CZ20022971A3 - Vakcinační prostředek vhodný pro léčbu aterosklerózy - Google Patents

Description

Vakcinační prostředek vhodný pro léčbu aterosklerózy

Oblast techniky

Vynález popisuje nové vakcinační terapie a profylaktické léčby aterosklerótických onemocnění. Popisují se imunogeny ^zahrnující apolipoproteiny nebo jejich deriváty či fragmenty. Celý apolipoprotein vykazuje alespoň jednu z následujících aktivit: (a) inhibice navázání apolipoproteinu B na jeho receptor a/nebo (b) inhibice lipoproteinové lipázy. Výhodný příklad jednoho takového apoliproteinu je apoliprotein C-III (ApoCIII). Vakciny podle vynálezu obsahující uvedené imunogeny jsou účinné při dlouhotrvající prevenci nebo zeslabení tvorby aterosklerótických plaků, čímž se snižuje potenciál aterosklerózy vedoucí ke koronárnímu nebo cerebrovaskulárnímu onemocnění. Popisuje se nový způsob léčby aterosklerózy selektivně inhibující aktivitou specifických apolipoproteinu u

Ve výhodném provedení vynálezu Uvedený způsob zahrnuje aplikaci vede k selektivní inhibicí lidského hostitele, apoliprotein je ApoCIII. činidla člověku, což apolipoproteinové aktivity. Také se popisují způsoby léčby a prevence aterosklerózy aktivní nebo pasivní vakcinací pomocí aplikace protilátek pacientovi, přičemž uvedené protilátky jsou schopny se vázat na apolipoprotein, který má alespoň aktivit: (a) inhibice navázání jeho receptor a/nebo (b) inhibice Protilátky se přednostně váží na aktivitu ApoCIII. Dále se popisuje použití imunogenů nebo vakcin podle vynálezu v medicíně a způsob jejich produkce.

jednu z následujících apolipoproteinu B na lipoproteinové lipázy. ApoCIII a odstraňují

Dosavadní stav techniky

Ateroskleróza je vedoucí příčinou úmrtí a invalidity v rozvojových zemích a je hlavní příčinou koronárních a .* *2 • · » · · • · · · · ·· · · • ·

, 14th Edition,	McGraw
1995,	Circulation,
, 362:	801) .	Název
vnitřní	vrstvy	cévní

cerebrovaskulárních úmrtí. Na celém světě umírá na následky těchto onemocnění přibližně 7,2 respektive 4,6 miliónu lidí ročně (ateroskleróza se popisuje v publikaci Harrison s Principles of internal medicine,

1345-1352), Berliner, J. et al.,

2496, Ross, R., 1993, Nátuře, znamená ztluštění (skleróza; hromadění lipidů (athere) v lézích.

Ačkoli vývoj tohoto onemocnění závisí na mnoha obecných nebo systémových faktorech, jako je strava s vysokým obsahem cholesterolu a kouření, uvedené onemocnění může ovlivnit různé oblasti krevního oběhu. Ateroskleróza koronárních arterii běžně způsobuje angínu pektoris a infarkt myokardu. Ateroskleróza arterii, které zásobí centrální nervový systém, často vyvolávají dočasnou cerebrální ischemii a mrtvici. V periferním oběhu ateroskleróza může způsobit přerušované kulhání a gangrénu a může ohrozit funkčnost končetiny. Postižení splanchnického oběhu může způsobovat mezenterickou ischemii a infarzaci střev. Ateroskleróza může také přímo ovlivnit ledviny (například může způsobit zúžení renální arterie) a navíc ledvina je časté místo ateroembolického onemocnění.

Aterogeneze u lidí v typickém případě probíhá řadu let, Pomalá tvorba aterogenních plaků může vést k chronické klinické expresi, jako je omezení krevního průtoku (jako je angína pektoris vyvolaná stálým namáháním nebo předpověditelné a opakované přerušované kulhání). V jiném případě po protržení plaků může dojít k daleko dramatičtějšímu akutnímu klinickému jevu, jako je infarkt myokardu nebo cerebrovaskulární příhoda. Způsob, kterým ateroskleróza ovlivňuje segment arterie, se také liší, což tvoří další rys heterogenity a komplexnosti tohoto onemocnění. Za ateromy se obvykle uvažují stenózní léze nebo'plaky, které mohou omezit krevní oběh. Ateroskleróza může obvykle řadu desítek let v cévách krevního oběhu

také způsobíje rozšíření a může se vyvinout aneurysmální onemocnění se zvětšením průměru cév. Toto vyjádření aterosklerózy se často objevuje u aorty, přičemž vzniká predispozice k prasknutí nebo oddělení spíše než ke stenóze nebo okluzi.

Podrobně se studovala tvorba aterogenních plaků. U normálních dospělých jedinců vnitřní vrstva arterií obsahuje nějaké rezidentní buňky hladkého svalstva uložené v extrabuněčné matrici a je překryta jednou vrstvou vaskulárních endoteliálních buněk. Počáteční stádium vývoje arterií zahrnuje vývoj žilek tuku ve stěnách krevních cév, které vedou k akumulací a uložení lipoproteinů v oblastech vnitřní vrstvy arterie. Částice lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) bohaté na cholesterol jsou například aterogenní lipoproteiny, které je schopny se ukládat ve stěnách cév za vzniku tukových žilek.

Po uložení do stěny cév částice lipoproteinů prochází chemickou úpravou, která zahrnuje oxidaci a neenzymatickou glykaci. Tyto oxidované a glykované lipoproteiny se pak mohou podílet na mnoha následných jevech při vývoji lézí. Chemické úpravy přitahují makrofágy ke stěně cév, který pohlcují oxidovaný LDL a zvětší svůj objem a iniciují vznik lézí, které se nazývají plaky. Jsou to aterosklerotické plaky, které odpovídají za klinickou manifestaci aterosklerózy a buď omezují průtok krve nebo umožňují vznik aneurizmu nebo mohou dokonce prasknout a způsobit koronární nebo cerebrovaskulární atak.

Vývoj aterosklerózy je dlouhý proces, který může probíhat po desítky let a je iniciován nerovnováhou mezi aterogenními a ochrannými lipoproteiny. Tak například množství cholesterolu spojeného s lipoproteiny s vysokou hustotou nebo HDL (tak zvaný „dobrý cholesterol) a s lipoproteiny s nízkou hustotou • 4 · · • · · 4 · 4 · * » 4 • 4 444. 44 · • 4 4 4 4 4 4 4 * ·· ··· 444 ·· 44 4444 nebo LDL (tak zvaný „špatný cholesterol) v krevním oběhu je znamení zvýšené pravděpodobnosti aterosklerózý (popisuje se v publikaci Harrison, Principles of Internal Medicine, 14^th edition, McGraw Hill, p. 1345-1352) .

Cholesterol, estery cholesterolu, triacylglyceroly a jiné lipidy se transportují do krevních tekutin seriemi lipoproteinů, které se dělí do tříd podle jejich zvyšující se hustoty: chylomikrony, lipoproteiny s velmi nízkou, s nízkou, střední a vysokou hustotou (CM, VLDL, LDL, IDL a HDL) . Tyto lipoproteinové komplexy obsahují jádro hydrofóbních lipidů, které jsou obklopeny polárními lipidy a pak skořápkou apolipoproteinů. V současné době existuje deset typů známých apoliproteinů, A-I, A-II, B, Cl, Cil, Clil, D, E, H a J. Existují alespoň dvě funkce uvedených apolipoproteinů, které jsou běžné pro všechny lipoproteinové komplexy. První zodpovídají za rozpustnost hydrofóbních lipidových jader, které nesou, a druhé se také podílejí na regulaci pohlcování cholesterolového lipoproteinů specifickými buňkami. Různé typy lipoproteinů mohou mít různé funkce, například LDL bohaté na estery cholesterolu jsou pravděpodobně spojeny s transportem cholesterolu do periferních tkání za účelem syntézy nových membrán.

Jeden z těchto apoliproteinů, apoliprotein C-III (ApoCIII) je protein obsahující 79 aminokyselin, který vzniká v játrech a ve střevech (popisuje se v publikaci Brewer et al., J. Biol. Chem. (1974), 249: 4975-4984, Protter, A. A., et al., 1984,

DNA, 3: 449-456, Fruchart, J. C. et al., 1996, Drugs Affecting Lipid Metabolism, (Eds. Gotto, A. M. et al.), Kluwer Academie Publishers and Fordazione Giovanni Lorenzini, Netherlands, p. 631-638, Claveny, V. et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15, 7, 963-971, patent USA č. 4 801 531,

McConathy, W. J. et al., 1992, Journal of Lipid Research, 33,

995-1003) . Apo Clil je komponent CM, VLDV a LDL (popisuje se

v publikaci Lenich et al., C., J. Lip. Res. (1988) 29, 755764), který existuje ve třech izoformách: apo CIIIO, apo Cílil a apo CIII2. Apo Clil není glykosylovaný, avšak apo Cílil a apo' CIII2 jsou glykosylovaný a máji jeden nebo dva zbytky kyseliny sialové (popisuje se v publikaci Ito et al., 1989 J.

Nov. 30: 11 1781-1787). Cukerná část obsahuje β-D-galaktosyl(1-3)-a-N-acetyl-D-galaktosamin treonin v pozici 74 řetězce proteinu 0lipd. Res. dísacharid připojený na glykosidickou vazbou (popisuje se v publikaci Assmen et al., 1989, BBA 541: 234-240). V lidské plazmě s normálním obsahem lipidů apo CIIIO, apo Cílil a apo CIII2 reprezentuje 14 %, 59 % a 27 % celkového apo Clil. Mutageneze glykosylačního místa lidského apo Clil neovlivňuje jeho vylučování a lipidovou vazbu (popisuje se v publikaci Roghani et al., 1988 JBC 34: 17925-32) .

Lidské ApoCIII má následující aminokyselinovou sekvenci: SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLK DYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA (SEQ ID.NO. 1)

Koncentrace apo Clil v plazmě je přímo úměrná s množstvím triglyceridů v plazmě (popisuje se v publikaci Schonfeld et al., Metabolism (1979) 28: 1001-1010, Kaslyap et al., J. Lip.

Res. (1981) 22: 800-810). Studie perfúze jater ukázala, že apo Clil inhibuje pohlcení lipoproteinů bohatých na triglyceridy (TRL) do jater (popisuje se v publikaci Shelburne et al., J. Clin. Inves., (1980) 65: 652-658, Windler et al. , J. Lip. Res.

