CZ20031044A3 - Způsob diagnostikování infekčních agens s využitím antigenových mimetik - Google Patents

Abstract

Způsob spočívá v identifikaci vazebně specifičnosti molekul antigenu a protilátky v séru metodou detekce protilátky antigenovou mimetikou (ADAM), spočívající ve screeningu fágové knihovny za použití séra pacientů infikovaných antigenem a neinfikovaných jedinců identifikací protilátek vážících peptidy (ligandy) specificky asociované se jmenovaným antigenem. Zdokonalení metody je provedeno dozráváním ligandů in vitro a vazbou ligandů na společnou strukturu (core), jimižjsou například MAP. Způsob diagnostikování hepatítidy C (HCV) spočívající ve screeningu fágové knihovny za použití séra od HCV pacientů a od neinfikovanýchjedinců identifikováním protilátek, které vážou ligandy, specifické pro infekci HCV.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká diagnostické zkoušky k detekci infekčních agens, zvláště virových agens, a obzvláště humánního viru hepatitidy C (zde zkráceně nazývaného HCV), peptidů vázajících protilátky proti infekčním agens vhodných pro zkoušku, a postupu přípravy jmenovaných peptidů a souprav k provádění jmenované zkoušky. Předložený vynález se týká zvláště peptidů vážících protilátky anti HCV vhodných k diagnostické zkoušce, postupu jejich přípravy a souprav k provádění jmenované zkoušky.

Dosavadní stav techniky

Virus hepatitidy C (HCV) je hlavním etiologickým agens parenterálně přenosné hepatitidy non A, non B. Tento virus velmi často působí přetrvávající infekci a často vede k vývoji chronické hepatitidy a cirhose jater, vytvářeje tak hlavně rozšířenou příčinu chronického onemocněni jater (Boyer, N., Marcellin, P.: Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C, J. Hepatol., 32,98-112, 2000).

Virové onemocnění je diagnostikováno detekcí protilátek proti HCV v séru nebo zjištěním virové RNA metodami amplifikace nukleové kyseliny (Robbins, D. J., Pasupuleti, V,, Cuan, J., Chiang, C.S.: Reverse transcriptase PCR quantification of hepatitis C virus, Clin. Lab. Sci., 13, 23 - 30, zima 2000). Tyto posledně jmenované metody jsou velice citlivé, avšak nákladné a

- 2 náchylné k technické nebo laboratorní chybě. Navíc spolehlivost a specifičnost techniky poíymerázové řetězové reakce (PCR) nejsou standardizovány (Gretch, D. R.: Diagnostic tests for hepatitis C, Hepatology, 26, (3, Suppk 1), 43S-47S, září 1997).

Předložený vynález se týká diagnostiky takových infekčních onemocnění, jako jsou virové infekce, zvláště infekce HCV, pomocí detekce protilátek vytvořených proti infekčnímu agens, a to zvláště protilátek proti HCV.

Zcela nedávno bylo referováno o systému citlivé detekce core proteinu HCV (Komatsu, F., Takasaki, K.: Liver, 19, (5), 375 380, říjen 1999).

Na téma diagnostických metod a souprav je tudíž v detekci HCV věnováno významné množství patentové i nepatentové literatury.

US patent 5,985,542 převedený na Sumitomo Chemical Company zajišťuje diagnostickou soupravu pro taková onemocnění jater jako jsou hepatitida C a alkoholická cirrhosa, která obsahuje protilátky schopné rozpoznat cytochrom P450.

US patent 5,972,347 převedený na Baxter Aktiengesellschaft zajišťuje přípravek, působící na infekci HCV obsahující inaktivovaný HCV, vázaný na neutralizační humánní protilátky proti HCV, kde tyto protilátky působí proti alespoň jednomu • · • «··

- 3 proteinu vybranému ze skupiny sestávající z core proteinu HCV a proteinu NS3.

US patenty 5,939,262; 5,919,625 a 5,677,124 převedené na Ambion and Cenetron, poskytují velmi širokou metodu ke stanovení přítomnosti zkoumané sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, vyznačující se získáváním segmentu (ribo)nukleové kyseliny odolného (ribo)nukleáze.

US patent 5,866,139 převedený na Institut Pasteur obsahuje soupravu ke stanovení přítomnosti specifických protilátek na HCV E-1. Viz též US patent 5,854,001 náležející Abbottu.

US patent 5,800,982 převedený na Tonen popisuje antigenní peptidy schopné specificky reagovat s protilátkami směrovanými proti skupině II HCV. JP 10019897 náležející Tonen, zajišťuje soupravu obsahující peptid mající aminokyselinovou sekvenci alespoň pěti navazujících aminokyselin, vytvářejících protein nestrukturální oblasti 4A (NS4A) HCV a peptid, mající aminokyselinovou sekvenci alespoň pěti navazujících aminokyselin, vytvářejících protein nestrukturální oblasti 4B (NS4B) HCV.

Pro celkový obraz o stavu techniky viz též US patenty US 5,871,904; US 5,869,253; US 5,750,331; US 5,747,251; US 5,667,992; US 5,645,983; US 5,625,034; US 5,610,009 a patenty WO 9707400, WO 9637783; EP 593291; EP 593290; EP 586065 a JP 4349885.

- 4 Detekce protilátek proti HCV v séru zůstává tedy nejrozšířenější zkouškou k vyhodnocení infekce HCV. Od roku 1987, kdy byl genom HCV klonován, byly vyvinuty různé zdokonalené verze diagnostických zkoušek na HCV. Běžně dostupné diagnostické soupravy odhalují v séru protilátky proti směsi čtyř rekombinantních antigenů, odpovídajících nestrukturální oblasti 3, nestrukturální oblasti 4 a nestrukturální oblasti 5 HCV core polypeptidu HCV (Gretch, D. R.: Diagnostic tests for hepatitis C, Hepatology, 26, (3, Suppl. 1), 43S -47S, září 1997). Vzorky, které jsou hodnoceny jako pozitivní tímto postupem ELISA, musejí být potvrzeny imunoblotovou zkouškou, kde se zvlášť detekuje přítomnost protilátek odděleně proti stejným čtyřem antigenům. Pozitivní diagnóza vyžaduje detekci protilátek proti alespoň dvěma rekombinantním antigenům.

U významné části populace s protilátkami proti HCV byla zjištěna reaktivita pouze proti jednomu antigenů, což činí nemožným formulovat průkaznou diagnostiku. Dalším problémem, odvíjejícím se od použití rekombinantních antigenů je ten, že mohou být zjištěny protilátkami neodpovídajícími HCV a vytvářet tak falešnou pozitivní diagnózu. To potom vyžaduje dodatečné zkoušky a dlouhodobé sledování pacienta k tomu, aby se dosáhlo průkazné diagnózy.

Styk cizího antigenů s organismem aktivuje specifickou imunitní odezvu. Obraz antigenů, který se detekuje humorální odezvou, je definován epitopy zjištěnými hostitelskými protilátkami. Za předpokladu, že místo vazby protilátky je negativním obrazem epitopu - látky, která specificky váže paratop - může • 4 • 444

- 5 představovat pozitivní obraz epitopu. Tento směr úvah naznačuje, že co se týká humorální odezvy, může být antigen výslovně popsán specifickými ligandy, které váží protilátky specifické pro antigen. Identifikace těchto ligandů nabízí cestu detekce specifické humorální odezvy na antigen, nezávisle na tom, zda je znám, neboje dostupný stejný antigen čí nikoliv.

Tato koncepce byla použita k vývoji diagnostiky k detekci protilátek spojovaných s infekcí, včetně infekce HCV u lidí. Screeningem fágových knihoven HCV pozitivními séry byly identifikovány peptidové ligandy, které specificky váží protilátky proti HCV. Toho bylo dosaženo úpravou strategie výběru, protože séra infikovaných pacientů obsahovala protilátky specifické na virus, které byly rozšířené mezi populací ještě s velkým počtem dalších protilátek s různou vazebnou specifikou.

