CZ20032060A3

CZ20032060A3 - Farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ20032060A3
Application number: CZ20032060A
Authority: CZ
Inventors: Nobuya Matsuoka; Takayuki Yamaji; Bruce Gold
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-12-31
Publication date: 2004-01-14
Also published as: RU2003123493A; HUP0302521A3; AU2002231277B2; NO20032913D0; PL366301A1; AR035411A1; EP1353671A4; CN1538843A; BR0116762A; MXPA03005941A; KR100794204B1; CN1293877C; KR20070030331A; RU2288716C2; IL156664A0; CA2433384A1; EP1353671A1; KR20040007431A; JP2004527472A; ZA200305806B

Description

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká použití neurotrofního analogu tacrolimus pro výrobu farmaceutického prostředku s neurotrofním účinkem.

Dosavadní stav techniky

Některé makrolidové sloučeniny, například tacrolimus a příbuzné látky mohou zabránit mozkové ischémii nebo tuto ischémii léčit, takové látky byly popsány například v dokumentu WO 94/14443. Je známo, že některé deriváty kyseliny pipekolinové, které mají afinitu pro imunofiliny typu FKBP, například takrolimus, stimulují růst poškozených periferních nervů nebo podporuji regeneraci neuronů podle WO 96/40140. Také některé neimunosupresivní sloučeniny, jako geldanamycin a jeho analogy, rozrušuji komplex steroidních receptorů a podporuji růst nervů podle WO 99/21552.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že určitý analog tacrolimus, sloučenina vzorce I, má výborný neurotrofní účinek, avšak na rozdíl od tacrolimus má malý nebo nemá žádný imunosupresivní účinek. Jak bude dále prokázáno, má sloučenina vzorce I dobrou neurotrofní účinnost ve srovnání s tacrolimus, například měřeno schopností prodloužit délku neuritu. Podobně bylo prokázáno, že podáváním sloučeniny vzorce I je možno vyvolat regeneraci axonu a rychlou regeneraci po poranění nervu nebo míchy. Mimoto má • · · · sloučenina vzorce I tyto výhodné účinky při jen malé nebo vůbec žádné imunosupresivní účinnosti ve srovnání s tacrolimus.

Podstatu vynálezu tedy tvoří použití sloučeniny vzorce I jako velmi dobré neurotrofní látky, která nemá v podstatě žádnou imunosupresivní účinnost, řešení se zejména týká použití sloučeniny vzorce I pro výrobu farmaceutického prostředku s neurotrofním účinkem.

Neočekávaně bylo zjištěno, že sloučeninu vzorce I je možno použít pro prevenci nebo léčení neurologických dysfunkcí nebo poranění, které bylo způsobeno přímým poškozením nebo chorobou nervového systému, nebo je možno dosáhnout alespoň zlepšení takových stavů, přičemž nedochází k žádnému nebo dochází jen k malému ímunosupresivnímu účinku.

Sloučenina vzorce I je tedy vhodná pro léčení poškození nebo dysfunkce, přičemž tyto stavy mohou být vyvolány fyzickým poraněním, poruchami výživy, ischemií, degenerativními chorobami, zhoubnými chorobami, infekčními chorobami nebo působením drog, toxinů nebo jedů.

Sloučeninou vzorce I je například možno zlepšit poškození nebo dysfunkci, které byly vyvolány chirurgickými zákroky na nervové soustavě, poraněním periferních nervů, popáleninami, encephalomyelitidou, HIV, herpetickým virem, zhoubnými nádory, ozářením, interakcí různých účinných látek, nedostatkem kyseliny listové nebo vitaminu B12 nebo také působením neurotoxinů nebo chemických látek, například působením olova.

Sloučeninu vzorce I je tedy možno použít pro výrobu farmaceutických prostředků, určených pro prevenci nebo léčení poškození nervů a jejich dysfunkce, jako jsou polymyositis (mnohočetná myositis) , syndrom Guillan-Barré, Menierův syndrom, polyneuritis (mnohočetná neuritis), mononeuritis (zánět jednoho nervu), Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza ALS, Huntingtonova nemoc, radikulopathie, neuropathie, například diabetická neuropathie nebo neuropathie, vyvolaná chemotherapií a podobně, poranění míchy, senilní demence, vaskulární demence, roztroušená skleróza a podobně.

Sloučenina vzorce I má následující strukturu:

Uvedenou látku je možno připravit podle příkladu 29 dokumentu US 5376663. Je zřejmé, že tato látka může mít jeden nebo větší počet stereoisomerů, a to optických i geometrických isomerů vzhledem k asymetrickým atomům uhlíku a dvojným vazbám, přičemž všechny tyto formy je možno využít v souladu s podstatou vynálezu.

Sloučenina vzorce I může tvcřit farmaceuticky přijatelné soli, deriváty, solváty nebo prekursory, všechny tyto látky jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu. Ze solvátů jsou obvykle nej výhodnější hydráty a ethanoláty.

Výhodnou formu sloučeniny vzorce I je možno vyjádřit strukturou

Sloučeninu vzorce I je možno podávat jako čistou látku nebo ve směsi s dalšími sloučeninami nebo jinými složkami, s výhodou s farmaceutickým nosným prostředím nebo nosičem.

