CZ20021652A3 - Způsob přípravy lysofosfatidylethanolaminu - Google Patents

Description

Oblast vynálezu

Předložený vynález se týká způsobu přípravy lysofosfatidylethanolaminu o vysoké čistotě ze směsi fosfolipidů. Zvláště se předložeňý vynález týká způsobu čištění lysofosfatidylethanolaminu na vysokou čistotu.

Dosavadní stav techniky

Lysofosfatidylethanolamin se přirozeně vyskytuje v buňkách zvířat nebo v rostlinných buňkách a je hojný ve vaječném žloutku či mozkových buňkách. Lysofosfatidylethanolamin je odvozen od fosfatidylethanolaminu, který je druhem fosfolipidů a vyskytuje- se v buněčné membráně. Fosfatidylethanolamin, hojný ve vaječném žloutku nebo sójovém lecitinu je druhem fosfolipidů obsahujícího ve své molekule dvě mastné kyseliny.

V organismu, kde fosfolipaza A2 - druh fosfólipiidové hydrolázy - působí na fosfatidylethanolamin, se jedna z mastných kyselin umístěná v poloze sn-2 eliminuje za vzniku lysofosfatidylethanolaminu.

Lysofosfatidylethanolamin je znám tím,- že hraje důležitou úlohu při dozrávání a vadnutí ovoce. Je dobře známo, že působení lysofosfatidylethanolaminu na rostlinu rajského .jablíčka potlačuje vadnutí í

jejich listů a plodů a že působení lysofosfatidylethanolaminem na sklizené í plody prodlužuje jejich skladovací dobu (US patent 5,110,341 a US patent ,

5,110,155). Známo je též, že úprava jablek lysofosfatidylethanolaminem

Ο·- ·· • <» · · · podporuje tvorbu anthocyaninu ve slupce jablek a potlačuje ztrátu pevnosti při skladování. Dále je známo, že výše popisované účinky týkající se funkce lysofosfatidylethanolaminu na snižování rychlosti respirace ovoce (například jablek, klikvy, rajčat, atd.) a podporu či potlačení tvorby plynného ethylenu (Farag, K. M. a Palta, J. P., „Stimulation of Ethylene Production by Erea, Thidiazoron and Lysophosphatidylethanolamine and Possible sites of this stimulation, Annual meeting of the American Society of Plant Physiologists, duben 1989).

K prodloužení životnosti řezaných květin byl použit způsob s působením lysofosfatidylethanolaminového roztoku udržovaného na požadované koncentraci (Hort Science, 32, (5), 888 - 890, 1997). Dříve byl pro účely potlačení vadnutí květin používán roztok thiosíranu stříbrného obvykle obsahujícího cukr působící na tyto sklizené (řezané) květiny po dobu 20 hodin či déle. Výše uvedený roztok měl však nevýhodu, že stříbrný iont přítomný v roztoku způsoboval znečištění prostředí. Jelikož lysofosfatidylethanolamin přečištěný z přírodního preparátu má podobně jako thiosíran stříbrný charakteristickou schopnost zvýšení skladovací doby řezaných květin ve váze, byl v této oblasti lysofosfatidylethanolamin cílem širokého zkoumání.

Až dosud nebyl v průmyslovém měřítku vyvinut žádný způsob výroby lysofosfatidylethanolaminu o vysoké čistotě. V laboratořích byl pouze v malém měřítku provedena izolace a čištění lysofosfatidylethanolaminu na chromatografické koloně se silikagelem. Pouze malé množství lysofosfatidylethanolaminu je prodáváno jako chemikálie firmou Avanti Polar Lipids, lne., nebo firmou Sigma Chemical Co., a to za vysokou cenu. Pokud se lysofosfatidylethanolamin připravuje sloupcovou chromatografií, je velmi obtížné oddělit od sebe dvě přítomné látky - lysofosfatidylcholin a >:3 lysofosfatidylethanolamin - protože máji podobné retenční hodnoty. Pokud se pracuje sloupcovou chromatografií za použití málo toxických organických rozpouštědel jako je hexan či ethanol jako s jediným rozpouštědlem, je obtížné tento lysofosfatidylethanolamin čistit, protože rozpustnost lysofosfatidylethanolaminu je velmi nízká. Pokud se chromatografie provádí za použití rozpouštědla, o kterém je známo, že je vysoce toxické (například chloroform, benzen nebo methanol), je výsledek čištění dobrý, avšak výtěžek je malý a cena čištění je vysoká.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je tedy zajištění způsobu přípravy lysofosfatidylethanolaminu o vysoké čistotě.

Ke splnění výše uvedeného předmětu předloženého vynálezu je způsob přípravy lysofosfatidylethanolaminu zajišťován těmito kroky: působením fosfolipázy na směs fosfolipidů obsahující fosfatidylethanolamimza účelem konverze jmenovaného fosfatidylethanolaminu na lysofosfatidylethanolamin; působením na takto získanou . směs lysofosfolipidů obsahující lysofosfatidylethanolamin speciální rozpouštěd lovou směsí za účelem selektivní extrakce a krystalizace lysofosfatidylethanolaminu; á separací lysofosfatidylethanolaminu.

Předložený vynález zajišťuje také způsob obsahující dále krok zpracování fosfatidylcholinu, který je ve fosfolipidů přítomen ve značném množství

K) fr99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · · · • · ··-*·· · * • · · · · · ·

Ο · · · ·· ···· fosfolipázou D - druhem hydrolyzujíeího enzymu fosfoiipidu - ke zvýšení obsahu fosfatidylethanolaminu ve fosfoíipidové směsi.

