NO20131316L

NO20131316L - Antistoff-molekyler med spesifisitet for human tumornekrosefaktor-alfa, og anvendelse derav

Info

Publication number: NO20131316L
Application number: NO20131316A
Authority: NO
Inventors: David John King; Diljeet Singh Athwal; Derek Thomas Brown; Andrew Neil Charles Weir; Andrew George Popplewell; Andrew Paul Chapman
Original assignee: Ucb Pharma Sa
Priority date: 2000-06-06
Filing date: 2013-10-01
Publication date: 2002-04-08
Also published as: GB0128386D0; RU2303604C2; BR0106682A; DE122010000027I1; IL147992A0; IS6217A; BG66072B1; TWI316088B; DE10192353T1; PL399351A1; NO20020554D0; US20060233800A1; HU230561B1; ZA200200097B; CY2019018I1; CA2707766A1; CY1109889T1; BE2010C019I2; CN1383450A; FR10C0015I1

Abstract

Oppfinnelsen angår et antistoffmolekyl med spesifisitet for human TNFa, og angår også DNA sekvenser som koder for kjedene til antistoffmolekylet, vektorer, transformerte vertceller, fremgangsmåte for fremstilling av antistoffmolekylet, et terapeutisk/diagnostisk preparat samt anvendelser av antistoffmolekylet for behandling av sykdommer mediert ved TNFa.

Description

ANTISTOFFMOLEKYLER MED SPESIFISITET FOR HUMAN TUMOR NEKROSEFAKTOR-ALFA, OG ANVENDELSE DERAV.

Foreliggende oppfinnelse vedrører et antistoffmolekyl med spesifisitet for antigeniske determinanter av human tumor nekrosefaktor-alfa (TNFa). Foreliggende oppfinnelse vedrører også de terapeutiske anvendelser av antistoffmolekylet og fremgangsmåte for fremstilling av antistoffmolekylet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoffmolekyler. I et antistoffmolekyl er det to tunge kjeder og to lette kjeder. Hver tunge kjede og hver lette kjede har et variabelt domene i sin N-terminale ende. Hvert variable domene omfatter fire ramme ("framework") regioner (FRer) som alternerer med tre hypervariable områder ("complementarily determining regions") (CDRer). Restene i de variable domener er konvensjonelt nummerert i henhold til et system som er tenkt ut av Kabat et al. Dette system er fremsatt i Kabat et al., 1987, i Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (heretter "Kabat et al. ( supra)"). Dette nummereringssystem anvendes i den foreliggende søknad dersom annet ikke er indikert.

Kabat-restangivelsene svarer ikke alltid direkte til den lineære nummerering av aminosyrerestene. Den reelle lineære aminosyresekvens kan inneholde færre eller ytterligere aminosyrer enn i den strenge Kabatnummerering tilsvarende en forkortning av eller insersjon inn i en strukturell komponent, enten ramme eller CDR, av den grunnleggende variable domenestrukturen. Den korrekte Kabatnummerering av rester kan bestemmes for et gitt antistoff ved å oppstille rester med homologi i sekvensen til antistoffet med en "standard" Kabatnummerert sekvens.

CDRene til tung kjede variabel domenet er lokalisert i rester 31-35 (CDRH1), rester 50-65 (CDRH2) og rester 95-102 (CDRH3) i henhold til Kabatnummereringen.

CDRene til lett kjede variabel domenet er lokalisert i rester 24-34 (CDRL1), rester 50-56 (CDRL2) og rester 89-97 (CDRL3) i henhold til Kabatnummerering.

Konstruksjon av CDR-podede antistoffer beskrevet i Europeisk patentsøknad EP-A-0239400, som omhandler en fremgangsmåte hvor CDRene til et monoklonalt museantistoff er podet på rammeregionene av de variable domenene av et humant immunoglobulin ved seterettet mutagenese ved anvendelse av lange oligonukleotider. CDRene bestemmer antigenbindingsspesifisiteten til antistoffer og er relativt korte peptidsekvenser som bæres på rammeregionene til de variable domener.

Det tidligste arbeid om humanisering av monoklonale antistoffer ved CDR-poding ble gjennomført på monoklonale antistoffer som gjenkjenner syntetiske antigener, som NP. Eksempler hvor et monoklonalt museantistoff som gjenkjenner lysozym og et monoklonalt rotteantistoff som gjenkjenner et antigen på humane T-celler ble humanisert ved CDR-poding er imidlertid blitt beskrevet av Verhoeyen et al.

(Science, 239, 1534-1536, 1988) og Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988).

Riechmann et al. fant at overføring av CDRene alene som definert av Kabat (Kabat et al. ( supra) og Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970) var ikke tilstrekkelig til å tilveiebringe tilfredsstillende antigen bindingsaktivitet i det CDR-podede produkt. Det ble funnet at en rekke av rammerester måtte endres slik at de svarer til dem i donor-rammeregionen. De foreslåtte kriterier for å selektere hvilke rammerester som måtte endres er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 90/07861.

En rekke tidskrifter som omtaler CDR-podede antistoffer har blitt publisert, inkluderende Vaughan et al. (Nature Biotecknology, 16, 535-539, 1998).

TNFa er et pro-inflammatorisk cytokin som frigis ved og interagerer med celler i immunsystemet. Således frigis TNFa ved makrofager som er blitt aktivert ved lipopolysakkarider (LPS) av gram-negative bakterier. Som sådan, synes TNFa å være en endogen mediator av sentral viktighet involvert i utviklingen og patogenesen av endotoksisk sjokk assosiert med bakteriell sepsis. TNFa er også blitt vist til å være oppregulert i en rekke humane sykdommer, som inkluderer kroniske sykdommer som reumatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt og multippel sklerose. Mus som er transgene for human TNFa produserer høye nivåer av TNFa konstitutivt og utvikler en spontan, destruktiv polyartritt som ligner reumatoid artritt (Kaffer et al., EMBO J., 10, 4025-4031, 1991). TNFa er derfor omtalt som et pro-inflammatorisk cytokin.

Monoklonale antistoffer mot TNFa er tidligere blitt beskrevet. Meager et al., (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) beskriver murine monoklonale antistoffer mot rekombinant TNFa. Fendly et al., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) beskriver anvendelse av murine monoklonale antistoffer mot rekombinant TNFa for å definere nøytraliserende epitoper på TNFa. Shimamoto et al., (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) beskriver anvendelse av murine monoklonale antistoffer mot TNFy og deres anvendelse for å forhindre endotoksisk sjokk i mus. Videre, i internasjonal patentsøknad WO 92/11383, er rekombinante antistoffer, inkluderende CDR-podete antistoffer, spesifikke for TNFa, omtalt. Rankin et al., (British J. Rheumatology, 34. 334-342,1995) beskriver anvendelse av slike CDR-podede antistoffer i behandling av reumatoid artritt. US-A-5 919 452 omhandler anti-TNF kimære antistoffer og deres anvendelse for å behandle patologier assosiert med tilstedeværelsen av TN F.

Antistoffer overfor TNFa er blitt foreslått for profylakse og behandling av endotoksisk sjokk (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodner et al., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) og Wherry et al., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) omtaler det terapeutiske potensiale hos anti-TNFa antistoffer i behandling av septisk sjokk. Bruk av anti-TNFa antistoffer i behandlingen av septisk sjokk er også omtalt av Kirschenbaum et al., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626,1998). Kollagen-indusert artritt kan behandles effektivt ved anvendelse av et anti-TNFa monoklonalt antistoff (Williams et al.

(PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992).

Økte nivåer av TNFa er funnet i både synovialvæsken og i perifert blod hos pasienter som lider av reumatoid artritt. Når TNFa-blokkerende midler administreres til pasienter som lider av reumatoid artritt, reduserer de inflammasjon, forbedrer symptomer og retarderer leddskade (McKown et al.

(Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).

Bruk av anti-TNFa antistoffer i behandlingen av reumatoid artritt og Crohns sykdom er omtalt i Feldman et al., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) og i Feldman et al., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Antistoffene overfor TNFa som anvendes i slike behandlinger er generelt kimære antistoffer, som dem beskrevet i US-A-5 919 452.

To TNFa blokkerende produkter er nå tillatt for behandling av reumatoid artritt. Det første, betegnet etanercept, er markedsført av Immunex Corporation som Enbrel. Det er et rekombinant fusjonsprotein som omfatter to p75 oppløselige TNF-reseptor domener koblet til Fc delen av et humant immunoglobulin. Det andre, betegnet infliksimab, er markedsført av Centocor Corporation som Remicade. Det er et kimært antistoff med murine anti-TNFa variable domener og humane lgG1 konstante domener.

De tidligere kjente rekombinante anti-TNFa antistoffmolekyler har generelt en redusert affinitert for TNFa sammenlignet med antistoffene hvorfra de variable regioner eller CDRene er avledet, de må generelt fremstilles i pattedyrceller og er kostbare å produsere. Tidligere kjente anti-TNFa antistoffer er beskrevet i Stephens et al., (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 og GB-A-2 297 145.

Der er et behov for et antistoffmolekyl for å behandle kroniske inflammatoriske sykdommer som kan anvendes gjentagende og som kan fremstilles enkelt og effektivt. Der er også et behov for et antistoffmolekyl med en høy affinitet for TNFa og lav immunogenitet i mennesker.

I et første aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et antistoffmolekyl med spesifisitet for TNFa, omfattende en tung kjede hvor det variable domene omfatter et CDR (som definert av Kabat et al., ( supra)) med sekvensen gitt som H1 i figur 3 (SEQ ID NO:1) for CDRH1, som H2' i figur 3 (SEQ ID NO:2) eller som H2 i figur 3 (SEQ ID NO:7)for CDRH2 eller som H3 figur 3 (SEQ ID NO:3) for CDRH3.

Antistoffmolekylet ifølge det første aspekt av den foreliggende oppfinnelse omfatter minst ett CDR valgt fra H1, H2' eller H2 og H3 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 eller SEQ ID NO:7 og SEQ ID NO:3) for tung kjede variabel domenet. Foretrukket omfatter antistoffmolekylet minst to og foretrukket alle tre CDRer i tung kjede variabel domenet.

I et andre aspekt av oppfinnelsen er der tilveiebrakt et antistoffmolekyl med spesifisitet for human TNFa, omfattende en lett kjede hvor det variable domenet omfatter et CDR (som definert av Kabat et al., ( supra)) med sekvensen gitt som L1

i figur 3 (SEQ ID NO:4) for CDRL1, L2 i figur 3 (SEQ ID NO:5) for CDRL2 eller L3 i figur 3 (SEQ ID NO:6) for CDRL3.

Antistoffmolekylet ifølge det andre aspekt av oppfinnelsen omfatter minst ett CDR valgt fra L1, L2 og L3 (SEQ ID NO:4 til SEQ ID NO:6) for lett kjede variabel domenet. Antistoffmolekylet omfatter foretrukket minst to og mer foretrukket alle tre CDRer i lett kjede variabel domenet.

Antistoffmolekylene ifølge det første og andre aspekt av oppfinnelsen har foretrukket henholdsvis en komplementær lett kjede eller en komplementær tung kjede.

Antistoffmolekylet ifølge det første og andre aspekt av oppfinnelsen omfatter foretrukket en tung kjede hvor det variable domenet omfatter et CDR (som definert av Kabel et al., { supra)) med sekvensen gitt som H1 i figur 3 (SEQ ID NO:1) for CDRH1, som HZ eller H2 i figur 3 (SEQ ID NO:2 eller SEQ ID NO:7) for CDRH2 eller som H3 i figur 3 (SEQ ID NO:3) for CDRH3 og en lett kjede hvor det variable domenet omfatter et CDR (som definert av Kabat et al., ( supra)) med sekvensen gitt som L1 in figur 3 (SEQ ID NO:4) for CDRL1, som L2 i figur 3 (SEQ ID NO:5) for CDRL2 eller som L3 i figur 3 (SEQ ID NO:6) for CDRL3.

CDRene gitt i SEQ ID NO:1 og 3 til 7 og i figur 3 som omtalt over er avledet fra et mus-monoklonalt antistoff hTNF40. SEQ ID NO:2 består imidlertid av et hybrid CDR. Hybrid CDRet omfatter en del av tung kjede CDR2 fra monoklonalt museantistoff hTNF40 (SEQ ID NO:7) og en del av tung kjede CDR2 fra en human gruppe 3 germline V region sekvens.

De fullstendige sekvenser av de variable domener i mus hTNF40 antistoffet er vist

i figur 6 (lett kjede) (SEQ ID NO:99) og figur 7 (tung kjede) (SEQ ID NO:100). Dette museantistoff er i det etterfølgende omtalt som "donor antistoffet".

En første alternativ foretrukket utførelse av det første eller andre aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det monoklonale museantistoff hTNF40 med lett og tung kjede variabel domenesekvensene vist i henholdsvis figur 6 (SEQ ID NO:99) og figur 7 (SEQ ID NO: 100). Lett kjede konstant regionen av hTNF40 er kappa og tung kjede konstant regionen er lgG2a.

I en andre alternativ foretrukket utførelse, er antistoffet i henhold til hvilket som helst av det første og andre aspekt av den foreliggende oppfinnelse et kimært mus/humant antistoffmolekyl, omtalt heri som det kimære hTNF40 antistoffmolekyl. Det kimære antistoffmolekyl omfatter de variable domener til det monoklonale museantistoff hTNF40 (SEQ ID NO:99 og 100) og humane konstante domener. Det primære hTNF40 antistoffmolekyl omfatter foretrukket det humane C kappa domenet (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; Genbank aksesjonsnummer J00241) i den lette kjede og de humane gamma 4 domener (Flanagan et al., Natur, 300, 709-713, 1982) i den tunge kjede.

