CZ20022554A3 - ®ivý oslabený virus PRRS, nukleotidová sekvence a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Živý oslabený virus PRRS, nukleotidové sekvence a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká živých virů PRRS, které jsou oslabené mutacemi aminokyselin na specifických místech virového proteinu kódovaného otevřeným čtecím rámcem (ORF) zvoleným ze skupiny ORF 1a, ORF 1b a/nebo ORF 2. Vynález se také týká nukleotidových sekvencí kódujících uvedené viry, způsobů vytváření těchto virů a jejich použití pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a léčení infekcí PRRS.

Dosavadní stav techniky

Záhadné onemocnění vepřů, později nazvané reprodukční a respirační syndrom vepřů (porcine reproductive and respirátory syndrome, PRRS) je způsobeno virem RNA s pozitivním řetězcem opatřeným obalem ze skupiny arteriviridae (E. J. Snijder, 1998). Před přibližně 10 až 15 lety se náhle objevily zřejmě nezávisle v USA a v Evropě dva různé kmeny viru PRRS. Onemocnění je nyní endemické v mnoha zemích produkujících vepře v Severní Americe, Evropě a Asii. Je stále hlavní příčinou reprodukčních ztrát a respiračního onemocnění u vepřů. V USA se odhaduje rozšíření této infekce až na 70 %.

Virus se přenáší inhalací, polknutím, pohlavním stykem, poraněním při pokousání nebo jehlami. K jeho replikaci dochází v makrofázích siiznic, plic nebo v jiných oblastech.

Subklinicky vede onemocnění k rozptýlené nebo přetrvávající infekci. Zvířata s přetrvávající infekcí šíří virus v orálních/hltanových tekutinách, krvi, stolici, moči a semeni.

• · · ·

- 2 Klinické příznaky u prasnic se týkají potratu nebo předčasného porodu slabých živě narozených selat, mrtvě narozených selat a autolyzovaných plodů. Infikovaná novorozená selata mají vysokou úmrtnost nebo trpí zápalem plic. Následná péče o vepře a jejich růst jsou komplikovány zápalem plic, souběžnými bakteriálními infekcemi a zvýšenou úmrtností. U kanců je sklon k horečkám a morfologickým změnám semene.

Podobně jako u všech arterivirů tvoří genom viru PRRS jediná molekula RNA s pozitivním řetězcem o délce přibližně 15 kb. Otevřené io čtecí rámce (ORF) 1a a 1b kódují replikázy, ORF 2 až 5 domnělé glykoproteiny (gp 1 až 4), ORF 6 kóduje membránový protein (M) a

ORF 7 kóduje protein nukleokapsidy (N).

U původní infekce PRRS v USA (izolát ATCC VR-2332, uložený 18. července 1991 ve sbírce American Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA, Genebank U 87392 U00153) a v Evropě (WO 92/21375, izolát Lelystad Agent (CDI-NL- 2.91), uložený

5. června 1991 ve sbírce Institute Pasteur, Paris, depozitní číslo I1102) byly identifikovány viry s genomickými a sérologickými rozdíly. Srovnání ukázalo, že oba viry mají společného předka, u kterého došlo k rozdělení před popisem klinického onemocnění na konci 80. let. Pro celou řadu virů PRRS byly ukázány úplné sekvence genomu a jejich úplné oblasti kódující strukturní proteiny (Snijder a další, 1998, Meulenberg a další 1993b; Conzelmann a další, 1993; Murtaugh a další, 1995; Kapur a další, 1996).

Virus PRRS může být replikován in vitro v makrofázích vepřových plic, monocytech, gliálních buňkách a na dvou subpopulacích buněk MA-104 (buňky embryonální opičí ledviny) známých jako CL-2621 a MARC145 (K. D. Rossow, Porcin reproductive and respirátory syndrome, Vet. Pathol. 35: 1 - 20 (1998).

Jsou také dostupné rekombinantní prostředky pro vytváření infekčních klonů PRRS (EP 0 839 912 A1).

··· ·

Pro ochranu vepřů jsou komerčně dostupné živé oslabené vakciny proti PRRS (RespPRRS/Ingelvac® PRS MLV, Boehringer Ingelheim).

