CZ2002837A3 - Molekuly protilátky, které jsou specifické pro humánní nádorový nekrotický faktor alfa a jejich pouľití - Google Patents

Molekuly protilátky, které jsou specifické pro humánní nádorový nekrotický faktor alfa a jejich pouľití Download PDF

Info

Publication number
CZ2002837A3
CZ2002837A3 CZ2002837A CZ2002837A CZ2002837A3 CZ 2002837 A3 CZ2002837 A3 CZ 2002837A3 CZ 2002837 A CZ2002837 A CZ 2002837A CZ 2002837 A CZ2002837 A CZ 2002837A CZ 2002837 A3 CZ2002837 A3 CZ 2002837A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
antibody molecule
heavy chain
human
set forth
Prior art date
Application number
CZ2002837A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ300737B6 (cs
Inventor
Diljeet Singh Athwal
Derek Thomas Brown
Andrew Neil Charles Weir
Andrew George Popplewell
Andrew Paul Chapman
David John King
Original Assignee
Celltech R & D Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ2002837(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Celltech R & D Limited filed Critical Celltech R & D Limited
Publication of CZ2002837A3 publication Critical patent/CZ2002837A3/cs
Publication of CZ300737B6 publication Critical patent/CZ300737B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Description

• * φ Φ Φm · · ····
Molekuly protilátky, které jsou specifické pro humánní nádorový nekrotický faktor alfa a jejich použití
Oblast techniky Předkládaný vynález se týká molekul protilátky, které jsou specifické pro antigenní determinanty nádorového nekrotického faktoru alfa (TNFa, „tumour necrosis factor alpha") . Předkládaný vynález se také týká terapeutického použití protilátkových molekul a způsobů výroby protilátkových molekul.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká protilátkových molekul. V molekule protilátky jsou dva těžké řetězce a dva lehké řetězce. Každý těžký řetězec a každý lehký řetězec má ve svém N-koncovém úseku variabilní doménu. Každá variabilní doména je složena ze čtyř rámcových úseků (FR, „framework region"), které jsou střídány se třemi úseky určujícími komplementaritu (CDR, „complementarity determining region"). Zbytky ve variabilní doméně jsou dohodou číslovány podle systému navrženého autory Kabat a kol. Tento systém je uveden v práci autorů Kabat a kol., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIEI, USA (dále „Kabat a kol. (výše)"). Tento systém číslování byl také použit v předkládaném popisu, pokud není uvedeno jinak.
Kabatovo označení zbytků neodpovídá vždy přímo lineárnímu číslování aminokyselinových zbytků. Aktuální lineární aminokyselinová sekvence může obsahovat méně aminokyselin nebo další aminokyseliny, než v přesném Kabátově číslování, což odpovídá zkrácení strukturální složky nebo vložení (inzerci) do strukturální složky, ať už do úseku rámce nebo do CDR, • · ··· ♦ • · ·Φ 9 9 9 · · · · * · # ····· 9 0 Φ 0 9 ♦ 9 0 9 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 0 9 9 9 9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 · * 99 9 0 2 základní struktury variabilní domény. Správné Kabatovo číslování zbytků může být pro danou protilátku zjištěno porovnáním homologie zbytků v sekvenci protilátky se „standardní,, sekvencí číslovanou dle Kabata. CDR variabilních domén těžkého řetězce jsou lokalizovány ve zbytcích 31 až 35 (CDRH1) , zbytcích 50 až 65 (CDRH2) a zbytcích 95 až 102 (CDRH3) podle Kabatova číslování. CDR variabilních domén lehkého řetězce jsou lokalizovány ve zbytcích 24 až 34 (CDRL1), zbytcích 50 až 56 (CDRL2) a zbytcích 89 až 97 (CDRL3) podle Kabatova číslování.
Konstrukce CDR-roubovaných protilátek je popsána v evropské patentové přihlášce EP-A-0239400, která popisuje postup, kterým jsou CDR myší monoklonální protilátky jsou roubovány do úseků rámce variabilních domén humánního imunoglobulinu místně cílenou mutagenezí s použitím dlouhých oligonukleotidů. CDR určují specifičnost vazby antigenu protilátkami a jsou to relativně krátké peptidové sekvence nesené v úsecích rámce variabilních domén.
Rané práce týkající se humanizace monoklonálních protilátek prostřednictvím CDR-roubování byly prováděny na monoklonálních protilátkách rozpoznávajících syntetické antigeny, jako je například NP. Ale byly popsány příklady, ve kterých myš monoklonální protilátka rozpoznávající lysozym a monoklonální protilátka laboratorního potkana rozpoznávající antigen na humánních T lymfocytech byly humanizovány pomocí CDR-roubování, a to autory Verhoeyen a kol. (Science, 239, 1534-1536, 1988) a Riechmann a kol. (Nátuře, 332, 323-324, 1988), v daném pořadí.
Riechmann a kol., zjistili, že transfer samotných CDR (jak definovány Kabatem (Kabat a kol. (výše) a Wu a kol., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) nebyl postačující pro vznik uspokojivé aktivity vázající antigen u CDR-roubovaného produ-ktu. Bylo zjištěno, že musí být změněn velký počet zbytků • · ···· ·* ♦ ·· * · « ···# « · ♦ ♦· « « « « « » • ·· · « <9 · »9« · ♦ »♦·· » · · I* t 0 · ·« ·♦ ·♦ t* ··♦· ο
J rámce tak, aby odpovídaly zbytkům úseku rámce dárce. Navrhovaná kritéria pro výběr, které zbytky rámce potřebují být změněny, jsou popsána v mezinárodní patentové přihlášce WO 90/07861.
Byl publikován velký počet přehledů pojednávajících o CDR-roubovan protilátkách, včetně Vaughan a kol. (Nátuře Biotechnology, 16, 535-539, 1998). TNFa je pro-zánětlivý cytokin, který je uvolňován buňkami imunitního systému a interaguje s nimi. Tedy, TNFa je uvolňován makrofágy, které byly aktivovány lipopolysacharidy (LPS) z gram-negativních bakterií. Ukazuje se, že TNFa je endogenní mediátor ústředního významu zapojený do rozvoje a patogeneze endotoxického šoku spojeného s bakteriální sepsí. Bylo také zjištěno, že se zvyšuje počet receptorů pro TNFa u velkého počtu nemocí člověka, včetně chronických nemocí, jako je například revmatoidní artritida, Crohnova nemoc, ulcerativní kolitida a sclerosis multiplex. Myši transgenní pro humánní TNFa produkují konstitutivně vysokou hladinu TNFa a vyvíjí se u nich spontánní, destruktivní polyarthritida připomínající revmatoidní arthritidu (Kaffer a kol., EMBO J., 10, 4025-4031, 1991). TNFa je tudíž nazýván pro-zánětlivý cytokin.
Ve stavu techniky byl popsány monoklonální protilátky proti TNFa. Meager a kol., (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) popsali myší monoklonální protilátky proti rekombinantnímu TNFa. Fendly a kol., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) popsali použití myších monoklonálních protilátek proti rekombinantnímu TNFa při definování neutralizaci epitopů na TNF. Shimamoto a kol., (Imunology Letters, 17, 311-318, 1988) popsali použití myších monoklonálních protilátek proti TNFy a jejich použití při prevenci endotoxického šoku u myší. Dále, v mezinárodní patentové přihlášce WO 92/11383, jsou popsány rekombinantní 4 • · ·# • · c · ··· f · « # · · ♦ • · ♦·* · * · Λ * · • · « · · · · · « · · * « · · · ««·· i»*· •é »« 9* ♦· ·· ···· protilátky, včetně CDR-roubovaných protilátek, specifických pro TNFa,. Rankin a kol., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) popsali použiti těchto CDR-roubovaných protilátek v léčeni revmatoidní artritidy. US-A-5 919 452 popisuje anti-TNF chimérické protilátky a jejich použiti v léčeni patologických stavů spojených s výskytem TNF.
Protilátky k TNFa byly navrženy pro profylaxi a léčeni endotoxického šoku (Beutler a kol., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer a kol., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) a Wherry a kol., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) pojednávají terapeutický potenciál anti-TNFa protilátek v léčení septického šoku. Použití anti-TNFa protilátek v léčení septického šoku je také projednáváno autory Kirschenbaum a kol., (Critical Care Medicine·, 26, 1625-1626, 1998). Arthritida vyvolaná kolagenem může být účinně léčena použitím anti-TNFa monoklonálních protilátek (Wiliam a kol. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)). U pacientů trpících revmatoidní artritidou byly zjištěny zvýšené hladiny TNFa jak v synoviální tekutině, tak v periferní krvi. Když jsou pacientovi trpícímu revmatoidní artritidou podávána agens blokující TNFa, zmírňují zánět, zlepšují symptomy a oddalují poškození kloubu (McKown a kol. (Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).
Použití anti-TNFa protilátek v léčení revmatoidní arthritidy a Crohnovy nemoci je diskutováno v práci autorů Feldman a kol., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini a kol., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) a v Feldman a kol., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Protilátky k TNFa použité v těchto léčebných postupech jsou obecně chimérické protilátky, jako například ty popsané v US-A-5 919 452. 5 • o Φ » « · ··* * • Φ 9 9 9 0 Φ φ 9 Φ · ΦΦ 99
«· 9 Φ Φ Φ · 9 9 Φ Φ Φ Φ 9 V současnosti jsou schváleny dva produkty blokující TNFa pro léčení revmatoidní artritidy. První, nazvaný etanercept, je dodáván na trh firmou Immunex Corporation jako Enbrel™. Je to rekombinantní fúzní protein obsahující dva p75 rozpustné domény TNF-receptoru spojené k Fc části humánního imunoglobulinu. Druhý, nazvaný infliximab, je dodáván na trh firmou Centocor Corporation Remicade™. Je to chimérická protilátka mající myší anti-TNFa variabilní domény a humánní IgGl konstantní domény.
Rekombinantní anti-TNFa protilátkové molekuly podle stavu techniky obecně mají redukovanou afinitu pro TNFa ve srovnání s protilátkami, ze kterých variabilní úseky nebo CDR pocházejí, obecně musí být tvořeny v savčích buňkách a jsou pro výrobu nákladné. anti-TNFa protilátky podle stavu techniky jsou popsány v práci autorů Stefen a kol., (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 a GB-A-2 297 145.
Existuje trvalá potřeba protilátkových molekul k léčení chronických zánětlivých onemocnění, které mohou být používány opakovaně a vyrábí se snadno a účinně. Existuje také potřeba protilátkových molekul, které mají vysokou afinitu pro TNFa a pro člověka jsou málo imunogenní.
Podstata vynálezu V prvním aspektu předkládaný vynález poskytuje protilátkovou molekulu, která je specifická pro TNFa, obsahující těžký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak definováno Rabatem a kol., (výše)) mající sekvenci označenou jako H1 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 1) pro CDRH1, H2' na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 2) nebo H2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 7) pro CDRH2 nebo H3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 3) pro CDRH3. «4 4 4 « t *> ♦ 4 · ♦ 4 4 4 4 4 4 44 4444 4 4 4 * 4 · · · * · • · 4 4 4 · ( 4 444 · · 4 • 4 I « · 4 · 4 4 4 4 4444 •4 4¾ 4# % 4 6
Protilátková molekula podle prvního aspektu předkládaného vynálezu obsahuje alespoň jeden CDR vybraný z Hl, H2' nebo H2 a H3 (SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 7 a SEKV. ID. Č. 3) pro variabilní doménu těžkého řetězce. Výhodně, protilátková molekula obsahuje alespoň dva a výhodněji všechny tři CDR ve variabilní doméně těžkého řetězce.
Ve druhém aspektu předkládaného vynálezu je poskytnuta protilátková molekula specifická pro humánní TNFa, obsahující lehký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak definováno Rabatem a kol., (výše)) mající sekvenci označenou jako Ll na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 4) pro CDRLl, L2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. S) pro CDRL2 nebo L3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 6) pro CDRL3.
Protilátková molekula podle druhého aspektu předkládaného vynálezu obsahuje alespoň jeden CDR vybraný z Ll, L2 a L3 (SEKV. ID. Č. 4 až SEKV. ID. Č. 6) pro variabilní doménu lehkého řetězce. Výhodně, protilátková molekula obsahuje alespoň dva a výhodněji všechny tři CDR ve variabilní doméně lehkého řetězce.
Protilátkové molekuly podle prvního a druhého aspektu podle předkládaného vynálezu výhodně mají komplementární lehký řetězec nebo komplementární těžký řetězec, v daném pořadí.
Protilátková molekula podle prvního nebo druhého aspektu předkládaného vynálezu obsahuje výhodně těžký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak definováno Kabatem a kol., (výše)) mající sekvenci označenou jako Hl na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 1) pro CDRH1, H2' nebo H2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 7) pro CDRH2 nebo H3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 3) pro CDRH3 a lehký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak definováno Kabatem a kol., (výše)) mající sekvenci označenou jako Ll na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 4) pro 7 4« ·♦·♦ • * 7 4« ·♦·♦ • * • » • · »* • · t * 4 · · #·· · · 4 4«· ··*« » · · w 44 *♦ 4· ·· ···* CDRLl, L2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 5) pro CDRL2 nebo L3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 6) pro CDRL3. CDR označené v SEKV. ID. Č. 1 a 3 až 7 a na obrázku 3, uvedené výše, pocházejí z myší monoklonální protilátky hTNF40. Ale SEKV. ID. Č. 2 se skládá z hybridního CDR. Hybridní CDR obsahuje část těžkého řetězce CDR2 z myší monoklonální protilátky hTNF40 (SEKV. ID. Č. 7) a část těžkého řetězce CDR2 z humánní skupiny 3 zárodečné linie sekvence úseku V.
Kompletní sekvence variabilních domén myší hTNF40 protilátky jsou ukázány na obrázku 6 (lehký řetězec) (SEKV. ID. Č. 99) a obrázku 7 (těžký řetězec) (SEKV. ID. Č. 100) . Myší protilátka je nazývána níže „dárcovská protilátka,,.
První výhodné provedení prvního nebo druhého aspektu předkládaného vynálezu je myší monoklonální protilátka hTNF40 mající sekvence variabilní domény lehkého a těžkého řetězce ukázané na obrázku 6 (SEKV. ID. Č. 99) a obrázku 7 (SEKV. ID. Č. 100), v daném pořadí. Konstantní úsek lehkého řetězce hTNF40 je kappa a konstantní úsek těžkého řetězce je IgG2a. V druhém výhodném provedení je protilátka podle prvního a druhého aspektu předkládaného vynálezu chimérická myší/humánní protilátková molekula, nazývaná v tomto textu chimérická hTNF40 protilátková molekula. Chimérická protilátková molekula obsahuje variabilní domény myší monoklonální protilátky hTNF40 (SEKV. ID. Č. 99 a 100) a humánní konstantní domény. Výhodně, chimérická hTNF40 protilátková molekula obsahuje humánní C kappa doménu (Hieter a kol., Cell, 22, 197-207, 1980, Genebank přístupové číslo J00241) v lehkém řetězci a humánní gama 4 domény (Flanagan a kol., Nátuře, 300, 709-713, 1982) v těžkém řetězci.
Ve třetím výhodném provedení je protilátka podle prvního a druhého aspektu předkládaného vynálezu CDR-roubovaná protilátková molekula. Termín „CDR-roubovaná protilátková molekula,,, použitý v tomto textu, se týká protilátková 8
··«· • « « · ♦ • » • * · ·· ♦ # ♦ • é ·« **·· molekuly, kde těžký a/nebo lehký řetězec obsahuji jeden nebo více CDR (včetně, je-li to žádoucí, hybridního CDR) z donorové (dárcovské) protilátky (např. myší monoklonální protilátky) naroubované na variabilní úsek rámce těžkého a/nebo lehkého řetězce akceptorové (příjemcovské) protilátky (např. humánní protilátky). Výhodně má tato CDR-roubovaná protilátka variabilní doménu obsahující úseky rámce humánního příjemce, a také jeden nebo více dárcovských CDR uvedených výše.
Když CDR jsou roubovány, může být použit každá vhodná sekvence příjemce variabilního úseku rámce s ohledem na třídu/typ dárcovské protilátky, ze které CDR pocházejí, včetně úseků rámce myši, primáta a člověka. Příklady humánních rámců (rámcových úseků protilátky), které mohou být použity v předkládaném vynálezu, jsou KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY a POM (Kabat a kol. (výše)) . Například, KOL a NEWM mohou být použity pro těžký řetězec, REI může být použit pro lehký řetězec a EU, LAY a POM mohou být použity pro oba těžký i lehký řetězec. Výhodné úseky rámce pro lehký řetězec jsou humánní skupina 1 úseků rámce ukázaná na obrázku 1 (SEKV. ID. Č. 83, 85, 87 a 89) . Výhodné úseky rámce pro těžký řetězec jsou humánní skupina 1 a skupina 3 úseků rámce ukázané na obrázku 2 (SEKV. ID. Č. 91, 93, 95 a 97 a SEKV. ID. Č. 106, 107, 108 a 109), v daném pořadí. U CDR-roubovaných protilátek podle předkládaného vynálezu je výhodné použít jako příjemcovskou protilátku takovou, která má řetězce, které jsou homologní k řetězcům dárcovské protilátky. Příjemcovské těžké a lehké řetězce nemusí nezbytně pocházet ze stejné protilátky a mohou, je-li žádoucí, obsahovat složené řetězce mající úseky rámce pocházející z odlišných řetězců. V CDR-roubovaných protilátkách podle předkládaného vynálezu úseky rámce nemusí také mít přesně tutéž sekvenci, 9 • · « · ♦ • · · *· ··· » • · * · * ·· * · 1 * · «* * · · C * · ···· jako je sekvence příjemcovské protilátky. Například, neobvyklé zbytky mohou být změněny na častěji se vyskytující zbytky pro danou třídu nebo typ příjemcovského řetězce. Alternativně, vybrané zbytky v příjemcovských úsecích rámce mohou být změněny tak, že odpovídají zbytku nalezenému ve stejné poloze v dárcovské protilátce. Takové změny by měly být udržovány na minimu nezbytném k obnovení afinity dárcovské protilátky. Protokol pro selekci zbytků v příjemcovských úsecích rámce, které mohou potřebovat změnu, je uveden ve WO 91/09967. Výhodně, v CDR-roubované protilátkové molekule podle předkládaného vynálezu, jestliže příjemcovský těžký řetězec má úseky rámce z humánní skupiny 1 (ukázáno na obrázku 2) (SEKV. ID. Č. 91, 93, 95 a 97), pak příjemcovské úseky rámce těžkého řetězce obsahují, navíc k jednomu nebo více dárcovským CDR, dárcovské zbytky v polohách 28, 69 a 71 (podle Kabat a kol. (výše)).
Alternativně, jestliže příjemcovský těžký řetězec má úseky rámce ze skupin 1, pak příjemcovské úseky rámce těžkého řetězce obsahují, navíc k jednomu nebo více dárcovským CDR, dárcovské zbytky v polohách 28, 38, 46, 67, 69 a 71 (podle Kabat a kol. (výše). Výhodně, v CDR-roubované protilátkové molekule podle předkládaného vynálezu, jestliže příjemcovský těžký řetězec má úseky rámce humánní skupiny 3 (ukázána na obrázku 2) (SEKV. ID. Č. 106, 107, 108 a 109), pak příjemcovské úseky rámce těžkého řetězce obsahují, navíc k jednomu nebo více dárcovským CDR, dárcovské zbytky v polohách 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 a 78 (podle Kabat a kol. (výše)). Výhodně, v CDR-roubované protilátkové molekule podle předkládaného vynálezu, jestliže příjemcovský lehký řetězec má úseky rámce humánní skupiny 1 (ukázána na obrázku 1) (SEKV. ID. Č. 83, 85, 87 a 89), pak příjemcovské úseky rámce lehkého «+ 9« 4 4 4·4 4 ·9 ·· 9 « · · <t · » « « t ··««· 4 · 4 · t * • 4 4 ě Λ 4 4 ··· '« * ···· 4 4 4 0 · · · •4 44 44 44 |· »··» 10 řetězce obsahují dárcovské zbytky v polohách 46 a 60 (podle Kabat a kol. (výše)). Dárcovské zbytky jsou zbytky z dárcovské protilátky, tj. protilátky, ze které původně pocházejí CDR.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat: kompletní protilátkovou molekulu, mající kompletní těžké a lehké řetězce, její fragment, jako například Fab, modifikovaný Fab, Fab', F(ab')2 nebo Fv fragment, monomer nebo dimer lehkého řetězce nebo těžkého řetězce, protilátka s jedním řetězcem, např. jednořetězcová Fv, ve které jsou variabilní domény těžkého a lehkého řetězce spojeny peptidovou spojkou. Podobně, variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce mohou být spojeny s další protilátkovou doménou, jak je to vhodné. Výhodně protilátková molekula podle předkládaného vynálezu je Fab fragment. Výhodně Fab fragment má těžký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 111 a lehký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 113.