I en tredje alternativ foretrukket utførelse, er antistoffet ifølge hvilket som helst av det første og andre aspekt av den foreliggende oppfinnelse et CDR-podet antistoffmolekyl. Betegnelsen "et CDR-podet antistoffmolekyl" som anvendt heri refererer til et antistoffmolekyl hvor den tunge og/eller lette kjede inneholder ett eller flere CDRer (inkluderende, om ønsket, et hybrid CDR) fra donor antistoffet (for eksempel et murint monoklonalt antistoff) podet inn i en tung og/eller lett kjede variabel region ramme til et akseptorantistoff (for eksempel et humant antistoff).

Et slikt CDR-podet antistoff har foretrukket et variabelt domene omfattende humane akseptor-ramme regioner så vel som en eller flere av donor CDRene omtalt over.

Når CDRene er podet, kan en hvilken som helst passende akseptor variabel region rammesekvens anvendes under hensyntagen til klassen/typen av donorantistoffet hvorfra CDRene er avledet, inkluderende rammeregioner fra mus, primater og mennesker. Eksempler på humane rammer som kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse er KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY og POM (Kabat et al. ( supra)). KOL og NEWM kan for eksempel anvendes for den tunge kjede, REI kan anvendes for den lette kjede og EU, LAY og POM kan anvendes for både den tunge og den lette kjede. De foretrukne rammeregioner for den lette kjede er de humane gruppe 1 rammeregioner vist i figur 1 (SEQ ID NO:83, 85, 87 og 89). De foretrukne rammeregioner for den tunge kjede er de humane gruppe 1 og gruppe 3 rammeregioner vist i figur 2 (SEQ ID NO:91, 93, 95 og 97 og SEQ ID NO: 106, 107, 108 og 109), respektivt.

I et CDR-podet antistoff ifølge oppfinnelsen, er det fortrukket å anvende, som akseptor og antistoff, ett med kjeder som er homologe med kjedene til donorantistoffet. Akseptor tunge og lette kjeder behøver nødvendigvis ikke være avledet fra det samme antistoffet og kan, om ønsket, omfatte komposittkjeder med rammeregioner avledet fra forskjellige kjeder.

I et CDR-podet antistoff ifølge oppfinnelsen behøver heller ikke rammeregionene å ha nøyaktig den samme sekvens som akseptorantistoffet. Vanlige rester kan for eksempel være byttet til mere hyppig forekommende rester for denne akseptorkjede-klasse eller -type. Valgt rester i akseptor-rammeregioner kan alternativt forandres slik at de svarer til resten funnet i den samme posisjon i donorantistoffet. Slike forandringer bør holdes på det minimum som er nødvendig for å gjenvinne affiniteten av donorantistoffet. En protokoll for selekteve rester i akseptor-rammeregionene som eventuelt må forandres er fremsatt i WO 91/09967.

I et CDR-podet antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, dersom akseptor-tungkjeden har human gruppe 1 rammeregioner (vist i figur 2) (SEQ ID NO:91, 93, 95 og 97), da omfatter akseptor-rammeregionene til den tunge kjede (foretrukket, i tillegg til ett eller flere donor CDRer, donorrester i stillingene 28, 69 og 71 (i henhold til Kabat et al. ( supra)).

Dersom akseptor-tungkjeden har gruppe 1 rammeregioner, da omfatter akseptor-rammeregionen til den tunge kjede alternativt, i tillegg til ett eller flere donor CDRer, donorrester i stillingene 28, 38, 46, 67, 69 og 71 (i henhold til Kabat et al.

( supra)).

Foretrukket, i et CDR-podet antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, dersom akseptor-tungkjeden har human gruppe 3 rammeregioner (vist i figur 2) (SEQ ID NO:106, 107, 108 og 109), da omfatter akseptor-rammeregionene til den tunge kjede, i tillegg til ett eller flere donor CDRer, donorrester i stillinger 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 og 78 (i henhold til Kabat et al. ( supra)).

I et CDR-podet antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen, dersom akseptor-lettkjeden har humane gruppe 1 rammeregioner (vist i figur 1) (SEQ ID NO:83, 85, 87 og 89) da omfatter foretrukket akseptor-rammeregionene til den lette kjede donorrester i stillingene 46 og 60 (i henhold til Kabat et al. ( supra)).

Donorrester er rester fra donorantistoffet, dvs. antistoffer hvorfra CDRene opprinnelig ble avledet.

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen kan omfatte: et fullstendig antistoffmolekyl, med full lengde tunge og lette kjeder, et fragment derav, slik som et Fab, modifisert Fab, Fab', F(ab')2eller Fv fragment, en lett kjede eller tung kjede monomer eller dimer, et enkelt kjede antistoff, for eksempel et enkelt kjede Fv hvor tung og lett kjede variabel domenene er forbundet ved hjelp av en peptidlinker. Likeledes kan tung og lett kjede variabel regionene være kombinert med andre antistoffdomener som passende.

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen er foretrukket et Fab fragment. Fab fragmentet har fortrukket en tung kjede med sekvensen gitt som SEQ ID NO:111 og en lett kjede med sekvensen gitt som SEQ ID NO:113. Aminosyresekvensen gitt i SEQ ID NO:111 og SEQ ID NO:113 er foretrukket kodet for av nukleotidsekvensene gitt i henholdsvis SEQ ID NO:110 og SEQ ID NO:112.

Det er alternativt foretrukket at antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen er et modifisert Fab fragment hvor modifikasjonen er addisjonen til den C-terminale ende av dets tunge kjede, en eller flere aminosyrer for å tillate festingen av et effektor- eller reportermolekyl. De ytterligere aminosyrer danner foretrukket en modifisert hengselregion inneholdende en eller to cysteinrester hvortil effektor eller reportermolekylet kan være festet. Et slikt modifisert Fab fragment har foretrukket en tung kjede med sekvensen gitt som SEQ ID NO:115 og den lette kjede med sekvensen gitt som SEQ ID NO:113. Aminosyresekvensen gitt i SEQ ID NO:115 er foretrukket kodet for av nukleotidsekvensen gitt i SEQ ID NO:114.

En foretrukket effektorgruppe er et polymermolekyl som kan være festet til det modifiserte fragment for å øke dets halveringstid in vivo.

Polymermolekylet kan generelt være en syntetisk eller naturlig forekommende polymer, for eksempel en eventuelt substituert rettkjedet eller forgrenet polyalkylen-, polyalkenylen- eller polyoksyalkylenpolymer eller et rettkjedet er forgrenet polysakkarid, for eksempel et homo- eller heteropolysakkarid.

Spesielle eventuelle substituenter som kan være tilstede i de ovennevnte syntetiske polymerer inkluderer en eller flere hydroksy-, metyl- eller metoksygrupper. Særlige eksempler på syntetisk polymerer inkluderer eventuelt substituert rettkjedet eller forgrenet poly(etylenglykol), poly(propylenglykol), poly(vinylalkohol) eller derivater derav, særlig eventuelt substituert poly(etylenglykol) som metoksypoly(etylenglykol) eller derivater derav. Særlige naturlig forekommende polymerer inkluderer laktose, amylose, dekstran, glykogen eller derivater derav. "Derivater" som anvendt heri skal inkludere reaktive derivater, foreksempel tiol-selektive reaktive grupper som maleimiderog lignende. Den reaktive gruppe kan være koblet direkte eller gjennom et koblingssegment til polymeren. Det vil forstås at resten i en slik gruppe i noen tilfeller vil utgjøre en del av produktet som koblingsgruppen mellom antistoff-fragmentet og polymeren. Størrelsen på polymeren kan om ønsket varieres, men vil generelt være i et gjennomsnittlig molekylvektområde fra 500Da til SOOOODa, foretrukket fra 5000 til 40000Da, mer foretrukket fra 25000 til 40000Da. Polymerstørrelsen kan særlig velges på grunnlag av produktets tilsiktede anvendelse. Således, der produktene skal forlate sirkulasjonen og penetrere vev, for eksempel for anvendelse i behandling av en tumor, kan det for eksempel være fordelaktig å anvende en polymer med liten molekylvekt, for eksempel med en molekylvekt på omtrent 5000Da. For anvendelse hvor produktet forblir i sirkulasjonen, kan det være fordelaktig å anvende en polymer med høyere molekylvekt, for eksempel med en molekylvekt i området fra 25000Da til 40000Da.

Særlig foretrukne polymerer inkluderer en polyalkylenpolymer, som en poly(etylenglykol) eller særlig en metoksypoly(etylenglykol) eller et derivat derav, og særlig med en molekylvekt i området fra omtrent 25000Da til omtrent 40000Da.

Hvert polymermolekyl festet til det modifiserte antistoff-fragment kan være kovalent bundet til svovelatomet i en cysteinrest lokalisert i fragmentet. Den kovalente binding vil generelt være en disulfidbinding eller særlig en svovel-karbonbinding.

Om ønsket kan antistoff-fragmentet ha en eller flere effektor- eller

reportermolekyler festet dertil. Effektor- eller reportermolekylene kan være festet til antistoff-fragmentet gjennom en hvilken som helst tilgjengelig aminosyre sidekjede eller en terminal aminosyre-funksjonell gruppe lokalisert i fragmentet, for eksempel en hvilket som helst fri amino-, imino-, hydroksyl- eller karboksylgruppe.

En aktivert polymer kan anvendes som utgangsmaterialet for fremstilling av polymermodifisere antistoff-fragmenter som beskrevet over. Den aktiverte polymer kan være en hvilket som helst polymer som inneholder en tiol-reaktiv gruppe som en a-halokarboksylsyre eller ester, for eksempel jodacetamid, et imid, for eksempel maleimid, et vinylsulfon eller et disulfid. Slike utgangsmaterialer kan oppnås kommersielt (for eksempel fra Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) eller kan fremstilles fra kommersielt tilgjengelige utgangsmaterialer ved anvendelse av konvensjonelle kjemiske prosedyrer.

Med hensyn til poly(etylenglykol) (PEG) enhetene for festing, vises det til "Poly(etylenglykol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applictions", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglykol) Chemistry og Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC og "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam og A. Dent, Grove Publishers, New York.

Når det er ønskelig å oppnå et antistoff-fragment koblet til et effektor- eller reportermolekyl, kan dette fremstilles ved standard kjemiske eller rekombinante DNA prosedyrer hvor antistoff-fragmentet enten kobles direkte eller via et koblings-middel til effektor- eller reportermolekylet, enten før eller etter reaksjon med den aktiverte polymer, som passende. Særlige kjemiske prosedyrer inkluderer for eksempel dem beskrevet i WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195 og WO 89/01476. Alternativt, der effektor- eller reportermolekylet er et protein eller polypeptid kan koblingen oppnås ved anvendelse av rekombinante DNA prosedyrer, for eksempel som beskrevet i WO 86/01533 og EP-A-0392745.

Det modifiserte Fab fragmentet ifølge oppfinnelsen er foretrukket PEGylert (det vil si har PEG (poly(etylenglykol)) kovalent bundet dettil) i henhold til metoden omtalt i EP-A-0948544. Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen er foretrukket et PEGylert modifisert Fab fragment som vist i figur 13. Som vist i figur 13, har det modifiserte Fab fragment en maleimidgruppe kovalent bundet til en enkelt tiolgruppe i en modifisert hengselregion. En lysinrest er kovalent bundet til maleimidgruppen. Til hver av aminogruppene på lysinresten er en metoksypoly(etylenglykol)polymer med en molekylvekt på omtrent 20000 Da bundet. Den totale molekylvekt for hele effektormolekylet er derfor omtrent 40000 Da.

I forbindelsen vist i figur 13 har den tunge kjede til antistoffdelen foretrukket sekvensen gitt som SEQ ID NO:115 og den lette kjede har sekvensen gitt i SEQ ID NO: 113. Denne forbindelse er foretrukket omtalt heri som CDP870.

Konstant region domenene for antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen, om tilstede, kan velges med hensyn til den foreslåtte funksjon for antistoffmolekylet, og særlig effektorfunksjonene som kan være påkrevd. Konstant region domenene kan for eksempel være human IgA, IgD, IgE, IgG eller IgM domener. Human IgG konstant region domener kan særlig anvendes, særlig av lgG1 og lgG3 isotypene når antistoffmolekylet er tiltenkt for terapeutiske anvendelser og hvor antistoff-effektorfunksjoner er påkrevd. Alternativt kan lgG2 og lgG4 isotyper anvendes når antistoffmolekylet er tiltenkt for terapeutiske formål og antistoff-effektorfunksjoner ikke er påkrevd, for eksempel for kun blokkering av TNFa aktivitet. Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen kan også ha et effektor- eller et reportermolekyl festet dertil. Det kan for eksempel ha en makrosyklus, for å kompleksdanne et tungmetallatom, eller et toksin, som ricin, festet dertil ved hjelp av en kovalent brodannelsesstruktur. Alternativt kan prosedyrer for rekombinant DNA teknologi anvendes for å fremstille et antistoffmolekyl hvor Fc fragmentet (CH2, CH3 og hengseldomener), CH2 og CH3 domenene eller CH3 domenet av et komplett immunoglobulinmolekyl er blitt erstattet med, eller har festet dertil ved hjelp av en peptidkobling, et funksjonelt ikke-immunoglobulinprotein, slik som et enzym eller toksinmolekyl.