•i

Podrobný výklad vynálezu

Zde dále bude podrobně popsán předložený vynález.

Výchozí látkou podle způsobu předloženého vynálezu je směs; fosfoiipidu obsahující ÍQ áž 99 % hmotnostních fosfatidylethanolaminu, přednostně 30 až 39 % hmotnostních fosfatidylethanolaminu. Příkladem takové směsi je sójový lecitin, surový sójový lecitin žloutkový lecitin a podobně.

’’T *- ' · 0 '

Obsah fosfatidylethanolaminu obsaženého ve směsi fosfoiipidu, která existuj? v přírodě je nižší než obsah fošfatidylcbolinu. Pro účinnější postup je nutné zvýšit obsah fosfatidylethanolaminu ve fosfoiipidu.

Surový sójový lecitin („surový lecitin“) - vedlejší produkt postupu přípravy sójového oleje -Je. například složen.ze 60 až 70 % polárních lipidů JosfoiO^/gíyko^pid), 27 až 39 % sójového oleje, 1 až 3 % vody‘a 0,5 až 3 % dalších s’ožek Polární lipid se č's^fí odstmňevé.ním sójového ?'??·(druh' neutráWho oleje) obsaženého v surovém lecitinu. Složení^lamího.-lipidu y.přečištěném stavu je toto: 22 až 30 % fcsfatidylcholinu („PC“); 2 až 5 % íysoíosíatidylchólinu („LPC“); 16 až 22 % fosfatidylethanolaminu Í(„PE“); 0,5 až 2 % lysofosfatidýlethanolaminu („LPE“); 0,5 až 8 % kyseliny fosfatidylové („PA“); 0,1 až 3 %,fosfatidylserinu; 6 až 15 % fosfatidylinositolu, atd. Lecitin, ze žloutku vajíčka.je složen ze 73 až 83 % PC, 2 až 5 % LPC, 13 až 17 % i

·» ...:4^4 4^-^0-4 *' ¹ , · _¥ ·' · ·.· · · ·

4 · 4 >·,.·’ 4 · ..· · · '

- 4 ‘ ^r 4 · .» ·-··«— · 4 -4 · :»· · . ..· -- . · -.4 -4 4 4 ,4 4

Λ»·. ’

4 4 4 ' 4 · 4 •4 44 ·« 4441

PE, 0,1 až 3 % LPE a dalších látek. Jelikož fósfóíípid obsahuje velmi male i s množství lysofosfatidýlethanolaminu, jde o další zábranu pro i konnerční & využívání lysofosfatidýlethanolaminu jeho přímým čištěním zvýše uvedených lecitinů.

Je proto žádoucí připravit výchozí materiál takto: po převedení PC, kterého je ve fosfolipidové směsi mnoho na .PE; čistit PE od fosfolipidové směsi nebo zvýšit koncentraci PE tak, aby byla na požadované výši. Mezi způsoby' ' « jak zvýšit obsah PE patří rozpouštědlová frakcionace za využití různé Sť, , 1 rozpustnosti fosfolipidů v různých rozpouštědlech, frakcionace sloupcovou # chromatografií, koncentrace fosfatidylethanolaminu za využití enzymu » konvertujícího fosfolipid a tak dále. _; ‘

Jako způsobu ke koncentraci fósíatldyiethanolaminu sloupcovou chromatografií se využívá frakcionačnímetody a koncentrování za použití i v dobře známých adsorbentů jako je například silikágel nebo Florísil, či iontoměnič jako je,například celulosa DEAE nebo celulosa. TĚAt (Houser, G,, Krichevsky, G., Yamanoto, A , „Lipid Chrcmatographic Analysis vyd; Marinetti, G. V, sv. 1, s. 99, Dekker, New York, 1967; Hanahan, Ď.;J., -Dittmer, J. C., Warashina, E., J. Bicí Chem., 228, 685, 1957), Jako způsoby frakcionace při využití různé rozpustnosti jsou známy frakcionace i- ,.;,4

používající alkohol (Pardon, V. H., Fetto Sóífeh Anstrichmittel, 8S,:55; 1984; Honzl, J. a Wangner, H., Z. Naturforsch., 26b. 1151, 1971) a rozdělovači chromatograíic s odstředěním (Bio industry, 2, (8), 40, 1985). í

•-i -

- 6 - , . ?

V dalším způsobu pro zvýšení obsahu fosfaíidylethaholaminu ve fosfolipidů lze použít enzym (zvláště fosfolipázu D nebo fósfatidy Ichol in • f fosfatidohydrolázu E.C.3.1.1.4). Fosfolipidy se skládají ze sn-glycerol-3fosfátové kostry a řetězce mastných kyselin na hydroxylových skupinách na uhlících 1 a 2. Fosfolipáza A1 a A2 katalyzuje hydrolýzu acylové skupiny sn-1 a sn-2. Fosfolipáza C hydrolyzuje fosfodiešterovou vazbu na postraním řetězci glycerolu. Fosfolipidy jsou klasifikovány podle substituentu na čelní skupině fosfátové skupiny a tato čelní skupina jako je cholin nebo ethanolamin může být hydrolyzována fosfolipázou D. FosfolipázajD je pro své hydrolytické účinky a transfosfatidylační účinky vhodná k výrobě mnoha druhů derivátů kyseliny fosfatidové. Pokud se k fosfolipidů ze sóji nebo vaječného žloutku přidá enzym konvertující fosfolipid (jmenovitě fosfolipáza D) a odpovídající množství ethanůlaminu, získá se transfosfatidylační reakcí fosfolipid obsahující velké množství fosfatidylethanolaminu (Yang,_tS. F., et al., J. Biol. Chem., 242, (3), 477 - 484, 1967; Dawson, R. M. C., Biochem.