Neživé vakciny (inaktivovaný úplný virus) nebo podjednotkové 5 vakciny (běžně vyčištěné nebo heterologně exprimované čištěné virové proteiny) mají nejčastěji horší účinky než živé vakciny při produkci úplné ochranné imunitní odpovědi, a to i v přítomnosti adjuvantních látek. V případě PRRS bylo ukázáno, že v porovnání s běžně dostupnými neživými vakcinami indukují oslabené vakciny imunitu proti onemocnění, která déle přetrvává a je účinnější (Snijder a další, výše). Současné živé vakciny proti PRRS se oslabují běžně sériovým pasážováním viru ve vhodných hostitelských buňkách až do ztráty patogenity (EP 0529584 B1). U současných živých vakcin proti PRRS stále ještě existuje prostor pro další zlepšování. Tyto vakciny za is prvé nezabrání opakované infekci. Za druhé neumožní sérologické rozlišení mezi vakcinovanými zvířaty a zvířaty infikovanými virem z terénu. Nejdůležitejší ze všeho však je, že živé vakciny z úplných mikroorganismů, i když oslabených, mohou být spojeny s vážnými bezpečnostními riziky. To platí zvláště pro viry RNA jako je virus

PRRS, u kterých dochází k vysoké rychlosti mutace v důsledku nepřesné replikace genomu RNA, v důsledku nepřítomnosti opravného čtení enzymy replikujícími RNA.

Možnost reverze oslabných živých virů může představovat vážnou hrozbu pro vakcinováná* zvířata. Pro oslabené viry získané běžným způsobem, kdy se oslabení dosahuje běžným vícenásobným pasážováním, zůstávají molekulární původ stejně jako genetická stabilita neznámé a nelze předpovědět vypuknutí onemocnění způsobené revertovanými viry.

Předkládaný vynález proto řeší problém poskytnutí virů PRRS,

3o u kterých by k reverzi docházelo s nižší pravděpodobností než u virů standardního typu.

• ·

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká živých virů PRRS, které jsou oslabené aminokyselinovými mutacemi ve specifických místech virového proteinu kódovaného otevřeným čtecím rámcem (ORF) zvoleným ze skupiny ORF 1a, ORF 1b a/nebo ORF 2. Vynález se tako týká nukleotidových sekvencí kódujících uvedené viry, způsobů vytváření těchto virů a jejich použití pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a léčení infekcí PRRS.

Podrobný popis vynálezu

Řešení výše uvedeného technického problému je uvedeno v popisu a provedeních charakterizovaných v nárocích.

Před popisem jednotlivých provedení předkládaného vynálezu je is třeba zdůraznit, že v popisu a přiložených nárocích zahrnují formy jednotného čísla také větší počet jedinců, pokud není výslovně uvedeno jinak. Tak například výraz „virus PRRS“ zahrnuje větší počet takových virů PRRS, výraz „buňka“ odkazuje na jednu nebo více buněk a jejich ekvivalenty známé odborníkům v oboru atd. Pokud není

2o definováno jinak, všechny technické a vědecké termíny používané v přihlášce mají stejné významy, jaké jsou zřejmé odborníkovi v oboru, kterého se předkládaný vynález týká. Ačkoli při provádění nebo testování předkládaného vynálezu mohou být použity jakékoli metody a materiály podobné nebo stejné jako popisované metody a materiály, v dalším textu se popisují výhodné metody, zařízení a materiály. Všechny zde uváděné publikace jsou zahrnuty odkazem pro účely popisu a zveřejnění buněčných linií, vektorů a metod uváděných v těchto publikacích, které by mohly být použity v souvislosti s předkládaným vynálezem.

• « • ♦· · • ·

Překvapivě bylo zjištěno, že viry PRRS obsahují určitá místa v genomu v některých otevřených čtecích rámcích, u kterých v této poloze opakovaně dochází k reverzi aminokyselin původního virulentního kmene VR-2332 nacházeného v terénu. Na tuto formu, která bude dále nazývána „specifické virulenční místo“ (virulence specific site), nebo zjednodušeně „místo podle vynálezu“ nebo pouze „místo“ je vykonáván značný evoluční tlak. Pro dva revertované kmeny RespPRRS bylo možné poprvé ukázat, že mutace aminokyselin na aminokyselinu původního virulentního izolátu z terénu v tomto virulenčním specifickém místě probíhala geograficky nezávisle jak v USA, tak i Evropě.

Živé vakcíny s definovanými mutacemi sloužícími jako základ pro oslabení podle vynálezu umožňují vyhnout se nevýhodám současné generace oslabených vakcín. Další výhoda uvedených oslabujících mutací spočívá v jejich známé molekulové jedinečnosti, což umožňuje použití určitých značek pro oslabené škodlivé viry a jejich odlišení od škodlivých virů nalézaných v terénu.