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen har foretrukket en bindingsaffinitet på minst 0,85x10"<10>M, mer foretrukket minst 0,75x10"10M og mest foretrukket minst 0,5x10"<10>M. (Det skal bemerkes at det foretrukne humaniserte antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen som beskrevet under, har en affinitet på omtrent 0,5x10"<10>M som er bedre enn affiniteten til det murine monoklonale antistoff hvorfra det er avledet.

Det murine antistoff har en affinitet på omtrent 0,85x10"10M.)

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen omfatter foretrukket lett kjede variabel domenet hTNF40-gl_1 (SEQ ID NO:8) og tung kjede variabel domenet gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11). Sekvensene til de variable domener av disse lette og tunge kjeder er vist i henholdsvis figur 8 og 11.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også varianter av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen, som har en forbedret affinitet for TNFa. Slike varianter kan oppnås ved en rekke affinitet-maturitetsprotokoller som inkluderer mutering av CDRene (Yang et al., J. Mol Biol., 254, 392-403, 1995), kjede-"shuffling" (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783,1992), anvendelse av mutator stammer av E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA "shuffling" (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), "phage display" (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) og seksuell PCR (Crameri et al., Nature, 391., 288-291, 1998). Vaughan et al. ( supra) omtaler disse metoder for affinitetsmaturering.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en DNA sekvens som koder for den tunge og/eller lette kjede til antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen.

DNA sekvensen koder foretrukket for den tunge eller den lette kjede til antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelse koder DNA sekvensen for en lett kjede og omfatter sekvensen vist i SEQ ID NO:8 (hTNF40-gl_1) eller SEQ ID NO:9 (h-TNF-40-gl_2) eller en degenerasjonsekvivalent derav.

I en alternativ foretrukket utførelse koder DNA sekvensen for en tung kjede og omfatter sekvensen vist i SEQ ID NO:10 (gh1hTNF40.4) eller SEQ ID NO:11 (gh3hTNF40.4) eller en degenerasjonsekvivalent derav.

DNA sekvensen ifølge oppfinnelsen kan omfatte syntetisk DNA, for eksempel fremstilt ved kjemisk prosessering, cDNA, genomisk DNA eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en klonings- eller ekspresjonvektor omfattende en eller flere DNA sekvenser ifølge oppfinnelsen. Klonings- eller ekpresjonsvektoren omfatter foretrukket to DNA sekvenser, som henholdsvis koder for den lette kjede og den tunge kjede til antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelse tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en E. coli ekspresjonsvektor omfattende en DNA sekvens ifølge oppfinnelsen. Ekspresjonsvektoren er foretrukket pTTO(CDP870) som vist skjematisk i figur 22.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også vektor pDNAbEng-G1 som vist i figur 19.

Generelle metoder hvorved vektorene kan konstrueres, transfeksjonsmetoder og dyrkingsmetoder er velkjent for fagkyndige på området. I denne forbindelse vises det til "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York og the Maniatis Manual produces by Cold Spring Harbor Publishing.

DNA sekvenser som koder for antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen kan oppnås med metoder som er velkjent for fagkyndig på området. DNA sekvenser som for eksempel koder for noen eller alle av antistoffets tunge og lette kjeder kan syntetiseres som ønsket fra de bestemte DNA sekvenser eller på grunnlag av de tilsvarende aminosyresekvenser.

DNA som koder for akseptor rammesekvenser er omfattende tilgjengelig for fagkyndig på området og kan lett syntesiseres på basis av deres kjente aminosyresekvenser.

Standardteknikker innen molekylærbiologi kan anvendes for å fremstille DNA sekvensen som koder for antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen. Ønskede DNA sekvenser kan syntesiseres fullstendig eller delvis ved anvendelse av oligonukleotid synteseteknikker. Sete-rettet mutagenese og polymerase-kjede-reaksjon (PCR) teknikker kan passende anvendes.

Et hvilket som helst passende vertcelle/vektorsystem kan anvendes for ekspresjon av DNA sekvensene som koder for antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen. Bakterielle, for eksempel E. coli, og andre mikrobielle systemer kan tildels anvendes for ekspresjon av antistoff-fragmenter som Fab og F(ab')2fragmenter og særlig Fv fragmenter og enkeltkjede-antistoff-fragmenter, for eksempel enkeltkjede Fver. Eukaryotiske, for eksempel pattedyr, vertscelle-ekspresjonsystemer kan anvendes for fremstilling av større antistoffmolekyler, som inkluderer fullstendige antistoffmolekyler. Passende pattedyr-vertsceller inkluderer CHO, myelom- eller hybridomceller.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen som omfatter dyrking av en vertcelle som inneholder en vektor ifølge oppfinnelsen under betingelser som er egnet for å føre til ekspresjon av protein fra DNA som koder for antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen, og isolere antistoffmolekylet.

Fremgangsmåten for fremstilling av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen omfatter foretrukket dyrking av E. coli som inneholder en E. coli ekspresjonsvektor omfattende DNA sekvensen ifølge oppfinnelsen under betingelser egnet til å føre til ekspresjon av protein fra DNA sekvensen og isolering av antistoffmolekylet. Antistoffmolekylet kan utskilles fra cellen eller targeteres til periplasmaet ved passende signalsekvenser. Alternativt kan antistoffmolekylene akkumulere i cellens cytoplasma. Antistoffmolekylet targeteres foretrukket til periplasmaet. Avhengig av det antistoffmolekyl som produseres og den anvendte fremgangmåte, er det ønskelig å la antistoffmolekylene re-folde seg og innta en funksjonell konformasjon. Prosedyrer for å la antistoffmolekyler få re-folde seg er vel kjent for fagkyndige på området.

Antistoffmolekylet kan omfatte kun et tung eller lett kjedepolypeptid, i hvilket tilfelle kun en tung kjede eller lett kjede polypeptid-kodesekvens behøver å anvendes for å transfektere vertscellene. For fremstilling av produkter som omfatter både tunge og lette kjeder, kan cellelinjen transfekteres med to vektorer, en første vektor som koder for et lett kjede polypeptid og en andre vektor som koder for et tung kjede polypeptid. Alternativt kan en enkelt vektor anvendes, idet vektoren inkluderer sekvenser som koder for lett kjede og tung kjede polypeptide. Alternativt kan en enkelt vektor anvendes, idet vektoren inkluderer sekvenser som koder for lett kjede og tung kjede polypeptider.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et terapeutisk eller diagnostisk preparat som omfatter et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, fortynningsmiddel eller bærer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangmåte for fremstilling av et terapeutisk eller diagnostisk preparat som omfatter blanding av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen med en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, et fortynningsmiddel eller en bærer.

Antistoffmolekylet kan være den eneste aktive bestanddel i det terapautiske eller diagnostiske preparat eller kan være sammen med andre aktive bestanddeler som inkluderer andre antistoffbestanddeler, for eksempel anti-T celle, anti-IFNy eller anti-LPS antistoffer, eller ikke-antistoffbestanddeler som xantiner.

De farmasøytiske preparater bør foretrukket inneholde en terapeutisk effektiv mengde av antistoff ifølge oppfinnelsen. Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" som anvendt heri refererer til en mengde av et terapeutisk middel som er nødvendig for å behandle, forbedre eller forebygge en målsykdom eller måltilstand, eller for å utvise en detekterbar terapeutisk eller preventiv effekt. For et hvilket som helst antistoff kan en terapeutisk effektiv dose estimeres initialt i enten cellekulturanalyser eller i dyremodeller, vanligvis i gnagere, kaniner, hunder, griser eller primater. Dyremodellen kan også anvendes for å bestemme det passende konsentrasjonområde og administreringsruten. Slik informasjon kan deretter anvendes for å bestemme anvendbare doser og ruter for administrering i mennesker.

Den nøyaktige effektive mengde for et menneskeindivid vil avhenge av alvorligheten av sykdomstilstanden, individets generelle helse, alder, vekt og kjønn, diett, tid og hyppighet for administrering, en eller flere legemiddel-kombinasjoner, reaksjonssensitiviteter og toleranse/respons på terapi. Denne mengde kan bestemmes ved rutineforsøk og er innenfor legens vurdering. Generelt vil en effektiv dose være fra 0,01 mg/kg til 50 mg/kg, foretrukket fra 0,1 mg/kg til 20 mg/kg, mere foretrukket omtrent 15 mg/kg. Som vist i de etterfølgende eksempler er doser på 1,5 og 20 mg/kg blitt anvendt for å behandle pasienter som lider av reumatoid artritt.

Preparater kan administreres individuelt til en pasient eller kan administreres i kombinasjon med andre midler, legemidler eller hormoner.

Den dose hvorved antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen administreres avhenger av naturen til den tilstand som behandles, den grad hvortil det nivå av TNFa som skal nøytraliseres er økt eller forventes og økes over et ønsket nivå, og av om antistoffmolekylet anvendes profylaktisk eller for å behandle en eksisterende tilstand.

Således hvor produktet for eksempel er for behandling eller profylakse av en kronisk inflammatorisk sykdom, som reumatoid artritt, ligger passende doser av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen i området mellom 0,5 og 50 mg/kg, mer foretrukket mellom 1 og 20 mg/kg og mest foretrukket omtrent 15 mg/kg. Dosehyppigheten vil avhenge av antistoffmolekylets halveringstid og varigheten av dets effekt.

Dersom antistoffmolekylet har en kort halveringstid (for eksempel 2 til 10 timer) kan det være nødvendig å gi en eller flere doser per dag. Dersom antistoffmolekylet alternativt har en lengre halveringstid (for eksempel 2 til 15 dager) kan det kun være nødvendig å gi en dosering en gang per dag, per uke eller til og med en gang hver måned eller hver annen måned.

Et farmasøytisk preparat kan også inneholde en farmasøytisk aksepterbar bærer for administrering av antistoffet. Bæreren bør i seg selv ikke indusere produksjon av antistoffer som er skadelige for individet som mottar preparatet og bør ikke være toksis. Passende bærere kan være store, sakte metaboliserte makromolekyler som proteiner, polypeptider, liposomer, polysakkarider, polymelkesyrer, polyglykolsyrer, polymere aminosyrer, aminosyre-kopolymerer og inaktive viruspartikler.

Farmasøytisk aksepterbare salter kan anvendes, for eksempel mineralsyresalter, som hydroklorider, hydrobromider, fosfater og sulfater, eller salter av organiske syrer som acetater, propionater, malonater og benzoater.

Farmasøytiske aksepterbare bærere i terapeutiske preparater kan i tillegg inneholde væsker som vann, saltoppløsning, glyserol og etanol. I tillegg kan hjelpesubstanser, som fuktig midler eller emulgeringsmidler eller pH buffer-substanser være tilstede i slike preparater. Slike bærere muliggjør utforming av de farmasøytiske preparater som tabletter, piller, drasjeer, kapsler, væsker, geler, siruper, slurryer og suspensjoner for inntak derav hos pasienten.

Foretrukne former for administrering inkluderer former som er egnet for parenteral administrering for eksempel ved injeksjon eller infusjon, for eksempel bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Når produktet er for injeksjon eller infusjon, kan det være i form av en suspensjon, oppløsning eller emulsjon i en oljeaktig eller vandig vehikkel og det kan inneholde formuleringsmidler, som suspensjonsmidler, preserveringsmidler, stabiliseringsmidler og/eller disper-geringsmidler. Antistoffmolekylet kan alternativt være i tørr form for rekonstituering for anvendelse med en passende steril væske.

Når formulert kan preparatene ifølge oppfinnelsen administreres direkte til individet. Individene som skal behandles kan være dyr. Det er imidlertid foretrukket at preparatene er tilpasset for administrering til mennesker.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan administreres ved en hvilken som helst rute som inkluderer, men som ikke er begrenset til, oral, intravenøs, intramuskulær, intra-arteriell, intramedulær, intratekal, intraventrikulær, transdermal, transkutan (se for eksempel WO98/20734), subkutan, intraperitoneal, intranasal, enteral, topisk, sublingval, intravaginal eller rektal rute. Hyposprayer kan også anvendes for å administrere de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen. De terapeutiske preparater kan typisk fremstilles som injiserbare preparater, enten som flytende oppløsninger eller suspensjoner. Faste former som er egnet for oppløsning i eller suspensjon i flytende vehikler før injeksjon kan også fremstilles.

Direkte avlevering av preparatene vil generelt gjennomføres ved injeksjon, subkutan, intraperitoneal, intravenøs eller intramuskulær, eller ved avlevering til det interstitielle rom til et vev. Preparatene kan også administreres inn i en lesjon. Doseringsbehandling kan være i form av et enkelt doseprogram eller et program med multiple doser.

Det vil forstås at den aktive bestanddel i preparatet vil være et antistoffmolekyl. Det vil som sådan være mottagelig for nedbrytning i gastrointestinalkanalen. Således, dersom preparatet skal administreres ved en rute ved anvendelse av gastrointestinalkanalen, må preparatet inneholde midler som beskytter antistoffet fra nedbrytning, men som frigjør antistoffet straks det er blitt absorbert fra gastrointestinalkanal.