Aminokyselinové sekvence uvedené v SEKV. ID. Č. 111 a SEKV. ID. Č. 113 jsou výhodně kódovány nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEKV. ID. Č. 110 a SEKV. ID. Č. 112, v daném pořadí.
Alternativně je výhodné, když protilátková molekula podle předkládaného vynálezu je modifikovaný Fab fragment, kde modifikace je přidání na C-koncovou část jeho těžkého řetězce jedné nebo více aminokyselin, aby se umožnilo připojení efektorové nebo reportérové molekuly. Výhodně, další aminokyseliny tvoří modifikovaný kloubový úsek obsahující jeden nebo dva cysteinové zbytky, ke kterým může být připojena efektorová nebo reportérové molekula. Takto modifikovaný Fab fragment výhodně má těžký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 115 a lehký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 113. Aminokyselinová sekvence #t ·· ·« *··· ·· «· « * t · · · < * » » • « · ·· · t # · · · • · · » · · « ··· # « • * · · · · · # ··· ·* «· «« «» «· ···· 11 uvedená v SEKV. ID. Č. 115 je výhodně kódována nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEKV. ID. Č. 114. Výhodná efektorová skupina je molekula polymeru, která může být připojena k modifikovanému Fab fragmentu, aby se zvýšil jeho biologický poločas in vivo.
Polymerové molekuly mohou být obecně syntetické nebo přirozeně se vyskytující polymery, například volitelně substituovaný polymer polyalkylenu, polyalkenylenu nebo polyoxyalkylenu s přímým nebo rozvětveným řetězcem, nebo polysacharid s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem, např. homo- nebo heteropolysacharid.
Konkrétní volitelné substituenty, které mohou být přítomny na výše uvedených syntetických polymerech, zahrnují jednu nebo více hydroxyskupin, methylových skupin nebo methoxyskupin. Konkrétní příklady syntetických polymerů zahrnují volitelně substituovaný póly(ethylenglykol), póly(propylenglykol), póly(vinylalkohol) nebo jejich deriváty s přímými nebo rozvětvenými řetězci, zejména volitelně substituovyný póly(ethylenglykol), jako je například methoxypoly(ethylenglykol) nebo jejich deriváty. Konkrétní přirozeně se vyskytující polymery zahrnují laktózu, amylózu, dextran, glykogen nebo jejich deriváty. Termín „deriváty", jak je použit v tomto textu, zahrnuje reaktivní deriváty, například thiol-selektivní reaktivní skupiny, jako jsou například maleimidy apod. Reaktivní skupina může být připojena k polymeru přímo nebo přes spojovací segment. Je nutné rozumět, že zbytek takové skupiny v některých případech tvoří instance část produktu jako spojovací skupina mezi protilátkovým fragmentem a polymerem.
Velikost polymeru může být měněna dle přání, ale obecně je v průměrném rozmezí molekulových hmotností od 500 (Da) do 50000 (Da) , výhodně 5000 až 40000 (Da) a výhodněji 25000 až 40000 (Da). Velikost polymeru může být konkrétně vybrána na ·« #* Μ ···* Μ ·· < « · * · · < « » » ····« ·· « ·· · • ·· * · · * · « « · « « « · · # · · » « « * ·« * ♦ «« «9 Μ Μ4Ι 12 základě zamýšleného použiti produktu. Tedy, například, když je zamýšleno, aby produkt opustil cirkulaci a pronikl do tkání, například pro použití při léčení nádorů, může být výhodné použít polymer s nízkou molekulovou hmotností, například s molekulovou hmotností přibližně 5000 (Da). Pro aplikace, při kterých produkt v cirkulaci zůstává, může být výhodné použít polymer s vyšší molekulovou hmotností, mající například molekulovou hmotnost v rozmezí 25000 (Da) až 40000 (Da).
Obzvláště výhodné polymery zahrnují polyalkylenové polymery, jako je například póly(ethylenglykol) nebo, zejména, methoxypoly(ethylenglykol) nebo jejich deriváty a zejména polymery s molekulovou hmotností v rozmezí přibližně 25000 (Da) až přibližně 40000 (Da).
Každá molekula polymeru připojená k modifikovanému protilátkovému fragmentu může být kovalentně připojena k atomu síry cysteinového zbytku lokalizovaného ve fragmentu. Kovalentní vazba je obecně disulfidová vazba nebo, zejména, vazba mezi atomy síry a uhlíku.
Kde je to žádoucí, může mít protilátkový fragment připojenou jednu nebo více efektorových nebo reportérových molekul. Efektorové nebo reportérové molekuly mohou být připojeny k protilátkovému fragmentu přes kterýkoliv dostupný aminokyselinový postranní řetězec nebo terminální aminokyselinovou funkční skupinu ve fragmentu lokalizovanou, například jakoukoliv volnou aminoskupinu, iminoskupinu, hydroxylovou skupinu nebo karboxylovou skupinu.
Pro přípravu protilátkových fragmentů modifikovaných polymerem popsaných výše může být použit jako výchozí látka každý aktivovaný polymer. Aktivovaný polymer může být každý polymer obsahující thiolovou reaktivní skupinu, jako je například α-halogenkarboxylová kyselina nebo ester, např. jodacetamid, imid, např. maleimid, vinylsulfon nebo disulfid. Tato výchozí látka může být získána komerčně (například od |φ ·· 1« « · ♦ · · · · · « · * * · * ·«·· ««· + # · · · · · · ····*«« ·#·« « • · · φ φ · · * φ φ » • # · « ·♦ · * 4 · · · * « 13 firmy Shearwater Polymers lne., Huntsville, AL, USA) nebo může být připravena z komerčně dostupných výchozích látek s použitím obvyklých chemických postupů.
Co se týče připojení póly(ethylenglykol)ových (PEG) skupin, odkazuje se na práce „Póly(ethylenglykol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenům Press, New York, „Póly(ethylenglykol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris a S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC a "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam a A. Dent, Grove Publishers, New York.
Když je třeba získat protilátkový fragment připojený k efektorové nebo reportérové molekule, může to být připraveno standardními chemickými postupy nebo technikami rekombinantni DNA, kdy je protilátkový fragment spojen buď přímo nebo prostřednictvím kondenzačního činidla k efektorové nebo reportérové molekule buď před nebo po reakci s vhodným aktivovaným polymerem. Konkrétní chemické postupy zahrnují, například, postupy popsané ve WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90,195 a WO 89/1476. Alternativně, když je efektorová nebo reportérové molekula protein nebo polypeptid, může být spojení dosaženo s použitím postupů rekombinantni DNA, popsaných například ve WO 86/01533 a EP-A-0392745. Výhodně, modifikovaný Fab fragment podle předkládaného vynálezu je PEGylován (tj. má k sobě kovalentně připojen PEG (póly(ethylenglykol))) podle metody popsané v EP-A-0948544. Výhodně protilátková molekula podle předkládaného vynálezu je PEGylovaný modifikovaný Fab fragment ukázaný na obrázku 13. Jak je ukázánu na obrázku 13, modifikovaný Fab fragment má maleimidovou skupinu kovalentně připojenou k jedné thiolové skupině v modifikovaném kloubovém úseku. K maleimidové skupině je kovalentně připojen zbytek lysinu. Ke každé aminoskupině na * 9 • 9 «« ·« 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 •999« 99 · 99 · • 9# 999 9 999 9 9 9999 9999 999 99 99 «9 99 99 9*99 14 lysinovém zbytku je připojen polymer methoxypoly(ethylenglykol)u majici molekulovou hmotnost přibližně 20000 (Da). Celková molekulová hmotnost celé efektorové molekuly je tudíž přibližně 40000 (Da). Výhodně, ve sloučenině ukázané na obrázku 13, těžký řetězec protilátkové části má sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 115 a lehký řetězec má sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 113. Tato sloučenina je v tomto textu nazývána CDP870.
Domény konstantních úseků protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu, jestliže se vyskytují, mohou být vybírány s ohledem na navrhovanou funkci protilátkové molekuly a zejména efektorové funkce, které mohou být nezbytné. Například, domény konstantních úseků mohou být humánní domény IgA, IgD, IgE, IgG nebo IgM. Mohou být použity obzvláště domény konstantních úseků humánního IgG, zejména izotypy IgGl a IgG3, když je protilátkové molekula zamýšlena pro terapeutické použití a jsou nezbytné protilátkové efektorové funkce. Alternativně, mohou být použity izotypy IgG2 a IgG4, když je protilátkové molekula zamýšlena pro terapeutické použití a protilátkové efektorové funkce nejsou nezbytné, např. pro jednoduchou blokádu aktivity TNFa.
Protilátkové molekula podle předkládaného vynálezu může mít také připojenou efektorovou nebo reportérovou molekulu. Například, může mit připojen makrocyklus, pro chelataci těžkého kovového atomu, nebo toxin, jako například ricin, kovalentní můstkovou strukturou. Nebo může být použita technologie rekombinantní DNA pro produkci protilátkové molekuly, kdy Fc fragment (CH2, CH3 a kloubové domény), CH2 a CH3 domény nebo CH3 doména kompletní molekuly imunoglobulinu jsou (byly) nahrazeny nebo byly připojeny peptidovou vazbou, k funkčnímu neimunoglobulinovému proteinu, jako například molekule enzymu nebo toxinu.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu má výhodně vazebnou afinitu alespoň 0,85xl0_1° M, výhodněji alespoň 0,75xl0~10 M a nejvýhodněji alespoň 0,5xl0_1° M. (Je nutné poznamenat, že výhodná humanizovaná protilátková molekula podle předkládaného vynálezu, jak je popsáno níže, má afinitu přibližně 0,5xl0_1° M, což je lepší než afinita myši monoklonální protilátky, ze které pochází. Myší protilátka má afinitu přibližně 0,85xl0"10 M. ) Výhodně, protilátková molekula podle předkládaného vynálezu obsahuje variabilní doménu lehkého řetězce hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č. 8) a variabilní doménu těžkého řetězce gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11). Sekvence variabilní domény těchto lehkých a těžkých řetězců jsou ukázány na obrázku 8 a 11, v daném pořadí. Předkládaný vynález se také týká variant protilátkových molekul podle předkládaného vynálezu, které mají zlepšenou afinitu pro TNFa. Tyto varianty mohou být získány pomocí velkého počtu postupů afinitního zrání (afinitní maturace) včetně mutací CDR (Yang a kol., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), „shuffling" řetězce (Marks a kol., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), použití mutátorového kmen E. coli (Low a kol., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA „shuffling" (Patten a kol., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), vystavování na fágu, fágový displej (Thompson a kol., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) a „sexual" PCR (Crameri a kol., Nátuře, 391, 288-291, 1998). Vaughan a kol. (výše) pojednávají o těchto metodách afinitní maturace. Předkládaný vynález také poskytuje DNA sekvence kódující těžké a/nebo lehké řetězce(řetězec) protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu. Výhodně, DNA sekvence kóduje těžký nebo lehký řetězec protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu. • t ·« ♦ ♦ ··♦» ·· ·· • · · ♦ · · * · · · ····« ♦ ♦ · · · · • ·· f « · · · · ♦ t · • « · · ···· · « · ·· ·* ««9» «· *··· 16 V jednom výhodném provedení DNA sekvence kóduje lehký řetězec a obsahuje sekvence ukázané v SEKV. ID. Č. 8 (hTNF40-gLl) nebo SEKV. ID. Č. 9 (h-TNF40-gL2) nebo jejich degenerované ekvivalenty. V alternativním výhodném provedení DNA sekvence kóduje těžký řetězec a obsahuje sekvence ukázané v SEKV. ID. Č. 10 (ghlhTNF40.4) nebo SEKV. ID. Č. 11 (gh3hTNF40.4) nebo jejich degenerované ekvivalenty. DNA sekvence podle předkládaného vynálezu může obsahovat syntetickou DNA, například vytvořenou chemickými postupy, cDNA, genomovou DNA nebo jakoukoliv jejich kombinaci. Předkládaný vynález se také týká klonovaciho nebo expresního vektoru obsahujícího jednu nebo více DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu. Výhodně, klonovací nebo expresní vektor obsahuje dvě DNA sekvence, kódující lehký řetězec a těžký řetězec protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu, v daném pořadí.
Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález E. coli expresní vektor obsahující DNA sekvenci podle předkládaného vynálezu. Výhodně expresní vektor je pTTO(CDP870), jak je schematicky ukázán na obrázku 22. Předkládaný vynález také obsahuje vektor pDNAbEng-Gl, jak je ukázán na obrázku 19.
Obecné metody, kterými mohou být vektory konstruovány, transfekční metody a kultivační metody jsou odborníkům dobře známy. V tomto ohledu se odkazuje na "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley
Interscience, New York a Maniatis Manual vydaný nakladatelstvím Cold Spring Harbor Publishing. DNA sekvence, které kódují protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu mohou být získány metodami, které odborníci dobře znají. Například, DNA sekvence kódující část nebo celý protilátkový těžký a lehký řetězec mohou být • · ·· · · ·*·· ·· ·· • · · «· · «φ«· 99··· ·· · ·· · ······· ·*·· · ···· ···· ··· ·♦ ·· ·· *· ·· ···· 17 syntetizovány dle přání ze zjištěných DNA sekvencí nebo na základě odpovídajících aminokyselinových sekvencí. DNA kódující sekvence příjemcovského (akceptorového) rámce je odborníkům široce dostupná a může být snadno syntetizována na základě svých známých aminokyselinových sekvencí.
Standardní techniky molekulární biologie mohou být použity pro přípravu DNA sekvencí kódujících protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu. Požadované DNA sekvence mohou být syntetizovány kompletně nebo částečně s použitím technik syntézy pomocí oligonukleotidů. Vhodně mohou být použity techniky místně cílené mutageneze a polymerázové řetězové reakce (PCR).
Každý vhodný systém hostitelská buňka/vektor může být použit pro expresi DNA sekvence kódující protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu. Může být použit bakteriální systém, například E. colí, a další mikrobiální systémy, částečně, pro expresi protilátkových fragmentů, jako jsou například Fab a F(ab')2 fragmenty a zejména Fv fragmenty a fragmenty protilátky s jedním řetězcem, například, jednořetězcové Fvs. Eukaryotické, např. savčí, hostitelské buněčné expresní systémy mohou být použity pro produkci větších protilátkových molekul, včetně kompletních protilátkových molekul. Vhodné savčí hostitelské buňky zahrnují CHO buňky, myelomové nebo hybridomové buňky. Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby protilátkových molekul podle předkládaného vynálezu obsahující kultivaci hostitelských buněk obsahujících vektor podle předkládaného vynálezu za podmínek vhodných a vedoucích k expresi proteinu z DNA kódující protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu a izolaci protilátkové molekuly. Výhodně způsob výroby protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu obsahuje pěstování E. coli obsahující E. coli expresní vektor obsahující DNA sekvenci podle 18 ·· «· • · · • · · ·♦ • · · • ·
předkládaného vynálezu za podmínek vhodných a vedoucích k expresi proteinu a izolaci protilátkové molekuly. Protilátková molekula může být sekretována z buněk nebo cílena do periplazmy vhodnými signálními sekvencemi. Nebo se protilátková molekula může akumulovat v cytoplazmě buňky. Výhodně je protilátková molekula cílena do periplazmy. V závislosti na vytvářené protilátkové molekule a použitém postupu, je žádoucí, aby se protilátková molekula správně prostorově složila („refold") a přijala funkční konformaci. Postupy umožňující protilátkové molekule, aby se složila, jsou odborníkům dobře známé.
Protilátková molekula může obsahovat pouze polypeptid těžkého nebo lehkého řetězce, v tomto případě je zapotřebí použít pouze kódující sekvenci těžkého řetězce nebo lehkého řetězce polypeptide pro transfekci hostitelských buněk. Pro výrobu produktů obsahujících oba těžké a lehké řetězce, může být buněčná linie transfekována dvěma vektory, první vektor kódující polypeptid lehkého řetězce a druhý vektor kódující polypeptid těžkého řetězce. Nebo může být použit jeden vektor, který zahrnuje sekvence kódující polypeptidy lehkého řetězce a těžkého řetězce. Předkládaný vynález také poskytuje terapeutický nebo diagnostický přípravek obsahující protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem. Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby terapeutického nebo diagnostického přípravku obsahující smísení protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem.
Protilátková molekula může být jediná aktivní složka v terapeutickém nebo diagnostickém přípravku nebo může být doprovázena další včetně aktivní složkou dalších ·· ♦· t· ···· ♦· ·· • · · · · · ···· ···#· · ♦ · ·· · * ·· ♦ ♦ · · ♦ · ♦ * « • · · « ···· ··· ·· ·· ·· ti ·· #··« 19 protilátkových složek, například protilátek anti-T lymfocyt, anti-IFNy nebo anti-LP nebo neprotilátkových složek, jako jsou například xantiny.
Farmaceutické přípravky výhodně obsahují terapeuticky účinné množství protilátky podle vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množství", použitý v tomto textu, se vztahuje k množství terapeutického agens potřebného k léčbě, zmírnění nebo prevenci cílové nemoci nebo stavu nebo k projevení detekovatelného terapeutického nebo preventivního účinku. Pro každou protilátku může být terapeuticky účinná dávka stanovena nejprve buď v testech na tkáňových kulturách nebo ve zvířecích modelech, obvykle na hlodavcích, králících, psech, prasatech nebo primátech. Zvířecí model může být také použit pro stanovení příslušného rozmezí koncentrace a způsobu podávání. Tyto informace pak mohou být použity pro stanovení použitelné dávky a způsobu podávání u lidí. Přesné účinné množství pro humánního pacienta závisí na závažnosti chorobného stavu, všeobecném zdraví pacienta, věku, hmotnosti a pohlaví pacienta, stravě, době a častosti podávání, kombinaci léků reakční citlivosti a toleranci/reakci na léčbu. Toto množství může být stanoveno rutinním experimentováním a závisí na úsudku lékaře. Obecně, účinná dávka je od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, výhodně 0,1 mg/kg až 20 mg/kg, výhodněji přibližně 15 mg/kg. Jak je ukázáno v příkladu níže, dávky 1, 5 a 20 mg/kg byly použity pro léčení pacientů trpících revmatoidní artritidou. Přípravky mohou být podávány pacientovi samostatně nebo mohou být podávány v kombinaci s dalšími agens, léčivy nebo hormony. Dávka, ve které jsou protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu podávány, závisí na povaze léčeného chorobného stavu, na stupni, do kterého vystoupila nebo se očekává, že vystoupila, hladina TNFa, která má být 20 20 ·· ·· » · · ι · · ·· • i ·« • · · · · • ♦ · « • · ♦ · • ♦ ·· ··«· neutralizována, nad požadovanou úroveň, a na tom, zda protilátková molekula bude použita profylakticky nebo k léčeni již existujícího chorobného stavu.
Tak například, když produkt je pro léčení nebo profylaxi chronického zánětlivého onemocnění, jako je například revmatoidní artritida, vhodná dávka protilátkové molekula podle předkládaného vynálezu leží v rozmezí mezi 0,5 a 50 mg/kg, výhodněji mezi 1 a 20 mg/kg a nejvýhodněji je přibližně 15 mg/kg. Častost podávání dávky závisí na biologickém poločase protilátkové molekuly a trváni účinku.
Jestliže má protilátková molekula krátký biologický poločas (např. 2 až 10 hodin) může být nezbytné podávat jednu nebo více dávek denně. Nebo, jestliže má protilátková molekula dlouhý biologický poločas (např. 2 až 15 dnů) může být nutné podávat dávku pouze jednou denně, týdně nebo dokonce jednou za 1 nebo 2 měsíce.
Farmaceutický přípravek může také obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič pro podávání protilátky. Nosič sám by neměl indukovat produkci protilátek škodlivých pro jedince, který dostává přípravek, a neměl by být toxický. Vhodné nosiče jsou velké, pomalu metabolizované makromolekuly, jako jsou například proteiny, polypeptidy, liposomy, polysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerní aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery a inaktivní virové částice.