J., 102, 205-210, 1967). . > s i

Taková směs fosfolipidů připravená výše uvedenými známými 'způsoby obsahující tedy fosfatidylethanolamin ve vysoké koncentraci může) tedy být * ; použita jako výchozí materiál pro předložený vynález.

V příkladu předloženého vynálezu ke zvýšení ‘ obsahu fosfatidylethanolaminu ve fosfolipidů se použije fosfolipáza D (druh fosfolipidové konvertázy), kterýžto enzym může být připraven z mikroorganismů nebo rostlin. Obecný způsob k získání fosfolipázy D ze ' -o , . I zelí je popsán Yangem, et al. (Yang, S. P., et al., J. Biol Chem., 242, (3),

477 - 484, 1967). Fosfolipázu D extrahovanou z burských oříšků, lněného semínka, sóji a podobně lze použít v předloženém vynálezu v částečně nebo zcela vyčištěném stavu. Jako fosfolipázu D lze využít enzym ‘vzniklý a

·.·

-7vyrobený fermentační reakcí mikroorganismem pocházejícím z rodu Streptomyces. Při konverzní reakci se obecně dává spíše přednost fosfolipáze D produkované mikroorganismem, než extraktu z rostlin, protože má při konverzní reakci fosfolipidu lepší účinnost.

Tuto reakci konverzního enzymu lze provádět za běžných podmínek. Směs získanou z výše uvedené reakce lze použít v následující hydrolytické reakci, či přečistit pro následné použití. t

Podle předloženého vynálezu se působením takovou fosfolipid hydrolázou jako je fosfolipáza A2 na fosfolipidovou směs, a to ať už je na ni předběžně působeno fosfolipázou D, či nikoliv, zkonvertuje fosfatidylethanolamin ve směsi na lysofosfatidylethanolamln. Jako výsledek je možno získat velké množství lysofosfatidylethanolaminu.

Mezi fosfolipid hydrolázy, které lze použít v předloženém vynálezu, náleží fosfolipáza A2 extrahovaná z bovinního nebo prasečího pankreatu, lipáza mající účinky fosfolipázy A2 a pankreátin z bovinního nebo prasečího pankreatu s inaktivovanou proteázou a lipázou. Patří sem též fosfolipáza A2 z fermentace mikroorganismů. Fosfolipáza A2 je enzym, který hydrolyzuje esterovou vazbu mezi glycerolem a mastnou kyselinou v poloze sn-2 fosfolipidu, a který převažuje v hadím jedu nebo pankreatu zvířat. Pro průmyslové účely se fosfolipáza A2 extrahuje z prasečího pankreatu a zkoncentrovaná se potom prodává. Fosfolipáza A2 využitá v příkladu předloženého vynálezu je fosfolipázou extrahovanou z prasečího pankreatu a přečištěnou, a je výrobkem vyvinutým pro komerční využití firmou Novo NordiskA/S.

- 8 Enzymatická hydrolytická reakce fosfolipidů se obecně skládá z kroku?’ rozpuštění fosfolipidů nebo směsi fosfolipidů ve vodě nebo organických rozpouštědlech o 5 až 100 krát větším objemu, a přidání enzymu do roztoku' a silného míchání při stálé teplotě. Teplota enzymatické reakce sé řídí tak, aby byla mírná, jmenovitě tak, aby to bylo od laboratorní teploty do 70 °C, přednostně však 25 až 50 °C.

V případě použití organického rozpouštědla v enzymové reakci se kvůli stabilitě procesu a provozu se musí přednostně uvážit bod varu a bod vzplanutí rozpouštědla. Množství přidaného enzymu se stanoví po zvážení druhu, čistoty, stavu materiálu, cený a obsahu fosfolipidů v substrátu, atd. Množství použitého enzymu na 1 kg fosfolipidů se obecně pohybuje od < 10000 do 50000 jednotek (Lecitasy - obsah doporučovaný Novo Nordisk S/K). Reakční doba hydrolýzy se stanovuje podle obsahu přidaného enzymu, reakční teploty, obsahu fosfolipidů, rychlosti míchání a itak dále. Enzymatická reakce se podle předloženého vynálezu provádí reakčním postupem doporučovaným společností dodávající enzym vyjma toho, že obsah enzymu a reakční teplota řídí tak, aby se udržela konstantní rychlost, hydrolytické reakce a přidává se organické rozpouštědlo k rozpouštění fosfolipidů.

t,

Mezi organická rozpouštědla pro enzymatickou reakci patří diethylether, isopropylether, butylether, n-hexan, cyklohexan, n-heptan, methylacetát, . t ethylacetát, butylacetát a tak dále. ' í

Voda a organické rozpouštědlo zbývající po enzymatické reakci, pokud to je i

nutné, může být použito i v následujícím frakcionačním procesu organickým rozpouštědlem bez jeho odstranění. V určitých případech je v následujícím frakcionačním postupu s organickými rozpouštědly potřeba i voda? Proto se tt * · 0 0 0 0 v dále uvedeném frakcionačním postupu s organickými rozpouštědly voda, která z enzymatické hydrolytické reakci zbude, použije, nebo se další voda dodá. ;

*Z^S'Í »«·<. '·'*'*· *' <Κ · · ·· 9 • * · · ·*· ; β :· · '0 o · > · · ,«.<>.· ·. 0 ·