(1985) 26: 556-563). Také experimenty in vitro ukazují, že apo Clil inhibuje aktivitu obou lipoproteinových lipáz (LPL) a hepatických lipáz (popisuje se v publikaci Brown and Bakinsky, Biochim. Biophs. Acta (1972) 46: 375-382, Krauss et al. , Circ.

Res. (1973) 33: 403-411, Wang et al., J. Clin. Inves. (1985)

75: 384-390, Mc Conathy et al., J. Lip. Res. (1972) 33: 9951003, Kinnemen and Enholm, FEBS (1976) 65: 354-357). Uvádí se však, že ApoCIII se podílí na inhibici navázání LDL na receptory LDL (popisuje se v publikaci Fruchart, J. C. et al.,

1996, Drugs Affecting Lipid Metabolism, (Eds. Gotto, A. M. et al.), Kluwer Academie Publishers and Fordazione Giovanni

Lorénzini, Netherlands, p. 631-638) prostřednictvím ApoB.

Úloha apo Clil v plazmě metabolizmu TRL se více definuje na základě výsledků jistých studií provedených na transgenních zvířatech (popisuje se v publikaci Aalto-Setala et al. , J. Clin. Invest. (1992) 90: 5 1889-1900). Ukázalo se, že akumulace TRL do plazmy u myší, které nadměrně exprimují apo Clil je spojena redukovaným množstvím VLDL v plazmě a s odstraněním chylomikronu (popisuje se v publikaci Harrold et al., J. Lip. Res. (1996) 37: 754-760), také se prokázal inhibiční účinek C apolipoproteinů na receptor LDL lipoproteinů obsahující apo B (popisuje se v publikaci Clavey et al., Arth. Thromb. and Vasc. Biol. (1995) 15: 963-971).

Předchozí vakcíny v oblasti imunoterapie aterosklerózy se zaměřily na použití cholesterolu, jako imunogenu pro snížení množství cholesterolu v séru (popisuje se v publikaci Bailey, J. M. et al., 1994, Biochemical Society Transactions, 22, 433S, Alving, C. and Swartz, G.M., 1991, Crit. Rev. Immunol., 10, 441-453, Alving, C. and Wassef, Ν. M., 1999, Immunology Today, 20, 8, 362-366). Jiní se snaží vakcinací změnit aktivitu proteinu, který přenáší ester cholesterolu (CETP) popisuje v patentovém dokumentu WO 99/15655). V jiném případě někteří autoři popisují vakcíny použitím oxidovatelného LDL, jako imunogenu za účelem inhibovat tvorbu plaků po poranění králíků s vysokým obsahem cholesterolu (popisuje se v publikaci Nilsson, J. et al., 1997, JACC, 30, 7, 1886-1891).

Překvapivě se zjistilo, že ateroskleróze se může předcházet nebo se může zlepšit aktivní nebo pasivní imunoterapii, snížením nebo zablokováním funkce jistých apolipoproteinů, které napomáhají vzniku aterosklerózy.

imunogeny účinné při prevenci nebo a také se popisují způsoby léčby imunogenů podle vynálezu jednotlivcům,

Podstata vynálezu

Vynález popisuje terapii aterosklerózy aterosklerózy aplikací kteří to potřebují.

Imunogeny podle vynálezu obsahují apolipoproteiny vybrané z těchto apolipoproteinů, které vyvolávají tvorbu aterosklerotických plaků u jednotlivců, kteří trpí aterosklerózou. Apolipoproteiny, které se vybraly na základě skutečnosti, že tvoří základ preferovaných imunogenů podle vynálezu, jsou apolipoproteiny, které vykazují alespoň jednu z následujících vlastností: Přirozený apolipoprotein je schopný (a) inhibovat navázání apolipoproteinů B na jeho receptor a/nebo (b) inhibovat enzym lipoproteinovou lipázu.

Apolipoproteiny, které se mohou použít jako imunogeny podle vynálezu mají alespoň jednu ze shora uvedených aktivit, ale nejvýhodnější je, když vykazují obě aktivity. Nej výhodnější imunogen, který vykazuje obé aktivity zahrnuje apolipoprotein CIII (ApoCIII).

Aktivita libovolného daného apolipoproteinů při inhibici apo B zahrnující navázání lipoproteinů na svůj receptor nebo při enzymatické aktivitě lipoproteinové lipázy se může zkoumat použitím metod, které jsou dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Fruchart, J. C. et al., 1996, Drugs Affecting Lipid Metabolism, (Eds. Gotto, A. M. et al.), Kluwer Academie Publishers and Fordazione Giovanni Lorenzini, Netherlands, p. 631-638, Claveny, V. et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15, 7, 963-971, McConathy, W. J. et al.,

1992, Journal of Lipid Research, 33, 995-1003, Shelburne et al., J. Clin. Inves., (1980) 65: 652-658, Windler et al. , J.

Lip. Res. (1985) 26: 556-563).

• · 99 9 9

Imunogen podle vynálezu může obsahovat přirozený apolipoprotein v celé délce nebo může v jiném případě obsahovat fragmenty, peptidy nebo jejich mimotopy, které si zachovávají funkční aktivitu terapie nebo prevence aterosklerózy.

Imunogen může být například apolipoprotein v celé délce nebo může obsahovat fragmenty přirozeného apolipoproteinu, které jsou kratší než přirozený apolipoprotein v plné délce. .Je výhodné, aby fragmenty proteinů celé délky obsahovaly méně než 80 aminokyselin, výhodnější je, aby obsahovaly méně než 50 aminokyselin, výhodnější je, aby obsahovaly méně než 40 aminokyselin a nejvýhodnější je, aby obsahovaly 4 až 25 aminokyselin.

Apolipoproteinové fragmenty, které se mohou použít jako imunogeny podle vynálezu sdílí funkci apolipoproteinu celé délky. Což znamená, že jsou schopny vyvolat (když jsou vhodně prezentovány imunitnímu systému) protilátky proti apolipoproteinu. Protilátky vyvolané fragmenty jsou funkční při léčbě aterosklerózy a ve výhodné formě vynálezu odstraňují inhibici navázání ApoB na jeho receptor způsobenou apolipoproteinem a/nebo aktivitu lipoproteinové lipázy.

Peptidy, který se mohou upravit za vzniku imunogenů podle vynálezu se mohou izolovat z povrchových epitopů apolipoproteinů. Vynálezci zjistily, že peptidy použitelné podle vynálezu jsou také vysoce povrchově exponované epitopy. Na základě tohoto pozorování se navrhl způsob provedení jiných vhodných epitopů, jimiž budou epitopy mající snadno dosažitelné oblasti vypočítatelné pomocí pohyblivého okénka pěti zbytků. Zjistilo se, že výhodné oblasti apolipoproteinů mají dosažitelný povrch vypočtený pomocí pohyblivého okna pěti zbytků za použití softwaru Molecular Simulations Software • I » · (MSI), který je větší než 50 %/. Je výhodné, když je větší než

0 Á².

Vynález popisuje peptidy začleňující aminokyselinovou sekvenci takového povrchu vystavených epitopu je obsahem vynálezu. Mimotopy, které mají stejné charakteristiky jako tyto peptidy a imunogeny obsahující takové mimotopy, které tvoří imunitní odezvu, která zkříženě reaguje s apolipoproteinem také tvoří součást vynálezu.

Imunogeny podle vynálezu proto zahrnují izolované peptidy obsahující samotné apolipoproteinové epitopy a libovolný jejich mimotop. Termín mimotop se definuje jako entita, která je dostatečně podobná epitopu apolipoproteinu a tak protilátky rozeznávající apolipoprotein jsou schopny také rozeznat tento epitop (Gheysen, Η. M., et al., 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, p. 130-149, Gheysen, Η. M., 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709-715) nebo jestliže jsou spojeny s vhodným nosičem, jsou schopny dát vzniku protilátkám, které zkříženě reagují s přirozeným apolipoproteinem.

Peptidové mimotopy shora v textu definovaných epitopu apolipoproteinu se mohou upravit pro určitý účel adici, delecí nebo substitucí zvolných aminokyselin. Pak peptidy podle vynálezu se mohou upravit tak, aby se zjednodušila konjugace s proteinovým nosičem. Pro určité způsoby chemické konjugace je nutné, aby epitop apolipoproteinu zahrnoval terminální být nutné pro peptidy konjugované aby zahrnovaly hydrofobní konec konjugovaného konce peptidu tak, že volný konec peptidu zůstává spojen s povrchem nosičového proteinu Tato skutečnost snižuje stupeň volnosti prostorového uspořádání peptidu a tak se zvyšuje pravděpodobnost, že peptid je přítomen v uspořádání, které cystein. Navíc může s proteinovým nosičem, vzdálený od nekonj ugovaný ··»* · · ·♦ ·· ·· <·· toéto · · · «

·. ίιο. : i i. ! : .· ··· · « 4 « · t připomíná uspořádání apolipoproteinového peptidů, které se zjistilo v kontextu celého apolipoproteinu. Peptidy se například mohou změnit tak, že mají N-terminální cystein a Ctermínální hydrofobní amidovaný konec. V jiném případě adice nebo substituce D-stereoizomérové formy jedné nebo více aminokyselin se může provést za vzniku derivátu, který má například zesílenou stabilitu peptidů. Odborník snadno rozezná, že takový upravený peptid nebo mimotop by mohl být zcela nebo částečně nepeptidový mimotop, kde konstituující zbytky nejsou nezbytně omezeny na 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin. Navíc se tyto zbytky mohou cyklizovat způsobem známým v oboru, přičemž začleňují peptid do uspořádání, které připomíná tvar, kdy peptidová sekvence je v souladu s celým apolipoproteinem.

také být retrosekvence apolipoproteinu, kde je

Peptidové mimotopy mohou peptidových sekvencí přirozeného orientace sekvence obrácená nebo v jiném případě sekvence mohou být zcela nebo alespoň částečně součástí Dstereoízomérové aminokyseliny (inverzní sekvence). Peptidové sekvence mohou mít také retroinverzní charakter. To znamená, že orientace sekvence je obrácená a aminokyseliny jsou v Dstereoizomérové formě. Takové retro peptidy nebo retroinverzo-peptidy mají výhodu, že se nevyskytují samotné a tak se může v imunitním systému předejít problémům samotolerance.

V jiném případě se peptidové mimotopy mohou identifikovat použitím protilátek, které jsou schopné se samostatně vázat na apolipoproteiny za použití metod, jako technologie vykazování fágů (popisuje se v patentovém dokumentu EP 0 552 267 Bl) . Tento způsob tvoří velké množství peptidových sekvencí, které napodobují strukturu přirozených peptidů a jsou proto schopny vázat protilátky proti přirozenému peptidů, ale mohou také nezbytně samy sdílet podstatnou homologii sekvence s přirozeným apolipoproteinem.