Mohou být použity farmaceuticky přijatelné soli, například soli minerálních kyselin, jako jsou například hydrochloridy, hydrobromidy, fosfáty a sulfáty nebo soli organických kyselin, jako jsou například acetáty, propionáty, malonáty a benzoáty.
Farmaceuticky přijatelné nosiče v terapeutických přípravcích mohou dále obsahovat tekutiny, jako je například voda, fyziologický roztok, glycerol a ethanol. V těchto přípravcích mohou být dále přítomny pomocné látky, jako jsou 21 ·« • ♦ • » ·· •· ···· • * • · • · · ·« *· • · · ·· ·* ·· ·· • · · · « t * • · · ·· ··#· například smáčedla nebo emulgátory nebo pH pufry. Tyto nosiče umožňují, že farmaceutické přípravky jsou formulovány jako tablety, pilulky, dražé, tobolky, tekutiny, gely, sirupy, směsi a suspenze, pro požití pacientem. Výhodné formy pro podávání zahrnují formy vhodné pro parenterální podávání, např. injekcí nebo infúzí, například bolusovou injekcí nebo kontinuální infúzí. Když je produkt pro injekci nebo infúzi, může mít formu suspenze, roztoku nebo emulze v olejovitém nebo vodném vehikulu a může obsahovat formulační činidla, jako jsou například suspendující činidla, konzervační činidla, stabilizační a/nebo dispergační činidla. Nebo protilátková molekula může být v suché formě pro rekonstituci před použitím s vhodnou sterilní tekutinou.
Jakmile jsou jednou formulovány, mohou být podávány přípravky podle vynálezu přímo pacientovi. Léčení pacienti mohou být zvířata. Ale je výhodné, když jsou přípravky upraveny pro podávání humánním pacientům.
Farmaceutické přípravky tohoto vynálezu mohou být podávány celou řadou způsobů včetně, ale bez omezení, perorálního, intravenózního, intramuskulárního, intraarteriálního, intramedulárního, intrathekálního, intraventrikulárního, transdermálního, transkutánního (viz například, W098/20734), subkutánního, intraperitoneálního, intranazálního, enterálního, topického, sublingválního, intravaginálního nebo rektálního způsobu. Spreje mohou také být použity pro podávání farmaceutických přípravků podle vynálezu. Terapeutické přípravky mohou být typicky připraveny jako přípravky pro injekce, a to buď jako tekuté roztoky nebo suspenze. Mohou být také připraveny pevné látkové formy vhodné pro přípravu roztoku nebo suspenze v tekutém vehikulu před injekcí. Přímá aplikace přípravku je obecně uskutečňována injekcí, subkutánní, intraperitoneální, intravenózní nebo intramuskulární nebo aplikací do intersticia tkání. Přípravek 22 ·· ·· ·· #»·· «· • 9 * • « • • • t • • · • · • ·· • · • • a • • • • · • · • • · • • « • • • · • • • · • a • ·· ·· « « aa • a·· může také být podáván na léze. Dávkování léčby může být jednou dávkou nebo podle rozpisu několika dávek.
Je nutné chápat, že aktivní složka v přípravku je protilátková molekula. Jako taková podléhá degradaci v gastrointestinálním traktu. Tedy, jestliže přípravek má být podáván způsobem používajícím gastrointestinální trakt, je zapotřebí, aby přípravek obsahoval činidla, která chrání protilátku před degradací, ale která protilátku uvolní, když byla absorbována z gastrointestinálního traktu. Důkladná diskuse o farmaceuticky přijatelných nosičích je k dispozici v Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J., 1991). Předpokládá se také, že protilátka podle předkládaného vynálezu bude podávána s použitím genové terapie. Aby se toho dosáhlo, jsou DNA sekvence kódující těžké a lehké řetězce protilátkové molekula pod kontrolou příslušných DNA složek zavedeny pacientovi, takže protilátkové řetězce jsou exprimovány z DNA sekvence a sestaveny in šitu. Předkládaný vynález také poskytuje protílátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu pro léčení nemocí zprostředkovaných TNFa. Předkládaný vynález dále poskytuje použití protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení nemocí zprostředkovaných TNFa.
Protilátková molekuly podle předkládaného vynálezu může být použita pro jakoukoliv léčbu, kde je žádoucí, aby se snížil stupeň biologicky aktivního TNFa vyskytujícího se v lidském nebo zvířecím organismu. TNFa může cirkulovat v organismu nebo se může vyskytovat v nežádoucím vysokém stupni lokalizovaný v konkrétním místě v organismu.
Například zvýšená hladina TNFa je zapojena do akutních a chronických imunitních a imunoregulačních poruch, infekcí ·« ·· ·· ·» *· * · « · * · % · * > • «O»* ·» » « · · • · * ··· * · · * · « • « · · I « · i · * « *0 ·· ♦· «· ·* ··#· 23 včetně septického, endotoxického a kardiovaskulárního šoku, zánětlivých onemocnění, neurodegenerativních onemocnění, maligních nemocí a hepatitidy indukované alkoholem. Detaily o početných chorobách spojených se zvýšenou hladinou TNFa jsou uvedeny v US-A- 5 919 452. Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může/mohou být použita pro léčbu nemocí zprostředkovaných TNFa. Konkrétní relevantní nemoci, které mohou být léčeny protilátkovou molekulou podle předkládaného vynálezu, jsou sepse, městnavé srdeční selhání, septický nebo endotoxický šok, kachexie, syndrom respirační tísně dospělých, AIDS, alergie, psoriasis, TBC, zánětlivá kostní onemocnění, poruchy krevní koagulace, popáleniny, rejekce po transplantaci orgánů nebo tkání, Crohnova nemoc a autoimunitní onemocnění, jako je například tyreoiditida a revmatoidní artritida a osteoartritida.
Protilátková molekula nebo přípravek mohou být dále použity: aby se snížily vedlejší účinky sdružené s tvořením TNFa v průběhu terapie neoplastických onemocnění, aby se odstranily nebo snížily symptomy šoku spojené s léčením nebo prevencí rejekce štěpu při použití anti-lymfocytárních protilátek, nebo pro léčení multiorgánového selhání.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu je výhodně použita pro léčení revmatoidní artritidy nebo osteoartritidy. Předkládaný vynález také poskytuje způsob léčení humánních nebo zvířecích pacientů, kteří trpí nebo jsou v riziku onemocnění zprostředkovaného TNFa, tento způsob zahrnuje podávání pacientovi účinného množství protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může také být použita pro diagnózu, například pro in vivo diagnózu a znázornění chorobného stavu se zvýšenou hladinou TNFa. • · ··« · • · ··« · • · • · · · ♦ · · * · · · · é • · · · * · · · · · o ·· #*· * * · O M ···· 24 Předkládaný vynález také poskytuje protilátkovou molekulu obsahující hybridní CDR obsahující zkrácené dárcovské CDR sekvence, kde chybějící část zkráceného dárcovského CDR je nahrazena odlišnou sekvencí a tvoří funkční CDR. Termín „hybridní CDR", používaný v tomto textu, znamená CDR obsahující dárcovský CDR, který byl zkrácen v jedné nebo více polohách, například na jednom nebo obou koncích, chybějící část zkráceného dárcovského CDR je nahrazena odlišnou sekvencí a tvoří kompletní a funkční CDR. Hybridní CDR má alespoň jednu aminokyselinovou změnu ve srovnání s kompletním dárcovským CDR. Sekvence nahrazující zkrácenou část CDR může být jakákoliv sekvence. Výhodně nedárcovská část CDR sekvence je z protilátky, ze které pocházejí úseky rámce protilátkové molekuly, jako je například protilátková sekvence zárodeční linie.
Bylo zjištěno, že protilátkové molekuly obsahující hybridní CDR si podržely v podstatě stejnou vazebnou afinitu jako protilátková molekula obsahující kompletní dárcovské CDR. Termín „v podstatě stejná vazebná afinita", používaný v tomto textu znamená alespoň 70 %, výhodněji alespoň 85 % a nejvýhodněji alespoň 95 % vazebné afinity odpovídající protilátkové molekuly obsahující kompletní dárcovské CDR. Jak uvedeno výše, v určitých případech může být afinita protilátky podle vynálezu větší než afinita dárcovské protilátky. Použití hybridní CDR poskytuje výhodu redukce množství cizorodé (tj. dárcovské) sekvence vyskytující se v protilátkové molekule a může zvýšit vazebnou afinitu protilátkové molekuly ve srovnání s odpovídající protilátkovou molekulou obsahující kompletní dárcovské CDR.
Každý CDR protilátkové molekuly může být hybridní. V protilátkové molekule je výhodně hybridní CDR2 těžkého řetězce. ·· ·« ·· ···· ·« ·· • · t ·· · · « · « ····· « « · ·· * • · · ··· · ··· · · Výhodně je zkrácení dárcovského CDR o 1 až 8 aminokyselin, výhodněji o 4 až 6 aminokyselin. Je dále výhodné, když je zkrácení provedeno v C-koncové části CDR. V závislosti na sekvenci zkrácené části CDR a sekvenci odlišné sekvence nahrazující chybějící část může být vytvořen velký počet aminokyselinových změn. Výhodně jsou vytvořeny alespoň 2 aminokyselinové změny, výhodněji jsou vytvořeny alespoň 3 aminokyselinové změny a nejvýhodněji jsou vytvořeny alespoň 4 aminokyselinové změny.
Konkrétním provedením tohoto aspektu vynálezu je protilátka podle prvního aspektu vynálezu, kde druhý CDR v těžkém řetězci má sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 2. Ta má lepší afinitu pro svůj antigen, než dárcovská protilátka, ze které pochází část CDR. Předkládaný vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protilátkovou molekulu obsahující hybridní CDR podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález také poskytuje expresní vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující protilátkovou molekulu obsahující hybridní CDR podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález také poskytuje hostitelskou buňku transformovanou vektorem podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby protilátkové molekuly obsahující hybridní CDR zahrnující kultivaci hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu a izolaci protilátkové molekuly.
Popis obrázků je pro ilustraci dále popsán v které se vztahují k doprovázejícím Předkládaný vynález následujících příkladech, obrázkům: 26 ·♦ · · · · · · ι· ·· • ι · #« · c « · · ····· · · # ·» » • ·· ·♦· · « f · · · • · · · · · · i * · * ·· · · ·· · · ·· ····
Obrázek 1 ukazuje úseky rámce podskupiny 1 humánních lehkých řetězců ve srovnání s úseky rámce hTNF40 lehkého řetězce (SEKV. ID. Č. 83 až 90).
Obrázek 2 ukazuje úseky rámce podskupiny 1 a podskupiny 3 humánních těžkých řetězců ve srovnání s úseky rámce hTNF40 těžkého řetězce (SEKV. ID. Č. 91 až 98 a 106 až 109).
Obrázek 3 ukazuje aminokyselinovou sekvenci CDR z hTNF40 (SEKV. ID. Č. 1 až 7), kde CDR H2' je hybridní CDR, kde šest aminokyselin z C-koncové části je z H2 CDR sekvence humánní podskupiny 3 protilátky zárodečné linie a aminokyselinové změny sekvence plynoucí z této hybridizace jsou podtrženy.
Obrázek 4 ukazuje vektor pMRl5.1.
Obrázek 5 ukazuje vektor pMRl4.
Obrázek 6 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci myší hTNF40Vl(SEKV. ID. Č. 99). Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci myší hTNF40Vh (SEKV. ID . Č. 100). Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č . 8). Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci hTNF40-gL2 (SEKV. ID. Č . 9). Obrázek 10 ukazuje nukleotidovou u předpovězenou aminokyselinovou sekvenci ghlhTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 10). 27 ··· · • Ψ · · tt ** ► ι «ι»
·· ····
Obrázek 11 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11).
Obrázek 12 ukazuje vektor CTIL5-gL6.
Obrázek 13 ukazuje strukturu sloučeniny nazvané CDP87D obsahující modifikovaný Fab fragment pocházející z protilátky hTNF40 kovalentně spojený prostřednictvím cysteinového zbytku k lysyl-maleimidové spojce, kde každá aminoskupina na lysylovém zbytku má k sobě kovalentně připojen methoxy-PEG zbytek, přičemž n je přibližně 420.
Obrázek 14 ukazuje vektor pTTQ9.
Obrázek 15 ukazuje sekvence OmpA oligonukleotidového adaptéru (SEKY. ID. Č. 101).
Obrázek 16 ukazuje vektor pACYC184.
Obrázek 17 ukazuje vektor pTTO-1.
Obrázek 18 ukazuje vektor pTTO-2.
Obrázek 19 ukazuje vektor pDNAbEng-Gl.
Obrázek 20 ukazuje oligonukleotidové kazety kódující odlišné intergenové sekvence pro expresi modifikovaného Fab v E. coli (SEKV. ID. Č. 102 až 105).
Obrázek 21 ukazuje akumulaci modifikovaného Fab IGS variant v periplazmě.
Obrázek 22 ukazuje vektor pTTO(CDP870). 28 • « • * • * • ··· *· • · • t « • • »99 • 1 • · • ·· <4 ♦ · · | 4 4 4 4 1 « • · • · < 'i · • « · • « » 4 4 4 4 4 « *· • * f a • ♦ · · 4444
Obrázek 23 ukazuje skóre aktivity nemoci (DAS) u pacientů léčených odlišnými dávkami CDP870 a placebo. Medián a IQ rozmezí jsou uvedeny pro populaci pro každý postup s posledními pokračujícími pozorováními. Malé čtverečky označují placebo, kosočtverce označují 1 mg/kg, trojúhelníky označují 5 mg/kg a velké čtverce označují 20 mg/kg.
Obrázek 24 ukazuje četnost výskytu citlivých kloubů, četnost výskytu oteklých kloubů, skóre bolesti, celkový odhad aktivity nemoci stanovený odhadcem, modifikovaný dotazník k vyhodnocení zdravotního stavu (HAQ), C reaktivní protein (CRP) a rychlost sedimentace červených krvinek (ESR) u pacientů léčených odlišnou dávkou CDP870 a placebem. Medián a IQ rozmezí jsou uvedeny pro populaci pro každý postup s posledními pokračujícími pozorováními. Malé čtverečky označují placebo, kosočtverce označují 1 mg/kg, trojúhelníky označují 5 mg/kg a velké čtverce označují 20 mg/kg. Příklady provedení vynálezu
Klonování genu a exprese chimérické hTNF40 protilátkové molekuly
Izolace RNA z hTNF40 hybridomových buněk
Celková RNA byla připravena z 3 x 107 hTNF40 hybridomových buněk takto. Buňky byly promyty ve fyziologickém roztoku a rozpuštěny v RNAzolu (0,2 ml na 105 buněk). Byl přidán chloroform (0,2 ml na 2 ml homogenátu) a směs byla důkladně třepána po dobu 15 sekund, a poté ponechána na ledu po dobu 15 minut. Výsledná vodná a organická fáze byly odděleny centrifugací po dobu 15 minut v Eppendorfově centrifuze a RNA • · *· 9 9 ···· ti ·· • · · · I · I * * ( t · IM 9 0 · · I · • · · 0 t · 0 9 0 0 « · « · « · I Φ 9 » ··· 9 0 «« # · 9 0 0 9 99 9 0 29 byla precipitována z vodné fáze přidáním stejného objemu isopropanolu. Po 15 minutách na ledu byla RNA stočena do peletu, promyta 70% ethanolem, usušena a rozpuštěna ve sterilní vodě bez RNázy. Výtěžek RNA byl 400 μς.
PCR klonování hTNF4 0 Vh a VI cDNA sekvence kódující variabilní domény hTNF40 těžkého a lehkého řetězce byly syntetizovány s použití reverzní transkriptázy za vzniku jednovláknových cDNA kopií mRNA přítomné v celkové RNA, pak následovala polymerázová řetězová reakce (PCR) na cDNA se specifickými oligonukleotidovými primery.
a) syntéza cDNA cDNA byla syntetizována v reakční směsi o objemu 20 μΐ obsahující následující reagencie: 50mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KC1, 10 mM dithiothreitol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 20 jednotek RNAsinu, 75 ng náhodných hexanukleotidových primerů, 2 μg hTNF40 RNA a 200 jednotek reverzní transkriptázy z viru MoMuLV (Moloneyovy myší leukémie) . Po inkubaci ve 42°C po dobu 60 minut, reakce byla ukončena zahříváním v 95°C po dobu 5 minut.
b) PCR
Alikvoty cDNA byly podrobeny PCR s použitím kombinace primerů specifických pro těžké a lehké řetězce. Nukleotidové sekvence 5' primerů pro těžké a lehké řetězce jsou ukázány v tabulce 1 a 2, v daném pořadí. Tyto sekvence všechny obsahují postupně restrikční místo začínající 7 nukleotidů od jejich 5' konců, sekvenci GCCGCCACC (SEKV. ID. Č. 12) pro umožnění optimální translace výsledných mRNA, iniciační kodon a 20-30 nukleotidů založených na vedoucí peptidové sekvenci ·· ♦· ·« ···· ·· ·· • · « # ♦ · · · · ·
····· · · # ·· I • I · ·4· · 9 9 0 · # «♦·· « · · * ··· f· *# 90 ·· ♦· ···# 30 známých myších protilátek (Kabat a kol., Sequences of proteins of immunological interest, 5. vydání, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health). 3' primery jsou ukázány v tabulce 3. Primer lehkého řetězce přesahuje J-C spojení protilátky a obsahuje restrikční místo pro enzym SplI pro usnadnění klonování Vl PCR fragmentu. 3' primery těžkého řetězce jsou směsí navrženou k přesáhnutí J-C spojení protilátky. 3' primer zahrnuje Apal restrikční místo pro usnadnění klonování. 3' úsek primerů obsahuje smíšenou sekvenci založenou na sekvencích zjištěných ve známých myších protilátkách (Kabat a kol., 1991, výše).
Kombinace primerů popsaných výše umožní PCR produktům pro Vh a VI, že jsou klonovány přímo do vhodného expresního vektoru (viz níže) pro produkci chimérických (myší-humánní) těžkých a lehkých řetězců, a těmto genům, že jsou exprimovány v savčích buňkách k pro produkci chimérických protilátek požadovaného izotypu.
Inkubace (100 μΐ) pro PCR byly nastaveny takto. Každá reakce obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,01 % (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 10 pmol směsi 5' primerů (tabulka 4), 10 pmol 3' primerů (CL12 (lehký řetězec) nebo R2155 (těžký řetězec) (tabulka 3), 1 μΐ cDNA a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly inkubovány v 95°C po dobu 5 minut a poté podrobeny cyklům v 94°C po dobu 1 minuty, 55°C po dobu 1 minuty a 72°C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byl alikvot z každé reakce analyzován elektroforézou na agarózovém gelu. Reakce pro lehké řetězce obsahující směsi 5' primerů ze skupin pro lehké řetězce 1, 2 a 7 vytvořily pásy o velikostech souhlasných s kompletními Vl fragmenty, zatímco reakce ze skupin pro těžké řetězce 3 vytvořily fragment o velikosti očekávaného Vh genu. Pás vytvořený primery ze skupiny pro 31 31 Μ Μ • · « • · · · · • · · • · · « c « »
• Μ Μ i ♦ · · · • · * • · · · * # · lehké řetězce 1 nebyl dále sledován, protože předběžné výsledky ukázaly, že tento pás odpovídá pseudogenu lehkého řetězce tvořeného hybridomovými buňkami. Pás vytvořený primery ze skupiny pro lehké řetězce 7 byl slabší než pás primerů ze skupiny 2, a tudíž nebyl dále sledován. Pouze pás vytvořený primery ze skupiny pro lehké řetězce 2, což byl nejsilnější pás, byl dále sledován. c) Molekulární klonování PCR fragmentů DNA fragmenty vytvořené v reakcích s primery ze skupiny pro lehké řetězce 2 byly štěpeny enzymy BstBI a SplI, koncentrovány ethanolovou precipitací, podrobeny elektroforéze na 1,4% agarózovém gelu a DNA pásy o velikosti 400 párů baží byly opětně získány. Byly klonovány ligací do vektoru pMRl5.1 (obrázek 4), který byl štěpen BstBI a SplI. Po ligaci byly směsi transformovány do E. coli LM 1035 a s plazmidy z výsledných bakteriálních kolonií byl prováděn screening na inzerty pomocí štěpení s BstBI a SplI. Reprezentativní vzorky s inzerty z každé ligace byly analyzovány dále prostřednictvím nukleotidového sekvencování.