Screening peptidů velkým počtem negativních sér eliminoval ty ligandy, které detekovaly protilátky u negativních vzorků (falešně pozitivní), což vedlo k selekci souboru vysoce selektivních peptidů. Výskyt nespecifických reaktivit byl omezen též použitím krátkých peptidových sekvencí nesouvisejících s přirozenými antigeny. Tato technika je obsažena vEP 0 698 091 B1, publikovaném 28.2.1996. Viz též J. Mol. Biol., 222, 301 - 310, 1991; Gene, 128, 51 - 57, 1993; Gene, 148, 7 - 13, 1994; The EMBO Journal, 13, (9), 2236 - 2243, 1994; Bacterial Protein Toxins, Zb. Bakt. Suppl., 24, 415 - 425, 1994; The Journal of tt · • ···

- 6 Immunology, 4504 - 4513, 1996; Methods in Molecular Biology, díl 87, s. 195 - 208, Humana Press lne.; Combinatorial Libraries (Cortese, R., vyd.) Gruyter, Walter de, kap. 8, 1996; Methods in Enzymology, 267, 116 - 129, 1996; Biol. Chem., 378, 495 - 502, červen 1997; The EMBO Journal, 17, (13), 3521 - 3533, 1998; Nátuře Biotechnology, 16, 1068 - 1072, listopad 1998; přehled o technologii mimotopů a fagotopů je uveden ve výše uvedeném EP 0 698 091 i se způsoby provádění.

Tyto selekční strategie identifikují ty peptidové struktury, které nejlépe váží imunodominantní protilátky proti HCV. Multivalentní rozvinutí ligandu poskytlo navíc významným efektem avidity k citlivosti detekce. Přes tyto předpoklady vyústilo zkoušení směsi způsobem ADAM-HCV (ADAM = Antibody Detection by Antigen Mimics) na panelu sér, která nebyla použita ke sereeningu, k citlivosti nižší než 100 %, i když byla tato citlivost poměrně vysoká. Tento výsledek může vysvětlit zvláštní charakteristika humorální odezvy na protilátky HCV, protože ta se netýká hlavního imunodominantního epitopu, ale je spíše směrována proti velkému počtu různých virových determinantů. To je dále komplikováno existencí různých virových genotypů.

Běžně dostupné diagnostické soupravy mají sérové protilátky proti čtyřem rekombinantním antigenům odpovídajícím širokým oblastem HCV polypeptidů (Gretch, D. R.: Diagnostic tests for hepatitis C, Hepatology, 26, (3, dodatek 1), 43S -47S, září 1997).

* 4 ·· ·· 44 »4 44 4»

- 7 Pozitivní diagnóza vyžaduje detekci sérových protilátek proti alespoň dvěma rekombinantním antigenům: z tohoto důvodu je nemožné formulovat konečnou diagnózu pro odpovídající část populace s protilátkami proti HCV, protože se může zjistit specifická reaktivita pouze s jedním antigenem. ADAM - HCV EIA (Enzymatic Immuno Assay) využívá mimetiku mnoha různých imunodominantních epitopů z různých antigenů a tím zajišťuje vyšší rozlišovací schopnost analýzy. Bezprostředním výsledkem může být drastické omezení četnosti neurčených vzorků.

Značné úsilí jsme věnovali technickému vývoji zkoušky ADAM HCV (za použití strategie použité v zásadě ve výše uvedeném EP 0 698 091). Peptidy vybrané z fágových knihoven jsou prokázány jako N-koncové fůze s hlavním kapsidovým proteinem pVIII. Používání fágu jako diagnostického agens má mnoho výhod: je to extrémně flexibilní reagens, které je již samo předurčeno pro mnoho typů imunologických zkoušek (Dente, et al.: 1994; Felici, F., Galfré, G., Luzzago, A., Monaci, P„ Nicosia, A a Cortese, R.: „Phage-displayed peptides as tools for the characterization of human sera“, Methods in Enzymology, 267, 116 - 129, 1996; Bartoli, et al.: Nátuře Biotechnology, 16, 1068 1073, listopad 1998), a jeho malovýroba je snadná a laciná.

Přes tyto výhody omezuje velikost fágové částice koncentraci molekul peptidu, kterou je ve zkoušce možno dosáhnout. Interference protilátek séra sfágovým kapsidem vyžaduje přídavek nosného fágu do zkušební směsi k oddělení protilátek • « • ί ·Μ

- 8 proti fágu. Velkovýroba, pokud by se vůbec uskutečnila, čelí problémům mikrobiální kontaminace činidla, reprodukovatelnosti, kontroly kvality, čištění a výrobním nákladům.

Lineární syntetické peptidy odvozené od peptidových sekvencí, které se na fágu objeví, nezajistí ve většině případů ani citlivost, ani specifičnost k dosažení dostatečně účinné detekce protilátky.

Podstata vynálezu

Nyní byl nalezen - a to je předmětem předloženého vynálezu způsob diagnostikování takových infekčních onemocnění jako jsou virové infekce, zvláště infekce hepatitidou C, spočívající v identifikaci vazebné specifičnosti molekul antigenové protilátky v séru metodou detekce protilátky antigenovými mimetiky (ADAM) zahrnující screening fágových knihoven využívajícím séra pacientů infikovaných antigenem a osob neinfikovaných, a to identifikací protilátek vážících peptidy (ligandy) specificky asociované se jmenovaným antigenem.

U způsobu řešení, kterému se v předloženém vynálezu dává přednost, se to týká infekce HCV,

Podrobný popis vynálezu

U prvního řešení, kterému se u způsobu podle předloženého vynálezu dává přednost, se jmenované ligandy vylepšují zráním in vitro.

« · « ···

- 9 U druhého řešení, kterému se u způsobu podle předloženého vynálezu dává přednost, jsou jmenovanými ligandy syntetické peptidy.

U třetího řešení jsou jmenované ligandy navázány na společnou strukturu (core). U řešení, kterému se dává obzvláště přednost, jsou jmenované ligandy dohromady se jmenovaným společným jádrem MAP podle definice dále uvedené.

Podle ještě dalšího předmětu předloženého vynálezu lze soubor HCV specifických ligandů získat postupem zahrnujícím:

a) první prohlédnutí fágové knihovny n positivními séry k vytvoření první série n-fágových poolů;

b) přípravu n poolových směsí obsahujících n-1 poolů;

c) selekci affinity každé z n-směsí proti séru, která vytvořila vybraný fágový pool k získání druhé série n-fágových poolů, a případně

d) další prohlédnutí každého z n-fágových poolů z druhé série na směs složenou ze všech n-původních sér, vyjma těch, které byly použity pro první prohlédnutí;

e) imunoscreening výsledných druhých sérií n-fágových poolů za použití směsi všech n-původních sér k získání pozitivních klonů;

f) zkoušení jednotlivých reaktivit všech pozitivních klonů panelem pozitivních a negativních sér s použitím určené sady jmenovaných klonů jako kolonií vylučujících fágy;

g) vytvoření replik jmenovaných kolonií vylučujících fágy;

• · • ·»·

- 10 h) screening každé repliky na její reaktivitu s pozitivním a negativním sérem ke zjištění klonů specificky reagujících s pozitivním sérem;

i) použití každého ze jmenovaných specificky reagujících fágů jako ligandu k affinitnímu čištění protilátek z pozitivního séra;

j) zkoušení jmenovaných protilátek na jejich reaktivitu s předešle identifikovanými HCV peptidy;

k) vyjednocení klonů detekujících sérové protilátky.

Jednotlivé peptidy vycházející z výše uvedeného postupu jsou též předmětem předloženého vynálezu.

Dalším zvláštním předmětem předloženého vynálezu použitého pro HCV je řešení s použitím následujících peptidů:

- YSREQLNKLFGIDMT;

- YSREQLNKMFGIEIS;

- YSREQLSKLFGIEPM;

- NSRWLSKAHGIEGM;

- YSREQLNKLFGIEVM;

- YSREQLSKLFGIDTQ;

- KSREQLSKLHGVDTS;

- RSREQLSKLFGIDLT;

- MWRTWLMKTHGIESW;

- MLRTWLMKYQGIESW;

- YSRSWLMKAHGLELG;

- MMRSYLMKAHGIESL;

- MSRLWLMKAHGISSE;

· * • · ···

- 11 • 44* 4444 4 4*4

44 44 4* *4 4·

- KHSEWLNKARGIESW;

- MSRTFLMKAHGIESW;

- MSRTWLMKAHGIESW;

- AEGEKKLRRSTNWGD PAK;

- ABGEFKTRRQTNYQDPAK;

- AEGEFKTLRNANRLD PAK;

- AEGEFKTLRNSNRLDPAK;

- AEGEFKKFPGSSTPKDPAKAAFDSL;

- AEGEFPQDARIFPGGGDPAKAAFDSL;

- PQDARFPGGGDPAKAAFDSL;

- AE GEFKGAGGAQTVD WALLVD PAK;

- AEGEFMGKHFGGAQWIMGDPAK;

- AEGEPLSLKGSGGGQLRALVDPAK;

- AEGEFLSLKGSGGAQLRALVDPAK;

- AEGEFYLLKRSSPPDPAKAAFDSL;

- AEGEFPILVGPYLLPRRSREEAVDPAK;

- AEGEFPILVGPYLLPRRSRBEAVDPAKGK;

- AEGEFRLGVRAPRKALDPAK;

- AE GEFRLG VRALRKALD PAK;

- AEGEFRLGVPALRKAPDPAK;

- RLGVRALRKAPDPAK;

- AEGEWFQPRGHSYQDPAK;

- AEGEFLKERAEM SARKTLGADPAK;

- AEGEFFYQIPRRMETKYGD PAK;

« « · • · ··· • · « · » · · · · * · · ·· ·· ·« ·· ·· ··

- 12 AEGEFSREQLNKLFGIEGDPAK;

AEGEFNSREWLSKAHGIEGMDPAK;

AEGEFRSREQLSKLFGIDLTDPAK;

AEGEFYSRKQLNKLFGIDMTDPAK;

AEGEFYSREQLNKMFGIETSDPAK;

AEGEFYSREQLNKLFGIEVMDPAK.