V případě, že se sloučenina vzorce I užívá ve formě farmaceutického prostředku, je možno ji mísit s organickým nebo anorganickým nosičem, nosným prostředím nebo pomocnými látkami, vhodnými pro místní pcdání, .perorální, enterální, podkožní, nitrožilní, nitrosvalcvé nebo parenterální podání. Může přitom jít o pevný, polotuhý nebo kapalný prostředek, který jako účinnou složku obsahuje sloučeninu vzorce I a mimoto jeden nebo větší počet nosičů, nosných ·· · · · ······ · · ··· · · · · · · · • · · · · ·· · · ·· ·· prostředí nebo pomocných látek. Typickými pomocnými látkami jsou běžné farmaceutické nosiče, další účinné látky, pufry, dispergační prostředky, emulgační činidla a další pomocné látky.

Sloučeninu vzorce I je tedy možno zpracovat spolu s netoxickými obvyklými farmaceuticky přijatelnými nosiči na tablety, pelety, kapsle, oční kapky, čípky, roztoky, například roztok ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, emulze, suspenze, například v olivovém oleji, mazání, aerosoly, krémy, náplasti a další lékové formy.

Z vhodných nosičů je možno uvést vodu, vodný roztok chloridu sodného, roztok dextrózy, oleje včetně živočišných, rostlinných a syntetických olejů a některé naftové produkty. Dalšími vhodnými nosiči mohou být například glukóza, laktóza, akaciová guma, želatina, mannitol, škrobová pasta, křemičitan horečnatý, mastek, kukuřičný škrob, keratin, koloidní oxid křemičitý, bramborový škrob, močovina a další nosiče, vhodné pro přípravu pevných, polotuhých nebo kapalných prostředků.

Dále je možno použít stabilizační prostředky, emulgátory, zahušúovadla, barviva, látky pro úpravu chuti a parfémy.

Sloučenina vzorce I se použije ve farmaceutickém prostředku v množství, účinném pro vyvolání požadovaného účinku na chorobný proces nebo stav. S výhodou se tato látka užije v množství, dostatečném pro dosažení neurotrofního účinku nebo pro stimulaci růstu nervových buněk.

Ze savců, kterým je možno podávat farmaceutický prostředek s obsahem sloučeniny vzorce I, lze uvést domácí

• ·· • · · ·	• · · · • · · ·	• · · · · · • · ·
• · · · • · · · ·	• · · · · • · · ·	• · · · • · · ·

zvířata, jako jsou krávy, koně, vepři, psi, kočky, krysy, myši, králíci, křečci a podobně, dále může jít o primáty a také člověka.

Výhodným způsobem podání prostředku s obsahem sloučeniny vzorce I je injekční nebo perorální podání.

Účinná dávka sloučeniny vzorce I se může u jednotlivých nemocných měnit a závisí na věku a celkovém stavu nemocného. Denní dávka se obvykle bude pohybovat v rozmezí 0,0001 až 1000 mg, s výhodou 0,001 až 500 mg a zvláště 0,01 až 100 mg, průměrná jednotlivá dávka se bude pohybovat v rozmezí 0,001 až 0,1 mg, 0,2 až 0,5 mg, obvykle se podává 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg nebo 500 mg. Denní dávka při chronickém podávání u člověka bude v rozmezí 0,1 až 30 mg/kg/den. Sloučeninu vzorce I je také možno podávat současně nebo následně s jinými látkami s neurotrofním účinkem nebo stimulačním účinkem na růst nervových buněk.

Farmaceutický prostředek podle.vynálezu je možno podávat savcům, například člověku k vyvolání regenerace neuronů a funkční regenerace nervů a ke stimulaci růstu neuritů při léčení různých neuropathologických stavů včetně poškození periferních nervů a centrálního nervového systému, které bylo vyvoláno poraněním, například poraněním míchy, poškozením ischiatického nebo faciálního nervu, transplantací končetiny po amputaci a podobně, dále může jít o podávání v případě různých nervových chorob, jako je diabetická neuropatie, stavů po léčení zhoubných nádorů, může jít například o neuropatii, vyvolanou akrylamidem, taxolem, alkaloidy vinca a doxorubicinem, dále může jít například o poruchy artikulace, zakalené vědomí, poruchy • · · 4 • · 4 4 · 4 • · · · ·

4 4 4 4 4 4 4

444 444444 4 4 *4 44 4 4*44

44 44 44 44 hybnosti, například spojené s mozkovým infarktem, mozkovým krvácením a podobně a další neurologické poruchy, včetně různých periferních neuropathických a neurologických poruch, jako jsou neuralgie trojklanného nervu, glossopharyngeální neuralgie, Bellova choroba, mysthenia gravis, svalová dystrofie, amyotrofická laterální skleróza, progresivní svalová atrofie, progresivní vrozená atrofie očních svalů, protržená nebo vyhřezlá meziobratlová ploténka, spondylóza krční páteře, choroby nervových pletení, neuropatie, zejména periferních nervů, vyvolané například působením olova, akrylamidů, gamma-diketonů, sirníkem uhelnatým, porfyrie, syndrom Gullain-Barré, Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc a Huntingtonova chorea.