Podobně byly štěpeny DNA fragmenty vytvořené v reakcích s primery ze skupiny pro těžké řetězce 3 s enzymy HindlII a Apal a klonovány do vektoru pMR14 (obrázek 5), který byl štěpen HindlII a Apal. Opět, reprezentativní plazmidy obsahující inzerty byly analyzovány nukleotidovým sekvencováním. d) Analýza sekvencováním nukleotidů
Plazmidová DNA z velkého počtu izolátů obsahujících Vh inzerty byla sekvencována s použití primerů R1053 (viz tabulka 5) (které nasedají v 3' úseku HCMV promotoru v pMR14) a R720 (viz tabulka 5) (které nasedají v 5' úseku humánního C - gama 4 a umožňují sekvencování přes DNA inzert v pMR14). Bylo Μ «* 9 · · · 9 · |· Μ « I < * « · ···· • · ··· 9 » · · 9 9 • ♦ 9 · 9 9 9 9 9 9 · 9 • 9 9 4 » 9 9 9 9 9 9 99 99 99 99 »9 9999 32 zjištěno, že nukleotidové sekvence Vh inzertu ve velkém počtu klonů byly totožné, s výjimkou rozdílů v signálním peptidu a J úsecích. To ukazovalo, že vyšetřené klony jsou nezávislé izoláty vznikající použitím odlišných primerů ze směsi oligonukleotidů v průběhu PCR stádia. Zjištěné nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence variabilní domény těžkého řetězce protilátky hTNF40 (hTNF40Vh) jsou uvedeny na obrázku 7 (SEKV. ID. Č. 100).
Pro analýzu klonů lehkého řetězce byly vyšetřovány sekvence pocházející z reakcí s primery R1453 (viz tabulka 5) a R684 (SEKV. ID. Č. 62) (které nasedají v 5' úseku humánního C-kappa a umožňují sekvencování přes DNA inzert na pMR15.1). Nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence VI genů vznikajících z reakcí ve skupině 2 byly analyzovány podobně. Opět bylo zjištěno, že nukleotidové sekvence VI inzertu ve velkém počtu klonů byly totožné, s výjimkou rozdílů v signálním peptidu a J úsecích, což ukazovalo, že vyšetřené klony byly nezávislé izoláty vznikající použitím odlišných primerů ze směsi oligonukleotidů v průběhu PCR stádia. Zjištěné nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence variabilní domény lehkého řetězce protilátky hTNF40 (hTNF40Vl) jsou uvedeny na obrázku 6 (SEKV. ID. Č. 99).
Tabulka 1
Oligonukleotidové primery pro 5' úsek myších těžkých řetězců. CH1: 5'ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3' (SEKV. ID. Č. 13) CH2: 5'ATGGGATGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G) (C,T)TCTT 3' (SEKV. ID. Č. 14) CH3: 5'ATGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3' (SEKV. ID. Č. 15) CH4 : 5 'ATG (G, A) ACTTTGGG (T, C) TCAGCTTG (G, A) T3 ' (SEKV. ID. Č. 16) CH5: 5'ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3' (SEKV. ID. Č. 17) 33 ι· ·· • · · • #
·· ·«
CH6: 5'ATGGCTGTC(C, Τ) Τ (G,A) G (G, C)GCT(G,A)CTCTTCTG3' (SEKV. ID. Č. 18) CH7 : 5 ' ATGG (G, A) ATGGAGC (G, T) GG (G, A) TCTTT (A, C) TCTT3 1 (SEKV. ID. Č. 19) CH8: 5'ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3' (SEKV. ID. Č. 20) CH9: 5'ATGG(C,A)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT3' (SEKV. ID. Č. 21) CH10: 5' ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3' (SEKV. ID. Č. 22) CH11: 5'ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3' (SEKV. ID. Č. 23) CH12: 5'ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3' (SEKV. ID. Č. 24)
Každý z výše uvedených primerů má ke svému 5’ konci přidanou sekvenci 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3' (SEKV. ID. Č. 25).
Tabulka 2
Oligonukleotidové primery pro 5' úsek myších lehkých řetězců. CLI: 5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3' (SEKV. ID. Č. 26) CL2 : 5 'ATGGAG (T, A) CAGACACACTCCTG (T, C) TATGGGT3 ' (SEKV. ID. Č. 27) CL3: 5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3' (SEKV. ID. Č. 28) CL4 : 5 'ATGAGG (G, A) CCCCTGCTCAG (A, T) TT (C, T) TTGG3 1 (SEKV. ID. Č. 29) CL5 : 5 'ATGGATTT (T, A) CAGGTGCAGATT (T, A) TCAGCTT3 ' (SEKV. ID. Č. 30) CL5A: 5,ATGGATTT(T,A)CA(A,G)GTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3' (SEKV. ID. Č. 31) CL6: 5 'ATGAGGT (T, G) C (T, C) (T, C) TG (T, C) T (G, C) AG (T, C) T (T, C) CTG (A, G) G3 ' (SEřCV. ID. Č. 32) CL7: 5'ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3' (SEKV. ID. Č. 33) 34 34
♦ ♦ ♦· # · ·
·· ·· • · · · • · ♦ ·· ···» CL8: 5'ATGTGGGGA(T,C)CT(G,T)TTT(T,C)C(A,C)(A,C)TTTTTCAAT3'(SEKV. ID. Č. 34) CL9: 5'ATGGT(G, A)TCC(T, A)CA(G,C)CTCAGTTCCTT3' (SEKV. ID. Č. 35) CL10: 5'ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3' (SEKV. ID. Č. 36) CLU: 5' ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3' (SEKV. ID. Č. 37) CL12A: 51ATG(A,G)AGT(T,C)(A,T)CAGACCCAGGTCTT(T,C)(A,G)T3' (SEKV. ID. Č. 38) CL12B: 5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3' (SEKV. ID. Č. 39) CL13: 51ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCT'TAT3' (SEKV. ID. Č. 40) CL14: 5'ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3’ (SEKV. ID. Č. 41) CL15: 5'ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3' (SEKV. ID. Č. 42) CLI6: 5'ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3' (SEKV. ID. Č. 43) CL17A: 5’ATGAGGTGCCTA(A,G)CT(C,G)AGTTCCTG(A,G)G3' (SEKV. ID. Č. 44) CL17B: 5’ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3' (SEKV. ID. Č. 45) CL17C: 5'ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3' (SEKV. ID. Č. 46)
Každý z výše uvedených primerů má ke svému 5' konci přidanou sekvenci 5'GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3' (SEKV. ID. Č. 47).
Tabulka 3
Oligonukleotidové primery pro 3' konce myších Vh a VI genů.
Lehký řetězec (CL12): 5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3' (SEKV. ID. Č. 48) Těžký řetězec (R2155): 5' GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC(G,T,A)GTGA3» (SEKV. ID. Č. 49) ·· f* «« ·»** ·· • · · · · · ···· • · · ·· · · # · · · ·· ·* *· ♦· ♦♦ ···» 35
Tabulka 4 a) směsi 5' primerů pro lehké řetězce pro PCR reakce skupina 1: CL2. skupina 2: CL7. skupina 3: CL13. skupina 4: CL6. skupina 5: CL5A, CL9, CL17A. skupina 6: CL8. skupina 7: CL12A.
skupina 8: CLI, CL3, CL4, CL5, CL10, CLU, CL2B, CL14, CL15, CLI6, CL17B, CL17C b) směsi 5' primerů pro těžké řetězce pro PCR reakce skupina 1: CH1, CH2, CH3, CH4. skupina 2: CH5, CH6, CH7, CH8. skupina 3: CH9, CH10, CH11, CH12.
Tabulka 5
Primery použité pro analýzu sekvencovánim nukleotidů R1053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEKV. ID. Č. 50) R720: 5'GCTCTCGGAGGTGCTCCT3' (SEKV. ID. Č. 51)
Hodnoceni aktivity chimérických genů
Aktivita chimérických genů byla hodnocena jejich expresi v savčích buňkách a purifikací a kvantifikací nově syntetizovaných protilátek. Metodologie je popsána níže, následovaná popisem biochemických a buněčných testů použitých pro biologickou charakterizaci protilátek. 36 Μ ·* ·· ·*· · ·· · · • t · I · * * · t · • •••9 · · # · · · ««··«»· · · « » 4 ···· · · ♦ · · · · ·· ·* *« ·· ·· ···· a) Produkce chimérické hTNF40 protilátkové molekuly
Chimérická protilátka pro biologické hodnoceni byla vytvořena pomoci přechodné exprese příslušných párů těžkých a lehkých řetězců po ko-transfekci (společné transfekci) na buňkách z ovarií čínského křečka - Chinese Hamster Ovary (CHO) s použití precipitace fosfátem vápenatým. V den před transfekci byly baňky s napůl konfluentními buňkami CHO-L761 podrobenu působení trypsinu, buňky byly počítány a do každé baňky T75 bylo vloženo 107 buněk. Příští den bylo kultivační médium změněno 3 hodiny před transfekci. Pro provádění transfekce byl připraven precipitát fosfátu vápenatého smícháním 1,25 ml 0,25M CaCl2 obsahujícího 50 μς expresních vektorů s každým těžkým a lehkým řetězcem s 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCl, 11,0 g HEPES a 0,4 g Na2HP04 v 1 1 vody, pH upraveno na 7,1 pomocí NaOH) a byl okamžitě přidán do média k buňkám. Po 3 hodinách ve 37°C v C02 inkubátoru byly médium a precipitát odstraněny a buňky byly podrobeny šoku přidáním 15 ml 15% glycerolu ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) po dobu 1 minuty. Glycerol byl odstraněn, buňky byly jednou promyty PBS a inkubovány po dobu 48-96 hodin ve 25 ml média obsahujícího 10 mM butyrát sodný. Protilátka byla purifikována z kultivačního média vazbou na protein A-Sepharose a elucí.
b) ELISA
Pro provádění testu ELISA byly destičky Nunc ELISA potaženy přes noc ve 4°C s F(ab)2 fragmentem anti-humánní polyklonální kozí protilátky specifické pro Fc fragment (Jackson Imunovýzkum, kóduj 109-006-098) v 5 μg/ml ve vazebném pufru (15 mM uhličitan sodný, 35 mM hydrouhličitan sodný, pH 6,9). Nenavázaná protilátka byla odstraněna promytím 5 krát destilovanou vodou. Vzorky a purifikované standardy, které 37 ·· ·« Ψ t · • t ··· • · ·
měly být kvantifikovány, byly naředěny přibližně na 1 μς/ιηΐ v konjugačnim pufru (0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2% (objem/objem) Tween 20, 0,2% (hmotnost/objem) Hammerstenův kasein). Vzorky byly titrovány v mikrotitračních jamkách ve dvojkových ředěních za vzniku konečného objemu 0,1 ml v každé jamce a destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny s třepáním. Po prvním inkubačním kroku byly destičky promyty 10 krát destilovanou vodou, a poté inkubovány po dobu 1 hodiny jako předtím s 0,1 ml myší anti-humánní kappa monoklonální protilátkou (klon GD12) konjugovanou s peroxidázou (The Binding Site, katalog, č. MP135) v ředění 1 k 700 v konjugačnim pufru. Destička byla opět promyta a do každé jamky byl přidán roztok substrátu (0,1 ml). Roztok substrátu obsahoval 150 μΐ N,N,N,N-tetramethylbenzidin (10 mg/ml v DMSO), 150 μΐ peroxid vodíku (30% roztok) v 10 ml 0,1 M acetát sodný/ citrát sodný, pH 6,0. Destičky byly vyvolávány po dobu 5-10 minut, dokud nebyla absorbance v 630 nm přibližně 1,0 pro horní standard. Absorbance v 630 nm byla měřena s použitím přístroje pro odečítání mikrotitračních destiček a koncentrace vzorku stanovena srovnáním titrační křivky s křivkou standardu. c) stanovení afinitních konstant analýzou BiaCore
Vazebné interakce mezi hTNF40 a humánním TNF byly zkoumány s použitím technologie BIA. Afinitně purifikovaná kozí polyklonální protilátka, namířená proti konstantnímu úseku hTNF40, byla imobilizována na dextranový polymer povrchu sensorického čipu s použitím standardní NHS/EDC chemie. Relativně nízké množství (200-500 RU) hTNF40 bylo zachyceno, aby bylo zajištěno, že byly minimalizovány účinky hmtotového transportu. Přes zachycenou hTNF40 „protékal” humánní TNF v různých koncentracích, aby bylo možné stanovit asociační • · ·· »4 ···· ·· • · • · * · » · · • · ··· · · · · · · ····#······· • · · · · · * « | «· ·· *· ·♦ ·· ·· ···» 38 kinetiku. Po injekci ligandu přecházel přes povrch pufr, aby bylo možné měřit disociaci. Byly vypočteny konstanty rychlosti asociace a disociace pro interakce mezi hTNF40 na pevné fázi a humánním TNF a byla určena hodnota KD. Příklad 1 CDR-roubování hTNF40
Molekulární klonování genů pro variabilní úseky těžkých a lehkých řetězců hTNF40 protilátky a jejich použití pro produkci chimérických (myší-humánní) hTNF40 protilátek bylo popsánu výše. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence myších hTNF40 VI a Vh jsou ukázány na obrázku 6 a 7 (SEKV. ID. Č. 99 a 100), v daném pořadí. Tyto příklady poppisují CDR-roubování hTNF40 protilátky. CDR-roubování hTNF40 lehkého řetězce
Porovnání úseků rámce hTNF40 lehkého řetězce s úseky čtyř podskupin humánních lehkých řetězců (Kabat a kol., 1991, výše) odhalilo, že hTNF40 byla většinou homologní s protilátkami v podskupině humánních lehkých řetězců 1. proto tedy pro konstrukci CDR-roubovan lehkého řetězce vybrané úseky rámce odpovídaly úsekům kanonické sekvence humánní skupiny 1.
Srovnání aminokyselinových sekvencí úseků rámce myší hTNF40 a kanonických lehkých řetězců humánní skupiny 1 je uvedeno na obrázku 1 a ukazuje, že se vyskytuje 22 rozdílů (podtrženo) mezi těmito dvěma sekvencemi. Analýza přínosu, který každý z těchto rozdílů v rámcovém úseku protilátky může mít na vazbu antigenu, identifikovala 2 zbytky pro výzkum, byly v polohách 46 a 60. Na základě této analýzy byly konstruovány dvě verze CDR-roubovaného lehkého řetěz. V první z nich, hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č. 8), zbytky 46 a 60 pocházejí 39 ·· *· ·· ♦ »·· ·· ·# 9 « · 9 9 · «999 • 9 999 · · · 9 9 · 99 9994 z hTNF40 lehkého řetěz, zatímco ve druhé, hTNF40-gL2 (SEKV. ID. Č. 9), všechny zbytky jsou humánní kanonické kromě zbytku č. 60, který je z hTNF40 lehkého řetězce.
Konstrukce CDR-roubovan lehkého řetězce hTNF40-gLl
Konstrukce hTNF40-gLl je detailně uvedena níže. Následující překrývající se oligonukleotidy (P7982-P7986) byly použity v polymerázových řetězových reakcích (PCR) k sestavení zkráceného roubovaného lehkého řetězce. Sestavený fragment postrádá protilátkovou vedoucí sekvenci a prvních 17 aminokyselin rámce 1. oligo 1 P7982: 5 ' GAAT T CAGGGT CAC CAT CAC T T GTAAAGC CAGT CAGAACGTAGGTACTAAC GTAGCCTGGTATCAGCAAA31 (SEKV. ID. Č. 52) oligo 2 P7983: 5 ’ ATAGAGGAAAGAGGCACT GTAGATGAGGGCT TT T GGGGCT T TACCTGGTTT TTGCTGATACCAGGCTACGT3' (SEKV. ID. Č. 53) oligo 3 P7984: 5' TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCG GTAGTGGTACTGATTTCAC3' (SEKV. ID. Č. 54) oligo 4 P7985: 5 ' GACAGTAATA, AGTGGCGAAAT CTT CTGGCTGGAGGCTACTGATCGTGAGGGT GAAATCAGTACCACTACCG3' (SEKV. ID. Č. 55) oligo 5 P7986: 5 ' AT T T C GC CAC T TAT TACTGT CAACAGTATAACAT CTACC CACT CACATTCGGT CAGGGT ACTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3' (SEKV. ID. Č. 56) Μ ·♦ ·· *··· ·· ·φ ♦ ♦ · ♦ ♦ · « « · * • · ··♦ · · · · · · ♦ ······ ···· · • · · · ···· ··· ·♦ ·♦ «· ·· ·♦ ·»·· 40
Fwd Ρ7981: 5’ GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3' (SEKV. ID. Č. 57)
Bwd P7980 5' GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3' (SEKV. ID. Č. 58), PCR reakce v objemu 100 μΐ obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 2 pmol P7982, P7983, P7984, P7985, P7986, 10 pmol P7980, P7981 a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94°C po dobu 1 minuty, 55°C po dobu 1 minuty a 72°C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla každá reakce analyzována elektroforézou na agarózovém gelu a PCR fragment byl z gelu vyříznut a znovu získán s použití soupravy Mermaid Kit. Získaný fragment byl štěpen enzymy BstEII a SplI v příslušném pufru. Výsledný produkt byl nakonec podroben elektroforéze na agarózovém gelu a z gelového řezu byl opět získán DNA fragment o velikosti 270 párů baží a byl ligován do vektoru CTIL5-gL6 (obrázek 12), který byl dříve štěpen stejným enzymem. Výše uvedený vektor poskytuje chybějící protilátkovou vedoucí sekvenci a prvních 17 aminokyselin rámce 1.
Ligační směs byla použita pro transformaci kmene LM1035 E. coli a výsledné kolonie byly analyzována pomocí PCR, štěpením restrikčními enzymy a nukleotidovým sekvencovánim. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence VI úseku hTNF40-gLl je ukázána na obrázku 8 (SEKV. ID. Č. 8).
Konstrukce CDR-roubovaného lehkého řetězce hTNF40-gL2 hTNF40-gL2 (SEKV. ID. Č. 9) byl konstruován s použitím PCR. Pro zavedení aminokyselinových změn byly použity následující oligonukleotidy: ·· ·«·· • · · · · · ···· ····· · · · · · · ···♦··· · · · · · • · · · · · · · ··· ·♦ ·· ·· ·· ·· ··«· 41 R 1053: 5' GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEKV. ID. Č. 59) R5 3 5 0 : 5 ' TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTT TGATGCAGCATAGAT CAGGAGCTTAGGAGC3' (SEKV. ID. Č. 60) R5 3 4 9: 5'GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCA GGCACAGACTTTACCCTAAC3' (SEKV. ID. Č. 61) R684: 5'TTCAACTGCTCATCAGAT3' (SEKV. ID. Č. 62)
Dvě reakce, každá po 20 μΐ, obsahovaly po 10 niM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 itiM MgCl2, 50 mM KC1, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 0,1 μς hTNF40-gLl, 6 pmol R1053/R5350 nebo R5349/R684 a 0,25 jednotky Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94°C po dobu 1 minuty, 55°C po dobu 1 minuty a 72°C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla každá reakce analyzována elektroforézou na agarózovém gelu a PCR fragment byl z gelu vyříznut a znovu získán s použití soupravy Mermaid Kit.
Alikvoty těchto reakcí byly poté podrobeny druhému kolu PCR. Reakce 100 μΐ obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM
MgCl2, 50 mM KC1, 0,01 % (hmotnost/objem) želatiny, 1/5 každého PCR fragmentu z první sady reakcí, 30 pmol R1053 a R684 a 2,5 jednotky Taq polymerázy. Reakční teploty byly uvedeny výše. Po PCR byla směs extrahována směsí fenolu a chloroformu, a poté chloroformem a precipitována ethanolem. Ethanolový precipitát byl znovu získán centrifugací, rozpuštěn v příslušném pufru a štěpen enzymy BstEII a SplI. Výsledný produkt byl nakonec podroben elektroforéze na agarózovém gelu a z gelového řezu byl opět získán DNA fragment o velikosti 20 párů baží a byl ligován do vektoru pMR15.1 (obrázek 4), který byl dříve štěpen stejným enzymem. ·· 44 ·· ··#· ·♦ ·♦ • · · · · ♦ 4 4 4 4 ♦ ♦ 4*4 » « « · ♦ 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 44 44 ·« »· ·· 4444 42
Ligační směs byla použita pro transformaci kmene LM1035 E. coli a výsledné kolonie byly analyzována pomoci PCR, štěpením restrikčními enzymy a nukleotidovým sekvencováním, Nukleotidová a aminokyselinová sekvence VI úsek hTNF40-glL2 je ukázána na obrázku 9 (SEKV. ID. Č. 9). CDR-roubování hTNF40 těžkého řetězce CDR-roubování hTNF40 těžkého řetězce bylo uskutečněno s použitím stejné strategie, jak byla popsána pro lehké řetězce.