I když fosfolipidová konverzní reakce běží, těžko lze očekávat 100 % i í

výtěžek konverze a není možné predéjít tvorbě vedlejších produktů, jako je ¹ kyselina fosfatidová (PA), kyselina lýsofosfatidová, atd. Jelikož je ‘ lysofosfolipid připravený enzymatičkou reakcí vysoce hydrofilní na svém ^: rozhraní, je obtížné jej zcela izolovat. Pokud se lysofosfolipid izoluje rozpouštědlovou extrakcí, je proces koncentrace obtížný, protože obsahuje vysoké procento vody, která vytváří v odpařovacím stupni bubliny. Po >

vytvoření lysofosfolipidu není tedy snadné selektivně izolovat z í _f lysofosfolípidu lysofosfatidylethanolamin. jelikož _s mají. í lysofosfatidylethanolamin i lysofosfatidylcholin - primární s složka ' lysofosfolipidu - blízké rozpustnosti v organických rozpouštědlech^ je tento :

stupeň izolace obtížný.

Pro řešení těchto problémů a ve snaze získat vysoce čistý * ¹ lysofosfatidylethanolamin, zavádí, předložený vynález způsob obsahující ' < působení vody a jednoho nebo více organických rozpouštědel vybíraných ze skupiny sestávající z alkoholu, uhlovodíku, alkylesteru a tak dále na výše uvedenou směs lysofosfolipidu obsahující LPIE, a potom krýstalizaci výsledné směsi. Jako výsledek zavádí předložený vynález způsob, který eliminuje nečistoty (tj. fosfolipid - například PC, LPC, PE, PA, atd.,'neutrální ^! lipidy, mastné kyseliny, cholesterol a tak dále, tedy všechny látky reakcí vytvořené) vyjma lysofosfatidylethanolaminu a tak může vyrábět vysoce

Ϊ čistý lysofosfatidylethanolamin. j i

' 7 .· , ' ,· · 0 · ’ ·4 ϊ , > · ' '·· • · ' « · · · · · • ” 4 ', ♦ , ·. · · ι> » Λ · · * · ♦, • · • · ····

- 10 - ...

Κ odstranění nečistot z reakční směsi vyjma lysofosfatidylethanolaminúíse ve frakcionačním postupu podle předloženého vynálezu ’ používá rozpouštědla, kterým je směs vody a jednoho nebo více organických rozpouštědel vybíraných ze skupiny sestávající z nižších alkoholů s 1 až 4 uhlíky (například methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, atd.)· jednoho nebo více uhlovodíků (alifatický uhlovodík se 6 áž 12 uhlíky, například pentan, hexan, cyklohexan, heptan, oktan, cyklooktan, methylcyklohexan, atd.); a alkylesterů karboxylové kyseliny (například methylacetát, ethylacetát, methylpropionát, methylbutyrát, methylkaproát, atd., mající 2 až 6 uhlíků). !

Ve stupni rozpouštědlové frakcionace se celkově použité množství rozpouštědla pohybuje v mezích od 0,5 do 20 násobku hmotnosti fosfolipidu, přednostně 5 až 10 násobku hmotnosti fosfolipidu.

Přednostně používanými organickými rozpouštědly v předloženém vynálezu jsou například methanol nebo ethanol jako .nižší alkoholy, hexan, cyklohexan nebo heptan jako uhlovodíky a ethylacetát jako alkylester.

Požadovaný objemový poměr směsi vody a organického rozpouštědla se pohybuje v mezích 0,5 až 80 : 20 až 99,5. Jak je výše uvedeno, pokud vé stupni hydrolytické reakce použitá voda nebo organické rozpouštědlo zbude nad rozsah, kterému se dává přednost, či nikoliv, přidává jse další odpovídající množství vody nebo organického rozpouštědla nebo nepřidává. V případě použití dvou nebo více druhů organických rozpouštědel, se jejich poměr nějak zvláště neomezuje. V případě použití směsi organických rozpouštědel obsahujících nižší alkohol, může být obsah tohoto nižšího alkoholu 10 až 99 % objemu. ’ ·

Po působení rozpouštědlové směsi organického rozpouštědla a. vody na výslednou reakční směs hydrolýzy fosfolipidu se získá vysoce čistý f

lysofosfatidylethanolamin touto cestou: krystalizací směsi při nízké teplotě v oblasti od -10°C do 50 °C, odstraněním nečistot odstředěním a filtrací či dekantací supernatantu. Krystalizační stupeň je možno provést regulací teploty, zvláště po rozpouštědlové frakcionaci, nebo jej lze provést souběžně s rozpouštědlovou frakcionaci.

V předloženém vynálezu je reakční teplota při rozpouštědlové frakcionaci fosfolipidu jedním z nejdůležitějších faktorů. Rozpustnosti lysofosfatidylethanolaminu a lysofosfatidylcholinu v organickém rozpouštědle jsou velmi závislé, na teplotě. Teplota pro selektivnější frakcionaci lysofosfolipidu se musí regulovat v mezích od -10°C do 50 °C, přednostně od -5 °C do 30 °C, či ještě lépe od -5 ⁰ do 6°C.

Podle předloženého vynálezu je pro účinnější frakcionaci velmi důležitá regulace pH reakce. Podle předloženého vynálezu se upřednostňuje pH mezi hodnotou 3 a 9, lépe mezi 4 a 8.

?