Přerušení periferního nervu nebo poranění míchy je možno léčit podáváním stimulačního množství sloučeniny vzorce I a použitím štěpu periferního nervu, například allogenního štěpu podle publikace Osawa a další, J. Neurocytol. 19, 833-849, 1990, Buttemeyer a další, Ann. Plastic Surgery 35, 396-401, 1995, nebo je možno použít artificiální nervový štěp podle publikací Madison a Archibald, Exp. Neurol. 128, 266-275, 1994. Wells a další, Exp. Neurol. 146, 395-402, 1997. Prostor mezi přerušenými konci periferního nervu nebo míchy se s výhodou vyplní speciálním materiálem bez obsahu buněk, například kolegenem, methylcelulózou a podobně, nebo suspenzí buněk, která podporuje růst nervových buněk, může jít například o Schwannovy buňky podle publikace Xu a další, J. Neurocytol. 26, 1-16, 1997, čichové buňky a krycí buňky podle publikace Li a další, Science 277, 2000-2002, 1997. Sloučenina, podporující růst nervů, může být podávána společně s takovým buněčným nebo nebuněčným výplňkovým materiálem nebo • · * 44 44 44 4444

4 4 4444 44 4 • 44 «444 44 4

444 444444 4 4

4 4 44 4 4444

44444 44 44 49 44 je možno ji podávat systemicky před uložením štěpu, v průběhu jeho uložení nebo po něm.

Sloučenina vzorce I může být použita zejména pro léčení nebo prevenci nervové dysfunkce, jako je polymyositis (mnohočetná myositis) , syndrom Guillan-Barré, Menierův syndrom, polyneurítis (mnohočetná neuritis), mononeuritis (zánět jednoho nervu), Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza ALS, Huntingtonova nemoc, radikulopathie, neuropathie, například diabetická neuropathie nebo neuropathie, vyvolaná chemotherapií a podobně, poraněni míchy, senilní demence, vaskulární demence, roztroušená skleróza a podobně.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Sloučenina vzorce I statisticky významně prodlužuje neurity hippokampálních neuronů

Příprava buněčných kultur

Embryonální hippokampální neurony byly získány z krysích plodů v embryonálním dnu 18,5 (E18,5) podle publikace Bankéř a Cowan, Brain Research, 1977, 126, 397-425. Hippokampální oblasti byly odstraněny, rozdrceny a inkubovány ve 100 I.U. papainu při 37 °C celkem 45 minut, pak byly buňky znovu uvedeny do suspenze v úplném prostředí pro neurony, kterým je minimální základní prostředí bez • · · · · · ·« φ · φ φ φ • · · φ φ φ «Φφφ ·Φ· ·♦ φφ φφ φφ ·Φ

L-glutaminu (GIBCO, Grand Island, NY) s obsahem

1,5 ml/100 ml minimálního základního prostředí s vysokým obsahem glukózy, (GIBCO), 0,1 ml/100 ml séra (Hito + Tm, Collaborative Research lne., Lexington, ΜΑ) , glutaminu (GIBCO) a 5 % fetálního telecího séra (GIBCO).

Buňky byly naočkovány na krycí sklíčka v množství 500 buněk na jedno víčko, opatřené povlakem poly-L-lysinu.

Sklíčka pak byla nasazena na misky, předem opatřené povlakem astrocytů mozkové kůry v jedné vrstvě.

Analýza délky axonů hippokampálních neuronů

Hippokampální neurony, identifikované jejich charakteristickou polaritou a dendrity byly denně sledovány a náhodně fotografovány v průběhu 72 hodin (9 až 12 fotografií na víčko). Axon, který je definován jako nej delší výběžek, byl měřen na fotografiích při použití zařízení Houston HI-PAD, napojeném na počítač IBM XT s příslušným softwarem Bioquant IV, R & M Biometrics,

Nashville, TN, měřeny byly pouze výběžky, které byly alespoň 3krát delší než buněčné tělo. Údaje ze stejně ošetřených sklíček (3 nebo 4 na skupinu) se od sebe nelišily a z tohoto důvodu byly údaje spojeny. Průměrné hodnoty byly vypočítány a srovnávány (srovnávány byly skupiny, léčené sloučeninou Ia nebo tacrolimus, mimoto byly zařazeny kontrolní skupiny) , použit byl program ANOVA, následovaný mnočetným srovnáváním podle Newman-Kuelse (WINKS 4,62, profesionální vydání).

Výsledky •Φ « 4

4» 4 * » · Ο ···« • · ♦ · · · · • · · >

·· ··

44· Φ ·· • · 4 • · · ·

4« ·*

Ρο 72 hodinách nebylo možno pozorovat žádný statisticky významný rozdíl mezi neošetřenou kontrolní skupinou a skupinou, ošetřenou koncentrací 10 nM tacrolimus. Avšak v případě skupiny, ošetřené koncentrací 10 nM sloučeniny vzorce Ia došlo ke statisticky významnému prodloužení neuritů, jak je zřejmé z tabulky 1.

Tabulka 1. Vliv sloučeniny Ia a tacrolimus na střední délku neuritů v primárních kulturách krysích hippokampálních buněk po 72 hodinách.

