CZ20031098A3 - Nová krystalická forma 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]fenoxy)-2-(4-methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochloridu - Google Patents

Description

Nová krystalická forma 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1yl)ethoxy]fenoxy)-2-(4-methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochloridu

Dosavadní stav techniky

6-Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-l-yl)ethoxy]fenoxy)-2-(4methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochlorid (arzoxifen) byl poprvé obecně popsán v US patentu č. 5 510 357 a podrobně byl popsán v US patentu č. 5 723 474 ('474) a eyropské patentové přihlášce 0729956. Arzoxifen je nesteroidní smíšený antagonista/agonista estrogenu užitečný kromě jiného při snižování sérového cholesterolu a pro inhibici hyperlipidémie, osteoporózy, estrogen dependentních karcinomů včetně rakoviny prsu a dělohy, endometriózy, poruch CNS včetně Alzheímerovy choroby, proliferace aortálních buněk hladkého svalstva a restenózy.

Specificky je arzoxifen užitečný i klinický vyzkoušený pro léčbu receptor pozitivní metastatické rakoviny prsu, léčbu receptor pozitivních pacientů po vhodné systémové nebo lokální léčbě; pro snížení recidivy invazivní a neinvazivní rakoviny prsu; a pro snížení dopadu invazivní rakoviny prsu a duktálního karcinomu in šitu (DCIS). Arzoxifen je také užitečný v kombinaci s inhibitory aromatázy, analogy LHRH a inhibitory acetylcholinesterázy (AChE).

Analýzy vzorku arzoxifenu izolovaného postupy popsanými ve výše uvedeném US patentu '474 práškovou metodou rentgenové difraktometrie (XRD), termogravimetríckou analýzou (TGA), protonovou nukleární magnetickou rezonancí (¹H NMR) a metodami podle Karla Fischera (KF) ukázaly, že tato látka byla hydratována, • 9 99 ·

9 9 9 9 špatně krystalizovala a obsahovala proměnné množství organické těkavé látky (ethylacetatu) ve své mřížce.

Špatně krystalické a/nebo amorfní materiály jsou obvykle méně žádoucí oproti vysoce krystalickým materiálům pro výrobu přípravků. Amorfní sloučeniny jsou chemicky a fyzikálně méně stálé, protože mají tendenci adsorbovat významná množství vody. Adsorpce vody amorfním materiálem například v želatinových kapslích může způsobit smrštění nebo pokroucení kapsle, protože vlhkost přechází z kapsle do amorfní komponenty. Kromě toho amorfní sloučeniny mají tendencí se vysrážet z roztoků, ve kterých jsou obsaženy.

V případě, že amorfní látka léčiva se vysráží z transportního roztoku, může být negativné ovlivněno rozpouštění a biologická dostupnost léčiva.

Dále není obecně žádoucí připravovat farmaceutické přípravky obsahující podstatné množství organického rozpouštědla, jako je například ethylacetat, z důvodu možné toxicity rozpouštědla vůči pacientovi a z důvodu změn účinnosti farmaceutického přípravku v závislosti na rozpouštědle. Z hlediska výroby je také obecně méně žádoucí připravovat nekrystalické látky, neboť taková příprava zahrnuje shromažďování konečného produktu prostřednictvím filtrace. Takové filtrace se provádějí obtížněji, jestliže shromažďovaný materiál není krystalický. Kromě toho je také z hlediska výroby obecně méně žádoucí připravovat farmaceutické přípravky obsahující značné množství vody (hydrátů), protože stupeň hydratace obvykle bude nějakou funkcí relativní vlhkosti, při které je farmaceutický přípravek vyráběn nebo skladován. Jinak řečeno variabilita účinku je obvykle oproti bezvodé formě u hydrátu problematičtěj ší.

Ačkoliv arzoxifen připravený postupy popsanými v patentovém spise '474 může být použit jako farmaceutický ·· · · · · · · ·· · · · · • · ··· · · 9 • · · · · · · · ♦ · · · ·· · · · · · ··· 9 · ·· · · ·· · · ·· · ·· · · · · · · «· · · přípravek, i tak by bylo velmi žádoucí a výhodné nalézt krystaličtější formu arzoxifenu, která by neobsahovala vodu ani organické rozpouštědlo uvnitř své krystalické mřížky a která by mohla být reprodukovatelně a efektivně připravena v komerčním měřítku.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká nesolvatované bezvodé krystalické formy 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1yl)ethoxy]fenoxy)-2-{4-methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochloridu (F-V) mající rentgenový difraktogram, který obsahuje alespoň jeden z následujících píku: 7,3 + 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 17,6 ± 0,2° při 2Θ za použití měděného radiačního zdroje.

Dále se tento vynález týká farmaceutického přípravku obsahujícího F-V; jeden nebo více farmaceutických nosičů, ředidel nebo vehikul; a případně stabilizátor vybraný z methioninu, acetylcysteinu, cysteinu nebo cystein hydrochloridu; a případně estrogen, případně progestin, případně inhibitor aromatázy, případně analog LHRH a případně inhibitor acetylcholinesterázy (AChE).

Dále se tento vynález týká způsobů použití F-V při inhibici patologických stavů jako je: fibróza dělohy, endometrióza, proliferace aortálních buněk hladkého svalstva, restenóza, rakovina prsu, rakovina dělohy, rakovina prostaty, benigní prostatická hyperplazie, úbytek kosti, osteoporóza, kardiovaskulární onemocnění, hyperlípidémie, poruchy CNS a Alzheimerova choroba a použití F-V pro výrobu léčiva k inhibici výše uvedených patologických stavů.

Tento vynález se dále týká způsobů použití F-V pro zvyšování enzymatické aktivity cholinacetyltransferázy • 4 • 4

(ChAT) a použití F-V pro. výrobu léčiva zvyšujícího enzymatickou aktivitu cholinacetyltransferázy.

Tento vynález se také týká způsobu přípravy F-V, který zahrnuje krystalizaci 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1yl)ethoxy]fenoxy)-2-(4-methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochloridu z krystalizačního rozpouštědla vybraného ze skupiny sestávající z: methanolu nebo vodného methanolu, ethanolu nebo isopropanolu; a následné sušení.výsledné tuhé látky do konstantní hmotnosti.

Stručný popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 je typický TGA záznam F-V.

Obrázek 2 je typický DSC záznam F-V.

Obrázek 3 je typický rentgenový difraktogram formy V.

Detailní popis vynálezu

F-V může být připravena sušením, buď při pokojové teplotě nebo při mírně zvýšené teplotě, krystalické tuhé látky izolované při pokojové teplotě krystalizaci arzoxífenu (nebo jakéhokoliv jeho polymorfu/solvátu) z methanolu, ethanolu, isopropanolu nebo vodných směsí methanolu. Při použití ethanolu a 2-propanolu je výhodně obsah vody v těchto rozpouštědlech menší než 0,2 % (spektrofotometrická kvalita). Výhodně vodný prostředek v methanolu obsahuje méně než 30 objemových procent vody. Výhodněji je F-V připravena sušením, buď při pokojové teplotě nebo při mírně zvýšené teplotě, tuhé látky izolované krystalizaci z vodného methanolu, přičemž objem vody je mezi 20 % a 5 %. Nejvýhodnějí je F-V připravena sušením tuhé látky v prostředí vakua při teplotě 50 až 70 °C izolované krystalizaci arzoxifenu (nebo jakéhokoliv jeho · ··· · ·· · · · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 99 9 9 9 9 ·9 polymorfu/solvátu) při pokojové teplotě z vodného methanolu, přičemž obsah vody je 15 objemových procent.

Obvykle může být arzoxifen rozpuštěn v methanolu (asi 1 g rozpuštěné látky/20 ml rozpouštědla) a případně i zahříván z důvodu rozpouštění výchozí látky arzoxifenu. Po rozpuštění může být tento roztok případně koncentrován na asi 1 g rozpuštěné látky/5 ml rozpouštědla například destilací, a potom je vzniklý roztok ponechán, aby se pomalu ochladil na pokojovou teplotu. Po ochlazení ria pokojovou teplotu může být tento roztok dále ochlazen prostřednictvím ledové lázně nebo chladničky na teplotu mezi 0 až 5 °C. Po ponechání dostatečného času pro krystalizaci mohou být krystaly F-V zachyceny vakuovou filtrací a promyty chladným methanolem (asi 0 °C), potom jsou krystaly sušeny v prostředí vakua do konstantní hmotnosti. Výhodné je použít mírně zvýšené teploty sušení (asi 50 °C po dobu 12 až 48 hodin) za použití promývání dusíkem. Z komerčního hlediska syntézy F-V může být výhodné zaočkovat krystalizaci krystaly F-V.

Mezi vhodný výchozí materiál arzoxifenu pro výše popsanou krystalizaci patří například S-II, F-I, F-III (solvatované a nestechiometricky hydrátováné krystalické formy arzoxifenu popsané v PCT patentových přihláškách PCT/USOO/16332 a PCTUSOO/16333, na které se tímto odkazuje), arzoxifen připravený postupy popsanými v patentovém spise '474, nebo jakékoliv jeho směsi. Není důležité, která výchozí forma arzoxifenu je použita, protože krystalizaci z bezvodého methanolu za použití postupů popsaných v tomto vynálezu jsou připraveny krystaly

F-V.

• · • · • · · · · ·

Charakterizace F-V

Pro charakterizaci F-V byly použity následující metody: diferenční skenovací kalorimetrie/termogravimetrická analýza (DSC/TGA), sorpce/desorpce vlhkosti a prášková rentgenová difraktometrie. TGA je měření termálně indukované ztráty hmotnosti látky v závislosti na teplotě. Je nejběžněji používána ke studiu desolvatačních procesů a kvantitativně stanovuje celkový obsah těkavých látek v tuhé látce. DSC je technikou, která je často používána pro screening polymorfie sloučenin, neboť teplota, při které dochází k fyzikálním změnám v látce, je obvykle charakteristickou vlastností této látky. Vlhkostní sorpční izotermy poskytují hodnocení stupně hydroskopicity dané látky a charakterizují nehydráty a hydráty. XRD je technika, která zjišťuje uspořádání v krystalické látce.

Typický TGA záznam je zobrazen na obrázku č. 1. Termogravimetrická analýza F-V neukázala žádný úbytek hmotnosti, což odpovídá izolaci nesolvatované krystalické formy. DSC analýza F-V ukázala ostrou tavící endotermu při teplotě 174 až 175 °C, jak je zobrazeno na obrázku 2, která je významně vyšší než endoterma pozorovaná pro F-III.

Vlhkostní sorpční/desorpční izoterma naměřená pro F-V ukázala nárůst hmotnosti o 0,11 % v rozsahu od 0 do 95 % relativní vlhkosti, což ukazuje na stálou bezvodou krystalovou formu s malou tendencí adsorbovat vodu nebo se přeměňovat na hydratovanou formu arzoxifenu.

Rentgenový difraktogram F-V se vyznačuje ostrými píky a rovnou základní linií, což je znak vysoce krystalických látek. Úhlové polohy píků při 2Θ a odpovídající údaje I/I_o pro všechny píky s intenzitami shodnými nebo většími než 10 % z největšího píku jsou uvedeny v tabulce 1 (stanovení F7 • · · · ·· ·· · · « · · · · · · • ···· · · ··· · • · · ··· · · · · · • · · · · · · · · ·· «· ·· ·· ··

V). Všechny údaje v tabulce 1 jsou vyjádřeny s přesností ± 0,2 %.