Nejvýhodnější imunogeny podle vynálezu obsahují Apo Clil nebo fragment, peptid nebo jeho mimotop.

Imunogen ApoCIII může být přirozený protein v celé délce: lidský ApoCIII 1 až 79

SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLK DYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA (SEQ ID NO. 1).

V jiném případě imunogen může obsahovat fragmenty celého Apo Clil, které zahrnují 78 nebo méně aminokyselin. Výhodné je, když obsahují 40 aminokyselin nebo méně a nejvíce se preferuje rozmezí 4 až 25 aminokyselin. Zvláště výhodné fragmenty nebo peptidy budou zahrnovat oblast definovanou aminokyselinami 1 až 17, 1 až 40, 12 až 35, 41 až 79, 45 až 65 nebo 45 až 76 přirozeného Apo Clil. Peptidové sekvence některých preferovaných peptidů jsou:

lidský ApoCIII 1-17: SEAEDASLLSFMQGYMK (SEQ ID NO. 2) lidský ApoCIII 1-4 0: SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSV

QESQVAQQAR (SEQ ID NO. 3) lidský ApoCIII 12-35 : MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV (SEQ ID NO. 4) lidský ApoCIII 41-7 9: GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKESEFWDLD

PEVRPTSAVAA (SEQ ID NO. 5) lidský ApoCIII 45-65: DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW (SEQ ID NO. 6) lidský ApoCIII 45-76.‘ DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSA (SEQ ID

NO. 7)

Imunologicky ekvivalentní fragment ApoCIII se může definovat jako menší polypeptid ve srovnání se samotným ApoCIII, který je schopen vytvořit imunitní odezvy, které rozeznávají přirozený ApoCIII a které jsou funkční při terapii nebo prevenci .aterosklerózy.

Jiné apolipoproteiny, které se mohou použít v imunogenech podle vynálezu jsou apolipoprotein Cil nebo apolipoprotein E.

• · » 4

12· • 4 44 • 4*4

V jednom zvláště preferovaném provedení vynálezu apolipoprotein nebo jeho fragment je spojen s molekulou nosiče, aby se zesílila imunogennost apolipoproteinu nebo jeho fragmentu. Peptidy nebo mimotopy mohou být spojeny chemickou kovalentní vazbou nebo expresí geneticky upravených fúzních partnerů prostřednictvím linkerové sekvence. Peptidy mohou mít jako linkerovou sekvenci dva nebo více glycinových zbytků a často mají terminální exponovaný cysteinový zbytek pro účely vzniku vazby. Některé z těchto výhodných peptidů jsou uvedeny dále v textu:

MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV GGC CGGMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWGGC CGGDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW (SEQ ID NO. 8) (SEQ ID NO. 9) (SEQ ID NO. 10) (SEQ ID NO. 11)

Kovalentní spojení apolipoproteinu, jako je ApoCIII, s nosičovým proteinem se může provést způsobem dobře známým v oboru. Tak například při přímém kovalentním spojení je možné využít karbodiimid, glutaraldehyd nebo ester (N-[y-maleimidobutyryloxy]sukcinimidu, přičemž se využívají běžné komerčně dostupné heterobifunkční linkery, jako je CDAP a SPDP (podle instrukcí výrobce). Po kuplovací reakci se může imunogen jednoduše izolovat a čistit dialýzou, gelovou filtrací, frakcionací atd..

Typy nosičů používané v imunogenech podle vynálezu jsou dobře známy v oboru. Funkce nosiče je poskytnout pomoc cytokinů za účelem zesílit imunitní odezvu proti apolipoproteinu nebo peptidů apolipoproteinu. Seznam nosičů, které se mohou použít podle vynálezu zahrnuje: hemocyanin přílipkovitých plžů (KLH), sérové albuminy, jako je bovinní sérový albumin (BSA), neaktivované bakteriální toxiny, jako je tetanus nebo toxiny difterií (TT a DT) nebo jejich rekombinantní fragmenty (oblast 1 fragmentu C z TT nebo translokace oblasti DT) nebo čištěný proteinový derivát « · ··*·* ·· ··· 999 ·· 99 9999 tuberkulinu (PPD). V jiném případě apolipoprotein nebo mimotopy nebo epitopy mohou být spojeny s nosičem nekovalentním způsobem, jako je spojení prostřednictvím lipdzomového nosiče nebo společnou adsorbcí do hlinité sole, která může navíc obsahovat imunogeny schopné vyvolat pomoc buněk T nebo další adjuvanční imunostimulátory. Je výhodné, aby poměr počet molekul apolipoproteinu nebo jeho fragmentu nebo peptidu ku nosičovému proteinu je 1:1 až 20:1 a upřednostňuje se, aby každý nosič mohl nést 3 až 15 apolipoproteinů nebo peptidů nebo jejich fragmentů.

V jednom provedení vynálezu nosičem je protein D pocházející z mikroorganizmu Haemophilus influenzae (popisuje se v patentovém dokumentu EP 0 594 610 Bl) . Protein D je protein vázající IgD pochází z mikroorganizmu Haemophilus influenzae a je chráněn patenty WO 91/18926, EP 0 594 610 (Forsgren). Za některých okolností například v expresních systémech rekombinantních imunogenů může být nutné použít fragmenty proteinu D, například protein D 1/3 (obsahuje 100 až 110 N-terminální aminokyselin proteinu D (popisuje se v patentových dokumentech WO 99/10 375, WO 00/50 077) .

Jiný výhodný způsob prezentující apolipoprotein, jako je ApoCIII nebo peptidy podle vynálezu, je v souvislosti s rekombinantní fúzní molekulou. Patentový dokument EP 0 421 635 B například popisuje použití částic antigenu jádra chimeróvého hepadnaviru při začlenění cizorodých peptidových sekvencí do částic podobných viru. Imunogeny podle vynálezu jako takové mohou obsahovat apolipoprotein nebo apolipoproteinové peptidy přítomné v chimerových částicích, které obsahují antigen jádra hepatitidy B (jádro HepB). Navíc rekombinantní fúzní proteiny mohou obsahovat mimotopy podle vynálezu a nosičový protein, jako je NS1 viru chřipky. V případě libovolného rekombinantně exprimovaného proteinu, který tvoří část vynálezu, nukleová kyselina kódující uvedený imunogen je také předmětem vynálezu.

• 49

4· 444 4

Výhodné imunogeny podle vynálezu obsahují peptid se sekvencí SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2 až 7 prezentovaný ve výhodném rekombinantním expresívním systému (jako je jádro HepB) nebo konjugovaný s proteinovým nosičem tak, že rekombinantní expresívní systém nebo protein nosiče poskytuje pomoc T buněk při vyvolání imunitní odezvy na sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2 až 7. Zvláště výhodné imunogeny obsahují samotnou sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo může být tato sekvence konjugovaná nebo fúzovaná s proteinovým nosičem, aby se dosáhlo pomoci buněk T při vytvoření imunitní odezvy na sekvenci SEQ ID NO: 4.

V jiném provedení vynálezu imunogennost peptidů je zesílena přidáním epitopů pomocných buněk T (Th) . Imunogeny vynálezu mohou obsahovat peptidy popsané shora v textu a promiskuitní epitopy Th buď jako chemické konjugáty nebo jako čistě syntetické peptidové konstrukce. Apolipoproteinové peptidy jsou přednostně spojeny s epitopy Th prostřednictvím mezerníku (například Gly-Gly) buď na N-konce nebo C-konci apolipoproteinového peptidu. Imunogeny mohou obsahovat 1 nebo více promiskuitních epitopů Th a více epitopů Th, upřednostňuje se 2 až 5 epitopů.

Epitop Th je sekvence aminokyselin, která obsahuje epitop Th. Epitop Th může obsahovat kontinuální nebo přerušovaný epitop. Proto ne každá aminokyselina je nezbytně část epitopu. Epitopy Th, které jsou promiskuitní jsou ve zvířecí a lidské populaci silně reaktivní s široce divergentními typy MHC (popisuje se v publikaci Partidos et al. (1991) „Immune responses in mice following immunization with chimeric synthetic peptides representing B and T cell epitopes of

* 4 4 · 4	9 99 99 99
·. S15.	4 9 4	9 9 4
9 4 « ·· 444	4 4 4 44 4 99	4 4 4 4« 9999

measles virus proteins, J. of Gen. Virol. 72: 1293-1299 a v patentovém dokumentu USA č. 5 759 551).

Domény Th, které se. mohou použít v souladu s vynálezem, mají přibližně 10 až 50 aminokyselin a je výhodné, když obsahují 10 až 30 aminokyselin. Když je přítomno více Th epitopů, každý epitop Th je nezávisle stejný nebo odlišný.

Epitopy Th zahrnují jako příklady epitopy odvozené z patogenů, jako jsou epitopy Th povrchového nebo jaderného antigenu viru hepatitidy (peptid 50-69 se popisuje .v publikaci Ferrari et al., J. Clin. Invest., 1991, 88, 214-222), epitopy Th toxinu pertuze, epitopy Th toxinu tetanu (jako je P2, který se popisuje v patentovém dokumentu EP 0 378 881 Bl a P30, který se popisuje v patentovém dokumentu WO 96/34 888, WO 95/31 480, WO 95/26 365), epitopy Th proteinu F spalničkového viru, epitopy Th proteinu hlavní vnější membrány mikroorganizmu Chlamidia trachomatis (jako je Pil, který se popisuje v publikaci Stagg et al., Immunology, 1993, 79, 1-9), epitopy Th toxinu difterie a mikroorganizmu Zersinia invasin. Jiné epitopy Th se popisují v patentovém dokumentu USA č. 5 759 551, WO 95/ 26 365 a EP 0 752 886 Bav publikaci Cease et al., 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. 84, 4249-4253 a Partidos et al., J. Gen. Virol., 1991, 72, 1293-1299).

Peptidy používané podle vynálezu se mohou syntetizovat postupem na pevné fázi, které jsou dobře známy v oboru. Vhodné syntézy se mohou provést využitím postupů „T-boc nebo „Fmoc. Cyklické peptidy se mohou syntetizovat postupem na pevné fázi za použití dobře známého postupu „F-moc a polyamidové pryskyřice v plně automatizovaném zařízení. V jiném případě jsou v oboru dobře známy laboratorní postupy vhodné pro manuální postup. Metody a postupy syntézy na pevné fázi se popisují v publikaci „Solid phase peptide synthesis: A practical approuch, E. Atherton and R.C. Sheppard, IRL,

16.