	Délka neuritu (μιη)
Bez ošetření	372,3 ± 18,23
Tacrolimus 10 nM	423,4 ± 19,50
Sloučenina Ia 10 nM	502,2 + 23,61*

*P<0,5 oproti kontrolám bez ošetření při svrchu popsaném statistickém hodnocení

Příklad 2

Po působení sloučeniny I na průměrnou délku neuritů u buněk lidského neuroblastomu SH-SY5Y

Příprava kultury neuroblastomových buněk SH-SY5Y

Buňky lidského neuroblastomu SH-SY5Y byly udržovány v prostředí DMEM (Gibco), doplněném 10 % fetálního telecího séra (Sigma), 50 I.U./ml penicilinu a 50 μg/ml streptomycinu (Gibco), buňky byly pěstovány při 30 °C v atmosféře se 7 % oxidu uhličitého. Pak byly buňky naočkovány na plotny se 6 vyhloubeními v množství 15 000 buněk/vyhloubení a byly zpracovány působením 0,4 μΜ aphidicolinu (Sigma). Po pěti dnech byly buňky promyty a

byl k nim přidán nervový růstový faktor NGF v dávce 10 ng/ml v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 nM tacrolimus nebo 1 nM sloučeniny Ia. Po 96 hodinách byla prostředí nahrazeno čerstvým prostředím na dalších 72 hodin, celkem byly buňky inkubovány 168 hodin. Ve všech pokusech bylo použito dvojí provedení a byl vypočítán průměr hodnot pro každou skupinu.

Analýza délky neuritů neurobíastomových buněk SH-SY5Y

Při analýze délky výběžků byly buňky po 168 hodinách náhodně fotografovány (20 polí na vyhloubení) . Délka neuritů byla měřena na fotografiích při použití zařízení Houston HI-PAD, napojeným na počítač IBM XT, vybavený příslušným softwarem (Bioquant, IV, R & m Biometrics, Nashville, TN). Měřeny byly pouze ty výběžky, jejichž délka byla více než dvojnásobná ve srovnání s tělem buňky. Údaje od stejně zpracovaných vyhloubení se nelišily a byly proto spojeny. Byly vypočítány průměrné hodnoty, které pak byly srovnávány pro sloučeninu vzorce Ia nebo tacrolimus a pro vzorky, na něž bylo působeno pouze samotným NGF. Použit byl program ANOVA, následovaný srovnávacím testem Newman-Kuels (Winks 4,62, profesionální vydání).

Výsledky

Měření délky neuritů prokázalo, že jak sloučenina vzorce Ia v koncentraci 1 nM, tak tacrolimus v koncentraci 10 nM statisticky významně prodlužovaly délku neuritů po 168 hodinách ve srovnání se samotným NGF v dávce 10 ng/ml. Účinek 1 nM sloučeniny vzorce Ia v kombinaci s NGF však byl vyšší než účinek 10 nM tacrolimus v kombinaci s NGF.

Tabulka 2. Účinek sloučeniny Ia a tacrolimus na průměrnou délku neuritů buněk lidského neuroblastomu SH-SY5Y po 168 hodinách.

	Délka neuritu (μπι)
Bez ošetření	94,75 ± 3,734
NGF 10 ng/ml	198,8 + 8,991
Tacrolimus 10 nM + NGF 10 ng/ml	227,6 ± 9,130*
Sloučenina Ia 1 nM + NGF 10 ng/ml	256,0 ± 9,067*
* P<0,05 ve srovnání s MGF při svrc^	au popsaném statistickém

hodnoceni

Přiklad 3

Sloučenina I vyvolává funkční regeneraci ischiadického nervu u krysy po jeho poranění

Pokusná zvířata a chirurgický zákrok krysích samců kmene Sprague-Dawley ve stáří 6 týdnů bylo anestetizováno 2% halothanem, pravý ischiadický nerv byl obnažen a byl 2krát sevřen na celkovou dobu 60 sekund do kleští Dumont č. 7 v úrovni kyčle. Místo poranění bylo označeno sterilním stehem 9-0, který byl veden epineurálním krytem.

Příprava sloučeniny Ia a podání

Sloučenina Ia byla rozpuštěna v nosném prostředí, které obsahovalo 30 % dimethylsulfoxidu DMSO a 70 % fyziologického roztoku chloridu sodného. Třem krysám s poraněným nervem byla denně podána buď sloučenina Ia v dávce 1 nebo 5 mg/kg nebo ekvivalentní objem nosného prostředí v množství 5 ml/kg.

• · ·· ·· ·· 99 99

Hodnocení chování zvířat

Zvířata byla sledována denně až do 18 dne.

K vyhodnocení regenerace funkce nervu byla použita následující stupnice:

ochrnutí s končetinou vytočenou ven při chůzi, skrčené prsty schopnost napřímit končetinu a pohybovat prsty schopnost chůze na postižené končetině schopnost natáhnout prsty v průběhu chůze došlapování na šlapku včetně paty a téměř normální natahování prstů

Zvířata, jejichž schopnost byla na rozmezí jednotlivého hodnocení byla hodnocena následujícím způsobem: +, 0,25, ++, 0,5, +++, 0,75.