AEGEFKSREQLRKLHGPDTSDPAK;

AIEGEFKMRNYLNKAFGIEGMDPAK;

AEGEFRSRBQLSKLFGIELTDPAK;

AEGEFSRREYSNKAFGIETQDPAK;

AEGEFRRREYLNKAFGIEGDPAK;

AEGEFSRREWLNKRFGIEYLDPAK;

AEGEFMSRTWLMKAHGIESWDPAK;

AEGEFYSPEWLNKARGIDRSDPAK;

AEGEFKSREQLSKLHGVDTSDPAK;

AEGEFYSREQLNKMFGIEISDPAK;

AEGEFYSRSWLMKAHGLELGDPAK.

AEGEFMMRSYLMKAHGIESLDPAK;

AEGEFMSRLWLMIKAHGISSEDPAK;

AEGEFPQPQEVHVYREQLGLDPAKAAFDSL;

AEGEFGEVLYRGFDEVGGDPAKAAFDSL;

AGEPYVIERGMQDPAK;

AEGEFTTASPRHFLVPLDPAKAAFDSL;

AEGEFTTASPAHFLVPLDPAKAAFDSL;

• v ·

• ·

- 13 AEGEFTTASPSHFLVPLDPAKAAFDSL;

AEGEFATAPPRHYSWDPAK;

AEGEFATAPPAHYSWDPAK;

AEGEFATAPPSHYSWDPAK;

AEGEFRFWKVPDYDPPAAGGDPAK;

AEGEFTESSVSSTLADLASKTFGSADPAK;

AEGEFTLADLATMTFGSTDPAK;

AEGEFGLADLATLTFGSPDPAK;

Pro soubor podle předloženého vynálezu je preferovanou fágovou knihovnou kroku a) knihovna pVIll-12aa.

Pro soubor podle předloženého vynálezu mají vložky preferovaných klonových singletů z kroku k) tyto sekvence:

1. SREQLNKLFGIEG;

2. RATLSNEHGITIG;

3. DQRENWFKYHGFG;

4. EWRRYMSDIHGYG;

5. DSLRYMYVMPGFG.

V souboru podle předloženého vynálezu je nejlépe, když se vytvoří fágová knihovna, ve které jsou reagující klony, přednostně nejlepší reakční klony, částečně mutagenizovány tak, že je každá aminokyselina klonové sekvence nezávisle substituována nějakou další aminokyselinou.

V souboru podle předloženého vynálezu mají jmenované klony nejlépe tuto vloženou sekvenci: SREQLNKLFGIEG.

• · · • · ··« * · · · »·»· « ·· ·· · ·· ·· ··

- 14 V souboru podle předloženého vynálezu může být ve fágové kniihovně náhodná sekvence obklopena dvěma cysteinovými zbytky. Tento aspekt lze při využívání předloženého vynálezu použít obecně a neomezuje se jen na případ HCV.

Předmětem předloženého vynálezu je využívání výše uvedeného souboru k přípravě diagnostické zkoušky pro detekci takových infekčních agens jako jsou viry, zvláště HCV, u subjektů, u kterých se předpokládá, že byly postiženy takovými jmenovanými infekčními původci, jako jsou viry, zvláště HCV.

Předmětem předloženého vynálezu je souprava pro diagnostické účely obsahující výše uvedený soubor.

Předmětem předloženého vynálezu jsou imunogenní peptidy, které lze získat ze zde uvedeného postupu jak ve formě souboru, tak jako jednotlivé peptidy. Jmenované peptidy jsou vhodné jako imunogeny, a tudíž vhodné k přípravě vakcín, zvláště vakcíny proti HCV. Peptidy jsou vhodné ve formě výše zmíněné soupravy.

Oproti systému založenému na antigenech má diagnostický postup, který jsme zkoušeli, výhodně zabudovanou možnost rozšíření: pro tento případ se mohou provést selekce těmi séry, pro která nebyla detekována žádná odezva. Podobnou metodiku lze použít k identifikaci peptidového panelu, který rozlišuje mezi různými genotypy HCV, a tak nahradit nákladné a pracné PCR metody lacinějšími a rychlejšími EIA.

- 15 4 4 4 · 9 * 4 « 4 · · * • 4 4 4 44·· 9 44 4

44 94 94 44 4«

Příklady provedení

Předložený vynález bude dále podrobněji popisován na příkladech a obrázcích, kde:

Obrázek 1 představuje charakterizaci klonů získaných screeningem. Aminokyselinové sekvence vybraných klonů jsou uvedeny jednopísmenovým kódem. Horní i dolní panel znázorňuje sekvence získané z původní nebo sekundární knihovny. Sekvence pVIII obklopující cizí epitop jsou (NH₂)AEGEF[cízí epitopjDPAK. Šedé obdélníčky označují zbytky častěji přítomné v kterékoliv poloze v klonu původní knihovny. Zbytky přispívající ke shodě sekvence peptidů ze sekundární knihovny jsou označeny tučným písmem. Uvedené údaje jsou průměrnými hodnotami ze dvou nezávisle provedených zkoušek a uvádějí rozdíly absorbancí (A = A_{450 nm} - A₆₂₀ nm) měřených na označeném fágu a měřené na wt fágu pC89 (Felici, et al., 1991). * označuje nezkoušená séra.

Obrázek 2 znázorňuje identifikaci fágu napodobujícího stejný antigenový determinant. Affinita protilátek přečištěných pozitivním sérem C65 klony PA1, PA3. PA8, PA12 nebo P18 (uvedené v prvním sloupci) byla zkoušena metodou ELISA na reaktivitu proti stejnému fágu (uvedenému v první řádce).

Uvedené údaje jsou průměrnými hodnotami dvou na sobě nezávislých zkoušek a uvádějí rozdíl absorbancí (A = A^o _nm - A₆₂o • # · • t ··· • ·

- 16 • * · · · * * · · · ♦ ♦ ·· ·· ·· φ« · «· _nm) měřených na označeném fágu a měřených na wt fágu pC89 (Felici, et al., 1991).

Obrázek 3 uvádí reaktivitu poolu získanou metodou ELISA pocházející ze selekce knihovny pVIIIA12. Fágový pool pocházející z prohlédnutí knihovny pVIIIA na pozitivní séra C76 byla zkoušena metodou ELISA na reaktivitu s pozitivními séry C12, C13, C29, C40, C47, C65, C73, C74, C76, C83 a C85. Bílé, šedé a černé sloupce představují reaktivitu wt fágu, knihovny pVIIIA12 a poolu p76. Výsledky zkoušky ELISA jsou vyjádřeny jako A = A405 nm - A_62o nm- Uváděné hodnoty jsou průměrnými hodnotami ze dvou na sobě nezávislých pokusů.

Obrázek 4 představuje na diagramu A reaktivitu směsi ADAMHCV se sérem. Hraniční hodnota (CO = 0,232) byla vypočítána jako CO = N + 5σ , kde N je průměr a σ je standardní odchylka hodnot získaných s negativním sérem. Diagram B je ADAM-HCV EIA na panelu sér získaných od italského Červeného kříže. Hraniční hodnota (CO = 0,252) byla vypočítána jako CO = N + 5σ, kde N je průměr a σ je standardní odchylka hodnot získaných z pěti negativních kontrolních sér. Zkouška ELISA, tak jak to je popsáno v odstavci Materiály a metody, detekovala vazbu peptidů na protilátky přítomné v lidských sérech. Shromážděny byly průměrné hodnoty dvou na sobě nezávislých pokusů. Výsledky jsou vyjádřeny jako poměr mezi měřeným signálem a hraniční hodnotou (S/CO). Uveden je také počet zkoumaných sér v každé skupině sér.