Ačkoliv mnoho z těchto intenzivních odrazů má obecně podobné difrakční úhly ve srovnání s S-II, F-I a F-III, každá z těchto forem má rozdílné práškové difraktogramy, což umožňuje jasné rozlišení mezi S-II, F-I, F-III a F-V.

Proměnná teplota při práškové rentgenové difraktometrii F-V neukázala žádnou významnou změnu v difraktogramu až do teploty 125 °C, což se shoduje s DSC profilem a označuje stálou krystalovou formu.

V krystalografii je známo, že v jakékoliv krystalové formě se mohou lišit relativní intenzity difrakčních píků z důvodu výhodné orientace způsobené takovými faktory, jako je morfologie krystalu a tvar. V případě přítomnosti účinků výhodné orientace dochází k změně intenzit píků, ale polohy charakteristických píků polymorfu jsou nezměněny. Viz například The United States Pharmacopeia #23., National Formulary #18, s. 1843-1844, 1995. Dále je také v krystalografii dobře známo, že pro jakoukoliv krystalovou formu se mohou mírně lišit úhlové polohy píků. Například polohy píků se mohou posouvat z důvodu rozdílnosti teploty, při které je vzorek analyzován, odchýlení vzorku a přítomnosti nebo nepřítomnosti vnitřního standardu. V tomto případě bude brána v úvahu variabilita polohy píku ±0,2 při 2Θ, aby potenciální variace nezabránila jednoznačné identifikaci F-V.

Dobře známou a uznávanou metodou zkoumání krystalových forem v literatuře je „Finkova metoda. Finkova metoda používá 4 nej intenzivnější čáry pro počáteční zkoumání a dále zkoumá další 4 nej intenzivnější čáry. V souladu s Finkovou metodou, na základě intenzit píků a rovněž i polohy píku může být F-V identifikován přítomností píků v 7,3 ± 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2 a 17,6 ± 0,2° při 2Θ za • · • · · · • · • ··· použití měděného radiačního zdroje. Přítomnost F-V může být dále potvrzena píky v 17,9 ± 0,2, 18,2 ± 0,2, 18,9 ± 0,2 a 21,5 + 0,2° při 2Θ za použití měděného radiačního zdroje.

Tabulka 1

Úhel 2Θ	I/Io (%)	Úhel 2Θ	I/Io (%)	Úhel 2Θ	I/Io (%)
7,3	45	17,6	72	22, 6	19
9,0	22	17,9	83	23,3	20
10,0	10	18,2	56	24,4	4 6
12, 8	39	18,9	82	25,8	38
14,6	15	19,8	27	27,4	32
15,5	50	21,5	100	28,2	18
15,9	64

F-V má několik výhod oproti dřívější formě arzoxifenu popsané v '474 a oproti F-I a F-III, které byly popsány v PCT přihláškách, na které se tímto odkazuje. Ve vztahu k arzoxifenu vyrobeném podle postupů popsaných v '474 je FV stabilnější při pokojové teplotě a proto je i dostupnější pro farmaceutický vývoj, tj. pro vývoj dávkovacího přípravku. Dále na rozdíl od formy popsané v '474 je F-V vysoce krystalická. Krystalické látky jsou obecně méně hygroskopické a jsou stabilnější (například jsou méně náchylné k chemické degradaci, udržují shodnou účinnost) oproti amorfním materiálům a proto jsou vhodnější pro výrobu přípravku. Dále na rozdíl od formy arzoxifenu vyrobené podle postupů popsaných v '474, která obsahovala • · 9 · 9 · — (J « 99 9 9 ·· * · * * *

-⁷ 9 · 99 ·· 9 9 99 ·9 ethylacetat a vodu ve své mřížce, F-V neobsahuje žádnou z těchto látek.

Na rozdíl od S-II, F-I a F-III je F-V skutečně bezvodou formou arzoxifenu, která nemá žádnou tendenci adsorbovat vodu při změnách relativní vlhkosti. Dále krystalová mřížka F-V je stálá až k jejímu bodu tání. F-V má přibližně o 10 % vyšší rozpustnost ve vodě oproti F-III a je termodynamicky nej stabilnější známou formou arzoxifenu. ^:

Metody pro stanovení charakteristických vlastností F-V

DSC analýza byla prováděna na přístroji TA Instruments 2920 vybaveném automatickým vzorkovačem a chladícím zařízením. Vzorek byl umístěn v obroubené hliníkové misce a byl analyzován oproti prázdné referenční misce. Tok tepla byl měřen po ekvilibraci při teplotě 30 °C. Rychlost ohřevu byla 5 °C za minuta až do teploty 300 °C. Graf toku tepla proti teplotě byl integrován z důvodu zjištění jakýchkoliv endotermických nebo exotermíckých j evů.

TGA analýza byla prováděna na přístroji TA Instruments 2950 vybaveném automatickým vzorkovačem. Vzorek byl vložen do vyvážené hliníkové misky a teplota byla zvyšována od pokojové teploty až po teplotu 300 °C při rychlosti 10 °C za minutu. Graf hmotnostního procenta proti teplotě byl integrován z důvodu stanovení procentického úbytku.

Vlhkostní sorpční izotermy byly vytvořeny za použití průtokového přístroje VTI SGA-100. Vzorky byly analyzovány při teplotě 25 °C a relativní vlhkosti v rozsahu od 0 do 95 % pro adsorpci a v rozsahu od 95 do 5 % pro desorpci při krocích 5 % relativní vlhkosti. Adsorpční a desorpční

00 ··

0 0 · 0 • ·000 0 ·

0 0 0 0 0 0 _0 0 0 « 0 ·

00 00

00 0000 0 0 0 0 000 000 0 0 0 0 0 ·

0 0 0 0 0

0· 00 izotermy byly vytvořeny jako graf změny hmotnostního procenta proti procentům relativní vlhkosti.

Rentgenové práškové difraktogramy byly naměřeny na rentgenovém difraktometru Siemens D5000 práškovou metodou a přístroj byl vybaven zdrojem CuKa (λ = 1,54056), který byl provozován při 50 kV a 40 mA s křemíkovým polovodičovým detektorem dotovaným lithiem Kevex. Vzorky byly snímány od 4 do 35° při 2Θ za 2,5 s s velikostí kroku 0,04°. Suché prášky byly plněny do držáků vzorků s vybráním a horním plněním a hladký povrch byl vytvořen skleněným podložním sklíčkem.

Rentgenové práškové difraktogramy s proměnnou teplotou byly naměřeny na rentgenovém difraktometru Siemens D500 práškovou metodou a přístroj byl vybaven zdrojem CuKa (λ = 1,54056), který byl provozován při 50 kV a 40 mA se scintilačním detektorem a niklovým filtrem. Prášek byl plněn do držáku s regulací teploty a horním plněním a následně byl upraven hladký povrch pro měření difrakce. Vzorek byl snímán od 2 do 35° při 2Θ za 2,5 s s velikostí kroku 0,04° s počátkem při teplotě 25 °C po ekvilibraci trvající 5 minut. Následné záznamy byly naměřeny při vzrůstající teplotě s krokem 25 °C až do maximální teploty 125 °C.

Následující příklady dále objasňují pracovní postupy pro přípravu F-V. Příklady nemají omezovat rozsah těchto postupů v žádném ohledu a neměly by takto být chápány.

• 4 4 4

44 44 44 44

4·4 444 · ·

4 444 4 4 444 4 4 — 1 1 J ♦ · · 4 4 4 4 4 44 4

J- ± ·« 44 .44 44 44 44

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Krystalizace z methanolu bez koncentrace

20,00 g vzorku arzoxifenu bylo smícháno s 500 ml bezvodého methanolu (čistoty pro HPLC) a vařeno pod zpětným chladičem. Po rozpuštění všech tuhých částic vzniknul homogenní světle žlutý roztok. Tento roztok byl ochlazen pod bod varu a bylo přidáno 5,00 g dalšího arzoxifenu. Roztok byl opět vařen pod zpětným chladičem do rozpuštění všech tuhých částic. Potom byl roztok za míchání ponechán, aby se pozvolna ochladil. Při teplotě 50 °C byl roztok zaočkován několika miligramy dříve připravené soli F-V. Potom během 1,25 hodiny byla krystalická suspenze ponechána, aby se ochladila z teploty 50 °C na teplotu 30 °C. V tomto okamžiku bylo v suspenzi přítomno velké množství bílé tuhé látky. Míchaná suspenze byla ponořena do ledové lázně a míchána po dobu dalších 3 hodin. Suspenze byla filtrována za použití filtračního papíru Whatman #1 a bílá tuhá látka byla promyta 50 ml předem ochlazeného methanolu na teplotu 0 °C. Vlhký koláč byl sušen po dobu asi 48 hodin při teplotě 50 °C v prostředí vakua s mírným promýváním dusíkem. Výtěžek byl 15,94 g (63,8 %). HPLC síla 89,4 % (jako volná báze), celkové příbuzné látky (TRS) 0,28 %. Porovnáním hmotnosti produktu před a po sušení ukázalo, že původní vlhký koláč obsahoval 65 % rozpouštědla.

Příklad 2

Krystalizace z methanolu s koncentrací

25,00 g vzorku arzoxifenu bylo smícháno s 500 ml bezvodého methanolu (čistoty pro HPLC) a vařeno pod zpětným chladičem. Po rozpuštění všech tuhých částic vzniknul homogenní světle žlutý roztok. Tento roztok byl zahuštěn ·· 9· · 9 ·

9 999 9

9 9 9 9 9 • «

9 99

9 99 9 · · ·· « • · 9 ·

99 destilací za atmosférického tlaku oddestilováním 375 ml destilátu. V tomto okamžiku reakční směs byla čirým homogenním žlutým roztokem. Var pod zpětným chladičem byl přerušen a roztok byl zaočkován několika miligramy dříve připravené F-V. Po zaočkování byla směs ponechána, aby se ochladila na pokojovou teplotu za pomalého míchání po dobu 1 hodiny. Během této doby se tvořilo velké množství bílé sraženiny. Suspenze byla potom ponořena do ledové lázně a míchána po dobu dalších 3 hodin. Suspenze byla filtrována za použití filtračního papíru Whatman #1 a bílá tuhá látka byla promyta 50 ml předem ochlazeného methanolu na teplotu 0 °C. Vlhký koláč byl sušen po dobu asi 48 hodin při teplotě 50 °C v prostředí vakua s mírným promýváním dusíkem. Výtěžek byl 22,44 g (89,8 %). HPLC síla 91,3 % (jako volná báze), TRS 0,26 %. Porovnáním hmotnosti produktu před a po sušení ukázalo, že původní vlhký koláč obsahoval 31,5 % rozpouštědla.

