in vivo.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um processo para a produção de uma proteína quimioatractiva da presente invenção, que compreende cultivar in vitro macrófagos, linfócitos, neutrófilos, mastócitos, células epiteliais das vias respiratórias, células de tecido conjuntivo, células endoteliais vasculares ou eosinófilos obtidas a partir de um animal humano ou não humano e isolar das células ou do fluido de cultura celular uma fracção que demonstra actividade quimioatractiva de eosinófilos in vitro e in vivo e que não apresenta substancialmente nenhum efeito atractivo para neutrófilos in vivo. A sequência de aminoácidos de uma eotaxina de porquinho da índia é apresentada em SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2 e nas Figuras 7 e 8 dos desenhos acompanhantes. Outras eotaxinas de porquinho da índia possuirão geralmente pelo menos 40% ou 50% de homologia global com a listagem de sequências apresentada em SEQ ID N°. 1 (Figura 7) ao nível dos aminoácidos. A homologia pode ser de pelo menos de 60%, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo 4 menos 80% com a sequência apresentada na SEQ ID N°. 1 e na Figura 7. A percentagem de homologia no presente caso é calculada com base nos aminoácidos que são idênticos nas posições correspondentes nas duas sequências sob investigação. As substituições conservadoras não são tomadas em consideração. No cálculo da percentagem de homologia de uma molécula de eotaxina putativa sob investigação com a sequência apresentada na SEQ ID N°. 1 (Figura 7), ou com SEQ ID N°. 2 (Figura 8) se a molécula sob investigação possui um comprimento diferente da eotaxina apresentada na SEQ ID N°. 1, ou SEQ ID N°. 2 (Figura 7 ou Figura 8) , então o cálculo baseia-se nos aminoácidos na porção da molécula sob investigação que se sobrepõe à sequência apresentada em SEQ ID N°. 1 (Figura 7) ou SEQ ID N°. 2 (Figura 8) . Programas informáticos para o alinhamento de sequências de aminoácidos e para o cálculo de homologia estão disponíveis comercialmente, por exemplo, o programa "Bestfit" disponível de Genetics Computer Group Sequence Analysis Software, Madison Wisconsin, EUA.
Salvo especificação em contrário, os valores específicos de percentagem de homologia entre eotaxina e outras citocinas quimiotácticas dadas na presente especificação foram calculadas com base na eotaxina apresentada na SEQ ID N°. 1 (Figura 7).
Como indicado acima, as eotaxinas que se podem obter a partir de outras espécies sem serem porquinhos da índia, por exemplo humanos, irão exibir diferenças inter-espécies do tipo demonstrado por outros membros do ramo C-C da superfamília das quimiocinas do factor 4 das plaquetas, por exemplo, diferenças no comprimento da proteína, sequência de aminoácidos e 5 modificações de carbo-hidratos. Podem ser, por exemplo, variações nos residuos C- e/ou N-terminais. Por exemplo, espera-se que o peso molecular de uma eotaxina de uma espécie diferente de porquinhos da índia cairá geralmente dentro do intervalo desde 6 kDa até 16 kDa, mas em alguns casos, uma eotaxina pode possuir um peso molecular inferior a 6 kDa ou mais do que 16 kDa.
De um modo semelhante, espera-se que, em geral, uma eotaxina de uma espécie diferente de porquinhos da índia terá pelo menos 40% de homologia qlobal com a sequência apresentada em SEQ ID N° 1 e na Figura 7. A homologia pode ser pelo menos de 50%, por exemplo pelo menos 60%, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 80% com a sequência apresentada em SEQ ID N° 1 e na Figura 7. Podem existir, todavia, eotaxinas de espécies diferentes de porquinhos da índia que possuem pelo menos 40% de homologia com SEQ ID N° 1 (Figura 7).
As eotaxinas podem ser identificadas através de qualquer uma, ou mais, das caracteristicas apresentadas acima, em particular pela sua capacidade para atrair e/ou activar eosinófilos in vitro e provocam a sua acumulação e/ou activação in vivo. Uma caracteristica que assiste à identificação de uma molécula como uma eotaxina é a falta de efeito atractivo nos neutrófilos. A presente invenção proporciona um método para determinar a capacidade de uma substância para induzir a acumulação de eosinófilos e/ou a activação in vivo, o mesmo é dizer, um método para testar eotaxina putativas, que compreende administrar a substância, geralmente intradermicamente, a um animal de teste previamente tratado com eosinófilos marcados com, por exemplo 6 marcados com 1UI e subsequentemente determinar o número de eosinófilos marcados num sítio da pele.
Um método in vitro que pode ser utilizado para testar uma eotaxina putativa quanto à capacidade para atrair e/ou activar eosinófilos in vitro é a capacidade das substâncias para aumentarem os níveis de cálcio intracelular nos eosinófilos. Podem ser utilizados outros métodos gerais para determinar actividade quimiotáctica in vitro para testar eotaxinas putativas in vitro. A confirmação de que um atractor de eosinófilo é uma eotaxina pode também ser realizada em consideração à homologia de sequências dessa proteína com a sequência apresentada na SEQ ID N°.l (Figura 7) e/ou com a sequência apresentada na SEQ ID N°. 2 (Figura 8) e/ou em consideração com a relação estrutural entre a proteína e a eotaxina de porquinho da índia.
Como mencionado acima, RANTES e ΜΙΡ-Ια são ambos activadores de eosinófilo. A eotaxina possui semelhanças funcionais mas baixa homologia estrutural com RANTES e ΜΙΡΙα (31% de homologia com ΜΙΡ-Ια ao nível do aminoácido calculado com base na SEQ ID N°. 1 (Figura 7); 32% de homologia quando calculado com base nas sequências sobreponíveis e 26% de homologia com RANTES ao nível dos aminoácidos calculada com base na SEQ ID N°. 1 (Figura 7); 27% de homologia quando calculado com base nas sequências sobreponíveis). Uma eotaxina pode ser distinguida de RANTES e ΜΙΡ-Ια não apenas pelo grau de homologia, mas também pelas diferenças globais na sequência e estrutura.
Adicionalmente a moléculas de eotaxina de comprimento total, a presente invenção também proporciona moléculas que compreendem 7 menos do que uma sequência de eotaxina de comprimento total. Tais moléculas (aqui denominadas "fragmentos") podem ser polipéptidos ou péptidos. Para utilização como um substituto de eotaxina, um fragmento pode reter uma ou mais actividades biológicas da molécula de origem.
Os eosinófilos contêm uma armadura de quimicos necessária para matar parasitas. Estes quimicos foram implicados na lesão do epitélio das vias respiratórias que ocorre na asma e podem estar relacionados com as alterações observadas na função respiratória (26, 27). A partir dos estudos dos requerentes, foi sugerido que as eotaxinas devam ser consideradas como mediadores importantes da acumulação de eosinófilos in vivo. Os macrófagos, linfócitos, neutrófilos, mastócitos, células epiteliais das vias respiratórias, células de tecido conjuntivo, células do endotélio vascular e os próprios eosinófilos são candidatos prováveis como a fonte de actividade quimioatractiva de eosinófilos geradas no pulmão. As plaquetas também podem ter um papel como tem sido demonstrado que elas podem libertar quimiocinas C-C (22). Além disso, um depósito de plaquetas precoce pode estar envolvido na acumulação subsequente de eosinófilos in vivo (28, 29) e existem evidência de que o factor de activação de plaquetas induz a sintese de um quimioatractivo de eosinófilos não identificado in vivo (30). A este respeito, tem interesse que o factor de crescimento derivado de plaquetas possa induzir a expressão genética de quimiocinas C-C em fibroblastos (31). Além disso, as quimiocinas C-C foram implicadas na cura de feridas (18) . Isto pode ser importante na fibrose da membrana da base sub-epitelial, que é uma caracteristica proeminente do pulmão asmático. Assim, as eotaxinas podem estar envolvidas tanto na acumulação de eosinófilos como nas alterações estruturais crónicas no pulmão. 8
As eotaxinas podem possuir um papel importante na asma e outras doenças possuindo um componente inflamatório em que a acumulação e/ou activação de eosinófilos é uma caracteristica proeminente, por exemplo renite e eczema, especialmente eczema alérgico. Consequentemente, os agentes que inibem ou, de outro modo, impedem a produção, libertação ou acção de eotaxinas têm potencial como agentes terapêuticos selectivos. Esses agentes e a sua utilização terapêutica são aqui descritos.