- 17 Obrázek 5. ADAM/HCV EIA na panelu neurčených sér. Sloupec nejvíce vlevo uvádí označení zkoušených HCV peptidů seskupených podle jejich vazebné specifiky. Následující čtyři sloupce uvádějící reaktivity uvedených peptidů s pozitivními (c25 a r15) a negativními (r6 a r13) kontrolními séry. Každý další sloupec uvádí reaktivity vyjmenovaných peptidů s neurčeným sérem. Vazba protilátek na HCV peptidy přítomné v lidském séru byla detekována metodou ELISA, jak to je popsáno v odstavci Materiály a metody. Byly stanoveny průměrné hodnoty ze dvou na sobě nezávislých pokusů. Pro každý peptid byla vypočítána hraniční hodnota jako CO = N + 5σ , kde N je průměr a σ je standardní odchylka hodnot získaných z 31 negativních kontrolních sér. Výsledky jsou vyjádřeny jako poměr mezi měřeným signálem a hraniční hodnotou (S/CO).

Obrázek 6. ADAM-HCV/SIA na pozitivních, negativních a neurčených sérech. Podle specifické vazby byly seskupeny a imobilizovány na nylonové membráně tyto ADAM-HCV peptidy tak, aby vzniklo 10 pásů: m1909.22 a m1913.2 (A); m1901.31, m3322.3, m3362.3 (B); m1977.1 (C); m3551.3 (D); m3566.3 (E); m858, mF78 a mH1 (F); mA12.1, mA12.2 a mA12.12 (G) mB11.17 (H); mG21.2 (I); m1929A3.1, m1929C3.4 a m1929.21 (J). Další přidaná linie obsahující přečištěný humánní IgG slouží jako interní pozitivní kontrola. Vazba protilátek na HCV peptidy přítomné v lidském séru byla detekována podle popisu v odstavci Materiály a metody.

- 18 4«*· 4 · 4 4 4 4 · 4

4· 44 4* ·· ·· ··

Nejlepším řešením podle předloženého vynálezu jsou složené antigenové peptidy (MAP), ve kterých je C-terminál osmi identických peptidových sekvencí navázán na společné jádro (Tam, J. P.: Synthetic peptide vaccine design: Synthesis and properties of high-density multiple antigenic peptide systém. Proč. Nati. Acad. Sci., 85, 5409 - 5413, 1988), které byly syntetizovány za použití látek majících úroveň specifiky srovnatelnou s peptidy vzniklými zfágů. Odstranění kostry fágu umožňuje vyšší peptidovou koncentraci imobilizovaného ligandu, což vyúsťuje ve větší citlivost.

Panel ligandů specifických na HCV, který lze podle předloženého vynálezu získat, obsahuje peptidy mimikující HCV NS3 imunodominantní HCV antigen. V případě řešení, kterému se zde dává přednost, je toto podle našich znalostí první popsaný krátký peptid, který mimikuje imunnodominantní NS3 determinant. Peptodová skenovací analýza NS3 proteinu ukazuje delší sekvence, které vzácně reagují s pozitivními séry (Khudyakov, Y., et al.: Virology, 206, 666 - 672,1995).

Jiné postupy naproti tomu (Santini, C., Brenan, D., Mennuni, C., Hoess, R. H., Nicosia, A., Cortese, R., Luzzago, A.: Efficient display of an HCV cDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid protein D of bacteriophage lambda., J. Mol. Biol., 11, 282, (1), 125 - 135, září 1998; Pereboeva: J. Med. Virol., 56, (2), 105-111, říjen 1998) izolovaly velké proteinové domény, které si * · · · fe » · » · · « • · * · ···« ···· *· ·· ·♦ ·· ®*

- 19 zachovaly antigenní vlastnosti. Postup, který jsme vyvinuli má tedy podstatné vlastnosti, nespoléhající se na použití či informaci o HCV antigenech, ale může být použit i v systémech, kde je antigen neznámý, a tak vytvářet postup, který vede k odhalení antigenu.

Fágové knihovny náhodných peptidů představují mocný nástroj pro identifikaci ligandů, které se specificky rozpoznávají protilátkami séra proti HCV. Peptidy pocházející z fágů mají velký mimikující potenciál, protože jsou schopny mimikovat lineární, konformační i neproteinové epitopy (pro přehled viz Felici, F., Luzzago, A., Monaci, P., Nicosia, A., Sollazzo, M., Traboni, C.: Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage, Biotechnol. Annu. Rev., 1,149 - 183, 1995; Zwick, Μ. B., Shen, J., Scott, J. K.: Phage-displayed peptide libraries, Curr. Opin. Biotechnol., 9, (4), 427 -436, srpen 1998).

V předloženém vynálezu je uváděna identifikace širšího souboru účinných ligandů specifických na HCV a vývoj nových typů diagnostických souprav k detekci HCV protilátek v séru.

Peptidy použité v předloženém vynálezu jsou vhodné jako diagnostika nebo jako imunogeny či vakcíny.

Farmaceutické přípravky, obsahující imunogeny a vakcíny podle předloženého vynálezu, se běžně připravují tak, jak to znají • · · · · · · 4 · · · · «· ♦· *· ·· «· ··

- 20 odborníci mající běžnou zkušenost v oboru. Mohou být připraveny například podle popisu v EP 0 698 091.

Následující příklady vynález objasní více.

Příklad

Identifikace HCV-specifických ligandů s novými specifiky

Fágová knihovna pVIII-12aa byla nasazena na 8 pozitivních sér (C13, C14, C27, C29, C40, C47, C62 a C65) k vytvoření 8 fágových poolů (označených p13', p14', p27', p29‘, p40', p47‘, p62‘ a p65'). Bylo připraveno osm směsí, z nichž každá obsahovala různou kombinaci sedmi z těchto osmi fágových poolů. Každá směs byla affinitně selektována za použití séra, které vytvořilo vydělený pool fágů: např. směs mixůp65 složená z poolů p13', p14', p27', p29', p40', p47' a p62' byla nasazena na sérum C65. Každý ze vzniklých osmi fágových poolů (označených jako p13, p14, atd.) byl jednotlivě opět nasazen na směs složenou ze všech původních sér vyjma toho, které bylo použito pro předchozí selekci. Například pool ρ13¹¹ byl nasazen na směs sér C14, C27, C29, C40, C47, C62 a C65.

Imunoscreening výsledných osmi fágových poolů s použitím směsi všech osmi původních sér vykázal velký počet pozitivních klonů. Zkoušeli jsme jednotlivé reaktivity všech těchto klonů

- 21 • · · ·· ·· • β · · ·«· ·* ·· ·· ·· s panelem pozitivních a negativních sér vytvořením uspořádaného souboru klonů jako kolonií vylučujících fágy. Následoval jejich růst, celý soubor klonů byl přenesen jako uspořádaný soubor na nitrocelulozový filtr pomocí vícejehlového zařízení. Stejný postup se opakoval k vytvoření mnoha replik, které potom byly jednotlivě a souběžně projížděny na reaktivitu s pozitivními a negativními séry za vzniku mnoha klonů, které specificky reagovaly s pozitivními séry. Každý z těchto fágů byl použit jako ligand k afinitnímu přečištění protilátek od pozitivního séra. Tyto protilátky byly potom zkoušeny v ELISA na reaktivitu s kteroukoliv ze 4 skupin před tím identifikovaných HCV peptidů (odkaz: Prezzi, C., Nuzzo, M., Meola, A., Delmastro, R., Galfre, C., Cortese, R., Nicosia, A. a Monaci, P.: 1. Immunology, 156, 4504 - 4513, 1996); (Bartoli, et al.: Nátuře Biotechnology, 16, 1068 - 1073, listopad 1998). Tato analýza vyjednotila 12 klonů, které detekovaly protilátky séra s novým vazebnou specifičností, a tak indikovala jejich mimikující antigenní determinanty, odlišné od již dříve identifikovaných.

Sekvenční analýza ukázala 5 různých sekvencí. Z každého z těchto 5 klonů (PA1, PA3, PA8, PA12 a PA18) byly připraveny kultivační supernatanty a jejich reaktivita metodou ELISA byla zkoušena se 30 různými pozitivními a 24 negativními séry (obrázek 1). Pouze klony PA8 a PA12 vykázaly statisticky významnou reaktivitu s pozitivními séry (p < 0,2).