Příklad 3

Rekrystalizace z methanolu v rozsahu 30 galonů

3,08 kg vzorku arzoxifenu bylo smícháno s 60 1 bezvodého methanolu (čistoty pro HPLC) a vařeno pod zpětným chladičem. Po rozpuštění všech tuhých částic vzniknul homogenní světle žlutý roztok. Tento roztok byl zahuštěn destilací za atmosférického tlaku oddestilováním 40 1 destilátu. V tomto okamžiku reakční směs byla čirým homogenním žlutým roztokem. Reakční směs byla ochlazena k přerušení varu pod zpětným chladičem odvzdušňovací otvor byl otevřen při teplotě 40 °C z důvodu kontroly krystalizace. V reakční nádrži byly pozorovány krystaly a ochlazování pokračovalo rychlostí 12 °C za hodinu až do konečné teploty 0 °C. Krystalizační suspenze byla míchána přes noc pří teplotě 0 °C a potom byla filtrována přes

444 ·

4 4 4 4

4 4 4

4 4 444 4 4 4

4 4 • 44

jednodeskový kalolis. Z důvodu odstranění veškerého produktu z krystalizační nádrže byl matečný louh použit jako vymývací roztok a potom byl filtrován na kalolisu. Vlhký koláč byl potom promyt 11,3 1 bezvodého methanolu předem ochlazeného na teplotu 0 °C. Vlhký koláč v kalolisu byl sušen za použití vakua a cirkulací vody o teplotě 50 °C v plášti kalolisu. Po dobu 24 hodin bylo aplikováno i mírné promývání dusíkem. Celková doba sušení byla asi 36 hodin. Výtěžek byl 2,588 kg (86,27%); HPLC síla 92,7 % (jako volná báze), TRS 0,39 %.

Příklad 4

Krystalizace z ethanolu

Velmi čistý ethanol (250 ml) a arzoxifen (10,0 g) byly smíchány a vařeny pod zpětným chladičem z důvodu rozpuštění. Roztok byl ponechán, aby se ochladil na pokojovou teplotu po dobu. 3 hodin, během které se vytvořila bílá krystalická sraženina. Tuhé, částice byly izolovány filtrací a sušeny přes noc v prostředí vakua při teplotě 50 °C s mírným promýváním dusíkem. Výtěžek 5,50g, bod tání byl 173 °C (stanoveno DSC). Naměřený práškový rentgenový difraktogram tohoto vzorku byl v podstatě totožný s rentgenovým difraktogramem F-V zobrazeným na obrázku 3.

Příklad 5

Krystalizace z 2-propanolu

Bezvodý 2-propanol (250 ml) a azroxifen (10,0 g) byly smíchány a vařeny pod zpětným chladičem z důvodu rozpuštění. Ohřev byl ukončen a roztok byl zaočkován několika miligramy F-V. Reakční směs byla ponechána, aby se ochladila na pokojovou teplotu a byla míchána přes noc, během této doby se vytvořila bílá sraženina. Tuhé částice ·· >· 4 · » • 4 4 4·

444· » 4 · ·

14* ·· byly izolovány filtrací s výtěžkem 12,11 g vlhkého koláče. 4,01 g vzorku vlhkého koláče bylo sušeno přes noc při teplotě 60 °C v prostředí vakua s mírným promýváním dusíkem. Výtěžek 2,72 g, bod tání 171,5 °C (stanoveno DSC). Naměřený práškový rentgenový difraktogram tohoto vzorku byl v podstatě totožný s rentgenovým difraktogramem F-V zobrazeným na obrázku 3.

Příklad 6

Příprava z volné báze azroxifenu

Volná báze azroxifenu (5,07 g) byla převedena do suspenze v 65,0 ml methanolu. K reakční směsi bylo přidáno 1,41 ml koncentrovaného roztoku kyseliny chlorovodíkové a 10,0 ml vody. Z důvodu rozpuštění byla reakční směs zahřívána při teplotě 55 °C po dobu 15 minut. Reakční směs byla ochlazena.na teplotu 30 °C a zaočkována 50 mg F-V. Reakční směs byla ochlazena na teplotu 10 °C při rychlosti l°C/hod. a byla míchána 8 hodin při této teplotě. Tuhé částice byly izolovány filtrací, promyty předem ochlazeným methanolem na teplotu 10 °C a vakuově sušeny při teplotě 50 °C přes noc za mírného promývání dusíkem. Výtěžek 4,42 g (87,7 %); účinnost (HPLC) 99,7; TRS 0,32 %. Naměřený práškový rentgenový difraktogram tohoto vzorku byl v podstatě totožný s rentgenovým difraktogramem F-V zobrazeným na obrázku 3.

Definice použitých pojmů

Výraz „účinné množství, jak je zde použit označuje množství F-V, které je schopno inhibovat zdravotní stavy nebo jejich škodlivé účinky, které jsou popsané v tomto textu. V případě, že F-V je podávána společně s estrogenem, progestinem, inhibitorem aromatázy, analogem LHRH nebo •9 9999

9 9 · · ♦

9 999 9 9 9

999 99 999 9 9

9999 9999 inhibitorem AChE, potom výraz „účinné množství také znamená množství takového činidla schopného vytvořit jeho zamýšlený účinek.

Výrazy „inhibice a „inhibovat zahrnují jejich obecně přijímaný význam, tj. zabránění, odrazení, omezování, tišení, zlepšení, zpomalení, zastavení nebo obrácení postupu nebo intenzity patologického stavu nebo jejich následků popsaných v tomto textu.

Výrazy „prevence, „profylaxe, „profylaktický, a „působit prevenčně jsou použity zaměnitelně a označují snížení pravděpodobnosti, že u příjemce F-V se vyvinou jakékoliv patologické stavy nebo jejích následky popsané v tomto textu.

Výrazy „estrogenová deprivace a „estrogenově deprivovaný označují stav, buď se přirozeně vyskytující nebo klinicky vyvolaný, kdy žena nemůže produkovat dostatečné množství endogenních estrogenních hormonů pro udržení estrogen-dependentních funkcí jako je například menstruace, homeostáze kostní hmoty, neuronová funkce, kardiovaskulární stav atd. Takové situace s nedostatkem estrogenu jsou například způsobeny menopauzou, chirurgickou nebo chemickou ovariektomií včetně jejich funkčních ekvivalentů, jako je léčba inhibitorem aromatázy, agonisty nebo antagonisty GnRH, ICI 182780 a podobně. Mezi onemocnění spojovaná s nedostatkem estrogenu například patří úbytek kosti, osteoporóza, kardiovaskulární onemocnění a hyperlipidémie.

V tomto textu použitý výraz „estrogen zahrnuje steroidní sloučeniny mající estrogenní aktivitu, jako je například 17p-estradiol, estron, konjugovaný estrogen (Premarin®), koňský estrogen 17p~ethynylestradiol a podobně. Výhodnou sloučeninou na bází estrogenu je Premarin® a norethylnodrel.

·44· «* 99 ·· • 99 9 9 4 • 4 944 · · 944 • 9 4 · · · 9 9 • · 9 · · · ·

V tomto textu použitý výraz „progestin zahrnuje sloučeniny mající progestační aktivitu jako je například progesteron, norethylnodrel, nongestrel, megestrolacetat, norethindron a podobně. Norethindron je činidlem na bázi progěstinu.

V tomto textu použitý výraz .„inhibitor aromatázy zahrnuje sloučeniny schopné inhibovat aromatázu, jako jsou například komerčně dostupné inhibitory: aminoglutemid (CYTANDREN®), Anasťrazol (ARIMIDEX®), Letrozol (FEMARA®), Formestan (LENATRON®), Exemestan (AROMASIN®) a podobně.

V tomto textu použitý výraz „analog LHRH se týká analogu spouštěcího hormonu luteinizačního hormonu, který inhibuje produkci estrogenu u žen v období před menopauzou, jako je například goserlin (ZOLADEX®), leuprolid (LUPRON®) a podobně.

V tomto textu použitý výraz „inhibitor AChE zahrnuje sloučeniny, které inhibují acetylcholinesterázu, jako je například fyzostigminsalicylat, takrinhydrochlorid, donepezilhydrochlorid a podobně.

Výraz zvyšovat aktivitu ChAT se týká zvyšování enzymatické aktivity ChAT, tj. napomáhání konverzi cholinu na acetylcholin. Toto působení by zahrnovalo zvýšení výtěžku a/nebo rychlosti reakce ChAT a cholinu a/nebo zvýšení množství ChAT přítomného v místě působení. Toto zvýšení množství přítomného enzymu může být způsobeno regulací genu nebo jiným syntetickým krokem při tvorbě enzymu a/nebo snížením deaktivace a metabolismu enzymu.

Vybrané testovací postupy

Obecný postup přípravy pokusu s krysami: Krysí samice rodu Sprague Dawley ve stáří 75 dní (jestliže není uvedeno jinak) o hmotnosti v rozmezí 200 až 225 g byly získány z ·· ·· • · · • · ··· • · · 9

9 9 9

99

9 9

9 999

9 9 9 9

9 9 9 ·« ····

9 9

9 9

9 9 9 • · · ·

Charles River Laboratories (Portage, MI). Zvířatům byly buď oboustranně odebrány vaječníky (OVX) nebo byly vystaveny Shamově chirurgické proceduře v Charles River Laboratories; a potom byly dodány po jednom týdnu. Po dodání byly umístěny v kovových závěsných klecích ve skupinách po 3 až 4 zvířatech a měly přístup k potravě po libosti (obsah vápníku byl přibližně 0,5 %) a vodu měly na jeden týden. Teplota místnosti byla udržována v teplotním rozmezí 22,0 ± 1,7°C s minimální relativní vlhkostí ve výši 40 %. Fotoperioda v místnosti byla 12 hodin světla a 12 hodin tmy.

Dávkovači schéma při odebírání tkání: Po jednom týdnu aklimatizace (2 týdny po OVX) bylo započato s denním dávkováním F-V. 17a-ethynylestradiol nebo F-V byly podávány orálně, jestliže není uvedeno jinak, jako suspenze v 1% karboxymethylcelulose nebo byly rozpuštěny v 20% cyklodextrinu. Zvířatům byly podávány dávky denně po dobu 4 dnů. Po ukončení dávkovacího režimu byla zvířata znecitlivěna směsí ketamin : Xylazin (2 : 1, obj. : obj.) a vzorek krve byl odebrán srdeční punkcí. Zvířata byla potom usmrcena zadušením CO2, děloha byla odebrána přes středový řez a byla stanovena hmotnost dělohy v syrovém stavu. 17aethynylestradiol byl získán od firmy Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO.

Kardiovaskulární onemocnění/hyperlipidémie

Vzorky krve dle výše uvedeného postupu byly ponechány koagulovat při pokojové teplotě po dobu 2 hodin a sérum bylo získáno následným odstředěním po dobu 10 minut při 3000 ot./min. Sérový cholesterol byl stanoven za použití vysoce rozlišovací zkoušky na cholesterol od firmy Boeringer Mannheim Diagnostics. Cholesterol byl oxidován na cholest-4-en~3-on a peroxid vodíku. Peroxid vodíku potom ·-· ·· • · · » * < ·· • · · · • · · — »· e* ·· « * · • tl «·· • · · · *· ·« ·« «·Μ t « ♦ ♦ « · • · ♦

9 9 · ·· ·· reaguje s fenolem a 4-aminofenazonem za přítomnosti peroxidázy za vzniku p-chinoniminového barviva, které je stanoveno spektrofotometricky při 500 nm. Koncentrace cholesterolu je potom vypočtena z kalibrační křivky. Celá zkouška je automatizována za použití přístroje Biomek Automated Woekstation.