Bylo zjištěno, že hTNF4Q těžkého řetězce je většinou homologní s humánními těžkými řetězci patřícími k podskupině 1, a tudíž kanonická sekvence čtecích rámců humánní podskupiny 1 byl vybrán pro přijetí CDR z hTNF4Q těžkého řetěz.
Pro zkoumáni podmínek, aby homologní humánní rámec fungoval jako příjemcovský rámec pro CDR roubování, byl vybrán druhý rámec z humánní skupiny 3 pro humanizaci hTNF4Q těžkého řetězce,
Srovnání hTNF40 se dvěma odlišnými úseky rámce je ukázáno na obrázku 2, kde je možné vidět, že hTNF4Q se liší od kanonické humánní podskupiny 1 v poloze 32 (podtrženo) a od kanonické humánní podskupiny 3 se liší v poloze 40 (podtrženu). Po analýze příspěvku k tomu, že každý z nich může vázat antigen, byly zbytky 28, 38, 46, 67, 69 a 71 zachovány jako dárcovské v CDR-roubovaném těžkém řetězci ghlhTNF40,l, s použitím rámce skupiny 1, Zbytky 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 7 6 a 7 8 byly zachována jako dárcovské v CDR-roubovaném těžkém řetězci, gh3hTNF40,4, s použitím rámce skupiny 3, Zbytky 28, 69 a 71 byly udrženy jako dárcovské v CDR-roubovaném těžkém řetězci, ghlhTNF40,4 s použitím rámce skupiny 1. 43 « 9 #*» Mtl «· 99 9 9 # • 9 • • 9 9 9 9 • • • • 9 9 9 9 • • · <4 • • n 9 9 9 9 • • Φ ♦ • • • · 9 9 9 99 ♦ ♦ ·« • 9 99 99*9
Konstrukce CDR-roubovaného těžkého řetězce ghlhTNF40.4 ghlhTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 1,0) byla sestavena pomocí překrývajících se oligonukleotidů metodou PCR v přítomnosti příslušných primerů. V PCR byly použity následující oligonukleotidy:
Roub skupiny 1 oligo 1 P7989: 5 ' GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAG AGTGCACGAATTC3’ (SEKV. ID. Č. 63) oligo 2 P7990: 5' GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGCTAC GTGTTCACAGACTATGGTA3' (SEKV. ID. Č. 64) oligo 3 P7991: 5' CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTCATAC CATAGTCTGTGAACACGT3' (SEKV. ID. Č. 65) oligo 4 P7995: 5' GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEKV. ID. Č. 66) oligo 5 P7992: 5' CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3' (SEKV. ID. Č. 67) oligo 6 P7993: 5 ' C CACAAGCACT GCATACAT GGAGCTGT CAT CT CT GAGAT CCGAGGACACCGC AGTGTACTAT3' (SEKV. ID. Č. 68) 44 9 4 • · 9«·· : : • I f • 4 4Λ • 99 «1
oligo 7 P7994: 5' GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAG CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3' (SEKV. ID. Č. 69)
Fwd: P7988: 5'GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGC'TGGTC3' (SEKV. ID. Č. 70)
Bwd P7 987: 5 ’ GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEKV. ID. Č. 71)
100 μΐ reakce obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM
MgCl2, 50 mM KC1, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 2 pmol každého z p7989, p7990, p7991, p7995, p7992, p7993 a p7994, 10 pmol každého z p7988 a p7987 a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72°C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla reakce extrahována směsi fenolu a chloroformu (1/1), poté chloroformem a precipitována ethanolem. Po centrifugaci byla DNA rozpuštěna v příslušném restrikčním pufru a štěpena ApaLI a KpnI. Výsledný fragment byl izolován z agarózového gelu a ligován do pMR14 (obrázek 5), který byl dříve štěpen stejným enzymem. pMRl4 obsahují humánní gama 4 konstantní úseky těžkého řetězce. Když pMR14 je štěpen ApaLI a KpnI, naštěpený vektor je schopný přijmout štěpenou DNA tak, že 3' konec štěpené DNA se ve čtecím rámci spojí s 5' koncem sekvence kódující konstantní úsek gama 4. Tudíž těžký řetězec exprimovaný tímto vektorem má izotyp gama 4. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli LM1035 a výsledné bakteriální kolonie byly podrobeny screeningu restrikčním štěpením a analýze nukleotidovým sekvencováním. Takto byl identifikován plazmid obsahující správnou sekvenci pro ghlhTNF40.4 (obrázek 10) (SEKV. ID. Č. 10). 9 45 Λ · 9 45 Λ · • ·· .: í I · • · 9 1 · · • · 4> ·# · ·
Konstrukce CDR-roubovaného těžkého řetězce gh3hTNF40.4 gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11) byla sestavena podrobením překrývajících se oligonukleotidů metodou PCR v přítomnosti příslušných primerů. V PCR byly použity následující oligonukleotidy:
Roub skupiny 3 oligo 1 P7999: 5' GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCTCAG AGTGCACGAATTC3’ (SEKV. ID. Č. 72) oligo 2 P8000: 5' TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCTGGTTACG TCTTCACAGACTATGGAA3' (SEKV. ID. Č. 73) oligo 3 P8001: 5 T CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTCATTC CATAGTCTGTGAAGACGT3' (SEKV. ID. Č. 74) oligo 4 P7995: 5 ' GGC CT GAAAT GGAT GGGT T GGAT T AATACT T ACAT T GGAGAGC CT AT T T AT GT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEKV. ID. Č. 66) oligo 5 P7997: 5' GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3' (SEKV. ID. Č. 75) oligo 6 P7998: 5' CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCGC AGTGTACTAT3' (SEKV. ID. Č. 76) 46 46 ·· t t t * • « *
• * · t · · ·· M : .· i r • · · · ♦ * • * · · · · ** · · · · · » · oligo 7 P7993: 5' GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAG CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3' (SEKV. ID. Č. 77)
Fwd P7996: 5' GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3' (SEKV. ID. Č. 78)
Bwd P7987: 5' GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEKV. ID. Č. 71)
100 μΐ reakce obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM
MgCl2, 50 mM KC1, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 2 pmol každého z p7999, p8000, p8001, p7995, p7997, p7998 a p7993, 10 pmol každý p7996 a p7987 a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94°C po dobu 1 minuty, 55°C po dobu 1 minuty a 72°C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla reakce extrahována směsi fenolu a chloroformu (1/1), poté chloroformem a precipitována ethanolem. Po centrifugaci byla DNA rozpuštěna v příslušném restrikčním pufru a štěpena ApaLI a KpnI. Výsledný fragment byl izolován z agarózového gelu a ligován do pMR14 (obrázek 5), který byl dříve štěpen stejným enzymem. pMR14 obsahují humánní gama 4 konstantní úseky těžkého řetězce. Když pMRl4 je štěpen ApaLI a KpnI, naštěpený vektor je schopný přijmout štěpenou DNA tak, že 3' konec štěpené DNA se ve čtecím rámci spojí s 5' koncem sekvence kódující konstantní úsek gama 4. Tudíž těžký řetězec exprimovaný tímto vektorem má izotyp gama 4. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli LM1035 a výsledné bakteriální kolonie byly podrobeny screeningu restrikčním štěpením a analýze nukleotidovým sekvencováním. Takto byl identifikován plazmid obsahující správnou sekvenci pro gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11) (obrázek 11). 47 47 9 9 9 9 ·t 9« * I · • 9 9 9· • · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 · · 4 « • · 9 * 9 9 9 « 9 9 9 9 · 9 *
Produkce CDR-roubovaného modifikovaného Fab Fragmentu CDR-roubovaný modifikovaný Fab fragment, založený na protilátce hTNF40, byl konstruován s použitím E. coli vektoru pTTO-1. Variabilní úseky protilátky hTNF40 byly subklonovány do tohoto vektoru a intergenové sekvence byly optimalizovány za vzniku pTTO(CDP870). pTTO expresní vektor byl navržen za vzniku rozpustné periplazmatické akumulace rekombinantních proteinů v E. coli. Hlavní charakteristické vlastnosti tohoto plazmidu jsou: (i) markér rezistence na tetracyklin - přičemž antibiotikum není inaktivováno produktem genu rezistence, proto je udržována selekce buněk obsahujících plazmid, (ii) nízký počet kopií - počátek replikace pocházející z plazmidu pl5A, který je kompatibilní s plazmidy obsahujícími replikony pocházející z colEl, (iii) silný indukovatelný tac promotor pro transkripci klonovaného genu(ů), (iv) laclq gen - propůjčuje konstitutivní exprese lac represorového proteinu, udržujícího tac promotor v reprimovaném stavu až do indukce s IPTG/allolaktózou, (v) OmpA signální sekvence - zajišťuje periplazmatickou sekreci klonovaného genu(ů), a (vi) translační připojení OmpA signální sekvence ke krátkému lacZ peptidu, zajišťující účinnou iniciaci translace.
Vektor byl vyvinut pro expresi modifikovaných Fab fragmentů z dicistronové mRNA tak, že byla navržena metoda pro empirický výběr optimální intergenové sekvence ze série 4 cíleně připravených kazet. Použití je popsáno při konstrukci pTTO(CDP870). ·· '*♦ ·· ···· ·· # · · · 9 · φ « » f t · β ·· · · φ » φ m * ·· *·« · « * · · ψ • · Φ Φ * Φ « Φ Φ Φ Φ ·* ·* ·f Φ« φφ Φφ·« 48
Materiál a metody Techniky DNA
Standardní postupy byly použit pro protokoly zahrnující DNA restrikci, elektroforézu na agarózovém gelu, ligaci a transformaci. Restrikční enzymy a DNA modifikující enzymy byly získány od firem New England Biolabs nebo Boehringer Mannheim a byly použity podle doporučení výrobce. DNA fragmenty byly purifikovány z agarózy s použitím protokolu GeneClean (BIO 101). Oligonukleotidy byly dodány firmou Oswel Oligonukleotid Service a byly syntetizovány v měřítku 40 nM. Plazmidová DNA byla izolována s použitím souprav Plazmid DNA Mini/Midi od firmy Qiagen. PCR bylo prováděno s použitím Perkin Elmer „Amplitaq" dle doporučení. DNA sekvencování bylo prováděno s použitím soupravy pro sekvencování Applied Biosystem Taq cycle.
Indukce v třepaných baňkách E. coli W3110 kultury byly pěstovány v médiu L-broth doplněném tetracyklinem (7,5 g/ml). Pro indukce byly čerstvé přes noc rostoucí kultury (pěstované ve 30°C) naředěny na OD6oo 0,1 do 200 ml L-broth ve 2 1 kultivačních baňkách a byly pěstovány ve 30 °C v orbitálním inkubátoru. Při OD60o 0,5 byl přidán IPTG do koncentrace 200 μΜ. V intervalech byly odebírány vzorky (normalizované dle OD).
Periplazmatická extrakce
Vzorky kultury byly ochlazeny na ledu (5 minut), a poté byly buňky sklizeny centrifugací. Po resuspendování v extrakčním pufru (100 mM Tri HC1, 10 mM EDTA, pH 7,4) byly vzorky inkubovány přes noc ve 30 °C, a poté vyčištěny centrifugací. 49 • » • ·· * • · * » » · * • · · •· ···! • · • · · t· « « · t • · * » Ϊ * · · f · * » * ·
Test sestavení
Koncentrace modifikovaných Fab byly určovány pomocí testu ELISA. Destičky byly potaženy ve 4 °C přes noc s anti-humánní Fd 6045 (2 μς/ιπΐ ve vazebném pufru, fyziologický roztok, 100 μΐ na jamku). Po promytí byly jamky plněny 100 μΐ vzorku, jako standard byl použit purifikovaný A5B7 gama-1 Fab', původně v koncentraci 2 μρ/πιΐ. Vzorky byly sériově naředěny 2 krát napříč přes destičku konjugačním pufrem (na 1 litr: 6,05 g trisaminomethanu, 2,92 g NaCl, 0,1 ml Tween-20, 1 ml kaseinu (0,2%)), destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, s třepáním. Destičky byly promyty'a usušeny, a poté bylo přidáno 100 μΐ anti-humánní C-kappa (GD12)-peroxidázy (naředěno v konjugačním pufru), Inkubace byla prováděna při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny s třepáním. Destičky byly promyty a usušeny, a poté bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu (10 ml roztoku acetát sodný/citrát (0,1M pH 6), 100 μΐ roztoku H202, 100 μΐ roztoku tetramethylbenzidinu (10 mg/ml v dimethylsulfoxidu)). Absorbance v 630 nm byla odečítána 4 až 6 minut po přidání substrátu.
Konstrukce plazmidu pTTO-1 (a) nahrazení pTTQ9 polylinkeru
Plazmid pTTQ9 byl získán od firmy Amersham a je ukázán na obrázku 14, Alikvot (2 μρ) byl štěpen restrikčními enzymy Sáli a EcoRI, štěpný produkt byl puštěn na 1% agarózovém gelu a velký DNA fragment (4520 bp) byl purifikován. Byly syntetizovány dva oligonukleotidy, které po společném nasednutí kódují úsek OmpA polylinkeru ukázaný na obrázku 15, Tato sekvence má kohezivní konce, které jsou kompatibilní se Sáli a EcoRI konci vytvořenými restrikcí pTTQ9. Klonováním této oligonukleotidové 'kazety' do pTTQ9 vektoru nebylo regenerováno místo Sáli, ale místo EcoRI bylo udrženo. Kazeta (ί· ·· · · · · · ♦ ·· »· • · ♦ ·» · t » * ♦ * * »·· I * « ·» t Ϊ· · ·*· · 4 · · · ♦ • 4 « · · * · · * · «· Μ · · 4f ·· ···· 50 kóduje prvních 13 aminokyselin signální sekvence E. coli proteinu Omp-A vnější membrány, předcházených Shine-Dalgarno vazebným místem pro ribozom OmpA genu. Kromě toho jsou přítomna restrikční místa pro enzymy Xbal, MunI, Styl a SplI.
MunI a Styl místa jsou v kódujícím úseku OmpA signální sekvence a jsou zamýšlena jako 5' klonovací místa pro inzerci genů. Dva oligonukleotidy, které vytváří tuto kazetu, byly spojeny dohromady smícháním v koncentraci 5 pmol/μΐ a zahříváním ve vodní lázni na 95 °C po dobu 3 minut, a poté pomalým ochlazením na teplotu místnosti. Spojená sekvence pak byla ligována do pTTQ9 štěpeného Sall/EcoRI. Výsledný plazmidový meziprodukt, nazvaný pTQOmp, byl ověřen pomocí DNA sekvencování. (b) Příprava a ligace fragmentu
Plazmid pTTO-1 byl konstruován ligací jednoho DNA fragmentu z plazmidu pACYC184 ke dvěma fragmentům vytvořeným z pTQOmp. Plazmid pACYC184 byl získán od firmy New England Biolabs a restrikční mapa je ukázána na obrázku 16. Alikvot (2 μρ) byl štěpen do úplnosti restrikčním enzymem Styl, a pak podroben působení nukleázy z fazolí mungo, což vytvořilo slepé konce odstřižením 5' báze přesahů. Po fenolové extrakci a ethanolové precipitaci byla DNA štěpena enzymem PvuII, za vytvoření fragmentů o velikosti 2348, 1081, 412 a 403 bp. fragment o velikosti 2348 bp byl purifikován po elektroforéze na agarózovém gelu. Tento fragment kóduje markér rezistence na tetracyklin a pl5A počátek replikace. Fragment pak byl podroben působení alkalické fosfatázy z telecího střeva, aby se odstranily 5' koncové fosfáty, a tím se této molekule zabránilo v ligaci sama k sobě.
Alikvot (2 μg) plazmidu pTQOmp byl štěpen enzymem SspI a EcoRI a fragment o velikosti 2350 bp byl purifikován z nežádoucích fragmentů o velikosti 2040 bp a 170 bp po elektroforéze na agarózovém gelu, tento fragment kóduje úsek transkripčního terminátoru a gen laclq. Další alikvot (2 μρ) pTQOmp byl štěpen s EcoRI a XmnI, za vzniku fragmentů o velikosti 2289, 1670, 350 a 250 bp. Fragment o velikosti 350 bp, kódující tac promotor, OmpA signální sekvenci a multiklonovací místo, byl purifikován přes gel. Tři fragmenty byly poté ligovány s použitím přibližně ekvimolárního množství každého fragmentu za vzniku plazmidu pTTO-1. Všechna klonovací spojení byla ověřena pomocí DNA sekvencování. Restrikční mapa tohoto plazmidu je ukázána na obrázku 17. Plazmid pTTO-2 byl pak vytvořen inzercí DNA kódující konstantní doménu lehkého řetězce kappa humánního Ig. Ta byla získána jako SplI - EcoRI restrikční fragment z plazmidu pHC132 a vložena na odpovídající místa v pTTO-1. Plazmid pTTO-2 je ukázán na obrázku 18.
Inzerce humanizovaných hTNF40 variabilních úseků do pTTO-2
Variabilní úsek lehkého řetězce hTNF40gLl (SEKV. ID. Č. 8) byl získán pomocí PCR „záchrany" z odpovídajícího vektoru pro expresi v savčích buňkách pMRlO.l. OmpA vedoucí sekvence nahradila nativní Ig vedoucí sekvenci. Sekvence PCR primerů je ukázána níže: 5' primer: CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAG CTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC (SEKV. ID. Č. 79) 3' primer: TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEKV. ID. Č. 80)
Po PCR ve standardních podmínkách byl produkt purifikován, štěpen enzymy MunI a SplI, a poté purifikován přes gel. Purifikovaný fragment byl poté vložen do MunI/SplI míst v pTTO-2 za vzniku meziproduktu lehkého řetězce pTTO(hTNF40L). 4 0 · * 0 0 9 0·0 ·· «· 0 9 9 9 9 9 9 4 9 9 9 9 0 00 0 0 9 9 0 9 0 9 0 9 9 9 · 0 4 4 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 09 99 9-9 09 9990 52
Variabilní úsek těžkého řetězce gh3hTNF40.4 byl získán stejným způsobem z vektoru pGamma-4. Sekvence PCR primerů je ukázána níže: 5' primer: GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAG CTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC (SEKV. ID. Č. 81) 3' primer: GCCTGAGTTCCACGACAC (SEKV. ID. Č. 82)
Po PCR byl produkt purifikován, štěpen enzymy Nhel a Apal, a poté byl subklonován do vektoru pDNAbEng-Gl (obrázek 19). Po ověření pomocí DNA sekvencování byl těžký řetězec štěpen enzymem EcoRI a subklonován do EcoRI místa v pTTO(hTNF40L) za vzniku E. coli expresního plazmidu pTTO(hTNF40).