Krystaly LPE vytvořené ve stupni rozpouštědlové frakcionace a ve stupni krystalizace mohou být izolovány běžnými způsoby, například filtrací, odstředěním, dekantací supernatantu a tak dále. i (

• - (

I ' ř

Postup skládající se z frakcionace organickým rozpouštědlem, krystalizace a izolace krystalů lze provést jedenkrát. Pro,zlepšení čistoty LPE je možno postup provést dvakrát nebo vícekrát, zatímco druh a poměr složek ve směsi použitých organických rozpouštědel v každém postupu může být stejný nebo odlišný.

i í

I i

ř • ι·, · ·· ·4··

- 12 Postup přípravy lysofosfatidylethanolaminu podle předloženého vynálezu lze provádět v laboratorním měřítku či v průmyslovém měřítku? a lysofosfatidylethanolamin lze účinně připravovat bez jakýchkoliv dalších potíží. Takovýto vysoce čistý lysofosfatidylethanolamin připravený)s malými náklady lze široce využívat ve farmacii či zemědělství.

Jednotlivá řešení, kterým se podle vynálezu dává přednost ;

Předložený vynález bude objasněn na následujících příkladech. Tyto příklady jsou však uvedeny pouze pro ilustraci a nesmějí být považovány za postupy omezující rozsah vynálezu, který je vytyčen v doprovázejících patentových nárocích.

Příklad 1 g čištěného fosfolipidu vaječného žloutku (vyrobený u Doosarí Serdary Research Labs - 75 % fosfatidylcholinu, 14 %Tosfatidylethanolaminu, 11 % ostatních; % se míní hmotnostní %) se rozpustí v 80 ml chloroformu. K 1000 ml chloroformu se přidá 450 g silikagelu (Merck, 70 až 230 mesh) asměs se naplní do skleněné kolony o rozměrech 70 mm x 700 mm. Po nastříknutí výše uvedeného roztoku fosfolipidu dó kolony se tato kolona ěluuje 500 ml chloroformu, 1000 ml směsi chloroformu /methanolu (95 : 5; obj/obj), 1500 ml chloroformu : methanolu (90 ; 10; obj/obj), 2000 ml směsi chloroformu : methanolu (85 : 15; obj/obj), a potom se eluovaný fosfolipid zkouší tenkovrstvou chromatografií. Jednotlivé frakce fosfatidylethanolaminu se sbírají a potom koncentrují v rotační vakuové odparce při 50 °C.Í Získaný fosfatidylethanolamin zvýše uvedeného postupu se analyzuje HPLC (Shimazu, Japonsko). Jako výsledek se získá 18,5 g fosfatidylethanolaminu o čistotě 76 % (obsahující 11 % fosfatidylcholinu).

- 13 15 g takto získaného fosfatidylethanolaminu (obsahujícího 11 % fosfatidylcholinu) se rozpustí ve 150 ml diethyletheru a potom se do‘něj přidá 20 ml ústojného roztoku octanu sodného (pH 5,6, 100 mM) obsahujícího 100 mM CaCI₂. K roztoku se dále přidá 5 ml Lecitasy (10000 m.j..mr¹, vyrobené v Novo Nordisk A/S) a potom se tento roztok prudce míchá při 30 °C po dobu 13 hodin. Po ustání roztoku se rozpouštědlo a i

vznikla mastná kyselina oddělí dekantací supernatantu. Sraženina se za laboratorní teploty extrahuje 200 ml směsi hexan :: ethanol ; voda (v poměru 1:1: 0,3; obj/obj/obj). Po odstranění spodní vrstvy vodného roztoku se ke zbytku přidá 50 ml ethanolu a výsledný produkt se za laboratorní teploty zfiltruje. Na filtrační koláč se působí opět 100 ml roztoku hexan : ethanol (v poměru 1 :1; obj/obj), zfiltruje a vysuší. Analýzou výsledné suché látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 4,5 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 98 %.

i

Příklad 2 t

g fostatidylethanolaminu o čistotě 99 % (vyroben u Doosan · Serdary Research Labs.) se rozpustí v 50 ml ethylacetátu a potom se přidá 50 ml ústojného roztoku octanu sodného (pH 5,6, 100 mM) obsahujícího. 100 mM CaCI₂. Kvýše uvedenému roztoku se dále přidá 1 ml Lecitasy (Novo Nordisk A/S), potom se tento roztok při 30 °C prudce míchá po dobu 6 r

hodin. Po ustání roztoku po dobu 1 hodiny se za laboratorní teploty rozpouštědlo a vzniklá mastná kyselina oddělí dekantací supernatantu.

!

Sraženina se extrahuje 20 ml směsi hexan ; ethanol; voda (v poměru 1 : 1 ;

i

0,3; obj/obj/obj). Po odstranění spodní vrstvy vodného roztoku se ke zbytku přidá 5 ml ethanolu a výsledný produkt se při teplotě -5 °C ponechá stát 3 hodiny a potom se zfiltruje. Na filtrační koláč se působí opět 15 ml roztoku hexan : ethanol (v poměru 1 :1; obj/obj), zfiltruje a vysuší, /^nalýzou

výsledné suché látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 0,85 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 98 %.