Stanovení peroxidázy z děložních eozinofilů

Dělohy dle výše uvedeného postupu byly uchovány při teplotě 4 °C až do doby enzymatické analýzy. Potom byly dělohy homogenizovány v 50 objemech 50 mM Tris pufru (pH 8,0). obsahujícího 0,005% Triton X-100. Po přidání 0,01% peroxidu vodíku a 10 mM o-fenylendiaminu (konečné koncentrace) v Tris pufru byl zaznamenáván nárůst absorbance po dobu 1 minuty při 450 nm. Přítomnost eozinofilů v děloze je indikací estrogenní aktivity sloučeniny. Maximální rychlost v 15 sekundovém intervalu byly stanovena v počáteční lineární části reakční křivky.

Testovací procedura inhibice úbytku kosti (osteoporózy)

Po výše popsaném obecném postupu přípravy byly krysy krmeny denně po dobu 35 dní (6 krys v jedné skupině) a 36 den byly usmrceny zadušením oxidem uhličitým. Doba 35 dnů je dostatečná k projevení se maximálního snížení hustoty kosti,což bylo měřeno způsobem popsaným v tomto textu. Po usmrcení byly dělohy vyňaty, odděleny od vnější tkáně a kapalný obsah byl odstraněn před stanovením hmotnosti v syrovém stavu z důvodu potvrzení deficitu estrogenu spojovaného s úplným odnětím vaječníků. Hmotnost dělohy byla běžně snížena na asi 75 % v reakci na ovariektomii. Dělohy byly potom vloženy do 10% neutrálního pufrovaného formalinu pro následnou histologickou analýzu.

• * · · · · • · · · • · · · • · 4 4 4 44 4 4 44 4 • 4 44 44 44 4 4 44

Pravé kosti stehenní byly vyříznuty a analyzovány v místě distální metafýzy rentgenovou analýzou, výsledné snímky byly digitalizovány a analyzovány programem pro obrazovou analýzu (NIH image). Proximální strana holenních kosti z těchto zvířat byla také snímána kvantitativní počítačovou tomografií. V souladu s výše uvedenými postupy byly testovaným zvířatům podávány orálně F-V nebo ethynyl estradiol (EE₂) v 20% hydroxypropyl β-cyklodextrinu. F-V je také užitečná v kombinací s estrogenem nebo progestinem.

Prolifetrační zkouška MCP-7

MCF-7 buňky prsního adenokarcinomu (ATCC HTB 22) byly udržovány v médiu MEM {minimální esenciálním médiu, bez fenolové červeně, Sigma, St. Louis, MO) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) (V/V), L-glutaminem (2 mM), pyruvátem sodným (lmM), HEPES {(N-[2hydroxyethyl]pipérazin-N'-[2-ethansulfonová kyselina] 10 mM}, neesenciálními aminokyselinami a hovězím inzulínem (1 pg/ml) (uchovávací medium). Deset dnů před zkouškou byly MCF-7 buňky převedeny do uchovávacího media doplněného 10% dextranem na živočišném uhlí desorbujícím fetální hovězí sérum (DCC-FBS), zkušební medium, místo 10% FBS z důvodu vyčerpání interních zásob steroidů. MCF-7 buňky byly odebrány ze zásobních baněk za použití uvolňovacího media (Ca²⁺/Mg²⁺, bez HBSS, bez fenolové červeně) doplněného lOmM HEPES a 2 mM EDTA). Buňky byly promyty 2 krát zkušebním mediem a jejich koncentrace byla upravena na 80 000 buněk/ml. Přibližně 100 μΐ (8000 buněk) bylo přidáno do mikrokultivačních jamek s plochým dnem (Costar 3596) a bylo inkubovány při teplotě 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s přídavkem 5% CO₂ po dobu 48 hodin, aby se buňky přichytily k povrchu jamky a rovněž došlo i k ekvilibraci po přesunu. Postupná ředění léčiv nebo DMSO (kontrola s ředidlem) byla • · · · připravena ve zkušebním mediu a 50 μΐ bylo přeneseno (3 x) k mikrokulturám a potom bylo přidáno 50 ml μΐ zkušebního media, čímž byl konečný objem 200 μΙ.Ρο dalších 48 hodinách při teplotě 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s přídavkem 5% C0₂ byly mikrokultury pulzně značeny thymidinem značeným tritiem (1 pCi/jamka) po dobu 4 hodin. Kultivace byly ukončeny zmrazením na teplotu -70 °C po dobu 24 hodin. Potom byly mikrokultury rozmraženy a sklizeny za použití přístroje Skatron Semiautomatic Cell Harvesťer. Vzorky byly měřeny detektorem s kapalným scintilátorem za použití čítače Wallac BetaPlace β.

DMBA-indukovaná inhibice prsního nádoru

Estrogen-dependentní prsní nádory byly vyvolány u samic krys rodu Sprague-Dawley, které byly zakoupeny od Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. Asi ve stáří 55 dní dostávaly krysy jednorázově 20 mg 7,12dimethylbenz[a]antracenu (DMBA). Asi 6 týdnů po podání DMBA byly u zvířat v týdenním intervalu vyšetřovány pohmatem prsní žlázy z důvodu výskytu nádoru. U každého zjištěného nádoru byl měřen nejdelší a nej kratší průměr pomocí metrického kalibru, měření byla zaznamenávána a toto zvíře bylo vybráno pro další pokusy. Zvířata byla do testovacích skupin zařazována tak, aby byly rovnoměrně rozděleny různé velikosti nádorů v ošetřovaných i kontrolních skupinách. Kontrolní skupiny a testovací skupiny v každém pokusu obsahovaly 5 až 9 zvířat.

F-V byla podávána buď prostřednictvím intraperitoneálních injekcí v 2% klovatině nebo orálně. Orálně podávané sloučeniny byly buď rozpuštěny nebo suspendovány v 0,2 ml kukuřičného oleje. Každé ošetření, včetně kontrolních ošetření klovatinou a kukuřičným olejem, bylo aplikováno jedenkrát denně každému testovanému • ·

- 21 • · 4' 4 « • · · · 4 · 4 • 4 4 4 4 4 4 • 4 44 44 zvířeti. Po počátečním měření nádoru a výběru testovacích zvířat byly nádory měřeny každý týden způsobem popsaným výše. Ošetřování a měření zvířat pokračovalo 3 až 5 týdnů, až do doby, kdy byly stanoveny konečné plochy nádorů. Pro každou sloučeninu a kontrolní ošetření byla stanovena změna průměrné plochy nádoru.

Testovací postupy pro stanovení fibrózy dělohy

Test 1: Třem až dvaceti ženám majícím fíbrózu dělohy byla podávána F-V. Množství podávané sloučeniny bylo v rozmezí od 0,1 do 1000 mg/den a doba podávání byla 3 měsíce. Ženy byly sledovány během doby podávání a potom až 3 měsíce po skončení podávání z důvodu zjištění účinku léčby na fíbrózu dělohy.

Test 2: Byl použit stejný postup jako v testu 1 s tou výjimkou, že doba podávání byla 6 měsíců.

Test 3: Byl použit stejný postup jako v testu 1 s tou výjimkou, že doba podávání byla 1 rok.

Test 4: Prodloužená stimulace estrogenu byla použita k vyvolání leimyomů u sexuálně dospělých samic morčat. Zvířatům byl dávkován estradiol 3 až 5-krét týdně injekcí po dobu 2 až 4 měsíců nebo dokud nevznikly nádory. Léčivo skládající se z F-V nebo vehikula bylo podáváno denně po dobu 3 až 16 týdnů a potom byla zvířata usmrcena, dělohy byly vyjmuty a analyzovány pro zjištění regrese nádoru.

Test 5: Tkáň z lidských leiomyomů byla implantována do dutiny břišní a/nebo do děložní svaloviny sexuálně dospělých, kastrovaných samic holých myší. Exogenní estrogen byl dodáván z důvodu vyvolání růstu explantované • · tkáně. V některých byly získané nádorové buňky kultivovány in vitro před implantací. Léčivo skládající se z F-V nebo vehikula bylo aplikováno denně žaludečním výplachem po dobu 3 až 16 týdnů, potom byly implantáty odstraněny a byl měřen jejich růst nebo regrese. V době usmrcení byly odebrány dělohy pro hodnocení stavu orgánu.

Test 6: Tkáň z lidských děložních fibroidních nádorů byla odebrána a uchována in vitro jako primární netransformované kultury. Chirurgické vzorky byly protlačeny přes sterilní síť nebo síto nebo alternativně byly separovány od okolní tkáně za vzniku jednobuněčné suspenze. Buňky byly uchovávány v mediích obsahujících 10% sérum a antibiotikum. Byly stanoveny rychlosti růstu za přítomnosti a nepřítomnosti estrogenu. Buňky byly testovány na jejich schopnost produkovat komplementární složku C3 a na jejich odezvu na růstové faktory nebo růstový hormon. In vitro kultury byly testovány na jejich proliferační odezvu po ošetření progestiny, GnRH, F-V a vehikulem. Koncentrace receptorů steroidních hormonů byly testovány týdně pro určení, zda jsou udržovány in vitro důležité charakteristické vlastnosti buněk. V testu byla použita tkáň od 5 až 25 pacientek.

Test 7: Schopnost F-V inhibovat estrogenem stimulovanou proliferaci ELT buněčných linií odvozených od leiomyomů byla měřena v podstatě tak, jak je popsáno v článku Fuchs-Young, et al., „Inhibition of EstrogenStimulated Growth of Uterine Leimyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators”, Mol. Car., 17(3): 151-159 (1996), na který se tímto odkazuje.

4· • 4 4

4 4 44

4 4 4

4 4 ·

44 • 4 4 4 4 * * 4 « · · · 4 · 4 4 · • 4 4 4 4 4 4' * «4 ·· 44 44

Postupy pro stanoveni endometriózy

Test 1: K testování bylo použito 12 až 30 dospělých krysich samic linie CD. Byly rozděleny do 3 skupin o stejném počtu. U všech zvířat byl sledován estrální cyklus.

V den proestra byl na každé samici proveden chirurgický .zákrok. Samice v každé skupině měly odstraněn levý děložní roh, ten byl rozřezán na malé čtverce a tyto čtverce byly volně přišity na různá místa přiléhající k mezenterickému krevnímu toku. Kromě toho měly'samice ve skupině 2 odstraněny vaječníky. Od následujícího dne po chirurgickém zákroku byly zvířatům ve skupině 1 a 2 po dobu 14 dnů aplikovány intraperitoneální injekce s vodou, zatímco zvířatům ve skupině 3 byly aplikovány po stejnou dobu intraperitoneální injekce obsahující 1,0 mg F-V/kg tělesné hmotnosti. Po 14-denním působení byla každá samice usmrcena a byly odebrány endometriální explantáty, nadledvíny, zbývající děloha a vaječníky, kde to bylo možné, a vzorky byly připraveny na histologické vyšetření. Vaječníky a . nadledvíny byly zváženy.

Test 2: K testování bylo použito 12 až 30 dospělých krysích samic linie CD. Byly rozděleny do 2 skupin o stejném počtu. U všech zvířat byl sledován estrální cyklus.

V den proestra byl na každé samici proveden chirurgický zákrok. Samice v každé skupině měly odstraněn levý děložní roh, ten byl rozřezán na malé čtverce a tyto čtverce byly volně přišity na různá místa přiléhající k mezentrickému krevnímu toku. Asi 50 dnů po chirurgickém zákroku byly zvířatům ve skupině 1 po dobu 21 dnů aplikovány intraperitoneální injekce s vodou, zatímco zvířatům ve skupině 2 byly aplikovány po stejnou dobu intraperitoneální injekce obsahující 1,0 mg F-V/kg tělesné hmotnosti. Po 14denním působení byla každá samice usmrcena a byly odebrány a zváženy endometriální explantáty a nadledvíny. Tyto

I ftftft ft· ft» • ft ftft » · · ft ftftftft ft ftft <

• ft explantáty byly měřeny jako indikace růstu. Byly sledovány estrální cykly.

