CZ2002480A3 - Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje polypeptid s autoproteolytickou aktivitou - Google Patents
Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje polypeptid s autoproteolytickou aktivitou Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2002480A3 CZ2002480A3 CZ2002480A CZ2002480A CZ2002480A3 CZ 2002480 A3 CZ2002480 A3 CZ 2002480A3 CZ 2002480 A CZ2002480 A CZ 2002480A CZ 2002480 A CZ2002480 A CZ 2002480A CZ 2002480 A3 CZ2002480 A3 CZ 2002480A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- fusion protein
- nucleic acid
- amino acid
- acid molecule
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 43
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 35
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N csfv Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N 0.000 claims 6
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 claims 1
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 13
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 12
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 8
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NSHWGYPCYVZQOD-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=C)C(=O)O)=CC2=C1 NSHWGYPCYVZQOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001118702 Border disease virus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000863013 Caulobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000010804 Caulobacter vibrioides Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000021 N-terminal protease Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 101800001098 Serine protease NS3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102000034288 naturally occurring fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006048 naturally occurring fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
- C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu výroby požadovaného heterologního polypeptidu s jasně definovaným homogenním N-koncem v bakteriální hostitelské buňce, přičemž požadovaný heterologní polypeptid autoproteolyticky vyštěpen autoproteolytickou aktivitou Npro z původně exprimovaného fúzního proteinu, který obsahuje peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy Npro pestiviru a heterologní polypeptid.
Dosavadní stav techniky
Při přípravě rekombinantních proteinů v heterologních organismech jako např. při expresi humánních nebo jiných eukaryotických proteinů v bakteriálních buňkách je často obtížné získat jasně definovaný N-konec, který by byl pokud možno 100% homogenní, až se týká především rekombinantních farmaceutických proteinů, jejichž aminokyselinová sekvence by v mnoha případech měla být shodná s aminokyselinovou sekvencí proteinů přirozeně se vyskytujících u člověka/zvířete.
Při normální, přirozené expresi, např. u člověka, mnohé farmaceutické proteiny, které se užívají, jsou transportovány do extracelulárního prostoru, přičemž štěpení signální sekvence přítomné v prekurzorovém proteinu právě pro tento účel vede ke vzniku jasně definovaného N-konce. Takový homogenní N-konec φφ Φφφφ β« *♦ ·· ·· φ φ φ · · · * · φ φ φ φ φ · ΦΦΦ φφφφ φ • Φφ ΦΦΦ ΦΦΦ φφ φ φφ φφφφ φφ φφφφ
- 2 není vždy snadné připravit, např. při expresi v bakteriálních buňkách, a až z několika důvodů.
Jen ve výjimečných případech je možný export do bakteriálního periplazmatického prostoru pomocí eukaryotické prosekvence nebo signální sekvence, protože se zde může akumulovat jen velmi malé množství produktu z důvodu nízké transportní kapacity bakteriálního exportního mechanismu.
Bakteriální cytoplazma se výrazně liší od extracelulárního prostoru eukaryot. Na jedné straně jsou zde redukující podmínky, na druhé straně zde není žádný mechanismus pro odštěpení N-koncové vedoucí (leader) sekvence z maturovaného (zralého) proteinu. Syntéza všech cytoplazmatických proteinů začíná methioninem, který je kódován příslušným iniciačním (startovním) kodonem (ATG = iniciace translace). Tento N-koncový methionin je u mnoha proteinů zachován, zatímco u jiných je odštěpen methioninaminopeptidázou (MAP), která je přítomna v cytoplazmě a je vlastní hostiteli. Účinnost štěpení závisí v podstatě na dvou parametrech:
1. Povaha následující aminokyseliny a
2. Lokalizace N-konce v trojrozměrné struktuře proteinu.
N-koncový methionin je přednostně ' odstraněn, když následující aminokyselinou je serin, alanin, glycin, methionin nebo valin a když N-konec je exponován, tzn. když není ukryt uvnitř proteinu. Na druhé straně, když je následující aminokyselina jiná, především nabitá aminokyselina (kyselina glutamová, kyselina asparagová, lysin, arginin), nebo když je N-konec lokalizován uvnitř proteinu, ve většině případů k odštěpení N-koncového methioninu nedojde (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).
- 3 •· ··»· • ·'· φ φ φφ φ φ φ φ φ Φ ΦΦΦ φ φ φ φφφ φ · φ ·· φ «φ φφφφ φφ ΦΦΦΦ
Dokonce i když aminokyselina podporující štěpení je přítomna v poloze 2, štěpení je zřídkakdy úplné. Obvykle významné množství (1-50%) zůstane neovlivněno MAP.
V časných dobách produkce rekombinantních farmaceutických proteinů v bakteriálních buňkách se jednoduše vkládal methionin-kódující ATG startovní kodon před otevřený čtecí rámec (ORF) pro maturovaný protein (tj . bez signální sekvence nebo jiných extenzí N-konce). Exprimovaný protein pak měl sekvenci H2N-Met-cílový protein. Pouze v několika případech bylo možné dosáhnout úplného odštěpené N-koncového methioninu MAP hostitele. Většina proteinů připravovaných tímto způsobem byla tudíž buďto nehomogenní na svém N-konci (jednalo se o směs Met-formy a formy bez Met) nebo měly všechny molekuly dodatečnou cizorodou aminokyselinu (Met) ne svém N-konci(pouze Met-forma).
Tato nehomogenita nebo odchylka od přírodní sekvence je však v mnoha případech nepřijatelná, neboť, takové produkty často vykazují odlišné imunologické (např. indukce protilátek) a farmakologické vlastnosti (biologický poločas, farmakokinetika). Z těchto důvodů je nyní nutné produkovat většinou přírodně identické produkty (homogenní a bez cizorodé aminokyseliny na N-konci). V případě cytoplazmatické exprese je nápravou zpravidla fúze štěpné sekvence (leader sekvence) pro specifickou endopeptidázu (např. Faktor Xa, enterokináza, KEX endopeptidázy, IgA proteáza) nebo aminopeptidázu (např. dipeptidylaminopeptidáza) na N-konec cílového proteinu. Avšak až představuje další krok a vynaložení dalších nákladů a materiálu při následném (tzv. downstream) zpracování produktu.
• * « *· · ··
- 4 Takže existuje stálá potřeba nových způsobů přípravy cílového proteinu v bakteriálních buňkách, kdy by byl cílový protein s požadovaným uniformním N-koncem bez potřeby dalších in vitro kroků (nové svinutí, purifikace, štěpení proteázou, nová purifikace atd.). Právě takový způsob využívající virové autoproteázy Npro z pestiviru je předmětem předkládaného vynálezu.
Pestiviry tvoří skupinu patogenů, které způsobují značné ekonomické ztráty v chovech prasat a přežvýkavců po celém světě. Zvláště významným patogenem je klasický virus horečky prasat (CSFV, Clasical swine fever virus), který způsobuje přenosné onemocnění a podléhá tudíž ohlašovací povinnosti. Ztráty způsobené virem průjmu hovězího dobytka (BVDV, bovine viral diarrhoea virus) jsou také značné, zejména z důvodu pravidelného výskytu intrauterinní infekce plodů.
Pestiviry jsou malé obalové viry, jejichž genom velikosti 12,3 kb působí přímo jako mRNA, ze které jsou v cytoplazmě transkribovány virové produkty. K tomu dochází ve formě jediného polyproteinu, který obsahuje přibližně 4000 aminokyselin a který je naštěpen virovým a buněčnými proteázami na 12 zralých proteinů.
Do nynějška byly identifikovány dvě virově kódované proteázy u pestivirů, a sice autoproteáza Npro a serinová proteáza NS3. N-koncová proteáza Npro je lokalizována na N-konci polyproteinu a má zjevnou molekulovou hmotnost 23000 (D). Katalyzuje štěpení, ke kterému dochází mezi jejím vlastním C-koncem (Cysl68) a N-koncem (Serl69) nukleokapsidového proteinu C (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095).
Navíc duplikace genu Npro byly popsány u cytopatogenních virů «9*9
- 5 • 9·
9 «9 9999
BVDV. V nich je druhá kopie Npro na N-konci podobně dup li kované NS3 proteázy. Autoproteolytické štěpení proteinu Npro-NS3 bylo pozorováno i v tomto případě (R. Stark et al., viz výše).
Npro je autoproteáza délky 168 aminokyselin (aa) a zjevnou Mr 20,000 (D) (in vivo). Je prvním proteinem v polyproteinu pestivirů (jako je např. CSFV, BVDV nebo BDV (border disease virus)) a podléhá autoproteolytickému odštěpení od následujícího nukleokapsidového proteinu C
| (M. Wiskerchen et | al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514; Stark et | ||
| al., J. Virol. | 67 (1993), | 7088-7095). | Toto štěpení se |
| uskutečňuje za tj. Cysl68. | poslední | aminokyselinou | sekvence Npro, |
| Podstata vynálezu | |||
| Nyní bylo | překvapivě | zj ištěno, že | autoproteolytická |
funkce autoproteázy Npro pestivirů je zachována v bakteriálním expresním systému, především při expresi heterologních proteinů. Předkládaný vynález se tudíž týká způsobu výroby požadovaného heterologního polypeptidu s jasňě definovaným Nkoncem v bakteriální hostitelské buňce, přičemž požadovaný heterologní polypeptid je autoproteolytickou aktivitou Npro odštěpen z na počátku exprimovaného fúzního proteinu, který obsahuje peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy Npro pestivirů a heterologní polypeptid. Předkládaný vynález se dále týká prostředků klonování, které se užívají při způsobech podle vynálezu.
φφ φφφφ • φ · » · « φφφφ φ φφφ φφφ φφφ φφ φ φφ φφφφ φφ φφφφ
- 6 Polypeptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy Npro pestiviru nebo polypeptid s autoproteolytickou funkcí autoproteázy Npro pestiviru je především autoproteáza Npr0 pestiviru, nebo její derivát autoproteolytickou aktivitou.
V předkládaném vynálezu termín heterologní polypeptid znamená polypeptid, který není v přírodě odštěpován autoproteázou Npro pestiviru z přírodně se vyskytujícího fúzního proteinu nebo polyproteinu. K příkladům heterologních polypeptidů patří průmyslové enzymy nebo polypeptidy s farmaceutickou aktivitou, především farmaceutickou aktivitou u člověka.
K příkladům výhodných polypeptidů s humánní farmaceutickou aktivitou patří cytokiny jako jsou interleukiny, např. IL-6, interferony jako jsou leukocytární interferony, např. interferon a2B, růstové faktory, především růstové faktory účastnící se hematopoezy hojení poranění, jako jsou např. G-CSF, erythropoetin nebo IGF, hormony jako je např. humánní růstový hormon (hGH), protilátky anebo vakcíny.
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká molekuly nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, přičemž tento fúzní protein obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy Npro pestiviru, a druhý polypeptid, který je spojen s prvním polypeptidem na C-konci prvního polypeptidů takovým způsobem, že druhý polypeptid může být odštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidů, a přitom druhý polypeptid je heterologní polypeptid.
Pestivirus je pro účely vynálezu výhodně vybrán ze skupiny obsahuj CSFV, BDV a BVDV, zvláště výhodný je CSFV.
- 7 «« ·· ·· ·· 9 9 · · ♦ · ♦ « · · «·· · · · · · · 99 » 99 9999 99 ···
Výhodná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je taková molekula, kde první polypeptid fúzního proteinu obsahuje následující aminokyselinovou sekvenci autoproteázy Npro z CSFV (viz také sekvence s přístupovým číslem X87939 v databázi EMBL) (aminokyseliny 1 až 168, čtení ve směru od N-konce do C-konce) (1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), nebo aminokyselinovou sekvenci jejího derivátu, který má autoproteolytickou aktivitu.
Deriváty s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy Npr° pestiviru jsou autoproteázy Npro připravené mutagenezí, především užitím substitucí, delecí, adicí a/nebo inzercí aminokyselin, pokud je uchována požadovaná autoproteolytická aktivita, především pro vytváření požadovaných proteinů s homogenním N-koncem. Způsoby přípravy takových derivátů mutagenezí jsou odborníkům známy. Takovými mutacemi je možné optimalizovat aktivitu autoproteázy Npro, např. ve vztahu k různým heterologním proteinům, které mají být štěpeny. Po přípravě nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, který kromě požadovaného heterologního proteinu obsahuje derivát autoproteázy Npro vykazující jednu nebo více mutací vzhledem k přírodně se vyskytující autoproteáza Npro, se určí, zda je požadovaná funkce přítomna stanovením autoproteolytické aktivity v expresním systému.