Aminokyselinová a nukleotidová sekvence běžného oslabeného viru RespPRRS byla porovnána s původním izolátem VR-2332 z terénu. Pro identifikace specifických virulenčních míst byly vzájemně porovnány dva výše uvedené virulentní revertované kmeny a VR-2332, stejně jako RespPRRS.

To umožnilo identifikaci specifického virulenčního místa na *· λί’·'.4 jednom virovém proteinu, který se podle předpokladů účastní virulence virů PRRS.

Jedno provedení vynálezu se tedy týká živých virů PRRS, které nejsou RespPRRS, a které jsou méně virulentní než virus PRRS kmen ATCC VR-2332, a které se vyznačují tím, že obsahují protein kódovaný otevřeným čtecím rámcem (ORF) zvoleným ze skupiny ORF 1a podle obr. 1 pro uvedený kmen VR-2332, ORF 1b podle obr. 2 pro uvedený kmen VR-2332, a/nebo ORF 2 podle obr. 3 pro uvedený ·* · ·· · • · · • · • · · • · · ··· · ·· ···· kmen VR-2332, kde alespoň jedna z aminokyselin v identifikovaných specifických virulenčních místech není identická s alespoň jednou z aminokyselin kmene VR-2332 v odpovídajících polohách.

Číslování aminokyselin a nukleotidů odpovídá údajům v databázi pro VR-2332. Obr. 1, 2 a 3 poskytují informace reprezentativní pro všechny kmeny PRRS, které umožňují viditelné zobrazení vynálezu a identifikují výhodné aminokyseliny a výhodné místo u všech virů PRRS, které by mohly být odlišně číslovány. Identifikace těchto poloh se dosáhne identifikací zachovaných charakteristických identických io aminokyselin ve sledovaném kmenu PRRS a uvedeném referenčním kmenu a následným zjištěním polohy místa ve sledovaném viru vzhledem k místu ukázanému na obr. 1, 2 a/nebo 3.

Tři z těchto míst byla identifikována pro protein kódovaný virovými ORF 1a, ORF 1b a/nebo ORF 2, které jsou zobrazeny pro kmen VR-2332 v obr. 1, 2 a/nebo 3.

Další provedení vynálezu se týká živého oslabeného viru PRRS obsahujícího ORF 1a, 1b a 2 v podstatě tak jako ve VR-2332, který není RespPRRS, a který se vyznačuje tím, že alespoň jedna z aminokyselin v polohách 321 až 341 ORF 1a není nebo nejsou identické s aminokyselinou nebo aminokyselinami kmene VR 2332 v odpovídající poloze nebo polohách, jak je ukázáno na obr. 1 a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v polohách 936 až 956 ORF 1b není nebo nejsou identické s aminokyselinou nebo aminokyselinami kmene VR 2332 v odpovídající poloze nebo polohách, jak je ukázáno na obr.

2, a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 1 až 20 ORF 2 není nebo nejsou identické s aminokyselinou nebo aminokyselinami kmene VR 2332 v uvedené odpovídající poloze nebo polohách, jak je ukázáno na obr. 3. V místě 321-341 ORF1a, místě 936-956 ORF1b, a/nebo místě 1-20 ORF2 (viz obr. 4, 5 nebo 6), je tedy mutován jeden nebo

3o více kódujících nukleotidových tripletů pro jednu nebo více než jednu aminokyselinu, což vede k jedné nebo několika změnám v sekvenci ** 4444 v uvedených místech buď na úrovni nukleové kyseliny, nebo navíc a výhodně také na úrovni aminokyselin, přičemž mohou být mutovány až veškeré nukleotidové nebo aminokyselinové polohy v uvedeném místě. Předkládaný vynález zahrnuje viry, ve kterých je mutováno jedno, dvě nebo všechna tři uvedená místa. „Mutace“ znamená záměnu aminokyseliny za jinou aminokyselinu, nebo záměnu kódujícího nukleotidu jiným nukleotidem (např. C za T) a tzv. „substituci“, s výhodou takovou, že dojde ke změně kódované aminokyseliny, nebo jakoukoli jinou mutaci, jako je „delece“ nebo „inzerce“. Mutace se vždy provádí v kódující nukleotidové sekvenci.

Tyto mutace se mohou provádět standardními metodami známými v oboru, například místně specifickou mutagenezí (viz např. Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor,

New York) infekční kopie, tak jak se popisuje např. v Meulenberg a další, Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440: 199 - 206).

