ITRM20000077A1 - Metodo per aumentare l'espressione genica per geni trasfettati. - Google Patents
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Description
La presente invenzione si riferisce all’uso di C1-C6 alcanoil L-carnitine, in particolare dell’acetil L-carnitina, nella produzione di proteine ricombinanti.
È nota la produzione di proteine mediante tecnica di ingegneria genetica, ossia utilizzando cloni cellulari nei quali vengono inseriti geni mediante trasfezione. Uno dei problemi che si riscontrano nell’utilizzo dei cloni trasfettati è che dopo un certo tempo i geni inseriti artificialmente nella cellula con lo scopo di produrre la proteina d’interesse, si silenziano. Il problema del silenziamento dei geni è ancor più sentito nella terapia genica. In questo caso, il gene, che è stato inserito nel paziente, cessa di produrre la proteina necessaria dal punto di vista terapeutico.
È stato ora trovato che C1-C6 alcanoil L-carnitine, preferibilmente l’acetil L-carnitina, ovvero la L-carnitina, aumenta l’espressione genica dei geni trasfettati.
Nell’intento della presente invenzione per “una carnitina” si intende una C1-C6 alcanoil L-carnitina o L-carnitina. Nella descrizione che segue, in via del tutto esemplificativa, si fa riferimento alla realizzazione preferita con acetil L-carnitina.
Il trattamento con acetil L-carnitina nei cloni cellulari trasfettati con tecniche note, ad esempio i liposomi, aumenta considerevolmente l’espressione delle proteine codificate dai geni trasfettati.
La presente invenzione ha per oggetto un metodo di aumento di espressione genica per geni trasfettati che comprende la somministrazione di acetil L-carnitina.
Negli aspetti connessi con l’applicabilità industriale, la presente invenzione si riferisce all’uso dell’acetil L-carnitina per aumentare l’espressione di proteine ricombinanti, assieme a un metodo per la produzione di proteine ricombinanti, il cui miglioramento consiste nell<*>utilizzo di acetil L-carnitina per aumentare l’espressione di dette proteine.
Nel settore 'terapeutico e nel campo dell’ingegneria genetica generale, la presente invenzione ha per oggetto l’uso dell’acetil L-carnitina per la preparazione di un prodotto utile nella terapia genica per migliorare l’espressione di proteine, come pure l’uso dell’acetil L-carnitina per la preparazione di un prodotto utile per il mantenimento dei geni trasfettati in cloni.
La presente invenzione è ulteriormente illustrata per mezzo della parte sperimentale che segue.
Materiali e Metodi
Esperimenti in vitro
Colture cellulari. E' stata utilizzata la linea cellulare di carcinoma della cervice uterina (HeLa, ATCC). Le cellule sono state coltivate in terreno di crescita RPMI 1640 Medium (eurobio), contenente antibiotici e siero fetale di vitello al 10 %.
Trattamento con Acetil-L-Camitina (ALC). In due fiasche da 125 cm<2 >sono state seminate 4x10<6 >e 5X10<6 >cellule coltivate in un mezzo contenente ALC alla concentrazione, rispettivamente, di 5 mM e 10 mM finale; invece, in una fiasca da 75 cm<2 >sono state piastrate 2x10<6 >cellule che non sono state sottoposte a trattamento con ALC. Il trattamento è stato ripetuto dopo 48h (in coincidenza della semina delle cellule per la trasfezione), dopo 72 h (al termine della trasfezione stessa) e solo per i campioni trasfettati da Usare a 72h è stato ripetuto dopo 120h.
Trasfezione transiente del plasmide pRL-CMV Le cellule sono state seminate per la trasfezione 24h prima in piastre da 12 pozzetti (Corning), in un numero di 10<5 >cellule per pozzetto. La trasfezione è stata eseguita in triplcato per ogni campione ed è stato utilizzato il liposoma DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) ed il plasmide pRL-CMV (Promega cat. N° E2261). Brevemente, per ogni campione è stato utilizzato 1,5 μg/ pozzetto di DNA e 9,2 μΜ/pozzetto di liposoma, considerando un volume finale di 1050 μl/ campione; la miscela di trasfezione (25 μl/ campione) è stata lasciata a temperatura ambiente per 30', è stato quindi aggiunto HBS 2x (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) in quantità di 25 μl/ campione e 50 μl/ campione della soluzione così ottenuta è stata aggiunta alle cellule per 5 ore. Dopo aver effettuato tre lavaggi con PBS (buffer fosfato pH 7,4) senza Calcio e Magnesio, le cellule sono state coltivate in terreno di crescita contenente ALC alle concentrazioni indicate nei trattamenti fino al momento della lisi cellulare per il saggio luciferasi, Come controllo è stato aggiunto alle cellule dei DNA nudo in una soluzione di HBS lx.
