CZ20022757A3 - Způsob zvyšování genové exprese transfektovaných genů - Google Patents
Způsob zvyšování genové exprese transfektovaných genů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022757A3 CZ20022757A3 CZ20022757A CZ20022757A CZ20022757A3 CZ 20022757 A3 CZ20022757 A3 CZ 20022757A3 CZ 20022757 A CZ20022757 A CZ 20022757A CZ 20022757 A CZ20022757 A CZ 20022757A CZ 20022757 A3 CZ20022757 A3 CZ 20022757A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- alc
- carnitine
- cells
- transfected
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O (R)-carnitinium Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC(O)=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O 0.000 claims abstract 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N O-acetyl-L-carnitine Chemical compound CC(=O)O[C@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 44
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 4
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- -1 C 6 alkanoyl L-carnitines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Způsob zvyšování genové exprese transfektovaných genů
- Oblast techniky
Zde popisovaný vynález se týká použití C1 - C6 alkanoyl-L-karnitiňů, zvláště acetyl-L-karnitinu k přípravě rekombinantních proteinů.
Dosavadní stav techniky
Výroba proteinů technologií genetického inženýrství, tj. využíváním buněčných klonů, ve kterých jsou vloženy geny transfekcí, je známa. Jeden z problémů, se kterým je nutno počítat při použití transfektovaných klonů tkví v tom, že po určité době se geny uměle do buněk vkládané za účelem tvorby požadovaného proteinu utlumí. Problém útlumu genů si uvědomujeme mnohem pronikavěji v genové terapii. V tomto případě geny, které byly pacientovi vloženy přestávají vytvářet terapeuticky nezbytný protein.
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že CrC6 alkanoyl-L-karnitiny a zvláště acetyl-L-karnitin nebo L-karnitin zvyšuje genovou expresi transfektovaných genů.
„Karnitinem“ je pro účel tohoto vynálezu míněn Ci-C6 alkanoyl-L-karnitin nebo L-karnitin. V následujícím popisu, čistě jako příklad, se bude odkazovat na upřednostňované řešení s acetyl-L-karnitinem.
Působení acetyl-L-karnitinu transferovaného do buněčných klonů známými technikami, např. liposomy, transferovanými geny, značně zvyšuje expresi pro ně kódovaných proteinů. .
• · , ·· · · ·· ·· • ·· · · · · · · · • · · · · · · · e ·· ·· ······ ·» ····
- 2 Předmětem předloženého vynálezu je způsob zvýšení genové exprese transfektovaných genů spočívající v podávání acetyl-L-kamitinu.
Z hlediska průmyslové využitelnosti při použití acetyl-L-karnitinu odkazuje zde popisovaný vynález na zvýšení exprese rekombinantních proteinů současně se způsobem výroby těchto rekombinantních proteinů spočívající v použití acetyl-L-karnitinu ke zvýšení exprese jmenovaných proteinů.
V terapeutické oblasti a v oblasti genetického inženýrství obecně, je předmětem zde popisovaného vynálezu použití acetyl-L-karnitinu k přípravě produktu vhodného ke genové terapii zlepšující expresi proteinů, rovněž tak jako jeho použití (acetyl-L-karnitinu) k přípravě produktu vhodného k udržení transfektovaných genů v klonech.
Zde popisovaný vynález je dále ilustrován dále uváděnou pokusnou částí.
Materiály a metody
Pokusy in vitro
Buněčné kultury.
Byly použity buněčné linie HeLa ATCC rakoviny děložního hrdla. Buňky byly kultivovány v mediu RPMI 1640 (eurobio) obsahujícím antibiotika a 10 % fetální telecí sérum.
- 3 Pokusy s acetyl-L-karnitinem (ALC).
4.106 a 5.106 buněk kultivovaných v mediu obsahujícím ALC o výsledné koncentraci 5 mM a 10 mM bylo naočkováno do dvou 125 ml lahví, přičemž 2.10® buněk, na které se nepůsobilo ALC byly naočkováno do 75 ml lahve. Pokus byl opakován po 48 hodinách (shodující se s naočkováním buněk pro transfekci) a po 72 hodinách (na konci transfekce) a opakoval se také po 120 hodinách, a to pouze u vzorků transfektovaných na lysi ve 72 hodině.