»·· • ·

9 9

9999

Oxford University Press (1989). V jiném případě se peptidy mohou produkovat postupy rekombinace, které zahrnují expresi molekul nukleové kyseliny kódující mimotopy v bakteriální nebo savčí buněčné linii. Pak následuje čištění exprimovaného mimotopu. Způsoby rekombinantní exprese peptidů a proteinů jsou známy v oboru a popisují se v publikaci Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Předmětem vynálezu jsou také části nukleové' kyseliny, která kóduje imunogeny podle vynálezu nebo peptidy, mimotopy nebo jejich deriváty nebo rekombinantní fúzní proteiny obsahující imunogeny. Popisují se také určité nukleové kyseliny, které kódují sekvence SEQ ID NO: 1 až 7 nebo imunogeny obsahující sekvence SEQ ID NO: 1 až 7.

Imunogeny podle vynálezu jsou určeny pro použití v medicíně, při léčbě aterosklerózy a při tvorbě imunogenního prostředku nebo vakcín podle vynálezu.

Imunogeny podle vynálezu mohou tvořit imunogenní prostředky nebo vakciny, které jsou účinné při prevenci nebo terapii aterosklerózy. Imunogenní prostředky nebo vakcína obsahují jeden nebo více imunogenů podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu. Vakciny obsahují apolipoproteiny vybrané z apolipoproteinů, které podporují vytvoření aterosklerotických plaků. Výhodné vakciny obsahují imunogeny zahrnující apolipoproteiny, které mají alespoň jednu z následujících vlastností: přirozený apolipoprotein je aktivní v potlačení navázání ApoB na jeho receptor a/nebo je schopen inhibovat enzymatickou aktivitu lipoproteinové lipázy.

Nejvýhodnější vakciny nebo imunogenní prostředky podle vynálezu obsahují Apo Clil nebo jejich fragmenty a peptidy.

Nej výhodnější je, když vakcína obsahuje Apo Clil a jeho

17, ·* ··«« fragment konjugovány nebo fúzovaný s proteinovým nosičem, přičemž dochází k pomoci buněk T při vyvolání imunitní odezvy proti Apo Clil nebo jeho fragmentu.

Vakcíny nebo imunogenní prostředky podle vynálezu mohou také s výhodou zahrnovat adjuvans. Adjuvans vhodné pro vakcíny podle vynálezu zahrnují ty adjuvans, které jsou schopny zesílit protilátkové odezvy proti apolipoproteinovému imunogenu. Adjuvans jsou dobře známy v oboru (Vaccine design The Subunit and ' Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, eds. Powell, M. F. and Newman, M. J. ,

Plenům Press, New

ISBN 0-306-44867-X).

York and London,

Preferovaná adjuvans vhodná pro použití v imunogenech zahrnují sole hliníku fosforečnany).

a vápníku (například hydroxidy nebo Adjuvans vhodná pro použití jako imunogeny podle vynálezu zahrnují sole hliníku a vápníku (hydroxid nebo fosforečnan), emulze olej ve vodě (popisuje se v patentovém dokumentu WO 95/17 210, EP 0 399 843) nebo nosiče částic, jako jsou liposomy (popisuje se v patentovém dokumentu WO 96/33 739). Zvláště výhodné jsou imunologicky aktivní frakce saponinu (například Quil A) vykazují adjuvanční aktivitu získáno u z kůry stromu rostoucího v Jižní Americe Quillaja Saponaria Molina. Deriváty Quil A, jako je například QS21 (frakce odvozené od Quil A čištěné HPLC) a způsob jejich produkce se popisuje v patentovém dokumentu USA č. 5 075 540. Mezi QS21 (známé jako QA21) se také popisují jiné frakce, jako je QA17. 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) je dobře známé adjuvans vyrobené firmou Ribi Immunochem, Montana. Tato látka se může připravit způsoby popsanými v patentovém dokumentu Velké Británie č. 2 122 204B. Výhodná forma 3D-MPL se vyskytuje ve formě emulze, kde průměr částice 3D-MPL je menší než 0,2 mikrometru (popisuje se v publikaci EP 0 689 454 Bl) .

9« • 9

9*9

9 • 9

1» «9 99 * 9 9 ·

9·0 ·♦ 9999

Adjuvans také zahrnují muramyldipeptid a saponiny, jako je Quil A, bakteriální lipopolysacharidy, jako je 3D-MPL (3-0deacylovaný monofosforyllipid A) nebo TDM. Další alternativa může být protein uzavřený do mikročástic, jako jsou liposomy, nebo do suspenzí polyoxyethylenetheru, které neobsahují částice (popisuje se v patentovém dokumentu WO 99/52 549). Zvláště výhodná adjuvans jsou kombinace 3D-MPL a QS21 (popisují se v patentovém dokumentu EP 0 671 948 Bl), emulze olej ve vodě obsahující 3D-MPL a QS21 (popisuje se v patentovém dokumentu WO 95/17 210, PCT/EP 98/05 714), 3D-MPL vytvořenými s jinými nosiči (popisuje se v publikaci EP 0 689 454 Bl) nebo QS21 obsažených v liposomech obsahujících cholesterol (popisuje se v patentovém dokumentu WO 96/33 739) nebo imunostimulační oligonukleotidy (popisují se v patentovém dokumentu WO 96/02 555).

Vakcina podle vynálezu se může aplikovat jako primární dávka i jako zesilující dávka. Očekává se, že zesilovací dávky se budou adekvátně načasovány nebo se přednostně aplikují dříve nebo v takovém okamžiku, kdy množství cirkulujících protilátek se sníží pod požadovanou hodnotu. Zesilující dávky mohou obsahovat peptid, aniž je přítomna původní molekula nosiče. Takové zesilovací konstrukce mohou obsahovat alternativní nosič nebo mohou být bez nosiče.

Dále vynález popisuje vakcínu nebo imunogenní prostředek, jak se popisuje shora v textu, který je vhodný pro použití v medicíně.

Imunogenní prostředek nebo vakcinační prostředek podle vynálezu se může použít při prevenci nebo léčbě savce náchylného k ateroskleróze nebo už trpícího tímto onemocněním. Vakcina se může aplikovat systémově nebo sliznici. Tyto způsoby aplikace mohou zahrnovat intramuskulární, intraperitoneální, intradermální nebo subkutánní injekci nebo ·»*· 4 4 44 4Λ 44 4 44 44 4 4 444 ·· ϊΐ9· * ί ί ♦ ϊ : 4*

4 4 4 4 4 4 4 9 94 444 444 94 44 4444 aplikaci sliznicí do orálního/zažívacího, respiračního, genitourinárního traktu.

Množství proteinu v každé dávce vakciny nebo imunogenního prostředku se vybralo jako množství, které vyvolává imunologicky ochranou odezvu bez podstatných, nežádoucích vedlejších účinků u typických vakcín. Takové množství bude kolísat v závislosti na typu vybraného specifického imunogenu a jakým způsobem je prezentován. V obecném případě se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1 000 μρ proteinu, upřednostňuje se 1 až 500 μg, přednostně 1 až 100 μg, nej výhodnější je rozmezí 1 až 50 μg. Optimální množství v případě určité vakciny může být zjištěno na základě standardních studií, které zahrnují pozorování vhodné imunitní odezvy u subjektů. Po počáteční vakcinací se subjektům může aplikovat jedna nebo několik zesilovacích dávek ve vhodných časových intervalech.

Vakcinační prostředky se v obecném případě popisují v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978. Spojení proteinů s makromolekulami se popisuje v patentovém dokumentu USA č. 4 372 945 (Likhite) a č. 4 474 757 (Armor).

Ligandy, které se mohou vázat na stejné apolipoproteiny a tvoří základ imunogenu podle vynálezu, jsou důležitým předmětem vynálezu. Takové ligandy se mohou využívat při pasivní prevenci nebo terapii aplikací pacientovi, přičemž dochází ke zlepšení aterogenního onemocnění.

Výhodné ligandy podle vynálezu jsou schopny vázat se na apolipoproteiny a tak omezovat jejich aktivitu, přičemž uvedené apolipoproteiny vykazují alespoň jednu z následujících dvou vlastností: přirozený apolipoprotein je schopný potlačit *

«.· navázání apolipoproteinu B na jeho receptor a/nebo je schopen inhibovat enzymatickou aktivitu lipoproteinové lipázy.

Ligandy podle vynálezu se přednostně váží na apolipoproteiny, které mohou vykazovat jednu nebo obě shora uvedené aktivity, ale nej výhodnější jsou obě aktivity. Zvláště preferovaný ligand je ten, který se váže na apolipoprotein cm (Apo cm).

Výhodné příklady takových použitelných ligandů zahrnují monoklonální nebo polyklonální protilátky. Například protilátky vyvolané u jednoho zvířete se mohou čistit a pasivně aplikovat jinému zvířeti za účelem prevence nebo terapie aterosklerózy. Imunogeny podle vynálezu se mohou také použít při tvorbě monoklonálních protilátkových hybridomů (použitím známých postupů, které se popisují například v publikaci Kohler and Milstein, Nátuře, 1975, 256, p. 495), humanizovaných monoklonálních protilátek nebo monoklonálních protilátek implantovaných do CDR způsoby, které jsou dobře známy v oboru.

Termín „protilátka je molekula, která má použitelnou antigenní vazebnou specifitu. Pro odborníka bude výhodné, že tento termín může také zahrnovat polypeptidy, které jsou fragmenty nebo deriváty protilátek, které mohou vykazovat stejnou nebo podobnou funkčnost. Takové fragmenty nebo deriváty protilátek jsou také zahrnuty do termínu protilátka.

Vynález popisuje izolovanou protilátku vytvořenou proti izolovaným imunogenům podle vynálezu.

Vynález dále popisuje polyklonální nebo monoklonální protilátkové přípravky, které se váží na Apo Clil. Zvláště výhodné polyklonální nebo monoklonální protilátky rozeznávají fragmenty celého přirozeného Apo Clil, jako je lidský Apo Clil 1-17, SEAEDASLLSFMQGYMK (SEQ ID NO: 2) lidský ApoCIII 1-40, SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDLSSVQESQVAQQAR (SEQ ID NO: 3) lidský ApoCIII 12-35, MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV (SEQ ID NO: 4) lidský ApoCIII 41-79, GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA (SEQ ID NO: 5) lidský ApoCIII 45-65, DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW (SEQ ID NO: 6) lidský ApoCIII 45-76, DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSA (SEQ ID NO: 7).