Optimalizace intergenové sekvence pro expresi modifikovaného Fab
Ve vektoru pTTO nastává exprese modifikovaného Fab z dicistronické RNA kódující nejdříve lehký řetězec, a poté těžký řetězec. DNA sekvence mezi těmito dvěma geny (intergenová sekvence, IGS) může ovlivnit stupeň exprese těžkého řetězce působením na rychlost iniciace translace. Například krátká intergenová sekvence může mít za následek translační spojení mezi lehkými a těžkými řetězci, ve kterém translační ribozom nemusí plně disociovat z mRNA po ukončení syntézy lehkého řetězce před iniciací syntézy těžkého řetěz. „Síla" jakéhokoliv vazebného Shine-Dalgarnova (SD) místa ribozomu (homologie s 16 rRNA) může mít také vliv, stejně jako vzdálenost a složení sekvence mezi SD a ATG startovacím kodonem. Potenciální sekundární struktura mRNA kolem ATG je další důležitý faktor, ATG by měl být v „kličce" a ne stísněný v „stonku", zatímco pro SD to platí opačně. Tak modifikací složení a délky IGS je možné modifikovat sílu iniciace 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ft · · • t · · · · · 9 « · · · f * · 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 ·· *· * » < * • ♦ · 9 9 9 9 Ψ Φ 9 Φ ΦΦΦφ 53 translace, a tudíž stupeň produkce těžkého řetěz. Je pravděpodobné, že pro maximalizaci exprese těžkého řetězce daného modifikovaného Fab je nutné dosáhnout optimální rychlosti iniciace translace. Například, pro jeden modifikovaný Fab může být tolerován vysoký stupeň exprese, ale pro odlišný modifikovaný Fab s odlišnou aminokyselinovou sekvencí se ukáže vysoký stupeň exprese jako toxický, možná pro odlišnou účinnost sekrece nebo skládání. Z tohoto důvodu byly navrženy série čtyř intergenových sekvencí (obrázek 20) umožňujících empirické stanovení optimálních IGS pro modifikovaný Fab založený na hTNF40. IGS1 a IGS2 mají velmi krátké intergenové sekvence (-1 a +1, v daném pořadí) a je možné očekávat vznik těsně spojené translace, SD sekvence (podtrženo) jsou slabě odlišné. Tyto dvě sekvence s největší pravděpodobností propůjčují vysoký stupeň iniciace translace. IGS3 a IGS4 mají delší vzdálenost mezi startovacím kodonem a stop kodonem ( + 13) a liší se ve složení svých sekvencí, IGS3 má „silnější" SD sekvence. Všechny sekvence byly studované na výskyt sekundární struktury (s použitím programu m/fold) a „optimalizovány" co možná nejvíce, ale, při těsném spojení translace dvou řetězců chybění ribozomální disociace znamená, že mRNA nemusí být „nahá", aby se zabránilo vytvoření sekundární struktury.
Klonování IGS variant IGS kazety ukázané na obrázku 20 mají hraniční klonovací místa Sací a MunI. Byly vytvořeny nasednutím komplementárních oligonukleotidových párů. Vektorový fragment byl připraven štěpením pTTO(hTNF40) enzymy Sací a Notl a fragment těžkého řetězce byl připraven štěpením pDNAbEngGl (hTNF40H) enzymy MunI a Notl. Poté byly prováděn troj čestné ligace s použitím ekvimolárních množství dvou restrikčních fragmentů a přibližně 0,05 pmol každé spojené oligokazety. Tak vznikly čtyři «· ·| ·· ·#·♦ «· t« « · · I · · · · · · ····· · · · t · t • · · « » 9 · · · · · · • · « · · » « · 9·· »· *» ·· *♦ f · ···» 54 expresní plazmidy pTTO(hTNF40 IGS-1), pTTO(hTNF40 IGS-2), pTTO(hTNF40 IGS-3), pTTO(hTNF40 IGS-4).
Expresní analýza při kultivaci v třepaných baňkách Čtyři plazmidy byly transformovány do kmene W3110 E. coli, spolu s původním expresním konstruktem, a poté byla analyzována jejich exprese v třepaných baňkách, jak bylo popsáno. Výsledky typického pokusu jsou ukázány na obrázku 21. Odlišné intergenové sekvence propůjčují odlišné expresní profily. IGS1 a IGS2 akumulují periplazmatické modifikované Fab rychle s vrcholem 1 hodinu po indukci, po kterém dosažená hladina padá. Pro IGS1 je vrchol větší a padá ostřeji. Tyto výsledky jsou souhlasné s vysokým stupněm syntézy, jak je očekáváno pro těsné translační spojení u těchto konstruktů. IGS1 zjevně propůjčuje vyšší stupeň exprese těžkého řetězce než IGS2. V tomto případě se zdá, že tento vysoký stupeň exprese je špatně tolerován, protože periplazmatické hladiny exprese padají po 1 hodině vrcholu. To lze pozorovat na růstovém profilu IGS1 kultury (není ukázáno), který vrcholí 1 hodinu po indukci před poklesem svědčícím pro buněčnou smrt a lýzi. IGS3 akumuluje modifikovaný Fab pomaleji, ale vrcholí 2 hodiny po indukci s vyšší hodnotou vrcholu (325 ng/ml/OD) předtím, než se hladiny sníží. Růst této kultury pokračoval 3 hodiny po indukci a dosáhl vyššího vrcholu biomasy (neukázáno). To je v souhlase s nižším stupněm syntézy těžkého řetěz. IGS4 akumuluje materiál ještě pomaleji a nezdaří se mu dosáhnout vysoký vrchol produktivity dalších 3 konstruktů. Všechny IGS varianty významně překonaly původní vektor.
Hypotéza, že odlišné IGS sekvence propůjčují odlišnou rychlost iniciace translace je podporována těmito experimentálními výsledky. Zdá se, že pro modifikovaný Fab založený na hTNF40 je vysoká rychlost iniciace translace těžkého řetězce špatně tolerována a není tudíž optimální. Pomalejší rychlost 55 55 « · Μ ·· ··♦· »»
• · · I · * I ····* » · * *« • ·· ··· · ♦«· · ···* ·#*· ·· ·« · · ·· * · · · propůjčená IGS3 má za následek lepší růstové charakteristiky a proto v průběhu času akumuluje lepší výtěžek.
Po srovnání produktivity ve fermentoru byl IGS3 konstrukt vybrán jako poskytující nejvyšší výtěžek a byl nazván pTTO(CDP870) - viz obrázek 22. Těžký řetězec kódovaný plazmidem pTTO(CDP870) má sekvenci označenou jako SEKV. ID. C. 115 a lehký řetězec má sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 113.
PEGylace CDR-roubovaného, modifikovaného Fab založeného na hTNF4Q
Purifikcvaný modifikovaný Fab je místně specificky konjugován s rozvětvenou molekulou PEG. Tím je dosažena aktivace jednoho cysteinového zbytku ve zkráceném kloubovém úseku modifikovaného Fab, pak následuje reakce s (PEG)-lysyl-maleimidem, jak bylo popsáno už dříve (A.P. Chapman a kol., PEGylovaná molekula Μπ+·η ro Dí Γι+όοΊ^γιλΙ ^ Cl \ 7 1 *~7 H Q Π — *7 Q “D 1GGQ\ je ukázána na obrázku 13 a je nazývána sloučenina CDP870. Účinnost PEGylovaného CDR-roubovaného modifikovaného Fab založeného na hTNF40 (CDP870) v léčbě revmatoidní artritidy CDP870 má biologický poločas dlouhý přibližně 11 dnů. Původci hodnotili bezpečnost a účinnost intravenózně podávané CDP870 v randomizované dvojitě slepé klinické zkoušce s placebem a stoupající kontrolovanou dávkou u pacientů s RA.
Metody Pacienti:
Pacienti ve věku mezi 18 a 75 lety a ti, kteří splnili diagnostická kritéria pro revmatoidní arthritidu (RA) revidovaná v roce 1987 American College Rheumatology (ACR) (Arnett al., Arthriti DV| 0 31. ei iqbbi byli získáváni z ambulance revmatcl ogické kliniky v Len dýně, 56 • · ·« # · * « · · · · • · · • ι « ·· *· ·* ···» ·· ·» • · · * * ♦ · • · · • · · • · *·* *
Cambridgi, Norfolku a Norwichi (Spojené království). Byli požadováni pacienti, kteří měli klinicky aktivní nemoc, což bylo definováno tak, že měli alespoň 3 z následujících kritérií: > 6 bolestivých nebo citlivých kloubů, á 45 minut trvající ranní ztuhlost a rychlost sedimentace červených krvinek (ESR) á 28 mm/hodinu. Pacienti dále nereagovali na léčbu alespoň jedním lékem modifikujícím průběh revmatických nemocí (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug - DMARD) a byli bez léčby po dobu nejméně 4 týdnů. Užívání kortikosteroidů bylo povoleno, jestliže dávka byla á 7,5 mg/den prednisolonu. Těhotné ženy, kojící ženy a ženy ve fertilním věku neužívající účinnou metodu kontracepce byly vyloučeny. Pacienti byly také vyloučeni, jestliže měli v anamnéze malignitu, současné závažné nekontrolované chorobné stavy, předešlou terapii neutralizující TNFa, která selhala, nebo alergii na polyethylenglykol. Před zapsáním do studie byl od každého pacienta získán psaný souhlas. Studie byla schválena místní etickou komisí pro vědu. Léčebný protokol: 36 pacientů s RA bylo rozděleno do 3 skupin, které dostávaly stoupající dávku zkoušeného léčiva (1, 5 nebo 20 mg/kg). Každá skupina po 12 byla náhodně rozdělena na 8 pacientů, kteří dostávali CDP870 a na 4 pacienty, kteří dostávali placebo. CDP870 byla podávána jako jedna intravenózní infúze (100 ml celkem) po dobu 60 minut. Placebo (pufr acetát sodný) bylo podáváno podobně, jako jedna intravenózní infúze o objemu 100 ml po dobu 60 minut. Léčba byla podávána ambulantně. Po 8 týdnech měli všichni pacienti otevřenou možnost dostat infúzi buď 5 nebo 20 mg/kg CDP870. Klinické vyhodnocení:
Aktivita RA byla hodnocena na základě kritérií World Health Organization a International League of Associations for • · • · ·· ··«! 57
Rheumatology (Boers a kol., J. Rheumatol., Supplement, 41, 8 6-89, 1994) a European League Against Rheumatism (EULAR) (Scott a kol., Clin. Exp. Rheumatol., 10, 521-525, 1992) s hodnocením souboru dat získaných z 28 kloubů. Změny v aktivitě nemoc byly hodnoceny pomocí stupnice pro aktivitu nemoci (Prevoo a kol., Arthritis Rheum., 38, 44-48, 1995) a kritérií ACR (Felson a kol., Arthritis Rheum., 38, 727-735, 1995). Hodnocení se provádělo před léčbou a 1, 2, 4, 6 a 8 týdnů po léčbě. U pacientů byla také hodnocena bezpečnost a tolerance studovaného léčiva. Při každé vizitě byly hodnoceny hematologické a biochemické parametry a anti-CDP870 protilátky a vedlejší účinky.
Plazmatická koncentrace CDP870 a anti-CDP870 protilátek CDP870 byla měřena enzymatickým imunotestem (ELISA). Sériová ředění plazmy pacientů byla inkubována na mikrotitrační destičce (Nunc) potažené rekombinantním humánním TNFa (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Zachycená CDP870 byla detekována kozí anti-humánní protilátkou, specifickou pro lehký řetězec kappa, konjugovanou s křenovou peroxidázou (Cappel, ICN), následovanou přidáním tetramethylbenzidinu (TMB) jako substrátu. S protilátkami k CDP870 byl prováděn screening (s ředěním plazmy 1/10) s použití „sendvičového" testu ELISA s dvojím antigenem s biotinylovanou CDP870 jako druhou vrstvou. Navázané protilátky byly detekovány s použitím HRP-streptavidinu a substrátu TMB. Test byl kalibrován s použitím hyperimunitního králičího standardního IgG. Jednotka aktivity je totožná s 1 μ g králičího standardu.
Statistická analýza
Studie měla výzkumný charakter a velikost vzorku byla založena na předešlé zkušenosti s podobnými přípravky. ·· • · ·« ♦ · ···· ·»· Φ m · · · · · • · ♦ ·· ♦ · · ·· · • · · · ♦ * · ··· · · ···· ···· · · · ·· ·* *· ·· · · ·· · · 58 Účinnost CDP870 byla analyzována vypočtením skóre aktivity nemoci (DAS) a reakcí ACR20/50 na léčebný záměr a na protokol s použitím neměnného testovacího postupu. Skóre aktivity nemoci bylo vypočteno takto: DAS = 0,555 x druhá odmocnina (28 citlivých kloubů) + 0,284 x druhá odmocnina (28 oteklých kloubů) + 0,7 x In(ESR) + 0,0142 x (pacientovo celkové hodnocení). Nejdříve byly sloučené aktivní skupiny porovnány . s placebem. Jestliže toto srovnání bylo významné na 5% hladině, každý dávkovaná skupina byla porovnána s placebem. Všechna srovnání byla dvoustranná s hladinou významnosti 5%. Všechny P-hodnoty pocházely z výzkumných analýz a neměly by být použity pro deduktivní interpretaci. Výsledky
Demografická situace:
Bylo získáno 36 pacientů s RA. Jejich demografické detaily jsou uvedeny v tabulce 6. Průměrný věk byl 56 let a 30 pacientů byly ženy. Průměrné trvání RA bylo 13 let a 21 pacientů mělo pozitivní revmatoidní faktor. Pacienti v odlišných skupinách měli podobné demografické charakteristiky. V období slepého dávkování 6/12 pacientů léčených placebem opustilo studii kvůli zhoršení RA ^ 4 týdny po začátku podávání dávky. 2/24 pacientů léčených CDP870 opustilo studii, oba ve skupině s dávkou 1 mg/kg, kvůli zhoršení RA/ztrátě pro další sledování > 4 týdny po začátku podávání dávky. Rozdíl byl statisticky významný (p=0,009, Fisherův přesný test). 59 59 ·· ···· «· ·· # ♦ ♦ · ·* ♦· • · · · ♦ • · · ·♦ ·· ·· ·· ·« ···«
Tabulka 6 Demografické detaily (průměr ± standardní odchylka) Počet Pohlaví Věk Trvání Revmatoidní Počet (M: ž) nemoci faktor dřívějších DMARD Placebo 12 1:11 51+8 12±8 8(67%) 5±1 1 mg/kg 8 1:7 59+7 12±7 4(0%) 4 + 1 5 mg/kg 8 2:6 54±13 13±5 5(63%) 5+2 20 mg/kg 8 2:6 61 + 11 14+13 4(50%) 4+2
Klinická účinnost:
Podíl pacientů se zlepšením ACR20 ve skupinách podle jednotlivých protokolů s posledním prováděným sledováním byl 16, 7, 50, 87,5 a 62,5% po placebu, 1, 5 a 20 mg/kg CDP870 (účinek kombinované léčby p=0,012) ve 4 týdnech a 16,7, 25, 75 a 75% (p=0,032) v 8 týdnech. Snížení skóre DAS (medián) ve skupinách podle jednotlivých protokolů s posledním prováděným sledováním bylo 0,15, 1,14, 1,91 a 1,95 po placebu, 1, 5 a 20 mg/kg CDP870 (účinek kombinované léčby p=0,001) ve 4 týdnech a 0, 31, 0,09, 2,09 a 1,76 (p=0, 008) v 8 týdnech (obrázek 23).
Změny v jednotlivých složkách souboru dat podle World Health Organization a International League of Associations for Rheumatology jsou ukázány na obrázku 24.
Po viditelně značené.dávce CDP870 bylo dosaženo podobného prospěšného účinku. Ze 36 pacient získaných do studie dostalo 32 pacientů druhou infúzi CDP870. Podíl pacientů se zlepšením ACR20 oproti období před první infúzi bylo 72,2 a 55,6% po 5 a 20 mg/kg CDP870 ve 4 týdnech a 55,6 a 66,7% v 8 týdnech. Výskyt vedlejších účinků Léčba byla dobře snášena bez reakcí spojených s podáváním infúze. Nebyla hlášena žádná alergická reakce nebo kožní «* ·· ·· *·♦· *· ·* • » « · · · »·*· • · ··· ψ · · · « · • ·· · · · · · · · · · ···· · · · · ··· ·· *· ·· «· ·· *··· 60 vyrážka. Ve dvojitě slepé fázi se vyskytlo 19, 38, 8 a 14 vedlejších účinků ve skupinách s placebem, 1, 5 a 20 mg/kg, v daném pořadí. Nejčastější byly bolesti hlavy s 9 epizodami u 5 pacientů (1 placebo, 3 ve skupině s dávkou 1 mg/kg, 1 ve skupině s dávkou 20 mg/kg). U jednoho pacienta, který dostával placebo a u 3 pacientů, kteří dostali CDP870 (1 ve skupině s dávkou 5 mg/kg a 2 ve skupině s dávkou 20 mg/kg), se objevily infekce dolních cest dýchacích. Byly označeny jako lehké nebo mírné. Byly léčeny perorálními antibiotiky a vyléčeny v průběhu období 1 až 2 týdnů. U tří pacientů ve skupinách s dávkou 1 a 5 mg/kg a u jednoho ve skupině s dávkou 20 mg/kg se objevila infekce močových cest 1 až 2 měsíce po léčení CDP870.
Jeden vedlejší účinek byl popsán jako vážný, byla to epizoda bolesti krční páteře, která se objevila 3 dny po infúzi s dávkou 1 mg/kg. U 4 pacientů bylo pozorováno zvýšení anti-nukleárních protilátek: u 1 ve skupině s placebem (negativní až 1/40), u 2 ve skupině s 1 mg/kg (negativní až 1/40, negativní až 1/80) a u 1 ve skupině 20 mg/kg (negativní až 1/40). Co se týče protilátek anti-DNA nebo anti-kardiolipinových protilátek, nebyla zjištěna žádná změna.
Plazmatická koncentrace CDP870 a hladina anti-CDP870
Jak bylo očekáváno u všech dávek CDP870, vrcholové plazmatické koncentrace se vyskytovaly na konci infúze a byly proporcionální podávané dávce, přičemž plazmatická koncentrace poté pomalu klesala. Profily plazmatických koncentrací CDP870 vypadaly velmi podobně profilům, které byly dříve pozorovány u dobrovolníků, kdy bylo vypočteno, že biologický poločas je přibližně 14 dnů. Při opětovném podání dávky byl pozorován podobný profil jako u infúze jedné dávky.
Po jedné intravenózní infúzi byly hladiny anti-CDP870 nízké nebo nedetekovatelné. • φ • ♦ · ♦ * · · φ φ φ φφ φ · · · • φ φ φ φ · φ · · · φ φ φ φ φφφφ φ φφ φφ φφ φφ φ · 61
Diskuse
Neutralizace TNFa je účinná léčebná strategie u RA. V současné době vyžaduje použití biologických přípravků, jako například chimérických mAb nebo fúzního proteinu rozpustný receptor/humánní Fc, které jsou pro výrobu drahé. Léčebný přípravek neutralizující TNFa potřebuje vázat TNFa s vysokou afinitou a musí mít dlouhý biologický poločas, nízkou antigeničnost a vysokou snášenlivost a musí být bezpečný. Je také zapotřebí, aby byl přístupný pro všechny pacienty s RA, kteří by mohli mít prospěch z blokády TNFa. Jedna technika, která by mohla dosáhnout těchto cílů, je konjugace v E. coli vytvořeného protilátkového fragmentu vázajícího TNFa s polyethylenglykolem. V této předběžné studii původci zjistili, že CDP870, PEGylovaná anti-TNFa modifikovaná Fab, je účinná a dobře snášena pacienty s RA.
In vitro studie ukázaly, že CDP870 má podobnou TNFa neutralizující aktivitu k myším anti-TNFa parentálním protilátkám. Tato studie potvrdila, CDP870 redukoval zánět a zlepšil příznaky RA. Klinické zlepšení měřené podle kritérií ACR20 u skupin s dávkou 5 a 20 mg/kg (75%, 75%) byle srovnatelné s etanerceptem (60%) (Moreland a kol., Annals Int. Med., 130, 478-486, 1999) a infliximabem (50%) (Maini a kol., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). U středních a nejvyšších testovaných dávek trval léčebný účinek 8 týdnů, což je srovnatelné s jinými dosavadními mAb (Elliott a kol., Lancet, 344, 1105-1110, 1994 a Rankin a kol., Br. J. Rheumatol., 34, 334-342, 1995). Dřívější studie ukázala, že terapeutický účinek anti-TNFa protilátek je je ve vztahu k jejich plazmatickému poločasu a vytvoření cirkulujících protilátek (Maini a kol., Arthritis Rheum., 38 (doplněk): S186, 1995 (abstrakt)). Studie původců prokázala, že CDP870 má plazmatický poločas 14 dnů, což je ekvivalentní poločase celé ·· 9» ·· ♦··· 9# it • 9
• 9 * ·»« 62 • · • · 9 • 9 9 9 9 · · • 9 9 · 99 999 protilátky (Rankin a kol., (výše)) a mnohem déle než biologický poločas nekonjugovaných Fab' fragmentů. Dále CDP870 vyvolala pouze velmi nízké hladiny stupeň protilátkové reakce.