K imunočištění protilátek ze séra C65 byl potom použit fág PA1. Tyto přečištěné protilátky specificky reagovaly s klony PA3, PA8, PA12, PA18, rovněž tak jako se samotným klonem PA1 ukazujíce, • «4 4

4· » 4 4 t ··· ·· ·· ··

- 22 že všechny tyto fágy mohou být zařazeny do jediné třídy rozpoznané protilátkami stejné specifičnosti (obrázek 2). U žádného z výše uvedených klonů nebyla zjištěna žádná reaktivita, pokud se jako ligand použil divoký typ, nebo pokud byly protilátky affinitně přečištěny z negativního séra.

Pokud se k imunočištění protilátek séra použily různé klony ze stejné skupiny, nebo pokud se použila různá pozitivní séra, získali jsme výsledky shodné s reaktivitami uváděnými na obrázku 1. Pokud byl použit k imunočištění protilátek ze stejného séra například fág PA3 , reagovaly tyto protilátky ještě navíc vedle PA3 s klony PA8 a PA12. Tyto výsledky ukazují, že klony PA1, PA3, PA8, PA12 a PA18 detekují protilátky reagující se stejným epitopem B-buněk, jak to naznačuje mírná podobnost mezi peptidovými sekvencemi (obrázek 1).

Affinitní zrání HCV peptidů

Byla vytvořena fágová knihovna, u které byla sekvence klonu PA12 částečně mutagenizovaná. V této „sekundární“ knihovně označené pVIIIA12 byly syntetizovány oligonukleotidy tak, že každá aminokyselina sekvence SREQLNKLFGIEG byla nezávisle substituována nějakou jinou aminokyselinou; teoreticky by měla nastat substituce v každé poloze s četností 20 procent. Navíc byl na obě strany cizí peptidové sekvence vložen náhodný fragment. Knihovna pVIIIA12 byla dvakrát nasazena na 12 pozitivních sér (C8, C10, C12, C13, C22, C58, C60, C76, C83, C85, C141 a C177).

- 23 Při zkoušení metodou ELISA vykázaly fágové pooly p76, p14l a p177 (pocházející ze selekce s použitím séra C76, C141 a C177) největší a nejširší reaktivitu s panelem pozitivních sér a byly dále zanalyzovány (obrázek 3). Na základě této reaktivity byly fágové pooly p76, p141 a p177 ímunoscreenovány za použití sér C40, C141 a C177. U každého poolu tato analýza vytáhla několik klonů, které byly potom jednotlivě zkoušeny na reaktivitu s mnoha » různými pozitivními a negativními séry postupem replikace filtru, jak to bude dále podrobněji popsáno. Tento závěrečný screening vyjednotil 51 klonů specificky reagujících s pozitivními séry.

Sekvenční analýza odhalila 16 různých sekvencí (8, 5 a 3 odvozené z poolu p76, p14l a p177). Z každého z těchto klonů byl připraven kultivační supematant a jejich reaktivita byla zkoušena metodou ELISA se 33 různými pozitivními a 24 negativními séry (obrázek 1).

Klony P40.17 a P40.7 reagovaly s pozitivnějšími zkoušenými séry (42 % každý). Jejich kombinace sklony P141.7 a P177.22 vyhodnotila 70 % pozitivních sér panelu. Seskupení vybraných peptidů definuje souhlasnou sekvenci (M/Y)SRE(W/Q)L(M/N)K(A/L)(H/F)GIES(W/M).

Identifikace dalších HCV-specifických ligandů ·«

- 24 Podobná selekce byla prováděná se zaměřením na identifikaci ligandů s novými vazebnými specifikami odlišnými od předešle identifikovaných způsobů. Byly projížděny fágové knihovny různých délek, ve kterých byla náhodná sekvence buď zcela náhodná, nebo obklopena cysteinovými fragmenty, které omezují konformaci vykázaných peptidů.

K selekci fágových knihoven byly použity různé kombinace sér a fágových poolů. Fágové pooly vykazující zajímavé reakční profily s pozitivním sérem byly dále analyzovány. Hodnocení reaktivity velkého počtu jednotlivých klonů screeningem replik vyjednotilo fágy vykazující specifickou reaktivitu s pozitivními séry.

Zaměřili jsme svou pozornost na klony se zajímavou charakteristikou reaktivity.

Zkoušení těchto klonů pomocí protilátek affinitně vyčištěných pomocí HCV peptidů eliminovalo ty klony, které mimetikovaly antigenní determinanty dříve identifikovaných peptidů. Klony, které přestály tyto výběrové stupně, byly zkoušeny metodou ELISA s velkým počtem pozitivních a negativních sér, aby se statisticky určila jejich specifičnost na HCV.

Tyto vybrané klony byly dále vylepšeny vytvořením a screeningem sekundárních knihoven, ve kterých byla sekvence původního klonu nebo populace klonů částečně mutagenizována a opět byly prověřeny pro výběr variant s vylepšenými vazebnými vfastnostmi. Tento stupeň byl proveden s odlišně upravenou strategií, která již

- 25 byla popsána (odkaz na sdělení Urbanelli, Zhu). Toto extenzivní a opakované úsilí identifikovalo 7 nových skupin ligandů, které specificky vázaly protilátky séra specifické pro HCV s různou vazebnou specifičností.

Screening repertoáru HVR1 variant reprezentovaných rekombinantními fágy pomocí sér, izoloval peptidy specificky reagující s velkým počtem pozitivních sér (Puntoriero, et al.: Nicosia - nepublikováno): Soubor HVR1 peptidů, pocházejících z fágů získaný z tohoto screeningu, byl analyzován naším panelem sér. Byly identifikovány tři peptidy s nejvyšší a specifickou frekvencí reaktivity s pozitivními séry (mF78, mH1 a m858).

Souhrnně bylo identifikováno 12 skupin ligandů, včetně 4 skupin identifikovaných předešle (Bartoli, et al.: Nátuře Biotechnology, 16, 1068 - 1073, listopad 1998; Prezzi, C., Nuzzo, M., Meola, A., Delmastro, R., Galfre, C., Cortese, R„ Nicosia, A. a Monaci, P.: 1. Immunology, 156, 4504 - 4513, 1996); viz obrázek 5, skupina A až L.

Od peptidů neseného na fágu k syntetickému peptidů Bylo syntetizováno dvaadvacet peptidových sekvencí odvozených od 12 skupin HCV ligandů jako složené antigenové peptidy s osminásobným rozvětvením (ADAM-HCV peptidy). V této molekule je osm identických sekvencí vázáno přes lysinovou vidlici na společné core vytvářející složené uspořádání podobné • 4

- 26 fúzovaným pVIII peptidům na fágové kapsidě. Níže jsou uvedeny sekvence ADAM-HCV peptidů:

m858 ETYTTGGAAARTTSGLTSLFSPGPSQN m1901.31 AEGEFKKFPGSSTPKDPAKAAFDSL m1901.34 AEGEFPEDTFPGSKLILSGDPAKAAFDSL m 1909.2 AEGEFKTRRNTNYQDPAK m19 13.2. AEGEFKTLRNTNRLDPAK m 1929.21 AEGEFATASPTHYTSELDPAK m1929A3.1 AEGEFTTASPTHFLVPLDPAK m1929C3.4 AEGEFATAPPSHYSWDPAK m1977.1 AEGEFPYLLPRRSREEAVDPAK m3322.3 AEGEFPQDARFPGGGDPAK m3362 .3 AEGEFLSLKGSGGGQLRALVDPAK m3555 1.3 AEGEFRLGVRALRKAPDPAK m3566.3 AEGEFKTSVRSVPRARPPINGDPAK

Ma12. 1 AEGEFNSREWLSKAHGIEGMDPAK mA12.2 AEGEFRSREQLSKIFGIDLTDPAK.

mA12.13 AEGEFMSRTWLMKAHGIESWDPAK

Nb11.17 AEGEFRELLYEAFDDMEGDPAK mF78 QTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQN rnG2 1.2 AGEPYVIEQGMMDPAK mH 1 QTHTTGGVVGHATSGLTSLFSPGPSQN mN 15.3 AEGEFGLADLATLTFGSTDPAK mS48,5 AEGEFRPWKVPDYDPPAAGGDPAK a údaje o provedení analýz jsou shrnuty v tabulce 1 a dále jsou připojeny i obrázky.