Vynález dále popisuje hybridomy vylučující monoklonální protilátkové ligandy.

Dále se popisují farmaceutické prostředky obsahující ligandy popsané shora. Vynález dále zahrnuje použití ligandů v medicíně a aterosklerózy.

při výrobě léčiv vhodných pro léčbu

Pří pasivní léčbě aterosklerózy aplikace ligand nebo protilátek pacientů podle vynálezu probíhá intravenózně. Frekvence aplikace se může stanovit klinicky následujícím stanovením títrů protilátek v séru pacientů v čase, ale v libovolném případě může být frekvence 1 až 52 krát v roce, nejvýhodnější je frekvence mezi 1 a 12 dávkami v roce. Množství protilátek a ligandů může kolísat podle vážnosti onemocnění a poločasu rozpadu v séru, ale přednostně bude v rozmezí od 1 do 10 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta a výhodné je rozmezí 1 až 5 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta a více se preferuje 1 až 2 mg/kg pacienta.

Imunogeny, imunogenní prostředky, vakciny nebo ligandy podle vynálezu se mohou aplikovat pacientovi, který trpí nebo má předpoklady onemocnět aterosklerózou. Tyto prostředky jsou účinné při nastolení správné rovnováhy mezi tzv. „špatnými lipoproteiny (jsou to „dobrými lipoproteiny lipoproteiny obsahující apo B) a (lipoproteiny obsahující apo A-I) a minimalizují čas oběhu lipoproteinů, které obsahují apo B.

9*99 • ·

«« ·9 99

9 9 *99 • 9 9 9 9 ·

9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 99 999 9

Věří se, že tyto funkce minimalizují možnost ukládat a oxidovat lípoproteiny obsahující apo B do stěn'krevních cév a proto snižují nebezpečí tvorby a růstu aterosklerótických plaků.

Vynález popisuje použití apolipoproteinových imunogenů podle vynálezu (jak se definuje shora v textu) při výrobě farmaceutických prostředků vhodných pro prevenci nebo terapii aterosklerózy. Imunogeny obsahující apolipoprotein nebo peptidy podle vynálezu a molekuly nosiče jsou vhodné pro použití při výrobě vakcin vhodných pro prevenci nebo léčbu aterosklerózy. Apolipoproteinové imunogeny podle vynálezu jsou určeny pro použití v medicíně a při léčbě nebo prevenci aterosklerózy.

Vynález dále popisuje způsob léčby nebo prevence aterosklerózy, která zahrnuje aplikaci pacientovi, jenž trpí nebo je náchylný vůči ateroskleróze, pomocí imunogenních prostředků nebo vakciny nebo ligandu podle vynálezu.

Popisuje se způsob prevence nebo léčby aterosklerózy, který zahrnuje snížení celkového množství triglyceridu v krevním oběhu pacienta aplikací vakciny podle vynálezu. Zvláště se popisuje způsob snížení množství obíhajícího VLDL a LDL aplikací vakciny nebo ligandu podle vynálezu.

Vynález také popisuje způsob prevence nebo léčby aterosklerózy aplikací vakciny, která je schopná snížit průměrný cirkulační čas lipoproteinů, které obsahují Apo B. S tímto ohledem průměrná doba cirkulace lipoproteinů, které obsahují Apo B se může zjistit ve zvířecích modelech in vivo měřením rychlosti vymizení značených lipoproteinů, které obsahují Apo B z plazmy savce (poločas rozpadu značených lipoproteinů, které obsahují Apo B).

·*·· • 9 • · ·· ·

• · • ·*

Výhodným imunogenem vhodným pro tyto způsoby léčby podle vynálezu je Apo CIII. Překvapivě, cílení Apo CIII vakcínou nebo lígandem snižuje negativní účinky „špatného cholesterolu (LDL), zatímco neovlivňují „dobrý cholesterol (HDL).

Vynález dále popisuje způsob léčby nebo prevence aterosklerózy selektivně inhibující aktivitu aterogenního apolipoproteinů u lidského hostitele, který zahrnuje aplikaci činidla, jejíž výsledkem je inhibice alespoň jedné z následujících aktivit uvedeného aterogenního apolipoproteinů u lidského hostitele, který potřebuje takovou léčbu nebo prevenci. Jedná se o (a) inhibici navázání apolipoproteinů B na jeho receptor a/nebo (b) inhibici lipoproteinové lipázy. Vynález dále popisuje způsob léčby nebo prevence aterosklerózy selektivně inhibující aktivitu ApoCIII u lidského hostitele, který zahrnuje aplikaci činidla, jejíž výsledkem je selektivní inhibice aktivity ApoCIII u lidského hostitele, který potřebuje uvedenou léčbu nebo prevenci. S tímto ohledem činidlo může být imunogenní prostředek nebo vakcína, která jako imunogen obsahuje ApoCIII nebo jeho fragment nebo v jiném případě činidlo může být ligand, který je schopný blokovat aktivitu ApoCIII (v tomto případě odstraňuje inhibici lipoproteinové lipázy zprostředkovanou ApoCIII a navázání ApoB na jeho receptor). Preferované ligandy podle vynálezu jsou polyklonální nebo monoklonální protilátky.

Výhodné způsoby léčby jednotlivců trpících aterosklerózou vykazující zvýšené množství ApoCIII cirkulující v plazmě zahrnují snížení množství obíhajícího ApoCIII aplikací vakcína, která obsahuje jako imunogen ApoCIII nebo jeho fragment. V jiném případě vynález popisuje způsob léčby nebo prevence aterosklerózy snížením množství obíhajícího ApoCIII v plazmě pacienta aplikací ligandu, který je schopný blokovat aktivitu ApoCIII tím, odstraňuje inhibici lipoproteinové lipázy zprostředkovanou ApoCIII a navázání ApoB na jeho • 4 44 «4

4 4 4 4

4 4 4 ·

4 4 4 · 4

4*4 4 4

44 44 4444 podle vynálezu jsou polyklonální

4444 • 4 receptor. Výhodné ligandy nebo monoklonální protilátky

Vynález dále popisuje způsob léčby nebo prevence aterosklerózy snížením počtu molekul ApoCIII, které jsou spojeny s molekulou ApoB ín sítu co se týče lipoproteinu. U normálních jedinců je přibližně jeden ApoB přítomen v jedné částici LDL, přičemž ApoB je spojen s přibližně jednou až pěti molekulami ApoCIII. Vynález dále popisuje způsob léčby nebo prevence aterosklerózy snížením poměru molekul ApoCIII na jednu molekulu ApoB u LDL u jednotlivce s aterosklerózou. Cílem je snížit poměr ApoC : ApoB ve stádiu těžkého onemocnění přibližně 20 až 25 : 1 na poměr pod 5 : 1, výhodně 3:1a nejvýhodněji 1 : 1. Množství ApoCIII spojený s lipoproteiny, které obsahují ApoB mohou být stanoveny hefelometrií nebo elektroimunodifúzí (normální rozmezí je 2 až 3 mg/dl).

Vynález popisuje syntetické a rekombinantně produkované ApoCIII vhodné pro použití v medicíně.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Syntéza peptidu

Peptidy ApoCIII (1-79, 1-17, 12-35, 45-65 a 45-76 (SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6 a 7)) se syntetizovaly způsobem na pevné fázi (popisuje se v publikaci Merrifield, 1986) za použití automatického syntetízéru model ABI 433A (Applied Biosystems Inc.) použitím strategie Boc/Bzl a pryskyřice Boc-Aly-PAM v případě celého apo Clil a pryskyřice MBHA v případě fragmentů. Každá aminokyselina se spojila dvakrát pomocí dicyklohexylkarbodiimidu/hydroxybenzotriazolu bez značení. Skupiny chránící vedlejší řetězec jsou následující Arg(Ts), Asp(Ochex), Glu(Ochex), Lys(2-Cl-Z), His(Dnp), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Met(O) a Tyr(Br-Z). Před štěpením se v závislosti na sekvenci odstranila skupina Dnp chránící His z peptidu pomocí aplikace 10% β-merkaptoetanolu, 5% diizopropyletylaminu v DCM po dobu 2 hodin a v NMP po dobu dalších 2 hodin. Peptidylová pryskyřice se pak ošetřila 50% TFA v DCM po dobu 20 minut, aby se odstranil N-terminální Boc. Peptid se z pryskyřice odštěpil a současně se odstranila chránící skupina podle postupu s nízkou koncentrací a vysokou koncentrací HF. Pryskyřice (1 g) se ošetřil nevodným HF (2,5 ml) v přítomnosti p-krezolu (0,75 g), p-thiokrezolu (0,25 g) a dimetylsulfidu (6,5 ml) při teplotě 0 °C. Po 3 hodinách se odstranila odpařením ve vakuu fluorid a dimetylsulfid a zbylý nosič a produkty se extrahovaly dietyleterem. Reakční nádoba se znovu naplnila pkrezolem (0,75 g) , p-thiokrezolem (0,25 g) a 10 ml bezvodého HF a smě se nechala reagovat při teplotě 0 °C po dobu 1,5 hodiny. Hydrogenfiuorid se odstranil odpařením a zbytek se trituroval dietyleterem. Zbytek se odfiltroval, promyl se dietyleterem a extrahoval se 200 ml 10% vodné kyseliny octové a lyofilizoval se. Surový produkt se analyzoval HPLC s reverzní fází na koloně Vydac C18 (rozměry kolony jsou 4,6 x 250 mm, 5 μ, 100 A) použitím šedesátiminutového lineárního gradientu od 0 do 100% pufru B (pufr A: 0,05 % TFA ve vodě a pufr B obsahuje 0,05% TFA, 60% CH3CN ve vodě) při rychlosti průtoku 0,7 ml/min.. Detekce se uskutečnila při vlnové délce 215 nm. Syntetický peptid se čistil RP-HPLC a charakterizoval se a analyzoval se HPLC. Molekulová hmotnost se definovala spektrometrií.

Příklad 2: Produkce protilátek

Syntetický celý ApoCIII syntetizovaný v příkladu 1 se použil při vytvoření polyklonálních protilátek u králíků.

Testovala se reaktivita polyklonálního antiséra proti celému

ApoCIII s jinými kratšími syntetickými peptidy a z antiséra se získávaly frakce protilátek specifických pro každé peptid.