Fixace tkáně a příprava

Po 18 dnech po poranění nervu byly krysy uvedeny do hluboké anestezie 4% halothanem, heparinizovány a promyty 4% paraformaldehydem v 0,1 M pufru s fosforečnanem sodným o pH 7,4 celkem 10 sekund, načež byly krysy promývány 1 litrem 5% glutaraldehydu v 0,1 M pufru s fosforečnanem sodným o pH 7,4 a uloženy na 24 hodin při 4 °C. Tkáň byla odebrána z ischiadického nervu ve vzdálenosti 5 mm od místa poranění. V této studii byly hodnoceny pouze údaje z větve n.tibialis posterior, která zásobuje m.soleus. Tkáň byla uložena do 0,1 M pufru s fosforečnanem sodným o pH 7,4, fixována 2,5 hodiny 1% oxidem osmičelým v 0,1 M fosfátovém pufru, dehydratována v ethanolu a zalita do plastické hmoty. Tenké řezy byly barveny uranylacetátem a citronanem

olovnatým, upevněny na sítě 75 mesh, uložené na folii a sledovány elektronovým mikroskopem JEOL 100 CX.

Morfometrická analýza

Analýza velikosti axonů byla provedena na n.soleus.

Při použití elektronového mikroskopu byl určen počet regenerujících myelinizovaných axonů. Průměrné hodnoty a stantardní odchylka byly vypočítány pro skupinu, jíž bylo podáno pouze nosné prostředí, pro skupinu, jíž byla podána sloučenina Ia v dávce 1 mg/kg a pro skupinu s toutéž látkou v dávce 5 mg/kg.

Statistická analýza

Pro analýzu chování byly srovnávány průměrné hodnoty pro regeneraci funkce při použití programu ANOVA, následovaného mnohočetným srovnáním testem podle Newman-Keulse. V případě morfometrické analýzy byly srovnávány počty regenerovaných axonů při použití týchž statistických metod.

Výsledky

Funkční regenerace

Funkční regenerace byla pozorována ve dnech 15 až 17 a došlo k ní dříve u krys, jimž byla podávána sloučenina Ia v dávce 1 mg/kg a 5 mg/kg než u krys, jimž bylo podáváno pouze nosné prostředí. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3. Vliv sloučeniny Ia na funkční regeneraci ischiadického nervu u krys po jeho poranění.

	Funkční hodnocení
	Nosné prostředí s.c.	Sloučenina Ia
	30% DMSO ve fyziologickém roztoku	1 mg/kg (s.c.)	5 mg/kg (s.c.)
Den 15	1,67 ± 0,08	2,58 ± 0,17*	3,17 ± 0,08*
Den 16	1,83 ± 0,08	2,83 ± 0,17*	3,50 ± 0,00*
Den 17	2,50 + 0,00	3,08 + 0,22*	3,50 ± 0,00*

* P<0,05 při použiti svrchu uvedeného statistického hodnoceni

Elektronová mikroskopie

Morfologické sledování zvířat bylo provedeno 18 dnů po poranění nervu.

Množství regenerujících myelinizovaných axonů na oblast nervu 5000 pm² bylo dramaticky zvýšeno od 5,5 + 2,7 (průměr+SEM) u krys, jimž bylo podáno nosné prostředí až na 19 + 2,4 a 20 ±2,9u krys, jimž bylo podáno 1 a 5 mg/kg sloučeniny Ia, P<0,05. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4. Vliv sloučeniny Ia na počet regenerujících myelinizovaných axonů n.soleus 18 dnů po poranění nervu u krys.

	Nosné prostředí s.c.	Sloučenina Ia
	30 % DMSO ve fyziologickém roztoku NaCl	1 mg/kg (s.c.)	5 mg/kg (s.c.)
Regenerované myelinizované axony	5,5 ± 2,7	19 ± 2,4*	20 ± 2,9*

*P<0,05 při srovnání účinné látky a nosného prostředí svrchu popsanými statistickými metodami ·· ····

Příklad 4

Sloučenina I vyvolává funkční regenerací na modelu poranění krysí míchy

1. Metody

Pokusná zvířata a chirurgický zákrok krysích samců kmene Sprague-Dawley ve stáří 6 týdnů bylo anestetizováno 2% halothanem, pak byla provedena laminektomie v oblasti T10/T11 a v této oblasti byla na polovině svého průřezu poškozena mícha v téže oblasti T10/T11.

Příprava sloučeniny Ia a podání

Sloučenina Ia byla rozpuštěna v nosném prostředí, tvořeném 30 % dimethylsulfoxidu DMSO a 70 % fyziologického roztoku chloridu sodného. Krysám s poškozenou míchou bylo denně podkožně injekčně podáno 2 mg/kg sloučeniny Ia nebo ekvivalentní objem nosného prostředí 5 ml/kg 7 týdnů od chirurgického zákroku.

Hodnocení funkční regenerace

Funkční regenerace byla hodnocena podle modifikované stupnice Tarlov/Klinger, podle chůze po úzkém hranolu a podle testu s otiskem tlapky 2 týdny po poškození.