• 4

4·

- 27 4· 4·

V mnoha případech byly uvedeny sekvence pVIII obklopující cizí epítopy (NH2AEGEF a/nebo DPAK-COOH), které jsou relevantní pro vazebnou specifičnost odpovídajícího peptidu.

Směs obsahující těchto 22 ADAM-HCV peptidů (ADAM-HCV směs) byla použita k detekci přítomnosti protilátek proti HCV pomocí EIA (ADAM-HCV EIA). Směs peptidů ADAM-HCV byla imobilizována pasivním pokrytím dna vícejamkové destičky ELISA a inkubována se vzorky sér zředěných 1 : 40 po dobu 40 minut. Lidské protilátky vázané na peptidy byly detekovány inkubací po dobu 20 minut s protilidským konjugátem a měřeny chromogenní enzymatickou reakcí.

Jak je uvedeno na obrázku 4A, ADAM-HCV EIA účinně rozlišuje pozitivní a negativní séra.

ADAM-HCV/EIA

Panel HCV pozitivních a HCV negativních sér byl zkoušen na přítomnost anti-HCV protilátek pomocí ADAM-HCV-EIA (obrázek 4B). Zkouška identifikovala všechna pozitivní séra daná na panel a také prokázala 100 % specifičnost identifikací všech negativních vzorků.

Neurčené vzorky

Soubor sér diagnostikovaných jako neurčených komerčně dostupnými konfirmačními zkouškami k průkazu HCV, byl získán

- 28 z různých zdrojů. Jednotlivě bylo na reaktivitu zkoušeno metodou ELISA 23 peptidů ADAM-HCV s 31 vzorky (obrázek 5). 6 vzorků nereagovalo se žádným ze zkoušených MAP a byly proto posuzovány jako negativní. 8 vzorků zjistilo pouze jeden antigen, a tak potvrdilo neurčitost analýzy. 17 vzorků nakonec vykázalo dvě nebo více reakcí proti různým skupinám peptidů, takže tím byly identifikovány jako pozitivní.

Proužková imunoblotová zkouška ADAM-HCV (ADAM-HCV/SIA) Peptidy ADAM-HCV byly kovalentně imobilizovány na aktivované nylonové membráně tak, aby se získaly proužky s deseti pásy. Každý řádek obsahoval různé peptidy se stejnou vazebnou specifičností, jak to je blíže uvedeno v legendě k obrázku 6. Zaveden byl také kontrolní řádek obsahující přečištěný humánní IgG jako kontrolu na pozitivní výsledek. Vybrané množství vzorků z panelu neurčených sér bylo inkubací vzorků séra na proužku zkoušeno imobilizovanými antigeny na reaktivitu. Inkubací pásků s protilidským enzymovým konjugátem byly protilátky proti HCV zachycené jednotlivými antigeny vizualizovány kolorimetrickou enzymatickou reakcí. Reaktivita vzorků s peptidovými pásy byla stanovena vizuálním porovnáváním intenzity každého pásu s řádkem interního kontrolního pozitivního pásu.

ADAM-HCV/SIA vykázal reaktivitu všech 8 pozitivních sér zkoušených na různé virové determinanty mimetikovanými peptidy ADAM-HCV. Při zkoušce 8 negativních sér nebyla zjištěna žádná reaktivita (obrázek 6).

• · * ·

- 29 Pomocí ADAM-SIA jsme také analyzovali vybrané množství neurčených vzorků. Jak je z obrázku 6 zřejmé, analýza 8 neurčených sér potvrdila výsledky získané ADAM-HCV/EIA při použití jednotlivých peptidů, což ukázalo na srovnatelnou citlivost obou zkoušek.

Použité materiály a metody

Fágové knihovny

Jako zdroj ligandů bylo použito čtyř různých knihoven náhodných peptidů obsahujících fágy: pVHI9a, pVlllaa_cys, pVIII12aa, pVIIHSaa a pVIIIA12. pVIII9aa (Felici, et al., 1991), pVIII12aa a pVIII15aa jsou tři různé knihovny, složené z náhodných nonamerů, dodekamerů a pentadekamerů, které se objevují na vláknitém fágu jako nakondenzovaný NH₂ terminál hlavního pláště proteinu pVIII. pVIIl9aa_cys je knihovna, ve které jsou devítinásobné peptidy obklopeny dvěma cysteinovými fragmenty (Luzzago, et al., 1993). V této poslední knihovnně vyvolávají cysteiny tvorbu disulfidového můstku, což do určité míry omezuje konformaci vykazovaných peptidů. Knihovna pVIIIA12 byla vytvořena syntetizováním oligonukleotidů kódujících aminokyselinovou sekvenci SREQLNKLFGIEG. Úpravou syntetické metody štěpení vysokomolekulárních látek (Glaser, et al., 1992) může být každá aminokyselinová poloha substituována tripletem NNS s četností 20 procent. Vedle toho se na obou koncích cizí peptidové sekvence nacházejí náhodné fragmenty. Všechny sbírky byly vytvořeny podle literatury (Folgori, et al.,

- 30 1998). Komplexnost knihovny tak, jak se odvíjela od počtu jednotlivých klonů získaných bakteriální transformací, byla okolo 1 x 10⁸ v každé z pěti knihoven.

Lidská séra

Lidská séra použitá v této studii byla shromážděna náhodně z odmítnutých jednotek dárcovské krve z transfúzních stanic a různých oddělení nemocnic a z jednotek získaných od zdravých dobrovolníků. Jmenovitě mnoho použitých neurčených vzorků v této studii bylo získáno z Laboratory of Virology, Istituto Superiore di Sanita, Řím (Itálie) a z Centro Nazionale Transfusione Sangue della Croce Rossa Italiana, Řím, (Itálie). Séra byla zkoušena na přítomnost protilátek proti HCV zkušebním systémem HCV ELISA druhé generace (Ortho Diagnostic Systems, Bersee, Belgie) a potvrzena imunologickým zkušebním systémem dot blot RIBA HCV první generace (Chiron Co., Emmeryville, CA). Séra byla též zkoušena na nepřítomnost protilátek proti HbsAg a na HIV-1/HIV-2 zkouškou AUSAB EIA (Abbot Labs, Chicago, IL) a zkouškou HIV-1/HIV-2 EIA třetí generace (Abbott Labs, South Pasadena, CA). Vzorky pozitivní na přítomnost protilátek proti HCV, avšak negativní na protilátky proti anti-HbsAg a anti-HIV, byly do této studie zahrnuty jako HCV pozitivní séra. Séra negativní na přítomnost protilátek proti všem třem antigenům, byla do této studie zahrnuta jako HCV negativní séra.

4

4

4

- 31 Affinitní selekce a imunoscreening

K affinitní selekci náhodných peptidových knihoven fágů byla použita HCV pozitivní séra (Folgori, et al., 1998; Felici, et al., 1996; Prezzi, et al., 1996). Klony pocházející z affinitní selekce prošly imunoscreeningem za použití sér podle popisu v literatuře (Prezzi, et al., 1996; Minenkova, et al.).

Zkouška ELISA používající fágové klony

Zkouška ELISA používající fágový supernatant a lidská séra byla provedena takto; Fágové supernatanty byly připraveny z infikovaných buněk DH5a-F', jak to již bylo předešle popsáno (Felici, et al., 1991). Vícejamkové destičky (Immunoplate Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dánsko) byly při 4°C pokryty přes noc 200 μ\ anti-plll monoklonální protilátkou 57D1 (Dente, et al., 1994) o koncentraci 1/vg protilátky na ml v 50 mM NaHCO₃ o pH 9,6. Po odstranění krycího roztoku byly destičky inkubovány při 37 °C po dobu 60 minut s blokovacím ůstojným roztokem ELISA (0,1 % kasein, 1 % Triton-X100 v PBS). Destičky byly několikrát promyty PBS/0,05 % Tween-20 (promývací ústojný roztok). Do každé jamky byla přidána směs blokovacího ústojného roztoku ELISA a vyčiřeného fágového supernatantu v poměru 1:1a ponecháno reagovat při 37 °C po dobu 1 hodiny. Lidské sérum zředěné 1 : 40 bylo za laboratorní teploty inkubováno po dobu 30 minut s 5.10¹⁰ jednotek vytvářejících plaky fágu f11.1 v ml (pfu.ml·¹) (Dente, et al., 1996), 25 /yl.ml¹ proteinového extraktu z buněk DH5-F infikovaných fágem f11.1 (Dente, et al.) a 25 pl.ml·¹ supernatantu z nepříbuzných krysích hybridomových buněk v blokovaném