Imunizace:

Peptid ApoCIII (1-79) se převedl do formy emulze v úplném Freundově adjuvans (CFA) a aplikoval se intradermální injekcí použitím 500 μς peptidů v jedné injekci v případě prvních dvou injekcí. Pak se aplikovaly v 15-ti denních intervalech zesilovací dávky ve stejném adjuvans, ale množství peptidů bylo 250 pg. Imunitní odezva se sledovala testováním antipeptidové aktivity odebrané krve systémem ELISA.

se izolovaly protilátky chromatografii. Peptidy

Z uvedených specifické produkované

Izolace protilátek ze séra:

Pozitivní odebraná krev se shromáždila a srážením s 27 i síranem sodným se izolovaly polyklonální protilátky, sebraných protilátek pro peptid afinitní v příkladu 1 se spojily se sefarózou 4B aktivovanou pomocí CH při afinitní kolonové chromatografii (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) (popisuje se v publikaci Axen and al., 1967) a sebrané protilátky procházely uvedenou kolonou. Proteiny, které se nezachytily na antigenovém gelu se vymyly izotonickým fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS: fosforečnan 50 mmol/1, pH7,2, NaCl 150 mmol/1). Nespecificky vázané frakce na peptidovém gelu se odstranily 25 mmol/1 PBS. Eluce polyklonálního specifického IgG se provedla použitím 0,2 M glycinu při pH 2,8. Čištěné protilátky se bezprostředně dialyzovaly proti 10 mmol/1 PBS, koncentrovaly se ultrafiltrací použitím systému Amicon (odstraňuje molekuly větší než 100 kDa) (Amicon, Beverly, USA), testoval se obsah proteinů (popisuje se v publikaci Lowry and al·., 1951) pak se skladovaly jako alikvoty o objemu ml (0,5 mg) při teplotě -30 °C.

Příklad 3: Mapování epítopu ApoCIII

Test ELISA:

* · · ·

2/. : .

• · · ·· ··· ··· • · ··· ·

Mikrotitrační destičky (EIA s 96 prohlubněmi s rovným dnem, Costar, Dutscher) se promyly 0,1 mmol/ί fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS, pH7,2) a pak se potáhly volným peptidem v množství 100 μΐ do jedné prohlubně (koncentrace 5 μς/ιηΐ) (1-17, 12-35, 45-65, 45-76 a ApoCIII(179)) a vše se inkubovalo přes noc při teplotě místnosti. Destičky se promyly čtyřikrát pufrem a aby se minimalizovalo nespecifické navázání v mikrotitračních prohlubních, destičky se saturovaly 3% bóvinním sérovým albuminem v množství 250 μΐ na jednu prohlubeň v ředěném 0,1 M PBS a vše se inkubovalo po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Destičky se opět čtyřikrát promyly a inkubovaly se po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C se 100 μΐ čištěné protilátky proti celému ApoCIII (produkovaném v příkladu 2), ředěném v 1% bóvinním sérovém albuminu v 0,1 M pufru PBS, pak se prohlubně promyly třikrát PBS. Aby se vyhodnotila imunologická reakce, do každé prohlubně se přidalo 100 μΐ 10 000 krát ředěného anti-králičího IgG značeného peroxidázou v 0,1% BSA v pufru PBS (Sanofi-Díagnostics Pasteur, Marnes-La-Coquette, Francie). Po inkubaci po dobu 2 hodiny při teplotě 37 °C se destičky promyly čtyřikrát PBS a přidalo se 100 μΐ roztoku substrátu. Roztok substrátu se připravil následujícím způsobem: 30 mg ofenylendiamindihydrochlorid se rozpustil ve 20 ml 0,1 mmol/1 fosforečnan-citrátového pufru, pH 5,5, který obsahuje 20 μΐ 30% peroxidu vodíku. Po 30 minutách při teplotě místnosti ve tmě se reakce zastavila přidáním 100 μΐ 1 mmol/1 HCL do každé prohlubně. Absorbance se měřila při vlnové délce 492 nm.

Výsledky:

Čištěné polyklonální protilátky vytvořené proti syntetickému celkovému apoCIII se použily k testování reaktivity s peptidy v testu ELISA a také proti celému ApoCIII. Výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 1 a ukazují, že ···· · · ·· ·· • · · · · · · · ·· · 9 · · ·· protilátka vytvořená proti celkovému ApoCIII rozeznává všechny peptidy 1-17, 12-35, 45-65 a 45-76.

Příklad 4: Afinita protilátek k ApoCIII přítomných v lípoproteinech

Testovalo se, zda různé epitopy odpovídající peptidům jsou v lípoproteinech dostupné a stanovila se afinita každé protilátkové frakce k lipoproteinům čištěným z lidské plazmy (HDL, VLDL) a proti celému ApoCIII.

Materiály a metody:

Frakce protilátek specifických pro peptid se připravily na základě imunoafinity . k různým peptidům spojovaných se sefarózou CH, jak se popisuje v příkladu 2.

Sendvičová ELISA:

Mikrotitrační destičky (EIA s 96 prohlubněmi s rovným dnem, Costar, Dutscher) se promyly 0,1 mol/1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS, pH7,2) a pak se potáhly afinitními protilátkami specifickými pro peptid v množství 100 μΐ do jedné prohlubně (koncentrace 10 mg/1) a inkubovaly se přes noc při teplotě místnosti. Destičky se pak promyly čtyřikrát pufrem a inkubovaly se po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C se 100 μΐ ředěného vzorku (použila se 4 vzorky: 1. standardní protein čištěného ApoCIII z lidské plazmy, 2. lidský HDL, 3. lidský VLDL a 4. syntetický ApoCIII(1-79)). Aby se v mikrotitračních prohlubních minimalizovalo nespecifické navázání ředění antigenu se uskutečnilo v 1% bovinním sérovém albuminu v 0,1 M pufru PBS. Aby se mohla hodnotit imunologická reakce, přidalo se do každé prohlubně 100 μΐ 2 500 krát ředěných polyklonálních protilátek proti celému ApoCIII značených peroxidázou v 0,1 % BSA v pufru PBS a 100 μΐ substrátu. Roztok substrátu se připravil následujícím postupem

4444 4 4 ·· ·· ·· • ·· · 4 4 · 4 · 4

25. : . :::.:: .· • 44 444 4 4 4

444 444 44 44 4444 mg o-fenylendiamindichloridu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se rozpustilo ve 20 ml’ 0,1 mmol/1 fos.forečnancitrátového pufru pH 5,5, který obsahuje 20 μΐ 30% peroxidu vodíku. Po 30 minutách při teplotě místnosti a ve tmě se reakce zastavila přidáním 100 μΐ 1 mol/1 HC1 do každé prohlubně. Absorbance se odečítala při vlnové délce 492 nm.

Výsledky:

Výsledky ukazují, že všechny protilátky anti-12-35 (obrázek č. 12), anti-45-65 (obrázek č. 3) a .anti-45-76 (obrázek č. 4) rozeznávají volný syntetický ApoCIII v roztoku (graf A) s přibližně stejnou afinitou jako vykazují polyklonální protilátky vytvořené proti celému ApoCIII („Ac celý - celý králičí imunoglobulin) . Graf B znázorňuje rozeznání VLDL, graf C znázorňuje rozeznání HDL a graf D znázorňuje rozeznání ApoCIII (1-79) . Z protilátek specifických pro peptid nejvyšší afinitu v případě ApoCIII v plazmatickém standardu a HDL vykazují protilátky anti-12-35. Také reaktivita anti(12-35) s VLDL je podobná aktivitě získané s králičími polyklonálními protilátkami proti apoCIII.

Příklad 5: Účinek různých protilátek na začlenění apoCIII do VLDL

Předmět vynálezu je stanovit kapacitu každé protilátky v případě inhibice asociace ApoCIII s VLDL. Frakce VLDL se připravily ultracentrifugací ze vzorků pacientů s normální obsahem triglyceridů (NTG) a hypertriglyceridemických (HTG) pacientů za použití běžných postupů. Třetí frakce VLDL se připravila ze skupiny NTG, kde další ApoCIII se naplnil in vitro do částic VLDL (obohacené VLDL nebo VLDL E-CIII).

Radioaktivní značení:

···· · · ·· ·· ··

99 99 9 · 9 99

Izolovaný ApoCIII se značil radioaktivním jódem pomocí McFaralaneho postupu upraveného podle Bilheimera (popisuje se v publikaci Bilheimer et al., 1972. Biochim. Biophys. Acta, 260, 212-221). Pryskyřice AG 2-X8 se regenerovaly 1M NaOH (po dobu 5 minut), promyly se destilovanou vodou a pak se saturovaly 1 % (hmotnost/objem) BSA v 0,01 M PBS. ApoCII se dialyzoval proti 0,01 M PBS-EDTA. 0,5 mCi ¹²⁵I se přidalo k 0,1 ml radioaktivně značeného pufru (glycin 1M, 1M NaCl), který obsahuje 5 μΐ 0,033 M roztoku IC1. Množství připraveného roztoku se smíchalo s 50 μΐ promyté pryskyřice. Pryskyřice s volným ¹²⁵I se pak odstranily centrifugací (která probíhala po dobu jedné minuty při 62 200 ot./min.), pak se získaný apoCIII dialyzoval proti 0,01 M PBS-ADTA.

Začlenění apoCIII do VLDL (v přítomnosti nebo v nepřítomnosti anti-apoCIII) :

μς každé protilátky proti apoCIII se inkubovalo po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C s ekvivalentním množstvím ¹²⁵I-apo Clil. Lipoproteiny (VLDL NTG, VLDL HTG nebo VLDL E-CIII) se smíchaly s protilátkou ¹²⁵I-apo Clil (hmotnost/hmotnost), vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Nevázané ¹²⁵I-apo Clil se dialyzovaly. Provedlo se měření radioaktivity ¹²⁵I v ¹²⁵i_ap_OciII navázané na lipočástice a nevázaného ¹²⁵I-apo Clil, aby se zjitilo rozmezí kapacity protilátek inhibovat asociaci mezi apo Clil a lipoproteiny.

Výsledky:

Výsledky na obrázku č. 5 zobrazují, že všechny protilátky (proti celému ApoCIII nebo protilátky specifické pro peptid) mají účinek ' na začlenění apo Clil do VLDL srovnatelný s polyklonálními protilátkami proti apo Clil.

Příklad 6: Účinek protilátek specifických pro ApoCIII na lipoproteinovou lipázovou aktivitu to··· to · ·· ·· ·· af ·: ·: ι : i :· .

to ·· ··*·*· · ··* ··· ··· to· ··· ··· ♦· ·♦ ·♦··

Předmětem vynálezu je schopnost protilátek chránit lipoproteinovou lipázu před inhibičním účinkem apo Clil.