Esses agentes incluem inibidores que afectam a interacção de uma eotaxina com receptores de eotaxina, por exemplo, através da ligação a uma eotaxina ou a um receptor de eotaxina. Um exemplo desse inibidor é, os próprios receptores que, após administração, se podem ligar a uma eotaxina e prevenir a sua interacção com receptores que ocorrem naturalmente. Esses receptores inibidores podem ser solúveis ou insolúveis. Os receptores que não estão envolvidos na activação celular podem ser ligados a, ou induzidos em, células. Esses receptores também podem ser utilizados para remover eotaxina endógena.
Outros exemplos que afectam a interacção de eotaxinas com receptores de eotaxina são antagonistas receptores e anticorpos, tanto anticorpos dirigidos contra (capazes de se ligar a) uma eotaxina, como anticorpos dirigidos contra um receptor de eotaxina, especialmente anticorpos monoclonais. Qualquer outro agente que iniba, ou de outro modo impeça a ligação de uma eotaxina a um receptor de eotaxina, também possui potencial terapêutico, por exemplo, qualquer outro agente que se ligue a uma eotaxina ou a um receptor de eotaxina. Outros agentes que possuem potencial terapêutico são aqueles que previnem ou reduzem a activação de receptores de eotaxina. 9
Assim, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um anticorpo que se liga especificamente à proteína quimioatractiva, como reivindicado na invenção.
Assim, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionada a utilização de um anticorpo como reivindicado na invenção, para a preparação de um medicamento para o tratamento de asma ou outra doença inflamatória.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma preparação farmacêutica que compreende, como ingrediente activo, um anticorpo como reivindicado na invenção, em mistura ou em conjunção com um veículo farmaceuticamente adequado. Outros agentes que inibem ou, de outra forma, impedem a acção de eotaxinas são aqueles que alteram a estrutura de uma eotaxina, de modo a que não seja capaz de se ligar a um receptor de eotaxina, por exemplo uma enzima ou outro agente que degrade especificamente a eotaxina. A promiscuidade de receptores é comum entre quimiocinas, por isso, embora seja essencial que o receptor seja capaz de se ligar a uma eotaxina, o receptor não necessita de ser necessariamente específico para a eotaxina. Por exemplo, um receptor pode ligar-se a ΜΙΡ-Ια, RANTES e/ou quimiocinas atractivas de eosinófilos, bem como uma eotaxina.
Como indicado acima, as possibilidades para intervenção terapêutica incluem a utilização de um receptor ao qual uma eotaxina se liga, especialmente um receptor solúvel. Pode ser vantajoso utilizar um receptor específico para eotaxina. Outras possibilidades para intervenção terapêutica incluem antagonistas 10 receptores, por exemplo com base nas estruturas tridimensionais ou nas sequências de aminoácidos de eotaxinas e/ou receptores de eotaxina e agentes que se observou inibirem a eotaxina ou outros agonistas que se ligam a, ou activam, receptores de eotaxina.
Por exemplo, um antagonista receptor ou um inibidor agonista pode ser um polipéptido no qual a sequência de uma eotaxina que ocorre naturalmente, de comprimento total foi modificada, por exemplo por substituição de aminoácidos, ou pode ser um fragmento de uma eotaxina (o que é dizer, um polipéptido ou péptido pequeno compreendendo parte da sequência de aminoácidos de uma eotaxina que ocorre naturalmente), ou um fragmento modificado de uma eotaxina, por exemplo modificada por substituição de aminoácidos.
Além disso, o conhecimento de uma sequência e/ou estrutura de eotaxinas, quer isoladamente ou em combinação com o conhecimento da sequência e/ou estrutura de outras quimiocinas que se ligam ao (s) mesmo(s) receptor (es) como eotaxinas, proporciona informação útil para a concepção de agentes terapêuticos.
Os agentes que previnem ou inibem a sintese de eotaxina ou libertação também podem ser utilizados terapeuticamente. Esses agentes e a sua utilização também são aqui descritos.
Todos os inibidores de actividade, sintese e libertação de eotaxina, incluindo receptores solúveis, anticorpos, antagonistas e inibidores de ligação de agonista e a sua utilização são aqui descritos.
Consequentemente, é descrito um agente que inibe, ou de outro modo impede, a produção, libertação ou acção de uma 11 eotaxina, especialmente um agente como acima, para utilização como um medicamento. A invenção também proporciona a utilização de um agente que inibe, ou de outro modo impede, a produção, libertação ou acção de uma eotaxina, especialmente um agente como descrito acima, no fabrico de um medicamento para o tratamento de asma, ou outra doença possuindo um componente inflamatório, particularmente com acumulação de eosinófilos, por exemplo renite ou eczema, especialmente eczema alérgico. A utilização da informação estrutural e sequência relacionada com eotaxinas na concepção de agentes úteis para terapêutica e diagnóstico, por exemplo na concepção com o auxilio de computador com base na estrutura tridimensional de eotaxinas, é uma parte da presente invenção.
Inibidores putativos de actividade de eotaxina podem ser pesquisadas utilizando ensaios in vivo e in vitro com base na inibição de quimioatracção e/ou acumulação e/ou activação de eosinófilos por eotaxinas. São conhecidos alguns métodos gerais para testar a actividade de um composto para um efeito inibidor na actividade de uma citocina quimioatractiva in vitro. Esses ensaios podem ser utilizados para determinar a acção inibidora de um inibidor putativo em efeitos in vitro induzidos em eosinófilos por eotaxinas.
Os ensaios que são adequados para o rastreio de inibidores de eotaxina putativos incluem, por exemplo, inibição in vitro da elevação de níveis intracelulares de cálcio induzida nas células por eotaxina. 0 método da presente invenção para determinar a capacidade de uma substância para induzir a acumulação e/ou activação de eosinófilos in vivo, o que é dizer, também pode ser utilizado um método para testar eotaxinas putativas para 12 determinar a capacidade de uma substância para inibir a acumulação e/ou activação de eosinófilos induzida in vivo por uma eotaxina: uma animal é pré-tratado com eosinófilos marcados, são administrados uma eotaxina e um inibidor putativo e o número de eosinófilos marcados num sitio da pele são determinados subsequentemente. A eotaxina é geralmente administrada intradermicamente e o inibidor putativo pode ser administrado pela mesma via, ou por uma via diferente, por exemplo sistemicamente. São aqui descritos exemplos de ensaios in vitro e in vivo, tanto para a determinação de actividade de eotaxina como para a determinação de actividade inibidora de eotaxina. Por exemplo, o Exemplo 1 fornece um protocolo detalhado para o ensaio in vivo da presente invenção e o Exemplo 4 fornece protocolos detalhados de vários ensaios. Os ensaios aqui descritos podem ser utilizados como tal ou podem ser modificados conforme necessário. Os ensaios podem ser utilizados isoladamente ou em combinação para estabelecer actividade de eotaxina e inibidora de eotaxina. Inibidores putativos podem ser qualquer um dos tipos de moléculas descrito acima, incluindo receptores, por exemplo receptores solúveis, anticorpos e antagonistas e inibidores de ligação de agonista. Os métodos para testar inibidores de eotaxinas putativos também fazem parte da presente invenção.
Em maior detalhe de acordo com a presente invenção é proporcionado um método para testar um composto para um efeito inibidor na actividade de uma citocina quimioatractiva in vitro, caracterizada por a citocina quimioatractiva ser uma proteína quimioatractiva como reivindicado na invenção. 13 É também descrita uma preparação farmacêutica compreendendo, como ingrediente activo, um agente que inibe, ou de outra forma impede, a produção, libertação ou acção de uma eotaxina, em mistura, ou em conjunção com um veiculo farmaceuticamente adequado. Esses agentes são descritos acima e incluem, por exemplo, um inibidor de sintese ou libertação de eotaxina, um receptor de eotaxina solúvel, um antagonista receptor de eotaxina, ou um inibidor de um agonista receptor de eotaxina, um anticorpo contra eotaxina, ou um anticorpo contra um receptor de eotaxina. É também descrito um método de tratamento de asma e outras doenças inflamatórias, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um agente que inibe, ou de outro modo impede a produção, libertação ou acção de uma eotaxina. 0 agente pode ser como descrito acima, por exemplo um inibidor da sintese ou libertação de eotaxina um receptor de eotaxina solúvel, um antagonista receptor de eotaxina, ou um inibidor de um agonista receptor de eotaxina, ou um anticorpo contra eotaxina ou contra um receptor de eotaxina. São também descritos ensaios para eotaxinas e para anticorpos anti-eotaxina, especialmente imunoensaios e em particular ELISAs (ensaios de imunoabsorção ligados a enzima). A invenção proporciona, por exemplo, um imunoensaio para um antigénio, caracterizado por o antigénio ser uma eotaxina, também proporciona um imunoensaio para um anticorpo, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo anti-eotaxina. São também descritos ensaios para eotaxinas que são análogos aos imunoensaios para eotaxinas, mas que utilizam um parceiro de ligação especifica sem ser um anticorpo. Nesses ensaios de 14 parceiro de ligação especifica pode ser utilizado um receptor de eotaxina em vez de um anticorpo anti-eotaxina.
Num imunoensaio, um anticorpo anti-eotaxina pode, por exemplo, ser revestido numa superfície sólida para permitir a captura e, desse modo, a detecção da eotaxina. Um anticorpo anti-eotaxina pode ser utilizado no ensaio para a detecção de anticorpos contra eotaxina, por exemplo, num ensaio de anticorpo competitivo. Uma eotaxina marcada ou um seu derivado, por exemplo uma eotaxina recombinante ou um péptido sintético compreendendo parte da sequência de aminoácidos de uma eotaxina, pode ser utilizada num ensaio de antigénio competitivo para eotaxina, ou pode ser utilizada para revestir uma superfície sólida num ensaio de captura para anticorpos contra eotaxina. Os muito diferentes tipos do formato de ensaio estão bem descritos na literatura da técnica, ver por exemplo "ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects" Eds. Kemeny D.M. & Challacombe S.J., John Wiley, 1988. (36). Podem ser realizados, analogamente, ensaios utilizando um receptor de eotaxina em vez de um anticorpo anti-eotaxina.
Como mencionado anteriormente, a presente invenção proporciona um processo para a produção de uma eotaxina, que compreende obter fluido de lavagem broncoalveolar obtido de um animal humano ou não humano exposto a um estimulo de provocação, por exemplo de um humano que sofre de asma alérgica ou não alérgica, ou outra doença pulmonar, ou um porquinho da índia sensibilizado com uma proteina estranha e isolar uma fracção que apresenta actividade quimioatractiva de eosinófilo. Um método de isolamento de uma fracção do fluido de lavagem broncoalveolar contendo eotaxina são os sistemas de HPLC de permuta catiónica sequencial, por exclusão de tamanho e de fase reversa. A fracção 15 desejada contém geralmente um polipéptido possuindo um peso molecular no intervalo de 6-16 kDa. A pureza pode ser verificada por SDS-PAGE. Se desejado, a autenticidade da substância obtida pode ser determinada por comparação da sua sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 (Figura 7 ou Figura 8).
As eotaxinas podem ser obtidas de acordo com o processo acima a partir de outras fontes, por exemplo de fluidos de exsudado inflamatório, ou de culturas in vitro de macrófagos, linfócitos, neutrófilos, mastócitos, células epiteliais das vias respiratórias, células de tecido conjuntivo, células do endotélio vascular e os próprios eosinófilos.
Alternativamente, uma eotaxina de comprimento total, ou uma parte (fragmento) de uma eotaxina, por exemplo um polipéptido ou fragmento de péptido, pode ser produzido por síntese química, por exemplo de acordo com a técnica de Merryfield. Outro método para produzir uma eotaxina de comprimento total ou uma sua parte é através da tecnologia do ADN recombinante. Todos os métodos de produção de eotaxina são parte da presente invenção.
Para produzir um polipéptido de eotaxina de comprimento total ou um fragmento de polipéptido (ou péptido) por tecnologia de ADN recombinante, uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido é inserida num vector de expressão sob o controlo de sequências de controlo apropriadas. Pode ser então expresso um polipéptido recombinante utilizando um sistema de expressão procariota, por exemplo em E. coli, ou utilizando um sistema de células eucariotas, em que nesse caso o polipéptido resultante pode ser glicosilado. Tais técnicas são
Fritisch, E.F. e convencionais, ver por exemplo Sambrook, J., 16
Maniatis T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SPring Harbor Laboratory Press, 1989 (37).
Um ácido nucleico que codifica todo ou parte de um polipéptido de eotaxina pode ser obtido rastreando uma biblioteca preparada a partir de células adequadas, por exemplo células de porquinho da índia exposto a alergénio ou pulmão humano. 0 rastreio pode ser realizado utilizando uma sonda compreendendo as sequências caracteristicas de uma eotaxina, em particular sequências que distinguem a eotaxina de outras citocinas relacionadas, por exemplo RANTES e ΜΙΡ-Ια. Pode ser preferível utilizar uma sonda comprida, por exemplo uma sonda compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipéptido de eotaxina de comprimento total.
Alternativamente, a sequência de polipéptido de uma eotaxina pode ser utilizada para conceber iniciadores oligonucleotidicos, por exemplo iniciadores degenerados. Os iniciadores podem, por exemplo, compreender bases menos especificas na sua interacção do que as bases que ocorrem naturalmente, por exemplo pode ser utilizada inosina. Exemplos de iniciadores são as sequências de sentido 5' TGC TGT TTC CGI GTI ACI AAC AAA (SEQ.ID.NO.3) com base na sequência de aminoácidos CCFRVTNK e a sequência anti-sentido 5' CAT CTT GTC TGG CTT IAT TTC (SEQ.ID. NO.4) com base na sequência de aminoácidos EIKPDKM. Tais iniciadores podem ser utilizados para a amplificação de ARNm sujeito a 17 transcrição reversa através da reacção de polimerase em cadeia. Isto proporciona sondas de ADNc para o rastreio de bibliotecas, por exemplo como descrito acima, para isolar clones de eotaxina de comprimento total. Os iniciadores podem incluir codões escolhidos com base na preferência conhecida da espécie.