A) Modifikovaná stupnice Tarlov/Klinger

Krysy byly ponechány v otevřeném prostoru po dobu ·· ····

• w · · • · · · * · · 4

minuta a byl hodnocen jejich pohyb podle následující stupnice 0 až 6:

poškozená zadní končetina je bez pohybu sotva zjistitelný pohyb poškozené zadní končetiny rychlé pohyby v kloubech zadní končetiny, kyčlích, kolenech nebo kotnících bez koordinace, končetina neudrží žádnou váhu střídavé kroky s pohybem směrem dopředu, končetina však neudrží žádnou váhu končetina udrží váhu chůze je možná jen s mírnými obtížemi normální chůze

B) Chůze po úzkém hranolu

Krysy byly podrobeny chůzí na dřevěných hranolech s délkou 1,5 m se snižující se šířkou: 7,7 cm, 4,7 cm, 2,7 cm a 1,7 cm. Zaznamenána byla šířka nejužšího hranolu, po kterém byly krysy schopny přejít sem a tam.

0	chůze	není možná i	ia žádném (	hranolu
1	chůze	je možná na	hranolu s	šířkou 7,7 cm
2	chůze	je možná na	hranolu s	šířkou 4,7 cm
3	chůze	je možná na	hranolu s	šířkou 2,7 cm
4	chůze	je možná na	hranolu s	šířkou 1,7 cm

C) Test na otisk tlapky

Zevní končetiny krys byly namočeny do inkoustu a byly sledovány otisky na papíru, který překrýval úzkou dráhu s délkou 6 0 cm a šířkou 7,5 cm. Hodnoceny byly případy, u nichž došlo k alespoň 6 po sobě následujícím krokům, k hodnocení byla užita následující stupnice:

·» ·· ·· ···· ♦ * · · · « ·

9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 « · • · · · · · · ·« «· + ·

O zadní končetiny se dotýkají papíru dorsální částí, není možno pozorovat žádný otisk tlapky je možno pozorovat otisk alespoň tří prstů na alespoň třech otiscích tlapky je možno pozorovat rotaci nohy s více než dvojnásobnými hodnotami proti normálním hodnotám není možno pozorovat natahování prstů, dochází k rotaci nohy není možno pozorovat rotaci dovnitř nebo ven, je možno pozorovat více než jeden otisk paty není možno pozorovat otisky pat

Statistická analýza

Stejně jako v předchozích případech byly srovnávány průměrné hodnoty pro každou funkční zkoušku při použití programu ANOVA, následovaného mnohočetným srovnáním podle Newmana-Keulse.

2. Výsledky

Funkční regenerace

Ve všech třech zkouškách na funkční regeneraci bylo zlepšeno poškození motorických funkcí při použití hodnocení Tarlov/Klinger (tabulka 5), chůze po dřevěných hranolech (tabulka 6) a testu s otiskem tlapky (tabulka 7) po podání sloučeniny Ia.

Tabulka 5. Vliv sloučeniny Ia na modifikovaný test Tarlov/Klinger při poškození míchy u krys

0000

	Modifikované hodnocení Tarlov/Klinger
	Nosné prostředí s.c. 30% DMSO ve fyziologickém roztoku NaCI	Sloučenina Ia 2 mg/kg (s.c.)
Týden 2	2,1 ± 0,1	3,7 ± 0,2*

*P<0,05 při srovnání účinné látky a nosného prostředí svrchu popsanými statistickými metodami

Tabulka 6. Vliv sloučeniny Ia na chůzi krys po hranolech po poškození míchy.

	Hodnocení
	Nosné prostředí s.c. 30% DMSO ve fyziologickém roztoku NaCI	Sloučenina Ia 2 mg/kg (s.c.)
Týden 2	0,9 ± 0,1	2,0 ± 0,3*

Tabulka 7. Vliv sloučeniny Ia na otisk tlapek u krys po poškození míchy.

	Hodnocení
	Nosné prostředí s.c. 30% DMSO ve fyziologickém roztoku NaCI	Sloučenina Ia 2 mg/kg (s.c.)
Týden 2	1,7 ± 0,4	3,6 ± 0,3*

*P<0,05 při srovnání účinné látky a nosného prostředí svrchu popsanými statistickými metodami ·· ···· • ·· Μ ·· ·<·· Φ · Φ 9 Φ · ·

Φ·Φ ΦΦΦ····

Příklad 5

Sloučenina Ia se váže na FKBP12, avšak na rozdíl od tacrolimus má jen malý nebo nemá žádný imunosupresivní účinek

1. Zkouška na vazbu na FKBP12

Zkouška na vazbu byla uskutečněna způsobem podle publikace Tamura K. a další, Biochemical and Biophysical Research Communications, sv. 202, č. 1, 437-499, 1994. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 8.

2. Reakce směsi lymfocytů MLR

Zkouška MLR byla provedena způsobem podle dokumentu US 4929611. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8. Farmakologický profil sloučeniny Ia a tacrolimus in vitro.

	IC₅₀ pro vazbu na FKBP12 (nM)	IC₅₀ při MLR (nM)
Sloučenina Ia	<5	>100
Tacrolimus	<5	<2

Svrchu uvedené výsledky prokazují, že sloučenina Ia nemá imunosupresivní účinnost, přestože je schopná se vázat na FKBP12.

Výsledky prokazují silný neurotrofní účinek sloučeniny vzorce I na modelech in vitro i in vivo. Na dvou modelech buněčných kultur zvyšovala sloučenina vzorce I i v nízkých ·· ···· • ·

· · • · · · ·· 99 koncentracích růst neuritů. Mimoto při systemickém podání této látky v nízkých dávkách došlo k urychlení funkční regenerace po poranění nervů zvýšením rychlosti regenerace axonů ischiadického nervu a také funkční regenerací po poranění míchy.