En inngående omtale av farmasøytiske aksepterbare bærere er tilgjengelig i Reminton's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

Man regner også med at antistoffet ifølge oppfinnelsen vil administreres ved anvendelse av genterapi. For å oppnå dette, blir DNA sekvenser som koder for de tunge og lette kjeder til antistoffmolekylet under kontrollen av passende DNA komponenter innført i en pasient slik at antistoffkjedene uttrykkes fra DNA sekvensene og samles in situ.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen for anvendelse i behandling av en sykdom mediert ved TNFa.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom mediert ved TNFa.

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i en hvilken som helst terapi hvor det er ønskelig å redusere nivået av biologisk aktiv TNFa tilstede i menneskekroppen eller dyrekroppen. TNFa kan sirkulere i kroppen eller være tilstede i et uønsket høyt nivå som er lokalisert på et spesielt sted i kroppen.

Økte nivåer av TNFa er for eksempel implisert i akutte og kroniske immunlidelser og immunregulerende lidelser, infeksjoner som inkluderer septisk, endotoksisk og kardiovaskulært sjokk, inflammatoriske lidelser, nevrodegenerative sykdommer, maligne sykdommer og alkoholindusert hepatitt. Detaljer om de mange lidelser som er forbundet med økte nivåer av TNFa er angitt i US-A-5 919 452. Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i terapi av sykdommer mediert ved TNFa. Særlige relevante sykdommer som kan behandles ved antistoffmolekylet

ifølge oppfinnelsen inkluderer sepsis, kongestiv hjertesvikt, septisk eller endotoksisk sjokk, kakeksi, akutt lungesviktsyndrom, AIDS, allergier, psoriasis, TB, inflammatoriske benlidelser, blodkoagulasjonslidelser, brannsår, avstøt-ningsepisoder etter organ- eller vevstransplantasjon, Crohns sykdom og autoimmune sykdommer, som tyreoiditt og reumatoid artritt og osteoartritt.

Antistoffmolekylet eller preparatet kan i tillegg anvendes, for å redusere bivirkninger forbundet med TNFa dannelse under neoplastisk terapi, for å eliminere eller redusere sjokk-relaterte symptomer assosiert med behandling eller forebygging av transplantatavstøtning ved anvendelse av et anti-lymfocytt antistoff, eller for behandling av multi-organsvikt.

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen anvendes foretrukket for behandling av reumatoid artritt eller osteoartritt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en metode for å behandle mennesker eller dyr som lider av eller har en risiko for en lidelse mediert ved TNFa, hvor metoden omfatter å administrere en effektiv mengde av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen til individet.

Antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i diagnose, for eksempel i in vivo diagnose og for å beskrive sykdomstilstander som involverer økte nivåer av TNFa.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et antistoffmolekyl som omfatter et hybrid CDR omfattende en trunkert donor CDR sekvens hvor den manglende del til det trunkerte donor CDR er erstattet med en annen sekvens og danner et funksjonelt CDR. Betegnelsen "hybrid CDR" som anvendt heri betyr et CDR omfattende et donor CDR som er blitt trunkert i en eller flere stillinger, for eksempel i den ene eller begge endene derav. Den manglende delen til det trunkerte donor CDR er erstattet med en annen sekvens for å danne et komplett eller funksjonelt CDR. Det hybride CDR har minst en aminosyreforandring sammenlignet med det komplette donor CDR. Sekvensen som erstatter den trunkerte del av CDR kan være en hvilken som helst sekvens. Ikke-donordelen av CDR sekvensen er foretrukket fra antistoffet hvorfra rammeregionen til antistoffmolekylet er avledet, slik som en germline antistoffsekvens.

Man har funnet at antistoffmolekyler som omfatter et hybrid CDR bibeholder i alt vesentlig den samme bindingsaffinitet som et antistoffmolekyl som inneholder komplette donor CDRer. Betegnelsen "i alt vesentlig den samme bindingsaffinitet" som anvendt heri betyr minst 70%, mere foretrukket minst 85% og mest foretrukket minst 95% av bindingsaffiniteten av det tilsvarende antistoffmolekyl omfattende komplette donor CDRer. Som angitt over, i bestemte tilfeller, kan affiniteten for antistoffet ifølge oppfinnelsen være større enn den til donorantistoffet. Anvendelse av et hybrid CDR gir fordeler med reduksjon av mengden av fremmed (dvs. donor) sekvens tilstede i antistoffmolekylet og kan øke antistoffmolekylets bindingsaffinitet sammenlignet med det tilsvarende antistoffmolekyl som omfatter komplette donor CDRer.

Hvilken som helst av CDRene i antistoffmolekylet kan være hybrid. CDR2 i den tunge kjede er foretrukket hybrid i antistoffmolekylet.

Trunkeringen av donor CDR er foretrukket fra 1 til 8 aminosyrer, mere foretrukket fra 4 til 6 aminosyrer. Det er videre foretrukket at trunkeringen gjennomføres ved C-terminalen til CDR.

Avhengig av sekvensen til den trunkerte del av CDR og sekvensen til den forskjellige sekvens som erstatter den manglende del, kan en rekke aminosyreforandringer gjøres. Foretrukket gjennomføres minst 2 aminosyreforandringer, mere foretrukket minst 3 aminosyreforandringer mest foretrukket gjennomføres minst 4 aminosyreforandringer.

En særlig utførelse av dette aspekt av oppfinnelsen er et antistoff ifølge det første aspekt av oppfinnelsen hvor det andre CDR i den tunge kjede har sekvensen gitt som SEQ ID NO:2. Dette har bedre affinitet for dets antigen enn donorantistoffet hvorfra en del av CDR er avledet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en nukleinsyresekvens som koder for antistoffmolekylet som omfatter et hybrid CDR ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en ekpresjonsvektor som inneholder nukleinsyresekvensen som koder for antistoffmolekylet som omfatter et hybrid CDR ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en vertscelle som er transformert med vektoren ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl som omfatter et hybrid CDR som omfatter dyrking av vertscellen ifølge oppfinnelsen og isolering av antistoffmolekylet.

Foreliggende oppfinnelse er videre, kun i illustrerende hensikt, beskrevet i de etterfølgende eksempler som refererer til de vedlagte tegninger, hvor: Figur 1 viser rammeregionene til human lett kjede subgruppe 1 sammenlignet med rammeregionene til hTNF40 lett kjede (SEQ ID NO:83 til 90),

figur 2 viser rammeregionene til human tung kjede subgruppe 1 og subgruppe 3 sammenlignet med rammeregionene til hTNF40 tung kjede (SEQ ID NO:91 til 98 og 106 til 109), figur 3 viser aminosyresekvensen til CDRene av hTNF40 (SEQ ID NO:1 til 7), hvor CDR H2' er et hybrid CDR hvor de C-terminale seks aminosyrer er fra H2 CDR-sekvensen til et humant subgruppe 3 germline antistoff og hvor aminosyreforandringene på sekvensen resulterende fra denne hybridisering er understreket,

figur 4 viser vektor pMR15.1,

figur 5 viser vektor pMR14,

figur 6 viser nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens av det murine hTNF40VI (SEQ ID NO:99),

figur 7 viser nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens av det murine hTNF40Vh (SEQ ID NO: 100),

figur 8 viser nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens av hTNF40-gl_1 (SEQ ID NO:8),

figur 9 viser nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens av hTNF40-gl_2 (SEQ ID NO:9),

figur 10 viser nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens av gh1hTNF40.4 (SEQ ID NO:10),

figur 11 viser nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens av gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11),

figur 12 viser vektor CTIL5-gL6,

figur 13 viser strukturen til en forbindelse betegnet CDP870 omfattende et modifisert Fab-fragment avledet fra antistoff hTNF40 kovalent koblet via en cysteinrest til en lysyl-maleimidlinker hvor hver aminogruppe på lysylresten har kovalent bundet dertil en metoksy PEG-rest hvor n er omtrent 420,

figur 14 viser vektor pTTQ9,

figur 15 viser sekvensen av OmpA oligonukleotidadapteren (SEQ ID NO: 101), figur 16 viser vektor pACYC184,

figur 17 viser vektor pTTO-1,

figur 18 viser vektor pTTO-2,

figur 19 viser vektor pDNAbEng-G1,

figur 20 viser oligonukleotidkassettene som koder for forskjellige intergeniske sekvenser for E. coli modifisert Fab ekspresjon (SEQ ID NO:102 til 105),

figur 21 viser periplasmisk modifisert Fab akkumulering av IGS-varianter,

figur 22 viser vektor pTTO(CDP870),

figur 23 viser sykdomsaktivitetscoren (DAS) i pasienter behandlet med ulike doser av CDP870 og placebo. Median og IQ-områder er angitt for per-protokollpopulasjon med siste observasjon overført. Små firkanter indikerer placebo, romber indikerer 1 mg/kg, trekanter indikerer 5 mg/kg og store firkanter indikerer 20 mg/kg,

figur 24 viser antallet ømme ledd, antallet hovne ledd, smerte-score, fagmannens globale vurdering av sykdomsaktivitet, modifisert "health assessment questionnaire" (HAQ), C reaktivt protein (CRP) og erytrocytt- sedimenteringsrate (ESR) i pasienter behandlet med forskjellige doser av CDP870 og placebo. Median og IQ område er angitt for pre-protokollpopulasjonen med siste observasjon overført. Små firkanter indikerer placebo, romber indikerer 1 mg/kg, trekanter indikerer 5 mg/kg og store firkanter indikerer 20 mg/kg.

EKSEMPLER

Genkloning og ekspresjon av et kimært hTNF40 antistoffmolekyl

RNA fremstilling fra hTNF40 hybridomceller

Total RNA ble fremstilt fra 3 x 107 hTNF40 hybridomceller som beskrevet under. Cellene ble vasket i fysiologisk saltoppløsning og oppløst i RNAzol (0,2 ml per 10<6>celler). Kloroform (0,2 ml per 2 ml homogenat) ble tilsatt, blandingen ble rystet kraftig i 15 sekunder og deretter etterlatt på is i 15 minutter. De oppnådde vandige og organiske faser ble separert ved sentrifugering i 15 minutter i en Eppendorf sentrifuge og RNA ble presipitert fra den vandige fase ved tilsetning av et likt volum isopropanol. Etter 15 minutter på is ble RNA pelletisert ved sentrifugering, vasket med 70% etanol, tørket og oppløst i sterilt, RNAsefritt vann. Utbyttet av RNA var 400 ug.

PCR-kloning av hTNF40 Vh og VI

cDNA sekvenser som koder for de variable domener av hTNF40 tung og lett kjede ble syntesisert ved anvendelse av revers transskriptase for å produsere enkelttrådete cDNA kopier av mRNA tilstede i det totale RNA, etterfulgt av Polymerase Chain Reaction (PCR) på cDNAene med spesifikke oligonukleotid primere.

a) cDNA syntese

cDNA ble syntesisert i et 20 ul reaksjonsvolum inneholdende de etterfølgende

reagenser: 50mM Tris-HCI pH, 8,3, 75 mM KCI, 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCI2, 0,5 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 20 enheter RNAsin, 75 ng random heksanukleotidprimer, 2 ug hTNF40 RNA og 200 enheter Moloney Murine Leukemia Virus revers transkriptase. Etter inkubasjon ved 42°C i 60 minutter ble reaksjonen terminert ved oppvarming ved 95°C i 5 minutter.

b) PCR

Alikvoter av cDNA ble underkastet for PCR ved anvendelse av kombinasjonen av

primere som er spesifikke for de tunge og lette kjeder. Nukleotidsekvensene til 5' primerne for de tunge og lette kjeder er henholdsvis vist i tabeller 1 og 2. Disse sekvenser inneholder alle, i rekkefølge, et restriksjonssete som starter 7 nukleotider fra deres 5' ender, sekvensen GCCGCCACC (SEQ ID NO: 12), for å tillate optimal translasjon av de resulterende mRNAer, et initeringskoden og 20-30 nukleotider basert på lederpeptidsekvensene til kjente museantistoffer (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).

3' primerne er vist i tabell 3. Lett kjede primeren spenner over J-C-forbindelsen til antistoffet og inneholder et restriksjonssete for enzymet Sp11 for å forenkle kloning av V1 PCR fragmentet. Tung kjede 3' primerne er en blanding som er utformet til å spenne over J-C forbindelsen til antistoffet. 3' primeren inkluderer et Apal restriksjonssete for å forenkle kloning. 3' regionen av primerne inneholder en blandet sekvens basert på dem funnet i kjente museantistoffer (Kabat et al., 1991, supra).

Kombinasjonene av primere beskrevet over muliggjør at PCR-produktene for Vh og VI kan klones direkte inn i en passende ekspresjonsvektor (se under) for å danne kimære (mus-human) tunge og lette kjeder og at disse gener kan uttrykkes i pattedyrceller for å danne kimære antistoffer av ønsket isotype.