Como indicado acima, os derivados de eotaxinas que ocorrem naturalmente também são parte da presente invenção. Tais derivados incluem polipéptidos que possuem uma ou mais das seguintes modificações relativas a uma eotaxina que ocorre naturalmente: (i) alongamento ou encurtamento no terminal C; (ii) alongamento ou encurtamento no terminal N; (iii) deleção e/ou inserção de sequências internas; (iv) substituições de aminoácidos, por exemplo no terminal C- e/ou N-; e (v) um padrão diferente de glicosilação. (Existe, por exemplo, um potencial sitio de O-glicosilação no residuo 70).
Tais derivados podem funcionar como agonistas para estudos de relação estrutura/actividade, ou como antagonistas de receptor.
Podem ser produzidos anticorpos anti-eotaxinas e anticorpos de receptor anti-eotaxina, tanto policlonais como monoclonais, de acordo com técnicas convencionais, por exemplo Kohler & Milstein (38). Pode ser utilizada uma eotaxina de comprimento total como antigénio, ou pode ser preferida para utilizar um fragmento de uma eotaxina de modo a produzir um anticorpo contra um determinante antigénico especifico. Pode ser utilizada uma 18 eotaxina que ocorre naturalmente como um antigénio. Alternativamente, pode ser utilizada uma eotaxina recombinante ou sintética, ou polipéptido ou péptido de eotaxina. Assim, de acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um processo para preparar um anticorpo de acordo com a invenção compreendendo a utilização de uma proteína quimioatractiva de acordo com a invenção.
As Figuras 1 a 18 dos desenhos acompanhantes ilustram a presente invenção. Segue-se uma descrição breve das Figuras. Uma descrição mais detalhada das Figuras é fornecida abaixo e na secção de Exemplos desta especificação.
Figura 1: Protocolo para a criação e ensaio da actividade quimioatractiva de eosinófilos in vivo.
Figura 2: Decurso de tempo da criação da actividade quimioatractiva de eosinófilos nos pulmões de porquinhos da índia sensibilizados após a exposição ao antigénio.
As Figuras 3, 4 e 5 referem-se todas à purificação de eotaxina de fluidos de lavagem broncoalveolar (BAL):
Figura 3: perfil de HPLC de fase reversa final apresentando a absorvência a 214 nm e o gradiente de acetonitrilo.
Figura 4: Medição da actividade quimioatractiva de inIn-eosinófilo das fracções obtidas em cromatografia de HPLC. 19
Figura 5: Medição de actividade quimioatractiva de i:L1In-neutróf ilo; foi observada ausência de actividade significativa.
Figura 6: Análise de SDS-PAGE das fracções 50-56 de HPLC de fase reversa em C18.
Figuras 7 e 8: Sequências de aminoácidos de uma eotaxina de porquinho da índia isolada.
Figura 9: Comparação da sequência de eotaxina da Figura 7 com MCP-1, MCP-2, MCP-3 humana (21), MCP-1 de porquinho da índia (24), ΜΙΡ-Ια humana, MIP-Ιβ e RANTES (18) apresentando residuos conservados (sombreado).
Figura 10: Comparação da acumulação de li:LIn-eosinóf ilo in vivo utilizando eotaxina de porquinho da índia e as proteinas humanas recombinantes RANTES, ΜΙΡ-Ια e MCP-1. Figura 11 (inserção): inrbrção da lrgação de I-RANTES a eosinófilos de porquinho da índia in vitro induzida por eotaxina e RANTES, mas não por um membro do ramo C-X-C das quimiocinas, IL-8.
As Figuras 12, 13 e 14 ilustram o potencial de bloqueamento da resposta a eotaxina de porquinho da índia. Isto utiliza o facto de a RANTES humana, embora competindo com eotaxina para sitios de ligação, não activar os eosinófilos de porquinho da índia.
Figura 12: Aumento dos níveis de cálcio intracelular em
eosinófilos humanos in vitro induzido por eotaxina, RANTES e, apenas a elevada concentração, MCP-1. 20
Figura 13: Aumento dos níveis de cálcio intracelular em eosinófilos de porquinho da índia in vitro induzido por eotaxina, mas não RANTES e MCP-1 humanas.
Figura 14: vestígios representativos apresentando a inibição do aumento dos níveis de cálcio intracelulares induzido por eotaxina de porquinho da índia in vitro pela exposição prévia das mesmas células a RANTES humana. Inserção:
Figura 15: Valores (média ± SEM) para quatro preparações de eosinófilo separadas.
Figura 16: Curva de resposta à dose apresentando inibição do aumento dos níveis de cálcio intracelulares induzido por eotaxina de porquinho da índia in vitro pela exposição prévia das mesmas células a RANTES humana.
Figura 17: Histograma apresentando a comparação da resposta in vivo de eosinófilos de porquinho da índia a eotaxina, RANTES e RANTES mais eotaxina co-injectada intradermicamente.
Figura 18: Histograma apresentando o número de eosinófilos e neutrófilos no fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) após a administração de eotaxina de porquinho da índia como um aerossol para as vias respiratórias de porquinho da índia.
Como em doentes asmáticos alérgicos, a exposição de porquinhos da índia sensibilizados a antigénio aerossolizado resulta numa fase imediata de broncoconstrição com desgranulação associada de mastócitos seguida, em alguns indivíduos, por uma 21 fase tardia de broncoconstrição e hiper-capacidade de resposta das vias respiratórias (4-7). Embora claramente nenhum modelo mimetize todas as características da doença humana, o modelo de porquinho da índia partilha caracteristicas comuns com a resposta asmática no homem e foi utilizado extensivamente para investigar possiveis mecanismos (7). Em particular, tanto no porquinho da índia como no homem, a resposta imediata ao alergénio despoleta a acumulação subsequente no pulmão de números elevados de eosinófilos. As experiências foram concebidas para detectar o surgimento no pulmão de quimioatractivos que podem ser responsáveis pela acumulação de eosinófilos. Foi empregue uma estratégia que foi previamente aplicada à identificação de quimioatractivos de neutrófilos em exsudados inflamatórios (8-10).