Mimoto, jak bylo svrchu prokázáno, má sloučenina vzorce I neurotrofní účinek na stimulaci růstu nervových buněk, přestože nemá imunosupresivní účinnost. Jde tedy o cennou neurotrofní látku pro stimulaci nebo vyvolání růstu nebo regenerace neuronů zvláště v případech, kdy imunosupresivní účinek není požadován nebo není vhodný.

Vynález se týká také balení, které obsahuje obalový materiál a sloučeninu vzorce I, uloženou v tomto materiálu, přičemž tato látka je účinná při prevenci nebo léčení dysfunkce neuronů, obalový materiál obsahuje označení, které uvádí, že sloučenina vzorce I může být použita pro prevenci nebo léčení dysfunkce nebo poranění neuronů.

Uvedené balení je obvykle určeno pro komerční účely.

Součást podstaty vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, například suspenze buněk, tkáně nebo štěp, který obsahuje buňky, které byly zpracovány působením sloučeniny vzorce I. Takový prostředek je vhodný pro nápravu poškození nervového systému. Kromě uvedené účinné látky může obsahovat ještě další látky, stimulující růst nervových buněk, například další suspenze těch typů buněk, které podporují nebo napomáhají růstu nervových buněk, může jít například o buňky, produkující myelin, jako Schwannovy buňky, oligodendrocyty, buňky glie nebo krycí buňky, dále materiál extracelulární matrice, jako je kolagen nebo jiné ·· ···· ·· ·· • * ·«·· · · · •9 9999999 • · · · « 999 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 •9 99 99 99 99 regulátory specifických nervových buněk, jako jsou cytokiny, mitogenní faktory, immunofiliny a neurotrofiny, například NGF-1, BDNF, CNTF, NT-3, NT-4 a NT-5.

Štěpy, například homo-, allo- nebo xenomateriály je rovněž možno zpracovat působením sloučeniny vzorce I k usnadnění růstu neuronů a použití těchto materiálů k transplantaci a dalším aplikacím.

Je zřejmé, že by bylo možno uskutečnit ještě řadu modifikací a variací, rovněž spadajících do rozsahu vynálezu, takže vynález může být uveden do praxe i jinak, než je specificky popsáno v přihlášce vynálezu. Řada takových modifikací a variací bude odborníkům zřejmá.

Přestože tedy byl vynález popsán v souvislosti se specifickými výhodnými provedeními, je zřejmé, že nemůže být na toto provedení omezen a že zahrnuje i další provedení, pokud nezbytné modifikace spadají do erudice běžných odborníků.

Zastupuj e:

//

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY ·· ···· pro výrobu prostředku s neurotrofním účinkem.
2. Použití podle nároku 1, při němž je prostředek určen pro prevenci nebo léčení dysfunkce nebo poranění neuronu.
3. Použití podle nároku 1, při němž je prostředek určen pro stimulaci nebo vyvolání růstu nebo regenerace nervových buněk.
4. Použití podle nároku 1, při němž je prostředek určen pro vyvolání funkční regenerace po poranění nervu.
5. Použití podle nároku 1, při němž je prostředek určen pro prevenci nebo léčení poškození nervů a jejich dysfunkce, jako jsou polymyositis (mnohočetná myositis), syndrom Guillan-Barré, Menierův syndrom, polyneurítis (mnohočetná neuritis), mononeuritis (zánět jednoho nervu), ·« ···· ·· • to ·· * · to· • ·· · • · · to • · ♦·· · • · · >· ·· to • to • · • · • · ·· · ··

Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza ALS, Huntingtonova nemoc, radikulopathie, neuropathie, například diabetická neuropathie nebo neuropathie, vyvolaná chemotherapií a podobně, poranění míchy, senilní demence, vaskulární demence, roztroušená skleróza a podobně.
6. Použití podle nároku 1, při němž je dysfunkcí nebo poškozením neuronu Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza, diabetická neuropathie, neuropathie, vyvolaná chemoterapií nebo poranění míchy.
7. Použití podle nároku 1, při němž je sloučenina vzorce I ve formě farmaceuticky přijatelné soli, derivátu, prekursorů nebo solvátů.
8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje sloučeninu vzorce I och₃ oc% ·« • Φ·· φφ φ · φ φφ φφφφ • φ • · ·♦ φ φ φ φ φ · φ • Φ φφ
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu vzorce I ve formě farmaceuticky přijatelné soli, derivátu, prekursorů nebo solvátu.
10. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že se užije sloučenina vzorce I ve formě, vyjádřené strukturou Ia.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jednu další neurotrofní látku.
12. Balení nebo sestava, vyznačující se tím, že obsahuje obalový materiál a sloučeninu vzorce I, při čemž obalový materiál obsahuje označení, které uvádí, že sloučenina vzrce I je určena pro prevenci, zlepšení nebo léčení dysfunkce nebo poranění nervu.
13. Komerční balení nebo sestava, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje obalový materiál a sloučeninu vzorce I, při čemž obalový materiál obsahuje označení, které uvádí, že sloučenina vzrce I je určena pro prevenci, zlepšení nebo léčení dysfunkce nebo poranění nervu.
14. Způsob výroby neurotrofního farmaceutického prostředku, vyznačující se tím, že se sloučenina vzorce I smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem, nosným prostředím nebo pomocnou látkou.
15. Způsob prevence, zlepšení nebo léčení dysfunkce nebo poranění neuronů, vyznačující se tím, že se podává účinné množství sloučeniny vzorce I.