Test 3: Autotransplantáty endometriální tkáně byly použity k vyvolání endometriózy u krys a/nebo u králíků. Samicím zvířat v reprodukční zralosti byly oboustranně chirurgicky odebrány vaječniky a estrogen byl dodáván exogenně tak, aby byla zvířatům dodávána specifická a konstantní hladina hormonu. Autologní endometriální tkáň byla implantována do peritonea 5 až 150 zvířat a estrogen byl dodáván k vyvolání růstu explantované tkáně. Léčivo obsahující sloučeninu podle tohoto vynálezu bylo aplikováno denně gastrickým vymýváním po dobu 3 až 16 týdnů. Potom byly implantáty odebrány a měřeny z hlediska růstu či regrese. V době usmrcení byl odebrán celý roh dělohy z důvodu vyhodnocení stavu endometria (děložní sliznice).

Test 4: Tkáň z lidských endometriálních lézí byla implantována do peritonea sexuálně zralých, kastrovaných samic holých myší. Exogenní estrogen byl dodáván k vyvolání růstu explantované tkáně. V některých případech byly získané endometriální buňky kultivovány in vitro před implantací. Léčivo obsahující F-V bylo aplikováno denně gastrickým výplachem po dobu 3 až 16 týdnů. Potom byly implantáty odebrány a měřeny z hlediska růstu či regrese. V době usmrcení byly odebrány dělohy z důvodu hodnocení stavu neporušenosti endometria.

Test 5: Tkáň z lidských endometriálních lézí byly odebrána a uchována in vitro jako primární netransformované kultury. Chirurgické vzorky byly protlačeny přes sterilní síť nebo síto nebo alternativně byly separovány od okolní tkáně za vzniku jednobuněčné suspenze. Buňky byly uchovávány v mediích obsahujících 10% sérum a antibiotikum.

• · ·· • · · • · · · · • · · • » * • * · · « · * · ···* φ · ♦ * ·· «· ·· ··

Byly stanoveny rychlosti růstu za přítomností a nepřítomnosti estrogenu. Buňky byly testovány na jejich schopnost produkovat komplementární složku C3 a na jejich odezvu na růstové faktory nebo růstový hormon. In vitro kultury byly testovány na jejich proliferační odezvu po ošetření progestiny, GnRH, F-V a vehikulem. Koncentrace receptorů stroidních hormonů byly testovány týdně z důvodu určení, zda byly udržovány in vitro důležité charakteristické vlastnosti buněk.V testu byl použita tkáň od 5 až 25 pacientek.

Poruchy CHS včetně Alzheimerovy choroby

Estrogeny, jako je 17Q-estradiol, regulují genovou transkripci vazbou na receptory estrogenů (ER), které se vyskytují v cytoplazmě určitých buněčných populací.

Aktivace ligandů je bezpodmínečně nutná pro jaderný transport tohoto komplexu, vazbou 13 párů bází konvenční sekvence palindromické DNA (estrogen-odezvový element, ERE) začíná shromažďování transkripčního aparátu, které vrcholí aktivací vhodných cílových genů. Bylo identifikováno mnoho genů, které jsou regulovány estrogenem. Mezi ně patří cytoskeletové proteiny, neuropřenašeÓe biosyntetických a metabolických enzymů a receptorů, a rovněž i další hormony a neuropeptidy. ERE byly identifikovány u mnoha estrogenresponzivních genů včetně vítellogenínu, c-fos, prolaktinu a luteinizačního hormonu.

Byly identifikovány sekvence podobající se ERE v p75^ngr a trkA, obě dvě slouží jako signalizační molekuly pro neurotrofiny: nervový růstový faktor (NGF), nervový růstový faktor odvozený z mozku (BDNGF) a neurotrofin-3.

9

99 99

9 9 9

9999 9

Bylo ukázáno, že BDNF a rovněž i NGF napomáhají přežívání cholinergických neuronů v kultuře. Předpokládá se, že interakce mezi neurotrofiny a estrogeny byly důležité pro vývoj a přežití bazálních neuronů předního mozku{ty degradují za vzniku Alzheimerovy choroby), potom klinické stavy, při kterých existuje nedostatek estrogenu (jako po menopauze), mohou přispívat ke ztrátě těchto neuronů.

Následující pokus byl prováděn na krysách s odebranými vaječníky, které byly připraveny výše popsaným způsobem, pro stanovení podobností a/nebo rozdílů mezi F-V a estrogenem pří ovlivňování genové exprese v různých oblastech mozku. Krysám ve stáří 6 týdnů byly denně aplikovány podkožní injekce estradíol benzoatu (0,03 mg/kg), F-V nebo vehikula (kontrola). Po 5 týdnech ošetřování byla zvířata usmrcena, jejich mozky byly odebrány a hippocampy byly shromážděny mikrodisekcí. Hippocampy byly rychle zmraženy v kapalném dusíku a byly skladovány pří teplotě - 70 °C. Z odebraných tkání jednotlivých skupin (kontrolní, testovacích) byl připravena celková RNA a byla reverzně přepsána za použití 3'oligonukleotidového primeru, který byl vybrán pro specifické mRNA (poly-A+) populace. Polymerázové řetězové reakce byly prováděny v směsi skládající se z náhodných 5'oligonukleotidů (délka 10 párů bází; celkově 150), reakčniho pufru, Tag polymerázy a ³²PdTCP.

Po 40 kolech amplifikace byly reakční produkty frakcionovány podle velikosti na 6% TBE-močovina gelu, byly vysušeny a rentgenově snímány na film. Výsledné zobrazené obrazce mRNA byly porovnány mezi jednotlivými ošetřovanými skupinami.

• 9··

9 99 • 9 9

9 999

Použití F-V společně s estrogenem

Ženy kolem menopauzy a po menopauze často podstupují náhradní hormonální léčbu (hormone replacement therapy HRT) z důvodu potlačení negativních důsledků spojených s poklesem cirkulujícího endogenního estrogenu, jako je například léčba návalů horka. Avšak HRT byla spojována se zvýšenými riziky určitých karcinomů včetně rakoviny dělohy a prsu. F-V může být použita společně s HRT k zamezení těchto rizik.

Použiti F-V společně s inhibitorem aromatázy

Vaječníky ženy po menopauze nejsou funkční. Jediný zdroj estrogenu u těchto žen pochází z přeměny andrenálních androgenů na estrogeny prostřednictvím enzymu aromatázy, která se nachází v periferních tkáních (včetně tuku, svalu a samotného nádoru prsu). Proto léčiva, která inhibuji aromatázu (inhibitory aromatázy), snižují hladinu cirkulujícího estrogenu u žen po menopauze. Nedostatek estrogenu z důvodu inhibice aromatázou byl důležitá léčebná varianta u pacientů s metastatickou rakovinou prsu. Během léčby s inhibitorem aromatázy může nedostatek cirkulujícího estrogenu způsobit negativní neočekávané vedlejší účinky jako například na hladiny sérových lipidů. F-V může být použita k inhibici těchto negativních účinků.

Použití F-V společně s analogem LHRH

Nepřetržitá expozice analogem LHRH (uvolňujícímu hormonu luteinizačního hormonu) inhibuje produkci estrogenu před menopauzou snížením citlivosti podvěsku mozkového, který potom již nestimuluje vaječníky k tvorbě estrogenu. Klinickým účinkem je „medicínské odnětí vaječníků, tento účinek je reverzibilní po přerušení příjmu analogu LHRH.

·* ·· ·· ·· ·· · » · « · · · ♦ · • · · · ··· · · • · · · * · ·· ·*· · »··· · » * · » · * ·· «« ·· «· *·

Během léčby s analogem LHRH může nedostatek cirkulujícího estrogenu způsobit negativní neočekávané vedlejší účinky, jako například na hladiny sérových lipidů. F-V může být použita k inhibici těchto negativních účinků.

Zvýšeni hladin acetylcholinu

Je známo, že pacienti trpící Alzheimerovou chorobou mají zjevně nižší hladinu cholinergních neuronů v \ hippocampu oproti zdravým jedincům. Zdá se, že postupná ztráta těchto cholinergních neuronů odpovídá postupné ztrátě paměti a rozpoznávací funkce u těchto pacientů. Předpokládá se, že jediným důvodem poklesu těchto neuronů je ztráta nebo zhoršení funkce neuropřenašeče, acetylcholinu.

Hladina acetylcholinu v neuronu je v podstatě určena polohou rovnováhy mezi jeho biosyntézou a biodegradací. Enzym cholinacetyltransferáza (ChAT) je zejména zodpovědný za jeho syntézu a acetylcholinesteráza (AChE) za jeho degradací.

Následující pokus byl prováděn pro stanovení účinku F-V na hladiny ChAT. Po obecném postupu přípravy krys popsaném výše byl 40 krysám denně dávkována podkožní injekcí nebo orální žaludeční sondou F-V o koncentraci 3 mg/kg/den ve vehikulu obsahujícím 10% cyklodextrin, estradiol benzoát o koncentraci 0,03 nebo 03 mg/kg/den nebo vehikulum pro kontrolní skupinu. Zvířata byla ošetřována po dobu 3 nebo 10 dnů. V každém dávkovacím schématu byl 20 zvířat. Ve vhodných časových intervalech byla zvířata usmrcena a jejich mozky byly vyjmuty. Určité části mozků byly homogenizovány a testovány. Byly zpracovány homogenáty z hippocampu a čelní kůry a stanovení ChAT aktivity byl provedeno radioaktivní zkouškou během biosyntézy acetylcholinu. Tento postup byl uveden v článku • 0 • 0 0 0 0 0

0 000 t 0 000

00 000 00

0 0 · 0 · *

0 0 0 ·· · * · 0 00 0

Schoepp et al., J. Neural Transmiss., 78: 183 - 193, 1989, na který se tímto odkazuje.

Jak se očekávalo, u OVX zvířat byly hladiny ChAT sníženy o více než 50 % (p < 0,001) ve srovnání s kontrolními skupinami.

V dalším provedení tohoto vynálezu byla F-V použita v kombinaci s inhibitorem AChE. Použití AChE inhibitoru zvyšuje hladiny acetylcholinu. zabráněním jeho degradace prostřednictvím inhibice AChE.

Benigní, prostatická hyperplasie

Pro získání základních informací o souvislosti mezi působením estrogenu a léčbou BPH a rakovinou prostaty viz PCT přihláška č. WO 98/07274, datum mezinárodní publikace: 15. října 1998.

V pokusech popsaných níže byl hodnocena schopnost F-V se vázat na receptory estrogenu u několika lidských prostatických rakovinných buněčných linií.

Lyzáty LNCaP, DU-45 a PC-3 lidské prostatické rakovinné buněčné linie byly připraveny v TEG mediu obsahujícím 50 nM Tris*HCl, pH 7,4, 1,5 mM ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA), 0,4 M KC1, 10% glycerol, 0,5 mM 2-ME, a lOmM molybdenan sodný, dále obsahující inhibitory proteinázy: pepstatin (1 mg/ml), leupeptin (2 mg/ml), aprotinín (5 mg/ml) a fenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF, 0,1 mM)(TEGP).