- 32 ústojném roztoku ELISA. Po odstranění směsi obsahující fágový supernatant byly destičky promyty promývacím ústojným roztokem a bylo přidáno 200 μ\ předem inkubované sérové směsi na každou jamku a inkubováno při 37 °C po dobu 60 minut. Destičky byly potom promyty promývacím ústojným roztokem a do každé jamky byl přidán kozí protilidský- IgG HRP-konjugát v ředění 1 : 20000 (Jackson Imuno Research Laboratories, lne., West Grove, PA) v sekundárním protilátkovém blokovacím ústojném roztoku (1 % Triton, 1 % koňské sérum, 50 % fetální telecí sérum v PBS, Mab supernatant 5 μ\ na jamku). Po 30 minutové inkubaci při 37 °C byly destičky promyty a peroxidázová aktivita stanovena inkubací s 200 μ\ kapalného substrátového systému TMB (Sigma, St. Louis, MO). Po 15 minutách působení byla reakce zastavena přidáním 25 μ\ 2M H₂SO₄. Destičky byly odečítány automatickou čtečkou ELISA (Labsystems Multiskan Bichromatic, Helsinky, Finsko) a výsledky byly vyjádřeny jako A = A450 nm - A₆₂o nm· Uvedené údaje ELISA jsou průměrnými hodnotami ze dvou nezávislých stanovení. Za statisticky významné se považují, pokud jsou větší než 0,3 nad hranicí a liší se o více než 3σ (σ = {1 /2[cr²p + ίΑν]}^1/2) od pozadí pozorovaného u tágu wt.

Hodnota p odkazující na klony PA8 a PA12 je pravděpodobnost, že pozorovaná četnost rozdělení reaktivit pozitivních a negativních sér je statisticky stejná podle %²-testu.

« *

- 33 Affinitní čištění protilátek specifických na fagotop ze séra

Polystyrénová Petriho miska o průměru 60 mm (Becton Dickinson Labware, NJ) byla při 4 °C přes noc pokryta roztokem 1.10¹¹.ml'¹ fágových částic přečištěných CsCI v 50 mM NaHCO₃ o pH 9,6. Po promytí PBS/Tween byla miska inkubována při 37 °C po dobu 60 minut s blokovacím ůstojným roztokem ELISA. Směs lidského séra (ředění 1 :100 v blokovacím ústojném roztoku ELISA), 1.10¹² f11.1 pfu.ml'¹ a 25 //l.ml’¹ extraktu buněčného proteinu XLI-modři byla inkubována za laboratorní teploty po dobu 60 minut. Po odstranění blokovacího roztoku byla předem inkubovaná směs dána na destičku a při 4°C inkubováno přes noc. Zředěné sérum bylo odstraněno a miska promyta promývacím ůstojným roztokem. Navázané protilátky byly eluovány 0,1 M glycin.HCI o pH 2,7, s přidanými 10//g.ml'¹ BSA a zneutralizováno.

Charakterizace fágových klonů

Affinitně přečištěné protilátky byly zkoušeny standardním ELISA na reaktivitu proti fagotopům. Vícejamkové destičky byly běžným způsobem pokryty 100 μΙ roztoku 1.10¹¹ TU.ml'¹ fágu přečištěného CsCI v 50 mM NaHCO₃ o pH 9,6 do jedné jamky a ponecháno při 4 °C přes noc. Po promytí směsí PBS/Tween byly destičky inkubovány při 37 °C po dobu 60 minut s blokovacím ůstojným roztokem. Potom bylo do každé jamky přidáno 100 //I affinitně přečištěné protilátky a ponecháno reagovat při 4 °C přes noc. Destičky byly potom promyty studenou směsí PBS/Tween a přidáno 100 μ\ kozích protilidských IgG (Fc specifické) protilátek

- 34 konjugovaných s alkalickou fosfatázou (Sigma, St. Louis, MO), zředěných blokovacím ústojným roztokem 1 : 5000. Po inkubaci za laboratorní teploty po dobu 2 hodin byly destičky promyty a alkalická fosfatáza se stanovila podle popisu uvedeného výše.

Syntetické peptidy

Použili jsme syntetické složené osminásobně rozvětvené peptidy (MAP): (Tam, 199X). Syntéza byla provedena průtokovou polyamidovou metodou. Peptidy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu.

ELISA využívající syntetické peptidy

Vícejamkové destičky (Immuno plate Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dánsko) byly přes noc pokryty při 4 °C roztokem MAP o koncentraci 10 //g.ml·¹ v 50 mM NaHCO₃ o pH 9,6. Po odstranění krycího roztoku byly destičky inkubovány při 37 °C po dobu 60 minut s blokovacím ústojným roztokem ELISA (0,1 % kasein, 1 % Triton-X100 v PBS). Destičky byly několikrát promyty roztokem PBS/0,05 % Tween-20 (promývací ústojný roztok). Do každé jamky bylo přidáno lidské sérum zředěné 1 : 40 a inkubováno při 37 °C po dobu 40 minut. Potom byly destičky promyty promývacím ústojným roztokem a do každé jamky přidáno kozí protilidský- IgG HRP-konjugát zředěný 1 : 20000 (Jackson Imuno Research Laboratories, lne., West Grove, PA) v blokovacím ústojném roztoku ELISA. Po 20 minutové inkubaci při 37 °C byly destičky promyty a peroxidázová aktivita stanovena inkubací s kapalným substrátem TMB (SIGMA, St. Louis, MO). Po 15

- 35 • 4 *4« · · · 4 4 · 4 • 4 4 · · « 4 · 4 4 4 4 • 4 44 4* ·· 44 4« minutové reakci byla tato reakce zastavena přídavkem 2M H₂SO₄. Destičky byly odečítány automatickou čtečkou ELISA (Labsystems Multiskan Bichromatic, Helsinky, Finsko) a výsledky vyjádřeny jako A = A4_50nm - A₆₂onm· Uváděné hodnoty ELISA jsou průměrem ze dvou nezávislých stanovení.

Odkazy

Smith, C. P. a Petrenko, V. A.: Phage display. Chem, Rev., 97, 391 -410,1997

Folgori, A., Tafi, R., Meola, A., Felici, F., Galfre, G., Cortese, R., Monaci, P. a Nicosia, A.: A generál stratégy to identity -mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera. EMBO 1.13, 2236 - 2243, 1994

Prezzi, C., Nuzzo, M., Meola, A., Delmastro, R., Galfre, C., Cortese, R., Nicosia, A. a Monaci, P.: 1. Immunology. 156, 45044513, 1996.

Alter, H. j.: To C or not to C: these are the questions’. Blood. 85,1681, 1995

Felici, F., Castagnoli, L., Musacchio, A., Jappelli, R. a Cesareni, C.: Selection of antibodies ligands from a large library of oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector, f. Mol. Biol. 222,301-310, 1991.

Luzzago, A., Felici F., Tramontano, A., Pessi, A. a Cortese, R.: Mimicking of discontinuous epitopes by phage displayed peptides, ·«** · · · · · · · · ·· ·· ·* ·♦ ·· ··

- 36 I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Cene, 128:51-57,1993

Dente, L., Cesareni, G., Micheli, C., Felici, F., Folgori, A., Luzzago, A., Monaci, P., Nicosia, A. a Delmastro, P.: Monoclonal antibodies that recognise fllamentous phage. Useful tools for phage display technology., Gene, 148, 7, 1994.