Výraz „v podstatě“ (essentially) znamená, že alespoň 75 % sekvence, s výhodou 85 % a nejvýhodněji veškerá sekvence kromě „míst“ podle vynálezu je identická s VR 2332. Mohou však být také mutovány další nukleové kyseliny kódující aminokyseliny mimo uvedená místa podle vynálezu. Takový virus podle vynálezu stále splňuje kritéria vynálezu, tj. má menší náchylnost k reverzi na virus standardního typu, a je také méně virulentní než VR 2332.

Živý virus PRRS podle vynálezu označuje virus PRRS tak jak je definován v publikaci E. J. Snijder a další (výše), který je schopný infikovat vepře a je schopný replikace ve vepřích. Běžným způsobem oslabeného viru RespPRRS konkrétně se vynález netýká. Tento virus není virem podle vynálezu a je specificky vyloučen (disclaimer) z rozsahu nároků. Virus RespPPRS je komerčně dostupný od firmy

Boehringer Ingelheim Vetmedica company (Ingelvace PRS MLV). Většina jeho sekvence je veřejně dostupná (Genebank AJ 223082).

• 9 9 ·9 « ·· ··»♦ »9 9·

Zvláště důležitá místa a aminokyseliny podle vynálezu nejsou v žádném případě omezeny na přesnou polohu jak je definována pro kmen VR-2332, ale jednoduše se používají formou příkladu pro ukázání výhodných aminokyselin, které se v této poloze nacházejí, nebo které se nacházejí v poloze odpovídající poloze v jiných kmenech PRRS. Pro různé viry PRRS může být číslování poloh výhodných aminokyselin odlišné, ale odborník v oboru molekulární biologie virů ze skupiny arteviridae může snadno identifikovat tyto výhodné aminokyseliny pomocí jejich polohy vzhledem k jiným io konzervovaným aminokyselinám uvedených proteinů.

Termín „méně virulentní než virus PRRS VR-2332“ má být chápán z hlediska porovnání klinických příznaků způsobených sledovaným virem s příznaky způsobenými virem VR-2332. Výhodný postup pro zjištění, zda je virus PRRS méně virulentní než virus PRRS kmen VR-2332 je uveden v příkladu 1. O všech možných výhodných aminokyselinových mutacích ve specifickém virulenčním místě nelze předpokládat, že by snížily virulenci. Postup podle příkladu 1 poskytuje přesné a jednoznačné experimentální uspořádání pro zjištění, zda je živý virus PRRS, který obsahuje protein podle předkládaného vynálezu, méně virulentní než virulentní izolát VR-2332 z terénu.

Specifické virulenční místo bylo identifikováno reverzí alespoň jedné aminokyseliny z oslabeného viru na aminokyselinu viru VR2332. Tato konkrétní aminokyselina je součástí větší sekundární v?

struktury peptidu, jako je alfa šrouboviče nebo β-iist nebo vlásenkový 25 motiv β nebo jiné struktury. Proto je vysoce pravděpodobné, že regulace virulence tohoto proteinu se také účastní okolní aminokyseliny. Odborník v oboru chemie proteinů by proto očekával vysokou pravděpodobnost identifikace dalších aminokyselin s předpokládanými vlastnostmi z hlediska virulence v okolí deseti aminokyselin nalevo a napravo vzhledem k původně identifikované poloze aminokyseliny. V proteinech je 10 až 20 aminokyselin typické rozmezí pro peptidové motivy. Proto obsahují výhodné viry podle ♦· ·»·· ·· ♦«« * < 0 0

0000 ·· 0« * * * 0

0 0 ••0 • 0 · • 0 0 0 0 0 předkládaného vynálezu protein popsaný v obr. 1 jako příklad nebo jemu odpovídající struktury v jiných kmenech, kde specifické virulenční místo zahrnuje 10 aminokyselin proti směru transkripce a 10 aminokyselin po směru transkripce vzhledem k původně identifikované poloze aminokyseliny. Výhodnější jsou viry uvedené výše, ve kterých specifické virulenční místo zahrnuje 5 aminokyselin proti směru transkripce a 5 aminokyselin po směru transkripce vzhledem k původně identifikované poloze aminokyseliny. Nejvýhodnější jsou viry uvedené výše, ve kterých specifické virulenční místo zahrnuje 3 io aminokyselin proti směru transkripce a 3 aminokyselin po směru transkripce vzhledem k původně identifikované poloze aminokyseliny.