Os porquinhos da índia foram sensibilizados com ovalbumina intraperitoneal no dia 1, seguido por uma curta exposição dos seus pulmões a ovalbumina aerossolizada no dia 8. No dia 15-21 os animais foram expostos a ovalbumina aerossolizada e mortos a diferentes intervalos utilizando uma sobredose de barbitúricos. Imediatamente após a morte as vias respiratórias foram lavadas com solução salina. O fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) foi centrifugado para remover células e sobrenadantes foram quer armazenados a -20 °C para ensaio ou sujeitos a purificação. A actividade quimioatractiva de eosinófilo em amostras de fluido de BAL, ou fracções de HPLC foi testada inj ectando-as intradermicamente em porquinhos da índia de ensaio previamente administrados com injecções intravenosas de 111In-eosinófilos (11, 12) . Após um intervalo de 2 ou 4 h, os animais de ensaio foram mortos e os sitios da pele retirados por perfuração foram contados num contador gama (Figura 1). 22 A Figura 2 apresenta o decurso de tempo de surgimento da actividade quimioatractiva de eosinófilos no fluido de BAL. Foi observada actividade significativa 30 min após a exposição ao antigénio. A actividade aumentou até 3 h, permaneceu elevada até 6 h, mas não foi significativa nas amostras de 24 h. As amostras de controlo (fluido de BAL de porquinhos da índia simuladamente sensibilizados/expostos ou sensibilizados/simuladamente expostos) retirado às 3 h não tinham actividade significativa. A actividade quimioatractiva de eosinófilo, que se denominou eotaxina, foi purificada de fluido de BAL com 3 h por HPLC de
permuta catiónica, exclusão de tamanho e fase reversa, utilizando o ensaio de acumulação de 111In-eosinófilo in vivo para medir a actividade das fracções ao longo do processo. A eotaxina eluiu como um pico único de bioactividade discreto tanto dos passos de permuta catiónica como de exclusão de tamanho, indicando uma proteína fortemente catiónica de 7-14 kDa. A cromatografia de fase reversa separou a actividade quimioatractiva de eosinófilo em dois picos (fracções 51 + 52 e fracção 54), que foram associados a picos discretos de absorvência de proteína (Figuras 3 e 4) . A selectividade para eosinófilos foi demonstrada pela falta de actividade quimioatractiva de neutrófilo significativa nestas fracções como medido pela acumulação de li:LIn-neutróf ilos no ensaio de pele (Figura 5) . O exame histológico da pele injectada com eotaxina (2 pmol) demonstrou a acumulação de eosinófilo a 4 e 24 h, particularmente em redor dos vasos sanguíneos pequenos (colorações de hematoxilina e eosina). A análise por SDS-PAGE revelou uma única banda de proteína em cada uma das fracções 51, 52 e 54 (Figura 6) . A proteína nas fracções 51 e 52 foi ligeiramente maior do que na fracção 54. 23
Isto foi confirmado por análise de massa em que os principais sinais foram a aproximadamente 8,81 e 8,38 kDa, respectivamente (ver Exemplo 3) . A sequenciação do terminal N das fracções 51, 52 e 54 revelaram sequências de aminoácidos idênticas (ver Figura 7) . A sequência do terminal N de 37 residuos de eotaxina como apresentada em SEQ.ID. NO. 1 e na Figura 7 apresenta 57% de homologia com a proteina quimiotáctica de monócito humana (MCP-1 (13), também conhecida como MCAF (14) e JE (15)). Os péptidos tripticos da fracção 54 foram também sequenciados e rapidamente alinhados por comparação com MCP-1 humana para proporcionar a sequência virtualmente completa de eotaxina com uma homologia global de 53%, ver Figura 7. É provável que as variações na massa molecular reflictam a glicosilação diferencial como os quatro sinais de massa obtidos (dois principais e dois menores, ver Exemplo 3) são todos diferentes uns dos outros por múltiplos de aproximadamente 220 unidades de massa. A sequência não contém sitios de N-glicosilação, mas foi identificado um sitio potencial de N-glicosilação na posição 70 (ver Exemplo 3). A MCP-1 humana também exibe heterogeneidade da SDS-PAGE devido a diferenças na modificação de hidrato de carbono ligada a O (16). A superfamilia do factor VIII de plaquetas das citocinas quimiotácticas, ou quimiocinas é caracterizada por quatro cisteinas conservadas. A posição relativa das duas cisteinas do terminal N permite a sub-divisão desta superfamilia nas quimiocinas C-X-C (e. g. IL-8 (17)), que são predominantemente quimioatractivos de neutrófilos e as quimiocinas C-C (e. g., MCP-1, RANTES, ΜΙΡ-Ια e ΜΙΡ-1β (18)) que são quimiotácticos para leucócitos diferentes de neutrófilos. A eotaxina é um membro do ramo C-C das quimiocinas. A maior homologia (53%) é com MCP-1 humana que, nos estudos limitados in vitro até à data, foi relatada como sendo inactiva em eosinófilos humanos (19, 20) e 24 com a recentemente descrita MCP-2 (54%) e MCP-3 humanas (51% de homologia calculada com base na SEQ.ID. No. 1 (Figura 7); 54% de homologia guando calculada com base nas seguências sobreponiveis) (21) . A homologia com outras guimiocinas C-C humanas (Figura 9) é: ΜΙΡ-1β (37% calculada com base na SEQ.ID. No. 1 (Figura 7); 39% guando calculada com base nas seguências sobreponiveis), ΜΙΡ-Ια (31% calculada com base na SEQ.ID. No. 1 (Figura 7); 32% quando calculada com base nas sequências sobreponiveis) e RANTES (26% calculada com base na SEQ.ID. No. 1 (Figura 7); 27% quando calculada com base nas sequências sobreponiveis). As últimas duas proteínas demonstraram recentemente ser activadores potentes de eosinófilo in vitro (20, 22), enquanto que a MIP-Ιβ activa linfócitos in vitro (23), mas aparentemente não eosinófilos (20) . A eotaxina apresenta a maior homologia estrutural com MCP-1, MCP-2 e MCP-3 humanas. A eotaxina possui semelhanças funcionais, mas homologia relativamente baixa, quando comparada com RANTES e ΜΙΡ-Ια. A eotaxina é claramente uma molécula distinta da MCP-1 de porquinho da índia/ esta última foi clonada recentemente (24) e possui apenas 43% de homologia com a sequência de eotaxina, ver Figura 9. A MCP-1 de porquinho da índia demonstrou ser quimiotáctica para monócitos, mas não foi testada em eosinófilos (24) . É interessante que a eotaxina possua apenas uma homologia de 41% com uma proteína C-C cujo gene é expresso em mastócitos de murganho e regulada positivamente 2 h após a interacção entre IgE e antigénio (25). Não foi relatada actividade funcional para esta proteína, mas é distinta (homologia de 51%) da MCP-l/JE de murganho (25). A eotaxina de porquinho da índia foi muito potente na indução da acumulação de eosinófilos in vivo: 1-2 pmol/sítio de pele produzindo uma resposta de 730 ± 140% (média ± s.e.m., 25 η = 18 animais), em comparação com sítios injectados com solução salina. Além disso, a acumulação de eosinófilos marcados foi observada dentro de 30 minutos após a injecção intradérmica (Figura 10). Isto é suportado por experiências in vitro. O efeito de eotaxina nos eosinófilos in vitro foi demonstrado por (i) inibição da ligação de 125I-RANTES a células de porquinho da índia (Figura 11), (ii) aumento do cálcio citoplásmico em células humanas e porquinho da índia (Figuras 12 e 13) e (iii) quimiotaxia de eosinófilos humanos num sistema de câmara de Boyden: as respostas quimiotácticas a eotaxina e RANTES foram de magnitude semelhante ao longo do intervalo de 0,1-2,0 nM. Em contraste com a eotaxina, a MCP-1 humana recombinante e RANTES não induziram respostas de eosinófilos de porquinho da índia in vitro ou in vivo (Figuras 10 e 13) . Isto pode reflectir uma diferença de espécies embora a RANTES se tenha ligado a eosinófilos de porquinho da índia sem induzir activação (Figura 11, inserção na Figura 10). A eotaxina possui uma potência semelhante a RANTES em eosinófilos humanos, enquanto que a MCP-1 é quer inactiva (20) ou activa apenas em doses elevadas (Figura 12) . Assim, a eotaxina possui um efeito directo potente tanto em eosinófilos humanos como de porquinho da índia.
As respostas de eosinófilos de porquinho da índia a eotaxina de porquinho da índia in vitro e in vivo podem ser inibidos por RANTES humana. As Figuras 14, 15 e 16 apresentam a resposta de eosinófilos de porquinho da índia carregados com FURA-1 a eotaxina de porquinho da índia antes e após adição de RANTES humana. O aumento da concentração de cálcio intracelular induzido por eotaxina é reduzido de um modo substancial quando as células são primeiro expostas a RANTES humana que, por sua vez, não consegue induzir uma resposta. A Figura 17 demonstra que a RANTES humana, quando co-injectada com a eotaxina reduz a 26 acumulação de eosinófilos de porquinho da índia induzidos pela eotaxina na pele de porquinho da índia in vivo. Os resultados suportam as observações de que a eotaxina exibe ligação competitiva com RANTES humanas marcadas radioactivamente em eosinófilos de porquinho da índia e que a eotaxina é um estimulante funcional potente, enquanto que a RANTES não é. Consequentemente, a RANTES parece actuar como um antagonista de receptor para a eotaxina em eosinófilos de porquinho da índia. A Figura 18 demonstra que os eosinófilos se acumulam nas vias respiratórias de porquinho da índia in vivo em 24 horas após a administração de eotaxina de porquinho da índia aerossolizada, enquanto que não se observou substancialmente nenhuma acumulação de neutrófilos.
Os Exemplos seguintes ilustram a presente invenção.
Exemplo 1
Produção e teste de fluido de lavagem broncoalveolar MÉTODOS: Foram sensibilizados porquinhos da índia Dunkin Hartley machos (300-400 g) com ovalbumina intraperitoneal (OA, 1 mg) no dia 1 seguido por exposição a antigénio aerossolizado (OA a 2% durante 5 min utilizando um nebulizador ultrassónico) no dia 8 (6). No dia 15-21, os animais foram pré-tratados com um anti-histaminico para prevenir fatalidade aguda (pirilamina, 10 mg kg”1, i.p.) e expostos por exposição a antigénio aerossolizado (OA a 1% durante 20 min). A tempos diferentes após a exposição ao antigénio os animais foram tratados com atropina (0,06 mg kg-1, i.p.) para evitar a broncoconstrição e mortos com 27 uma sobredose de barbiturato. A lavagem broncoalveolar foi realizada com 4 mL de solução salina. As amostras foram centrifugadas para remover as células e o sobrenadante foi armazenado a -20 °C antes do ensaio. As amostras de BAL foram ensaiadas por injecção intradérmica (0,1 mL) em porquinhos da índia previamente administrados com injecção intravenosa de 5 x 106 111In-eosinófilos (estimulados nos animais dadores por injecções por injecções intraperitoneais repetidas de soro de cavalo e purificados em gradientes descontínuos de Percoll, >94% de pureza) (11, 12) . Após 4 horas os animais ensaiados foram mortos e os sitios de pele foram retirados por perfuração para contagem gama. Os resultados foram apresentados como a média ± s.e.m. e foram testados por análise de variância de sentido restrito. Um valor de p de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. RESULTADOS: A Figura apresenta, esquematicamente, processos para a criação e medição de actividade quimioatractiva de eosinófilos in vivo. A Figura 2 ilustra o decurso de tempo da criação de actividade quimioatractiva de eosinófilos nos pulmões de porquinhos da índia sensibilizados após exposição ao antigénio (quadrados a cheio, n=4-10). A actividade foi medida num ensaio de pele in vivo de acumulação de 111In-eosinófilos em porquinhos da índia não sensibilizados (3 animais de teste por amostra de BAL) . Foi observada actividade significativa em amostras de lavagem broncoalveolar retiradas a 0,5, 1,5, 3 e 6 h após exposição ao antigénio (em comparação com as respostas a solução salina intradérmica, apresentadas como linha ponteada). Não foi observada actividade significativa nas amostras de 24 h. Não foi observada actividade nas amostras da lavagem obtidas 3 h após exposição a simulação (solução salina) de animais sensibilizados (círculos a cheio, n=5), ou exposição a antigénio 28 de animais sensibilizados com simulação (solução salina) (losangos a cheio, n=5). EXEMPLO 2
Purificação de eotaxina de fluidos de lavagem broncoalveolar antes de purificação em gradientes descontínuos de Percoll e marcação com Χ111η. RESULTADOS: Os resultados são apresentados nas Figuras 3, 4 e 5. A Figura 3 apresenta o perfil de HPLC de fase reversa final apresentando absorvência a 214 nm e gradiente de acetonitrilo. A Figura 4 demonstra que a actividade quimioatractiva de eosinófilos foi observada em 2 picos, correspondendo às fracções 51 + 52 e fracção 54, que corresponde a picos discretos de absorvência. A Figura 5 demonstra que não foi detectada actividade quimioatractiva de neutrófilos significativa nestas fracções. Em contraste, C5a de porquinho da índia dês Arg (30% de plasma activado com zimosan (11), aproximadamente 10 pmol/sítio) induziu a acumulação tanto de i:L1In-eosinóf ilos (521 ± 893) como de 111In-neutrófilos (9872 ± 473) . As fracções 50, 53, 55 e 56 produziram consistentemente pouca ou nenhuma actividade nos bioensaios de pele de porquinho da índia da acumulação de leucócitos. Não foi detectada absorvência de proteína significativa no restante do gradiente (até 80% de acetonitrilo).
Exemplo 3
Pureza, análise de massa e sequência de proteína de eotaxina MÉTODOS: foram liofilizadas alíquotas de 2% de cada fracção, redissolvidas em 10 pL de tampão de SDS, aquecidos (95 °C, 5 min) e 0,3 pL de separação em géis de gradiente de 8-25% num Pharmacia Phast System. Os géis forma visualizados com coloração de prata. A análise de massa foi realizada nas fracções 51, 52 e 30 54 utilizando um Finnigan MAT Lsermat com matrizes de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico e ácido sinapinico. As medições de massa foram calibradas internamente utilizando proteínas padrão. Foram aplicadas aliquotas de 5% de cada fracção bioactiva (51, 52 e 54) directamente para a análise automatizada da sequência do terminal N utilizando ciclos rápidos num Applied Biosystems 477A contendo um micro-cartuxo essencialmente como descrito (32) . Os resíduos do terminal amino 37, 35 e 29 foram obtidos para as fracções 51, 52 e 54, respectivamente. Não se encontraram diferenças entre as posições correspondentes. Os rendimentos iniciais aparentes destas três análises foram todos aproximadamente de 7-8 pmol. Por isso, as fracções 51, 52 e 54 continham aproximadamente 200 pmol cada, assumindo 70-80% de rendimentos de sequenciação. Os intervalos foram encontrados nas posições 8, 9 e 33, consistentes com a presença de resíduos de cisteína nestas posições. Aproximadamente 30 pmol da fracção 54 foi reduzida e alquilada por tratamento sequencial com ditiotreitol a 1 mM durante 5 min a 50 °C e depois acrilamida a 10 mM durante 30 min a 37 °C antes da digestão com tripsina alquilada (Promega) em Tris a 20 mM/HCl, pH 8, contendo Thesit a 0,5%. Os péptidos foram separados utilizando uma coluna Reliasil C18 (300 Â, 5 μιη) (1 x 150 mm) revelada com um gradiente de concentração de acetonitrilo linear em ácido trifluoroacético a 0,08% a 50 pL num sistema de HPLC Microm. Os péptidos purificados foram sujeitos a análise de sequência do terminal N como acima, mas todos os quatro resíduos de cisteína foram identificados positivamente como o derivado de PTH-cys-S-B-propionamida (33). A posição 70 não produziu derivado de PTH nos péptidos T6 e T7 e é uma posição provável de O-glicosilação. RESULTADOS: Os resultados são apresentados nas Figuras 6, 7, 8 e 9. A Figura 6 é uma fotografia do gel de SDS-PAGE. Para 31 referência, foi aplicado IL-8 humana (72 aminoácidos, aproximadamente 8 kDa) nas pistas A, B e C (12, 2,4 e 0,5 ng/0,3 pL/pista, respectivamente). O tempo de desabsorção por laser de análise de massa de trajectória produziu sinais a 8,81 kDa (principal) e 9,03 kDa (menor) para cada uma das fracções 51 e 52. A fracção 54 produziu sinais a 8,38 kDa (principal) e 8,15 kDa (menor).
As Figuras 7 e SEQ.ID.N°.l apresentam a sequência de aminoácidos de eotaxina, que foi determinada por sequenciação da molécula intacta, bem como de péptidos derivados da digestão com tripsina (T). As análises de terminal N apresentaram a homologia mais elevada com MCP-1 humana (57%) e os péptidos trípticos foram rapidamente alinhados por comparação com a sequência da MCP-1 humana. A Figura 8 apresenta a sequência de aminoácidos como confirmada por sequenciação do ácido nucleico. A Figura 9 é uma comparação da sequência da eotaxina humana com MCP-1, MCP-2, MCP-3 humanas (21), MCP-1 de porquinho da índia (24), ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ e RANTES humanas (18) apresentando residuos conservados (sombreado).
Exemplo 4
Testes in vitro e in vivo de eotaxina MÉTODOS: (i) A eotaxina foi uma mistura de ambos os picos de bioactividade (fracções 51 + 52 e fracção 54) da separação por HPLC de fase reversa final descrita no Exemplo 2 (ver Figuras 3, 4 e 5). A acumulação de 111In-eosinófilos na pele de porquinho da 32 índia foi medida ao longo de 4 h como descrito no Exemplo 1 (ver Figuras 1 e 2). Nos mesmos animais (n=4) foram injectados sitios adicionais com eotaxina 30 minutos antes da morte. (ii) Para os estudos de ligação, foram incubados 4 x 105 eosinófilos com 125I-RANTES a 0,1 nM e várias concentrações de ligando frio (50 pL a 0 °C durante 2 h) . A solução salina tamponada com Hank continha HEPES a 30 mM, EDTA a 10 mM, azida de sódio a 0,1% e BSA a 1% a pH 7,5. Os resultados são a média de dois ensaios cada um feito em triplicado. (iii) Para a medição dos niveis de cálcio intracelular foram aplicados eosinófilos humanos e de porquinho da índia (107 células/mL em PBS sem Ca2+/Mg2+ + BSA a 0,1%) com éster de fura-2-acetoximetilo (2,5 μΜ, 30 min a 37 °C). Após duas lavagens as células foram ressuspensas a 106 células/mL em PBS sem Ca2+/Mg2+ contendo HEPES a 10 mM, BSA a 0,25% e glucose a 10 mM (pH 7,4) As alíquotas foram dispensadas em cuvetes de quartzo e a [Ca2+] externa foi ajustada para 1 mM com CaCl2· As alterações na fluorescência foram monitorizadas a 37 °C utilizando um espectrofotómetro Perkin Elmer LS50 a comprimentos de onda de excitação de 340 nm e 380 nm e comprimento de onda de emissão de 510 nm. Os niveis de [Ca2+]± foram calculados como descrito previamente (34) utilizando a proporção das duas leituras de fluorescência e uma Kd para a ligação de Ca2+ a 37 °C de 224 nM. Os eosinófilos periféricos humanos foram preparados como descrito previamente (35) por centrifugação de densidade em Percoll, seguido pela remoção imunomagnética de neutrófilos CD16+ utilizando o sistema MACS. Os eosinófilos de porquinho da índia foram preparados como descrito no Exemplo 1 (11, 12) . 33 (iv) Para testar a supressão da acumulação de eosinófilos in vivo utilizando RANTES humana, a acumulação de eosinófilos de porquinho da índia marcados com i:liIN nos sítios da pele foi medida como descrito acima. Os porquinhos da índia foram injectados com 1,8 pmol de eotaxina (n=2), 100 pmol de RANTES (n=l), ou ambos 1,8 pmol de eotaxina e 100 pmol de RANTES (n=2). Foi utilizada solução salina como controlo. (v) Para testar a actividade antagonista do receptor, os eosinófilos de porquinho da índia carregados com éster de fura-2-acetoximetilo foram estimulados com eotaxina a 3 nM com ou sem pré-tratamento com RANTES humana. (vi) Para investigar o efeito da exposição a aerossol de porquinho da índia a eotaxina, os porquinhos da índia sem pré-tratamento foram expostos a um aerossol quer de eotaxina ou de um meio de controlo (n=8 por grupo) . A exposição foi realizada colocando dois animais numa única câmara e nebulizando 24 pmol de eotaxina dissolvida em 10 mL de PBS contendo proteína transportadora de BSA a 80 pg/mL durante um período de 35-40 minutos. Os animais de controlo receberam PBS/BSA aerossolizado do mesmo modo. Os animais foram mortos 20 horas após exposição a eotaxina ou meio de controlo. O fluido de BAL (5 x 10 mL de HBSS, EDTA a 10 mM, pH 7,35) foi recuperado e centrifugado (300 g, 20 min, 4 °C). A contagem de células BAL totais foi determinada por hemacitómetro e as contagens de células diferenciais foram realizadas em preparações de citospina corada (DiffQuick) (3 por animal, 400 contagens de célula por lâmina). RESULTADOS: Os resultados apresentados nas Figuras 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18. 34 A Figura 10 demonstra que a eotaxina de porquinho da índia (1,6 pmol) induz a acumulação significativa de li:LIn-eosinófilos in vivo 30 min (quadrados em branco, p<0,01) e 4 h (quadrados a cheio, p<0,01) após injecção intradérmica. Em contraste, as proteínas humanas recombinantes RANTES, ΜΙΡ-Ια e MCP-1, a doses até 100 pmol não tiveram efeito ao longo de 4 horas. A inserção da Figura 11 demonstra que a eotaxina e RANTES, mas não a quimiocina C-X-C IL-8, inibem a ligação de 125I-RANTES (Bo=14,4%) a eosinófilos de porquinho da índia in vitro. A Figura 17 apresenta demonstra (a) que a RANTES humana não induz a acumulação de eosinófilos significativa e (b) que a RANTES humana inibe, num grau substancial, a acumulação de eosinófilos induzida pela eotaxina, que sugere que a RANTES actua como um antagonista receptor para eotaxina in vivo. A Figura 12 demonstra que a eotaxina, RANTES e, apenas a concentração elevada, MCP-1, induzem o aumento dos níveis de cálcio intracelular em eosinófilos humanos in vitro. Os vestígios estão com os eosinófilos de um dador. Em dois outros dadores a eotaxina a 2 nM produziu um aumento médio de cálcio de 61 nM. Nos três dadores (97,3 ± 1,2% de eosinófilos) as respostas a RANTES a 10 nM foram 194 ± 74 nM [Ca2+]i e as respostas a MCP-1 a 100 nM foram 93 ± 38 nM [Ca2+]i. A Figura 13 demonstra que a eotaxina de porquinho da índia, mas não a de RANTES ou MCP-1 humanas, aumenta os níveis de cálcio intracelular em eosinófilos de porquinho da índia in vitro. Os vestígios estão com as células de um dador. Em três dadores (97,5 ± 0,8% de eosinófilos) as respostas foram: eotaxina a 2 nM, 90 ± 13 nM [Ca2+]i/ RANTES a 100 nM, 2,0 ± 1,7 nM [Ca2+]±; MCP-1 a 100 nM, 3,3 ± 0,7 nM [Ca2+]i. 35 A Figura 14 e a inserção da Figura 15 demonstra que o tratamento prévio de eosinófilos de porquinho da índia com RANTES (100 nM) inibe o aumento dos niveis de cálcio livre intracelular observado quando os eosinófilos são tratados com eotaxina (3 nM) isoladamente. A RANTES parece actuar como um antagonista receptor em eosinófilos de porquinho da índia. A Figura 16 é uma curva de dose-resposta utilizando eotaxina a 3 nM e aumentando as quantidades de RANTES. A Figura 18 mostra que a eotaxina de porquinho da índia, administrada como um aerossol, induz acumulação de eosinófilos nas vias respiratórias do porquinha da índia in vivo, sem que seja observada uma acumulação substancial de neutrófilos.
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: National Heart & Lung Institute (B) RUA: Dovehouse Street (C) Cidade: Londres
(E) PAÍS: INGLATERRA
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW3 6LY (G) TELEFONE: 071 352 8121 (H) TELEFAX: 071 376 3442 (A) NOME: Ludwig Institute for Câncer Research
(B) RUA: Hedges House, 153-155 Regent RUA (C) CIDADE: Londres (E) PAÍS: Inglaterra
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1R 7FD (G) TELEFONE: 071 494 0025 (H) TELEFAX: 071 494 1404
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: CITOCINA QUIMIOTÁTICA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 39 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) Tipo de meio: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: GB 9318984 (B) DATA DE ENTRADA: 14-SET-1993 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: GB 9408602 (B) DATA DE ENTRADA: 29-ABR-1994 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 40 (A) ORGANISMO: Cavia porcellus (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: fluido de lavagem bronquioalveolar (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: HIs Pro Gly 1 Ile Pro s* 5 :>r AI a Cys cys Piv; 10 árg vai Thr Asn Lys 15 Lys Ile ser Fhe Gin 20 Árg Li Lys S«r Tyr Ly.r» 25 110 11 ê T'hr Ser 30 Ser Lys Cys Pro Gin 35 Tbr A1 1. ie Vai Phe G1. u 1.1 o 40 Lys Pro Asp Lyo 4 5 Met 11 & Cys Ala Anp 50· Pro Ly'S X- aa Xaa ss Trp Vã.1 Glrií. Asp Ala 60 Lys Lys Tyr l,nu Asp Gin lis Ser Gin X rt·, a a Tb r n Lys Pro (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi)FONTE ORIGINAL: 41 (A) ORGANISMO: Cavia cobaya (F) TIPO DE TECIDO: Fluido de lavagem brônquica (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:
His 1 Pro Oly Ile Pro Ser Ala cys Cys Phe 10 Àrg Vai Thr Asrs Lys 15 Lys Ile Ser Phã Gin 20 Arg Leu Lys Ser Tyr 25 Lys Ile Ile Thr Ser Ser 30 Lys Cys Pro Gin Thr 35 Ala Ile Vai Phe 4 0 Glú IX® Lys Ργό Asp 45 Lys net Ile Cys Ala 60 Aap Fres Lys Lys 'Lys 55 Trp Vai G1 n Asp À X ci 60 Lys Lys Tyr Leu Ãsp Gin Ile Ser Gin Thr Thr l,ys Pro 65 ?0 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iniciador) (iii) HIPOTÉTICA: SIM (iii) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA: 42 (A) NOME/CHAVE: base modificada: N é inosina (B) LOCALIZAÇÃO: 12 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada: N é inosina (B) LOCALIZAÇÃO: 15 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada: N é inosina (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: TGCTGTTTCC GNGTNACNAA CAAA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (iniciador)
(iii) HIPOTÉTICA: SIM 43
(iii) ΑΝΤΙ-SENTIDO: SIM (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada: N é inosina (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada: N é inosina (B) LOCALIZAÇÃO: 16 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: CATCTTGTCN GGCTTNATTT C 24
Lisboa, 29 de Dezembro de 2006 44
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Proteína quimioatractiva isolada capaz de atrair eosinófilos e de induzir a acumulação e/ou activação de eosinófilos in vitro e in vivo e que não apresenta efeito de atracção substancial para neutrófilos in vivo, consistindo em, ou compreendendo, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 40% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°. 1, ou um fragmento da referida proteína quimioatractiva que retém as suas actividades biológicas.
- 2. Proteína quimioatractiva como reivindicado na reivindicação 1, possuindo pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°. 1.
- 3. Proteína quimioatractiva como reivindicado na reivindicação 1, possuindo pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°. 1.
- 4. Proteína quimioatractiva como reivindicada na reivindicação 1, consistindo em, ou compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2.
- 5. Processo para a produção de uma proteína quimioatractiva como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4, que compreende o isolamento de uma fracção do fluido de lavagem broncoalveolar ou um exsudado inflamatório obtido a partir de um animal humano ou não humano exposto a um estímulo provocador, em que a referida fracção demonstra 1 a actividade quimioatractiva de eosinófilos in vitro e in vivo e não apresenta efeito atractivo substancial para neutrófilos in vivo.
- 6. Processo para a produção de uma proteina quimioatractiva como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4, que compreende a cultura in vitro de macrófagos, linfócitos, neutrófilos, mastócitos, células epiteliais das vias respiratórias, células de tecido conjuntivo, células endoteliais vasculares ou eosinófilos obtidos a partir de um animal humano ou não humano, e isolamento a partir de células ou a partir das células ou a partir do fluido de cultura de células, de uma fracção que demonstra a actividade quimioatractiva de eosinófilos in vitro e in vivo e que não apresenta efeito atractivo substancial para neutrófilos in vivo. I. Anticorpo que se liga especificamente à proteina quimioatractiva como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4.
- 8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7 em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
- 9. Anticorpo como reivindicado na reivindicação 7 ou 8, para utilização como um medicamento ou em diagnóstico.
- 10. Utilização de um anticorpo de acordo com a reivindicação 7 ou 8 para a preparação de um medicamento para o tratamento de asma ou outra doença inflamatória. reivindicação 10 para o II. Utilização de acordo com a 2 tratamento de rinite ou eczema.
- 12. Preparação farmacêutica que compreende, como ingrediente activo, um anticorpo como reivindicado na reivindicação 7 ou 8 em mistura ou em conjunto com um veiculo farmaceuticamente adequado.
- 13. Imunoensaio para um antigénio, caracterizado por o antigénio ser uma proteina quimioatractiva como reivindicado em qualquer das reivindicações 1, 2 ou 4.
- 14. Imunoensaio para um anticorpo, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo que forma um complexo com uma proteina quimioatractiva como reivindicado em qualquer das reivindicações 1, 2 ou 4.
- 15. Método de teste de um composto quanto a um efeito inibitório na actividade de uma citocina quimioatractiva in vitro, caracterizado por a citocina quimioatractiva ser uma proteina quimioatractiva como reivindicado em qualquer das reivindicações 1,2 ou 4.
- 16. Processo para preparar um anticorpo de acordo com a reivindicação 7 ou 8 compreendendo a utilização de uma proteina quimioatractiva de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 4. Lisboa, 29 de Dezembro de 2006 3
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