Přechodná transfekce plasmidu pRL-CMV
Buňky pro transfekci byly naočkovány 24 hodin předem na 12 jamkové plotny (Corning) v počtu odpovídajícím 10® buněk na jamku. Transfekce byla provedena trojnásobně pro každý vzorek s použitím liposomu DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a plasmidu pRL-CMV (Promega, č. kat. E2261). Stručně: na každý vzorek bylo použito 1,5 pg DNK na jednu :ι· jamku a 9,2 μΜ liposomu na jednu jamku s tím, že konečný objem byl 1050 μΙ na jeden vzorek; transfekční směs (25 μΙ na vzorek) byla ponechána při teplotě okolí po dobu 30 minut a potom přidán HBS2x (20 mM HEPES, 150 mM NaCI, pH 7,4) v množství 25 μΙ roztoku na jeden vzorek a 50 μΙ takto získaného roztoku z jednoho vzorku bylo přidáno k buňkám na dobu 5 hodin. Po provedení tří promytí PBS (fosforečnanový ústojný roztok o pH 7,4) bez vápníku a hořčíku se ponechaly buňky kultivovat v růstovém mediu obsahujícím ALC v koncentracích vyznačených u pokusů až do doby lyže buněk na luciferázovou zkoušku. Jako kontrolní byla přidána čistá DNK v roztoku 1x HBS.
·· . · · • · ·· ··
Luciferázová zkouška v transferovaných vzorcích in vitro
Buňky byly promyty PBS (fosforečnanový ústojný roztok o pH 7,4) bez vápníku a hořčíku a podrobeny lyži přídavkem 200 μΙ lyzačního ústojného roztoku obsaženého v soupravě GeneLux L002-100 (Wallac) používané pro luciferázovou zkoušku. Po 20 minutách byly odebrány celkové proteiny a 10 μΙ z každého vzorku analyzováno na luciferázu postupem uvedeným v soupravě; zkouška byla provedena na 96 jamkových plotnách za použití luminometru Victor2 (Wallac). Získané hodnoty luminiscence vyjádřené v relativních světelných jednotkách (RLU) byly přepočteny na mg celkových proteinů s použitím výpočtu Bradfordovy metody.
Pokusy in vivo
Působení acetyl-L-karnitinem (ALC)
Použitými zvířaty pro pokusy in vivo byly myši Balb/c (Harlan), a to v každé skupině 5 zvířat. Skupiny byly rozděleny na kontrolní zvířata (3 skupiny) a na zvířata (6 skupin), která dostávala orálně ALC v dávce 100 mg.kg'1. Pokus začal čtyři dny před transfekcí při denním podávání a byl opakován každý den až do utracení.
Utracení zvířat
Zvířata byla utracena 24, 48 a 72 hodin po transfekci.
Z každého zvířete byly odebrány plíce, promyty fyziologickým roztokem, zváženy, zmraženy kapalným dusíkem a skladovány při -80 °C až do doby extrakce proteinu.
- 5 Transfekce plasmidu pRL-CMV
Zvířata tvořící kontrolní skupiny a tři skupiny zvířat zkoušených ALC obdržely intravenozní injekce 25 pg pRL-CMV plasmidu na jednu myš použitím liposomu o koncentraci 12 pm. pg'1 injikované DNK. Liposomy a DNK byly smíseny v roztoku PBS a uchovávány na ledu po dobu 1 hodiny ř před injikováním. Další tři skupiny zkoumaných zvířat obdržely injekce 25 pg pRL-CMV plasmidu na jednu myš v roztoku samotného PBS. Výsledný objem injikovaného roztoku každému zvířeti byl 208 pl.
Extrakce proteinů z plic a luciferázová zkouška
Výsledky
Exprese luciferázy při transfekci in vitro 'i
Lyzáty ve 24 hodině. Exprese luciferázy získaná ze vzorků zkoušených s ALC byla vyšší než u vzorků kontrolních buněk. Střední hodnota RLU na mg celkových proteinů počítaná na základě trojnásobně provedených vzorků vykazovala v porovnání s kontrolními vzorky přibližně 1,6 násobné zvýšení u vzorků na které se působilo 5 mM ALC. Navíc bylo pozorováno, že ve vzorcích zkoušených s 10 mM ALC nebylo žádné další zvýšení. Získané výsledky ukazují, žé neexistuje vztah dávkové závislosti mezi ALC a expresí luciferázy, a to alespoň u koncentrací použitých v našich pokusech, zatímco na expresi transfektované luciferázy kladný účinek vykazují. U vzorků transfektovaných samotnou DNK, která tvoří naši kontrolní skupinu, nebyla pozorována žádná aktivita luciferázy.
- 6 Lyzáty ve 48 hodině. Pozorovaný účinek na vzorcích vystavených lyži ve 24 hodině se neudržel 48 hodin po transfekci, kde se exprese luciferázy v absolutních hodnotách snižovala u všech transfektovaných vzorků. Získané hodnoty RLU na mg proteinů nevykazují žádné významné rozdíly mezi pokusnými a kontrolními vzorky.
Lyzáty ve 72 hodině. Vzorky nevykazovaly žádnou expresi luciferázy, takže hodnoty RLU.mg'1 nemohly být stanoveny.
··· · .· · · « •o ·· ··· ··· «· ····
Exprese luciferázy in vivo
Pokus 2. HeLa 100000/12 jamkové plotny 1,5 pg na jamku i
| RLU.mg'1 střední hodnota a std. odch. | |
| Dotap + LUC | 491,090 142,451 |
| Dotap + ETS | 20,802 2,283 |
| 5 mM ALC + LUC | 18,060 3,241 |
| 5 mM ALC + ETS | 17,025 3,481 |
| 5 mM ALC + dota + LUC | 779,340 159,453 |
| 5 mM ALC + dotap + ETS | 22,411 5 2,447 |
| 10mMALC + LUC | 20,481 7,044 |
| 10 mM ALC + ETS | 17,724 1,020 |
| lOmMALC + dotap + LUC | 750,034 94,431 |
| 10 mM ALC + dotap + ETS | 20,520 2,180 |
0· ·♦ • · • · ο · · • · ο • · ο • · · ·
Usoudili jsme, že k ověření, zda kladný účinek ALC na aktivitu luciferázy má vztah k aktivaci transkripčního mechanismu nebo zvýšení propustnosti buněk, vyhodnotíme celkové množství transfektované nitrobuněčné plasmidové DNK analýzou „slot blot“.
„Slot blot“
Buněčná kultura. Buněčné linie HeLa (ATCC) rakoviny děložního hrdla byla uchovávána v mediu RPMI (Europio) doplněného 10 % fetálním telecím sérem, 1 % P/S ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % CO2.
Působení s ALC.
5.106 buněk bylo naočkováno do 125 ml Jahve a uchováváno v RPMI doplněného jako v předchozím postupu a obsahujícího ALC ve dvou koncentracích (5 mM a 10 mM) 4 dny před transfekci. Působení bylo opakováno na konci transfekce. Buňky, na které nebylo působeno ALC byly kultivovány za stejných podmínek a použity jako kontrolní.
Přechodná exprese pRL-CMV.
Na 12 jamkové plotně (Corning) bylo 1 den před transfekci naočkováno 105 buněk na jamku. Pro transfekci byl použit liposom DOTAP (BoehringerMannheim, Indianapolis, IN) a plasmiď pRL-CMV (Promega, č. kat. E2261) v 6 jamkách na vzorek. Stručně: 1,5 pg DNK a vodný roztok liposomu o koncentraci 9,2 μΜ na jamku byly za laboratorní teploty smíseny (25 μΙ na vzorek) k vytvoření komplexu DNK-liposom. Po inkubaci po dobu 30 minut byl přidán stejný objem HBS 2x (20 mM HEPES, 150 mM NaCI, pH 7,4) na jednu jamku a transfekční směs byla rozdělena (50 μΙ na jamku v doplněném mediu). Buňky byly s tímto komplexem inkubovány po dobu 5 hodin a potom komplex odstraněn promytím PBS (fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok o pH 7,4, prostý Ca2+ a Mg2+). Buňky byly udržovány v doplněném mediu obsahujícím ALC po dobu 24 hodin a potom použity k analýze. Jako kontrolní byla transfektována čistá DNK v HBS 1x (pRLCMV).
Extrakce DNK.
Celková buněčná DNK byla od transferovaných buněk extrahována alkalickou lyží metodou uváděnou Maniatisem. Po promytí PBS byly buňky odebrány s PBS (1 ml na jamku) a centrifugovány při 1500 g po dobu 10 minut za laboratorní teploty.
Podle postupu byla každá peleta umístěná na led lyžována za použití: 100 μΙ roztoku I (50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCI (pH = 8), 10 mM EDTA (pH =
8)), 200 μΙ roztoku II (0,2 N NaOH, 1 % SDS), 150 μΙ roztoku III (5 M octan draselný, ledová kyselina octová). Po odstředění při 12000 g po dobu 5 minut při 4 °C byl supernatant oddělen a DNK vysrážena EtOH. Pelety byly resuspendovány v TE 1x (50 μΙ na vzorek).
Značení vzorků
Vzorek luciferázového genu byl získán vyluhováním pRL-CMV po dobu 2 hodin Hindlll při 37 °C a potom za stejných podmínek BamHl. Po vyloužení byla směs podrobena elektroforéze na 0,8 % agarovém gelu v ústojném roztoku TAE 1x (40 mM Tris-HCI (pH 7,8), 1,1 mM EDTA a 37 mM octan sodný) a excizí izolován fragment odpovídající luciferázovému genu. Značení luciferázového genu bylo provedeno značkovacím systémem Rediprime II DNK (Amersham Pharmacia biotech, č. kat. RPN 1633) a ·· • ·· ·♦ ·· • · · • · * • · »· ·« • · · ·< ··«
- 10 stabilizovaným Redivue [cc-32P]dCTP (Amersham Pharmacia biotech, č. kat. AA 0005) podle obdrženého návodu.
„Slot blot“
Vzorky DNK byly absorbovány na kladně nabitou nylonovou membránu (Boehringer, č. kat. 1209299) za použití přístroje Biorad Slot Blot. DNK byla navázána na filtr UV Stratalinkerem-2400 (Stratagene). Po předběžné inkubaci na filtru s hybridizačním roztokem QuikHyb (Stratagene, č. kat. 201220) po dobu 20 minut při 68 °C bylo po povaření s DNK lososího spermatu po dobu 2 minut přidáno 2,5.10® cpm.ml·1 značeného vzorku. Hybridizace byla prováděna při 68 °C po dobu 1 hodiny a potom byl filtr dvakrát promýván ústojným roztokem I (SSC 2x, SDS 0,1 %) po dobu 15 minut za laboratorní teploty a potom ústojným roztokem II (SSC 0,1x, SDS 0,1 %) po dobu 30 minut při 60 °C. Filtr byl k zobrazení vystaven v luminiscenčním přístroji („Phosphor Imager“) záření a potom densitometricky analyzován s použitím softwaru IPlab Gel.
Densitometrie „slot blot“ (viz tabulka) prozrazuje, že neexistuje žádný rozdíl mezi hodnotami získanými u transfektovaných buněk v přítomnosti a nepřítomnosti ALC. Malý pokles byl pozorován u 10 mM ALC. Tyto výsledky ukazují, že přítomnost ALC nemění buněčnou absorbci komplexu DNKliposom buňkou, což ukazuje, že by ALC mohla ovlivňovat expresi luciferázy v oblasti transkripce.
- 11 Densitometrické hodnoty (v relativních jednotkách)
| slot | objem | střední hodnota | |
| čistá DNK | 1 | 81620 | |
| 2 | 93505 | ||
| 3 | 85305 | 72618,2 | |
| 4 | 64280 | ||
| 5 | 56880 | ||
| 6 | 54119 |
| komplex Dotap/DNK | 7 | 239399 | |
| 8 | 250530 | ||
| 9 | 251720 | 252088,5 | |
| 10 | 258812 | ||
| ' 11 | 258100 | ||
| 12 | 253970 |
| čistá DNK + 5 mM ALC | 13 | 59846 | |
| 14 | 58324 | ||
| 15 | 61431 | 61441,5 | |
| 16 | 70373 | ||
| 17 | 63045 | ||
| 18 | 55630 |
| komplex Dotap/DNK + 5 mM ALC | 19 | 222013 | |
| 20 | 255756 | ||
| 21 | 253422 | 240634,5 | |
| 22 | 234654 | ||
| 23 | 239053 | ||
| 24 | 238909 |
| čistá DNK + 10 mM ALC | 25 | 26326 | |
| 26 | 71831 | ||
| 27 | 54172 | 52595,2 | |
| 28 | 70498 | ||
| 29 | 48707 | ||
| 30 | 44037 |
| komplex Dotap / DNK + 10 mM ALC | 31 | 173870 | |
| 32 | 225644 | ||
| 33 | 116848 | 165345 | |
| t 34 | 114911 | ||
| 35 | 157762 | ||
| 36 | 203035 |
Tabulka: na obrázku jsou znázorněny jednotlivé hodnoty (v relativních jednotkách) navzorkovaných filtrů získané densitometrickou analýzou za použití softwaru IPlab Gel. Jak je výše uvedeno, pRLCMV DNK byla transfektována Dotap (komplex Dotap/DNK) a transfekce byla provedena jak s buňkami, na které nebylo působeno (slot 7 až 12), tak s buňkami s 5 mM (slot 19 až 24) a 10 mM (slot 31 až 36) ALC. Jako kontrolní byla za stejných pokusných podmínek použita pRL-CMV bez liposomu (čistá DNK)): buňky, na které nebylo působeno (slot 1 až 6), buňky s 5 mM (slot 13 až 18) a 10 mM (slot 25 až 30) ALC.
·· ·» • · • · Φ ·· • o e · • · e · ·· ·· ··· • ·· ·· ·· • · · • » · • · · • · · ·* ««»·
- 12 Shrnutí.
Porovnání mezi densitometrickými hodnotami získanými transfekcí provedenou v přítomnosti nebo nepřítomnosti ALC ukazuje, že mezi permeabilitou buněk pro komplex DNK/Dotap a kladným účinkem ALC na aktivitu luciferázy není žádný vztah.
Claims (5)
- Patentové nároky1. Způsob zvýšení genové exprese transfektovaných genů vyznačující se tím, že se podává karnitin.
- 2. Použití karnitinu ke zvýšení exprese rekombinantních proteinů.
- 3. Způsob výroby rekombinantních proteinů a zlepšení vyznačující se tím, že se při jejich výrobě ke zvýšení exprese jmenovaných proteinů použije karnitin.
- 4. Použití karnitinu k přípravě produktu vhodného v genové terapii ke zlepšení exprese proteinů.
- 5. Použití karnitinu k přípravě produktu vhodného k udržení transfektovaných genů v klonech.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2000RM000077A IT1316990B1 (it) | 2000-02-17 | 2000-02-17 | Metodo per aumentare l'espressione genica per geni trasfettati. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022757A3 true CZ20022757A3 (cs) | 2003-02-12 |
| CZ303403B6 CZ303403B6 (cs) | 2012-08-29 |
Family
ID=11454443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022757A CZ303403B6 (cs) | 2000-02-17 | 2001-02-09 | Použití acetyl-L-karnitinu k príprave léciva pro zvýšení exprese transfektovaných genu |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030022859A1 (cs) |
| EP (1) | EP1257658B1 (cs) |
| JP (1) | JP4726378B2 (cs) |
| KR (1) | KR100768264B1 (cs) |
| AT (1) | ATE366320T1 (cs) |
| AU (1) | AU2001237712A1 (cs) |
| CA (1) | CA2400110A1 (cs) |
| CY (1) | CY1106872T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ303403B6 (cs) |
| DE (1) | DE60129206T2 (cs) |
| DK (1) | DK1257658T3 (cs) |
| ES (1) | ES2288164T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0204460A2 (cs) |
| IT (1) | IT1316990B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA02007959A (cs) |
| PL (1) | PL204125B1 (cs) |
| PT (1) | PT1257658E (cs) |
| SK (1) | SK287759B6 (cs) |
| WO (1) | WO2001061025A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1316990B1 (it) * | 2000-02-17 | 2003-05-26 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Metodo per aumentare l'espressione genica per geni trasfettati. |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995000137A1 (de) * | 1993-06-21 | 1995-01-05 | Bernardini, Attilio | Verwendung von acylcarnitin zur behandlund von aids-krankheiten |
| EP0681839A3 (en) * | 1994-05-12 | 1997-11-12 | Hirohiko Kuratsune | A pharmaceutical preparation comprising an acylcarnitine |
| US6040295A (en) * | 1995-01-13 | 2000-03-21 | Genemedicine, Inc. | Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy |
| IT1290801B1 (it) * | 1996-07-05 | 1998-12-11 | Mendes Srl | Uso della acetil l-carnitina, della isovaleril l-carnitina, della propionil l-carnitina o dei loro sali farmacologicamente accettabili |
| AU8765298A (en) | 1997-07-31 | 1999-02-22 | Larkom, L.L.C. | Shared high speed network access |
| IT1299172B1 (it) * | 1998-05-06 | 2000-02-29 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Esteri perfluorurati di alcanoil l-carnitine utilizzabili quali lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti |
| JP2002513775A (ja) * | 1998-05-06 | 2002-05-14 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | 細胞の中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを改良する治療組成物を調製するためのヌクレアーゼインヒビターまたはインターロイキン−１０（ｉｌ−１０）の使用、および遺伝子治療に有用な組成物 |
| WO2000001418A1 (en) * | 1998-07-02 | 2000-01-13 | Genzyme Corporation | Transgene expression in polarized cells |
| IT1316990B1 (it) * | 2000-02-17 | 2003-05-26 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Metodo per aumentare l'espressione genica per geni trasfettati. |
-
2000
- 2000-02-17 IT IT2000RM000077A patent/IT1316990B1/it active
-
2001
- 2001-02-09 MX MXPA02007959A patent/MXPA02007959A/es active IP Right Grant
- 2001-02-09 DE DE60129206T patent/DE60129206T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 AU AU2001237712A patent/AU2001237712A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 EP EP01910129A patent/EP1257658B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 JP JP2001559862A patent/JP4726378B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-09 ES ES01910129T patent/ES2288164T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 US US10/203,924 patent/US20030022859A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 PL PL365011A patent/PL204125B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-02-09 KR KR1020027010503A patent/KR100768264B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-09 HU HU0204460A patent/HUP0204460A2/hu unknown
- 2001-02-09 CA CA002400110A patent/CA2400110A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 SK SK1187-2002A patent/SK287759B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-02-09 CZ CZ20022757A patent/CZ303403B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-02-09 DK DK01910129T patent/DK1257658T3/da active
- 2001-02-09 WO PCT/IT2001/000057 patent/WO2001061025A1/en not_active Ceased
- 2001-02-09 PT PT01910129T patent/PT1257658E/pt unknown
- 2001-02-09 AT AT01910129T patent/ATE366320T1/de active
-
2004
- 2004-09-27 US US10/949,194 patent/US7560439B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-09-17 CY CY20071101195T patent/CY1106872T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CY1106872T1 (el) | 2012-09-26 |
| ITRM20000077A0 (it) | 2000-02-17 |
| IT1316990B1 (it) | 2003-05-26 |
| EP1257658B1 (en) | 2007-07-04 |
| US20050124570A1 (en) | 2005-06-09 |
| JP4726378B2 (ja) | 2011-07-20 |
| HUP0204460A2 (en) | 2003-04-28 |
| MXPA02007959A (es) | 2003-02-10 |
| KR20030072204A (ko) | 2003-09-13 |
| SK287759B6 (sk) | 2011-09-05 |
| PL204125B1 (pl) | 2009-12-31 |
| CZ303403B6 (cs) | 2012-08-29 |
| US20030022859A1 (en) | 2003-01-30 |
| ES2288164T3 (es) | 2008-01-01 |
| SK11872002A3 (sk) | 2002-11-06 |
| ATE366320T1 (de) | 2007-07-15 |
| DE60129206T2 (de) | 2008-03-06 |
| PL365011A1 (en) | 2004-12-27 |
| DE60129206D1 (de) | 2007-08-16 |
| PT1257658E (pt) | 2007-09-14 |
| KR100768264B1 (ko) | 2007-10-18 |
| AU2001237712A1 (en) | 2001-08-27 |
| WO2001061025A1 (en) | 2001-08-23 |
| EP1257658A1 (en) | 2002-11-20 |
| JP2003522544A (ja) | 2003-07-29 |
| US7560439B2 (en) | 2009-07-14 |
| CA2400110A1 (en) | 2001-08-23 |
| ITRM20000077A1 (it) | 2001-08-17 |
| DK1257658T3 (da) | 2007-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Greenwel et al. | Hydrogen peroxide: A link between acetaldehyde‐elicited α1 (i) collagen gene up‐regulation and oxidative stress in mouse hepatic stellate cells | |
| US5656610A (en) | Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue | |
| AU2021203492A1 (en) | Nucleic acid vaccines | |
| Verspieren et al. | An acridine-linked oligodeoxynucleotide targeted to the common 5'end of trypanosome mRNAs kills cultured parasites | |
| CN116790685B (zh) | 一种生物合成法制备王浆酸及其在护肤中的应用 | |
| AU1114501A (en) | Use of csf-1 inhibitors | |
| EP3661540A1 (en) | Treatment of local skin hypotrophy conditions | |
| WO2023086830A1 (en) | Intraspinal delivery of therapeutic agents | |
| CN116515747A (zh) | 一种牙髓间充质干细胞培养方法 | |
| CZ20022757A3 (cs) | Způsob zvyšování genové exprese transfektovaných genů | |
| WO2009120396A2 (en) | Compositions and methods for regulating erythropoientin expression and ameliorating anemia and stimulating erythropoiesis | |
| WO2021150891A1 (en) | The use of growth factor-encoding nucleoside-modified mrna for periodontal tissue and bone regeneration | |
| TW202527966A (zh) | 包含生物巨分子及奈米載體之組合物、包含其的醫藥組成物及其用途 | |
| TW202525304A (zh) | 包含核糖核酸及奈米載體之組合物、包含其的醫藥組成物及其用途 | |
| TW202525303A (zh) | 包含小分子核糖核酸及奈米載體之組合物、包含其的醫藥組成物及其用途 | |
| KR20060020139A (ko) | 동물세포 내에서 ＬＰＳ에 의하여 유도되는 활성산소종의생성 및 ＮＦ-κＢ의 활성화를 억제하는 방법 | |
| CN108578699B (zh) | 分子靶标在牙种植体修复中的应用 | |
| HK40112578A (zh) | 带状疱疹mrna疫苗及其制备方法和应用 | |
| KR100631488B1 (ko) | 단백질 도입부위 및 막활성화 부위가 함유된 새로운 합성펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달 방법 | |
| HK40112578B (zh) | 带状疱疹mrna疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN121285629A (zh) | 甲醇溶解剂和其使用方法 | |
| KR101353570B1 (ko) | 클러스터린 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물 | |
| CN121041408A (zh) | 莱茵衣藻源机体铁稳态调节剂及其应用 | |
| MXPA03011463A (es) | Oligo-o/y poli-ribonucleotidos xenogenicos como agentes para tratamiento de tumores malignos. | |
| CN108578700A (zh) | 一种用于糖尿病患者种植体骨整合的药物靶标 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20121127 |