Saggio luciferasi nei campioni trasfettati in vitro
Le cellule sono state lavate con PBS (tampone fosfato pH 7,4) senza Calcio e Magnesio e sottoposte a lisi mediante aggiunta di 200 μl di buffer di lisi contenuto nel kit GeneLux L002-100 (Wallac) utilizzato per la luciferasi. Dopo 20’ sono state raccolte le proteine totali e 10 μl di ciascun campione è stato saggiato per la luciferasi, seguendo le procedure indicate nel kit; il saggio è stato effettuato in piastre da 96-multiwells utilizzando il luminometro Victor<2 >(Wallac), Le letture di luminescenza ottenute, espresse in unità di luce relativa (RLU), venivano normalizzate per mg di proteine totali, calcolate con il Metodo Bradford.
Esperimenti in Vivo
Trattamento con Acetil-L-Camitina (ALC) Per gli esperimenti in vivo sono stati utilizzati topi Balb/c (Harlan), 5 animali per gruppo. I gruppi erano suddivisi in animali non trattati (3 gruppi) e' trattati (6 gruppi) alla dose di 100 mg/kg di ALC per via orale. Il trattamento è iniziato quattro giorni prima della trasfezione con somministrazioni giornaliere ed è stato ripetuto ogni giorno fino al momento del sacrificio.
Sacrifìcio degli animali
Gli animali sono stati sacrificati a 24, 48 e 72h dalla trasfezione. Ad ogni animale sono stati prelevati i polmoni, lavati in soluzione fisiologica, pesati, congelati in azoto liquido e conservati a -80° C fino al momento dell'estrazione delle proteine.
Trasfezione del plasmide pRL-CMV. Agli animali che costituivano i gruppi dei non trattati ed a tre gruppi di animali trattati con ALC sono stati iniettati 25μg/topo di plasmide pRL-CMV per via endovenosa utilizzando un liposoma ad una concentrazione di 12 μm/μg di DNA iniettato. Il liposoma ed il DNA sono stati miscelati in una soluzione di PBS e mantenuti in ghiaccio per Ih prima dell'iniezione . Ai rimanenti tre gruppi di animali trattati sono stati iniettati 25 μg/topo di plasmide pRL-CMV in una soluzione costituita dal solo PBS. Il volume finale di soluzione iniettata in ogni animale è stato di 208 μl.
Estrazione delle proteine dai polmoni e saggio luciferasi
Risultati
Espressione della luciferasi nella trasfezione in vitro
Lisati a 24h. L'espressione della luciferasi ottenuta nei campioni trattati con ALC risultava più elevata rispetto ai campioni di cellule non trattate. Infatti, il valore medio degli RLU per mg di proteine totali, calcolato dai campioni in triplicato, aumentava di circa 1,6 volte nei campioni trattati con 5 mM ALC rispetto ai non trattati. Inoltre, si è osservato che nei campioni trattati con 10 mM ALC non vi era nessun ulteriore aumento. I risultati ottenuti sembrano indicare l'assenza di una risposta dose-dipendente tra ALC ed espressione della luciferasi, almeno alle concentrazioni da noi utilizzate, mentre indicano un effetto positivo sull'espressione della luciferasi trasfettata. Nei campioni trasfettati con solo DNA, che costituivano i nostri controlli non si osservava nessuna attività della luciferasi.
Lisciti a 48h. L'effetto osservato nei campioni lisati a 24h non si manteneva a 48h dalla trasfezione, dove comunque l'espressione della luciferasi diminuiva in senso assoluto in tutti i campioni trasfettati. Gli RLU ottenuti per mg di proteine non mostrano variazioni significative tra i campioni trattati e non.
Lisati a 72h. I campioni non presentano espressione di luciferasi in quanto non sono determinabili dei valori significativi di RLU/ mg.
Espressione della luciferasi in vivo.
Esperimento 2 HeLa 100000/ pozz piastre da 12 1,5 μg/ pozzetto I
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per aumentare l’espressione genica per geni trasfettati, che comprende la somministrazione di una carnitina.
- 2. Uso di una carnitina per aumentare l’espressione di proteine ricombinanti.
- 3 Metodo per la produzione di proteine ricombinanti, il cui miglioramento consiste nell'utilizzo di una carnitina per aumentare l’espressione di dette proteine.
- 4. Uso di una carnitina per la preparazione di un prodotto utile nella terapia genica per migliorare l’espressione di proteine.
- 5. Uso di una carnitina per la preparazione di un prodotto utile per il mantenimento dei geni trasfettati in cloni.
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