V rámci předkládaného vynálezu je možné vytvořit oslabené kmeny PRRS z virulentních kmenů z terénu mutací aminokyselin ve specifickém virulenčním místě. Stále však zůstává bezpečnostní problém související s vysokou frekvencí mutace virů RNA. Tento problém může být podstatně omezen delecí specifických aminokyselin ve specifickém virulenčním místě virového proteinu. Vynález se tedy týká virů PRRS uvedených výše, které se vyznačují tím, že alespoň jedna aminokyselina ze specifického virulenčního místa virového proteinu je deletována. Termín „deletovaný“ je chápán v tom smyslu, že aminokyselina je nepřítomná při porovnání s aminokyselinami uvedenými na obrázku v příslušné poloze nebo polohách. Podle vynálezu tedy výraz „delece“ znamená odstranění jednoho nebo několika nukleotidů nebo aminokyselin/’

Ve výhodnějším provedení se proto vynález týká živého oslabeného viru PRRS podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že je deletována alespoň jedna z aminokyselin v poloze 321 až 341 ORF 1a a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 936 až 956 ORF 1b a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 1 až 20 ORF 2. Došlo tedy k deleci kódujícího nukleotidu pro jeden triplet aminokyseliny nebo pro několik tripletů buď v místě 321-341 ORF 1a, 936-956 ORF 1b, nebo 1-20 ORF 2 nebo ve všech třech místech, což vedlo • 0 000« ·· 000 0 • 000

• 0

- 10 • · 0 0 * 0 0 • 0

0 0 0 k jedné nebo několika delecím v uvedených místech. Vynález zahrnuje viry, ve kterých je deletován pouze jeden nukleotid nebo jedna aminokyselina stejně jako viry, ve kterých došlo k úplné deleci jakéhokoli z uvedených míst nebo dokonce všech míst (viz obr. 4, 5 nebo 6).

Pro identifikované specifické virulenční místo na určitém proteinu viru PRRS bylo ve výhodném příkladu ukázáno, že alespoň jedna kyselina je vystavena vysokému mutačnímu tlaku a účastní se virulentních vlastností revertantů kmene VR-2332 z terénu. Tato io individuální poloha aminokyseliny představuje nejvýhodnější provedení vynálezu.

V nejvýhodnějším provedení se proto předkládaný vynález týká živého oslabeného viru PRRS podle vynálezu, který není RespPRRS, a který je méně virulentní než kmen ATCC VR 2332, a který se vyznačuje tím, že aminokyselina v poloze 331 ORF 1a a/nebo aminokyselina v poloze 946 ORF 1b a/nebo aminokyselina v poloze 10 ORF 2 není identická (nebo nejsou identické) s aminokyselinou kmene ATCC VR 2332 v uvedené odpovídající poloze. Je tedy mutován kódující nukleotid pro jeden triplet aminokyseliny, nebo aminokyselina

2o nebo více těchto sekvencí v kterémkoli z míst 331 ORF 1a, 946 ORF 1b, nebo 10 ORF 2, což vede k jedné až třem mutacím v uvedených místech (viz obr. 4, 5 nebo 6).

Z výše uvedených důvodů je bezpečnější a výhodné zabránit reverzi změněných aminokyselin na virulentní typ jednoduchou deleci aminokyseliny, která je k reverzi náchylná.

Předkládaný vynález se tedy ve svém nejvýhodnějším provedení týká živého oslabeného viru PRRS podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že je deletována jedna nebo více aminokyselin v poloze 331 ORF 1a a/nebo v poloze 946 ORF 1b a/nebo v poloze 10 ORF 2, tedy jinými

3o slovy, že tyto aminokyseliny jsou ve srovnání s těmito polohami ve viru VR-2332 nepřítomny. Další nejvýhodnější provedení je živý oslabený • fc fcfcfc· fcfc ♦ fcfc · • · • · • ♦ fcfcfc • fcfcfc fcfc • fc • fc • fc fc fc

- 11 fc · virus PRRS podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že je deletována aminokyselina v poloze 331 ORF 1a, tj. je deletován kódující triplet. Další nejvýhodnější provedení je živý oslabený virus PRRS podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že je deletována aminokyselina v poloze 946 ORF 1b, tj. kódující triplet. Další nejvýhodnější provedení je živý oslabený virus PRRS podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že je deletována aminokyselina v poloze 10 ORF 2, tj. kódující triplet (viz obr. 4, 5 nebo 6). Uvedený nejvýhodnější virus je ve všech ostatních polohách identický s virem VR-2332.

io Poznatky předkládaného vynálezu nyní umožňují odborníkovi rekombinantně produkovat infekční klony virů PRRS, které mají nižší virulenci než virus VR-2332, a jsou využitelné pro přípravu živých farmaceutických prostředků. Všechny informace nezbytné pro produkci rekombinantních infekčních klonů virů RNA s pozitivním řetězcem jsou snadno dostupné v oboru, zvláště pro virus PRRS. Například evropská patentová přihláška EP 0 839 912, autorů Meulenberg a další, která se jako celek zařazuje odkazem, poskytuje jasný návod pro přípravu rekombinantních živých virů PRRS. V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká nukleotidových sekvencí kódujících virus podle vynálezu. V důsledku degenerace genetického kódu vede k identické translaci aminokyseliny větší počet nukleotidových variant. Tyto degenerované varianty jsou rovněž zahrnuty v rámci vynálezu.

Jak je uvedeno v úvodu, pro udržování dobrého zdravotního •v 9 stavu vepřů je důležité rozlišení mezi rřiéně virulentním kmenem živé vakciny z farmaceutického prostředku a infekcí virulentním virem standardního typu. To je často obtížné, zvláště pokud nejsou klinické příznaky infekce získané v terénu specifické, nebo jsou v průběhu pozorování překryty jinými infekcemi a doba vyhodnocení je krátká. Rekombinantní vytváření virů umožňuje zavedení modifikací genetického kódu, které vytvoří sérologický markér a/nebo markér virulence. Sérologický markér označuje antigenně detekovatelnou molekulu jako je peptid, protein nebo glykoprotein, které mohou být • 4 4 ·4 · •V 444 · •444 44 ·· 44

4 4 4 •4 f

4 4

4 4

4444 izolovány z infikovaných buněk nebo tělesných tekutin, jako jsou bez omezení tekutiny z jícnu nebo nosu nebo moč. Pod markérem virulence se rozumí markér v genetickém kódu, který může být identifikován rekombinantními analytickými metodami, jako je bez omezení PCR a běžné sekvenování. Proto se ve výhodném provedení předkládaný vynález týká nukleotidové sekvence podle vynálezu, kde nukleotidové sekvence byla modifikována tak, že kóduje markér virulence a/nebo sérologický markér. Jako markéry virulence a sérologické markéry jsou zvláště využitelné mutace nebo delece io zavedené pro účely oslabení virulence. Monitorováním těchto mutací v popsaných specifických virulenčních místech je možné v časném stadiu předpovědět vznik virulentní nebo potenciálně virulentní revertanty.

Výhodnější je, jestliže jsou nukleotidové sekvence podle vynálezu takové, že nukleotidové sekvence kódující uvedený markér je umístěna v rámci jakéhokoli z otevřených čtecích rámců kódujících strukturní virové proteiny.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu vytváření infekčního živého oslabeného viru PRRS podle vynálezu, kde tento způsob zahrnuje produkci rekombinantní nukleové kyseliny jak bylo popsáno výše, obsahující alespoň jednu úplnou kopii DNA nebo kopii RNA přepisované in vitro nebo jejich derivát.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu podle vynálezu, kde jsou molekulárně biologickými metodami vloženy specifické mutace, který se vyznačuje tím, že nukleová kyselina odpovídající polohám aminokyselin 321 až 341 ORF 1a a/nebo nukleová kyselina odpovídající polohám aminokyselin 936 až 956 ORF 1b a/nebo nukleová kyselina odpovídající polohám aminokyselin 1 až 20 je mutována tkovým způsobem, že je substituován nebo deletován alespoň jeden nukleotid v uvedených polohách.

* * 0*00 • » ·· 0000

- 13 Další důležité provedení vynálezu představuje farmaceutický prostředek obsahující virus PRRS podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

„Farmaceutický prostředek“ se v podstatě skládá z jedné nebo 5 více složek schopných modifikovat fyziologické, například imunologické funkce organismu, kterému byl podán, nebo organismu žijícímu v nebo na jeho povrchu, bez omezení na antibiotika nebo antiparazitika, stejně jako jiných složek přidaných k farmaceutickému prostředku pro dosažení některých jiných cílů, jako je například bez io omezení zpracování, sterilita, stabilita, vhodnost pro podávání prostředku enterálními nebo parenterálními cestami jako je orální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intradermáiní nebo jiný vhodný způsob, tolerance po podání a vlastnosti týkající se řízeného uvolňování.

Farmaceuticky přijatelný nosič může obsahovat fyziologicky přijatelné složky, které působí například pro stabilizaci nebo zvýšení absorpce nebo tvoří část formulace s pomalým uvolňováním s obsahem viru PRRS podle vynálezu. Tyto fyziologicky přijatelné látky zahrnují například uhlohydráty jako je glukóza, sacharóza nebo dextrany, antioxidanty jako je kyselina askorbová nebo glutathion, chelatační prostředky, nízkomolekulární proteiny nebo jiné stabilizátory nebo pomocné látky (viz také např. Remingtonů Pharmaceutical Sciences (1990), 18. vydání, Mack Publ., Easton). Odborníku v oboru by byla zřejmá volba farmaceuticky přijatelného nosiče včetně fyziologicky přijatelné sloučeniny v závislosti například na způsobu podávání prostředku.

Další provedení vynálezu se týká použití virů podle vynálezu. Jestliže jsou nyní dostupné živé oslabené viry PRRS podle vynálezu, je možno je používat při výrobě vakciny pro prevenci a léčení infekcí

3o PRRS. Viry podle vynálezu jsou výhodnější než v současnosti dostupné běžné oslabené viry z důvodů definovaného molekulárního ·· * * f «« « • 9 základu oslabení. Použití virů podle vynálezu obsahujících delece ve specifických virulenčních místech je zvláště výhodné, protože delece jsou méně náchylné k reverzi.

Následující příklad slouží pro další ilustraci předkládaného vynálezu, avšak nemá být považován za omezující rozsah vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Aminokyselinová sekvence ORF 1a kmene ATTC VR-2332 s vyznačenými výhodnými místy oslabení podle vynálezu.

io Obr. 2: Aminokyselinová sekvence ORF 1b kmene ATTC VR-2332 s vyznačenými výhodnými místy oslabení podle vynálezu.

Obr. 3: Aminokyselinová sekvence ORF 2 kmene ATTC VR-2332 s vyznačenými výhodnými místy oslabení podle vynálezu.

Obr. 4: Nukleotidová sekvence ORF 1a kmene ATTC VR-2332, ve které jsou výhodná místa oslavení podle vynálezu vyznačena tučně a nejvýhodnější místa podtržené.

Obr. 5: Nukleotidová sekvence ORF 1b kmene ATTC VR-2332, ve které jsou výhodná místa oslavení podle vynálezu vyznačena tučně a nejvýhodnější místa podtržené.

Obr. 6: Nukleotidová sekvence ORF 2 kmene ATTC VR-2332, ve které jsou výhodná místa oslaveni podle vynálezu vyznačena tučně a nejvýhodnější místa podtržené.

• * t · • *

Λ ·» ·»»·» • · · • 4 • · * · · ··♦* ·« ·♦

- 15 • 9 • 4 • 44»

Odkazy

1. Snijder E. J., Meulenberg J. J. M., 1998. The molecular biology of arteriviruses, Journal of General Virology May 79(5): 961 971.

2. Meulenberg J. J. M., Hulst, Μ. M. a další, 1993b. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemie abortion and respirátory syndrome, Virology 192, 62 - 72.

3. Conzelmann K. K., Visser N., Van Woensel P., Thiel H. J., 1993. Molecular characterization of porcine reproductive and io respirátory syndrome virus, a member of the arterivirus group,

Virology 103, 329 - 339.

4. Murtaugh Μ. P., Elám M. R., Kakach L. T., 1995. Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus, Archives of Virology 140, 1451 - 1460.

5. Kapur V., Elám M. R., Pawtovich T. M., Murtaugh Μ. P., 1996. Genetic variation in porcine reproductive and respirátory sydrome virus isolates in the midwestern United States, Journal of General Virology 77, 1271 - 1276.

6. Rossow K. D., 1998. Porcine reproductive and respirátory syndrome, Vet. Pathol. 35: 1 - 20.

• 0 • · e

; · · ·* ·*·♦ • · · •000 00

- 16 00 • 0 0 0 0000

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Prokázání oslabení viru

Tento příklad poskytuje jasný návod pro porovnání virulentního 5 charakteru dvou různých kmenů virů PRRS.

V každém pokusu je zahrnuto alespoň deset mladých prasnic, které pocházejí z farmy prosté PRRS.

Zvířata se testují na přítomnost protilátek specifických pro virus PRRS v séru a na negativitu na virus PRRS. Všechna zvířata zařazená io do experimentu jsou ze stejného zdroje a stejné linie. Uspořádání zvířat do skupin je náhodné.

Testovací podání se provádí v 90. den březosti pomocí intranazální aplikace 1 ml viru PRRS s hodnotou 10⁵ TDCID50 (třetí pasáž) do každého nosního otvoru. V každém textu jsou alespoň tři skupiny:

Jedna skupina s testovacím podáním VR-2332; jedna testovací skupina, které se podá pravděpodobně oslabený virus; a jedna přísně kontrolní skupina.

Studie se považuje za platnou, jestliže přísné kontroly zůstanou 20 po celý průběh studie negativní na PRRS a jestliže se v kontrolní skupině, které byl podán virus VR2332? narodí o alespoň 25 % méně zdravých selat ve srovnáni s přísnou kontrolou.

Oslabení, jinak řečeno nižší virulence, se definuje jako statisticky významná změna jednoho nebo více parametrů určujících reprodukční schopnost:

Výhodné je podstatné snížení alespoň jednoho z následujících parametrů v testované skupině:

četnost výskytu mrtvě narozených selat • · • · · · • · · · potrat před 112. dnem březosti počet mumifikovaných selat počet živých a slabých selat úmrtnost před odstavením

Dále je výhodné podstatné zvýšení alespoň jednoho z následujících parametrů testované skupiny:

počet odstavených selat na prasnici počet živě narozených zdravých selat na prasnici

- porovnání se skupinou infikovanou VR2332.

Claims (5)

1. Živý oslabený virus PRRS obsahující ORF 1a, 1b a

2 5 v podstatě jako ve VR-2332, kterým není RespPRRS, který se vyznačuje tím, že alespoň jedna z aminokyselin v poloze 321 až 341 ORF 1a není identická s aminokyselinou kmene VR 2332 v odpovídající poloze nebo polohách a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 936 až 965 ORF 1b není io identická s aminokyselinou kmene VR 2332 v odpovídající poloze nebo polohách a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 1 až 20 ORF 2 není identická s aminokyselinou kmene

VR 2332 v odpovídající poloze nebo polohách.

15 2. Živý oslabený virus PRRS podle nároku 1, kde alespoň jedna z aminokyselin v polohách 321 až 341 ORF 1a je deletována a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 936 až 956 ORF 1b je deletována a/nebo alespoň jedna z aminokyselin v poloze 1 až 20 je deletována.

3. Živý oslabený virus PRRS podle některého z nároků 1 nebo 2, kde aminokyselina v poloze 331jORF 1a a/nebo aminokyselina v poloze 946 ORF 1b a/nebo aminokyselina v poloze 10 ORF 2 není nebo nejsou v odpovídající poloze identické s

25 aminokyselinou kmene ATCC VR 2332.

4. Živý oslabený virus PRRS podle některého z nároků 1 nebo 3, kde aminokyselina v poloze 331 ORF 1a a/nebo aminokyselina v poloze 946 ORF 1b a/nebo aminokyselina v poloze 10 ORF 2

30 je nebo jsou deletovány.

• · · · • · · · • * ·· ·· • · · ·

- 19 5. Nukleotidové sekvence kódující virus podle některého z nároků 1 až 4.

5

6. Nukleotidové sekvence podle nároku 5, kde tato nukleotidové sekvence je modifikována pro kódování markéru virulence a/nebo sérologického markéru.

7. Nukleotidové sekvence podle nároku 6, kde nukleové kyselina io kódující uvedený markér je umístěna v kterémkoli z otevřených čtecích rámců kódujících virové strukturní proteiny.

8. Způsob vytváření infekčního živého oslabeného viru PRRS, kde uvedený způsob zahrnuje produkci rekombínantní nukleové

15 kyseliny obsahující alespoň jednu úplnou kopii DNA nebo kopii

RNA přepisovanou in vitro nebo derivát kterékoli z těchto sekvencí, vyznačující se tím, že tato nukleotidové sekvence je nukleotidovou sekvencí podle některého z nároků 5 až 7.

9. Způsob podle nároku 8, kde specifické mutace jsou vloženy metodami molekulární biologie/ vyznačující se tím, že nukleové kyselina odpovídající polohám aminokyselin 321 až 341 ORF 1a a/nebo nukleové kyselina

25 odpovídající polohám aminokyselin 936 až 956 ORF a/nebo nukleové kyselina odpovídající polohám aminokyselin 1 až 20 je mutována takovým způsobem, že je substituován nebo deletován alespoň jeden nukleotid v uvedených polohách.

• * • · · · • ·· · * ·

- 20 10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje virus PRRS podle některého z nároků 1 až 4 a farmaceuticky přijatelný nosič.

5 11. Použití viru PRRS podle některého z nároků 1 až 4 při výrobě vakciny pro prevenci a léčení infekcí PRRS.