Autoproteolytická aktivita může být na počátku např. detekována v systému in vitro. Pro tento účel je DNA konstrukt transkribován do RNA a pak translatován do proteinu pomocí »»4· ·
444 444 94 4 ·· 4449 ·4 4494
- 8 soupravy pro in vitro translaci. Pro zvýšení citlivosti může být v některých případech výsledný protein označen inkorporací radioaktivních aminokyselin. Výsledný fúzní protein Npr°-cílový protein je podroben kotranslačnímu a/nebo post-translačnímu autokatalytickému štěpení, kdy dojde k přesnému odštěpení Nkoncového Npro úseku od zbytku proteinu jeho vlastní autoproteolytickou aktivitou. Výsledné produkty štěpení lze snadno detekovat a směs může být snadno zpracována ihned po ukončení in vitro translace. Směs se nanese na gel pro analýzu proteinů (SDS-PAGE podle Lámmliho) a podrobí se elektroforéze. Pak se gel obarví vhodnými barvivý nebo se provede autoradiografie. Analýza užitím Western přenosu (Western blot) s následným imunobarvením je také možná. Účinnost štěpení fúzního proteinu může být vyhodnocena na základě intenzity výsledných proteinových pásů.
V dalším kroku fragment nukleové kyseliny pro fúzní protein může být klonován do bakteriálního expresního vektoru (pokud to nebylo provedeno již kvůli in vitro translaci) a ten je pak transformací vnesen do vhodného hostitele (např. E. coli) . Vzniklý expresní kmen exprimuje fúzní protein buďto konstitutivně nebo po přidání induktoru. ' V případě užití induktoru je třeba hostitele po přidání induktoru dále kultivovat 1 až více hodin, aby bylo dosaženo dostatečného titru produktu. Npro autoproteáza pak sama štěpí ko- nebo posttranslačně fúzní protein, takže výsledné fragmenty jsou samotná Npro autoproteáza a samotný cílový protein s definovaným N-koncem. Pro stanovení účinnosti štěpné reakce je na konci kultivace nebo indukční fáze odebrán vzorek a analyzován SDSPAGE, jak bylo popsáno výše.
- 9 φ· · φφφ ·« «φ ·φ φφ φ ♦ φ · φ · · φφφφ φφφ * · φφφ φ «φφ φφφ φφφ φφ φ φφ φφφφ φφ φφφφ
Výhodný derivát autoproteázy Npro popisovaného fúzního proteinu má např. N-koncový úsek, kde byla jedna nebo několik aminokyselin deletováno nebo substituováno v úsek aminokyselin 2 až 21, pokud vzniklý derivát nadále vykazuje autoproteolytickou funkci autoproteázy Npro v požadovaném rozsahu.
Výhodný derivát autoproteázy Npro ve fúzním proteinu obsahuje např. aminokyselinovou sekvenci autoproteázy Npro z CSFV s delecí aminokyselin 2 až 16 nebo 2 až 21. Je také možné prostřednictvím substituce nebo adice aminokyselin změnit nebo vložit aminokyselinovou sekvenci, např. se vnese aminokyselinová sekvence, která usnadňuje purifikaci (viz příklady).
Zvláště vynálezu je výhodná molekula nukleové kyseliny podle taková, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Glu22 až Cysl68 autoproteázy Npro z
CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
Podobně výhodná molekula nukleové' kyseliny podle vynálezu je taková, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Prol7 až Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je především ve formě molekuly DNA.
- 10 • ·♦ · *· ♦ · 99 99
9 9 «>·« »·** » » ♦ · · · « · « ·· · 99 9999 99 9999
Předkládaný vynález se dále týká klonovacích elementů, především expresních vektorů a hostitelských buněk, které obsahují molekulu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Vynález se dále týká expresního vektoru, který je kompatibilní s předem definovanou bakteriální hostitelskou buňkou, a který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu a alespoň jednu sekvenci pro kontrolu exprese. Sekvence pro kontrolu exprese jsou především promotory (např. lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL nebo phoA) , vazebná místa ribozomů (např. přirozená vazebná místa ribozomů patřící k výše zmíněným promotorům, cro nebo syntetická vazebná místa ribozomů), nebo terminátory transkripce (např. rrnB T1T2 nebo bia) . Hostitelské buňky jsou výhodně bakteriální buňky rodu Escherichia, především E. coli. Avšak mohou být užity i jiné bakteriální buňky. Ve výhodném provedení vynálezu je expresním vektorem podle vynálezu plazmid.
Předkládaný vynález se dále týká bakteriální hostitelské buňky, která obsahuje expresní vektor podle vynálezu. Takové bakteriální hostitelské buňky mohou být vybrány ze skupiny obsahující následující mikroorganismy: Gram-negativní baktérie rodu Escherichia, např. E. coli, nebo jiné Gram-negativní baktérie, např. Pseudomonas sp., jako je např. Pseudomonas aeruginosa, nebo Caulobacter sp., jako je např. Caulobacter crescentus, nebo Gram-pozitivní baktérie jako jsou baktérie rodu Bacillus sp., především Bacillus subtilis. Zvláště výhodné hostitelské buňky jsou E. coli.
Předkládaný vynález se dále týká způsobu výroby požadovaného heterologního polypeptidu, který obsahuje kroky: (i) kultivace bakteriálních hostitelských buněk podle vynálezu, které obsahují expresní vektor podle vynálezu, který obsahuje ·♦ ·»*« ♦ Φ
- 11 ♦ · #· • · φ · · · · · · · « φφφ φ» φ • · φ · φ φ • Φ ·«·« φφ ΦΦΦ· molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, přičemž kultivace probíhá v podmínkách, které způsobí expresi fúzního proteinu a dále autoproteolytické odštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu v hostitelské buňce autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, a (ii) izolace odštěpeného heterologního polypeptidu.
Způsob podle vynálezu se provádí v principu počáteční kultivací bakteriálních hostitelských buněk, tj . expresního kmenu těchto buněk, obvyklým mikrobiologickým způsobem, který je odborníkovi znám. Kmen je kultivován z jedné výchozí kolonie na živném médiu, ale je také možné jako výchozího materiálu užít kryoprezervovanou suspenzi buněk (buněčné banky). Kmen se obecně kultivuje v několika stupňovém procesu, aby byla získána dostatečná biomasa pro další zpracování.
V malém měřítku probíhá kultivace v protřepávaných kultivačních lahvích, ve většině případů je možné užít úplné médium (např. LB živné médium). Avšak může se užít také specificky definované médium (např. citrátové médium). Pro kultivaci se připraví maloobjemová překultura hostitelského kmenu (inokulovaná jedinou kolonií nebo kryoprezervovanou buněčnou suspenzí), teplota při této kultivaci obvykle není kritická pro pozdější výsledky exprese, takže se rutinně provádí při vyšších teplotách (např. 30°C nebo 37°C). Hlavní kultura se nasadí ve větším (např. 500 ml) , kde je především nutné zajistit dobré provzdušnění (velký objem kultivační lahve proti objemu obsahu, vysoká rychlost rotace). Vzhledem k úmyslu dosáhnout exprese v rozpustné formě, hlavní kultura se ve většině případů provádí při poněkud nižších teplotách (např. 22 nebo 28°C). Jak indukovatelné systémy (např. s promotory trp, lac, tac nebo phoA) tak konstitutivní systémy jsou vhodné pro »4 ♦· 44 • · · *444 4 · 4
4 4»4 · • •4 · 4 4 4 4 4 44 4 4« 4444 44 444
- 12 produkci rozpustných proteinů. Po té, co bylo dosaženo pozdní logaritmické fáze (obvykle při optické hustotě 0,5 až 1,0 v třepaných lahvích) se v indukovatelných systémech přidá induktor (např. indolylakrylová kyselina, isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid = IPTG) a inkubace pokračuje dále 1 až 5 hodin. Koncentrace induktoru se v takovém případě volí na spodní hranici, aby se dosáhlo mírné exprese. V průběhu této doby se vytvoří většina fúzního proteinu Npr°-cílový protein přičemž současně dojde ke ko- nebo post-translačnímu odštěpení úseku Npr0, takže na konci kultivace v kultivačním systému existují dva odštěpené úseky samostatně. Buňky je možné sklidit a dále zpracovat.
Ve velkém měřítku vícestupňový kultivační proces probíhá v řadě bioreaktorů (fermentorů), přičemž je výhodné užít definovaná živná média, aby bylo možné zlepšit ovládání a kontrolu procesu. Kromě toho je možné významně zvýšit nárůst biomasy a tvorbu produktu dávkováním určitých živin (krmná dávka). Jinak je proces analogický procesu v malém měřítku v třepaných lahvích. Tak např. se užije fermentor pro předběžnou fázi a fermentor pro hlavní fázi a zvolí se kultivační teploty shodné s teplotami při kultivaci v lahvích. Fermentor pro předběžnou fázi je inokulován inokulem, které se vypěstuje z jediné kolonie nebo z kryokultury v kultivační lahvi. Ve fermentorů je také třeba zajistit dobré provzdušňování a přítomnost dostatečné koncentrace induktoru, zejména pak v hlavní fázi. Indukční fáze však musí být někdy jinak dlouhá než indukce v kultivační lahvi. Výsledné buňky se pak užijí pro další zpracování.
*· ·· 4· *· ·· * · 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 · «4 44*4 99 9999
- 13 Heterologní cílový protein, který byl odštěpen z fúzního proteinu, může být izolován metodami purifikace proteinů, které jsou odborníkům známy (viz např. M.P. Deutscher, in: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academie Press lne., (1990), 309-392). Postup purifikace obvykle obsahuje kroky rozrušení buněk, pročištění média (centrifugací nebo mikrofiltrací) a pak různé kroky chromatografie, filtrace a precipitace.
Následující příklady slouží k ilustraci a předkládaného vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Exprese a in vivo štěpení fúzního proteinu Npro-C v bakteriálním hostiteli
Plazmid NPC-pET byl konstruován pro expresi Npro-C fúzního proteinu v bakteriálním hostiteli. 'Použitý expresní vektor byl vektor pETlla (F.W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Přírodní strukturní gen (z RNA genomu CSFV) pro Npro-C fúzni protein byl klonován do tohoto expresního vektoru. Strukturní gen pro fúzni protein byl připraven PCR amplifikací z virového genomu, který byl transkribován do cDNA (a klonován do vektoru). Navíc prvních 16 aminokyselin přírodní Npro-sekvence (MELNHFELLYKTSKQK) bylo nahrazeno 10 aminokyselin dlouhým oligo-histidinovým úsekem napomáhajícím purifikaci (MASHHHHHHH). Výsledný konstrukt byl *· ·*·» • · · · · » · · « · ·«· · · * « · · ·· · ·» ·· ··*
- 14 označen NPC-pET. Sekvence úseku Npro a autoproteolytické štěpné místo fúzního proteinu Npro-C kódované NPC-pET mají následující strukturu, kde štěpné místo je lokalizováno mezi aminokyselinami Cysl68 a Ser(169) :
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDC RSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIY VCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC(168)S(169)DDGAS(nukleokapsidový protein C)
V této sekvenci je prolin 17 (poloha 2 fúzního proteinu) z přírodní Npro sekvence označena kurzívou, a začátek C sekvence je označen tučně. Fúzní protein má Mr přibližně 32000 (D) , kde po autoproteolytickém štěpení úsek Npr° odpovídá asi 18000 (D) a úsek C odpovídá asi 14000 (D).
Aby bylo možné zhodnotit význam první aminokyseliny C-koncově od štěpného místa, přirozeně se vyskytující serin 169 v této poloze byl nahrazen postupně každou z 19 přirozeně se vyskytujících aminokyselin cílenou mutagenezí. Takto připravené konstrukty byly označeny NPC-pET-Ala, NPC-pET-Gly atd. Z těchto plazmidů pak byly připraveny expresní kmeny.
Kmen Escherichia coli BL21(DE3) byl užit jako Escherichia coli hostitelský kmen pro expresi fúzního proteinu Npro-C. Tento kmen měl následující genotyp:
E. coli B F dcm ompT hsdS (rbmb‘) gal λ(ΌΕ3)
Kmen byl připraven z komerčně dostupných kompetentních buněk (Stratagen). Nese lysogenní fág lambda, v jehož genomu je gen pro T7 RNA polymerázu řízený promotorem lacUV5. Produkce T7 RNA polymerázy a tudíž i cílového proteinu může být indukovaná isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG). Tento dvoufázový ·· ···· ·· ·« ·* ·· • · 9 ···· · ·» · • •4 · * ··· · • · · · · · · · · ·· · ·« MM ·· ··«· systém dovoluje vysoce specifickou a velmi vysokou expresi mnoha cílových proteinů.
Expresní kmeny BL21(DE3)[MPC-pET], BL21(DE3)[MPC-pETAla] atd. byly připraveny transformací příslušných expresních plazmidů do BL21(DE3). Transformace byla provedena podle instrukcí výrobce kompetentních buněk (Stratagen nebo Novagen). Transformační směs byla nanesena na plotny s Luriovým agarem obsahujícím 100 mg/1 ampicilinu. Transformace po inkubaci přes noc ve 37 °C poskytla několik klonů.
Středně velké kolonie s odlišitelnými okraji byly odebrány a staly se základem pro příslušné expresní kmeny. Klony byly kultivovány a pak konzervovány v kryoampulích v teplotě -80°C (hlavní buněčná banka, MCB, master cell bank). Pro běžnou denní práci byl kmen vždy nanesen na plotnu s Luriovým agarem (obsahujícím ampicilin).
Jednotlivý kmen byl použit pro inokulaci předkultury v třepané kultivační lahvi z jediné kolonie na agarové plotně. Alikvot předkultury byl užit k inokulaci hlavní kultury (10 až 200 ml v třepané kultivační lahvi) a ta pak byla kultivována až do dosažení OD600 0,5 až 1,0. Produkce fúzního proteinu pak byla indukována 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrace). Kultury byly dále kultivovány 2 až 4 hodiny, dokud nebylo dosaženo OD600 1,0 až 2,0. Kultivační teplota byla 30°C +/- 2°C, a bylo užito médium LB + 2g/l glukózy + 100mg/l ampicilin.
Vzorky byly z kultur odebrány před indukcí a v různých časových intervalech po indukci, centrifugovány a pelety byly denaturovány povařením ve vzorkovém pufru a pak analyzovány SDS-PAGE a Coomassie barvením nebo Western přenosem (Western blot). Vzorky byly odebírány za standardizovaných podmínek a ·· ···· ·» ·» ·· ·· • · · · · · r · * · · • · · ·· 4·· * ·*· · · · ··· r· · ·· ···· ·· ····
- 16 rozdíly v hustotě kultur byly kompenzovány objemem nanášecího pufru užitého k resuspendování vzorku.
Pásy, které se objevily po indukci, byl lokalizovány mírně nad 20000 (D) (odpovídá Npro) a přibližně 14000 (D) (odpovídá C) . Účinnost štěpení fúzního proteinu v každém konstruktu byla stanovena na základě intenzity pásů na gelu obarveném Coomassie modří a pak podle Western blotu. Bylo zjištěno, že většina aminokyselin byla tolerována v poloze bezprostředně sousedící C-koncově se štěpným místem (tj . na N-konci cílového proteinu), tzn. Že docházelo k velmi účinnému autoproteolytickému štěpení.
Tato data ukazují, že je možné v principu úspěšně využít autoproteolytickou aktivitu autoproteázy Npro ke specifickému štěpení rekombinantního fúzního proteinu v bakteriální hostitelské buňce.
Příklad 2
Exprese a in-vivo štěpení fúzního proteinu Npro a humánního interleukinu 6 (hIL6) pro produkci homogenního zralého hIL6
Plazmid NP6-pET byl konstruován pro expresi fúzního proteinu Npro-hIL6. Jako expresní vektor byl užit pETlla (F.W. Studier et al. , Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Nejdříve byl do expresního vektoru klonován fúzní protein sestávající z Npro a nukleokapsidového proteinu CSFV (viz Příklad 1) . Strukturní gen pro fúzní protein byl připraven PCR. To umožnilo prvních 16 aa přírodní sekvence Npr0 (MELNHFELLYKTSKQK) nahradit • · · · < · • · · · · · • · · ··♦♦ · · · « • * * · · * · · · • 4 · ··· ···* · • · · · · · ··· <·· · ·· ···· ·· ····
- 17 10 aa dlouhou oligo-histidinovou sekvencí (MASHHHHHHH) napomáhaj ící purifikaci.
Štěpné místo Spěl bylo vneseno do výsledného expresního plazmidu v místě spojení mezi Npro a nukleokapsidovým proteinem cílenou mutagenezí. To umožnilo deletovat strukturní gen pro nukleokapsidový protein z vektoru restrikcí Spěl na 5'-konci (odpovídá N-konci proteinu) a Xhol na 3'-konci (odpovídá C-konci proteinu). Odpovídající linearizovaný vektor
Npro-pETlla byl oddělen od fragmentu nukleokapsidového genu preparátivní gelovou elektroforézou. Pak bylo možné vložit strukturní gen hIL6 prostřednictvím lepivých konců Spěl a Xhol.
Byly potřebné následující přípravné práce. Strukturní gen byl amplifikován pomocí vysoce přesného systému PCR (například Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup byl proveden podle pokynů výrobce) hIL6 cDNA klonu, který lze získat z buněk C10-MJ2. Pro tento účel byly použity následující oligonukleotidy:
Oligonukleotid 1 (N-koncový):
5'- ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG -3'
Oligonukleotid 2 (C-koncový):
5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC -3'
Pomocí těchto oligonukleotidů bylo vneseno štěpné místo Spěl na 5'-konec, a štěpné místo Xhol bylo vneseno na
3'-konec. Navíc byl na 3'-konec strukturního genu vložen dvojitý stop kodon ochre (TAATAA) kvůli účinné terminaci translace. Štěpné místo Spěl na předním konci dovoluje ligaci • · · 9 • · ·· ·| • * «9
- 18 ve shodě se čtecím rámcem vektoru Npro-pETlla popsaného výše. Štěpné místo Xhol na zadním konci umožňuje přímé klonování.
Sekvence PCR fragmentu (593 bp) se strukturním genem hIL6 je zde dále uvedena (čtena ve směru od N-konce do C-konce), přičemž restrikční místo je podtrženo a první kodon hIL6 (Ala) a stop kodon jsou vyznačeny tučně:
ATAATTACTAGTTGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCACAC
AGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATC
TCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTG
GCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTC
AATGAGGAGACTTGCCTGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAG
TACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAA
GTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCA
ACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACA
ACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAA
ATGTAATAACTCGAGGATCCAATTAT
Konstrukt připravený ligací s plazmidem Npro-pETlla byl nazván NP6-pET.
Dále je uvedena Sekvence Npro-hIL6 fúzriího proteinu (347 aminokyselin, z nichž 162 aminokyselin tvoří Npro a 185 aminokyselin tvoří hIL6), kódovaného NP6-pET, přičemž sekvence hIL6 je vyznačena tučně:
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDC
RSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIY
VCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERID
KQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIIT • · • · · · • ·
GLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQ
AQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
Fúzní protein má Mr 39303,76 (D) v redukovaném stavu, a po případném odštěpení úseku Npro (redukovaný) by měl Mr 18338,34 (D) a úsek hIL6 (redukovaný) by měl 20983,63 (D) . Npro obsahuje šest cysteinů a hIL6 čtyři. Je pravděpodobné, že v bakteriální cytoplazmě jsou tyto cysteiny většinou v redukované formě. V průběhu dalšího opracování dochází pravděpodobně alespoň k částečnému vytvoření disulfidických můstků. Je třeba očekávat, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo části Npr0) je většinou štěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní hostiteli, redukovalo Mr přibližně o 131 (D) na 39172,76 (D) protein) a 18,207,13 (D) (Npro) .
Hostitelský kmen Escherichia coli pro expresi fúzního proteinu Npro-hIL6 je Escherichia coli BL21(DE3) (viz Příklad 1) ·
Expresní kmen BL21(DE3)[MP6-pET] byl připraven transformací expresního plazmidu MP6-pET popsaného výše do BL21(DE3), jak bylo popsáno v příkladu 1.
Kmen BL21(DE3)[MP6-pET] byl inokulován z jediné kolonie na agarovou plotnu, která pak byla užita k inokulaci předkultur do L média (Luria Broth) obsahujícího 100 mg/1 ampicilinu (200 ml v 1 1 kultivační lahvi s míchacími přepážkami). Předkultura byla třepána při 250 rpm a 30°C po 14 hodin až dosáhla OD600 přibližně 1,0. 10 ml alikvoty předkultury byly užity k inokulaci hlavní kultury (330 ml Luria Broth vil kultivační lahvi s míchacími přepážkami) (3% inokulum). Hlavní kultury byly udržovány na 30°C (250 rpm) do dosažení OD600 0,8 , a pak což by (fúzní * φ • · · φ • t> φ φ φ φ • * φ φ · φ φ φ 4 · ΦΦ· · · · · φ • φ · ΦΦ· Φ··· · Φ 4 · · · · Φφφ
Φ· Φ ΦΦ φφφφ φφ φφ·
- 20 byla produkce fúzního proteinu indukována 0,5 nebo 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrace). Kultury byly dále kultivovány při 30°C a 250 rpm po 3 hodiny, OD600 dosáhla přibližně 1,0 až 2,0.
Pak byly kultury přeneseny do sterilních 500 ml centrifugačních kyvet a centrifugovány 30 minut při 10000 g. Supernatant byl zcela odstraněn a pelety byly zamraženy v -80°C až do dalšího zpracování.
Výskyt nových proteinových pásů v úplném lyzátu byl snadno detekován Coomassie barvením po provedení SDS-PAGE. Pásy v lyzátu BL21(DE3)[MP6-pET] odpovídaly zjevné molekulové hmotnosti přibližně 19000 (D) , 21000 (D) a 4000 (D) . Analýzy exprese užitím protilátek anti-hIL6 nutně potvrdila výsledky získané Coomassie barvením.
Pro optimalizaci Npr°-hIL6 štěpení byla provedena indukce při různých teplotách a koncentracích IPTG a výsledné produkty byly analyzovány barvením gelů a Western blotem. Téměř úplné štěpení Npro-IL6 bylo pozorováno při kultivaci v teplotě 22°C.
Tento experiment také ukázal, že heterologní proteiny mohou být fúzovány k C-konci Npro v bakteriálním expresním systému, kde dochází k velmi účinnému štěpení. Změna N-koncové aminokyseliny následného proteinu (alanin místo šeřinu) také nemá žádný nepříznivý účinek. Tento systém podle předkládaného vynálezu je tudíž vhodný k produkci rekombinantních proteinů s homogenním autentickým N-koncem, zejména v heterologním expresním systému jako je např. bakteriální expresní systém, bez nutnosti dalších kroků zpracování.
• · · * • · · 9 · · * « « · •f· · W 9·· • 4 · 9 · · · 9 * · • 4 · «·· 9 « ·
9· 9 · · 9 9 99 9 · 99
- 21 Příklad 3
Exprese a in-vivo štěpení fúzního proteinu sestávajícího z Npro a humánního interferonu a2B (IFNa2B) pro produkci homogenního zralého IFNa2B
Postup klonování IFNa2B až po přípravu vektoru NPI-pET odpovídal postupu užitému pro hIL6 v příkladu 2. Strukturní gen byl amplifikován PCR s vysokou přesností (například Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup podle pokynů výrobce). Jako templát byl použit IFNa2B-cDNA klon, který byl připraven z humánních leukocytů standardním odborníkům známým postupem. Alternativní možností by bylo povést syntézu úplného genu. Sekvenci strukturního genu je možné získat v elektronické formě z databáze Genbank pod přístupovým číslem V00548. Pro amplifikaci byly užity následující oligonukleotidy:
Oligonukleotid 1 (N-koncový):
5'- ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC -3'
Oligonukleotid 2 (C-koncový):
5'-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G-3'
Sekvence PCR fragmentu (533 bp) se strukturním genem IFNa2B je uvedena níže. Štěpná místa pro restrikční enzymy jsou podtržena a první kodon IFNa2B (Cys) a stop-kodon jsou vyznačeny tučně:
ATAATTACTAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATG
CTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGA ·· · · ·· · · ·· ·· ·· • * « * · · φ » » · « ••f «·· « · « • Φ * ·· ···· ·· ····
- 22 TTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAG
ATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACC
CTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATA
CAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAA
TACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTT
GTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGT
AAGGAATAATAACTCGAGGATCCAATTAT
Konstrukt připravený ligací k plazmidu Npro-pETlla byl označen NPI-pET.
Sekvence fúzniho proteinu Npro-IFNa2B (celkem 327 aa, z toho 162 aa je Npro a 165 aa je IFNa2B) kódovaného NPI-pET je uvedena dále, přičemž sekvence IFNa2B je vyznačena tučně (znázorněna ve směru od N-konce k C-konci):
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDC RSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIY VCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLF SCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQ QLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSL STNLQESLRSKE
Fúzní protein má Mr 37591,44 (D) v redukovaném stavu a po možném rozštěpení by Npro část (redukovaná) měla Mr 18338,34 (D) a IFNa2B část (redukovaná) by měla 19271,09 (D) . Npr0 má šest cysteinových zbytků a IFNa2B má čtyři. Je pravděpodobné, že tyto cysteinové zbytky jsou v bakteriální cytoplazmě z větší části v redukovaném stavu. V průběhu následného opracování pravděpodobně dochází k alespoň částečnému vytváření disulfidických můstků. Je nutno počítat s tím, že N-koncový ♦ · • ·
- 23 methionin ve fúzním proteinu (nebo v části Npro) je většinou odštěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní hostiteli, což by snížilo Mr o 131 (D) na 37460,23 (D) (fúzní protein) a 18207,13 (D) (Npro) .
Hostitelský kmen Escherichia coli pro expresi fúzního proteinu Npro-IFNcc2B byl Escherichia coli BL21(DE3) (viz Příklad 1) ·
Expresní kmen BL21(DE3)[NPI-pET] byl připraven transformací expresního plazmidu NPI-pET popsaného výše do BL21(DE3), jak bylo popsáno v příkladu 1.
Kmen BL21(DE3)[NPI-pET] byl inokulován z jediné kolonie na agarovou plotnu, která pak byla užita k inokulaci předkultur do L média (Luria Broth) obsahujícího 100 mg/1 ampicilinu (200 ml v 1 1 kultivační lahvi s míchacími přepážkami). Předkultura byla třepána při 250 rpm a 3 0°C po 14 hodin až dosáhla OD600 přibližně 1,0. 10 ml alikvoty předkultury byly užity k inokulaci hlavní kultury (330 ml Luria Broth vil kultivační lahvi s míchacími přepážkami) (3% inokulum). Hlavní kultury byly udržovány na 30°C (250 rpm) do dosažení ODeoo 0,8, a pak byla produkce fúzního proteinu indukována 0,5 nebo 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrace). Kultury byly dále kultivovány při 30°C a 250 rpm po 3 hodiny, OD600 dosáhla přibližně 1,0 až 2,0.
Pak byly kultury přeneseny do sterilních 500 ml centrifugačních kyvet a centrifugovány 30 minut při 10000 g. Supernatant byl zcela odstraněn a pelety byly zamraženy v -80°C až do dalšího zpracování.
Výskyt nových proteinových pásů v úplném lyzátu byl snadno detekován Coomassie barvením po provedení SDS-PAGE. Pásy v lyzátu BL21(DE3)[MP6-pET] odpovídaly zjevné molekulové » · φ <Φ 9 • · φφ ► * φ *
ΦΦΦ φ φ φ • · φ··Φ ΦΦ ΦΦΦΦ
- 24 hmotnosti přibližně 38000 (D) a 19000 (D) . Pás IFNa2B nebylo možné technikou SDS-PAGE oddělit od pásu Npro.
Analýzy exprese užitím protilátek anti-IFNa2B potvrdily přítomnost vyštěpeného pásu IFNa2B.
Pro optimalizaci štěpení Npro- IFNa2B byla také v tomto případě provedena indukce při různých teplotách a koncentracích IPTG a výsledné produkty byly opět analyzovány barvením gelů a Western blotem. Bylo také zjištěno, že k úplnému štěpení došlo při snížené teplotě (22 až 23 °C).
Claims (11)
1. Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy Npro z pestiviru, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidu takovým způsobem, že druhý polypeptid může být vyštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, přičemž druhý polypeptid je heterologní polypeptid.
4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde první polypeptid obsahuje následující sekvenci aminokyselin:
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), nebo aminokyselinovou sekvenci, která je derivátem uvedené sekvence a má autoproteolytickou aktivitu.
5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Glu22 až Cysl68 z autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid navíc má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je navázán přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Prol7 až Cysl68 z autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid navíc má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je navázán přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
7. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároku 1 to 6, přičemž molekula nukleové kyseliny je molekula DNA.
8. Expresní vektor kompatibilní s předem určenými bakteriálními hostitelskými buňkami, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků' 1 až 7 a alespoň jednu sekvenci řídící expresi.
9. Expresní vektor podle nároku 8, kde bakteriální hostitelské buňky jsou buňky E. coli.
10. Expresní vektor podle nároku 8 nebo 9, přičemž expresní vektor je plazmid.
• · * ♦ · * • · · • · · • » ····
- 27
11. Bakteriální hostitelská buňka obsahující vektor podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10.
12. Bakteriální hostitelská buňka podle nároku 11, přičemž bakteriální hostitelská buňka je buňka E. coli.
13. Způsob produkce požadovaného heterologního polypeptidu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy (I) kultivují se bakteriální hostitelské buňky podle nároku 11 nebo 12 za podmínek, které vedou k expresi fúzního proteinu a k autoproteolytickému vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu v hostitelské buňce autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, a (II) izoluje se vyštěpený heterologní polypeptid.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT136899 | 1999-08-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2002480A3 true CZ2002480A3 (cs) | 2002-05-15 |
| CZ303341B6 CZ303341B6 (cs) | 2012-08-08 |
Family
ID=3512383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20020480A CZ303341B6 (cs) | 1999-08-09 | 2000-08-07 | Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje polypeptid s autoproteolytickou aktivitou |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7378512B2 (cs) |
| EP (1) | EP1200603B1 (cs) |
| JP (1) | JP5480458B2 (cs) |
| KR (1) | KR100735791B1 (cs) |
| CN (1) | CN1230542C (cs) |
| AU (1) | AU775681B2 (cs) |
| CA (1) | CA2380302C (cs) |
| CZ (1) | CZ303341B6 (cs) |
| HK (1) | HK1047127B (cs) |
| HU (1) | HU230117B1 (cs) |
| IL (2) | IL147411A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02001425A (cs) |
| NO (1) | NO329246B1 (cs) |
| PL (1) | PL203708B1 (cs) |
| SK (1) | SK288290B6 (cs) |
| TR (1) | TR200200048T2 (cs) |
| WO (1) | WO2001011056A1 (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2823220B1 (fr) | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
| CA2467397A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-06-05 | Replikun Biotech Pty Ltd | Flavivirus vaccine delivery system |
| AU2011253661B2 (en) * | 2005-04-26 | 2013-06-13 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein |
| WO2006113959A2 (en) * | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Sandoz Ag | Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein |
| GB0508435D0 (en) * | 2005-04-26 | 2005-06-01 | Sandoz Ag | Organic compounds |
| GB0508434D0 (en) * | 2005-04-26 | 2005-06-01 | Sandoz Ag | Organic compounds |
| US20100137563A1 (en) | 2008-12-03 | 2010-06-03 | Northwestern University | Cysteine Protease Autoprocessing of Fusion Proteins |
| EP2684951A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-15 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein of interest |
| EP2746390A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein of interest |
| EP2746391A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein of interest |
| UY35874A (es) | 2013-12-12 | 2015-07-31 | Novartis Ag | Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas |
| CN117362401A (zh) * | 2023-09-27 | 2024-01-09 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种牛病毒性腹泻病毒n蛋白及其作为自我切割蛋白的应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| DE3885431D1 (de) * | 1987-12-23 | 1993-12-09 | Boehringer Ingelheim Int | Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2. |
| US6077694A (en) * | 1990-09-21 | 2000-06-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins |
| DE69836075T2 (de) * | 1997-04-25 | 2007-06-06 | SemBioSys Genetics, Inc., Calgary | Verfahren zur spaltung von fusionproteinen |
| AU9260598A (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Zymogenic protease precursors that can be autocatalytically activated and their use |
| WO1999010483A2 (de) * | 1997-08-22 | 1999-03-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Autokatalytisch aktivierbare vorstufen von proteasen und deren verwendung |
| KR20020026366A (ko) * | 1999-08-09 | 2002-04-09 | 한스 루돌프 하우스, 헨리에데 부르너 | 단백질의 생산 |
-
2000
- 2000-08-07 SK SK187-2002A patent/SK288290B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-08-07 JP JP2001515841A patent/JP5480458B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 KR KR1020027001667A patent/KR100735791B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 HK HK02106953.0A patent/HK1047127B/en not_active IP Right Cessation
- 2000-08-07 EP EP00954596.3A patent/EP1200603B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 IL IL14741100A patent/IL147411A0/xx unknown
- 2000-08-07 CA CA2380302A patent/CA2380302C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 MX MXPA02001425A patent/MXPA02001425A/es active IP Right Grant
- 2000-08-07 TR TR2002/00048T patent/TR200200048T2/xx unknown
- 2000-08-07 WO PCT/EP2000/007642 patent/WO2001011056A1/en not_active Ceased
- 2000-08-07 CN CNB008110719A patent/CN1230542C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 AU AU66998/00A patent/AU775681B2/en not_active Expired
- 2000-08-07 PL PL353090A patent/PL203708B1/pl unknown
- 2000-08-07 CZ CZ20020480A patent/CZ303341B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-08-07 HU HU0203051A patent/HU230117B1/hu unknown
-
2001
- 2001-12-31 IL IL147411A patent/IL147411A/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-01-31 NO NO20020507A patent/NO329246B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-23 US US10/763,619 patent/US7378512B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL147411A (en) | 2013-12-31 |
| CZ303341B6 (cs) | 2012-08-08 |
| JP5480458B2 (ja) | 2014-04-23 |
| JP2003506092A (ja) | 2003-02-18 |
| HU230117B1 (hu) | 2015-08-28 |
| HUP0203051A2 (hu) | 2002-12-28 |
| AU6699800A (en) | 2001-03-05 |
| NO20020507L (no) | 2002-04-05 |
| EP1200603B1 (en) | 2014-12-24 |
| MXPA02001425A (es) | 2002-08-12 |
| CN1230542C (zh) | 2005-12-07 |
| EP1200603A1 (en) | 2002-05-02 |
| US20040215008A1 (en) | 2004-10-28 |
| NO329246B1 (no) | 2010-09-20 |
| AU775681B2 (en) | 2004-08-12 |
| CA2380302A1 (en) | 2001-02-15 |
| NO20020507D0 (no) | 2002-01-31 |
| CN1367837A (zh) | 2002-09-04 |
| WO2001011056A1 (en) | 2001-02-15 |
| HUP0203051A3 (en) | 2003-12-29 |
| KR100735791B1 (ko) | 2007-07-06 |
| TR200200048T2 (tr) | 2002-04-22 |
| PL203708B1 (pl) | 2009-11-30 |
| SK1872002A3 (en) | 2002-07-02 |
| PL353090A1 (en) | 2003-10-06 |
| KR20020021175A (ko) | 2002-03-18 |
| SK288290B6 (sk) | 2015-07-01 |
| CA2380302C (en) | 2013-02-26 |
| US7378512B2 (en) | 2008-05-27 |
| IL147411A0 (en) | 2002-08-14 |
| HK1047127B (en) | 2015-08-21 |
| HK1047127A1 (en) | 2003-02-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0539530B1 (en) | Purification directed cloning of peptides | |
| EP0682709A1 (en) | Fusion proteins including a cleavage site recognized by a plant virus protease | |
| JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| CZ2002480A3 (cs) | Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje polypeptid s autoproteolytickou aktivitou | |
| AU775662B2 (en) | Production of proteins | |
| AU740816B2 (en) | Fusion proteins comprising sequence derived from bovine IF1 ATPase inhibitor protein | |
| KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20200807 |