Inkubasjoner (100 ul) for PCR ble satt opp som følger. Hver reaksjon inneholdt 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01% vekt/volum gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 10 pmol 5' primer blanding (tabell 4), 10 pmol 3' primer (CL12 (lett kjede) eller R2155 (tung kjede) (tabell 3)), 1 ul cDNA og 1 enhet Taq polymerase. Reaksjoner ble inkubert ved 95°C i 5 minutter og deretter syklisert gjennom 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter 30 sykluser ble alikvoter fra hver reaksjon analysert ved elektroforese på en agarosegel. Lett kjede reaksjoner som inneholdt 5' primerblandinger fra lett kjede pooler 1, 2 og 7 ga bånd med størrelser som var konsistente med full lengde VI fragmenter, mens reaksjonen fra tung kjede reaksjonspool 3 ga et fragment med en størrelse forventet av et Vh gen. Båndet dannet ved lett kjede pool 1 primerne ble ikke fulgt opp da tidligere resultater hadde vist at dette bånd svarer til et lett kjede pseudogen produsert ved hjelp av hybridomceller. Båndet produsert ved lett kjede pool 7 primerne var svakere enn båndet fra pool 2 primerne og ble derfor ikke fulgt opp. Kun båndet fra lett kjede reaksjonspool 2, som var det sterkeste båndet, ble fulgt opp.

c) Molekylær kloning av PCR-fragmentene

DNA-fragmentene dannet i lett kjede reaksjonspoolen 2 ble kuttet med enzymene

BstBI og Spil, konsentrert ved etanol presipitering, underkastet elektroforese på en 1,4% agarosegel og DNA-bånd i området 400 basepar ble utvunnet. Disse ble klonet ved ligering inn i vektoren pMR15.1 (figur 4) som var blitt underkastet restriksjon med BstBI og Sp11. Etter ligering ble blandinger transformert in i E. coli LM 1035 og plasmider fra de resulterende bakteriekolonier ble screenet for insersjoner ved kutting med BstBI og Sp11. Representativer med insersjoner fra hver ligering ble analysert videre ved nukleotidsekvensering.

På tilsvarende måte ble DNA-fragmentene dannet i tung kjede reaksjonspool 3 kuttet med Hindi 11 og Apal og klonet inn i vektoren pMR14 (figur 5) som var blitt underkastet restriksjon med Hindi 11 og Apal. Igjen ble representative plasmider som inneholdt insersjoner analysert ved nukleotidsekvensering.

d)Nukleotid sekvensanalyse

Plasmid DNA fra en rekke isolater inneholdende Vh-insersjoner ble sekvensert ved

anvendelse av primerne R1053 (se tabell 5) (som primer i 3' regionen av HCMV-promoteren i pMR14) og R720 (se tabell 5) (som primer i 5' region av human C-gamma 4 og tillater sekvensering gjennom DNA insersjonen på pMR14). Det ble funnet at nukleotidsekvensene til Vh insersjonen i en rekke kloner var identiske, unntatt for forskjeller i signalpeptidet og J-regionen. Dette indikerte at klonene som undersøkes er uavhengige isolater som stammer fra anvendelsen av forskjellige primere fra blandingen av oligonukleotider under PCR-stadiet. Den bestemte nukleotidsekvens og predikterte aminosyresekvens av det variable domenet av den tunge kjede til antistoff hTNF40 (hTNF40Vh) er gitt i figur 7 (SEQ ID NO:100).

For å analysere lett kjede klonene, ble sekvensen avledet fra priming med R1053 (se tabell 5) og R684 (SEQ ID NO:62) (som primer i 5' regionen av human C-kappa og tillater sekvensering gjennom DNA-insersjonen på pMR15.1) undersøkt. Nukleotidsekvensen og den predikterte aminosyresekvens til Vl-genene som skyldes reaksjoner i pool 2 ble tilsvarende analysert. Igjen ble det funnet at nukleotidsekvensene til Vl-insersjonen i en rekke kloner var identiske, unntatt for forskjeller i signalpeptidet og J-regionene, som indikerer at de undersøkte kloner var uavhengige isolater som kommer av anvendelsen av ulike primere fra blandingen av oligonukleotider anvendt under PCR-stadiet. Den bestemte nukleotidsekvens og predikterte aminosyresekvens til det variable domenet av lett kjeden av antistoff hTNF40 (hTNF40VI) er gitt i figur 6 (SEQ ID NO:99).

Evaluering av aktiviteter til kimære gener.

Aktivitetene til de kimære gener ble evaluert ved å uttrykke dem i pattedyrceller å rense og kvantifisere de nylige syntesiserte antistoffer. Metodologien for dette er beskrevet under, etterfulgt av en beskrivelse av de biokjemiske og cellebaserte analyser anvendt for den biologiske karakterisering av antistoffene.

a) Fremstilling av kimært hTNF40 antistoffmolekyl

Kimært antistoff for biologiske evaluering ble fremstilt ved transient ekspresjon av

de passende tung og lett kjede parene etter ko-transfeksjon inn i Chinese Hamster Ovary (CHO) celler ved anvendelse av kalsiumfosfatpresipitering.

På dagen før transfeksjon, ble semi-konfluente kolber av CHO-L761-celler trypsinbehandlet, cellene ble talt og T75-kolber ble satt opp som hver hadde 10<7->celle.

Neste dag ble dyrkingsmediet forandret 3 timer før transfeksjon. For transfeksjon ble kalsiumfosfatpresipitatet fremstilt ved å blande 1,25 ml 0.25M CaCI2 inneholdende 50 ug av hver av tung og lett kjede ekspresjonsvektorer med 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCI, 11,0 g HEPES og 0,4 g Na2HP04i 1 liter vann med pH innstilt til 7,1 med NaOH) og umiddelbar tilsetning til mediet av cellene. Etter 3 timer ved 37°C i C02inkubator ble medium og presipitat fjernet og cellene ble sjokkbehandlet ved tilsetting av 15 ml 15% glycerol i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 1 minutt. Glycerol ble fjernet, cellene ble vasket en gang med PBS og inkubert i 48-96 timer i 25 ml medium inneholdende 10 mM natriumbutyrat. Antistoff kunne renses fra dyrkingsmediet ved binding til og eluering fra protein A-Sepharose.

b) ELISA

For ELISA, ble Nunc ELISA-plater belagt over nattet ved 4°C med et F(ab)2-fragment av et polyklonalt geit anti-humant Fc fragment spesifikt antistoff (Jackson Immunoresearch, code 109-006-098) ved 5 ug/ml i belegningsbuffer (15 mM natriumkarbonat, 35 mM natriumhydrogenkarbonat, pH 6,9). Ikke-belagt antistoff ble fjernet ved vasking 5 ganger med destillert vann. Prøver og rensede standarder som skulle kvantifiseres ble fortynnet til omtrent 1 ug/ml i konjugert buffer (0,1 M Tris-HCI, pH 7,0, 0,1 M NaCI, 0,2% volum/volum Tween 20, 0,2% vekt/volum Hammersten casein). Prøvene ble titrert i mikrotiterbrønnene i 2-ganger fortynninger til å gi et sluttvolum på 0,1 ml i hver brønn og platene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time med rysting. Etter det første inkubasjonstrinn ble platene vasket 10 ganger med destillert vann og deretter inkubert i 1 time som før med 0,1 ml av et mus monoklonalt anti-humant kappa (klon GD12) peroksidase-konjugert antistoff (The Binding Site, code MP135) ved en fortynning på 1 i 700 i konjugert buffer. Platen ble igjen vasket og substratoppløsning (0,1 ml) ble tilsatt til hver brønn. Substratoppløsningen inneholdt 150 ul N,N,N,N-tetrametylbenzidin (10 mg/ml i DMSO), 150 ul hydrogenperoksyd (30% oppløsning) i 10 ml 0,1 M natriumacetat/natriumcitrat, pH 6,0. Platen ble utviklet i 5-10 minuttet inntil absorbansen ved 630 nm var omtrent 1,0 for topp-standarden. Absorbans ved 630 nm ble målt ved anvendelse av en plateavleser og konsentrasjonen til prøven ble bestemt ved å sammenligne titreringskurvene med standardkurvene. c) Bestemmelse av affinitetskonstanter ved BiaCore analyse.

Bindingsinteraksjonen mellom hTNF40 og human TNF ble undersøkt ved

anvendelse av BIA-teknologi. Et affinitetsrenset geit polyklonalt antistoff, rettet mot den konstante region av hTNF40, ble immobilisert på dekstranpolymer-sensorchip-overflaten ved anvendelse av standard NHS/EDC-kjemi. Relativt lave nivåer (200-500 RU) av hTNF40 var fastholdt for å sikre at massetransporteffektene var

minimalisert. Humant TNF ved forskjellige konsentrasjoner ble ført over det fast-holdte hTNF40 for fastsettelse av assosiasjonskinetikkene. Etter injeksjonen av ligand, ble buffer ført over flaten slik at dissosiasjonen kunne måles. Assosiasjons- og dissosiasjons-hastighetskonstantene for interaksjonen mellom fast fase hTNF40 og human TNF ble beregnet, og en KDverdi ble utledet.

EKSEMPEL 1

CDR-poding av hTNF40

Molekylær kloning av gener for de variable regioner av de tunge og lette kjeder av hTNF40 antistoffet og deres anvendelse for å produsere kimære (mus-human) hTNF40 antistoffer er blitt beskrevet over. Nukleotid- og aminosyresekvensene til de murine hTNF40 VI og Vh er vist i henholdsvis figurer 6 og 7 (SEQ ID NO:99 og 100). Dette eksempel beskriver CDR-podingen av hTNF40 antistoffet.

CDR-poding av hTNF40 lett kjede

Oppstilling av rammeregionene av hTNF40 lett kjede med dem til de fire humane lett kjede subgrupper (Kabat et al., 1991, supra) viste at hTNF40 var mest homolog med antistoffer i human lett kjede subgruppe 1. Følgelig, for konstruksjon av CDR-podet lett kjede, korresponderte de valgte rammeregioner med dem til den humane gruppe 1 konsensus-sekvens.

En sammenligning av aminosyresekvensene til rammeregionen av murin hTNF40 og konsensus human gruppe 1 lett kjedene er gitt i figur 1 og viser at det er 22 forskjeller (understreket) mellom de to sekvenser. Analyse av bidraget som hvilken som helst av disse rammeforskjeller kan ha på antigenbinding identifiserer 2 rester for undersøkelse, disse er i stillinger 46 og 60. Basert på denne analyse, ble to versjoner av CDR-podet lett kjede konstruert. I den første av disse, hTNF40-gL1 (SEQ ID NO:8), er rester 46 og 60 avledet fra hTNF40 lett kjeden mens i den andre, hTNF40-gl_2 (SEQ ID N0:9), er alle rester human konsensus unntatt rest nummer 60 som er fra hTNF40 lett kjeden.

Konstruksjon av CDR-podet lett kjede hTNF40-gl_1.

Konstruksjonen av hTNF40-gl_1 er gitt nedenfor i detalj. De etterfølgende overlappende oligonukleotider (P7982-P7986) ble anvendt i polymerase-kjede-reaksjonene (PCR) for å sammenstille en trunkert podet lett kjede. Det sammenstilte fragment mangler antistoff-ledersekvensen og de første 17 aminosyrer av ramme 1.

En PCR-reaksjon, 100 ul ble oppstilt inneholdende, 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01% vekt/volum gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 2 pmol av P7982, P7983, P7984, P7985, P7986,10 pmol av P7980, P7981 og 1 enhet av Taq polymerase. Reaksjoner ble sykliserte gjennom 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter 30 sykluser ble hver reaksjon analysert ved elektroforese på en agaros gel og PCR-fragmentet ble skåret ut fra gelen og utvunnet ved anvendelse av et Mermaid Kit. Det oppnådde fragment ble underkastet restriksjon med enzymene BstEII og Spil i den passende buffer. Det oppnådde produkt ble til slutt underkastet elektroforese på en agarosegel og 270 basepar DNA fragmentet ble utvunnet fra en gelskive og ligert inn i vektor CTIL5-gL6 (figur 12), som på forhånd var blitt kuttet med de samme enzymer. Den ovennevnte vektor tilveiebringer den manglende antistoff-ledersekvens og de første 17 aminosyrer av ramme 1.

Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli stamme LM 1035 og de resulterende kolonier ble analysert ved PCRer, restriksjonenzym-kuttinger og nukleotid sekvensering. Nukleotid- og aminosyresekvensen for VI regionen av hTNF40-gL1 er vist i figur 8 (SEQ ID NO:8).

Konstruksjon av CDR-podet lett kjede hTNF40-gl_2

hTNF40-gl_2 (SEQ ID NO:9) ble konstruert ved anvendelse av PCR. De etterfølgende oligonukleotider ble anvendt for å introdusere

aminosyreforandringene:

To reaksjoner, hver på 20 ul, ble satt opp som hver inneholdt 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01% vekt/volum gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 0,1 ug hTNF40-gl_1, 6 pmol R1053/R5350 eller R5349/R684 og 0,25 enheter Taq polymerase. Reaksjoner ble syklisert gjennom 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter 30 sykluser ble hver reaksjon analysert ved elektroforese på en agarosegel og PCR fragmentene ble skåret ut fra gelen og utvunnet ved anvendelse av et Mermaid Kit.

Alikvoter av disse ble deretter underkastet for en andre runde av PCRer. Reaksjonen, 100 ul, inneholdt 10 mM Tris-HC1 pH 8,3,1,5 mM MgC12, 50 mM KCI, 0,01% vekt/volum gelatin, 1/5 av hver av PCR fragmentene fra den første gruppe av reaksjoner, 30 pmol R1053 og R684 og 2,5 enheter Taq polymerase. Reaksjonstemperaturene var som over. Etter PCR ble blandingen ekstrahert med fenol/kloroform og deretter med kloroform og presipitert med etanol. Etanolpresipitatet ble utvunnet ved sentrifugering, oppløst i den passende buffer og underkastet restriksjon med enzymene BstEII og Spil. Det oppnådde produkt ble til slutt underkastet elektroforese på en agarosegel og 270 basepar DNA fragmentet ble utvunnet fra en gelskive og ligert inn i vektoren pMR15.1 (figur 4) som på forhånd var blitt kuttet med de samme enzymene.