Sambrook, J., Fritsch, T. a Maniatis, T.: Molecular Cloning: a laboratory manual (second edition), 1989

Takamizawa, A., Moři, C., IFuke, I., Manabe, S., Murakami, S.,

Fujita, J., Onoshi, K., Andoh, T., Yoshida, I. a Okayama, H.: Structure and organisation of the Hepatitis C virus genome isolatedfrom human carriers. I. Virol. 65,1105-1113, 1991,

Smith, D. B.: Purification of glutathione S-Transferase fusion proteins. Methods in molecular and cellular biology. 4, 220 - 229, 1993

Frangioni, f. V. a Neel, B.J.: Solubilzation and purification of enzymatically active glutathione S-transferase (pGex) fusion proteins. Analyt. Biochem. 210, 179-187, 1993

Kornatsu F, Takasaki K: Determination of sérum hepatitis C virus (HCV) core protein using a novel approach for quantitative evaluation of HCV viraemia in anti-HCV-positive patients. Liver, 19,375-80, 1999

Tabulka 1 . Reaktivita peptidů ADAM-HCV

N = počet zkoušených sér; S = změřený signál; CO = hraniční hodnota; (CO = neg + 3σ, kde neg a σ jsou střední a standardní odchylky hodnot od hodnoty negativního séra);

negativní pozitivní séra séra

skupina	peptid	N	N	% S/CO>1	střední hodnota S/CO>1
A	m1913.2	33	. 21	100	45,0
	m1909.2	33	21	100	50,3
B	ΠΊ1901.31	39	38	61	3,2
	m1901.34	39	38	39	5,4
	m3322.3	30	18	78	10,1
	m3362.3	31	37	84	4,4
C	m1977.1	32	28	96	13,6
D	m3551.3	37	26	46	3,0
E	m3566.3	14	12	. 50	2,1
F	m858	40	41	73	8,9
	mH1	60	60	68	9,8
	mF78	64	51	80	5,8
G	mA12.1	37	45	64	8,4
	mA12.2	37	45	33	8,6
	m12,13	38	45	31	4,4
H	mB11.17	35	24	46	2,7
I	mG21.2	34	34	26	4,0
J	m1929C3.4	35	33	27	7,1
	m1929A3.1	43	25	40	3 Q
	mt 929.21	13	18	72	97
K	mS48.5	29	9	67	7,0
L	mN15.3	36	21	10	15,2

- 37 • · · · ♦ ♦ * · · * · ·

Claims (25)

1. Patentové nároky

   1. Způsob diagnostiky antigenu spočívající v identifikaci vazebné specifiky molekul protilátek s antigenem v séru metodou detekce protilátky antigenovou mimetikou (ADAM) skládající se ze sereeningu fágové knihovny za použití séra pacientů infikovaných antigenem a neinfikovaných jedinců, identifikací peptidů vázajících protilátky (ligandy) specificky asociované se jmenovaným antigenem.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenované ligandy jsou vylepšeny vyzráváním in vitro.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jmenované ligandy jsou syntetickými peptidy.
4. 4. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že jmenované ligandy jsou navázány na společné vnitřní struktury (core).
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že jmenované ligandy společně se jmenovaným společnými strukturami (core) jsou MAP.
6. 6. Soubor antigen-specifických ligandů vyznačující se tím, že se získá postupem obsahujícím:

   a) první prohlédnutí fágové knihovny n positivními séry k vytvoření první série n-fágových poolů;

   b) přípravu n poolových směsí obsahujících n-1 poolů;

   - 38 4 4 «44 4 4 4 · 4 · 4 »♦•4 4 4 4 4 44·· • 4 · 4* 4« 44 ··

   c) selekci affinity každé z n-směsí proti séru, což vytvořilo vybraný fágový pool k získání druhé série n-fágových poolů, a případně

   d) další prohlédnutí každého z n-fágových poolů z druhé série proti směsi ze všech n-původních sér, vyjma těch, které byly použity pro první prohlédnutí;

   e) ímunoscreening výsledných druhých sérií n-fágových poolů za použití směsi všech n-původních sér k získání pozitivních klonů;

   f) zkoušení jednotlivých reaktivit všech pozitivních klonů panelem pozitivních a negativních sér s použitím vybraného uspořádání sady jmenovaných klonů jako kolonií vylučujících fágy;

   g) vytvoření replik jmenovaných kolonií vylučujících fágy;

   h) screening každé repliky na její reaktivitu s pozitivním a negativním sérem ke zjištění klonů specificky reagujících s pozitivním sérem;

   i) použití každého ze jmenovaných specificky reagujících fágů jako ligandů kaffinitnímu čištění protilátek z pozitivního séra;

   j) zkoušení jmenovaných protilátek na jejich reaktivitu s předešle identifikovanými HCV peptidy;

   k) vyjednocení klonů detekovaných sérovými protilátkami.
7. 7. Způsob diagnostikování hepatitidy C vyznačující se tím, že se identifikují vazebné specifiky molekul protilátky proti HCV v séru metodou detekce protilátky antigenovou mimetikou

   I I «·« « « · · * · · «44« 1 4 4 4 4 44 4

   44 4· ·· ·· · ·*

   - 39 (ADAM) spočívající ve screeníngu fágové knihovny za použití séra od HCV pacientů a od neinfikovaných jedinců, identifikováním protilátek, které vážou peptidy (ligandy), specificky spjaté s infekcí HCV.
8. 8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že jmenované ligandy jsou vylepšeny vyzráváním in vitro.
9. 9. Způsob podle nároků 7 nebo 8, vyznačující se tím, že jmenované ligandy jsou syntetickými peptidy.
10. 10. Způsob podle nároků 6 nebo 7 nebo 8, vyznačující se tím, že jmenované ligandy jsou navázány na společné vnitřní struktury (core).
11. 11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že jmenované ligandy dohromady se společnou vnitřní strukturou (core) jsou MAP.
12. 12. Soubor HCV-specifických ligandů, které lze získat postupem zahrnujícím:

    a) první prohlédnutí fágové knihovny n positivními séry k vytvoření první série n-fágových poolů;

    b) přípravu n poolových směsí obsahujících n-1 poolů;

    c) selekci affinity každé z n-směsí proti séru, která vytvořila vybraný fágový pool k získání druhé série n-fágových poolů, a případně

    d) další prohlédnutí každého z n-fágových poolů z druhé série na směs složenou ze všech n-původních sér, vyjma těch, které byly použity pro první prohlédnutí;

    1« ·»

    - 40 • · · ·· #· ·· ··

    e) imunoscreening výsledných druhých sérií n-fágových poolů za použití směsi všech n-původních sér k získání pozitivních klonů;

    f) zkoušení jednotlivých reaktivit všech pozitivních klonů panelem pozitivních a negativních sér s použitím vybrané sady jmenovaných klonů jako kolonií vylučujících fágy;

    g) vytvoření replik jmenovaných kolonií vylučujících fágy;

    h) screening každé repliky na její reaktivitu s pozitivním a negativním sérem ke zjištění klonů specificky reagujících s pozitivním sérem;

    i) použití každého ze jmenovaných specificky reagujících fágů jako ligandu kaffinitnímu čištění protilátek z pozitivního séra;

    j) zkoušení jmenovaných protilátek na jejich reaktivitu s předešle identifikovanými HCV peptidy;

    k) vyjednocení klonů detekovaných sérovými protilátkami.
13. 13. Soubor podle nároku 12, vyznačující se tím, že fágovou knihovnou ze stupně a) je pVII 1-12aa.
14. 14. Soubor podle nároku 12 a 13 vyznačující se tím, že vložené klonové singlety ze stupně k) v nároku 12 mají následující sekvence: SREQLNKLFGIEG; RATLSNEHGITIG;

    DQRENWFKYHGFG; EWRRYMSDIHGYG;

    DSLRYMYVMPGFG.
15. 15. Soubor podle nároku 12 vyznačující se tím, že se vytvoří fágová knihovna, se každá aminokyselina klonové sekvence nezávisle substituuje nějakou další aminokyselinou.

    . Ϊ tet · · · · · * · • 44· · ·· a «···

    44 ·· >· ·· «« ··

    - 41
16. 16. Soubor podle nároku 12 vyznačující se tím, že se vytvoří fágová knihovna, ve které se nejlépe reagující klony částečně mutagenizují tím, že se každá aminokyselina klonové sekvence nezávisle substituuje na nějakou další aminokyselinou.
17. 17. Soubor podle nároku 15 nebo 16 vyznačující se tím, že jmenované klony mají vloženou sekvenci SREQLNKLFGIEG.
18. 18. Soubor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 17 vyznačující se tím, že ve jmenované fágové knihovně je náhodná sekvence obklopena dvěma cysteinovými fragmenty.
19. 19. Soubor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 18 vyznačující se tím, že peptidová sekvence je vázána na společnou vnitřní strukturu (core).
20. 20. Soubor podle nároku 17 vyznačující se tím, že jmenovaný peptid dohromady se společnou vnitřní strukturou (core) je MAP.
21. 21. Použití souboru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 20 k přípravě diagnostické soupravy k detekci HCV jedinců, u kterých se předpokládá, že byli postiženi jmenovanou HCV.
22. 22. Souprava k diagnostickým účelům obsahující soubor podle nároku 6.
23. 23. Souprava pro diagnostiku HCV obsahující soubor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 20.
24. 24. Souprava podle nároků 22 nebo 23 obsahující proužky vyznačující se tím, že se na nich tento soubor imobilizuje.
25. 25. Souprava podle nároku 24 vyznačující se tím, že jmenovaný proužek obsahuje dále interní standard.