- 14 9 4 4 4 ' · · * • · ·♦ .·' 4 4- 9

4 4 · · ·>

»·· '·'·» 9 '· * '· '· ♦ · 4

4’9 · ·· «·*·

Příklad 3

100 g přečištěného fosfolipidu z vaječného žloutku DS-PL95E (vyrobeno u Dorsan Serdary Research Labs. - 75 % fosfatidylcholinu, 14 % fosfatidylethanolaminu, 11 % ostatních) se rozpustí v 500 ml ethylacetátu. 8000 jednotek zelné fosfolipázy Ď připravené metodou podle Yanga (Yang,

S. F., et al., J. Biol. Chem., 242, (3), 477 - 484, 1967) se smísí s 500 ml ústojného roztoku octanu sodného (100 mM, pH 5,6) obsahujícího 80 mM CaCI₂ a 25 g ethanolaminu, potom se směs smísí s výše uvedeným roztokem fosfolipidu a ponechá ze za laboratorní teploty reagovat po dobu 13 hodin za současného míchání rychlostí 300 l.min'¹. HPLC analýzou výsledné sloučeniny bylo zjištěno, žé obsah fosfatidylethanolaminu v reakčním roztoku je 62 % a obsah fosfatidylcholinu 22 %. 500 ml reakčního roztoku se potom použije jako výchozí látka pro příklad 4.

K 500 ml reakčního roztoku se dále-přidá 10 ml Lecitasy (10000 m.j..ml·¹; Novo Nordisk A/S) a potom se tento roztok prudce míchá při 30 °C po dobu 6 hodin. Po ustání roztoku po 5 hodinách se rozpouštědlo a vzniklá mastná kyselina oddělí dekantací supernatantu. ^Zbývající reakční roztok se za laboratorní teploty extrahuje 1000 ml směsi hexan : ethanol (v poměru 1:1; obj/obj). Po oddělení supernatantu se ke zbytku přidá 200 ml ethanolu a výsledný produkt se ponechá stát při 4 °C po dobu 12 hodin. ;

Filtrací výsledného roztoku se potom získá filtrační koláč. Na získaný filtrační koláč se působí 200 ml roztoku hexan : ethanol : voda (v poměru 1 * - i ·· ' T ' 9 9 ' ' 4 *· · 4^X ' «Τ ' 4 * · '

V i 4 4 „ 9 9 · * ± ' i 9 «- » -4 4' · «44 * ' ó · · · * 4 . · · * · .

-·<>«.· a · 4:4. 44. \ 44· 'lití

- 15 :1 : 0,3; obj/obj/obj), zfiltruje se a ponechá stát po dobu 1 hodiny>Po oddělení dolní vodné vrstvy se ke zbytku přidá 100 ml ethanolu a provede se filtrace. Na získaný filtrační koláč se působí 200 ml roztoku hexan :

!

ethanol : (v poměru 1 :1; obj/obj), a ponechá stát při 4 °C po dobu 8 hodin. Následuje filtrace a sušení. Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 10,7 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 99 %.

I

Příklad 4 ^: ml Lecitasy (10000 m.j..ml·¹; Novo Nordišk A/S), se přidá k 500 ml roztoku připraveného v příkladu 3 a potom sé tato směs prudce míchá při 30 °C-po dobu 10 hodin. Po ustání roztoku se rozpouštědlo a vzniklá mastná kyselina oddělí dekantací supernatantu. Zbývající roztok se extrahuje 1000 ml směsi hexan : ethanol : voda (v poměru 1 ; 1 : 0;3; obj/obj/obj). Po odstranění supernatantu (tj. hexanové vrstvy) se ke zbytku přidá 200 ml methanolu a výsledný produkt se ponechá stát po dobu 2 hodin a následně se zfiltruje. Na získaný filtrační koláč se působí 200 ml roztoku hexan : methanol: voda (v poměru 1:1: 0,3; obj/obj/obj). Výsledná směs se ponechá stát 2 hodiny zfiltruje a vysuší ve vakuu při 60 °C. Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 8,5 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 98 %.

Příklad 5 g dipalmitoylfostatidylcholinu (vyroben u Doosan Serdary Research Labs.; 99 % fosfatidylcholin) se rozpustí v 500 ml diethyletheru. '

500 jednotek fosfolipázy D pocházející ze Streptomyces sp.' (Sigma Chemical Co.) se smísí s 500 ml ústojného roztoku octanu sodného (100 mM, pH 5,6) obsahujícího 80 mM CaCI₂ a 6 g ethanolaminu a potom se směs smísí s výše uvedeným roztokem fosfolipidů. Směs se ponechá za >

t

I

I

4 „·* '4 ♦ .4·

4 4 ·' 8 4 8 • 4 ·

4 4

4 4 « · 4 4 44

- 16 laboratorní teploty reagovat po dobu 48 hodin za současného míchání* při 300 l.min'¹. HPLC analýzou výsledné sloučeniny bylo zjištěno, že obsah dipalmitoylfosfatidylethanolaminu v reakčním roztoku fosfolipidu je 82 % a obsah dipalmitoylfosfatidylcholinu je 16 %. Kreakčnímu roztoku se přidá 5 ml Lecitasy (10000 m.j..mr¹; Novo Nordisk A/S) a potom se roztok prudce míchá při 30 °C po dobu 10 hodin. Po extrakci roztoku 300 ml směsi chloroform ; methanol (2:1; obj/obj) se spodní chloroformová vrstva při 50 °C zkoncentruje v rotační vakuové odparce k odstranění rozpouštědla. Jako výsledek se získá 8,2 g koncentrované látky. Koncentrovaná látka se za zahřívání rozpustí ve 100 ml směsi hexan : ethanol (1:1; obj/obj) a přidá se 60 ml vody. Po oddělení spodní vodné vrstvy se přidá 50 ml ethanolu a výsledná směs se uloží při -8 °C po dobu 4 hodiin a potom se zfiltruje. ~Na filtrační koláč se potom působí 100 ml roztoku hexanu s ethanolém (1:1; obj/obj), výsledná směs se zfiltruje a vysuší. Výše uvedený postup se dvakrát opakuje. Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografii bylo zjištěno, že 3,5 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 97 %.