Buněčné lyzáty byly odstředěny a pelety byly resuspendovány v chladném TEGP (1 ml TEGP/100 mg pelet) a sonikovány po dobu 30 sekund (pracovní cyklus 70 %, výkon 1,8) na přístroji Branson Model 450 Sonifier. Lyzáty byly peletizovány odstředěním při 10000 x G po dobu 15 minut při teplotě 4 °C, následně byly supernatanty odebrány a byly • · · 9 ··· buď okamžitě použity nebo byly skladovány při teplotě -70 °C.

• 99 ··

99*9 9 9

Kompetitivní vazebná zkouška: Vazebným pufrem byl TEG, v němž byl 0,4 M KC1 nahrazen 50 mM NaCl a ke kterému byl dále přidán vaječný albumin o koncentraci 1 mg/ml (TEGO). F-V byla zředěna na 20 nM v TEGO, z takto připraveného roztoku byla připravena 3 násobná postupná ředění. Testy byly prováděny na polypropylenových mikrodestíčkách s rovným dnem v míkrojamkách v trojitém provedení. Do každé jamky bylo odpipetováno 35 ml 17p-estradiolu značeného tritiem (0,5 nM, specifická aktivita 60,1 Ci/nmol, DuPontNew England Nuclear, Boston, MA.) a 35 ml chladné kompetitivní testovací sloučeniny 0,1 nM - 5 mM) nebo TEGO, a následující inkubaci po dobu 5 minut při teplotě 4 °C za třepání, 70 ml MCF-7 lyzátu buněčné linie.

Desky byly inkubovány po dobu 24 hodin při 4 °C, potom bylo do každé jamky přidáno 70 ml dextranu potaženého aktivním uhlím (DCC) a deska byla důkladně třepána 8 minut pří 4 °C. Desky byly potom odstředěny při 1500 x G po dobu minut a 4 °C. Supernatant z každé jamky byl odebrán do pružné polystyrénové mikrodestičky pro scintilační detekování na čítači Wallac Micobeta Model 1450.

Radioaktivita je vyjádřena jako počet rozpadů za minutu (DPM) po korekci na účinnost detekce (35-40 %) a pozadí.

Dalšími kontrolami byla celková četnost pulsů a celkový četnost pulsů + DCC z důvodu definování spodního limitu DCC četnosti pulsů. Výsledky z těchto kompetitivních vazebných testů byly vyjádřeny jako průměrná procentická vazba (% vazby) +/- směrodatná odchylka za použití vzorce:

DPM test. sloučenina ~ OPMcelkové četnost pulsů +DCC % vazby ------------------------------------------- x 100

DPM žádná test. sloučenina ~ DPMceifcová četnost pulsů +DCC >4 ····

44 44 4« • · · · 4 4

4444 9 4444

4· 4» • 4 44

Prevence rakoviny prsu

Tento vynález se také týká podávání F-V příjemci, u kterého existuje nebezpečí vyvinutí rakoviny prsu de novo. Výraz „de novo použitý v tomto textu znamená nedostatek transformace nebo proměny normálních prsních buněk na rakovinné nebo zhoubné. K takové transformaci může docházet v stádiích stejných nebo dceřiných buněk ........

prostřednictvím vývojového procesu nebo k ní může docházet v jednotlivém klíčovém případu. Tento de novo proces se lisí od metastázy, kolonizace nebo šíření již transformovaných nebo zhoubných buněk z původního místa tumoru do nových míst.

Osoba, u které není žádné zvláštní riziko vyvinutí rakoviny prsu je osobou, u které se může se může vyvinout rakovina prsu de novo, není u ní důkaz nebo podezření potenciálního onemocnění nad normální riziko a která nikdy neměla diagnózu tohoto onemocnění. Největší rizikový faktor přispívající k vývoji rakoviny prsu je anamnéza osoby nebo dřívější výskyt této nemoci, , i když dochází k dočasnému vymizení projevů nemoci. Dalším rizikovým faktorem je rodinná anamnéza této nemoci.

Indukce prsních nádorů u krys po podání karcinogenu Nnitroso-N-methylmočoviny je uznávaným živočišným modelem pro studium rakoviny prsu a je vhodný pro analyzování účinků chemopreventivních činidel.

Ve dvou samostatných studiích byla podávána krysím samicím rodu Sprague-Dawley ve stáří 55 dní intravenózní (studie 1) nebo intraperitoneální (studie 2) dávka 50 mg Nnitroso-N-methylmočoviny na kg tělesné hmotnosti jeden týden před krmením potravy po libosti, ve které bylo přimícháno proměnné množství F-V, (Z)-2-[4-(1,2-difenyl-l·* 4444

Η 44 44

44 4«· · 4 ·

4 444 4 4 444 4 4 4

44 4 4 4 44 444 4 4

44 4 4 44 4 4 44 4

44 44 44 44 44 butenyl)fenoxy]-Ν,Ν-dimethylethanaminová báze (tamoxifen báze) nebo kontrola.

Ve studii 1 dietní dávky 60 mg/kg potravy a 20 mg/kg potravy zhruba odpovídají srovnatelným dávkám 3 a 1 mg/kg tělesné hmotnosti u testovaných zvířat.

Ve studii 2 dietní dávky 20, 6, 2, a 0,6 mg/kg potravy zhruba odpovídají srovnatelným dávkám 1, 0,3, 0,1, a 0,03 mg/kg tělesné hmotnosti u testovaných zvířat.

Krysy byly pozorovány z hlediska toxicity, byla zjišťována jejich hmotnost a jedenkrát týdně byly vyšetřovány pohmatem z důvodu zjištění tvorby nádorů. Zvířata byla usmrcena po 13 týdnech (studie 1) nebo 18 týdnech (studie 2), kdy byly při pitvě potvrzeny i zváženy nádory.

Přípravky

Výraz „farmaceutický použitý v tomto textu jako přídavné jméno znamená v podstatě neškodný pro příjemce (savce). Výrazem farmaceutický přípravek je míněno, že nosič, ředidlo, vehikula a aktivní složka(y) musí být kompatibilní s dalšími složkami přípravku a nesmí škodit jeho příjemci.

F-V je výhodně připravován před podáváním. Výběr přípravku by měl provést ošetřující lékař beroucí v úvahu stejné faktory, které jsou zahrnuty při stanovení účinného množství.

Celkové aktivní složky v takových přípravcích zahrnují od 0,1 % do 99,9 % hmotnosti přípravku. Výhodně v tomto přípravku nejsou obsaženy více než 2 aktivní složky. To znamená, že je výhodné vytvářet F-V s druhou aktivní složkou vybranou ze skupiny zahrnující: estrogen, progestin, inhibitor aromatázy, analog LHRH a inhibitor

99 99 9« ·· • 99 999 99

9999 9 9999 9 9

AChE. Nejvýhodnějšími přípravky jsou ty, kde F-V je jedinou aktivní složkou.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu jsou připraveny pracovními postupy známými v oboru za použití dobře známých a snadno dostupných složek. Například F-V, buď .samotný nebo v kombinaci s estrogenem, progestinem, inhibitorem aromatázy, analogem LHRH nebo inhibitorem AChE je připravován s běžnými vehikuly, ředidly nebo nosiči a je zpracován do tablet, kapslí, suspenzí, roztoků, injektovatelných forem, aerosolů, prášků a podobně.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu pro parenterální podávání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, a rovněž i sterilní prášky, které jsou rekonstituovány bezprostředně před použitím v sterilních roztocích nebo suspenzích. Mezi příklady vhodných sterilních vodných a nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehikul patří voda, fyziologický roztok, ethanol, polyoly (jako je glycerol, propylenglykol, póly(ethylenglykol) a podobně), a jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je ethyloleat. Vhodná tekutost je udržována například použitím povlakových materiálů, jako je licithin, udržováním vhodné velikosti částic v případě disperzí a suspenzí a použitím povrchově aktivních látek.

Parenterální prostředky mohou také obsahovat adjuvans, jako jsou stabilizační látky, smáčedla, emulgátory a dispergační prostředky. Zamezení působení mikroorganismů je zajištěno použitím antibaktériálních a antifungélních látek, jako je například paraben, chlorbutanol, fenolsorbová kyselina a podobně. Také může být vhodné použít izotonická činidla, jako jsou cukry, chlorid sodný a podobně. Dlouhotrvající absorpce injektovatelných přípravků

4« 44 44 • 4 4

4444 4 4444

44 444 44

4 4 4 4 4 4

44 44 44 může být způsobena použitím činidel, která prodlužují absorpci, jako je aluminiummonostearat a želatina.

V některých případech z důvodu prodloužení účinku léčiva je žádoucí zpomalit absorpci léčiva po podkožní a nitrosvalové injekci. Toto může být dosaženo použitím kapalné suspenze krystalické látky s nízkou rozpustnosti ve vodě nebo rozpuštěním nebo suspendováním léčiva v olejovitém vehikulu. V tomto případě podkožní nebo nitrosvalová injekční suspenze obsahují formu léčiva s nízkou rozpustností ve vodě, rychlost absorpce léčiva závisí na jeho rychlosti rozpouštění.

Injektovatelné depotní přípravky F-V jsou připravovány vytvářením mikrozapouzdřených matric léčiva v biodegradovatelných polymerech, jako je póly(mléčná kyselina), póly(kyselina glykolová), kopolymery kyseliny mléčné a glykolové, póly(orthoestery) a póly(anhydridy) a dále ty látky, které jsou popsány v oboru. V závislosti na poměru léčiva k polymeru a charakteristických vlastnostech jednotlivých použitých polymerů může být řízena rychlost uvolňování léčiva.

Injektovatelné přípravky jsou sterilizovány například filtrací přes filtry zadržující bakterie nebo předsterilizací složek směsi před jejím smícháním buď v době výroby nebo těsně před podáním (jako v případě injekčního balení se dvěma komorami).

Mezi tuhé dávkovači formy pro orální podávání patří kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule, V takových tuhých dávkovačích formách je F-V smíchán s alespoň jedním farmaceutickým nosičem jako je citrát sodný, pyrofosforečnan vápenatý a/nebo (a) plnivy a nastavovadly, jako jsou škroby, cukry včetně laktózy a glukózy, mannitol a kyselina orthokřemičitá, (b) pojivý, jako je karboxymethyl celulóza a další deriváty celulózy, «· ·· • · · • · · ·· • · · · • · · · ·* ·» *· ·♦ • * · • 9 9 99

9999

9 9

9 9

9 9

9 9 9

99 algináty, želatina, póly(vinylpyrrolidin), sacharóza a arabská guma, (c)zvlhčovadly, jako je glycerol, (d) bobtnadly, jako je agar, uhličitan vápenatý, hydrogenuhličitan sodný, bramborový nebo tapiokový škrob, kyselina alginová, silikáty a uhličitan sodný, (e) zvlhčovadly jako je glycerol, (f) retardačními činidly jako je parafin, (g) absorpčními urychlovači, jako jsou kvartérní amoníové sloučeniny, (h) smáčedly, jako je cetylalkohol a glycerolmonostearat, (i) adsorbenty, jako je kaolín a bentonitový jíl, (j) mazivy, jako je mastek, stearat vápenatý, stearat hořečnatý, tuhé póly(ethylen glykoly), laurylsulfat sodný, a jejich směsi. V případě kapslí, tablet a pilulek může dávkovači forma také obsahovat pufrovací činidla.