Jedním z důležitých cílů této studie bylo prozkoumat toleranci a bezpečnost podávání tohoto PEGylovaného Fab'. Ve studii původců byla CDP870 dobře tolerována. Ale pro vyhodnocení dlouhodobé toxicity bude nutná další studie, zejména co se týče rizika demyelinizadního onemocnění, infekce a kožních vyrážek, které byly publikovány u léčení etanerceptem a infliximabem. Úhrnem, CDP870 je terapeuticky účinná u RA, a v této krátkodobé studii byla dobře snášena. Výše popsané příklady jsou uvedeny pouze jako ilustrativní příklady a neomezují rozsah předkládaného vynálezu, jak je definován následujícími patentovými nároky. ·· ·· * **** ·* · ··· · · · »·» ♦ · ··* · · · · · • · · » · · · ··· · • · · · ···· · * ** *· ♦· «* #· «··
SEZNAM SEKVENCI <160> 115 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRH1 <4 00> 1
Asp Tyr Gly Meť Asn 1 5
<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: ťTNF40/:Humánní hybrid CDRH2 <400> 2
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRH3 <400> 3
Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 ' 5 ·« ·· tt« ···» • · * · · ft • · · ·· · · · • · · ··· · | • · · · · t · » ·· *· M *· ·♦ tt • « · « • · · • · · • · · ·♦ ····
<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRL1 <400> 4
Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10
<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRL2 <400> 5
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5
<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRL3 <400> 6
Gin Gin Tyr Asn XIe Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRH2 <400> 7
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 8 ·· 99 ·· • • A • • • 9 • • * • ♦ ··· • • ♦ 9 • • • • • · • ♦ • • 9 9 • • • • • 9 • • • » 9 • • »· • A · + 99 99 ·*··
<211> 321 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <22 0> <223> Popis umělé sekvence: _ hTNF40—gLl <400> 8 gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tet gta gga 48
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa gcc ctc atc 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 tac agt gcc tet ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65. 70 75 80 gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <221> CDS <222> (1)..(321) <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40~gL2 <400> 9 gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tet gta gga 48
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly • · ·· ·· ··* · ♦ « « » · <*···· ·· ·» ·«
/- 'Ό C * · · · · * * · · f · · ·> · · · » · · ο ··· ·· «* · · »· · · Μ· 1 5 10 15 gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 gta gcc tgg tat cag ca a aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ctc ctc atc 144 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac agt gcc tet ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc age gga 192 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt age ctc cag cca 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1) . . (354) <22 0> <223> Popis umělé sekvence: ghlhTNF40.4 (Figuře 10) <400> 10 cag gtg cag ctg gtc cag tea gga gca gag gtt aag aag cct ggt get Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtc aaa gtt tcg tgt aag gcc tea ggc tac gtg ttc aca gac tat Ser Val Lys Val Ser Cys Lys' Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat get caa aag ttc Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 192 6 • · · · · · ·# ·· : η ί i • · « • · · ♦ · · 9 · ··· · cag ggc aga gtc acg ttc act cta gac acc tcc aca age act gca tac 240 Gin Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg tca tet ctg aga tcc gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aga gga tac aga tet tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 cta gtc aca gtc tcc tca 354 Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <220> <223> Popis umělé sekvence: gh3hTNF40.4 (Figuře 11) <400> 11 gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt ctc gtg cag cct ggc gga 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 '10 15 tca ctg aga ttg tcc tgt gct gca tet ggt tac gtc ttc aca gac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gga atg aat tgg gtt aga cag gcc ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct gac age gtc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc aga ttc acg ttc tet cta gac aca tcc aag tca aca gca tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctc caa atg aat age ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 336 gct aga gga tac aga tet tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc
• · · ·GS • · · • 0 · 0 ·0 0 0 0 00 : · s • · *
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 cta gtc aca gtc tcc tca 354 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 9 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: Část sekvence primeru <400> 12 gccgccacc 9 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CH1 <400> 13 atgaaatgca gctgggtcat sttctt 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CH2 <400> 14 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: <400> 15 atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt : primer CH3 26 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence <400> 16 atgractttg ggytcagctt grt <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt primer CH4 primer CH5 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CH6 <400> 18 aťggctgtcy trgsgctrct cttctg
<210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> primer CH7 <223> Popis umělé sekvence: <400> 19 atggratgga gckggrtctt tmtctt
<210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> :primer CH8 <223> Popis umělé sekvence <400> 20 * · * # r · ···· t * # · « * *·» • » ·»« ·· · I · - * 4··*··· « · i · » "-'i· *·········» ' J *t »1 ·· ·« ····· atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer CH9 <400> 21 atggmttggg tgtggamctt gctatt <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence 26 <22 0> <223> Popis umělé sekvence: .primer CH10 <400> 22 atgggcagac ttacattctc attcct <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Umělá sekvence 26 <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CH11 <400> 23 atggattttg ggctgatttt ttttattg <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence 28 <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer CH12 <400> 24 atgatggtgt taagtcttct gtacct <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence 26 <220> <223> Popis umělé sekvence: primer 5' end <400> 25
9 9 9 • 9 0 9 99 9 9 a 4 5 9 9 9
4 9 9949 gcgcgcaagc ttgccgccac c 21 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CLI <400> 26 atgaagttgc ctgttaggcť gttggtgct 29 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL2 <400> 27 atggagwcag acacactcct gytatgggt 29 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL3 <400> 28 atgagtgtgc tcactcaggt cct 23 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL4 <400> 29 atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 30 atggatttwc aggtgcagat twtcagctt primer CL5 26 29 • 9 • 9 4 4 • · · 4 4 9 9 4 *4 9« • 9 • ♦ 9 • • 4 * • 9 4 4 • • · • 4 • · • 9 9 · • 9. 49 4 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <4 00> 31 atggatttwc , argtgcagat twtcagctt <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence:
primer CL5A primer CL6 29 <400> 32 atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: <400> 33 atgggcwtca agatggagtc aca <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 34 atgtggggay ctktttycmm tttttcaat <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 35 atggtrtccw casctcagtt cctt primer CL7 primer CL8 primer CL9 26 23 29 <210> 36 <211> 26 24 • · *· • · ···· • · • • * • 0 • ·* » • · • · • * » « 0 · • · • · % • · · • «* • « • · % · * · «
<212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL10 <400> 36 atgtatatat gtttgttgtc tatttc 26
<210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer, CL11 <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctctt 26
<210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL12A <400> 38 26
primer CL12B 26 primer CLI3 atgragtywc agacccaggt cttyrt
<210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 39 atggagacac attctcaggt ctttgt
<210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 40 atggattcac aggcccaggt tcttat
<210> 41 <211> 26 <212> DNA 26 Ι· · é • « · • · ««« • » · · * · * · *# ·* t · «··· · · 4 · • « · ♦ · « · • · α · · * • · * « · ♦ · * · « * · · · »· *· ** ··»· <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL14 <400> 41 26 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtt
<210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL15 <400> 42 29 atgaatttgc ctgttcatct cttggtgct
<210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer CL16 <400> 43 29 atggattttc aattggtcct catctcctt
<210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer CL17A <400> 44 26 atgaggtgcc tarctsagťt cctgrg
<210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer CL17B <400> 45 atgaagtact ctgctcagtt tctagg Λ O 1—{ CM V 46 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence 26 <220> « · * · · * Ti? • · t* * * · • ♦ * • * ♦ « « · « • * « · * «
<223> Popis umělé sekvence: primer CL17C <400> 46 atgaggcatt ctcttcaatt cttggg 26
<210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer 5' end <400> 47 ggactgttcg aagccgccac c 21
<210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer CL12 <400> 48 30 primer R2155 37 ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt
<210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: <400> 49 gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga
<210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer R1053 <400> 50 gctgacagac taacagactg ttcc
<210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> primer R720 <223> Popis umělé sekvence: 24 «· «··* ·· 0 9 *4 9 · » * 0 0 9 0 9
1- c 9 0 9 0 0$ 9 9 0 0 9 9 0 0 0 9 0 9 09 00 9 <400> 51 gctctcggag gtgctcct 18
<210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7982 <400> 52 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa cgtagcctgg 60 tatcagcaaa 70
<210> 53 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7983 <400> 53 atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt tttgctgata 60 ccaggctacg t 71
<210> 54 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7984 <400> 54 tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt 60 acťgatttca c 71
<210> 55 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7985 <400> 55 gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg gtgaaatcag 60 taccactacc g 71
<210> 56 <211> 89 <212> DNA <213> Umělá sekvence
• · · · |β <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7986 <400> 56 atttcgccac ttattactgt caacagtata acatctaccc actcacattc ggtcagggta 60 ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc 89
<210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7981 <400> 57 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc
<210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> P7980 30 R1053 24 R5350 <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 58 gaattccgta cgtttgattt ctactttagt
<210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 59 gctgacagac taacagactg ttcc
<210> 60 <211> 57 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 60 tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc 57
<210> 61 <211> 59 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> 99 99 99 9 99 9 9 9 9 9 9 • · ♦ ·· ·* · • · ··· ♦ · 9 99 99 <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid R5349 <400> 61 gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac 59
<210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid R684 <400> 62 ttcaactgct catcagat 18
<210> 63 <211> 65 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer P7989 <400> 63 gaagcaccag gcttcttaac ctctgctccť gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60 aattc 65
<210> 64 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer P7990 <400> 64 ggttaagaag cctggtgctt ccgtcaaagť ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgttcac 60 agactatggt a 71
<210> 65 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer P7991 <400> 65 ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60 tgtgaacacg t 71
<210> 66 <211> 81 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> primer P7995 <223> Popis umělé sekvence: <400> 66 ggcctgaaat ggatgggttg gattaatact tacattggag agcctattta tgttgacgac 60 ttcaagggca gattcacgtt c 81
<210> 67 <211> 56 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer P7992 <400> 67 ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc cttgaa 56
<210> 68 <211> 62 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer P7993 <400> 68 ccacaagcac tgcatacatg gagctgtcat ctctgagatc cgaggacacc gcagtgtact 60 at 62
<210> 69 <211> 78 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer P7994 <400> 69 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 78
<210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer P7988 <400> 70 gaattcgtgc actctcaggt gcagctggtc 30
<210> 71 <211> 30 <212> DNA <?n «* ·· • · · • · · ·· « · · · * • · · · • · · · ·« ···· * ♦ * • · · • · « * · · « • * · · ·· *· • »· · • # · • · · · • · · ·· «··· <213> Uměla sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer P7987 <400> 71 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat
<210> 72 <211> 65 <212> DNA primer P7999 gactcgacca gctgaacctc agagtgcacg 60 65 primer P8000 gtcctgtgct gcatctggtt acgtcttcac 60 71 <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: <400> 72 gatccgccag gctgcacgag accgcctcct aattc
<210> 73 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: <400> 73 tctcgtgcag cctggcggat cgctgagatt agactatgga a
<210> 74 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> primer P8001 ggcctgctta acccaattca ttccatagtc 60 71 <223> Popis umělé sekvence: <400> 74 ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg tgtgaagacg t
<210> 75 <211> 55 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> primer P7997 gagagaacgt gaatctgccc ttgaa 55 <223> Popis umělé sekvence: <400> 75 ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta <210> 76 <211> 62 ·· ·· ♦ · ·*·· ·Φ ··
··· · ♦ · · · * # ····· · · · · · · • · * »»· ♦ · » · · · • · · · ···· I · «
·· ·· ·* ·· Μ ···· <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer P7998 <400> 76 ccaagtcaac agcatacctc caaatgaata gcctgagagc agaggacacc gcagtgtact 60 ať 62
<210> 77 <211> 78 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: primer P7993 <400> 77 gaaťtcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 78
<210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: primer P7996 <400> 78 gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc 30
<210> 79 <211> 74 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: 5' primer <400> 79 cgcgcggcaa ttgcagtggc cttggctggt ttcgctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60 atgacccaga gccc 74
<210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: ^ primer <400> 80 ttcaactgct catcagatgg 20 3 3 « · · · · · • » • · I · t * · · · • · ·♦ ·· · ·· · « · » · · · · · · · · ··· ···· ··· ·· ·· *· ·♦ ····
<210> 81 <211> 78 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: 51 primer <400> 81 gctatcgcaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggttcag 60 ctggtcgagt caggaggc 78
<210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: 3' primer <400> 82 gcctgagttc cacgacac 18
<210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence rámce skupiny 1 <400> 83
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20
<210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec LI <400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 20 ·· ·· • · · • · tf·
·· ···· ·« #· • · · · * · • · · · · ·♦ *· ·· ····
<210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence L2 rámce skupiny 1 <400> 85
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15
<210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec L2 <400> 86
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr 15 10 15
<210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence L3 rámce skupiny 1 <400> 87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec L3 <400> 88
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15
·· ·♦ • · · • · ·*φ • · · · • # · · ·* • · ·» • # · • · • ♦ • ♦ ···#
Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence L4 rámce skupiny 1 <400> 89 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 15 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec L4 <400> 90 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 . 10 <210> 91 <211> 30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H1 rámce skupiny 1 <400> 91 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala ! 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 92 <211> 30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H1 i i ·· ·« «I ·»»· ·» ·· 9 4 4 ·· · · · * · • · ··« · · · ·· · • ·· ♦ ♦ · ♦ · » é · · ···· · · · · ♦ · · ·· ·· 94 49 4· 4444 <400> 92
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr 20 25 30
<210> 93 <2U> 14 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H2 rámce skupiny 1 <400> 93
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 15 10
<210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H2 <400> 94
Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly 15 10
<210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H3 rámce skupiny 1 <4Q0> 95
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 96
• · · ·· ·· » · ·· «· • · · • · · • * • · ·· ···· <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H3 <400> 96 Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gin 1. 5 10 15 Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30
<210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H4 rámce skupiny 1 <400> 97
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 98 <212> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H4 <400> 98
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> myš <220> <221> CDS <222> (1).. (324) <223> variabilní doména lehkého řetězce myší hTNF40 <400> 99 • 4 1« »··* *· ·· • · · • t ··» • · t · • · · · ·* ·· • « • · · * · « * ·· #* I· ··«· gac att gtg atg acc cag tet caa aaa ttc atg tcc.aca tea gta gga 48
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aat 96
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tet cct aaa gca ctg att 14 4
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 tac tcg gca tcc ttc cta tat agt gga gtc cct tat ege ttc aca ggc 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc atc age act gtg cag tet 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac atc tat cct ctc 288
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 324 acg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105
<210> 100 <211> 354 <212> DNA <213> myš <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <223> variabilní doména těžkého řetězce myší hTNF40 <400> 100 cag atc cag ttg gtg cag tet gga cct gag ctg aag Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys 1 5 10 aca gtc aag atc tcc tgc aag get tet gga tat gtt Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val 20 25 gga atg aat tgg gtg aag cag get cca gga aag get Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala 35 40 ggc tgg ata aac acc tac att gga gag cca ata tat Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr 50 55 60 45 48 30 15 96 144 192 ** • · ·
• · « · • * · · • · « • · · • · · • * «· · · aag gga ega ttt gcc ttc tet ttg gaa acc tet gcc agc act gcc ttt 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggt tac cgg tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 tca gtc acc gtc tet tca 354 Ser Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 101 <211> 84 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> CDS <222> (29)..(67) <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotídový adaptor OmpA <400> 101 52 84 tcgagťtcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca gct atc gca att
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 1 5
gca gtg gcc ttg gct ctgacgtacg agtcagg Ala Val Ala Leu Ala 10 <210> 102 <211> 67 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22Q> <221> CDS <222> (2) . . (40) <220> <221> CDS <222> (43) . . (66) <220> <223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-1 <400> 102 g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt ta atg aag 48
» · ·* • · ··· • ♦ • • · ♦ · • »· t · « • · • · • Ψ · • · • · 6 · • ♦ · * * ·« • · ·«*
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 aag act gct ata gca att g 67
Lys Thr Ala Ile Ala Ile 20
<210> 103 <211> 69 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> CDS <222> (2) . .(43) <220> <221> CDS <222> (45)..(68) <220> <223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-2 <400> 103 g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga ggg gag tgt taa a atg 47
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Met 1 5 10 '15 aag aag act gct ata gca att g 69
Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 20
<210> 104 <211> 81 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> CDS <222> (2)..(43) <220> <221> CDS <222> (57)..(80) <220> <223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-3 <400> 104 g agc tca cca gta aca aaa agc ttt aat aga gga gag tgt tga 43
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 15 10 ggaggaaaaa aaa atg aag aaa act gct ata gca att g Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 81 ? η • · ·♦ • · * • · · · ♦ • ·« · # 9 ♦ · · *· ··
• * ·«* • * · • · · ·« ♦··· 20 15
<210> 105 <211> 81 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> CDS <222> (2) . . (43) <220> <221> CDS <222> (57)..(80) <220> <223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-4 <400> 105 g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgť tga Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 10 cgaggaťtat ata atg aag aaa act gct ata gca att g Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 15 20
<210> 106 <211> 30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H1 rámce skupiny 3 <400> 106
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
<210> 107 <211> 13 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H2 rámce skupiny 3 <400> 107 43 81
• * « • * · ·· «I·· • * • ♦ ♦ · *
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H3 rámce skupiny 3 <400> 108
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 25 30 20
<210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H4 rámce skupiny 3 <400> 109
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 110 <211> 648
<212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Roubovaný těžký řetězec pro Fab <400> 110 gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc ťagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 _ gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 Q' ti ·♦ • · · • · · · · ♦ · ♦ * · t ·· ·# • · ···· ·* ·· • · I « ♦ ♦ · * ♦ ♦ ♦ ♦ · t ft · · · ♦ * ♦ • t ♦ <! «t * · · * tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagtt 648
<210> 111 <211> 216 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Roubovaný těžký řetězec pro Fab <400> 111
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1.5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ue Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 HO
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 <210> 112 <211> 642
<212> DNA <213> Umělá sekvence «» ι« » * · • · II» • · · · • « « ί» • · · · c * • · · · • · ♦ • · • • · « • · • * • « *. · • · ·· « * · · I » · • * * « » · · •· «··»
<2 20> <223> Roubovaný lehký řetězec pro Fab a modifikovaný Fab <400> 112 gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgggtcacc 60 atcacttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 ggtaaagccc caaaagccct catctacagt gcctctttcc tctatagtgg tgtaccatac 180 aggttcagcg gatccggtag tggtactgat ttcaccctca cgatcagtag cctccagcca 240 gaagatttcg ccacttatta ctgtcaacag tataacatct acccactcac attcggtcag 300 ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agťtgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt 642 <210> 113 <211> 214
<212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Roubovaný lehký řetězec pro Fab a modifikovaný Fab <400> 113
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 . 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser ι« ·· η · · • · · ·· 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 •<210> 114 <211> 687
<212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0> <223> Roubovaný těžký řetězec pro modifikovaný Fab <400> 114 gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg 687 <210> 115 <211> 229
<212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Roubovaný těžký řetězec pro modifikovaný Fab <400> 115 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 ' 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 « · Μ»· ΠΓ ·» ····
Leu Gin i-iet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Ala Ala 225

Claims (67)

  1. 96 96 1 1 .-4 (*%-» -fri. #® κ& % Háils?5® ® PATENTOVÉ φι/itvi-fil· 4^VI NÁROKY 1. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která obsahuje těžký řetězec, ve kterém variabilní doména obsahuje CDR mající sekvenci uvedenou jako H1 na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 1) pro CDRH1, H2' na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 2) nebo H2' na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 7) pro CDRH2 nebo H3 na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 3) pro CDRH3.
  2. 2. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec, ve kterém variabilní doména obsahuje CDR mající sekvenci uvedenou jako LI na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 4) pro CDRL1, L2 na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 5) pro CDRL2 nebo L3 na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) pro CDRL3.
  3. 3. Molekula protilátky podle nároku 1 nebo 2, která obsahuje těžký řetězec, ve kterém variabilní doména obsahuje CDR mající sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č.l pro CDRHl, SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 7 pro CDRH2 nebo SEKV. ID. Č.3 pro CDRH3, a lehký řetězec, ve kterém variabilní doména obsahuje CDR mající sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 4 pro CDRLl, SEKV. ID. Č. 5 pro CDRL2 nebo SEKV. ID. Č. 6 pro CDRL3.
  4. 4. Molekula protilátky podle nároku 3, která obsahuje SEKV. ID. Č. 1 pro CDRHl, SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 7 pro CDRH2, SEKV. ID. Č. 3 pro CDRH3, SEKV. ID. Č. 4 pro CDRLl, SEKV. ID. Č. 5 pro CDRL2 a SEKV. ID. Č. 6 pro CDRL 3.
  5. 5. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, která obsahuje SEKV. ID. Č. 2 pro CDRH2. 97 97 9 9 99 ·· ·* • # ♦ ♦
  6. 6. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, která je CDR-roubovanou protilátkovou molekulou.