Ligeringsblandingen ble anvendt til å transformere E. coli LM 1035 og de oppnådde kolonier ble analysert ved PCR, restriksjonsenzymkuttinger og nukleotidsekvensering. Nukleotid- og aminosyresekvensen for VI region av hTNF40-glL2 er vist i figur 9 (SEQ ID NO:9).

CDR-poding av hTNF40 tung kjede

CDR-poding av hTNF40 tung kjede ble gjennomført ved anvendelse av den samme strategi som beskrevet for den lette kjede. hTNF40 tung kjede ble funnet til å være mest homolog med humane tunge kjeder som tilhører subgruppe 1 og konsensus-sekvensen av de humane subgruppe 1 rammeverk ble derfor valgt til å akseptere hTNF40 tung kjede CDRene.

For å undersøke kravet hos en homolog human ramme til å virke som en akseptorramme for CDR poding, ble en andre ramme, human gruppe 3, valgt for å humanisere hTNF40 tung kjede.

En sammenligning av hTNF40 med de to forskjellige rammeregioner er vist i figur 2 hvor det fremgår at hTNF40 avviker fra den humane subgruppe 1 konsensus i 32 posisjoner (understreket) og avviker fra den humane subgruppe 3 konsensus i 40 posisjoner (understreket). Etter analyse av bidraget som hvilken eller hvilke av disse kan gi til antigenbinding, ble rester 28, 38, 46, 67, 69 og 71 bibeholdt som donor i CDR-podet tung kjede gh1hTNF40.1, ved anvendelse av gruppe 1 rammen. Rester 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 og 78 ble bibeholdt som donor i CDR-podet tung kjede gh3hTNF40.4 ved anvendelse av gruppe 3 rammen. Rester 28, 69 og 71 ble bibeholdt som donor i CDR-podet tung kjede gh1hTNF40.4 ved anvendelse av gruppe 1 rammen.

Konstruksjon av CDR-podet tung kjede gh1hTNF40.4

gh1hTNF40.4 (SEQ ID NO:10) ble samlet ved underkaste overlappende oligonukleotider for PCR i nærvær av de passende primere. De etterfølgende oligonukleotider ble anvendt i PCR:

Gruppe 1 poding

Sammenstillingreaksjonen, 100 ul, inneholdt 10 mM Tris-Hcl pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01% vekt/volum gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 2 pmol av hver av p7989, p7990, p7991, p7995, p7992, p7993 og p7994, 10 pmol av hver av p7988 og p7987 og 1 enhet Taq polymerase. Reaksjoner ble syklisert gjennom 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter 30 sykluser ble reaksjonen ekstrahert med fe noi/kloroform (1/1), deretter med kloroform og presipitert med etanol. Etter sentrifugering ble DNA oppløst i den passende restriksjonsbuffer og kuttet med ApaLI og Kpnl. Det oppnådde fragment ble isolert fra en agarose gel og ligert inn i pMR14 (figur 5) som på forhånd var blitt kuttet med de samme enzymer. pMR14 inneholder human gamma 4 tung kjede konstant regionen når pMR14 er kuttet med ApaLI og Kpnl, idet den kuttede vektor er i stand til å motta det kuttede DNA slik at 3' enden av det kuttede DNA forenes i leserammen til 5' enden av sekvensen som koder for gamma 4 konstant regionen. Den tunge kjede som uttrykkes fra denne vektor vil derfor være en gamma 4 isotype. Ligeringsblandingen ble anvendt til å transformere E. coli LM1035 og resulterende bakteriekolonier ble screenet ved restriksjonskutting og nukleotidsekvensanalyse. På denne måte ble et plasmid identifisert som inneholdt den korrekte sekvens for gh1hTNF40.4 (figur 10) (SEQ ID NO:10).

Konstruksjon av CDR-podet tung kjede gh3hTNF40.4

gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11) ble sammenstilt ved å underkaste overlappende oligonukleotider for PCR i nærvær av de passende primere. De etterfølgende oligonukleotider ble anvendt i PCR:

Gruppe 3 poding

Sammenstillingsreaksjonen, 100 ul, inneholdt 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01% vekt/volum gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 2 pmol av hver av p7999, p8000, p8001, p7995, p7997, p7998 og p7993, 10 pmol av hver av p7996 og p7987 og 1 enhet Taq polymerase. Reaksjoner ble syklisert gjennom 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt. Etter 30 cykluser ble reaksjonen ekstrahert med fenyl/kloroform (1/1) og deretter med kloroform og presipitert med etanol. Etter sentrifugering ble DNA oppløst i den passende restriksjonbuffer og kuttet med ApaLI og Kpnl. Det oppnådde fragment ble isolert fra en agarosegel og ligert inn i pMR14 (figur 5) som på forhånd var blitt kuttet med de samme enzymer. pMR14 inneholdt human gamma 4 tung kjede konstant regionen. Når pMR14 kuttes med ApaLI og Kpnl, er den kuttede vektor istand til å motta det kuttede DNA slik at 3' enden av det kuttede DNA forenes i leserammen til 5' enden av sekvensen som koder for gamma 4 konstant regionen. Derfor vil den tunge kjede som uttrykkes fra denne vektor være en gamma 4 isotype. Ligeringsblandingen ble anvendt til å transformere E. coli LM1035 og resulterende bakteriekolonier ble screenet ved restriksjonkutting og nukleotidsekvensanalyse. På denne måte ble et plasmid identifisert som inneholdt den korrekte sekvens for gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11)

(figur 11).

Fremstilling av CDR-podet modifisert Fab fragment

Et CDR-podet, modifisert Fab fragment, basert på antistoff hTNF40, ble konstruert ved anvendelse av E. coli vektoren pTTO-1. De variable regioner av antistoff hTNF40 sub-klones inn i denne vektor og den intergeniske sekvensen optimaliseres for å danne pTTO(CDP870). pTTO ekspresjonsvektoren designes for å føre til oppløselig, periplasmisk akkumulering av rekombinante proteiner i E. coli. Hovedtrekkene til dette plasmid er: (i) tetracyklin-resistensmarkør - antibiotika ikke inaktivert ved produktet av resistens-gen, følgelig er seleksjon for plasmidholdige celler opprettholdt, (ii) lavt kopitall - replikasjons-origo avledet fra plasmid p15A, som er kompatibelt med plasmider inneholdende colE1 avledede replikoner, (iii) sterk, induserbar tac promoter for transkripsjon av et eller flere klonede gener, (iv) lacl<q>gen - gir konstitutiv ekspresjon av lac-repressorproteinet, opprettholder tac promotoren i den undertrykte tilstand inntil induksjon med IPTG/allolaktose, (v) OmpA signalsekvens - gir periplasmisk sekresjon av et eller flere klonede gener, og (vi) translasjonskobling av OmpA signalsekvens til et kort lacZ peptid, gir effektiv initiering av translasjon.

Vektoren er blitt utviklet for ekspresjon av modifiserte Fab fragmenter fra en di-cistronisk message ved design av en metode for å selektere empirisk den optimale intergeniske sekvens fra en serie av fire formålsbestemte kassetter. Anvendelsen av denne i konstruksjonen av pTTO(CDP870) er beskrevet.

Materialer og metoder

DNA teknikker

Standardteknikker ble anvendt for protokoller som inkluderer DNA restriksjon, agarosegelelektroforese, ligering og transformasjon. Restriksjonsenzymer og DNA modifiserende enzymer ble oppnådd fra New England Biolabs eller Boehringer Mannheim, og ble anvendt i henhold til produsentens anbefalinger. DNA fragmenter ble renset fra agarose ved anvendelse av GeneClean protokollen (BIO 101). Oligonukleotider ble supplert ved Oswel Oligonucleotide Service og ble syntetisert i 40 nm målestokken. Plasmid DNA ble isolert ved anvendelse av Plasmid DNA Mini/Midi kit fra Qiagen. PCR ble gjennomført ved anvendelse av Perkin Eimer "Amplitaq" som anbefalt. DNA sekvenseringen ble utført ved anvendelse av "the Applied Biosystems Taq cycle sequencing kit".

Rystekolbe induksjon

E. coli W3110 kulturer ble dyrket i L-medium supplert med tetracyklin (7,5 ug/ml). For induksjoner ble nye kulturer som var dyrket over natten (dyrket ved 30°C) fortynnet til en OD600på 0,1 i 200 ml L-medium i en 2 L plate-kolbe og ble dyrket ved 30°C i en orbital inkubator. Ved en OD6oopå 0,5, ble IPTG tilsatt til 200 uM. Prøver (normalisert for OD) ble tatt ved intervaller.

Periplasmisk ekstraksion

Dyrkingsprøver ble avkjølt på is (5 minutter) og deretter ble celler høstet ved sentrifugering. Etter resuspensjon i ekstraksjonsbuffer (100 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 7,4) ble prøver inkubert over natten ved 30°C, deretter klaret ved sentrifugering.

Sammenstillingsanalvse

Modifiserte Fab konsentrasjoner ble bestemt ved ELISA. Plater ble belagt ved 4°C over natten med anti-human Fd 6045 (2 ug/ml i belegningsbuffer, fysiologisk saltoppløsning, 100 ul per brønn). Etter vasking ble 100 ul prøve applisert per brønn, idet renset A5B7 gamma-1 Fab', opprinnelig ved 2 ug/ml, ble anvendt som en standard. Prøver ble seriefortynnet 2-ganger over platen i prøvekonjugatbuffer (per liter: 6,0 g trisaminometan, 2,92 g NaCI, 0,1 ml Tween-20, 1 ml kasein (0,2%)), og plater ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med rysting. Platene ble vasket og tørket, deretter ble 100 ul anti-human C-kappa (GD12) peroksidase tilsatt (fortynnet i prøvekonjugatbuffer). Inkubasjon ble gjennomført ved romtemperatur i 1 time med rysting. Platene ble vasket og tørket, deretter ble 100 ul substratoppløsning tilsatt (10 ml natriumacetat/citratoppløsning (0,1 M pH 6), 100 ul H2O2oppløsning, 100 ul tetrametylbenzidinoppløsning (10 mg/ml i dimetylsulfoksyd). Absorbans ved 630 nm ble avlest 4-6 minutter etter substrattilsetning.

Konstruksjon av plasmid pTTO- 1

(a) Erstatning av pTTQ9 polylinker

Plasmid pTTQ9 ble oppnådd fra Amersham og er vist i figur 14, En alikvot (2 ug) ble kuttet med restriksjonsenzymer Sali og EcoRI, kuttingen ble kjørt på en 1% agarosegel og det store DNA fragment (4520 bp) ble renset. To olignukleotider ble syntetisert som, når annealet tilsammen, koder for OmpA polylinkerregionen vist i figur 15. Denne sekvens har kohesive ender som er kompatible med Sali og EcoRI endene dannet ved restriksjon av pTTQ9. Ved kloning av denne oligonukleotid "kassett" inn i pTTQ9 vektoren, regenereres ikke Sali setet, men EcoRI setet opprettholdes. Kassetten koder for de første 13 aminosyrer av signalsekvensen av E. coli ytter-membranproteinet Omp-A, som kommer etter Shine Dalgarno ribosom bindingsetet av OmpA genet. I tillegg er restriksjonseter for enzymer Xbal, Munl, Styl og Spil tilstede. Munl og Styl setene er innen koderegion av OmpA signalsekvensen og er tenkt som 5' kloningssetene for insersjon av gener. De to oligonukleotider som utgjør denne kassett ble annealet sammen ved blanding med en konsentrasjon på 5 pmol/ul og oppvarming i et vannbad til 95°C i 3 minutter, deretter sakte avkjøling til romtemperatur. Den annealede sekvens ble deretter ligert inn i Sall/EcoRI kuttingen pTTQ9. Det oppnådde plasmid-mellomprodukt, betegnet pTQOmp, ble verifisert ved DNA sekvensering.

(b) Fragmentfremstilling og ligering

Plasmid pTTO-1 ble konstruert ved ligering av et DNA fragment fra plasmid pACYC184 til to fragmenter dannet fra pTQOmp. Plasmid pACYC184 ble oppnådd fra New England Biolabs, og et restriksjonskart er vist i figur 16. En alikvot (2 ug) ble kuttet fullstendig med restriksjonenzym Styl, deretter behandlet med Mung Bean Nuclease, denne behandling danner butte ender ved kutting av 5' base overheng. Etter fenolekstraksjon og etanolpresipitering, ble DNA underkastet restriksjon med enzym Pvull, med dannelse av fragmenter på 2348, 1081, 412 og 403 bp. 2348 bp fragmentet ble renset etter agarosegelelektroforese. Dette fragment koder for tetracyklinresistensmarkøren og p15A replikasjons-origo. Fragmentet ble deretter behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm for å fjerne 5' terminale fosfater, for derved å forhindre selv-ligeringen av dette molekyl.

En alikvot (2 ug) av plasmid pTQOmp ble kuttet med enzymer Sspl og EcoRI, og 2350 bp fragmentet ble renset fra uønskede fragmenter på 2040 bp og 170 bp etter agarosegelelektroforese, idet dette fragment koder for transkripsjons-terminator-regionen og lacl<q>genet. En annen alikvot (2 ug) av pTQOmp ble kuttet med EcoRI og Xmnl, med dannelse av fragmenter på 2289,1670, 350 og 250 bp. 350 bp fragmentet, som koder for tac promoteren, OmpA signalsekvens og multi-kloningsete, ble gelrenset.

De tre fragmenter ble deretter ligert ved anvendelse av passende ekvimolare mengder av hvert fragment, for å danne plasmidet pTTO-1. Alle kloningsforeninger ble verifisert ved DNA sekvensering. Restriksjonskartet for dette plasmid er vist i figur 17. Plasmid pTTO-2 ble deretter dannet ved insersjon av DNA som koder for human lg lett kjede kappa konstant domenet. Dette ble oppnådd som et Spl I - EcoRI restriksjonsfragment fra plasmid pHC132, og insertert inn i de tilsvarende seter i pTTO-1. Plasmid pTTO-2 er vist i figur 18.

Insersjon av humaniserte hTNF40 variable regioner inn i

pTTO- 2

Variabel lett kjede regionen hTNF40gl_1 (SEQ ID NO:8) ble oppnådd ved PCR "rescue" fra den tilsvarende vektor for pattedyrcelleekspresjon pMR10.1. OmpA ledersekvensen erstatter den native lg leder. Sekvensen til PCR primerne er vist under:

Etter PCR under standard betingelser ble produktet renset, kuttet med enzymer Munl og Spil, deretter gelrenset. De rensede fragment ble deretter insertert inn i Munl/Spll setene av pTTO-2 for å danne lett kjede mellomproduktet pTTO(hTNF40L).

Variabel tung kjede regionen av gh3hTNF40.4 ble oppnådd på samme måte fra vektoren pGamma-4. Sekvensen til PCR primerne er vist under:

Etter PCR ble produktet renset, kuttet med enzymer Nhel og Apal og deretter subklonet inn i vektoren pDNAbEng-G1 (figur 19). Etter verifikasjon ved DNA sekvensering, ble den tunge kjede underkastet restriksjon med enzym EcoRI og sub-klonet inn i EcoRI setet av pTTO(hTNF40L) for å danne E. coli ekspresjonsplasmidet pTTO(hTNF40).

Optimalisering av intergenisk sekvens for modifisert Fab ekspresjon

I pTTO vektoren forekommer modifisert Fab ekspresjon fra en di-cistronisk message som først koder for lett kjede og deretter tung kjede. DNA sekvensen mellom de to genene (intergenisk sekvens, IGS) kan innvirke på ekspresjonsnivået av den tunge kjede ved å påvirke translasjonsinitieringsraten. En kort intergenisk sekvens kan for eksempel resultere i translasjons-kobling mellom de lette og tunge kjeder, ved at det translaterende ribosom muligens ikke dissosierer fullstendig fra mRNA etter komplettering av lett kjede syntese før initering av tung kjede syntese. "Styrken" av et hvilket som helst Shine Dalgarno (SD) ribosom bindingsete (homologi til 16S rRNA) kan også ha en effekt, og likeså distansen og sekvenssammensetningen mellom SD og ATG startkodonet. Den potensielle sekundære struktur av mRNA rundt ATG er en annen viktig faktor, idet ATG bør være i en "sløyfe" og ikke sperret inne i en "stamme", mens det motsatte gjelder for SD. Således ved modifisering av sammensetning og lengde av IGS er det mulig å modifisere styrken av translasjonsinitiering og derfor nivået av tung kjede produksjon. Det er sannsynlig at en optimal translasjonsinitieringsrate må oppnås for å maksimere ekspresjon av den tunge kjede til et gitt modifisert Fab. Med et modifisert Fab kan for eksempel et høyt ekspresjonsnivå tolereres, men for et annet modifisert Fab med en annen aminosyresekvens vil et høyt ekspresjonsnivå vise seg å være toksisk, kanskje på grunn av forskjellige effektiviteter med hensyn til sekresjon eller folding. På grunn av dette, ble en serie av fire intergeniske sekvenser designet (figur 20), som tillater den impiriske bestemmelse av den optimale IGS for hTNF40-basert modifisert Fab. IGS1 og IGS2 har svært korte intergeniske sekvenser (henholdsvis -1 og +1) og vil kunne forventes å gi nær koblet translasjon, idet Sd sekvensene (understreket) er hårfint forskjellige. Disse to sekvenser vil sannsynlig gi et høyt translasjonsinitieringsnivå. IGS3 og IGS4 har en lenger avstand mellom start- og stopp-kodoner (+13) og avviker i deres sekvenssammensetning, idet IGS3 har en "sterk" SD sekvens. Alle sekvenser ble studert for sekundærstruktur (ved anvendelse av m/fold-program) og "optimalisert" i den grad det er mulig, men med tett translasjonskopling av de to kjedene betyr mangel på ribosomal dissosiasjon imidlertid at mRNA muligens ikke er "naken", og forebygger sekundærstrukturdannelse.

Kloning av IGS varianter

IGS kassettene vist i figur 20 har flankerende Sacl og Munl kloningsseter. De ble bygget ved å anneale komplementære oligonukleotidpar. Et vektorfragment ble fremstilt ved å kutte pTTO(hTNF40) med Sacl og Noti, og et tung kjede fragment ble fremstilt ved å kutte pDNAbEngG1(hTNF40H) med Munl og Noti. Tre-veis ligeringer ble deretter utført ved anvendelse av ekvimolare mengder av de to restriksjonsfragmenter og omtrent 0,05 pmol av hver annealede oligo kassett. Dette dannet de fire ekspresjonsplasmider pTTO(hTNF40 IGS-1), pTTO(hTNF40 IGS-2), pTTO(hTNF40 IGS-3), pTTO(hTNF40 IGS-4).

Rvstekolbe- ekspresionsanalvse

De fire plasmider ble transformert inn i E. coli stamme W3110 sammen med det originale ekspresjonskonstrukt, og ble deretter analysert for ekspresjon i rystekolber som beskrevet. Resultatene fra et typisk forsøk er vist i figur 21. De forskjellige intergeniske sekvenser gir ulike ekspresjonsprofiler. IGS1 og IGS2 akkumulerer periplasmisk modifisert Fab hurtig med en topp 1 time etter induksjon, hvoretter nivået som her fremkommer faller. Toppen er større og faller raskere for IGS1. Disse resultater er konsistent med et høyt syntesenivå, som forventet for nær translasjonskobling for disse konstrukter. IGS1 gir tilsynelatende et høyere nivå av tung kjede ekspresjon enn IGS2 gjør. I denne forbindelse, fremgår det at dette høye ekspresjonsnivå tolereres dårlig, da periplasmiske ekspresjonsnivåer faller etter 1 time toppen. Dette ser man på vekstprofilen av IGS1 kulturen (ikke vist), som har en topp 1 time etter induksjon før den faller, som foreslår celledød og lysis. IGS3 akkumulerer modifisert Fab saktere men har en topp 2 timer etter induksjon med en høyere toppverdi (325 ng/ml/OD), før nivåene faller. Veksten for denne kultur fortsetter 3 timer etter induksjon og når en høyere topp-biomasse (ikke vist). Dette er konsistent med et lavere nivå av tung kjede syntese. IGS4 akkumulerer likevel material ved en langsommere hastighet og mislykkes i å nå den høye produktivitetstopp til de andre 3 konstrukter. Alle IGS varianter gjør det signifikant bedre enn den opprinnelige vektor. Hypotesen om at de forskjellige sekvenser gir forskjellige grader av translasjonsinitiering understøttes av disse forsøksresultater. For det hTNF40-baserte modifiserte Fab fremgår det at en høy grad av tung kjede translasjonsinitiering tolereres dårlig og er derfor ikke optimal. En langsommere rate, som gitt ved IGS3, resulterer i bedre vekstegenskaper og følgelig akkumulerer et større utbytte over tid.

Etter sammenligning av produktivitet i fermentoren ble IGS3 konstruktet selektert som det beste og ble betegnet pTTO(CDP870), se figur 22.

Den tunge kjede kodet for av plasmidet pTTO(CDP870) har sekvensen gitt i SEQ ID NO:115 og den lette kjede har sekvensen gitt i SEQ ID NO:113.

PEGvlering av CDR- podet, hTNF40- basert modifisert Fab

Det rensede modifiserte Fab konjugeres sete-spesifikt med et forgrenet molekyl av PEG. Dette oppnås ved aktivering av en enkel cysteinrest i en trunkert hengselregion av det modifiserte Fab, etterfulgt av reaksjon med (PEG)-lysylmaleimid som tidligere beskrevet (A.P. Chapman et al., Nature Biotechnology 17, 780-783, 1999). Det PEGylerte molekyl er vist i figur 13 og betegnes forbindelse CDP870.

Effektivitet av PEGylert CDR- podet, hTNF40- basert modifisert Fab ( CDP870) for å behandle reumatoid artritt.

CDP870 har en lang halveringstid på omtrent 11 dager.

Man har evaluert sikkerhet og effektivitet av intravenøs CDP870 i et randomisert dobbel-blind placebokontrollert dose- eskalerende forsøk i pasienter med RA.

Metoder

Pasienter.

Pasienter i en alder mellom 18 og 75 år og som tilfredsstilte de 1987 reviderte American College of Rheumatology (ACR) diagnostiske kriterier for reumatoid artritt (RA) (Arnett et al., Arthritis Rheum., 31_, 315-324, 1988) ble rekruttert fra polikliniske reumatologiklinikker i London, Cambridge, Norfolk og Norwich (United Kindom). Pasienter måtte ha en klinisk aktiv sykdom som definert ved å ha minst 3 av de etterfølgende kriterier: > 6 smertefulle eller ømme ledd,

> 45 minutter tidlig morgenstivhet, og erytrocytt sedmenteringshastighet (ESR) >

28 mm/t. De må ha mislykkes i å respondere på minst ett Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug (DRARD) og de har vært ute av behandling i minst 4 uker. Kortikosteroider ble tillatt dersom dosen var > 7,5 mg/dag av prednisolon. Gravide kvinner, ammende kvinner og kvinner som har potensial til å få barn som ikke anvendte en effektiv prevensjonsmetode ble utelukket. Pasienter ble også utelukket dersom de hadde en tidligere historie vedrørende malignitet, samtidige alvorlige ukontrollerte medisinske tilstander, tidligere svikt i TNFa-nøytraliserende terapi eller allergi overfor polyetylenglykol. Skrevne informative samtykker ble oppnådd fra hver pasient før innskriving. Studiet ble godkjent av de lokale forsknings-etikk-komiteer.

Behandlingsprotokoll:

36 RA pasienter ble oppdelt i 3 grupper som hver mottok en økende dose av forsøkslegemiddelet (1,5 eller 20 mg/kg). Hver gruppe på 12 ble oppdelt tilfeldig i 8 for å motta CDP870 og 4 for å motta placebo. CDP870 ble gitt som en enkelt intravenøs infusjon (totalt 100 ml) i løpet av 60 minutter. Placebo (natriumacetatbuffer) ble likeledes gitt som en enkelt intravenøs infusjon på 100 ml i løpet av 60 minutter. Behandling ble gitt på en poliklinisk basis. Etter 8 uker hadde alle pasienter muligheten til å motta en infusjon av enten 5 eller 20 mg/kg CDP870 valgfritt.

Klinisk vurdering:

RA sykdomsaktivitet ble vurdert på grunnlag av the World Health Organization and International League of Associations for Rheumatology (Boers et al., J. Rheumatol - Supplement, 41., 86-89,1994) og European League Against Rheumatism (EULAR) Scott et al., Clin. Exp. Rheumatol., 10, 521-525, 1992) kjernedatasett med 28 leddtellinger. Forandringer i sykdomsaktivitet ble vurdert ved Disease Activity Score (Prevoo et al., Arthritis Rheum,. 38, 44-48, 1995) og ACR responskriteriene (Felson et al., Arthritis Rheum., 38, 727-735, 1995). Vurderinger ble gjennomført før behandling og 1, 2, 4, 6 og 8 uker etter terapi. Pasienter ble også vurdert med hensyn til sikkerhet og toleranse av det legemiddel som studeres. Hematologi, biokjemi, anti-CDP870 antistoffer og bivirkninger ble vurdert ved hvert besøk.

CDP870 plasmakonsentrasjon og anti- CDP870 antistoffer.

CDP870 ble målt ved "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). Seriefortynninger av pasientenes plasma ble inkubert i mokrotiter plater (Nunc) belagt med rekombinant human TNFa (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Innfanget CDP870 ble vist med pepperrotperokydase-konjugert geit anti-human kappa lett kjede (Cappel, ICN) etterfulgt av tetrametylbenzidin (TMB) substrat.

Antifstoffer overfor CDP870 ble screenet (ved 1/10 plasmafortynning) ved anvendelse av en dobbel antigen sandwich ELISA med biotinylert CDP870 som det andre lag. Bundne antistoffer ble vist ved anvendelse av HRP-streptavidin og TMB substrat. Analysen ble kalibrert ved anvendelse av en hyperimmun kanin IgG standard. En aktivitetsenhet er ekvalent med 1 ug av kaninstandarden.

Statistisk analyse

Studiet var eksplorativt av natur og prøvestørrelsen var basert på et tidligere forsøk med tilsvarende midler. Effektivitet av CDP870 ble analysert ved å beregne sykdomsaktivitets-score (DAS) og ACR20/50 responser for "intention to treat" og per-protokoll ved anvendelse av en lukket forsøksprosedyre. Sykdomsaktivitetsscoren ble beregnet som følger: DAS = 0,555 x kvadratrot av (28 ømme ledd) + 0,284 x kvadratrot av (28 hovne ledd) + 0,7 x In(ESR) + 0,0142 x (pasientens globale vurdering). Først ble de samlede aktive grupper sammenlignet med placebo. Dersom denne sammenligning var signifikant ved 5% nivået, ble hver doseringsgruppe sammenlignet med placebo. Alle sammen-ligninger var to-halet med et signifikansnivå på 5%. Alle P-verdier ble avledet fra eksplorative analyser og bør ikke anvendes for inferens-tolkning.