Tuhé prostředky podobného typu mohou také obsahovat výplň v měkkých nebo tvrdých želatinových kapslích za použití vehikul, jako je laktóza, a rovněž i vysokomolekulární póly(ethylenglykoly) a podobně.

Tuhé dávkovači formy, jako jsou tablety, dražé, kapsle, pilulky a granule mohou také být připraveny s povlaky nebo obaly, jako jsou enterosolventni povlaky nebo jiné povlaky dobře známé ve farmaceutickém průmyslu.

Povlaky mohou obsahovat kalidla nebo činidla, která uvolňují aktivní složku/složky v určité části zažívacího traktu, jako například kyselinami rozpustné povlaky uvolňují aktivní složku (nebo složky) v žaludku nebo bazicky rozpustné povlaky uvolňují aktivní složku(y) ve střevním traktu.

Aktivní složka (nebo složky) může také být mikroopouzdřena v trvale-uvolňujícím povlaku s mikrokapslemi, které jsou součástí pilulky kapslového přípravku.

· *4 4

I4 «f 44 44 • 4 · 4 4 4 • 4444 4 4444 4 4 4

44 444 4 4 444 4 4 • 44 4 4 44 4 4 44 4

4· 44 44 4· *·

Mezi kapalné dávkovači formy F-V pro orální podávání patří roztoky, emulze, suspenze, sirupy a elixíry. Kromě aktivních složek mohou kapalné přípravky obsahovat inertní ředidla běžně používaná v oboru, jako je voda nebo jiná farmaceutická rozpouštědla, solubilizátory a emulgátory jako je ethanol, 2-propanol, ethylkarbonát, ethylacetat, benzylalkohol, benzylbezoat, propylenglykol, 1,3butylenglykol, dimethylformamid, oleje (zejména bavlníkový, podzemnicový, kukuřičný, kličkový, olovový, ricinový a sezamový), glycerol, tetrahydrofurfurylalkohol, póly(ethylenglykoly), estery mastných kyselin se sorbitolem a jejich směsi.

Kromě inertních ředidel mohou kapalné orální přípravky také obsahovat adjuvans, jako jsou zvlhčovadla, emulgátory, stabilizátory suspenzí, sladidla, aromatizační prostředky a parfémovací činidla.

Kapalné suspenze kromě aktivní složky/složek mohou také obsahovat stabilizátory suspenzí, jako jsou ethoxylované isostearylalkoholy, polyoxyethylensorbitol a sorbitanové estery, mikrokrystalická celulóza, aluminiummetahydroxid, bentonitový jíl, agar, tragant a jejich směsi.

Prostředky pro rektální nebo itravaginální podávání se připravují smícháním F-V s vhodnými nedráždivými vehikuly, jako je kakaové mléko, polyethylenglykol nebo jakýkoliv čípkový vosk, který je tuhý při pokojové teplotě, ale kapalný při teplotě těla a proto se rozpouští v konečníku a pochvě za uvolnění aktivní složky/složek. Sloučeniny jsou rozpuštěny v roztaveném vosku, vytvarovány do požadovaného stavu a ponechány, aby ztuhly do konečného čípkového přípravku.

F-V může také být podáván ve formě lipozomů. Jak je známo v oboru, lípozomy jsou obecně odvozeny od fosfolipidů •9 ···♦ ♦ -» *· ♦· ·* • · · 9 19 9 1 1

1199 19 11· 9 11

9 9 111 19 9 11 · · • · · 1 1 11 · 1 9 1 ·

11 91 19 19 99 nebo jiných tukových látek. Lipozomové přípravky jsou tvořeny mono- nebo multilamelárními hydratovanými kapalnými krystaly, které jsou dispergovány ve vodném prostředí. Pro tvorbu lipozomů může být použit jakýkoliv farmaceutický metabolizovatelný lipid. Lipozomální prostředky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat kromě F-V stabilizátory, vehikula, konzervační látky a podobně. Výhodnými lipidy jsou fosfolipidy a fosfatidylcholiny (lecitiny) jak přírodní, tak i syntetické.

Způsoby přípravy lipozomů jsou dobře známy v oboru, jak je popsáno například v publikaci Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academie Press, New York, N.Y. (1976), str. 33 a násl.

Následující příklady přípravy jsou pouze vysvětlující a nemají omezovat rozsah tohoto vynálezu.

Přípravek 1:

Tablety obsahující přibližně 10 a 50 mg(s) F-V mohou být připraveny následovně:

Složka	Množství (mg/tableta)	Množství (mg/tableta)
F-V	11,3	56,5
Bezvodá laktóza	176,8	128,2
Sprejově sušená laktóza-speciál	44,2	32,0
Povidin	11,0	13,0
Polysorbat 80	2,5	2, 6
Krospovidin (uvnitř)	6,25	6,24
Krospovidin (vně)	6,25	6, 5
Stearat hořečnatý	1,5	1, 7
Mikrokrystalická celulóza (vně)	0,0	13, 0

4444 ♦ · ·· 44 49

4 4 9 4 4 4 4 · * ···· · » 4 · · » · · • · · « 4 · · · 4 9 4 4 · ···· · · » · · · · ·

4« ·· «« ♦· ·· ··

Složky byly smíchány a lisovány za vzniku tablet.

Alternativně se připravují tablety, každá obsahující 2,5 až 1000 mg F-V, následovně:

Přípravek 2: Tablety

Složka .	Množství (mg/tableta)
F-V	25-1000
Škrob	45
Celulóza, mikrokrystalická	35
Polyvinylpyrrolidon (jako 10% roztok ve vodě)	4
Natriumkarboxymethylcelulóza	4,5
Stearat hořečnatý	0,5
Mastek	1

F-V, škrob a celulóza byly přesáty přes síto (U.S.) s velikostí ok č. 45 a důkladně promíchány. Roztok polyvinylpyrrolidonu se smíchá s výslednými prášky, které byly přesáty přes síto (U.S.) s velikostí ok č. 14. Takto vytvořené granule byly sušeny při teplotě 50 až 60 °C a byly přesáty přes síto (U.S.) s velikostí ok 18. Natriumkarboxymethylškrob, stearat hořečnatý a mastek byly přesáty přes síto(U.S.) s velikostí ok 60 a potom byly přidány ke granulím, z nichž po smíchání a lisování na tabletovacím stroji vznikají tablety.

Suspenze, každá obsahující 0,1 až 1000 mg léčiva v 5 ml dávce, se připravují následovně:

•« • ··· • · a · ·· ··

9999 ♦· *· « 9 9 9 9 9 • 9 999 9 9 9

99 999 * ·

99 9 9 99 9 • 9 99 9f> 99

Přípravek 3; Suspenze

Složka	Množství (mg/5 ml)
F-V	0,1-1000 mg
Natriumkarboxymethylcelulóza	50mg
Sirup	1,25 mg
Roztok kyseliny benzoové	0,10 ml
Příchuť	q. v.
Barvivo	q.v.
Přečištěná voda	5 ml

Léčivo bylo přesáto přes síto (U.S.) s velikostí ok č. 45 a smícháno s natriumkarboxymethylcelulózou a sirupem za vzniku jemné pasty. Roztok kyseliny benzoové, příchuť a barvivo byly zředěny trochou vody a za míchání byly přidány k sirupu. Potom byla přidána voda na požadovaný objem.

Přípravek 4: Intravenózní roztok

Složka	Množství
F-V	25 mg
Fyziologický roztok	1000 ml

Roztok z výše uvedených složek se intravenózně podává pacientu rychlosti asi 1 ml/min.

Přípravek 5: Tablety obsahující cystein hydrochlorid .

Jádra tablet vážící přibližně 250 mg a obsahující přibližně 10 mg nebo 20 mg F-V byly připraveny obecně následovně. F-V, ředidla rozpustná ve vodě (laktóza • · · · ·« ·>

·· ··· · • ···· · ···· · · · monohydrát a bezvodá laktóza) a část bobtnadla (krospovidon) byly smíchány v vysokostřihovém granulátoru. Tato směs byla potom zvlhčována v granulátoru vodným roztokem povidonu a polysorbatu 80. Cystein hydrochlorid byl také rozpuštěn v granulačním roztoku a byl přidán během zvlhčování prostřednictvím granulačního roztoku. K udržení konstantní hmotností výplně tablety bylo sníženo množství laktózy (laktóza monohydrát a bezvodá laktóza) odpovídajícím způsobem k přidanému množství cystein hydrochloridu. Po úpravě velikosti za vlhka v rotačním lopatkovém mlýnu, byly granule sušeny za použití sušárny s fluidní vrstvou. Sušené granule jsou upraveny na vhodnou velikost v rotačním lopatkovém mlýnu. Zbývající složky (mikrokrystalická celulóza, stearat hořečnatý a zbytek krospovidídonu byly přidány k sušeným granulím a směs byla zamíchána. Tato směs byla následně lisována do tablet oválného tvaru za použití běžného rotačního tabletovacího lisu. Složení tablet pro každou z těchto šarží jsou uvedeny v tabulce č. 2, která obsahuje množství (mg/tabletu) a typ použitého vehikula v každém případě. Jak je vidět z tabulky, na jádra tablet u šarží C a D byl aplikován filmový povlak, který byl aplikován prostřednictvím vodné disperze v potahovací pánvi s bočním vývodem napojeným na ventilátor.

• ·

- li • ·

Tabulka 2:

Složení tablet (mg/tabletu)

Složka	Šarže A	Šarže B	Šarže C	Šarže D
F-V	11,31	11,31	22,73	22,73
(vztaženo na základ)	(10)	(10)	(20)	(20)
L-Cystein HCl monohydrát	0,10	0,50	0,50	0,75
Povidon	12,50	12,50	12,50	12,50
Polysorbat 80	1,25	1,25	1,25	1,25
Bezvodá laktóza	148,67	148,35	139,22	139,22
Laktóza monohydrát	37,17	37,09	34,80	34,75
Krospovidon	12,50	12,50	12,50	12,50
Mikrokrystalická celulóza	25,00	25,00	25,00	25,00
Stearat hořečnatý	1,50	1,50	1,50	1,50
Barviva - žlutá	——	——	10,00	10, 00

Přípravek 6: Tablety obsahující methionin

Jádra tablet vážící přibližně 250 mg a obsahující přibližně 1 mg F-V byla připravena v podstatě následovně. F-V, ředidla rozpustná ve vodě (laktóza monohydrát a bezvodá laktóza) a část bobtnadla (krospovidon) byly míchány v vysokostřihovém granulátoru. Tato směs byla potom zvlhčována v granulátoru vodným roztokem povidonu a polysorbatu 80. Methionin byl také rozpuštěn v granulačním roztoku a byl přidán během zvlhčování prostřednictvím granulačního roztoku. K udržení konstantní hmotnosti výplně tablety bylo sníženo množství laktózy (laktóza monohydrát a bezvodé laktóza) odpovídajícím způsobem k přidanému množství stabilizátoru. Po kroku úpravy velikosti za vlhka v rotačním lopatkovém mlýnu byly granule sušeny za použití sušárny s fluidní vrstvou. Sušené granule byly upraveny na vhodnou velikost v rotačním lopatkovém mlýnu. Zbývající složky (mikrokrystalická celulóza, stearat hořečnatý a • · · · · ♦ «·· · · · ·· · • _Λ · · · · · ···· · · ·

- <1-2; * · · ; ; · ; · ; ζ. ;

< · · · ·· ·<· · * ·· zbytek krospovidonu byly přidány k sušeným granulím a směs byla zamíchána. Tato směs byla následně lisována do tablet oválného tvaru za použití běžného rotačního tabletovacího lisu. Složení pro každou z těchto šarží jsou uvedeny v tabulce č. 3, která obsahuje množství (mg/tabletu) a typ použitého vehikula v každém případě.