•i

Příklad 6 g sójového fosfolipidu, tj. Phospholipon 90 G (vyroben u firmy Natterman Phospholipid GmbH; 94 % fosfatidylcholinu, 2 % lysofosfatidylcholinu, 4 % zbytek) se rozpustí ve 100 ml díéthyleťheru. 40 jednotek fosfolipázy D pocházející z Streptomyces sp. (Sigma Chemical Co.) se smísí se 100 ml ústojného roztoku octanu sodného (100 mM, pH 5,6) obsahujícího 40 mM CaCI₂ a 2,4 g ethanolaminu a potom se směs smísí s výše uvedeným roztokem fosfolipidu. Směs se ponechá za laboratorní teploty reagovat po dobu 36 hodin za současného míchání rychlostí 300 l.min':. HPLC analýzou výsledné sloučeniny bylo zjištěno, že I obsah

fosfatidylethanolaminu v reakční směsi je 72 % a obsah fosfatidylcholinu je

18,3 %.

- 17 K reakčnímu roztoku se přidají 2 ml Lecitasy (10000 m.j..ml·¹; Novo Nordisk A/S) a potom se roztok při 30 °C prudce míchá po dobu 5 hodin. Po extrakci roztoku 300 ml směsi chloroform : methanol (2:1; obj/obj) se spodní chloroformová vrstva při 50 °C zkoncentruje v rotační vakuové odparce k odstranění rozpouštědla a obdrží se 4,5 g výsledné látky. Výsledná směs se dvakrát vysráží 80 ml studeného acetonu a získá se v acetonu nerozpustná látka. Výsledná látka se za zahřívání rozpustí v 50 ml směsi hexan : ethanol (9:1; obj/obj) a potom se přidá 15 ml vody. Po 2 hodinovém stání se oddělí spodní vrstva a přidá se do ní 50 ml ethanolu. Výsledná směs se uloží při -8 °C na dobu 4 hodin a potom se při -8 °C zfiltruje. Na filtrační koláč se potom působí 100 ml roztoku hexanu s ethanolem (1:1; obj/obj), výslédná Směs se zfiltruje a vysuší. Výše uvedený postup se dvakrát opakuje. Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 0,9 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 86 %. >

Příklad 7 g přečištěného fosfolipidů z vaječného žloutku DS-PL95E (vyrobeno u Dorsan Serdary Research Labs. - 75 % fosfatidylcholinu, 14 % fosfatidylethanolaminu, 11 % zbytek) se rozpustí v 60 ml ethylacetátu. 800 jednotek fosfolipázy D pocházející z Štreptómyces sp. (Sigma Chemical Co.) se smísí se 100 ml ústojného roztoku octánu sodného (100 mM, pH 5,6) obsahujícího 80 mM CaCI₂ a 8 g ethanolaminu, potom se směs smísí s výše uvedeným roztokem fosfolipidů. Směs se ponechá za teploty 35 °C reagovat po dobu 13 hodin za současného míchání rychlostí 30Ó l.min'¹.

V, * · . -* · - « .

·Ο·4 ® «* '«♦ ♦·*<*

- 18 HPLC analýzou výsledné sloučeniny bylo zjištěno, že obsah fosfatidylethanolaminu v reakčním roztoku fosfolipidu je 79 %.a obsah fosfatidylcholinu je 16 %. K reakčnímu roztoku se přidají 3 ml Lecitasy (10000 m.j..ml'¹; vyrobeno u Novo Nordisk A/S) a potom se roztok prudce míchá při 35 °C po dobu 6 hodin. Na 50 ml reakčríího roztoku se působí 100 ml bezvodého ethanolu a výsledná směs se ponechá při -2 °C po dobu 30 minut stát, a potom se zfiltruje. K získanému filtračnímu koláči o hmotnosti 5,7 g se přidá 50 ml 80 % ethanolu a míchá se po dobu 30 minut rychlostí 300 l.min'¹. Výsledná směs se při -2 °C nechá stát po dobu 4 hodin a potom se zfiltruje. Za použití 50 ml 80 % ethanolu se výše uvedený postup dvakrát opakuje a potom se filtrační koláč vysuší) Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 1,5 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 97 %.

Příklad 8 ml reakčního roztoku připraveného podle příkladu 7 se při 40 °C zkoncentruje v rotační vakuové odparce k odstranění rozpouštědla, tj.

i ethylacetátu, a potom se provede stejný postup jako v příkladu 7. Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 1,9 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 95 % či více.

Příklad 9 ml reakčního roztoku připraveného v příkladu 7 se umístí do baňky s kulatým dnem a ve vakuové odparce se při 40 °C zkoncentruje k odstranění rozpouštědla, tj. ethylacetátu. Na zbytek se působí 100 ml bezvodého ethanolu a výsledná směs se ponechá při -2 °C po dobu jeden a půl hodiny stát, a potom se zfiltruje. K 8,9 g získaného filtračního koláče o se přidá 100 ml směsi ethanol : ethylacetát: voda (1 : 0,5 : 0,5; obj/obj/obj) a výsledná směs se zahřívá za pomalého míchání po dobu 30 minut. Výsledný roztok se zfiltruje k odstranění nečistot a zbývající roztok se nechá při -2 °C stát po dobu 3 hodin. Vykrystalizovaný roztok se zfiltruje a získá se filtrační koláč o hmotnosti 4,8 g. K získanému filtračnímu koláči se přidá 80 ml směsi ethanol ; ethylacetát; voda (v poměru 1 : 0,5 : 0,5; obj/obj/obj) a pomalu se za mírného míchání zahřívá na 60 °C po dobu 30 minut. Potom se směs ponechá pomalu zchladnout na teplotu -2 °C a zfiltruje se. Filtrační koláč se takto zpracuje ještě dvakrát stejně jako v předchozím způsobu a zbytek se vysuší ve vakuu při 30 °C. Analýzou výsledné vysušené látky kapalinovou chromatografií bylo zjištěno, že 1,6 g získaného lysofosfatidylethanolaminu má čistotu 97 %.

Porovnávací příklad 1 ml reakční směsi připravené podle příkladu 7 se extrahuje 50 ml směsi chloroform : methanol (2:1; obj/obj). Po odstranění horní vodné a methanolové vrstvy se ke spodní vrstvě přidá 10 ml ethanolu (nebo methanolu) a zbytek se ponechá stát při -5 °C po dobu 1 až 3 hodin. Analýzou výsledného produktu bylo zjištěno, že vykrystalizovaným produktem není vůbec lysofosfatidylethanolamin, ale že ve spodní vrstvě jakožto reakčním zbytku jde pouze o směs lysofosfatidylethanolaminu, ji ’ « » · · · · ·. ·

- 20 lysofosfatidylcholinu, mastných kyselin fosfatidylcholinu, sfingomyelinů a ; · fosfatidylethanolaminu. ' ;

Porovnávací příklad 2 i , í i ' Ιίο ml reakční směsi připravené podle příkladu 7 se extrahuje 30 ml ;

chloroformu. K odstranění horní vodné vrstvy se po dobu 5 minut odstřeďujé Á i rychlostí 2000 l.min¹. Analýzou spodní vrstvy tenkovrstvou chromatografii ; · i , ) i (TLC) se zjišťuje, že vykrystalizovanou látkou není vůbec ^t ‘ · - . v lysofosfatidylethanolamin, ale že ve spodní vrstvě jde pouze^o směs , ^: lysofosfatidylethanolaminu, lysofosfatidylcholinu, mastných ' kyselin | fosfatidylcholinu, sfingomyelinu a fosfatidylethanolaminu. _t

Porovnávací příklad 3 · í ¹ ml z reakční směsi připravené podlé příkladu 7 se extrahuje 30 ml ’ ethylacetátu (nebo hexanu). Po dobu 5 minut se odstřeďuje rychlostí 2000 >

l.min'¹. Analýzou spodní vrstvy tenkovrstvou chromatografii (TLC) se zjišťuje, že vykrystalizovanou látkou není vůbec lysofosfatidylethanolamin, ale že ve spodní vrstvě jde pouze o směs lysofosfatidylethanolaminu, lysofosfatidylcholinu, mastných kyselin, fosfatidylcholinu, sfingomyelinu a fosfatidylethanolaminu. i ’ .i

Vysoce čistý lysofosfatidylethanolamin připravený způsobem podle předloženého vynálezu tak, jak to bylo výše popsáno, se vyrábí s nízkými r

náklady a lze ho používat v oblasti potravinářství, medicíny, kosmetiky a

Í ;

zemědělství. ;

Claims (10)

1. Patentové nároky

   1. Způsob přípravy lysofosfatidylethanolaminu o vysoké čistotě vyznačující se následujícími kroky:

   (1) získání fosfolipidu působením fosfolipidovou hydrolázou na fosfolipidovou směs obsahující fosfatidylethanolamin za účelem konverze jmenovaného fosfatidylethanolaminu na lysofosfatidylethanolamln; ;

   , f (2) extrakce jmenovaného lysofosfolipidu směsí rozpouštědel obsahujících vodu a jedno nebo více organických rozpouštědel vybíraných ze skupiny sestávající z nižšího alkoholu, uhlovodíkTu a alkylesteru; .

   (3) vysrážení vykrystalizovaného lysofosfatidylethanolaminu stáním reakční směsi získané po extrakci při -10 °C až 50 °C; a (4) izolace sraženiny vytvořené vykrystalizováním lysofosfatidylethanolaminu · ⁴ i
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovaná směs fosfolipidů obsahuje fosfatidylethanolamin v množství od 10 do 99 % hmotnostních. ‘

   I
3. 3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se, tím, že jmenovaná směs fosfolipidů obsahuje fosfatidylethanolamin v množství od 30 do 99 % hmotnostních.
4. 4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovanou směsí fosfolipidů je sójový fosfolipid nebo fosfolipid z vaječného žloutku.

   • ··

   1« ····

   - 22
5. 5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se na jmenovanou směs fosfolipidů působí fosfolipid konvertázou za přídavku ethanolaminu, a tak se fosfatidylcholinová směs zkonvertuje na fosfatidylethanolamin.
6. 6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že fosfolipidovou hydrolázou je fosfolipáza A2.
7. 7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem je směs dvou nebo více rozpouštědel vybíraných ze skupiny sestávající z nižšího alkoholu s 1 až 4 uhlíky; alifatického nebo aromatického uhlovodíku majícího 6 až 12 uhlíků s přímým nebo rozvětveným řetězcem; a esteru majícího přímou nebo rozvětvenou mastnou kyselinu o 2 až 6 uhlících a přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu.
8. 8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že jmenovaným alkoholem je methanol nebo ethanol, jmenovaným uhlovodíkem je hexan, cyklohexan nebo heptan a jmenovaným alkýlesterem je ethylacetát.
9. 9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se konverze fosfolipidovou hydrolázou a extrakce provedou současně.
10. 10. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se krystalizace provádí při

    -10°Caž30°C. 5