Test lipolýzy heparansulfátu proteoglykanu vázaného na lipoproteinovou lipázu:

Test se provedl na mikrotitračních destičkách s 96 prohlubněmi. Prohlubně se inkubovaly s 0,5 pg heparansulfátu proteoglykanu (HSPG) ve 100 μΐ 0,1 M PBS a 0,15 M NaCl pH7,2 až 7,4 po dobu 18 hodin při teplotě 4 °C, promyly se třikrát PBS a následně se blokovaly po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C PBS, který obsahuje 1 % (hmotnost/objem) bovinni sérový albumin (BSA) v podstatě bez mastných kyselin. Prohlubně se pak inkubovaly s 2 pg lipoproteinové lipázy (LPL) ve 100 μΐ 0,1 M Tris s 20% glycerolem (objem/objem) pH 8,5 po dobu 2 hodin při teplotě 4 °C. Nefixované LPL se odstranilo tří násobným promytím pufrem Tris (0,1 M Tris, pH 8,5).

Pak se připravily čtyři frakce VLDL: Pl obsahoval VLDL získaný z lidské plazmy, která se obohatila in vitro ΑροΒ, P2 obsahuje VLDL izolovaný z lidské plazmy, která se in vitro obohatila ApoB a ApoE. Jiné frakce se připravily z Pl a P2 přidáním ApoCIII (Pl/obohacený ApoCIII a P2/obohacený ApoCIII). Některé z těchto 4 frakcí se pak inkubovaly s králičími protilátkami proti celému ApoCIII.

Lipolýza se pak odstartovala přidáním 100 μΐ lipoproteinových frakcí do prohlubní potažených LPL (0,55 k 0,5 mg/ml 0,1 M Tris, pH8,4 a 1,5 % BSA (hmotnost/objem)) a inkubace se provedla při teplotě 37 °C. Reakce se zastavila po 20 minutách přidáním 100 μΐ pufru Tris, Tritonu X-100 (konečná koncentrace 2% (objem/objem)). Z každé prohlubně se odebralo 100 μΐ lipolyzovaných lipoproteinů, zmrazilo se na teplotu -20 °C a pak se stanovila koncentrace volných mastných kyselin za ·♦·· « φ 99 ·· 99 π/9 · · · · · 4 9 9 9 ^2. * · > 9 9 · · • · · 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9

999 999 ·9 99 9999 použití kítu NEFA-C (Wako Chemicals Neuss, Německo) instrukcí výrobce.

Výsledky

Výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 6, ve všech případech se aktivita lipoproteinové lipázy zvýšila v přítomnosti protilátek proti ApoCIII.

Příklad 7: Účinek protilátek na odčerpání cholesterolu

Vynález popisuje test možných negativních účinků protilátek na HDL.

1. Izolace lipoproteinů:

HDL se izoloval z čerstvé plazmy normolipemických jedinců s hustotou 1,063 až 1,21 ultracentrifugací, kdy se pro adjustování hustoty použil Kbr, promyl se reflotací při hodnotě d rovná se 1,21 a dialyzoval se proti 0,01 M fyziologickém roztoku pufrovaným fosforečnanem pH7,4.

2. Izolace lipoproteinů obsahujících Apo-CIII imunoafinitní chromatografií:

HDL obsahující Apo-CIII a HDL, který neobsahuje Apo-CIII se připravil imunoafinitní chromatografií použitím protilátek proti Clil spojených s aktivovanou sefarózou 4B. HDL obsahující Apo-CIII se eluovaly použitím 0,01 M fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem pH7,4, EDTA 0,1 g/1 a HDL neobsahující Apo-CIII jsou eluovány použitím 3M thiokyanátu sodného. HDL obsahující Apo Clil se dialyzovaly proti 0,01 M fyziologickému roztoku pufrovaném fosforečnanem pH7,4, EDTA 0,1 g/1. Čistá frakce HDL se nazývá HDLt, zbývající frakce HDL obsahující ApoCIII se nazývá HDL Clil a frakce neadsorbovaného HDL se nazývá „HDL non Clil.

podle 3. Podmínky inokulace:

• · • 44 4 4 4 4 · 4 ·· ··· 444 *· 4« ····

Fu5AH, které jsou buňky jater krysy, se nanesly do prohlubní destiček s 12-ti prohlubněmi při koncentraci 25 000 buněk/ml a 2 ml do každé prohlubně a kultivovaly se v 95 % minimálním esenciálním médiu (GIBCO BRL) doplněném penicilínem (100 pig/ml) , streptomycinem (100 g/ml), glutaminem (2mM) a 5 % (objem/objem) sérem nově narozených telat. Buňky se nechaly růst po dobu 2 dní při teplotě 37 °C v atmosféře humidifikovaného 5 % CO₂ a pak se buněčné lipidy radioaktivně značily.

Pro jeden vzorek se použily 3 prohlubně a pro kontrolu správnosti snižování cholesterolu se použila negativní kontrola: 1 ml minimálního esenciálního média pozitivní kontrola: HDL₃ v koncentraci 100 μρ/ιηΐ vnitřní kontrola: sebraná lidská normolipemická plazma uložená při teplotě -20 °C a použití v koncentraci 2,5 % (objem/objem) kontrola naneseného značeného cholesterolu:

radioaktivita buněk se měřila před inkubací se vzorky.

4. Radioaktivní značení buněk Fu5AH:

Radioaktivně značený cholesterol [la,2a, (n) -³H]cholesterol se přidal do buněk tak, aby konečná koncentrace byla 1 μϋί v jedné prohlubni:

- odpařit	X μθί v atmosféře dusíku
přidat	1 ml etanolu a inkubovat 45 až 60 minut při
teplotě	60 °C
odpařit	v atmosféře dusíku
přidat	50 μΐ etanolu a inkubovat 15 až 30 minut při
teplotě	60 °C
přidat	stejný objem minimálního esenciálního média
(MEM) a	sérum z nově narozených telat tak, aby konečná

99

4 9 ·

9 9 *

9« 9 9

9 9 9 ·· 9 99 9

9999

• · 9 9« 9 « «9 koncentrace byla 5 % v MEM a inkubace byla 30 minut při teplotě 37 °C přidat MEM tak, aby se dosáhlo konečného objemu buňky se nechaly růst během 3 dní v přítomnosti radioaktivní značky (2 ml v každé prohlubni).

5. Snižováni cholesterolu:

Aby se zajistilo, že značení se dostane ke všem buňkám, značící médium se nahradilo MEM, které obsahuje 0,5 % bovinní sérový albumin (BSA), 24 hodin před snižováním cholesterolu.

prohlubně se promyly fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) a inkubovaly se tři hodiny při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO₂, konečná koncentrace HDL je 50 ng/ml (500 μΐ do jedné prohlubně). Před inkubací HDL s buňkami se HDL předem inkubovalo s různými protilátkami v koncentraci 15 ng/ml po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C fáze snížení se ukončila odstraněním média, které obsahuje sérum, z každé prohlubně a pak se buňky promyly třikrát PBS. Buňky se resuspendovaly v 500 μΐ hydroxydu sodného (0,1 mol/1) počítání buněk proběhlo v 250 μΐ média nebo v buněčné suspenzí, do které se přidaly 4 ml scintilačního koktejlu (optická fáze „Hisafe 3, WALLAC) pomocí kapalného scintilačního počítače (WALLAC 1410) během jedné minuty.

Procento odstranění se vypočítalo podle vzorce:

[dpm média / (dpm média + dpm buněk)] * 100

Výsledky:

HDL, který obsahuje ApoCIII se oddělil od HDL, který neobsahuje ApoCIII na základě imunoafinity. Snížení ·»*· • · · ♦ ··♦·* ·· ··· ··· ·· ·· ··*· cholesterolu se měřilo v různých frakcích (celkový HDL, HDL- Clil a HDH non Clil) s a bez protilátek proti celému ApoCIII a proti 12-35 v různých koncentracích. Výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 7 a 8. Potvrdilo se ve všech experimentech, že tyto protilátky neovlivňují funkci HDL při snižování cholesterolu.

Příklad 8: Výroba a imunogennost peptidových konjugátů

Připravily se imunogeny obsahující peptidy 12-35 a 45-65 konjugované s bovinním sérovým albuminem (BSA), použily se ve vakcínách a aplikovaly intramuskulárně myším.

Syntetizovala se čtveřice peptidů. Jeden pár peptidů je založen na sekvenci 12-35 a jiný pár peptidů je založen na sekvenci 45-65 ApoCIII. Každý pár peptidů měl linker GGC začleněný do N-konce nebo C-konce peptidu:

12-35cooh MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVGGC (SEQ ID NO. 8)

12-35nh2 CGGMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV (SEQ ID NO. 9)

45-65cooh DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWGGC (SEQ ID NO. 10)

45-65nh2 CGGDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW (SEQ ID NO. 11)

Peptidy se konjugovaly s BSA, který slouží jako proteinový nosič maleimidovým postupem. BSA se získal od Pierce, které se předem aktivoval sukcinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-cyklohexan-l-karboxylátovým (SMCC) linkerem. SMCC je možné získat od libovolného velkého výrobce a použije se podle návodu výrobce. Spojení BSA s nosičem prostřednictví SMCC se provedlo během 2 hodin při teplotě místnosti s přebytkem peptidu. Před ukončením reakce byl nadbytek cysteinu. Pak následovala díalýza proti fosforečnanovému pufru.

0000 0 ·:

0 0 0 0

000 • 0 0 0· 0 · 00 0 0 0 0 0

9 0 0 0 « 9 0 9 9

909 99 00 9000

protein

Analýza ukazuje, že obsahují s každou molekulou nosiče BSA se imunogenů spoj ilo přibližně 19 peptidů.

Imunogeny se použily ve vakcinách smíšením systému adjuvans obsahujícího saponin QS21, 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) a oleje ve vodní suspenzi (skvalen a atokoferolová olejová fáze), jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 95/17 210. Vakciny se aplikovaly skupinám, které obsahují vždy 10 myší BalbC, které obsahují 25 μρ imunogenu, intramuskulárně v den 0, 14 a 28 a vzorky séra se odebraly v den 28 a 42. Séra se pak analyzovala testem ELISA za účelem zjištění titrů protilátek proti celému ApoCIII a peptidu (destičky se potáhly buď celým ApoCIII nebo odpovídajícím peptidem) a výsledky se vyjádřily jako střední hodnota titrů.

Výsledky:

· *·· «·· ·· *· ····

Výsledky ukazují, že peptidové imunogeny produkovaly vysoce imunogenní protilátky, které zkříženě reagovaly s přirozeným celým ApoCIII. Výsledky získané ve skupinách byly vysoce homogenní a vykazovaly silný zesilující účinek po třetí aplikaci. Výsledky v případě každé myši ve skupině zahrnující 10 jedinců jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1: Titry IgG proti peptidu po II imunizaci (den 28)

	titry IgG proti peptidu (	po II imuniza	ci)
myš č.	12-35COOH-BSA	12-35NH2-BSA	45-65COoh-BSA	45-65nh2-BSA
1	8 930	7 147	3 481	6 091
2	74 950	10 459	1 128	12 112
3	24 889	8 825	1 847	3 780
4	51 084	11 922	1 907	9 289
5	34 756	9 084	2 217	6 563
6	19 427	3 346	1 068	4 283
7	66 607	1 677	1 794	773
8	13 579	7 020	907	3 269
9	14 493	15 311	2 434	939
10	30 499	43 065	1 318	12 667
průměr	33 921	11 786	1 810	5 977
geometrický průměr	27 297	8 450	1 672	4 305
standardní odchylka	23 013	11 673	777	4 232

Tabulka č. 2: Titry IgG proti peptidu po III imunizaci (den 42)

	titry IgG proti peptidu (po III imunizaci)
myš č.	12-35COOh-BSA	12-35nh2-BSA	4 5 - 65COoh-BSA	45-65NH2-BSA
1	69 735	11 369	9 667	3 005
2	123 458	17 581	3 440	15 804
3	68 283	7 867	17 535	5 826

• « • 9 *

4	75 884	22 679	20 866	23 188
5	34 135	12 938	16 917	11 930
6	82 473	11 664	7 353	8 013
7	163 248	7 996	3 620	172
8	51 196	10 605	7 859	2 464
9	65 127	11 165	6 122	2 026
10	59 430	25 079	6 304	23 379
průměr	79 297	13 894	9 968	9 581
geometrický průměr	72 590.	12 902	8 357	5 117
standardní odchylka	37 501	5 940	6 208	8 666

Tabulka č. 3: Titry IgG proti celému ApoCIII po II imunizaci (den 28)

	titry IgG proti celému ApoCIII (po II imunizaci)
myš č.	12-35COoH_BSA	12-35NH2-BSA	4 5- 65cooh_ BSA	4 5 — 65Nh2“BSA
1	607	2 618	9 531	786
2	4 471	2 176	7 997	3 854
3	2 193	250	763	2 370
4	6 118	649	4 728	475
5	3 587	775	6 890	3 816
6	3 012	1 223	9 924	3 627
7	3 350	250	8 340	250
8	1 853	718	6 079	250
9	1 155	4 791	10 037	2 618
10	1 056	2 730	1 948	6 067
průměr	2 740	1 618	6 624	2 411
geometrický průměr	1 718	1 452	3 266	1 963
standardní odchylka	2 225	1 075	5 334	1 469

·»·♦

Tabulka č. 4: Titry IgG proti celému ApoCIII po III imunizaci (den 42)

	titry IgG proti celému ApoCIII (po III	imunizaci)
myš č.	12-35Cooh~BSA	12 — 3 5nh2~BSA	4 5 - 65cooh~BSA	45 — 65Nh2~BSA
1	14 231	16 618	18 010	1 182
2	46 994	26 128	10 152	6 866
3	19 189	5 342	2 392	5 460
4	32 417	18 256	12 061	635
5	7 506	10 740	17 636	7 448
6	35 724	9 794	13 494	4 490
7	24 471	5 681	9 275	50
8	13 474	4 658	11 230	606
9	25 203	23 127	12 450	9 445
10	5 196	24 516	1 744 .	24 066
průměr	22 441	14 486	10 844	6 025
geometrický průměr	13 205	8 322	5 436	7 150
standardní odchylka	18 547	12 092	8 817	2 405

I» v

44 9 ·3θ : .

9 4 9 9 . · · 4 4 9

9 9 1 9 4

9 9 9 9 • ·· *4 4944

Seznam sekvencí (2)' Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 79 aminokyselinových zbytků
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/

xi)

Pop

is

sekvenc

e:

SEQ

ID

NO:

1:

Ser

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Phe

Met

Gin

Gly

Tyr

Met

1

5

10

15

Lys

His

Ala

Thr

Lys

Thr

Ala

Lys

Asp

Ala

Leu

Ser

Ser

Val

Gin

Glu

20

25*

30

Ser

Gin

Val

Ala

Gin

Gin

Ala

Arg

Gly

Trp

Val

Thr

Asp

Gly

Phe

Ser

35

40*

45

Ser

Leu

Lys

Asp

Tyr

Trp

Ser

Thr

Val

Lys

Asp

Lys

Phe

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Trp

Asp

Leu

Asp

Pro

Glu

Val

Arg

Pro

Thr

Ser

Ala

Val

Ala

Ala

65

70

75

(2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met Gin Gly Tyr Met 15 io ₁₅

Lys - (2)

Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 40 aminokyselinových zbytků TYP: aminokyselinová DRUH ŘETĚZCE: TOPOLOGIE:
(ii)	1 DRUH	MOLEKULY: protein
ix)	ZNAKY:

(D) Jiné informace: /poznámka=peptidy lidského ApoCIII/

(xi)

Popis

se

kvence:

SEi

2 ID NO

: 3

Ser Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Phe

Met

Gin

Gly

Tyr

Met

1

5

10

15

Lys His

Ala

Thr

Lys

Thr

Ala

Lys

Asp

Ala

Leu

Ser

Ser

Val

Gin

Glu

20

25

30

Ser Gin

Val

Ala

Gin

Gin

Ala

Arg

35

40

I n f o rm

.ace

O SEQ

ID

NO:

4 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met Gin Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu 1.5 10 15

Ser Ser Val Gin Glu Ser Gin Val 20

(2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) (ii) (ix)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselinových (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

DRUH MOLEKULY: protein ZNAKY:

zbytků (D) Jiné informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/

(xi)

Pop

iis

sekvenc

e:

SEQ

ID

NO:

5:

Gly

Trp

Val

Thr

Asp

Gly

Phe

Ser

Ser

Leu

Lys

Asp

Tyr

Trp

Ser

Thr

1

5

10

15

Val

Lys

Asp

Lys

Phe

Ser

Glu

Phe

Trp

Asp

Leu

Asp

Pro

Glu

Val

Arg

20

25

30

Pro

Thr

Ser

Ala

Val

Ala

Ala

(2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(xi)

Asp I

Phe (D) Jme informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/

Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys ⁵ 10 15

Ser Glu Phe Trp

• · · · · · ··« ·· ·· ···· (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) (ii) (ix)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 aminokyselinových (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

DRUH MOLEKULY: protein ZNAKY:

zbytků (D) Jme informace: /poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ (xi) Popis sekvence

Asp	Gly	Phe	Ser	Ser	Leu	Lys
1				5
Phe	Ser	Glu	Phe	Trp	Asp	Leu

SEQ ID NO: 7:

Asp	Tyr	Trp 10	Ser	Thr	Val	Lys	Asp 15	Lys
Asp	Pro 25	Glu	Val	Arg	Pro	Thr 30	Ser	Ala

:

(2) Informace o SEQ ID NO:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Met Gin Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu ! 5 10 15

Ser Ser Val Gin Glu Ser Gin Val Gly Gly Cys 20 25

2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace: /poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

·· ·· • · · ·

Cys Gly Gly Met Gin Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys	Thr Ala Lys
15 lo	15
Asp Ala Leu Ser Ser Val Gin Glu Ser Gin Val
'· 20 25

(2)

Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 24 aminokyselinových
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein

zbytků (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace:

/poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys ⁵ 10 15 Phe Ser Glu Phe Trp Gly Gly Cys (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ix) ZNAKY:

(D

DRUH MOLEKULY: protein

Jiné informace:

(ii) • ·

Cys

Lys /poznámka=peptidy lidského ApoCIII/ xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Gly Gly Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val 5 10 15

Asp Lys Phe Ser Glu Phe Trp

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   99 ·· ··

   19 · 9 9 » · · 0 · >00 9 • · 0 9 0

   0 ·0 00 0001

   1. Imunogenní prostředek vhodný pro aplikaci lidskému hostiteli za účelem léčby nebo prevence aterosklerózy, vyznačující setím, že má imunogen obsahující apolipoprotein nebo peptid nebo jeho fragment, který ve své přirozené formě apolipoproteinu v plné délce má alespoň jednu z následujících aktivit (a) inhibice navázání apolipoproteinu B na jeho receptor a/nebo (b) inhibice lipoproteinové lipázy a imunogenní prostředek je schopen vyvolat v lidském hostiteli imunitní odezvu.
2. 2. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že přirozená forma apolipoproteinu v plné délce vykazuje obě aktivity.
3. 3. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že apolipoprotein je ApoCIII nebo fragment, peptid nebo jeho mimotop.
4. 4. Imunogenní prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že ApoCIII nebo fragment nebo jeho mimotop je konjugováný nebo fúzováný s proteinovým nosičem.
5. 5. Imunogenní prostředek podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že imunogen je libovolná ze sekvencí vybráných ze SEQ ID NO: 1 až 7.
6. 6. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, ž e zahrnuje imunogenní prostředek podle libovolného z nároků 1 až 5 a adjuvans.
7. 7. Způsob léčby nebo prevence aterosklerózy selektivně inhibující aktivitu aterogenního apolipoproteinu v lidském hostiteli, vyznačuj ící aplikaci činidla, které vede z následujících aktivit se tím, že zahrnuje k inhibici alespoň jedné uvedeného aterogenního ··«· · · «· »» ·· « ·· ·» · · * · « » · · · » · · • ·· ······ · • · · · · · · · · ·« ··· ··· ·· ·· ···· apolipoproteinu v lidském hostiteli, který potřebuje takovou léčbu nebo prevenci, (a) inhibice navázání apolipoproteinu B na jeho receptor a/nebo (b) inhibice lipoprotinové lipázy.
8. 8. Způsob léčby nebo prevence aterosklerózy selektivně inhibující aktivitu ApoCIII v lidském hostiteli, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci činidla, což vede k selektivní inhibici aktivity ApoCIII v lidském hostiteli, který takovou léčbu nebo prevenci potřebuje.
9. 9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že činidlo je vakcinační prostředek obsahující jako imunogen ApoCIII nebo jeho fragment.
10. 10. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačuj ící se tím, že činidlo je ligand ApoCIII.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, ž e ligandem je protilátka.
12. 12. Způsob podle nároků 7 až 11, vyznačuj ící se tím, že činidlo blokuje inhibici lipoproteinové lipázy zprostředkovanou ApoCIII a navázání ApoB na jeho receptor.