Tabulka 3:

Složení tablet (mg/tabletu)

Složka	Šarže E	Šarže F	Složka	Šarže E	Šarže F
Šerm III HC1 (vztaženo na základ)	1,12 (1/0)	1,12 (1/0)	Laktóza monohydrát	38,88	38,78
Methionin	0,50	... i. qo	Krošpóvidon /	12,50	12,50
Povidon	12,50	12,50	Mikrokrystalická celulóza	25,00	25,00
Polysorbat 80	2,50	2,50	Stearat hořečnatý	1,50	1,50
Bezvodá laktóza	155,5	155,1

Dávkování

Specifická dávka F-V podávaná podle tohoto vynálezu je určena určitými okolnostmi v závislosti na situaci. Mezi tyto okolnosti patří způsob podávání, dřívější anamnéza příjemce, patologický stav nebo symptom, který je léčen, závažnost daného stavu/léčeného příznaku a věk a pohlaví příjemce.

Obecně účinná minimální denní dávka F-V je asi 1, 5, 10, 15 nebo 20 mg. Obvyklá účinná maximální dávka je asi 800, 100, 60, 50 nebo 40 mg. Nejčastěji se tato dávka pohybuje v rozmezí od 15 mg do 60 mg. Přesná dávka může být určena v souladu se standardní praxí určování dávek • · · · · · ·» ·· • · * »·· ·· · « ···· · · · · · · · ·

- 43 η : ·: :: : *: :. :

» · 9 · ·· · · · · · · v lékařství u pacienta, tj. zpočátku podávání nízké dávky této sloučeniny a postupné zvyšování dávky, dokud není pozorováno požadovaného terapeutického účinku.

Ačkoliv může být nezbytné uzpůsobit dávku u pacienta se zřetelem na kombinaci terapií diskutovaných výše, typické dávky aktivních složek jiných než F-V jsou následující: ethynylestrogen (0,01 až 0,03 mg/den), mestranol (0,05 až 0,15 mg/den), konjugované estrogenní hormony (například Premarin®, Wyeth-Ayerst; 0,3 až 2,5 mg/den), medroxyprogesteron (2,5 až 10 mg/den), norethylnodrel (1,0 až 10,0 mg/den), nonethindron (0,5 až 2,0 mg/den), aminoglutemid (250 až 1250 mg/den, výhodně 250 mg 4 krát denně), anastrazol (1 až 5 mg/den, výhodně 1 mg, krát denně), letrozol (2,5 až 10 mg/den, výhodně 2,5 mg 1 krát denně), formestan (250 až 1250 mg/týden, výhodně 250 mg 2 krát týdně), exemestan (25 až 100 mg/den, výhodně 25 mg 1 krát denně), goserlin (3 až 15 mg/3 měsíce, výhodně 3,6 až 7,2 mg 1 krát za 3 měsíce) a leuprolid (3 až 15 mg/měsíc, výhodně 3,75 až 7,5 mg 1 krát za měsíc).

Způsob podávání

F-V může být podávána mnoha způsoby včetně orálního, rektálního, transdermálního, subkutanního, intravenózního, intramuskulárního a intranazálního. Způsob podávání každého činidla na bázi estrogenu nebo progestinu odpovídá tomu, co je známo v oboru. F-V samotná nebo v kombinaci s estrogenem, progestinem nebo inhibitorem AChE bude podávána ve vhodném přípravku.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu mohou být podávány lidem nebo jiným savcům (jako jsou například psi, kočky, koně, prasata a podobně) orálně, rektálně, intravaginálně, parenterálně, místně, bukálně, sublingválně nebo nazálně. Výraz „parenterální podávání označuje v

-:41:I ·· • 4 • · · · tomto textu způsoby podávání, jako je intravenózní, intramuskulární, intraperitoneální, intrasternální, subkutánní podávání nebo intraartikulární injekce nebo infúze.

Způsob/délka podávání

Pro většinu způsobů podle tohoto vynálezu je F-V podávána kontinuálně jedenkrát až 3 krát denně nebo jak často je potřeba podávat účinné množství F-V pacientovi. Cyklická terapie může být obzvláště užitečná při léčbě endometriózy nebo může být použita akutně během bolestivých záchvatů tohoto onemocnění. V případě restenózy může být terapie omezena na krátké intervaly v trvání od 1 do 6 měsíců následně po lékařských procedurách jako je angioplastika.

Claims (35)

1. PATENTOVÉ N Á R OKY

   1. Krystalický 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1yl)ethoxy]fenoxy)-2-(4-methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochlorid (F-V) mající rentgenový difraktogram, který obsahuje alespoň jeden z následujících píků: 7,3 ± 0,2,

   15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2 a 17,6 ± 0,2° při 20 za použití měděného radiačního zdroje.
2. 2. Krystalický F-V podle nároku 1, kde uvedený rengenový difraktogram dále obsahuje alespoň jeden z následujících píků: 17,9 ± 0,2, 18,2 ± 0,2, 18,9 ± 0,2 a 21,5 + 0,2 při 20 za použití měděného radiačního zdroje.
3. 3. Farmaceutický přípravek obsahující krystalickou sloučeninu podle nároku 1; jeden nebo více farmaceutických nosičů, ředidel nebo vehikul; a případně stabilizátor vybraný z methíoninu, acetylcysteinu, cysteinu nebo cystein hydrochloridu; a případně estrogen, případně progestin, případně inhibitor aromatázy, případně analog LHRH a případně inhibitor acetylcholinesterázy (AChE).
4. 4. Přípravek podle nároku 3, který obsahuje krystalickou sloučeninu podle nároku 1; jeden nebo více farmaceutických nosičů, ředidel nebo vehikul; a estrogen.
5. 5. Přípravek podle nároku 4, kde estrogenem je Premarin®.
6. 6. Přípravek podle nároku 3, který obsahuje krystalickou sloučeninu podle nároku 1; jeden nebo více farmaceutických nosičů, ředidel nebo vehikul; a progestin.

   • · · · • · ··· · · ··· · · ·

   -:43:-: ·: :: : ·: :. :

   ·· ·· ·· ·· ·· ··
7. 7. Přípravek podle nároku 6, kde progestin je vybrán ze skupiny sestávající z norethylnodrelu a norethindronu.
8. 8. Přípravek podle nároku 3, který obsahuje krystalickou sloučeninu podle nároku 1; jeden nebo více farmaceutických nosičů, ředidel nebo vehikul; a inhibitor AChE.
9. 9. Přípravek podle nároku 8, kde inhibitor AChE je vybrán ze skupiny sestávající z fyzostigminsalicilatu, takrin hydrochloridu a donepezil hydrochloridu.
10. 10. Přípravek podle nároku 3, který obsahuje krystalickou sloučeninu podle nároku 1; jeden nebo více farmaceutických nosičů, ředidel nebo vehikul; estrogen a progestin.
11. 11. Způsob inhibice patologického stavu vybraného ze skupiny sestávající z: fibrózy dělohy, endometriózy, proliferace aortálních buněk hladkého svalstva, restenózy, rakoviny prsu, rakoviny dělohy, rakoviny prostaty, benigní prostatické hyperplazie, úbytku kosti, osteoporózy, kardiovaskulárního onemocnění, hyperlipidémie, poruch CNS a Alzheirrterovy choroby, který zahrnuje podávání účinného množství sloučeniny podle nároku savci, který to potřebuje.
12. 12. Způsob podle nároku 11, kde patologickým stavem je rakovina prsu.
13. 13. Způsob podle nároku 12, kde způsob inhibice je profylaktický.
14. 14. Způsob podle nároku 11, kde patologickým stavem je rakovina vaječníku.

    • · · · %v. :
15. 15. Způsob podle nároku 11, kde patologickým stavem je rakovina děložní sliznice.
16. 16. Způsob podle nároku 11, kde patologickým stavem je osteoporóza.
17. 17. Způsob zvyšování enzymatické aktivity cholinacetyltransferázy (ChAT) u savců, který zahrnuje podávání účinného' množství sloučeniny podle nároku 1 a případně inhibitoru acetylcholinesterázy (AChE) savci, který to potřebuje.
18. 18. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1, který zahrnuje krystalizaci 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1yl)ethoxy]fenoxy)-2-(4-methoxyfenyl)benzo[b]thíofen hydrochlorídu z krystalizačního rozpouštědla vybraného ze skupiny sestávající z: methanolu nebo vodného methanolu, ethanolu nebo isopropanolu; a následné sušení výsledné tuhé látky do konstantní hmotnosti.
19. 19. Způsob podle nároku 18, kde uvedeným rozpouštědlem je vodný methanol.
20. 20. Způsob podle nároku 19, kde poměr vody k methanolu (obj. : obj.) je mezi 20 % a 5 %.
21. 21. Způsob podle nároku 20, kde uvedený poměr je 15 %.
22. 22. Sloučenina podle nároku 1 pro inhibici patologického stavu vybraného ze skupiny sestávající z: fibrózy dělohy, endometriózy, proliferace aortálních buněk hladkého svalstva, restenózy, rakoviny prsu, rakoviny dělohy, rakoviny prostaty, benigní prostatické hyperplazie, úbytku • 9

    9·· 999 99 9

    9 9999 9 999* 9 9 9

    - :48::- : ·: :: : ·: :. :

    99 99 99 99 99 99 kosti, osteoporózy, kardiovaskulárního onemocnění, hyperlipidémie, poruch CNS a Alzheimerovy choroby.
23. 23. Sloučenina podle nároku 22 pro inhibici rakoviny prsu.
24. 24. Sloučenina podle nároku 23, kde způsob inhíbice je profylaktický.
25. 25. Sloučenina podle nároku 24 pro inhibici rakoviny vaječníku.
26. 26. Sloučenina podle nároku 22 pro inhibici rakoviny děložní sliznice.
27. 27. Sloučenina podle nároku 22 pro inhibici osteoporózy.
28. 28. Sloučenina podle nároku 1 pro zvyšování enzymatické aktivity cholinacetyltransferázy (ChAT) u savců.
29. 29. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro inhibici patologického stavu vybraného ze skupiny sestávající z: fibrózy dělohy, endometriózy, proliferace aortálních buněk hladkého svalstva, restenózy, rakoviny prsu, rakoviny dělohy, rakoviny prostaty, benigní prostatické hyperplazie, úbytku kosti, osteoporózy, kardiovaskulárního onemocnění, hyperlipidémie, poruch CNS a Alzheimerovy choroby.
30. 30. Použití podle nároku 29, kde uvedené léčivo je pro inhibici rakoviny prsu.
31. 31. Použití podle nároku 30, kde způsob inhibice je profylaktický.

    • ·

    99 ··· ·
32. 32. Použití podle nároku 29, kde uvedené léčivo je pro inhibici rakoviny vaječníku.
33. 33. Použití podle nároku 29, kde uvedené Léčivo je pro inhibici rakoviny děložní sliznice.
34. 34. Použití podle nároku 29, kde uvedené léčivo je pro inhibici osteoporózy.
35. 35. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro zvyšování enzymatické aktivity cholinacetyltransferázy (ChAT) u savců.