  7. 7. Molekula protilátky podle nároku 6, kde variabilní doména obsahuje humánní příjemcovské rámcové úseky a non-humánní dárcovské CDR.
  8. 8. Molekula protilátky podle nároku 7, kde humánní příjemcovské rámcové úseky variabilní domény těžkého řetězce jsou založeny na humánní kanonické sekvenci skupiny 1 a obsahují non-humánní dárcovské zbytky v polohách 28, 69 a 71.
  9. 9. Molekula protilátky podle nároku 7, kde humánní příjemcovské rámcové úseky variabilní domény těžkého řetězce jsou založeny na humánní kanonické sekvenci skupiny 1 a obsahují non-humánní dárcovské zbytky v polohách 28, 38, 46, 67, 69 a 71.
  10. 10. Molekula protilátky podle nároku 7, kde humánní příjemcovské rámcové úseky variabilní domény těžkého řetězce jsou založeny na humánní kanonické sekvenci skupiny 3 a obsahují non-humánní dárcovské zbytky v polohách 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 a 78.
  11. 11. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 7 až 10, kde humánní příjemcovské rámcové úseky variabilní domény lehkého řetězce jsou založeny na humánní kanonické sekvenci skupiny 1 a obsahují non-humánní dárcovské zbytky v polohách 46 a 60.
  12. 12. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, která obsahuje variabilní úsek lehkého řetězce hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č. 8) a variabilní úsek těžkého řetězce gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11).
  13. 13. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, která je fragment Fab.
  14. 14. Molekula protilátky podle nároku 12 a 13, která je fragment Fab obsahující těžký řetězec mající sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 111 a lehký řetězec mající sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113.
  15. 15. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, která je modifikovaný fragment Fab, mající na C-konci svého těžkého řetězce jednu nebo více aminokyselin, které dovolují navázání efektorové nebo reportérové molekuly.
  16. 16. Molekula protilátky podle nároku 15, kde dodatečné aminokyseliny vytvářejí modifikovanou kloubovou oblast obsahující jeden nebo dva cysteinové zbytky, ke kterým se může navázat efektorová nebo reportérová molekula.
  17. 17. Molekula protilátky podle nároku 12, která je modifikovaný fragment Fab obsahující těžký řetězec mající sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115 a lehký řetězec mající sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113.
  18. 18. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která má lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113.
  19. 19. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která má lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113. 99 • 4 ·· ·*·· • · 99 • 4 ·· ·*·· • · • · · • · · ·· • · · • · · m Λ 4
    4 0 4 • * 4 0 0 0 0 · 4
  20. 20. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která má těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115.
  21. 21. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která má těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115.
  22. 22. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která má lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115.
  23. 23. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která má lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115.
  24. 24. Varianta molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23, která má zlepšenou afinitu k TNFa.
  25. 25. Varianta podle nároku 24, která byla připravena postupem afinitního zrání.
  26. 26. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, která je myší anti-TNFa monoklonální protilátka hTNF40.
  27. 27. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, která je chimérická molekula protilátky obsahující variabilní domény lehkého a těžkého řetězce monoklonální protilátky podle nároku 26. 100 • » ····
  28. 28. Sloučenina obsahující molekulu protilátky podle kteréhokoliv z nároků 15 až 23, která má na C-koncové aminokyselině nebo aminokyselině blízké C-konci těžkého řetězce kovalentně navázanou efektorovou nebo reportérovou molekulu.
  29. 29. Sloučenina podle nároku 28, která obsahuje efektorovou molekulu.
  30. 30. Sloučenina podle nároku 29, kde efektorová molekula obsahuje jeden nebo více polymerů.
  31. 31. Sloučenina podle nároku 30, kde jeden nebo více polymerů je volitelně substituováno přímým nebo rozvětveným řetězcem polyalkylenového, polyalkenylenového nebo polyoxy-alkylenového polymeru nebo rozvětveným nebo nerozvětveným polysacharidem.
  32. 32. Sloučenina podle nároku 31, kde jeden nebo více polymerů je methoxypolyethylenglykol.
  33. 33. Sloučenina obsahující molekulu protilátky podle nároku 17 mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, přičemž každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da).
  34. 34. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, a 101 ·· ·· • · · « · # ·· • · · · · • · · · 1« ·· Μ *··· • · · » Μ ·· • · · * • · · » · · • * · ·· ·♦·· mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázaný jeden nebo více syntetických nebo přirozeně se vyskytujících polymerů.
  35. 35. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, a mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázaný jeden nebo více syntetických nebo přirozeně se vyskytujících polymerů.
  36. 36. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, a mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, kde každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da).
  37. 37. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, a mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, kde každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da). 102 ·· • · · • · ··♦ • · · • ♦ · ·· • · ♦ · · • · ψ
  38. 38. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, kde každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da).
  39. 39. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, kde každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da).
  40. 40. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, kde každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da).
  41. 41. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která má lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, mající na 103 ·♦ ··#· 103 ·♦ ··#· • * • ·· • « jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou lysyl-maleimidovou skupinu, kde každá aminoskupina lysylového zbytku kovalentně váže methoxypolyethylenglykolový zbytek s molekulovou hmotností 20000 (Da).
  42. 42. Molekula protilátky obsahující hybridní CDR obsahující zkrácenou donorovou CDR sekvenci, kde chybějící část dárcovského CDR je nahrazena odlišnou sekvencí a tvoří funkční CDR.
  43. 43. Molekula protilátky podle nároku 42, kde chybějící část CDR sekvence je z protilátky, ze které jsou odvozeny rámcové úseky protilátkové molekuly.
  44. 44. Molekula protilátky podle nároku 43, kde chybějící část CDR sekvence je protilátky zárodečné linie mající kanonické rámcové úseky.
  45. 45. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 42 až 44, kde CDRH2 těžkého řetězce je hybrid v molekule protilátky.
  46. 46. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 42 až 45, kde donorový CDR je zkrácen o 1 až 8 aminokyselin.
  47. 47. Molekula protilátky podle nároku 46, kde zkrácení je o 4 až 6 aminokyselin.
  48. 48. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 42 až 47, kde zkrácení je provedeno na C-konci CDR.
  49. 49. Sekvence DNA kódující těžký a/nebo lehký řetězec molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 a 42 až 48.
  50. 50. Sekvence DNA podle nároku 49 obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 8 nebo 10.
  51. 51. Sekvence DNA podle nároku 49 obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 10 nebo 11.
  52. 52. Sekvence DNA podle nároku 49 obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 110, 112 nebo 114.
  53. 53. Klonovací nebo expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle kteréhokoliv z nároků 49 až 52.
  54. 54. Expresní vektor pro E. coli obsahující sekvenci DNA podle kteréhokoliv z nároků 49 až 52.
  55. 55. Expresní vektor pro E. coli, který je pTTO(CDP870).
  56. 56. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle kteréhokoliv z nároků 53 až 55.
  57. 57. Způsob přípravy molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 a 42 až 48 vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 56 a izoluje se molekula protilátky.
  58. 58. Způsob přípravy molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 a 42 až 48 vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje E. coli obsahující expresní vektor pro Έ. coli obsahující sekvenci DNA podle kteréhokoliv z nároků 53 až 55 a izoluje se molekula protilátky.
  59. 59. Způsob podle nároku 58 vyznačující se tím, že molekula protilátky je nasměrována do periplazmy.
  60. 60. Tarapeutický nebo diagnostický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje molekulu protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 a 42 až 48 nebo sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 28 až 41.
  61. 61. Molekula protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 a 42 až 48 specifická pro humánní TNFa nebo sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 28 až 41 pro použití k léčení nemocí zprostředkovaných TNFa.
  62. 62. Molekula protilátky nebo sloučenina podle nároku 61 pro použití k léčení revmatoidní artritidy nebo osteoartritidy.
  63. 63. Použití molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 27 a 42 až 48 specifické pro humánní TNFa nebo sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 28 až 41 pro výrobu léku k léčení nemocí zprostředkovaných TNFa.
  64. 64. Použití podle nároku 63, kde nemoc je revmatoidní artritida nebo osteoartritida.
  65. 65. Vektor pDNAbEng-Gl jak je uveden na obr. 19.
  66. 66. Vektor pTTO(CDP870) jak je uveden na obr. 22.
  67. 67. Polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako kterákoliv ze sekvencí SEKV. ID. Č. 1 až SEKV. ID.
CZ20020837A 2000-06-06 2001-06-05 Molekula protilátky specifická pro humánní TNFalfa, sloucenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití mo CZ300737B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2002837A3 true CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
CZ300737B6 CZ300737B6 (cs) 2009-07-29

Family

ID=9893121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20020837A CZ300737B6 (cs) 2000-06-06 2001-06-05 Molekula protilátky specifická pro humánní TNFalfa, sloucenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití mo

Country Status (42)

Country Link
US (4) US7012135B2 (cs)
EP (4) EP1287140B1 (cs)
JP (3) JP4064812B2 (cs)
KR (1) KR20020047097A (cs)
CN (1) CN1289671C (cs)
AP (1) AP2092A (cs)
AR (1) AR033978A1 (cs)
AT (1) ATE451460T1 (cs)
AU (1) AU783756B2 (cs)
BE (1) BE2010C019I2 (cs)
BG (1) BG66072B1 (cs)
BR (2) BRPI0106682B8 (cs)
CA (2) CA2380298C (cs)
CY (6) CY1109889T1 (cs)
CZ (1) CZ300737B6 (cs)
DE (3) DE122010000027I1 (cs)
DK (4) DK2230308T3 (cs)
EC (1) ECSP024210A (cs)
ES (5) ES2707714T3 (cs)
FR (1) FR10C0015I2 (cs)
GB (2) GB0013810D0 (cs)
HU (4) HU230561B1 (cs)
IL (3) IL147992A0 (cs)
IS (2) IS2808B (cs)
LT (1) LT2308975T (cs)
LU (1) LU91674I2 (cs)
MX (1) MXPA01013440A (cs)
MY (1) MY136603A (cs)
NL (1) NL300982I9 (cs)
NO (4) NO334808B1 (cs)
NZ (1) NZ516596A (cs)
OA (1) OA12282A (cs)
PE (1) PE20020292A1 (cs)
PL (2) PL212738B1 (cs)
PT (4) PT3059314T (cs)
RU (1) RU2303604C2 (cs)
SI (3) SI1287140T1 (cs)
SK (1) SK288343B6 (cs)
TR (1) TR201900227T4 (cs)
TW (2) TWI316088B (cs)
WO (1) WO2001094585A1 (cs)
ZA (1) ZA200200097B (cs)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2817619A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
ES2358505T3 (es) * 2002-03-20 2011-05-11 Ucb Pharma, S.A. Métodos para analizar isómeros de disulfuro de anticuerpos.
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
SI2371392T1 (sl) * 2002-05-02 2015-10-30 Wyeth Holdings Llc Konjugati derivat-nosilec kaliheamicina
ATE518885T1 (de) * 2002-05-28 2011-08-15 Ucb Pharma Sa Peg-positionsisomer von einem antikorper gegen tnfalpha (cdp870)
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20040219142A1 (en) * 2002-07-19 2004-11-04 Abbott Laboratories S.A. Treatment of skin and nail disorders using TNFalpha inhibitors
WO2004019861A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Pharmacia Corporation Stable ph optimized formulation of a modified antibody
US20040247588A1 (en) * 2002-08-28 2004-12-09 Johnson Robert E. Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
EP2311867A1 (en) 2002-10-29 2011-04-20 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
DE60333228D1 (de) 2002-12-02 2010-08-12 Amgen Fremont Inc Gegen den tumor nekrose faktor gerichtete antikörper und deren verwendungen
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CA2513113A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1597299A2 (en) * 2003-02-19 2005-11-23 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
CN1845938B (zh) * 2003-06-30 2010-05-26 杜门蒂斯有限公司 多肽
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
JP5544063B2 (ja) * 2003-08-13 2014-07-09 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト 組換えポリペプチドの生産のための発現ベクター、形質転換宿主細胞及び発酵方法
ES2391457T3 (es) * 2003-08-13 2012-11-26 Sandoz Ag Procedimiento para la purificación de polipéptidos recombinantes
GB0319601D0 (en) 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
US8022040B2 (en) * 2004-11-29 2011-09-20 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
ES2359567T3 (es) * 2004-12-29 2011-05-24 Yuhan Corporation Anticuerpo humanizado específico para el factor de necrosis tumoral-alfa.
CN102961746B (zh) 2005-05-16 2016-06-15 艾伯维生物技术有限公司 TNFα抑制剂治疗腐蚀性多关节炎的用途
NZ563213A (en) * 2005-06-01 2009-07-31 Micromet Ag Anti-IL2 antibodies
NZ563580A (en) 2005-06-07 2010-09-30 Esbatech An Alcon Biomedical R Stable and soluble antibodies inhibiting TNFaplha
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
JP2009533347A (ja) * 2006-04-07 2009-09-17 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 抗ＴＮＦα抗体の複合体
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
EP2007426A4 (en) * 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PSORIASTIC POLYARTHRITIS AND THEIR APPLICATIONS
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
WO2008005429A2 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CA2678367C (en) * 2007-03-02 2014-07-08 Farnam Companies, Inc. Sustained release compositions using wax-like materials
JP2010532749A (ja) * 2007-06-07 2010-10-14 サーモディクス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 質量を削減した長時間作用剤形
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
WO2015164330A1 (en) 2014-04-21 2015-10-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-psyk antibody molecules and use of same for syk-targeted therapy
RU2010136988A (ru) * 2008-02-05 2012-03-20 Деленекс Терапьютикс Аг (Ch) Антигенсвязывающие полипептиды против дегенерации хряща
MX2010012052A (es) * 2008-05-07 2010-12-14 Novo Nordisk As Anticuerpos humanizados contra interferon-alfa humano.
PL3628686T3 (pl) 2008-06-25 2022-02-28 Novartis Ag Humanizowanie przeciwciał króliczych z zastosowaniem uniwersalnego zrębu przeciwciała
CN104004094B (zh) 2008-06-25 2017-09-22 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化
LT3216803T (lt) 2008-06-25 2020-06-10 Novartis Ag Stabilūs ir tirpūs antikūnai, slopinantys vegf
MX345039B (es) * 2008-06-25 2017-01-16 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles que inhiben el tnfa.
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
SG172855A1 (en) * 2009-01-29 2011-08-29 Abbott Lab Il-1 binding proteins
HUE051430T2 (hu) 2009-07-10 2021-03-01 Ablynx Nv Eljárás variábilis domének elõállítására
EP2480661A1 (en) 2009-09-24 2012-08-01 UCB Pharma, S.A. Bacterial host strain
MY173390A (en) 2009-10-23 2020-01-22 Takeda Pharmaceuticals Co Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201001791D0 (en) 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
BR112012022342A2 (pt) 2010-03-04 2017-02-14 Vet Therapeutics Inc anticorpos monoclonais dirigidos a cd52
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
WO2011127141A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Abbott Laboratories TNF-α BINDING PROTEINS
GB201012603D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012599D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
WO2012164083A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Actogenix N.V. Polycistronic expression system for bacteria
HRP20180226T1 (hr) 2011-07-13 2018-03-09 Ucb Biopharma Sprl Bakterijski soj domaćina koji eksprimira rekombinantnu dsbc
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
WO2013041672A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Actogenix Nv Modified gram positive bacteria and uses thereof
EP3382006B1 (en) 2011-09-23 2021-02-17 Intrexon Actobiotics NV Modified gram positive bacteria and uses thereof
WO2013087912A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
CN104520328B (zh) 2012-08-13 2019-06-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗锯齿蛋白抗体及使用方法
US9585934B2 (en) 2014-10-22 2017-03-07 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin D conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
KR102537099B1 (ko) 2014-12-22 2023-05-25 유씨비 바이오파마 에스알엘 단백질 제조 방법
WO2017035430A2 (en) * 2015-08-27 2017-03-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-alk antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA3011331C (en) 2016-01-14 2025-05-13 Intrexon Actobiotics N.V. Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
RU2680011C2 (ru) * 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
MY194619A (en) * 2016-06-02 2022-12-07 Abbvie Inc Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
WO2018119142A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
AU2018374634A1 (en) 2017-12-01 2020-05-28 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
JP7525499B2 (ja) 2019-01-31 2024-07-30 ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ＴＮＦα及びＩＬ－１７Ａに対する特異性を有する多重特異性抗体、ＩＬ－１７Ａを標的とする抗体、及びそれらの使用方法
KR102323342B1 (ko) * 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
EP4291227A2 (en) 2021-02-15 2023-12-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
EP4393937A4 (en) 2021-08-26 2025-12-31 Duality Biologics Shanghai Co Ltd STEROID COMPOUND AND CONJUGATE OF THIS ONE
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
MX2024003696A (es) 2021-09-24 2024-05-29 Xbrane Biopharma Ab Construcciones de adn y celulas huespedes para expresar proteinas recombinantes.
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
EP4593867A2 (en) 2022-09-30 2025-08-06 Extend Biosciences, Inc. Long-acting parathyroid hormone
WO2024180518A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein
TW202525846A (zh) 2023-08-25 2025-07-01 美商普羅特歐拉吉克適美國公司 抗ｉｌ—１３多特異性抗體構築體及其用途
WO2025099576A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
AU6852594A (en) * 1993-06-03 1995-01-03 Therapeutic Antibodies Inc. Production of antibody fragments
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
WO1996033204A1 (en) 1995-04-20 1996-10-24 The Kennedy Institute Of Rheumatology Multiple administrations of anti-tnf antibody
DK0929578T3 (da) 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) * 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
AU9262598A (en) * 1997-08-18 1999-03-08 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DK1411075T3 (da) 1998-03-12 2008-10-27 Nektar Therapeutics Al Corp Fremgangsmåde til fremstilling af polymerkonjugater
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
BR0106682A (pt) 2002-05-14
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
IL147992A0 (en) 2002-09-12
IS6217A (is) 2002-01-03
BG66072B1 (bg) 2011-01-31
TWI316088B (en) 2009-10-21
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
PL399351A1 (pl) 2012-12-17
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
HU230561B1 (hu) 2016-12-28
ZA200200097B (en) 2003-01-06
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
BE2010C019I2 (cs) 2020-08-20
CN1383450A (zh) 2002-12-04
FR10C0015I1 (cs) 2010-04-16
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
MY136603A (en) 2008-10-31
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
GB2366800B (en) 2005-01-19
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
IS3016B (is) 2019-10-15
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
PT2308975T (pt) 2016-11-14
US7402662B2 (en) 2008-07-22
NO20020554L (no) 2002-04-08
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
ECSP024210A (es) 2002-05-23
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
AU783756B2 (en) 2005-12-01
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
GB2366800A (en) 2002-03-20
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
CA2380298C (en) 2010-09-28
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
AU6051101A (en) 2001-12-17
TW200817430A (en) 2008-04-16
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
IS2808B (is) 2012-09-15
US7977464B2 (en) 2011-07-12
AR033978A1 (es) 2004-01-21
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
CZ300737B6 (cs) 2009-07-29
PT1287140E (pt) 2010-03-08
BG106278A (bg) 2002-12-29
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
LU91674I9 (cs) 2019-01-03
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
NO334808B1 (no) 2014-06-02
NZ516596A (en) 2004-07-30
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
NO20131316L (no) 2002-04-08
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
PL353960A1 (en) 2003-12-15
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
NO341218B1 (no) 2017-09-11
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
US7186820B2 (en) 2007-03-06
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
IL147992A (en) 2009-06-15
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
CN1289671C (zh) 2006-12-13
AP2092A (en) 2010-02-28
NL300982I1 (cs) 2019-05-01
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
PL212738B1 (pl) 2012-11-30
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
LT2308975T (lt) 2016-11-10
PT2230308E (pt) 2013-05-03
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
NO339282B1 (no) 2016-11-21
PL218516B1 (pl) 2014-12-31
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31
US7012135B2 (en) 2006-03-14
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
HUP1600483A2 (cs) 2002-10-28
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
OA12282A (en) 2006-05-11
IL195085A0 (en) 2009-08-03
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13
PT3059314T (pt) 2019-02-01
CA2707766C (en) 2013-05-21
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
TWI353358B (en) 2011-12-01
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
DE60140738D1 (de) 2010-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2380298C (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449A1 (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657A (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1148776B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1051385B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
SK288706B6 (sk) Molekuly protilátky, ktoré sú špecifické pre humánny nádorový nekrotický faktor alfa a ich použitie

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20241006