Resultater

Demografi:

36 pasienter med RA ble rekruttert. Deres demografiske detaljer er gitt i tabell 6. Gjennomsnittsalderen var 56 år og 30 pasienter var kvinner. Den gjennomsnittlige varighet av RA var 13 år og 21 pasienter var reumatoid-faktor positive. Pasienter i de forskjellige grupper har tilsvarende demografiske egenskaper. I blind-doseringsperioden, trakk 6/12 placebobehandlede pasienter seg fra studiet på grunn av forverrende RA > 4 uker etter dosering. 2/24 CDP870-behandlede pasienter trakk seg, begge i 1 mg/kg gruppen, med hensyn til forverrende RA/forsvunnet for oppfølging mer enn 4 uker etter dosering. Forskjellen var statistisk signifikant (p=0,009, Fisher nøyaktighetstest).

Den andel av pasienter med ACR20 forbedring for per-protokoll populasjonen med siste observasjon overført var

16,7, 50, 87,5 og 62,5% etter placebo, 1,5 og 20 mg/kg CDP870 (kombinert behandlingseffekt p=0,012) ved 4 uker og 16,7, 25,75 og 75% (p=0,032) ved 8 uker. Reduksjon i DAS score (median) for pre-protokoll populasjonen med siste observasjon overført var 0,15, 1,14, 1,91 og 1,95 etter placebo, 1,5 og 20 mg/kg CDP870 (kombinert behandlingseffekt p=0,001) ved 4 uker og 0,31, 0,09, 2,09 og 1,76 (p=0,008) ved 8 uker (figur 23). Forandringer i individuelle komponenter i "the World Health Organization and International League of Associations for

i Rheumatology" kjernedatasett er vist i figur 24.

Etter den åpne merkedose av CDP870 ble lignende fordelaktige effekter oppnådd. Av de 36 pasientene som var rekruttert inn i studiet, mottok 32 en andre infusjon av CDP870. Andelen av pasienter med ACR20 forbedring fra pre-første infusjon var 72,2 og 55,6% etter 5 og 20 mg/kg CDP870 ved 4 uker og 55,6 og 66,7% ved 8 uker.

Bivirkninger

> Behandling ble godt tolerert uten infusjonsrelatert reaksjon. Ingen allergisk reaksjon eller hudutslett ble rapportert. I dobbel-blindfasen, var det 19, 38, 8 og 14 bivirkninger i henholdsvis placebo og 1,5 og 20 mg/kg gruppene. Det vanligste var hodepine med 9 episoder i 5 pasienter (1 placebo, 3 ved 1 mg/kg, 1 ved 20 mg/kg). En pasient som mottok placebo og 3 pasienter som mottok CDP870 (1 ved 5 mg/kg og 2 ved 20 mg/kg) utviklet infeksjoner i nedre luftveier. Disse ble rapportert som milde eller moderate. De ble behandlet oralt med antibiotika og plagene forsvant i løpet av 1-2 ukers periode. Tre pasienter i hver av gruppene 1 og 5 mg/kg og en i gruppen 20 mg/kg utviklet en urinveisinfeksjon 1-2 måneder etter CDP870 behandling.

En bivirkning ble beskrevet som alvorlig som er en episode med nakkesmerter som forekom 3 dager etter infusjon med 1 mg/kg. Økning i anti-nukleært antistoff ble sett i 4 pasienter: 1 i placebogruppen (negativ til 1/40), 2 i 1 mg/kg gruppen (negativ til 1/40, negativ til 1/80) og 1 i 20 mg/kg gruppen (negativ til 1/40). Ingen forandring ble funnet i anti-DNA eller anti-kardiolipin antistoffer.

CDP870 plasmakonsentrasjon og anti- CDP870 nivåer.

Som forventet for alle dosenivåer av CDP870, forekom topp-plasmakonsentrasjonen på slutten av infusjonen og var doseproporsjonal med plasmakonsentrasjon som deretter sakte avtar. Plasmakonsentrasjonsprofilen for CDP870 viser seg å være tilsvarende den som tidligere er observert i frivillige hvor halveringstiden ble beregnet til å være omtrent 14 dager. Ved re-dosering ble en tilsvarende profil som enkeltdose infusjon observert.

Etter en enkelt intravenøs infusjon var anti-CDP870 nivåer lave eller ikke detekterbare.

Diskusjon

Nøytralisering av TNFa er en effektiv behandlingsstrategi i RA. Dette krever for tiden anvendelse av biologiske midler, slik som et kimært mAb eller et oppløselig reseptor/humant Fc fusjonsprotein, som er kostbare å fremstille. Et terapeutisk TNFa nøytraliserende middel må binde TNFa med høy affinitet og ha en lang plasma-halveringstid, lav antigenisitet og høy tolererbarhet og sikkerhet. Det må også være tilgjengelig for alle pasienter med RA som vil ha fordel av TNFa blokade. En teknologi som vil kunne oppnå disse formål er konjugeringen med

i polyetylenglykol av et TNFa bindende antistoff-frag ment dannet i E. coli. I dette preliminære studium har man funnet at CDP870, et PEGylert, anti-TNFa, modifisert Fab, er effektivt og godt tolerert av pasienter med RA.

In vitro studier har vist av CDP870 har tilsvarende TNFa nøytraliserende aktivitet som det murine anti-TNFa moderantistoff. Dette studium bekrefter at CDP870 reduserte inflammasjon og forbedret symptomer i RA. Klinisk forbedring som målt ved ACR20 responskriteriene i 5 og 20 mg/kg gruppene (75%, 75%) var sammenlignbare med etanercept (60%) (Moreland et al., Annals Int. Med., 130, 478-486, 1999) og infliksimab (50%) (Maini et al., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). i Ved de mellomste og høyeste doseringsnivåer som ble testet, varte den terapeutiske effekt 8 uker som er sammenlignbar med tidligere andre mAber (Elliott et al., Lancet, 344, 1105-1110, 1994 og Rankin et al, Br. J. Rheumatol, 34. 334-342, 1995). Tidligere studium har vist at den terapeutiske effekt av anti-TNFa antistoff er relatert til plasma-halveringstiden derav og dannelsen av sirkulerende antistoffer (Maini et al, Arthritis Rheum. 38, (Supplement): S186 1995 (Abstract)). Vårt studium viste at CDP870 har en plasma-halveringstid på 14 dager som er ekvivalent med den til et helt antistoff (Rankin et al., ( supra)) og mye lengre enn halveringstiden til ikke-konjugerte Fab' fragmenter. Videre dannet CDP870 kun svært lave nivåer av antistoffrespons.

Et av de viktige formål med dette studium er å undersøke tolererbarhet og sikkerhet i forbindelse med administrering av dette PEGylerte Fab'. I vårt studium synes CDP870 å være vel tolerert. Ytterligere studium vil dog være nødvendig for å vurdere langtids-toksisitet, særlig risikoen for demyelineringsykdom, infeksjon og hudutslett som er blitt rapportert med etanercept og infliksimab.

i Oppsummert, er CDP870 terapeutisk effektiv i RA og er vel tolerert i dette kortidsstudium.

Det skal forstås at de ovenfor angitte eksempler skal tjene som eksempel og ikke begrense rammen for oppfinnelsen som definert i de etterfølgende krav.

Claims

1. Antistoffmolekyl med spesifisitet for human TNFa, karakterisert ved at det inneholder a) en tung kjede hvor det variable domenet inneholder (i) sekvensen gitt i SEQ ID NO:1 for CDRH1, (ii) sekvensen gitt i SEQ ID NO:7 for CDRH2, og (iii) sekvensen gitt i SEQ ID NO:3 for CDRH3 og b) en lett kjede hvor det variable domenet inneholder (i) sekvensen gitt i SEQ ID NO:4 for CDRL1, (ii) sekvensen gitt i SEQ ID NO:5 for CDRL2, og (iii) sekvensen gitt i SEQ ID NO:6 for CDRL3.

2. Antistoffmolekyl ifølge krav 1 som er murint anti-TNFa monoklonalt antistoff hTNF40 med lett kjede sekvensen gitt i SEQ ID NO:99 og tung kjede sekvensen gitt i SEQ ID NO:100.

3. Antistoffmolekyl ifølge krav 1, som er et kimært antistoffmolekyl inneholdende lett og tung kjede variable domener av det monoklonale antistoffet ifølge krav 2.

4. Antistoffmolekyl ifølge krav 1, som er et CDR-podet antistoffmolekyl.

5. Antistoffmolekyl ifølge krav 4, hvor det variable domenet inneholder humane akseptor-rammeregioner og ikke-humane donor CDRer.

6. Antistoffmolekyl ifølge krav 5, hvor de humane akseptor-rammeregioner i det variable domenet til den tunge kjeden er basert på en human gruppe 1 konsensus sekvens og inneholder ikke-humane donorrester i stillinger 28, 69 og 71 i henhold til Kabat nummerering.

7. Antistoffmolekyl ifølge krav 5, hvor de humane akseptor-rammeregioner i det variable domenet til den tunge kjeden er basert på en human gruppe 1 konsensus sekvens og inneholder ikke-humane donorrester i stillinger 28, 38, 46, 67, 69 og 71 i henhold til Kabat nummerering.

8. Antistoffmolekyl ifølge krav 5, hvor de humane akseptor-rammeregioner av det variable domenet av den tunge kjeden er basert på en human gruppe 1 konsensus sekvens og inneholder ikke-humane donorrester i stillinger 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 og 78 i henhold til Kabat nummerering.

9. Antistoffmolekyl ifølge hvilket som helst av kravene 5 til 8, hvor de humane akseptor-rammeregioner i det variable domenet av den lette kjeden er basert på human gruppe 1 konsensussekvens og inneholder ikke-humane donorrester i stillinger 46 og 60 i henhold til Kabat nummerering.

10. Antistoffmolekyl ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 9 som er et fragment av et antistoff.

11. Antistoffmolekyl ifølge krav 10 som er et Fab, Fab', F(ab')2 eller Fv fragment; en lett kjede eller tung kjede monomer eller dimer eller et enkelt kjede antistoff.

12. Antistoffmolekyl ifølge krav 11, som er et modifisert Fab fragment som, i den C-terminale enden av dets tunge kjede, har en eller flere aminosyrer for å tillate festing av et effektor- eller reporter-molekyl.

13. Antistoffmolekyl ifølge krav 12, hvor de ytterligere aminosyrer danner en modifisert hengselregion inneholdende en eller to cysteinrester hvortil effektor-eller reporter-molekylet kan festes.

14. Antistoffmolekyl ifølge krav 13, hvor en maleimidgruppe er kovalent koblet til en enkelt tiolgruppe i den modifiserte hengselregion.

15. Antistoffmolekyl ifølge krav 14, hvor et lysin er kovalent bundet til maleimidgruppen.

16. Antistoffmolekyl ifølge krav 15, hvor en metoksypoly(etylenglykol)polymer med en molekylvekt på omtrent 20.000 Da er festet til hver av amingruppene i lysinet.

17. DNA, karakterisert ved at det koder for den tunge og/eller lette kjeden av antistoffmolekylet ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 13.

18. DNA ifølge krav 17, som inneholder sekvensen vist i SEQ ID NO:99 eller 100.

19. Kloning- eller ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder DNA ifølge krav 17 eller 18.

20. E. coli ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder DNA sekvensen ifølge krav 17 eller 18.

21. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 19 eller 20.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert ved at den omfatter dyrking av vertscellen ifølge krav 21 og isolering av antistoffmolekylet.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, hvor vertscellen er E. coli.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, hvor antistoffmolekylet er målrettet mot periplasmaet.

25. Diagnostisk preparat, karakterisert ved at det inneholder antistoffmolekylet ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 13.

26. Terapeutisk preparat, karakterisert ved at det inneholder antistoffmolekylet ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 13.

27. Antistoffmolekyl ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 13 som har spesifisitet for humant TNFa, for anvendelse i behandling av en patologi mediert ved TNFa.

28. Antistoffmolekyl ifølge krav 27 for anvendelse i behandling av en akutt eller kronisk immun og immunregulerende lidelse.

29. Antistoffmolekyl ifølge krav 28 for anvendelse i behandling av en inflammatorisk eller autoimmun lidelse.

30. Antistoffmolekyl ifølge krav 29 for anvendelse i behandling av reumatoid artritt, osteoartritt, Chrons sykdom eller psoriasis.

31. Anvendelse av antistoffmolekylet ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 13 med spesifisitet for human TNFa for fremstilling av et medikament for behandling av en patologi mediert ved TNFa.

32. Anvendelse ifølge krav 31, hvor patologien er en akutt eller kronisk immun og immunregulerende lidelse.

33. Anvendelse ifølge krav 32, hvor lidelsen er en inflammatorisk eller autoimmun lidelse.

34. Anvendelse ifølge krav 33, hvor lidelsen er reumatoid artritt, osteoartritt, Chrons sykdom eller psoriasis.

35. Plasmid, karakterisert ved at det er p TQOmp.

36. Plasmid, karakterisert ved at det er p TTO-1.