•4 ···· • 4 44 • 4 4 4 • 4 4 4

4 4 44 4 ·« 4

44 44

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4

44 44
16. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že léčeným subjektem je savec.
17. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že léčeným subjektem je člověk.
18. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že prostředek je určen pro prevenci nebo léčení poškození nervů a jejich dysfunkce, jako jsou polymyositis (mnohočetná myositis) , syndrom Guillan-Barré, Menierův syndrom, polyneuritis (mnohočetná neuritis), mononeuritis (zánět jednoho nervu), Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza ALS, Huntingtonova nemoc, radikulopathie, neuropathie, například diabetická neuropathie nebo neuropathie, vyvolaná chemotherapií a podobně, poranění míchy, senilní demence, vaskulární demence, roztroušená skleróza a podobně.
19. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, že dysfunkcí nebo poškozením neuronu je Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza, diabetická neuropathie, neuropathie, vyvolaná chemoterapií nebo poranění míchy.
20. Způsob stimulace nebo vyvolání růstu nebo regenerace nervových buněk, vyznačující se tím, že se nervové buňky uvedou do styku se sloučeninou vzorce I.
21. Způsob zvýšení rychlosti růstu nebo regenerace axonů nebo nervových buněk, vyznačující se tím, že se nervové buňky uvedou do styku se sloučeninou vzorce I.

fcfc fcfc » · · « > · « « ·· fcfc·· • · · • * · • · · · • · · · ·· »·
22. Způsob zvýšení rychlosti růstu nervových buněk ve tkáni, vyznačující se tím, že se na tkáň aplikuje sloučenina vzorce I.
23. Způsob podle nároku 22,vyznačuj ící se tím, že jde o mozkovou tkáň, míšní tkáň nebo periferní nerv.
24. Způsob vyvolání funkční regenerace po poranění nervu, vyznačující se tím, že se podává účinné množství sloučeniny vzorce I.
25. Způsob podle nároku 24,vyznačuj ící se tím, že nervovým poraněním je popálení, traumatické nebo mechanické poranění, poranění při chirurgickém zákroku, fyziologické poškození, patologické poškození nebo imunologické poškození.
26. Způsob úpravy přerušeného periferního nervu nebo míchy, vyznačující se tím, že se poškozená zakončení nervu nebo míchy uvedou do styku s účinným množstvím sloučeniny vzorce I.
27. Způsob úpravy přerušeného periferního nervu nebo míchy, vyznačující se tím, že se podává stimulační množství sloučeniny vzorce I a do periferního nervu nebo míchy se uloží štěp.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačuj ící se tím, že jde o alloštěp.

*» • ♦ · • · · • « * « ·· • · ·*· · <

9 ·
29. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že jde o arteficiální nervový štěp.
30. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že se dále vyplní místo mezi přerušenými konci periferního nervu nebo míchy nebuněčným výplňkovým materiálem.
31. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že se prostor mezi přerušenými konci periferního nervu nebo míchy vyplní buněčnou suspenzí.
32. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje nervové buňky, zpracované sloučeninou I.
33. Tkáň, vyznačující se tím, že obsahuje nervové buňky, zpracované sloučeninou I.
34. Štěp, vyznačující se tím, že obsahuje nervové buňky, zpracované sloučeninou I.
35. Štěp podle nároku 34, vyznačuj ící se tím, že jde o homo-, allo- nebo xenoštěp.
36. Způsob vyvolání funkční regenerace po poranění nervu, vyznačující se tím, že se podává účinné množství prostředku, který obsahuje buňky, zpracované působením sloučeniny I.
37. Způsob podle nároku 36, vyznačuj ící se tím, že nervovým poraněním je popálení, traumatické nebo mechanické poranění, poranění při chirurgickém zákroku, ·· ···· » · · · * c · ♦· » · * ·· ·· fyziologické poškození, patologické poškození nebo imunologické poškození.
38. Způsob úpravy přerušeného periferního nervu nebo míchy, vyznačující se tím, že se konce poškozeného periferního nervu nebo míchy uvedou do styku s účinným množstvím prostředku, obsahujícího buňky, zpracované působením sloučeniny I.
39. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje buňky, tkáně nebo štěp, zpracovaný působením sloučeniny vzorce I a alespoň jednu látku, podporující růst nervových buněk.
40. Prostředek podle nároku 39, vyznačuj ící se t í m, že se látka, podporující růst nervových buněk volí ze skupiny buněčných suspenzí, podporujících růst nervů, nebuněčného materiálu pro vyplnění vzniklé štěrbiny nebo faktoru nervového růstu.
41. Prostředek podle nároku 39, vyznačuj ící se t í m, že jako látku, podporující růst nervů, obsahuje kolagen nebo methylcelulózu.
42. Prostředek podle nároku 39, vyznačuj ící se t í m, že jako látku, podporující růst nervů obsahuje buněčnou suspenzi.

Zastupuj e: