CZ20032129A3 - Vazebné molekuly a farmaceutické přípravky, které je obsahují - Google Patents

Description

Vazebné molekuly a farmaceutické přípravky, které je obsahují

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká organických látek jako jsou vazebné molekuly proti izoformám antigenu CD45, např. monoklonálních protilátek (mAb).

Dosavadní stav techniky

U řady chorob je jedním ze způsobů léčby dosažení eliminace nebo inaktivace patogenních leukocytů a potenciálu pro navození tolerance, aby došlo k inaktivaci patologické imunitní odpovědi.

Má se za to, že za odvržení orgánu, buněk či tkáně a za různé autoimunitní choroby je primárně odpovědná imunitní odpověď zprostředkovaná pomocnými T schopny rozpoznat specifické antigeny, zpracovány a prezentovány buňkami, které jsou jež jsou zachyceny, T buňkám buňkami receptorů pro a k proliferaci působit přímo či zvýšené produkci aktivační molekuly pomocným prezentujícími antigen (APC), např. makrofágy a dendritickými buňkami, ve formě komplexů antigen-MHC, tj . jakmile pomocná T buňka rozpozná specifický antigen, je stimulována k produkci cytokinů, např. IL-2, a k expresi cytokiny či jiné

Některé tyto aktivované pomocné T buňky mohou či nepřímo, tj. jako pomoc efektorovým cytotoxickým T buňkám či B buňkám, při likvidaci buněk nebo tkáně exprimující daný antigen. Po ukončení imunitní odpovědi některé zralé klonálně vyselektované buňky zůstávají jako • · · · ···· ·· · • 4 4··· ··· • · ·· ······ · · • · ·· · ···· ••4···· · · · · «· ··

- 2 paměťové pomocné a paměťové cytotoxické T buňky, jež obíhají v těle a rychle rozpoznávají antigen, pokud se objeví znovu. Pokud je antigen vyvolávající tuto odpověď neškodným okolním antigenem, dochází k alergii, pokud pak antigen není cizorodým antigenem ale vlastním antigenem, může dojít k autoimunitnímu onemocnění; pokud antigen pochází z transplantovaného orgánu, výsledkem může být odvržení štěpu.

Imunitní systém si vyvinul schopnost rozlišovat vlastní od cizorodého. Tato schopnost umožňuje organismu přežít v okolí, v němž je vystaven každodenním dávkám patogenů. Tato specificita k nevlastnímu a tolerance k vlastnímu vzniká během vývoje repertoáru T buněk v thymu procesem pozitivní a negativní selekce, jež zahrnuje také rozpoznání a eliminaci autoreaktivních T buněk. Tento typ tolerance se označuje jako centrální tolerance. Některé z daných buněk však unikají tomuto selekčnímu mechanismu a představují potenciální riziko vzniku autoimunitních chorob. Pro zvládnutí autoreaktivních T buněk, jež unikly na periférii, má imunitní systém k dispozici regulační mechanismy, které poskytují ochranu před autoimunitou. Tyto mechanismy tvoří základ pro periferní toleranci.

Povrchové buněčné antigeny rozpoznávané specifickými protilátkami se obvykle označují CD („Cluster of Differentiation) a číslicí, jsou přidělovány na pravidelných mezinárodních seminářích International Leukocyte Typing Workshops a termín CD45 použitý v předkládaném vynálezu označuje společný povrchový leukocytární antigen CD45; protilátka proti tomuto antigenu se zde označuje jako „antiCD45.

Společný leukocytární antigen („leukocyte common antigen,

LCA) či CD45 je hlavní složkou antilymfocytárního globulinu • · · · · ·

- 3 (ALG). CD45 patří do rodiny transmembránových tyrosinových fosfatáz a je jak pozitivním, tak negativním regulátorem buněčné aktivace v závislosti na interakci s receptory. Fosfatázová aktivita CD45 je zřejmě nutná k aktivaci kináz rodiny Src, které jsou spojeny s receptory antigenu B a T lymfocytů (Trowbridge IS et al., Annu Rev Immunol. 1994;12:85-116). To znamená, že při aktivaci T buněk hraje CD45 významnou roli jako 1. signál a buňky s nedostatkem CD45 vykazují značné defekty při aktivačních procesech zprostředkovaných TCR.

Antigen CD45 existuje v různých izoformách tvořících rodinu transmembránových glykoproteinů. Jednotlivé izoformy CD45 se liší strukturou svých extracelulárních domén, což je výsledkem různého sestřihu tří variabilních exonů kódujících část extracelulární oblasti CD45 (Streuli et al, J. Exp. Med. 1987; 166:1548-1566). Různé izoformy CD45 mají odlišné extracelulární domény, ale mají tytéž transmembránové a cytoplasmatické úseky obsahující dvě homologní fosfatázové domény o cca 300 aminokyselinových zbytcích. Různé kombinace izoforem jsou odlišně exprimovány na subpopulacích T a B lymfocytů (Thomas ML. et al, Immunol. Today 1988; 9:320-325). Některé monoklonální protilátky rozpoznávají epitop společný pro všechny odlišné izoformy, zatímco jiné protilátky mají omezenou (CD45R) specificitu, v závislosti na tom, který z různě sestřižených exonů (A, B či C) rozpoznávají. Např.

se monoklonální protilátky rozpoznávající produkt exonu následně označují jako CD45RA, ty, jež rozpoznávají různé izoformy obsahující exon B, se označují CD45RB (Beverley PCL et al, Immunol. Supp. 1988; 1:3-5). Protilátky jako UCHL1 se selektivně vážou na izoformu CD45RO o 180 kDa (bez kteréhokoli z variabilních exonů A, B či C), která je zřejmě omezena na poskupinu aktivovaných T buněk, paměťových buněk a • · · · ······ · · ·· ·· ····· ··· ···· ·· ·· ·· «· kortikálních thymocytů a není detekována na B buňkách (Terry et al, Immunol. 1988; 64:331-336).

Podstata vynálezu

Původci objevili molekulu, která obsahuje polypeptidovou sekvenci vázající CD45RO a CD45RB, a která je v předkládaném vynálezu označena jako „vazebná molekula pro CD45RO/RB. Tyto vazebné molekuly z předkládaného vynálezu mohou vyvolat imunosupresi, potlačit primární T buněčnou odpověď a způsobit T buněčnou toleranci. Navíc vazebné molekuly z tohoto vynálezu mohou potlačovat primární smíšenou lymfocytární odpověď („mixed lymphocyte response, MLR). Buňky odvozené z kultur vystavených působení vazebné molekuly pro CD45RO/RB také výhodně vykazují sníženou proliferační odpověď v průběhu sekundární MLR, a to i v nepřítomnosti vazebných molekul pro CD45RO/RB při sekundární MLR. Tato snížená proliferační odpověď v průběhu sekundární MLR je příznakem schopnosti vazebných molekul tohoto vynálezu vyvolat toleranci. Navíc podání vazebné molekuly pro CD45RO/RB in vivo myším s těžkým kombinovaným imunodeficitem (severe combined immunodeficiency, SCID), u nichž byla provedena xeno-GVHD po injekci lidskými PBMC, může prodloužit přežití myší v porovnání s kontrolními zvířaty, i když v oběhu myší vystavených účinku vazebných molekul pro CD45RO/RB je možno dále detekovat lidské T buňky.

Termínem „vazebná molekula pro CD45RO/RB je míněna jakákoli molekula schopná specificky vázat izoformy CD45RB a CD45RO antigenu CD45, a to jak samotné, tak spojené s jinými molekulami. Vazebnou reakci lze prokázat standardními způsoby (kvalitativní test) či např. jakýmkoli typem vazebného testu, jakými jsou přímá či nepřímá imunofluorescence s fluorescenční • · · · · · · • ······ · · mikroskopie nebo cytofluorometrická analýza (FACS), ELISA test („enzyme-linked immunosorbent assay) nebo radioimunitní test, v němž lze vizualizovat vazbu molekuly na buňky exprimující konkrétní izoformu CD45. Navíc může vazba této molekuly způsobit změnu funkce buněk exprimujících dané ízoformy. Lze např. stanovit inhibici primární či sekundární smíšené lymfocytární odpovědi (mixed lymphocyte response, MLR), a to testem in vitro nebo biotestem stanovícím inhibici primární či sekundární MLR v přítomnosti a nepřítomnosti vazebné molekuly pro CD45RO/RB a dále rozdíly v inhibici primární MLR.

Jiným způsobem lze stanovit funkční modulační účinky in vitro také měřením proliferace PBMC, T buněk či CD4⁺ T buněk, produkce cytokinů, změny exprese buněčných povrchových molekul např. sledováním buněčné aktivace při MLR či sledováním stimulace specifickým antigenem jako tetanický toxoid nebo jiné antigeny, nebo polyklonálními stimulátory jako např. fytohemaglutinin (PHA), anti-CD3 či anti-CD28 protilátky nebo forbolestery a Ca²⁺ ionofory. Kultury se připravují podobně jako při MLR až na to, že místo alogenních buněk jako stimulátorů se využívá rozpustných antigenů či polyklonálních stimulátorů podobných výše zmíněným. T buněčná proliferace se výhodně měří jak bylo popsáno výše pomocí inkorporace ³H-thymidinu.

Produkce cytokinů se výhodně měří testem „sandwich ELISA, při kterém protilátka zachycující cytokin se nanese na povrch 96-důlkové destičky, přidají se supernatanty kultur a inkubují se po dobu 1 hod za laboratorní teploty, poté se po sekundární protilátce konjugované s enzymem jako např. křenová peroxidáza a odpovídajícím substrátu přidá detekční protilátka specifická pro konkrétní cytokin a čtečem destiček se změří absorbance. Změny povrchových molekul lze výhodně měřit přímou či nepřímou • ·

- 6 imunofluorescencí po obarvení cílových buněk protilátkami specifickými pro konkrétní povrchovou buněčnou molekulu. Protilátka může být buď přímo označena fluorochromem nebo lze využít fluorescenčně značenou sekundární protilátku specifickou pro primární protilátku a buňky analyzovat cytofluorimetrem.

Vazebná molekula z předkládaného vynálezu má vazebnou specificitu jak k CD45RO, tak k CD45RB („vazebná molekula pro CD45RB/RO).

Vazebná molekula výhodně váže izoformy CD45RO s disociační konstantou (Kd) <20 nM, výhodně s Kd<15 nM či <10 nM, výhodněji s Kd<5 nM.

Vazebná molekula výhodně váže izoformy CD45RB s disociační konstantou (Kd) <50 nM, výhodně s Kd<15 nM či <10 nM, výhodněji s Kd<5 nM.

V dalším výhodném provedení váže vazebná molekula tohoto vynálezu ty izoformy CD45, které

1) zahrnují epitopy A a B, ale nezahrnují epitop C molekuly CD45; a/nebo

2) zahrnují epitop B, ale nezahrnují epitopy A a C molekuly CD45; a/nebo

3) nezahrnují žádný z epitopů A, B či C molekuly CD45.

V ještě výhodnějším provedení vazebná molekula z tohoto vynálezu neváže izoformy CD45, které zahrnují

1) všechny z epitopů A, B či C molekuly CD45; a/nebo

2) současně epitopy B a C, ale ne epitop A molekuly CD45.

V dalších výhodných provedeních tohoto vynálezu vazebná molekula dále

1) rozpoznává paměťové a in vivo aloaktivované T buňky; a/nebo

AAA

- 7 • · A ··

2) váže se na cíle na lidských T buňkách, např. na buňkách PEER; přičemž tato vazba má Kd<15 nM, výhodněji Kd<10 nM,

nejvýhodněj i	Kd<5 nM; a/nebo
3) inhibuje in	vitro aloreaktivní	funkci T buněk, výhodně
s IC50 cca 5	nM, výhodněji s IC50	cca 1 nM, nejvýhodněji s
IC50 cca 0,5	nM či dokonce 0,1 nM;	a/nebo

4) indukuje T buněčnou toleranci specifickou pro aloantigen in vitro; a/nebo

5) zabraňuje letální xenogenní reakci štěpu proti hostiteli (graft versus host disease, GvHD) vyvolané v myších SCID injekcí lidských PBMC, pokud jsou podány v účinném množství.

V dalším výhodném provedení se vazebná molekula váže na tentýž epitop jako monoklonální protilátka „A6, popsaná v Aversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994).

Díky výše popsaným vazebným vlastnostem a biologické aktivitě jsou tyto vazebné molekuly z předkládaného vynálezu užitečné zvláště v lékařství, v léčbě a/nebo profylaxi. Choroby, pro které jsou tyto vazebné molekuly z předkládaného vynálezu zvláště výhodné, zahrnují autoimunitní choroby, psoriázu, zánětlivou chorobu střeva a alergie, jak bude uvedeno níže.

Bylo zjištěno, že molekula obsahující polypeptid o sekvenci (SEKV.) ID. Č. 1 a SEKV. ID. Č. 2 je vazebnou molekulou pro CD45RO/RB. Ve vazebné molekule pro CD45RO/RB o SEKV. ID. Č. 1 původci našli hypervariabilní oblasti CDRl', CDR2' a CDR3', přičemž CDRl' má aminokyselinovou sekvenci ArgAla-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) a CDR3' má aminokyselinovou sekvenci Gln-Gln-Ser• · • «

- 8 Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT).

Hypervariabilní oblasti CDRl, CDR2 a CDR3 byly také nalezeny ve vazebné molekule pro CD45RO/RB o SEKV. ID. Č. 2, přičemž CDRl má aminokyselinovou sekvenci Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Tyr-Phe-Asn-ProTyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) a CD3 má aminokyselinovou sekvenci SerGly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT).

CDR jsou 3 specifické komplementární determinující oblasti, též zvané hypervariabilní oblasti, které zásadním způsobem určují vazebné vlastnosti antigenů.

Tyto CDR jsou součástí variabilních oblastí, buď např. SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2, přičemž se tyto CDR střídají s rámcovými oblastmi (framework regions, FR), např. s konstantními oblastmi. Podle předkládaného vynálezu je sekvence SEKV. ID. Č. 1 součástí lehkého řetězce, např. SEKV. ID. Č. 3, a sekvence SEKV. ID. Č. 2 součástí těžkého řetězce, např. SEKV. ID. Č. 4, v chimérické protilátce. Oblasti CDR v těžkém řetězci spolu s oblastmi CDR v připojeném lehkém řetězci tvoří podstatu antigenního vazebného místa v molekule tohoto vynálezu. Je známo, že energetický vazebný příspěvek variabilní oblasti lehkého řetězce je malý ve srovnání s příspěvkem připojené variabilní oblasti těžkého řetězce a že izolované variabilní oblasti těžkého řetězce vykazují vlastní antigenní vazebnou aktivitu. Tyto molekuly se obvykle označují jako jednodoménové protilátky.

Z jednoho hlediska poskytuje předkládaný vynález molekulu obsahující nejméně jedno antigenní vazebné místo, např. vazebnou molekulu pro CD45RO/RB, v jejíž sekvenci jsou hypervariabilní oblasti CDRl, CDR2 a CDR3, přičemž příkladem aminokyselinové sekvence CDRl je Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), • · · · • ·* 00 ♦ · • · · · 000000 0 · ·· ·0 0 · 0 · · ··· 0000 00 00 «« «·

- 9 aminokyselinové sekvence CDR2 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-GlyThr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) a aminokyselinové sekvence CDR3 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-AspThr (SGPYAWFDT) nebo jejich přímé deriváty.

Z jiného hlediska poskytuje tento vynález molekulu obsahující nejméně jedno antigenní vazebné místo, např. vazebnou molekulu pro CD45RO/RB, která má např.

a) první doménu, v jejíž sekvenci jsou hypervariabilní oblasti CDR1, CDR2 a CDR3, přičemž aminokyselinová sekvence CDRl je Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), aminokyselinová sekvence CDR2 je Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-LysPhe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) a aminokyselinová sekvence CDR3 je Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT); a

b) druhou doménu, v jejíž sekvenci jsou hypervariabilní oblasti CDRl', CDR2' a CDR3', přičemž aminokyselinová sekvence CDRl' je Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-IleGln (RASQNIGTSIQ), aminokyselinová sekvence CDR2' je SerSer-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) a aminokyselinová sekvence CDR3' je Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT), a jejich přímé ekvivalenty.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je první doména obsahující sekvenci hypervariabilních oblastí CDRl, CDR2 a CDR3 těžký řetězec imunoglobulinu a druhá doména obsahující sekvence hypervariabilních oblastí CDRl', CDR2' a CDR3' je lehký řetězec imunoglobulinu.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález molekulu, např. vazebnou molekulu pro CD45RO/RB, obsahující polypeptid o SEKV. ID. Č. 1 a/nebo polypeptid o SEKV. ID. Č. 2, výhodně obsahující v jedné doméně polypeptid o SEKV. ID. Č. 1 a *· 4 4 4 4

-10ν další doméně polypeptid o SEKV. ID. Č. 2, např. chimérickou monoklonální protilátku, a z dalšího hlediska molekulu, např. vazebnou molekulu pro CD45RO/RB, obsahující polypeptid o SEKV. ID. Č. 3 a/nebo polypeptid o SEKV. ID. Č. 4, výhodně obsahující v jedné doméně polypeptid o SEKV. ID. Č. 3 a v další doméně polypeptid o SEKV. ID. Č. 4, např. chimérickou monoklonální protilátku.

Pokud antigenní vazebné místo obsahuje jak první, tak i druhou doménu nebo polypeptidy o sekvenci SEKV. ID. Č. 1 resp. SEKV. ID. Č. 3 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 2 resp. SEKV. ID. Č. 4, tyto sekvence se mohou nacházet na témže polypeptidu nebo výhodně může být každá doména na odlišném řetězci, např. první doména může být součástí těžkého řetězce, např. imunoglobulinového těžkého řetězce či jeho fragmentu, a druhá doména může být součástí lehkého řetězce, např. imunoglobulinového lehkého řetězce či jeho fragmentu.

Dále bylo zjištěno, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu je vazebnou molekulou pro CD45RO/RB v prostředí savčího, např. lidského těla. Vazebnou molekulu pro CD45RO/RB lze tedy označit jako monoklonální protilátku (mAb), přičemž vazebná aktivita je určena především oblastmi CDR popsanými výše, kde tyto oblasti CDR jsou spojeny např. s jinými molekulami bez vazebné specificity, jako jsou rámcové, např. konstantní oblasti, jež jsou zejména lidského původu.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález vazebnou molekulu pro CD45RO/RB, jež není monoklonální protilátkou „A6, jak byla popsána v Aversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994), který je uveden v literatuře pro pasáže charakterizující A6.

Z dalšího hlediska poskytuje předkládaný vynález vazebnou ·«· · ·

- 11 ·· molekulu pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu, jež je chimérickou, humanizovanou či zcela lidskou monoklonální protilátkou.

Příklady vazebných molekul pro CD45RO/RB zahrnují chimérické či humanizované protilátky, např. odvozené od protilátek produkovaných B buňkami či hybridomy a/nebo jejich fragmentů, např. fragmentů F(ab')2 a Fab, nebo jednořetězcové či jednodoménové protilátky. Jednořetězcová protilátka se skládá z variabilních oblastí lehkého a těžkého protilátkového řetězce kovalentně vázaných na peptidový spojovací úsek (linker), složený obvykle z 10 až 30 aminokyselin, výhodně z 15 až 25 aminokyselin. Tato struktura tedy neobsahuje konstantní část lehkého a těžkého řetězce a předpokládá se, že krátká peptidové mezičást (spacer) by měla být méně antigenní než celá konstantní část. Chimérickou protilátkou je míněna protilátka, jejíž konstantní oblasti těžkého a lehkého řetězce či obou dvou jsou lidského původu, zatímco variabilní domény těžkého i lehkého řetězce jsou jiného než lidského (např. myšího) původu. Humanizovanou protilátkou je míněna protilátka, jejíž hypervariabilní oblasti (CDR) jsou jiného než lidského (např. myšího) původu, zatímco celý nebo téměř celý zbytek, např. konstantní oblasti a vysoce konzervativní části variabilních oblastí, jsou lidského původu. V humanizované protilátce však může zůstat zachováno několik aminokyselin z myší sekvence v částech variabilních oblastí sousedících s hypervariabilními oblastmi.

Hypervariabilní oblasti, tj . CDR podle předkládaného vynálezu, mohou být spojeny s jakýmkoli typem rámcových oblastí, např. s konstantními částmi lehkého a těžkého řetězce lidského původu. Vhodné rámcové oblasti jsou popsány např. v „Sequences of proteins of immunological interest, Kabat, E.A.

·· ·· · « et al, US Department of health and human Services, Public health service, National Institute of health. Konstantní část lidského těžkého řetězce může být výhodně IgGI typu, včetně podtypů, konstantní část lidského lehkého řetězce může být výhodně typu κ nebo λ, výhodněji typu k. Výhodnou konstantní částí těžkého řetězce je polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 4 (bez částí sekvence CDRl, CDR2'a CDR3', jež jsou popsány výše) a výhodnou konstantní částí lehkého řetězce je polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 3 (bez částí sekvence CDRl, CDR2 a CDR3, jež jsou popsány výše).

Původci také objevili humanizovanou protilátku obsahující variabilní oblast lehkého řetězce o aminokyselinové sekvenci SEKV. ID. Č. 7 nebo o aminokyselinové sekvenci SEKV. ID. Č. 8, obsahující oblasti CDRl', CDR2'a CDR3' podle předkládaného vynálezu, a variabilní oblast těžkého řetězce o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 či SEKV. ID. Č. 10, obsahující oblasti CDRl, CDR2 a CDR3 podle tohoto vynálezu.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález humanizovanou protilátku obsahující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 či SEKV. ID. Č. 10 a polypeptid o SEKV. ID. Č. 7 či SEKV. ID. Č. 8.

Z jiného hlediska poskytuje humanizovanou protilátku obsahující předkládaný vynález polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 7, polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 8, polypeptid o sekvenci SEKV. ID. sekvenci SEKV. ID. Č. 7, nebo polypeptid o sekvenci SEKV. ID,

Č. 10 a polypeptid o

Č. 10 a polypeptid o • ·· ·· fcfc ······ • fc · · · · · fc · · _t * · · · · · · · · • · ·· ······ · · ·· ·· fc · · · fc •fcfc fcfcfcfc fcfc ·· ·» ··

- 13 sekvenci SEKV. ID. Č. 8.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu, např. o zde specifikované sekvenci, např. CDRl, CDR2, CDR3, CDRl', CDR2',

CDR3'	nebo o sekvenci SEKV. ID.	Č	. 1, SEKV.	ID.	Č. 2, SEKV.
ID. Č.	3, SEKV. ID. Č. 4, SEKV	•	ID. Č. 7,	SEKV	. ID. Č. 8,
SEKV.	ID. Č. 9 čí SEKV. ID. Č.	10	zahrnuj e	přímé	ekvivalenty
tohoto	(póly)peptidů (sekvence	) ,	včetně	např.	funkčního

derivátu tohoto polypeptidů. Tento funkční derivát může zahrnovat kovalentní modifikace specifikované sekvence a/nebo tento funkční derivát může zahrnovat varianty aminokyselinového složení specifikované sekvence.

„Polypeptid, pokud zde není specifikován jinak, zahrnuje jakýkoli peptid nebo protein obsahující aminokyseliny spojené navzájem peptidovou vazbou, jehož aminokyselinová sekvence začíná N-koncem a končí C-koncem. Polypeptidem v předkládaném vynálezu je výhodně monoklonální protilátka, výhodněji chimérická (obsahující V-štěp) či humanizovaná CDR-štěp) monoklonální protilátka. Humanizovaná CDR-štěp) monoklonální protilátka může či nemusí zahrnovat další mutace vnesené do rámcových (FR) sekvencí akceptorové protilátky.

(obsahuj ící (obsahuj ící

Funkční derivát polypeptidů, jak je zde používán, zahrnuje molekulu s biologickou aktivitou kvalitativně stejnou jako polypeptid předkládaného vynálezu, tj. se schopností vázat CD45RO a CD45RB. Funkční derivát zahrnuje fragmenty a peptidová analoga polypeptidů podle tohoto vynálezu.

Fragmenty představují oblasti uvnitř sekvence polypeptidů podle předkládaného vynálezu, např. o specifikované sekvenci.

Termín „derivát se užívá k definici aminokyselinových variant a kovalentních modifikací polypeptidů podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci. Funkční deriváty polypeptidů

4* 4444

- 14 podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci, mají výhodně nejméně cca 65%, výhodněji nejméně cca 75% a ještě výhodněji nejméně 85%, nejvýhodněji pak nejméně 95% celkovou sekvenční homologii s aminokyselinovou sekvencí polypeptidů podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci, a mají v podstatě zachovanou schopnost vázat CD45RO a CD45RB.

Termín „kovalentní modifikace zahrnuje modifikace polypeptidů podle předkládaného vynálezu, např. o specifikované sekvenci; nebo jejich fragmenty s organickým proteinovým či neproteinovým derivačním činidlem, fúzované produkty s heterologními polypeptidovými sekvencemi a posttranslační modifikace. Kovalentně modifikované polypeptidy, např. o specifikované sekvenci, stále mají schopnost vázat CD45RO a CD45RB pomocí zesítění. Kovalentní modifikace se tradičně vnášejí reakcí cílených aminokyselinových zbytků s organickým derivačním činidlem, které je schopno reagovat s vybranými postranními či koncovými zbytky, nebo adaptačními („harnessing) mechanismy posttranslačních modifikací, jež působí ve vybraných hostitelských buňkách. Některé posttranslační modifikace jsou výsledkem působení rekombinantních hostitelských buněk na exprimovaný polypeptid. Glutaminové a asparaginové zbytky jsou často posttranslačně deamidovány na odpovídající glutamátové a aspartátové zbytky. Tyto zbytky mohou být také deaminovány za mírně kyselých podmínek. Jiné posttranslační mechanismy zahrnují hydroxylaci prolinu a lysinu, fosforylaci hydroxylových skupin serinových, tyrosinových či threoninových zbytků, metylaci α-aminových zbytků lysinových, argininových a histidinových postranních řetězců, viz např. T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983). Kovalentní modifikace zahrnují např. fúzní proteiny obsahující polypeptid podle *· ·*·♦

- 15 ·»· ·· předkládaného vynálezu, např. o specifikované sekvenci, a jejich aminokyselinové sekvenční varianty, jako např. imunoadheziny, a N-koncové fúzní produkty s heterologními signálními sekvencemi.

„Homologie v souvislosti s nativním polypeptidem a jeho funkčním derivátem je zde definována jako procento aminokyselinových zbytků kandidátské sekvence, jež je totožné se zbytky v odpovídajícím nativním polypeptidu po paralelním srovnání obou sekvencí a v případě nutnosti vnesení mezer pro dosažení maximálního procenta homologie, přičemž jakékoli konzervativní substituce se nepovažují za součást sekvenční totožnosti. Jakékoli prodloužení N- či C-konců či jakékoli inzerce se nepovažují za omezení totožnosti či homologie. Postupy a počítačové programy pro paralelní srovnání jsou dobře známy.

„Aminokyselina(-y) označuje např. všechny přirozeně se vyskytující L-a-aminokyseliny a zahrnuje i D-aminokyseliny. Aminokyseliny jsou označovány dobře známým jednopísmenným či třípísmenným označením.

Termín „aminokyselinová sekvenční varianta označuje molekuly s několika odlišnostmi v aminokyselinové sekvenci oproti polypeptidu podle předkládaného vynálezu, např. o specifikované sekvenci. Aminokyselinové sekvenční varianty polypeptidu podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci, stále mají schopnost vázat CD45RO a CD45RB. Substituční varianty jsou ty, ze kterých byl odstraněn nejméně jeden aminokyselinový zbytek a nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem ve stejné pozici v polypeptidu podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci. Tyto substituce mohou být jednoduché, kdy je nahrazena pouze jedna aminokyselina, nebo mohou být násobné, kdy dvě nebo více aminokyselin bylo *· ·*»·

e • t * ♦

·♦· · · • · nahrazeno ve stejné molekule. Inzerční varianty jsou ty, u kterých jedna či více aminokyselin jsou vloženy přímo vedle aminokyseliny v určité pozici v polypeptidu podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci. Přímo vedle aminokyseliny znamená připojeno buď na α-karboxy nebo na aamino funkční skupinu aminokyseliny. Deleční varianty jsou ty, kdy jedna či více aminokyselin v polypeptidu podle tohoto vynálezu, např. o specifikované sekvenci, je odstraněno. Obvykle je v deleční variantě odstraněna jedna nebo dvě aminokyseliny v určité oblasti molekuly.

Původci dále objevili také polynukleotidové sekvence

- GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG, kódující aminokyselinovou sekvenci CDRl,

- TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG; kódující aminokyselinovou sekvenci

CDR 2

- ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT kódující aminokyselinovou sekvenci CDR 3,

TTATATTATCCACTG, kódující aminokyselinovou sekvenci CDRl',

- TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG kódující aminokyselinovou sekvenci CDR2',

- AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG kódující aminokyselinovou sekvenci CDR3',

SEKV. ID. Č. 5 kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 1, t j . variabilní oblast lehkého řetězce mAb podle předkládaného vynálezu;

SEKV. ID. Č.6 kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.2, tj . variabilní oblast těžkého řetězce mAb podle tohoto vynálezu;

··· ·

• · · • · · ·

SEKV. ID. Č.ll kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.9. tj. variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující CDRl, CDR2 a CDR3 podle tohoto vynálezu;

SEKV. ID. Č.12 kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.10, tj. variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující CDRl, CDR2 a CDR3 podle tohoto vynálezu;

SEKV. ID. Č.13 kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.7, tj. variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující CDRl', CDR2' a CDR3' podle tohoto vynálezu; a

SEKV. ID. Č.14 kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.8, tj. variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující CDRl', CDR2' a CDR3' podle tohoto vynálezu.

Z jiného hlediska tento vynález poskytuje izolované polynukleotidy obsahující polynukleotidy kódující vazebnou molekulu pro CD45RO/RB, kódující např. aminokyselinovou sekvenci CDRl, CDR2 a CDR3 podle tohoto vynálezu a/nebo, výhodně a, polynukleotidy kódující aminokyselinovou sekvenci

CDRl', CDR2' a CDR3' podle tohoto vynálezu; a polynukleotidy obsahující polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č. 5 a/nebo, výhodně a, polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č. 6; a polynukleotidy obsahující

polypeptid o	sekvenci	SEKV.	ID.
polypeptid o	sekvenci	SEKV.	ID,
kódující např.
polypeptid	o sekvenci	SEKV.	ID.
SEKV. ID. Č	.9,

polynukleotidy kódující

Č.7 či SEKV. ID. Č.8 a

Č.9 či SEKV. ID. Č.10;

Č.7 a polypeptid o sekvenci polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.7 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.10, • · · · • · · · ·

- polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.8 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.9, nebo

- polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.8 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.10; a polynukleotidy obsahující polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č.ll či SEKV. ID. Č.12 a polynukleotid o sekvenci SEKV.

ID. Č.13 či polynukleotid o obsahuj ící	sekvenci	SEKV. ID	. Č.14, výhodně
polynukleotid o sekvenci sekvenci SEKV. ID. Č.13,	SEKV.	ID.	Č.ll a	polynukleotid o
polynukleotid o sekvenci sekvenci SEKV. ID. Č.14,	SEKV.	ID.	Č.ll a	polynukleotid o
polynukleotid o sekvenci SEKV. sekvenci SEKV. ID. Č.13, nebo	ID.	Č.12 a	polynukleotid o
polynukleotid o sekvenci sekvenci SEKV. ID. Č.14.	SEKV.	ID.	Č.12 a	polynukleotid o
Polynukleotid, pokud	zde	není jinak specifikován,

zahrnuje bez omezení jakýkoli polyribonukleotid či polydeoxyribonukleotid, kterým může být nepozměněná RNA či DNA, pozměněná RNA či DNA, včetně jedno- a dvouvláknové RNA a RNA, jež je směsí jedno- a dvouvláknových oblastí.

Polynukleotid podle předkládaného vynálezu, např. polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci CDRl, CDR2, CDR3, CDRl', CDR2', CDR3' či sekvenci SEKV. ID. Č.l, SEKV. ID. Č.2, SEKV. ID. Č.3, SEKV. ID. Č.4, SEKV. ID. Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID. Č.9 resp. SEKV. ID. Č.10, jako např. polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č.5, SEKV. ID. Č.6, SEKV. ID. Č.ll, SEKV. ID. Č.12, SEKV. ID. Č.13 resp. SEKV. ID. Č.14, zahrnuje jejich alelické varianty a/nebo jejich komplementy;

- 19 ·· ·· • · · · · 9

9 9 · · · • ······ · • · ··· · zahrnuje dále např. polynukleotid, který hybridizuje s nukleotidovou sekvencí SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č.6, SEKV. ID. Č.ll, SEKV. ID. Č.12, SEKV. ID. Č.13 resp. SEKV. ID. Č.14; kóduje např. polypeptid vykazující alespoň 80% identitu se Č.l, SEKV. ID. Č.2, SEKV. ID. Č.3, SEKV.

sekvencí SEKV. ID. ID. Č.4, SEKV. ID SEKV. ID. Č.10,

Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID. Č.9 resp. zahrnující např. funkční derivát tohoto polypeptidu, přičemž tento funkční derivát má alespoň např.

65% homologii se sekvencí SEKV ID. Č.3, SEKV ID. Č.9 resp.

ID. C.l, SEKV. ID. C.2, SEKV. ID. Č.4, SEKV. ID. Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. SEKV. ID. Č.10, přičemž tento funkční derivát zahrnuje např. kovalentní modifikace sekvencí SEKV. ID. Č.l, SEKV. ID. Č.2, SEKV. ID. Č.3, SEKV. ID. Č.4, SEKV. ID. Č.7, Č.9 resp. SEKV. ID. Č.10, přičemž zahrnuje aminokyselinové sekvenční

SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID tento funkční derivát

SEKV.	ID.	Č.4,	SEKV. ID. Č
resp.	SEKV	. ID.	Č.10; např.
Č.6,	SEKV.	ID.	Č.ll, SEKV.
SEKV.	ID.	Č.14,	zahrnuje s<

varianty sekvencí SEKV. ID. Č.l, SEKV. ID. Č.2, SEKV. ID. Č.3, Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID. Č.9 . sekvence SEKV. ID. Č.5, SEKV. ID. /. ID. Č.12, SEKV. ID. Č.13 resp. sekvenci, jež následkem redundance (degenerace) genetického kódu kóduje také polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č.l, SEKV. ID. Č.2, SEKV. ID. Č.3, SEKV. ID. Č.4, SEKV. ID. Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID. Č.9 resp. SEKV. ID. Č.10, nebo kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí vykazující alespoň 80% totožnost s aminokyselinovou sekvencí SEKV. ID. Č.l, SEKV. ID. Č.2, SEKV. ID. Č.3, SEKV. ID. Č.4, SEKV. ID. Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID. Č.9 resp. SEKV. ID. Č.10.

Vazebná molekula pro CD45RO/RB, která je např. chimérickou či humanizovanou protilátkou, může být produkována způsoby využívajícími rekombinantní DNA. Lze tak připravit jednu či více molekul DNA kódujících CD45RO/RB pod kontrolou • · · · • ········ • · ·· ······ · · • · · · ····· ··· ···· ·· ·· ·· ··

- 20 odpovídajích regulačních sekvencí a vnesených do vhodného hostitele (organismu) k expresi odpovídajícím vektorem.

Z jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje polynukleotid kódující jediný, těžký a/nebo lehký řetězec vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu;

a použití polynukleotidu podle tohoto vynálezu k produkci vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu rekombinantními prostředky.

Vazebnou molekulu pro CD45RO/RB lze získat konvenčním postupem, např. analogicky, podle informací poskytnutých s tímto postupem, např. se znalostí aminokyselinové sekvence hypervariabilních či variabilních oblastí a polynukleotidových sekvencí kódujících tyto oblasti. Postup přípravy variabilní domény genu je popsán např. v EP 239 400 a lze ho stručně shrnout následovně: Gen kódující variabilní oblast mAb jakékoli specificity lze připravit klonováním. Určí se úseky kódující rámcové a hypervariabilní oblasti a úseky kódující hypervariabilní oblasti se odstraní. Dvouvláknové syntetické kazety CDR se připraví syntézou DNA podle sekvencí CDR a CDR', jak jsou zde specifikovaný. Tyto kazety se opatří kohezními konci, aby je bylo možno ve spojích ligovat s požadovaným rámcem lidského původu. Polynukleotidy kódující jednořetězcové protilátky lze také připravit konvenčními postupy, např. analogicky s nimi. Takto připravený polynukleotid podle tohoto vynálezu lze úspěšně přenést do odpovídajícího expresního vektoru.

Vhodné buněčné linie lze zajistit konvenčním postupem, např. analogicky s ním. Expresní vektory, obsahující např. vhodný promotor (promotory) a geny kódující konstantní oblasti těžkého a lehkého řetězce jsou známy a jsou např. komerčně dostupné. Vhodní hostitelé jsou známi nebo je lze zajistit • · · · • ·

- 21 konvenčním postupem, např. analogicky s ním, a zahrnují buněčné kultury či transgenní zvířata.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález expresní vektor obsahující polynukleotid kódující vazebnou molekulu pro

CD45RO/RB podle tohoto vynálezu, o sekvenci např. SEKV. ID. Č.15, SEKV. ID. Č.16, SEKV. ID. Č.17 či SEKV. ID. Č.18.

Z dalšího hlediska tento vynález poskytuje

- Expresní systém obsahující polynukleotid podle tohoto vynálezu, přičemž tento expresní systém nebo jeho část jsou schopny produkovat vazebnou molekulu pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu, pokud je tento expresní systém nebo jeho část přítomna v kompatibilní hostitelské buňce; a

Izolovanou hostitelskou buňku obsahující expresní systém jak byl definován výše.

Dále původci zjistili, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu inhibuje primární aloimunní odpovědi v závislosti na dávce, jak bylo určeno in vitro MLR. Výsledky ukazují, že buňky, jež byly aloaktivovány v přítomnosti vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu poskytují chybnou odpověď na aloantigen. To potvrzuje, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu může přímo působit na efektorové aloantigenní T buňky a modulovat jejich funkci. Navíc, funkční vlastnosti T buněk odvozené z primární MLR byly dále studovány v restimulačních experimentech při sekundární MLR s využitím specifických stimulátorových buněk či vnějších (third-party) stimulátorů ke zhodnocení specificity pozorovaných funkčních účinků. Zjistili jsme, že buňky odvozené z primárních MLR, v nichž je přítomná vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu, nebyly schopny poskytnout odpověď na následnou optimální stimulaci specifickými stimulátorovými buňkami, i když k sekundárním kulturám nebyla přidána žádná protilátka. Specificita inhibice byla prokázána schopností buněk vystavených vazebné molekule pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu poskytnout normální odpověď stimulátorovým buňkám z nepříbuzných vnějších (third-party) dárců. Restimulační experimenty využívající T buňky odvozené z primárních MLR kultur tak naznačují, že buňky, jež byly aloaktivovány vazebnou molekulou pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu mají sníženou odpověď, tj . jsou tolerantní vůči původnímu antigenu. Další biologické aktivity jsou popsány v příkladu 7.

Navíc bylo zjištěno, že buněčnou proliferaci v buňkách předem vystavených vazebné molekule pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu lze obnovit exogenním IL-2. To znamená, že působení vazebnou molekulou pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu na aloreaktivní T buňky vyvolává stav tolerance. Snížené proliferační odpovědi pozorované v buňkách vystavených vazebné molekule pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu byly skutečně zaviněné poškozením funkce T buněk a tyto buňky byly schopné reagovat na exogenní IL-2, což naznačuje, že tyto buňky jsou v anergním, skutečně umlčeném stavu. Specificita této odpovědi byla prokázána schopností buněk vystavených vazebné molekule pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu normálně proliferovat v reakci na nepříbuzné dárcovské buňky na úroveň týmž způsobem vystavených kontrolních buněk.

Experimenty navíc ukazují, že vazba vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu na CD45RO a CD45RB může inhibovat paměťové odpovědi mononukleárních buněk z periferní krve (PBMC) z imunizovaných dárců na specifický paměťový (recall) antigen. Vazba vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu na CD45RO and CD45RB je tedy také účinným prostředkem inhibice paměťových odpovědí na rozpustné antigeny. Schopnost vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu inhibovat paměťové (recall) odpovědi k tetanu v PBMC imunizovaných dárců naznačuje, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu je schopna cílit a modulovat aktivaci paměťových T buněk. Tyto údaje např. naznačují, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu kromě rozpoznávání aloreaktivních a aktivovaných T buněk je schopna modulovat jejich funkci, čímž je indukována anergie T buněk. Tato schopnost může být důležitá při léčbě probíhajících imunitních odpovědí na autoantigeny a alergeny a zřejmě i na aloantigeny, jak tomu bývá u autoimunitních chorob, alergie a chronického odhojovaní, a také u chorob jako psoriáza a zánětlivé choroba střeva, kde paměťové odpovědi hrají úlohu při udržení chorobného stavu. Zdá se, že jde o důležitou vlastnost pro průběh chorob jako např. autoimunitní choroba, při níž paměťové odpovědi na autoantigen mohou hrát klíčovou úlohu pro udržení choroby.

Původci dále zjistili, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu může modulovat proliferační odpovědi T buněk v smíšené lymfocytární odpovědi (MLR) in vivo, tj . bylo zjištěno, že vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu má při testování in vivo odpovídající inhibiční vlastnosti.

Vazebná molekula pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu tak může mít imunosupresivní a tolerogenní vlastnosti a může být využita pro navození in vivo a ex vivo tolerance k aloantigenům, autoantigenům, alergenům a antigenům bakteriální flóry, tj . vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu může být využita např. při léčbě a profylaxi chorob včetně např. autoimunitních chorob zahrnujících • · · ·

revmatoidní artritidu, autoimunitní thyreoiditidu, Gravesovu chorobu, diabetes I. a II. typu, roztroušenou sklerózu, systémový lupus erythematosus, Sjógrenův syndrom, sklerodermii, autoimunitní gastritidu, glomerulonefritidu, odhojení transplantátu, reakci štěpu proti hostiteli (GVHD), a také psoriázu, zánětlivou chorobu střeva, alergie a další.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález použití vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu jakožto farmaceutického přípravku, např. při léčbě a profylaxi autoimunitních chorob, odhojení transplantátu, psoriázy, zánětlivé choroby střeva a alergií.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález použití vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu k produkci léku při léčbě a profylaxi chorob spojených s autoimunitními chorobami, odhojením transplantátu, psoriázou, zánětlivou chorobou střeva a alergiemi.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález farmaceutický přípravek obsahující vazebnou molekulu pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu ve spojení s alespoň jedním farmaceuticky akceptovatelným nosičem či diluentem.

Farmaceutický přípravek může obsahovat další, např. aktivní složky, např. jiné imunomodulační protilátky jako anti-ICOS, anti-CD154, anti-CD134L a další, či rekombinantní proteiny, např. rCTLA-4 (CD152), rOX40 (CD134) a další, či imunomodulační sloučeniny jako cyklosporin A, FTY720, RAD, rapamycin, FK506, 15-deoxyspergualin, steroidy a další. Předkládaný vynález se tedy týká léčby a/nebo profylaxe chorob spojených s automunitní chorobu, odhojením transplantátu, psoriázou, zánětlivou chorobou střeva a alergiemi, která zahrnuje podávání účinného množství vazebné molekuly pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu osobě, u které je potřebná ···· ♦

♦ • ·

taková léčba a/nebo profylaxe, a to ve formě např. farmaceutického přípravku podle tohoto vynálezu.

Autoimunitní choroby, jež mají být léčeny vazebnou molekulou pro CD45RO/RB podle předkládaného vynálezu, zahrnují dále revmatoidní Gravesovu chorobu, artritidu, autoimunitní thyreoiditidu, typu, roztroušenou Sjogrenův syndrom, glomerulonefritidu;

diabetes I. a II. sklerózu, systémový lupus erythematosus, sklerodermii, autoimunitní gastritidu, odhojení transplantátu, např. odvržení orgánových a tkáňových alograftů a xenograftů a reakci štěpu proti hostiteli štěpu (GVHD), a další.

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje, že inhibice primární MLR „kandidátskou mAb je závislá na dávce v rozmezí 0,001 a 10 pg/ml. „Koncentrace znamená koncentraci „kandidátské mAb.

Obr. 2 uvádí plasmidovou mapu expresního vektoru HCMV-G1 HuAb-VHQ obsahujícího těžký řetězec o nukleotidové sekvenci SEKV. ID. Č. 12 (3921=4274) v úplné sekvenci expresního vektoru SEKV. ID. Č. 15.

Obr. 3 uvádí plasmidovou mapu expresního vektoru HCMV-G1 HuAb-VHE obsahujícího těžký řetězec o nukleotidové sekvenci SEKV. ID. Č. 11 (3921=4274) v úplné sekvenci expresního vektoru SEKV. ID. Č. 16.

- 26 Obr. 4 uvádí plasmidovou mapu expresního vektoru HCMV-K HuAb-humVl obsahujícího lehký řetězec o nukleotidové sekvenci SEKV. ID. Č. 14 (3964=4284) v úplné sekvenci expresního vektoru SEKV. ID. Č. 17.

Obr. 5 uvádí plasmidovou mapu expresního vektoru HCMV-K HuAb-humV2 obsahujícího lehký řetězec o nukleotidové sekvenci SEKV. ID. Č. 13 (3926=4246) v úplné sekvenci expresního vektoru SEKV. ID. Č. 18.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález bude možno lépe pochopit po shlédnutí následujících příkladů. Nelze je však považovat za omezující rozsah tohoto vynálezu. Všechny teploty v uvedených příkladech jsou ve stupních Celsia.

„Kandidátská mAb či „chimérická protilátka je vazebná molekula pro CD45RO/RB podle tohoto vynálezu obsahující lehký řetězec o sekvenci SEKV. ID. Č.3 a těžký řetězec o SEKV. ID.

Č.4.

V příkladech jsou použity následující zkratky:

ELISA (enzyme linked immuno-sorbant assay) enzymový imunoabsorpční test

FACS (fluorescence activated cell sorting) fluorescenční třídění buněk

FITC izothiokyanát fluoresceinu

- 27 ·* ···4

FBS fetální bovinní sérum

GVHD (graft-vs-host disease) reakce štěpu proti hostiteli

HCMV lidský cytomegalovirový promotor

IgE imunoglobulin izotypu E

IgG imunoglobulin izotypu G

PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok

PCR polymerázová řetězová reakce xGVHD xenogenní reakce štěpu proti hostiteli

Příklad 1

Primární smíšená lymfocytární odpověď (MLR)

Buňky

Vzorky krve se získají od zdravých lidských dárců. Mononukleární buňky z periferní krve (PBMC) se izolují centrifugací na Ficoll-Hypaque (Pharmacia LKB) z leukocytů plné periferní krve, leukoferézí či z vrstvy „buffy coats centrifugací známého typu krve o neznámém typu HLA. V některých MLR experimentech se PBMC používají přímo jako stimulátorové buňky po ozáření 40 Gy. V jiných experimentech se T buňky odstraní z PBMC pomocí kuliček CD2 či CD3 Dynabeads (Dynal, Oslo, Norsko). Kuličky a kontaminující buňky se odstraní působením magnetického pole. PBMC, ze kterých byly odstraněny T buňky, se po ozáření použijí jako stimulátorové buňky.

PBMC, CD3⁺ T buňky či CD4^d buňky se použijí jako reagující buňky v MLR. Buňky se připraví z různých dárců pro φφ ···* • φφ ·· φφ • φ φ φ · φφ φ · · * · φφφφ φφφ * · φφ φφφφφφ φ • · φφ φφφφ ··· φφφφ φφ φφ φφ ·Φ

- 28 stimulátorové buňky. CD3⁺ Τ buňky se vyčistí negativní selekcí pomocí anti-CDl6 mAb (Zymed, CA), kuliček goat anti-mouse IgG Dynabeads, anti-CDl4 Dynabeads, CD19 Dynabeads. K čištění CD4⁺

T buněk se navíc použijí kuličky anti-CD8 Dynabeads. Získané buňky se analyzují pomocí přístrojů FACScan či FACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA) a čistota takto získaných buněk byla >75%. Buňky se suspendují v médiu RPMI1640 obohaceném o 10 % tepelně inaktivované FBS, penicilín, streptomycin a

L-glutamin.

Reagenty

Připraví se také chimérická protilátka anti-CD45R0/RB kandidátská mAb a izotypově odpovídající kontrolní chimérická protilátka. Myší (lidská) kontrolní protilátka IgGi specifická pro KLH (keyhole limpet hemocyanin) či rekombinantní lidský IL-10 se získá of firmy BD Pharmingen (San Diego, CA) . Protilátka anti-human CD154 mAb 5c8 je podle Lederman et al 1992.

Primární smíšená lymfocytární odpověď (MLR)

Alikvoty po 1 x 10⁵ PBMC či 5 X 10⁴ buněk CD3⁺ či CD4⁺ se smíchají s 1 x 10⁵ ozářenými PBMC či 5 x 10⁴ PBMC zbavených T buněk a ozářených (50 Gy) po jednom důlku na 96-důlkových kultivačních destičkách (Costar, Cambridge, MA) za přítomnosti uvedené mAb či v nepřítomnosti Ab. V některých experimentech se kromě kandidátské mAb přidá fragment F(ab')2 kozího protimyšího Ig či kozího protilidského Ig specifického pro úsek Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) v koncentraci 10 pg/ml, aby bylo zajištěno optimální zesítění cílových molekul CD45 in vitro.

··»· • ·· 44 44 • · 4 4 4444 44 4 • « 4444 444 • 4 44 4 44 444 4 4 «4 44 4 4444

444 4444 44 44 44 44

- 29 Smíchané buňky se kultivují 4 až 5 dnů při 37°C v 5% C0₂ a proliferace se určí pulzováním buněk s ³H-thymidinem po dobu kultivace alespoň 16 - 20 hodin.

Další experimenty se podobají výše popsaným, ale s následujícími výjimkami: 1) Použité médium je EX-VIVO (BioWhittaker) obsahující 10% FBS a 1% lidskou plazmu; 2) jako sekundární zesíťovací krok se užívá protimyší celkový IgG (5 pg/ml); 3) ozařovaní buněk se provádí 60 Gy.

Primární MLR se provede v přítomnosti „kandidátské mAb či kontrolní chimérické IgGi (10 pg/ml), oboje se sekundárním reagentem, fragmentem F(ab')₂ kozího protilidského Ig specifického pro úsek for Fc (10 pg/ml). Procentuální inhibice „kandidátskou mAb se vypočítá ve srovnání s buněčnou proliferaci za přítomnosti kontrolního IgGi. Výsledky uvádí TABULKA 1 níže:

TABULKA 1

Inhibice primární MLR 10 pg/ml kandidátské mAb podle předkládaného vynálezu

Reagující buňka	stimulátor (ozář. PBMC)	% Inhibice
č.211 CD4	č.219 CD3	63.51
č.220 CD4	č.219 CD3 odstr.	63.07
č.227 CD4	č.220 CD3 odstr.	65.96
č.229 CD4	č.19 CD3 odstr.	50.76
Průměr + SD	60.83 +6.83 *

* Významně odlišné od kontrolní hodnoty (P<0.001) ♦ · ··»· • 99 99 ·« ··· « A ·· · * ··»····· * · * · ·<·<·| « 9 • · · A · A · A A ··· ··*· AA «» <« ··

- 30 Kandidátská mAb podle předkládaného vynálezu inhibuje primární MLR, jak je možno vidět v TABULCE 1. Průměrný inhibiční účinek je 60.83 + 6.83 % v CD4⁺ T buňkách ze čtyř různých dárců a je statisticky významný.

Obr. 1 ukazuje, že inhibice primární MLR „kandidátskou mAb je závislá na dávce v rozmezí 0.001 and 10 pg/ml kandidátské mAb.

Hodnota IC50 inhibice primární MLR kandidátskou mAb se určí z výsledků tří různých experimentů MLR využívajících jako reagující buňky PBMC jednoho dárce. Reagující CD4⁺ T buňky z dárců č.229 a č.219 a ozářené PBMC, z nichž byly odstraněny T buňky, jako stimulátory se smíchají za přítomnosti „kandidátské mAb či kontrolní chimérické Ab s 10 pg/ml fragmentu F(ab')ž kozího protilidského Ig. Experimenty se opakují 3-krát a procento proliferace za přítomnosti „kandidátské mAb se vypočítá ve srovnání s proliferací T buněk za přítomnosti kontrolní Ab. Hodnota IC50 se určí pomocí Origin (V. 6.0®). Hodnota IC₅₀ buněčné aktivity je podle výpočtu 0.87 + 0.35 nM (0.13 + 0.052 pg/ml).

Příklad 2

Sekundární MLR

K určení zda „kandidátská mAb vyvolává neodpovídavost CD4⁺ T buněk na specifické aloantigeny se provede po primární MLR pomocí sekundární MLR v nepřítomnosti protilátek. CD4⁺ T buňky se kultivují s ozářenými alogenními stimulátorovými buňkami (PBMC bez T buněk) za přítomnosti dané protilátky v 96-důlkových destičkách po dobu 10 dnů (primární MLR) . Poté fc· ott fc fcfc fcfc ·<

• fcfcfc · · · · * · 4 • fcfc fc····· • · fc · · ··· · · · · ·· · · ·· ··<

fc·· ··>· fc* ·· ·· ··

- 31 se buňky sklidí, nanesou se na gradient Ficoll-Hypaque, aby byly odstraněny mrtvé buňky, dvakrát se promyjí RPMI a znovu se stimulují týmž stimulátorem, vnějšími (third-party) stimulátorovými buňkami či IL-2 (50 U/ml). Buňky se kultivují 3 dny a proliferační odpověď se určí pulzováním buněk s ³H-thymidinem během posledních 16 - 20 hodin kultivace.

Konkrétně, CD4⁺ T buňky se kultivují s ozářenými alogenními stimulátorovými buňkami (PBMC z jiných dárců bez T buněk) za přítomnosti 10 pg/ml kandidátské mAb, kontrolní chimérické IgGi Ab a fragmentu F(ab')₂ kozího protilidského Ig. Primární MLR proliferace se určí v den 5. Pro sekundární MLR se reagující a stimulátorové buňky kultivují po dobu 10 dnů za přítomnosti „kandidátské mAb, poté se buňky sklidí, dvakrát promyjí RPMI1640 a znovu stimulují specifickým stimulátorem, vnějšími (third-party) stimulátory nebo IL-2 (50 U/ml) v nepřítomnosti Ab. Buněčná proliferace se určí v den 3. Výsledky jsou uvedeny v TABULCE 2:

TABULKA 2

Dárce reagujících CD4+ T buněk č.	% inhibice sekund. MLR
č.211	49.90*
č.220	59.33*
č.227	58.68*

* Významně rozdílné of kontrolní hodnoty (p=<0.001 určeno t-testem, SigmaStat V.2.03). # p=<0.046

K určení, zda proliferace je zhoršená díky neodpovídavosti jako následek působení „kandidátské mAb, se buňky odvozené z primární MLR kultivují za přítomnosti IL-2 (50 U/ml).

• · • · · ·

- 32 Přidáním IL-2 se proliferační odpovědi T buněk, na něž bylo působeno kandidátskou mAb v primární MLR, obnoví na hladiny podobné hladinám pozorovaným za přítomnosti kontrolní IgGi Ab.

Tyto údaje naznačují, že důvodem pro zhoršenou sekundární odpověď T buněk, na něž bylo působeno kandidátskou mAb, je funkční změna reagujících T buněk, které přestaly reagovat na specifické stimulátorové buňky.

Procentuální inhibice se vypočítá podle následujícího vzorce:

c.p.m. s kontrolní Ab - c.p.m. s „kandidátskou mAb _ x 100

c.p.m. s kontrolní Ab

Statistická analýza se provede pomocí SigmaStat (Verze 2.03).

Data se analyzují dvoucestným testem ANOVA a následně metodou Dunnett. Ve všech krocích testu se pravděpodobnosti <0.05 považují za významné. V některých experimentech se použije t-test (SigmaStat V.2.03).

Příklad 3

Studie přežití in vivo na SCID myších

Transplantace lidských PBL do SCID myší

Lidské mononukleární buňky z periferní krve (PBMC) se intraperitoneálně injikují do SCID myší C.B 17 /GbmsTacPrkdc^scld Lyst^bg (Taconic, Germantown, NY) v množství • ·

- 33 dostatečném pro vyvolání letální xenogenní reakce štěpu proti hostiteli (xGvDH) po přenosu buněk ve >90% myších. Takto ošetřené myši se dále označují jako hu-PBL-SCID myši.

Působení mAb na hu-PBL-SCID myši

Na hu-PBL-SCID myši se působí kandidátskou mAb nebo myšími či chimérickými kontrolními raAb odpovídajícího izotypu v den 0, ihned po injekci PBMC, v den 3, v den 7 a poté v týdenních intervalech. Protilátky se aplikují podkožně ve 100 μΐ PBS v konečné koncentraci 5 mg/kg tělesné hmotnosti. Aplikace se zastaví, jakmile uhynou všechny kontrolní myši.

Zhodnocení výsledků působení mAb

Hlavním kritériem pro zhodnocení účinnosti kandidátské mAb v této studii bylo přežití hu-PBL-SCID myší. Významnost výsledků je zhodnocena statistickým postupem pro analýzu přežití testem Log-rank (Mantelův postup) s pomocí software Systat v9.01. Postupem pro analýzu přežití je neparametrický test, který přihlíží nejen k tomu, zda je konkrétní myš ještě živá, ale také k tomu, zda byla utracena z důvodů nesouvisejících s procedurou/chorobou jako např. požadavkem provést in vitro analýzu jejích orgánů/buněk. Biopsie jater, plic, ledvin a sleziny z uhynulých myší se odeberou k dalšímu zhodnocení. Navíc se hu-PBL-SCID myši na začátku (před přenosem buněk) a v průběhu (každé dva dny) experimentu zváží, což slouží jako nepřímé hodnocení jejich zdravotního stavu. Pomocí tělesné hmotnosti vynesené proti dnům po přenosu PBMC byly získány lineární regresní křivky, jejichž sklon (kontrolní myši versus myši po anti-CD45) byl porovnán neparametrickým testem Mann-Whitneyho.

• · · · · ·

Výsledky

Všechny hu-PBL-SCID myši, na které bylo působeno kontrolní myší mAb, měly plíce, játra a slezinu infiltrované lidskými leukocyty a uhynuly (4/4) v průběhu cca 2 až 3 týdnů po přenosu buněk. Smrt byla zřejmě důsledkem xGvHD. Kontrolní myši, na které bylo působeno mAb, navíc lineárně ztrácely hmotnost, a to cca o 10% a více v průběhu 3 týdnů.

Všechny hu-PBL-SCID myši, na kandidátskou mAb, přežily (4/4) choroby déle než 4 týdny, dokonce kandidátskou mAb zastaveno po 3 kandidátské mAb lineárně přibývaly 5% v průběhu 4 týdnů.

které bylo bez zřejmých i pokud bylo týdnech. Myši na hmotnosti, působeno příznaků působení vystavené až do cca

Přiklad 4

Exprese protilátek podle předkládaného vynálezu

Exprese humanizované protilátky obsahující sekvenci SEKV. ID. Č.7, SEKV. ID. Č.8, SEKV. ID. Č.9 či SEKV. ID. Č.10 aminokyselinovou lehkého řetězce variabilní oblasti Č.7), humanizované

Podle plasmidových map uvedených na obr. 2 a 5 se sestrojí expresní vektory obsahující odpovídající nukleotidy kódující sekvenci humanizované humVl (SEKV. ID.

variabilní oblasti lehkého řetězce humV2 (SEKV. ID. Č.8), humanizované variabilní oblasti těžkého řetězce VHE (SEKV. ID. Č.9) resp. humanizované variabilní oblasti těžkého řetězce VHQ (SEKV. ID. Č.10). Tyto expresní vektory mají DNA •9 9·· · ·

• 9 (nukleotidovou) sekvenci SEKV. ID NO 15, SEKV. ID NO 16, SEKV. ID NO 17, resp. SEKV. ID NO 18.

Příprava expresních vektorů pro těžký a lehký řetězec humanizované protilátky

Expresní vektory pro lidský lehký řetězec kappa, verze VLh a Vlm.

Pro přípravu konečného expresního vektoru kódujícího úplný humanizovaný lehký řětězec izotypu lidského kappa byly z klonovacích vektorů PCR-Script (Stratagene), obsahujících VLh a VLm (oblast VLm), pomocí HindlII a BglII vyštěpěny fragmenty DNA kódující úplné variabilní oblasti lehkého řetězce. Fragmenty vyčištěné v gelu pak byly překlonovány do restrikčních míst HindlII and BglII expresního vektoru C21-HCMV Kappa připraveného při konstrukci humanizované anti-IgE protilátky TESC-21 (Kolbinger et al 1993) a získaného původně od M. Bendiga (MRC Collaborative Centre, London, UK) (Maeda et al. 1991). Produkty ligace pak byly vyčištěny extrakcí fenolem/chloroformem a elektroporací vneseny do kompetentního bakteriálního kmene Epicurian Coli® XLl-Blue (kat. č. 200228, Stratagene). Po nanesení na misky s LB/amp a přenoční kultuře při 37°C bylo každých 12 kolonií odebráno pro přípravu plasmidové DNA z 3 ml kultury pomocí BioRobot 9600 (Qiagen). Tím byly získány expresní vektory pro lehké řetězce humanizované protilátky verze VLh resp. VLm, jak bude dále uvedeno v obrázcích.

Expresní vektory lidského těžkého řetězce gama-1 pro VHQ

Expresní vektor pro VHQ byl připraven po krocích. Nejprve • ·

- 36 byla pomocí PCR připravena úplná variabilní oblast VHQ, jak je popsáno v Kolbinger et al 1993 (Protein Eng. 1993 Nov; 6(8):971-80), a ta byla poté klonována do expresního vektoru C21-HCMV-gamma-l, ze kterého byl odstraněn inzert C21 pomocí týchž enzymů. Fragment HindlII/BamHI klonu PCRScript VHQ obsahující úplnou variabilní oblast byl poté překlonován do expresního vektoru C21-HCMV-gamma-l štěpeného týmiž enzymy. Byl tak získán konečný expresní vektor pro humanizovanou protilátku verze VHQ.

Expresní vektory lidského těžkého řetězce gama-1 pro VHE

Konečný vektor VHE kódující úplný humanizovaný těžký řetězec izotypu lidského gama-1 byl připraven přímou ligací fragmentu PCR vyštěpeného enzymy HindlII and BamHI kódujícího variabilní oblast do restrikčních míst pro HindlII and BamHI expresního vektoru C21-HCMV gama-1 připraveného při konstrukci humanizované anti-IgE protilátky TESC-21 (Kolbinger et al 1993) také původně získané od M. Bendiga (MRC Collaborative Centre, London, UK) (Maeda et al. 1991).

Přechodná (transientní) exprese v buňkách COS

Pro přisedlé buňky COS byl přijat následující transfekční postup využívající 150 mm kultivační misky a SuperFect™ Transfection Reagent (kat. č. 301305, Qiagen). Čtyři různé expresní vektory popsané výše se použijí pro přechodnou transfekci buněk. K expresi humanizované protilátky je každý z dvou klonů obsahujících inzerty těžkého řetězce (VHE resp. VHQ) společnou transfekci (kotransfekcí) vnesen do buněk spolu s každým ze dvou klonů kódujících lehké řetězce (humVl resp.

• · • · · • · · · · · ·

humV2), což znamená 4 různé kombinace expresních vektorů pro těžké a lehké řetězce (VHE/humVl, VHE/humV2, VHQ/humVl a VHQ/humV2). Před transfekci se plasmidy linearizují restrikční endonukleázou Pvul, která štěpí v oblasti kódující gen pro rezistenci k ampicilínu. Den před transfekci se na 150-mm kultivační misky vyseje 4 χ 10⁶ buněk COS. Po vysetí takového množství buněk se obvykle dosáhne 80% konfluence po 24 hodinách. V den transfekce se čtyři různé kombinace linearizovaných DNA expresních vektorů pro těžké a lehké řetězce (15 pg od každého) rozpustí v celkovém množství 900 μΐ čerstvého média bez séra a antibiotik. 180 μΐ látky SuperFect Transfection Reagent se pak důkladně smíchá s roztokem DNA. Směs DNA se pak inkubuje po dobu 10 min za laboratorní teploty, aby se vytvořily komplexy. Zatímco se tvoří komplexy, z kultur buněk COS se odstraní růstové médium a buňky se jednou promyjí PBS. Poté se do každé zkumavky obsahující transfekční komplexy přidá 9 ml čerstvého kultivačního média (obsahujícího 10% FBS a antibiotika) a směs se dobře promíchá. Konečná směs se ihned přidá do každé ze 4 kultur připravených k transfekci a vše se opatrně promíchá. Buněčné kultury se poté inkubují s komplexy DNA po dobu 3 hodin při 37 °C a 5% CO2. Po inkubaci se médium obsahující transfekční komplexy odstraní a nahradí se 30 ml čerstvého kultivačního média. 48 hodin po transfekci se supernatanty kultur sklidí.

Koncentrace supernatantů z kultur

K analýze pomocí ELISA a FACS se supernatanty kultur buněk COS transfekovaných plasmidy těžkých a lehkých řětězců koncentrují následujícím způsobem. 10 ml každého supernatantu se přidá k Centriprep YM-50 Centrifugal Filter Devices (kat.

č. 4310, Millipore) podle návodu výrobce. Filtry Centriprep se centrifugují po dobu 10 min při 3000 rpm za laboratorní teploty. Centrifugační krok se pak opakuje se zbývajícími 20 ml supernatantu, tentokrát pouze 5 min s kontrolou průběhu koncentrování. Přechodných 500 μΐ koncentrovaného supernatantu se odebere, přenese na čerstvý filtr Microcon Centrifugal Filter Devices (kat. č. 42412, Microcon) a znovu koncentruje podle návodu výrobce. Koncentrované supernatanty se čtyřikrát centrifugují po dobu 24 min při 3000 rpm za laboratorní teploty, jednou po 10 min při 6000 rpm a poté třikrát po dobu 5 min, přičemž se stále kontroluje průběh koncentrování. Konečný objem získaného koncentrovaného upraveného média je 100-120 μΐ, což odpovídá 250 až 300-násobné koncentraci původního kultivačního média, a koncentrované médium se uloží při 4°C do dalšího použití. Pro srovnání a kontrolu se podobným způsobem koncentruje kultivační médium netransfekovaných buněk, s využitím téhož postupu, jenž byl popsán výše.

Příklad 5

Určení exprese rekombinantního lidského IgG pomocí ELISA

K určení koncentrací IgG rekombinantní lidské protilátky exprimované v supernatantech kultur byl vyvinut a optimalizován postup „sandwich ELISA s využitím lidského IgG jako kontroly. Na 96-důlkových mikrotitračních destičkách s plochým dnem (kat. č. 4-39454, Nunc Immunoplate Maxisorp) se přes noc nechá navázat při 4°C 100 μΐ kozího protilidského IgG (celá molekula, kat. č. 11011, SIGMA) v konečné koncentraci

- 39 0.5 pg/ml v PBS. Důlky se poté 3-krát promyjí promývacím pufrem (PBS obsahujícím 0.05% Tween 20) a blokují po dobu 1,5 hod při 37°C blokovacím pufrem (0.5% BSA v PBS). Po 3 promývacích cyklech se vzorky protilátky a standardní lidský IgG (kat.č. 14506, SIGMA) připraví sériovým 1,5-násobným ředěním v blokovacím pufru. 100 μΐ rozpuštěných vzorků nebo standardu se přenese po dvojicích na mističku pokrytou kozím protilidským IgG a inkubuje po dobu 1 hod za laboratorní teploty. Po inkubaci se destičky 3-krát promyjí promývacím pufrem a poté se znovu inkubují po dobu 1 hod se 100 μΐ kozího protilidského IgG lehkého kappa řetězce konjugovaného s křenovou peroxidázou (kat. č. A-7164, SIGMA) rozpuštěného v poměru 1/4000 v blokovacím pufru. Do kontrolních důlků se vnese 100 μΐ blokovacího pufru nebo koncentrovaného normálního kultivačního média. Po promytí se ve vzorcích a standardu provede kolorimetrická kvantifikace vázané peroxidázy pomocí soupravy TMB Peroxidase EIA Substráte Kit (kat. č. 172-1067, Bio-Rad) podle návodu výrobce. Peroxidázová směs se přidá po 100 μΐ do důlků a inkubuje se po dobu 30 min za laboratorní teploty. Kolorimetrická reakce se zastaví přidáním 100 μΐ 1 M kyseliny sírové a absorbance každého důlku se odečte při 450 nm pomocí čteče destiček pro ELISA (Model 3350-UV, BioRad).

Pomocí korelačního koeficientu 0.998 pro standardní křivku IgG jsou určeny koncentrace ve čtyřech různých koncentrátech kultur (cca 250-300-krát koncentrovaných):

supernatant VHE/humVl = 8,26 pg/ml supernatant VHE/humV2 = 6,27 pg/ml supernatant VHQ/humVl = 5,3 pg/ml supernatant VHQ/humV2 = 5,56 pg/ml

- 40 ·· 4 4 4 4

Příklad 6

Kompetiční analýza pomocí FACS (vazebná afinita)

Jako cílové buňky pro FACS analýzu jsou vybrány buňky lidské linie PEER, protože mají povrchově exprimovaný antigen CD45. Pro analýzu vazebné afinity supernatantů humanizované protilátky se provedou kompetiční experimenty využívající chimérickou protilátku s navázaným FITC jako kontrolu a srovnají se s inhibici vyčištěné myší protilátky a chimérické protilátky. Kultury buněk PEER se centrifugují po dobu 10 sekund při 3000 rpm a médium se odstraní. Buňky se resuspendují v pufru pro FACS (PBS obsahující 1% FBS a 0.1% azid sodný) a vysejí se na 96-důlkové mikrotitrační destičky s hustotou buněk lxlO⁵ buněk na důlek. Destička se centrifuguje a supernatant se odstraní. K blokovacím studiím se do každého důlku nejprve přidá 25 μΐ koncentrovaného netransfekovaného média nebo protilátky odpovídajícího izotypu (negativní kontroly), neznačené myší protilátky či chimérické protilátky (pozitivní kontroly), anebo koncentrovaného supernatantu obsahujícího různé kombinace humanizované protilátky (vzorky) o koncentraci uvedené v textu. Po 1 hodině inkubace při 4°C se buňky PEER pomocí centrifugace promyjí 200 μΐ pufru pro FACS. Buňky se poté inkubují 1 hod při 4°C s chimérickou protilátkou konjugovanou s FITC ve 25 μΐ pufru pro FACS v konečné koncentraci 20 pg/ml. Buňky se promyjí a resuspendují v 300 μΐ pufru pro FACS obsahujícím 2 pg/ml propidium jodidů, čímž se oddělí (gating) živé buňky. Buněčné preparáty se analyzují průtokovým cytometrem (FACSCalibur, Becton Dickinson).

Analýza FACS ukazuje, že chimérická protilátka značená fluorochromem je blokována koncentrovanými supernatanty ·* ··· ·

- 41 humanizované protilátky v závislosti na dávce. Žádné blokování závislé na dávce se neprokázalo u kontrolní protilátky odpovídajícího izotypu, takže blokující účinek různých kombinací humanizované protilátky je specifický podle epitopu a tato epitopová specificita zůstává zřejmě po procesu humanizace zachována.

Příklad 7

Biologické aktivity vazebných molekul pro CD45RB/RO

V této protilátka, v kulturách (i) podporuje studii byl zkoumán problém, zda chimérická pokud je přítomná lidských T buněk, s charakteristickým vazebná pro CD45RB/RO, polyklonně aktivovaných diferenciaci T buněk fenotypem Treg, (ii) brání apoptóze po aktivaci T buněk nebo ji podporuje a (iii) ovlivňuje expresi podskupinově specifických antigenů a receptorů po jejich restimulaci.

Chimérická protilátka vazebná pro CD45RB/RO podporuje buněčnou smrt v polyklonálně aktivovaných T buňkách

Primární T buňky (směs T podskupin CD4+ and CD8+) byly aktivovány anti-CD3 plus anti-CD28 mAb (200 ng/ml každá) za přítomnosti či nepřítomnosti (=kontrola) chimérické protilátky vazebné pro CD45RB/RO. Přebytečné protilátky byly odstraněny promytím v den 2. K měření buněčné smrti po aktivaci byl použit 7-amino-aktinomycin D (7-AAD) jako barva pro barvení DNA zachycená apoptotickými a nekrotickými buňkami. Výsledky ukazují, že aktivace T buněk za přítomnosti chimérické protilátky vazebné pro CD45RB/RO zvýšila frakci buněk pozitivních na 7-AAD více než dvakrát v den 2 po aktivaci. V den 7 bylo množství buněk pozitivních na 7-AAD v kultuře vystavené chimérické protilátce a kontrolní kultuře opět podobné.

Chimérická protilátka vazebná pro CD45RB/RO, oproti buňkám vystaveným kontrolnímu mAb, vykazuje fenotyp Treg (T regulátory cell)

Zvýšená exprese CD25 a negativní regulační protein CTLA-4 (CD152) jsou charakteristickými znaky buněk Treg. Funkční potlačení primárních a sekundárních T buněčných odpovědí chimérickou protilátkou vazebnou pro CD45RB/RO může být způsobeno indukcí buněk Treg. K řešení tohoto problému byly T buňky aktivovány monoklonálními protilátkami anti-CD3 + CD28 a kultivovány za přítomnosti chimérické protilátky vazebné pro CD45RB/RO nebo kontrolní mAb anti-LPS. Časový průběh exprese CTLA-4 a CD25 odhaluje výrazné rozdíly mezi kontrolami a T buňkami vystavenými chimérické protilátce vazebné pro CD45RB/RO v den 1 a 3 po sekundární stimulaci, což u těchto buněk naznačuje fenotyp Treg.

Intracelulární exprese CTLA-4 je v přítomnosti chimérické protilátky vazebné pro CD45RB/RO udržena

Bylo zjištěno, že podstatné množství CTLA-4 lze také najít uvnitř buněk. Proto paralelně s povrchovým barvením CTLA-4 byla analyzována intracelulární exprese CTLA-4. V den 4 po stimulaci byly mezi T buněčnými kulturami zjištěny mírné rozdíly. Po delší kultivaci se však vysoké hladiny intracelulárního CTLA-4 udržely jen v T buňkách vystavených

9999 • ·» 99 99 *· · ♦ · · 9 · . ·····<

• 9999 999 * 1 • · · · 9 ₄

999 9999 99 99

- 43 chimérické protilátce vazebné pro CD45RB/RO a ne v kontrolních T buňkách.

T buňky vystavené chimérické protilátce vazebné pro CD45RB/RO se stávají pozitivními současně na CD4 a na CD8

Po stimulaci T buňky indukují a podporují zvýšenou expresi některých povrchových receptorů jako např. CD25, CD152 (CTLA4), CD154 (CD40-Ligand) a dalších. Naproti tomu hladina exprese CD4 nebo CD8 zřejmě zůstává relativně stálá. Opakovaně jsme pozorovali silné zvýšení exprese jak CD4, tak CD8 na T buňkách vystavených po aktivaci chimérické protilátce vazebné pro CD45RB/RO, ale ne na buňkách vystavených kontrolní Ab. T buněčná populace pozitivní současně na CD4 a na CD8 zřejmě vzniká zvýšením exprese CD4 v CD8+ podskupině a naopak, zvýšením exprese CD8 v CD4+ podskupině. Tento výsledek se odlišuje od poměrně nízkého procenta dvojnásobně pozitivních T buněk v kontrolních kulturách.

Vysoká exprese alfa řetězce receptorů pro IL-2, ale velmi nízká exprese beta řetězce T buňkami vystavenými chimérické protilátce vazebné pro CD45RB/RO

Je známo, že buňky Treg jsou konstitutivně pozitivní na CD25, alfa řetězec receptorů pro IL-2. Regulace ostatních podjednotek trimerického receptorů pro IL-2 na buňkách Treg není známa. Nedávno jsme srovnávali expresi beta řetězce receptorů pro IL-2, tj . CD122, na T buňkách aktivovaných a množených za přítomnosti či nepřítomnosti chimérické protilátky vazebné pro CD45RB/RO. Výsledky ukazují, že T buňky vystavené chimérické protilátce vazebné pro CD45RB/RO vykazují asi desetinásobně nižší expresi CD122 než T buňky ·* ··*·

- 44 v kontrolních kulturách. Tento rozdíl může naznačovat, že buňky Treg potřebují k proliferaci jiné faktory než IL-2.

Příklad 8

Sekvence podle předkládaného vynálezu (sekvence CDR podle předkládaného vynálezu jsou podtržené)

SEKV. ID. Č. 1

Část aminokyselinové sekvence chimérického lehkého řetězce

DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIRSSSESISGIPSRF SGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNTWPFTFGSGTKLEIK

SEKV. ID. Č. 2

Část aminokyselinové sekvence chimérického těžkého řetězce

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYIIHWVKQEPGQGLEWIGYFNPYNHGTKYNE KFKGRATIjTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAI YYCARSGPYAWFDTWGQGTTVTVSS

SEKV. ID. Č. 3

Aminokyselinová sekvence chimérického lehkého řetězce

DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIRSSSESISGIPSRF

SGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNTWPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ

LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEKV. ID. Č. 4

Aminokyselinová sekvence chimérického těžkého řetězce ····

- 45 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYIIHWVKQEPGQGLEWIGYFNPYNHGTKYNE

KFKGRATLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCARSGPYAWFDTWGQGTTVTVSSASTKGP

SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK

SEKV. ID. C. 5

Nukleotidová sekvence kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 1

GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTT

CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAGAACAAATG

GTTCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTT

AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATAT

TGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGC

TTGAAATCAAA

SEKV. ID. Č. 6

Nukleotidová sekvence kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 2

GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTC

CTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTG

GTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAG

AAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGGACCT

CAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGATCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCT

GGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEKV. ID. Č. 7

Část aminokyselinové sekvence humanizovaného lehkého řetězce označená jako humV2 (humV2 = VLm)

DILLTQSPAT LSLSPGERAT FSCRASQNIG TSIQWYQQKT NGAPRLLIRS

SSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SNTWPFTFGQ GTKLEIK »· • · ·

- 46 SEKV. ID. Č. 8

Část aminokyselinové sekvence humanizovaného lehkého řetězce označená jako humVl (humVl = VLh)

DILLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQNIG TSIQWYQQKP GQAPRLLIRS

SSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SNTWPFTFGQ GTKLEIK

SEKV. ID. Č. 9

Část aminokyselinové sekvence humanizovaného těžkého řetězce označená jako VHE

EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYIIHWVKQE PGQGLEWIGY

FNPYNHGTKY NEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSG

PYAWFDTWGQ GTTVTVSS

SEKV. ID. Č. 10

Část aminokyselinové sekvence humanizovaného těžkého řetězce označená jako VHQ

QVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYIIHWVKQE PGQGLEWIGY

FNPYNHGTKY NEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSG

PYAWFDTWGQ GTTVTVSS

SEKV. ID. Č. 11

Nukleotidová sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 9

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGTVAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTC

CTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTG

GTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAG

AAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCT

CAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCT

GGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEKV. ID. Č. 12

Nukleotidová sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 10 * * · ··

- 47 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTC

CTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTG

GTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAG

AAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCT

CAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCT

GGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEKV. ID. Č. 13

Nukleotidová sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 7

GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCACTTT

CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAAACAAATG

GTGCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTT

AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTT

TGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGC

TGGAGATCAAA

SEKV. ID. Č. 14

Nukleotidová sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 8

GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCACTCT

CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAACCAGGTC

AGGCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTT

AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTT

TGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGC

TGGAGATCAAA

SEKV. ID. Č. 15

Nukleotidová sekvence expresního vektoru HCMV-G1 HuAb-VHQ (úplná sekvence DNA expresního vektoru pro humanizovaný těžký řetězec obsahující SEKV. ID. Č. 12 (VHQ) od 3921-4274)

AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG 51 GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA 101 TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC 151 GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG 201 CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG

• •4 4

>4 • * « 4 « · 4 4 • 4 944 •4 4 «· • >4 »

44

251

301

351

401

451

501

551

601

651

701

751

801

851

901

951

1001

1051

1101

1151

1201

1251

1301

1351

1401

1451

1501

1551

1601

1651

1701

1751

1801

1851

1901

1951

2001

2051

2101

2151

2201

2251

2301

2351

2401

2451

2501

2551

2601

AGATGCATGC

ACACCCTAAC

ACGGTGAAAA

CTGTAAGCGG

TGTTGGCGGG

GAGTGTATAC

TGCACCATAT

CGCATCAGGC

CGTTCGGCTG

TATCCACAGA

CAGCAAAAGG

TAGGCTCCGC

GGTGGCGAAA

AGCTCCCTCG

GTCCGCCTTT

GTAGGTATCT

CACGAACCCC

TCTTGAGTCC

CTGGTAACAG

TTGAAGTGGT

CTGCGCTCTG

GATCCGGCAA

CAGCAGATTA

TTCTACGGGG

TGGTCATGAG

AAATGAAGTT

CAGTTACCAA

TTCGTTCATC

CGGGAGGGCT

ACGCTCACCG

CCGAGCGCAG

AATTGTTGCC

CAACGTTGTT

GTATGGCTTC

TCCCCCATGT

TGTCAGAAGT

TGCATAATTC

GGTGAGTACT

TTGCTCTTGC

CTTTAAAAGT

AGGATCTTAC

CAACTGATCT

AAACAGGAAG

TGTTGAATAC

GGGTTATTGT

AACAAATAGG

TAAGAAACCA

GAGGCCCTTT

TTTGCATACT

TGACACACAT

CCTCTGACAC

ATGCCGGGAG

TGTCGGGGCG

TGGCTTAACT

GCGGTGTGAA

GCTCTTCCGC

CGGCGAGCGG

ATCAGGGGAT

CCAGGAACCG

CCCCCTGACG

CCCGACAGGA

TGCGCTCTCC

CTCCCTTCGG

CAGTTCGGTG

CCGTTCAGCC

AACCCGGTAA

GATTAGCAGA

GGCCTAACTA

CTGAAGCCAG

ACAAACCACC

CGCGCAGAAA

TCTGACGCTC

ATTATCAAAA

TTAAATCAAT

TGCTTAATCA

CATAGTTGCC

TACCATCTGG

GCTCCAGATT

AAGTGGTCCT

GGGAAGCTAG

GCCATTGCTG

ATTCAGCTCC

TGTGCAAAAA

AAGTTGGCCG

TCTTACTGTC

CAACCAAGTC

CCGGCGTCAA

GCTCATCATT

CGCTGTTGAG

TCAGCATCTT

GCAAAATGCC

TCATACTCTT

CTCATGAGCG

GGTTCCGCGC

TTATTATCAT

CGTCTTCAAG

TCTGCCTGCT

TCCACAGCTG

ATGCAGCTCC

CAGACAAGCC

CAGCCATGAC

ATGCGGCATC

ATACCGCACA

TTCCTCGCTC

TATCAGCTCA

AACGCAGGAA

TAAAAAGGCC

AGCATCACAA

CTATAAAGAT

TGTTCCGACC

GAAGCGTGGC

TAGGTCGTTC

CGACCGCTGC

GACACGACTT

GCGAGGTATG

CGGCTACACT

TTACCTTCGG

GCTGGTAGCG

AAAAGGATCT

AGTGGAACGA

AGGATCTTCA

CTAAAGTATA

GTGAGGCACC

TGACTCCCCG

CCCCAGTGCT

TATCAGCAAT

GCAACTTTAT

AGTAAGTAGT

CAGGCATCGT

GGTTCCCAAC

AGCGGTTAGC

CAGTGTTATC

ATGCCATCCG

ATTCTGAGAA

CACGGGATAA

GGAAAACGTT

ATCCAGTTCG

TTACTTTCAC

GCAAAAAAGG

CCTTTTTCAA

GATACATATT

ACATTTCCCC

GACATTAACC

AATTCAGCTT

GGGGAGCCTG CCTCGCGCGT CGGAGACGGT CGTCAGGGCG CCAGTCACGT AGAGCAGATT GATGCGTAAG ACTGACTCGC CTCAAAGGCG AGAACATGTG GCGTTGCTGG AAATCGACGC ACCAGGCGTT CTGCCGCTTA GCTTTCTCAT GCTCCAAGCT GCCTTATCCG ATCGCCACTG TAGGCGGTGC AGAAGGACAG AAAAAGAGTT GTGGTTTTTT CAAGAAGATC AAACTCACGT CCTAGATCCT TATGAGTAAA TATCTCAGCG TCGTGTAGAT GCAATGATAC AAACCAGCCA CCGCCTCCAT TCGCCAGTTA GGTGTCACGC GATCAAGGCG TCCTTCGGTC ACTCATGGTT TAAGATGCTT TAGTGTATGC TACCGCGCCA CTTCGGGGCG ATGTAACCCA CAGCGTTTCT GAATAAGGGC TATTATTGAA TGAATGTATT GAAAAGTGCC ΤΆΤΆΆΑΑΑΤΑ GGCTGCAGTG

GGGACTTTCC

TTCGGTGATG

CACAGCTTGT

CGTCAGCGGG

AGCGATAGCG

GTACTGAGAG

GAGAAAATAC

TGCGCTCGGT

GTAATACGGT

AGCAAAAGGC

CGTTTTTCCA

TCAAGTCAGA

TCCCCCTGGA

CCGGATACCT

AGCTCACGCT

GGGCTGTGTG

GTAACTATCG

GCAGCAGCCA

TACAGAGTTC

TATTTGGTAT

GGTAGCTCTT

TGTTTGCAAG

CTTTGATCTT

TAAGGGATTT

TTTAAATTAA

CTTGGTCTGA

ATCTGTCTAT

AACTACGATA

CGCGAGACCC

GCCGGAAGGG

CCAGTCTATT

ATAGTTTGCG

TCGTCGTTTG

AGTTACATGA

CTCCGATCGT

ATGGCAGCAC

TTCTGTGACT

GGCGACCGAG

CATAGCAGAA

AAAACTCTCA

CTCGTGCACC

GGGTGAGCAA

GACACGGAAA

GCATTTATCA

TAGAAAAATA

ACCTGACGTC

GGCGTATCAC

AATAATAAAA ♦♦ ·*4·

- 49 • ·· ·* ·· ·« · · · 4 · * * · · » · · • · · · 4 ««« • · · · ·

2651 TGTGTGTTTG TCCGAAATAC GCGTTTTGAG ATTTCTGTCG CCGACTAAAT 2701 TCATGTCGCG CGATAGTGGT GTTTATCGCC GATAGAGATG GCGATATTGG 2751 AAAAATCGAT ATTTGAAAAT ATGGCATATT GAAAATGTCG CCGATGTGAG 2801 TTTCTGTGTA ACTGATATCG CCATTTTTCC AAAAGTGATT TTTGGGCATA 2851 CGCGATATCT GGCGATAGCG CTTATATCGT TTACGGGGGA TGGCGATAGA 2901 CGACTTTGGT GACTTGGGCG ATTCTGTGTG TCGCAAATAT CGCAGTTTCG 2951 ATATAGGTGA CAGACGATAT GAGGCTATAT CGCCGATAGA GGCGACATCA 3001 AGCTGGCACA TGGCCAATGC ATATCGATCT ATACATTGAA TCAATATTGG 3051 CCATTAGCCA TATTATTCAT TGGTTATATA GCATAAATCA ATATTGGCTA 3101 TTGGCCATTG CATACGTTGT ATCCATATCA TAATATGTAC ATTTATATTG 3151 GCTCATGTCC AACATTACCG CCATGTTGAC ATTGATTATT GACTAGTTAT 3201 TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT 3251 CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG 3301 ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA 3351 ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC 3401 CCACTTGGCA GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG 3451 ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC 3501 TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT 3551 TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT GGATAGCGGT 3601 TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 3651 TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC 3701 CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA 3751 TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA 3801 CGCTGTTTTG ACCTCCATAG AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCAA 3851 GCTTGCCGCC ACCATGGACT GGACCTGGAG GGTGTTCTGC CTGCTGGCCG 3901 TGGCCCCCGG CGCCCACAGC CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC AGGAGCCGAA 3951 GTGAAAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGGTG TCCTGCAAGG CCTCTGGATA 4001 CACATTCACT AATTATATTA TCCACTGGGT GAAGCAGGAG CCTGGTCAGG 4051 GCCTTGAATG GATTGGATAT TTTAATCCTT ACAATCATGG TACTAAGTAC 4101 AATGAGAAGT TCAAAGGCAG GGCCACACTA ACTGCAAACA AATCCATCAG 4151 CACAGCCTAC ATGGAGCTCA GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACTGCGGTCT 4201 ACTACTGTGC AAGATCAGGA CCCTATGCCT GGTTTGACAC CTGGGGCCAA 4251 GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGAG TTCTAGAAGG ATCCCAAGCT 4301 AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG 4351 GCTAAGGTGA GGCAGGTGGC GCCAGCCAGG TGCACACCCA ATGCCCATGA 4401 GCCCAGACAC TGGACGCTGA ACCTCGCGGA CAGTTAAGAA CCCAGGGGCC 4451 TCTGCGCCCT GGGCCCAGCT CTGTCCCACA CCGCGGTCAC ATGGCACCAC 4501 CTCTCTTGCA GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT 4551 CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG 4601 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC 4651 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT 4701 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 4751 TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAA 4801 AGTTGGTGAG AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG 4851 CTCAGCGCTC CTGCCTGGAC GCATCCCGGC TATGCAGCCC CAGTCCAGGG 4901 CAGCAAGGCA GGCCCCGTCT GCCTCTTCAC CCGGAGGCCT CTGCCCGCCC 4951 CACTCATGCT CAGGGAGAGG GTCTTCTGGC TTTTTCCCCA GGCTCTGGGC 5001 AGGCACAGGC TAGGTGCCCC TAACCCAGGC CCTGCACACA AAGGGGCAGG

999 • 9

- 50 • 9 • · ·

* 999η • 9 • 9

9 • 9 • 9 «9

999

9

9 9

9

9 9

99

99

5051 TGCTGGGCTC AGACCTGCCA AGAGCCATAT CCGGGAGGAC CCTGCCCCTG 5101 ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC CACTCCCTCA GCTCGGACAC 5151 CTTCTCTCCT CCCAGATTCC AGTAACTCCC AATCTTCTCT CTGCAGAGCC 5201 CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GGTAAGCCAG 5251 CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC 5301 TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT 5351 CTTCCTCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC 5401 CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG 5451 CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT 5501 ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG 5551 CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA 5601 GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC 5651 TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG TGGGACCCGT 5701 GGGGTGCGAG GGCCACATGG ACAGAGGCCG GCTCGGCCCA CCCTCTGCCC 5751 TGAGAGTGAC CGCTGTACCA ACCTCTGTCC CTACAGGGCA GCCCCGAGAA 5801 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA 5851 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG 5901 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT 5951 CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT 6001 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC 6051 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG 6101 GGTAAATGAG TGCGACGGCC GGCAAGCCCC CGCTCCCCGG GCTCTCGCGG 6151 TCGCACGAGG ATGCTTGGCA CGTACCCCCT GTACATACTT CCCGGGCGCC 6201 CAGCATGGAA ATAAAGCACC CAGCGCTGCC CTGGGCCCCT GCGAGACTGT 6251 GATGGTTCTT TCCACGGGTC AGGCCGAGTC TGAGGCCTGA GTGGCATGAG 6301 ATCTGATATC ATCGATGAAT TCGAGCTCGG TACCCGGGGA TCGATCCAGA 6351 CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT 6401 GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA 6451 ACCATTATAA GCTGCAATAA ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT 6501 TATGTTTCAG GTTCAGGGGG AGGTGTGGGA GGTTTTTTAA AGCAAGTAAA 6551 ACCTCTACAA ATGTGGTATG GCTGATTATG ATCTCTAGTC AAGGCACTAT 6601 ACATCAAATA TTCCTTATTA ACCCCTTTAC AAATTAAAAA GCTAAAGGTA 6651 CACAATTTTT GAGCATAGTT ATTAATAGCA GACACTCTAT GCCTGTGTGG 6701 AGTAAGAAAA AACAGTATGT TATGATTATA ACTGTTATGC CTACTTATAA 6751 AGGTTACAGA ATATTTTTCC ATAATTTTCT TGTATAGCAG TGCAGCTTTT 6801 TCCTTTGTGG TGTAAATAGC AAAGCAAGCA AGAGTTCTAT TACTAAACAC 6851 AGCATGACTC AAAAAACTTA GCAATTCTGA AGGAAAGTCC TTGGGGTCTT 6901 CTACCTTTCT CTTCTTTTTT GGAGGAGTAG AATGTTGAGA GTCAGCAGTA 6951 GCCTCATCAT CACTAGATGG CATTTCTTCT GAGCAAAACA GGTTTTCCTC 7001 ATTAAAGGCA TTCCACCACT GCTCCCATTC ATCAGTTCCA TAGGTTGGAA 7051 TCTAAAATAC ACAAACAATT AGAATCAGTA GTTTAACACA TTATACACTT 7101 AAAAATTTTA TATTTACCTT AGAGCTTTAA ATCTCTGTAG GTAGTTTGTC 7151 CAATTATGTC ACACCACAGA AGTAAGGTTC CTTCACAAAG ATCCGGGACC 7201 AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC AGTTCGGGGG CATGGATGCG 7251 CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC GACGGATTTG CACTGCCGGT 7301 AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC AGCAGCTGAA CCAACTCGCG 7351 AGGGGATCGA GCCCGGGGTG GGCGAAGAAC TCCAGCATGA GATCCCCGCG 7401 CTGGAGGATC ATCCAGCCGG CGTCCCGGAA AACGATTCCG AAGCCCAACC • · · · ······ · • · ·· · · · · ··· ···· ·· ·· ·· «·

7451 TTTCATAGAA GGCGGCGGTG GAATCGAAAT CTCGTGATGG CAGGTTGGGC 7501 GTCGCTTGGT CGGTCATTTC GAACCCCAGA GTCCCGCTCA GAAGAACTCG 7551 TCAAGAAGGC GATAGAAGGC GATGCGCTGC GAATCGGGAG CGGCGATACC 7601 GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC TCTTCAGCAA 7651 TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTCCTGAT AGCGGTCCGC CACACCCAGC 7701 CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA CCATGATATT 7751 CGGCAAGCAG GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG CCGTCGGGCA 7801 TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG AACAGTTCGG CTGGCGCGAG CCCCTGATGC 7851 TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA CCGGCTTCCA TCCGAGTACG 7901 TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG CAGGTAGCCG 7951 GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC 8001 TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC 8051 CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG 8101 CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC 8151 TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG 8201 GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG 8251 TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA 8301 GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC 8351 TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA 8401 AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC 8451 GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC 8501 TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC 8551 TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT 8601 CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA 8651 GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCT

SEKV. ID. Č. 16

Nukleotidová sekvence expresního vektoru HCMV-G1 HuAb-VHE (úplná sekvence DNA expresního vektoru pro humanizovaný těžký řetězec obsahující SEKV. ID. Č. 11 (VHE) od 3921-4274)

AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG 51 GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA 101 TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC 151 GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG 201 CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG 251 AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC 301 ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG 351 ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT 401 CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG 451 TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG 501 GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG 551 TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC 601 CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT • ···· ·· · • · · · · ·· · • ·· ······ · · • · · · ····

651 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT 701 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC 751 CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA 801 TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA 851 GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA 901 AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT 951 GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT

1001 GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG 1051 CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG 1101 TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA 1151 CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC 1201 TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT 1251 CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT 1301 GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG 1351 CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT 1401 TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT 1451 TGGTCATGAG AT TAT C AAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA 1501 AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA 1551 CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT 1601 TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA 1651 CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC 1701 ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG 1751 CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT 1801 AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG 1851 CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG 1901 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA 1951 TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT 2001 TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC 2051 TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT 2101 GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG 2151 TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA 2201 CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA 2251 AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC 2301 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA 2351 AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA 2401 TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA 2451 GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA 2501 AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC 2551 TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC 2601 GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCAGCTT GGCTGCAGTG AATAATAAAA 2651 TGTGTGTTTG TCCGAAATAC GCGTTTTGAG ATTTCTGTCG CCGACTAAAT 2701 TCATGTCGCG CGATAGTGGT GTTTATCGCC GATAGAGATG GCGATATTGG 2751 AAAAATCGAT ATTTGAAAAT ATGGCATATT GAAAATGTCG CCGATGTGAG 2801 TTTCTGTGTA ACTGATATCG CCATTTTTCC AAAAGTGATT TTTGGGCATA 2851 CGCGATATCT GGCGATAGCG CTTATATCGT TTACGGGGGA TGGCGATAGA 2901 CGACTTTGGT GACTTGGGCG ATTCTGTGTG TCGCAAATAT CGCAGTTTCG 2951 ATATAGGTGA CAGACGATAT GAGGCTATAT CGCCGATAGA GGCGACATCA 3001 AGCTGGCACA TGGCCAATGC ATATCGATCT ATACATTGAA TCAATATTGG • · · ······ · · • · · β ····

3051 CCATTAGCCA TATTATTCAT TGGTTATATA GCATAAATCA ATATTGGCTA 3101 TTGGCCATTG CATACGTTGT ATCCATATCA TAATATGTAC ATTTATATTG 3151 GCTCATGTCC AACATTACCG CCATGTTGAC ATTGATTATT GACTAGTTAT 3201 TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT 3251 CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG 3301 ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA 3351 ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC 3401 CCACTTGGCA GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG 3451 ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC 3501 TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT 3551 TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT GGATAGCGGT 3601 TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 3651 TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC 3701 CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA 3751 TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA 3801 CGCTGTTTTG ACCTCCATAG AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCAA 3851 GCTTGCCGCC ACCATGGACT GGACCTGGAG GGTGTTCTGC CTGCTGGCCG 3901 TGGCCCCCGG CGCCCACAGC GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC AGGAGCCGAA 3951 GTGAAAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGGTG TCCTGCAAGG CCTCTGGATA 4001 CACATTCACT AATTATATTA TCCACTGGGT GAAGCAGGAG CCTGGTCAGG 4051 GCCTTGAATG GATTGGATAT TTTAATCCTT ACAATCATGG TACTAAGTAC 4101 AATGAGAAGT TCAAAGGCAG GGCCACACTA ACTGCAAACA AATCCATCAG 4151 CACAGCCTAC ATGGAGCTCA GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACTGCGGTCT 4201 ACTACTGTGC AAGATCAGGA CCCTATGCCT GGTTTGACAC CTGGGGCCAA 4251 GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGAG TTCTAGAAGG ATCCCAAGCT 4301 AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG 4351 GCTAAGGTGA GGCAGGTGGC GCCAGCCAGG TGCACACCCA ATGCCCATGA 4401 GCCCAGACAC TGGACGCTGA ACCTCGCGGA CAGTTAAGAA CCCAGGGGCC 4451 TCTGCGCCCT GGGCCCAGCT CTGTCCCACA CCGCGGTCAC ATGGCACCAC 4501 CTCTCTTGCA GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT 4551 CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG 4601 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC 4651 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT 4701 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 4751 TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAA 4801 AGTTGGTGAG AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG 4851 CTCAGCGCTC CTGCCTGGAC GCATCCCGGC TATGCAGCCC CAGTCCAGGG 4901 CAGCAAGGCA GGCCCCGTCT GCCTCTTCAC CCGGAGGCCT CTGCCCGCCC 4951 CACTCATGCT CAGGGAGAGG GTCTTCTGGC TTTTTCCCCA GGCTCTGGGC 5001 AGGCACAGGC TAGGTGCCCC TAACCCAGGC CCTGCACACA AAGGGGCAGG 5051 TGCTGGGCTC AGACCTGCCA AGAGCCATAT CCGGGAGGAC CCTGCCCCTG 5101 ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC CACTCCCTCA GCTCGGACAC 5151 CTTCTCTCCT CCCAGATTCC AGTAACTCCC AATCTTCTCT CTGCAGAGCC 5201 CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GGTAAGCCAG 5251 CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC 5301 TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT 5351 CTTCCTCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC 5401 CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG

- 54 φ · · · φφ φφφφ φφ φφφφ φφ · • φφφφ · φ φ φ φφ φφφφφφ φ φ • · φ φ ΦΦΦ·

5451 CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT 5501 ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG 5551 CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA 5601 GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC 5651 TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG TGGGACCCGT 5701 GGGGTGCGAG GGCCACATGG ACAGAGGCCG GCTCGGCCCA CCCTCTGCCC 5751 TGAGAGTGAC CGCTGTACCA ACCTCTGTCC CTACAGGGCA GCCCCGAGAA 5801 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA 5851 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG 5901 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT 5951 CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT 6001 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC 6051 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG 6101 GGTAAATGAG TGCGACGGCC GGCAAGCCCC CGCTCCCCGG GCTCTCGCGG 6151 TCGCACGAGG ATGCTTGGCA CGTACCCCCT GTACATACTT CCCGGGCGCC 6201 CAGCATGGAA ATAAAGCACC CAGCGCTGCC CTGGGCCCCT GCGAGACTGT 6251 GATGGTTCTT TCCACGGGTC AGGCCGAGTC TGAGGCCTGA GTGGCATGAG 6301 ATCTGATATC ATCGATGAAT TCGAGCTCGG TACCCGGGGA TCGATCCAGA 6351 CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT 6401 GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA 6451 ACCATTATAA GCTGCAATAA ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT 6501 TATGTTTCAG GTTCAGGGGG AGGTGTGGGA GGTTTTTTAA AGCAAGTAAA 6551 ACCTCTACAA ATGTGGTATG GCTGATTATG ATCTCTAGTC AAGGCACTAT 6601 ACATCAAATA TTCCTTATTA ACCCCTTTAC ΑΑΑΤΤΑΑΑΑΑ GCTAAAGGTA 6651 CACAATTTTT GAGCATAGTT ATTAATAGCA GACACTCTAT GCCTGTGTGG 6701 AGTAAGAAAA AACAGTATGT TATGATTATA ACTGTTATGC CTACTTATAA 6751 AGGTTACAGA ATATTTTTCC ATAATTTTCT TGTATAGCAG TGCAGCTTTT 6801 TCCTTTGTGG TGTAAATAGC AAAGCAAGCA AGAGTTCTAT TACTAAACAC 6851 AGCATGACTC AAAAAACTTA GCAATTCTGA AGGAAAGTCC TTGGGGTCTT 6901 CTACCTTTCT CTTCTTTTTT GGAGGAGTAG AATGTTGAGA GTCAGCAGTA 6951 GCCTCATCAT CACTAGATGG CATTTCTTCT GAGCAAAACA GGTTTTCCTC 7001 ATTAAAGGCA TTCCACCACT GCTCCCATTC ATCAGTTCCA TAGGTTGGAA 7051 TCTAAAATAC ACAAACAATT AGAATCAGTA GTTTAACACA TTATACACTT 7101 ΑΑΑΑΑΤΤΤΤΑ TATTTACCTT AGAGCTTTAA ATCTCTGTAG GTAGTTTGTC 7151 CAATTATGTC ACACCACAGA AGTAAGGTTC CTTCACAAAG ATCCGGGACC 7201 AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC AGTTCGGGGG CATGGATGCG 7251 CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC GACGGATTTG CACTGCCGGT 7301 AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC AGCAGCTGAA CCAACTCGCG 7351 AGGGGATCGA GCCCGGGGTG GGCGAAGAAC TCCAGCATGA GATCCCCGCG 7401 CTGGAGGATC ATCCAGCCGG CGTCCCGGAA AACGATTCCG AAGCCCAACC 7451 TTTCATAGAA GGCGGCGGTG GAATCGAAAT CTCGTGATGG CAGGTTGGGC 7501 GTCGCTTGGT CGGTCATTTC GAACCCCAGA GTCCCGCTCA GAAGAACTCG 7551 TCAAGAAGGC GATÁGAAGGC GATGCGCTGC GAATCGGGAG CGGCGATACC 7601 GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC TCTTCAGCAA 7651 TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTCCTGAT AGCGGTCCGC CACACCCAGC 7701 CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA CCATGATATT 7751 CGGCAAGCAG GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG CCGTCGGGCA 7801 TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG AACAGTTCGG CTGGCGCGAG CCCCTGATGC • f ·» · · ······ • · · · · · · · ·· · • «······· • · · · ······ · · • · ·· · ···· ··· ···· ·· ·· ·· ··

7851 TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA CCGGCTTCCA TCCGAGTACG 7901 TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG CAGGTAGCCG 7951 GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC 8001 TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC 8051 CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG 8101 CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC 8151 TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG 8201 GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG 8251 TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA 8301 GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC 8351 TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA 8401 AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC 8451 GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC 8501 TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC 8551 TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT 8601 CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA 8651 GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCT

SEKV. ID. Č. 17

Nukleotidová sekvence expresního vektoru HCMV-K HuAb-VLl humVl (úplná sekvence DNA expresního vektoru pro humanizovaný lehký řetězec obsahující SEKV. ID

1	CTAGCTTTTT	GCAAAAGCCT
51	TGGAATAGCT	CAGAGGCCGA
101	AATTAGTCAG	CCATGGGGCG
151	GCGGGATGGG	CGGAGTTAGG
201	TGCATGCTTT	GCATACTTCT
251	TGAGATGCAT	GCTTTGCATA
301	CCACACCCTA	ACTGACACAC
351	TGACGGTGAA	AACCTCTGAC
401	GTCTGTAAGC	GGATGCCGGG
451	GGTGTTGGCG	GGTGTCGGGG
501	CGGAGTGTAT	ACTGGCTTAA
551	AGTGCACCAT	ATGCGGTGTG
601	ACCGCATCAG	GCGCTCTTCC
651	GTCGTTCGGC	TGCGGCGAGC
701	GTTATCCACA	GAATCAGGGG
751	GCCAGCAAAA	GGCCAGGAAC
801	CATAGGCTCC	GCCCCCCTGA
851	GAGGTGGCGA	AACCCGACAG
901	GAAGCTCCCT	CGTGCGCTCT
951	CTGTCCGCCT	TTCTCCCTTC
1001	CTGTAGGTAT	CTCAGTTCGG
1051	TGCACGAACC	CCCCGTTCAG

C. 14 (humVl=Vlh) od 3964-4284)

AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA GCCTGCTGGG GAGCCTGGTT GCTGACTAAT CTTCTGCCTG CTGGGGAGCC TGGGGACTTT ATTCCACAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA ACATGCAGCT CCCGGAGACG GTCACAGCTT AGCAGACAAG CCCGTCAGGG CGCGTCAGCG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT φφφφ

- 56 * · · φφφφφφ φ φ φ · · φ φφφφ

1101 CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC 1151 CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT 1201 TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC AGTATTTGGT 1251 ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC 1301 TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA 1351 AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC 1401 TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT 1451 TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT 1501 AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT 1551 GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT 1601 ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA 1651 TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC 1701 CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG 1751 GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA 1801 TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG 1851 CGCAACGTTG TTGCCATTGC TGCAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT 1901 TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT 1951 GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC 2001 GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC 2051 ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA 2101 CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG 2151 AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AACACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG 2201 AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT 2251 CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA 2301 CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC 2351 AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA 2401 AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT 2451 CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA 2501 TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG 2551 TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA CCTATAAAAA TAGGCGTATC 2601 ACGAGGCCCT TTCGTCTTCA AGAATTCAGC TTGGCTGCAG TGAATAATAA 2651 AATGTGTGTT TGTCCGAAAT ACGCGTTTTG AGATTTCTGT CGCCGACTAA 2701 ATTCATGTCG CGCGATAGTG GTGTTTATCG CCGATAGAGA TGGCGATATT 2751 GGAAAAATCG ATATTTGAAA ATATGGCATA TTGAAAATGT CGCCGATGTG 2801 AGTTTCTGTG TAACTGATAT CGCCATTTTT CCAAAAGTGA TTTTTGGGCA 2851 TACGCGATAT CTGGCGATAG CGCTTATATC GTTTACGGGG GATGGCGATA 2901 GACGACTTTG GTGACTTGGG CGATTCTGTG TGTCGCAAAT ATCGCAGTTT 2951 CGATATAGGT GACAGACGAT ATGAGGCTAT ATCGCCGATA GAGGCGACAT 3001 CAAGCTGGCA CATGGCCAAT GCATATCGAT CTATACATTG AATCAATATT 3051 GGCCATTAGC CATATTATTC ATTGGTTATA TAGCATAAAT CAATATTGGC 3101 TATTGGCCAT TGCATACGTT GTATCCATAT CATAATATGT ACATTTATAT 3151 TGGCTCATGT CCAACATTAC CGCCATGTTG ACATTGATTA TTGACTAGTT 3201 ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG 3251 TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCT GACCGCCCAA 3301 CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC 3351 CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT 3401 GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT 3451 TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA • · · · • ·

- 57 3501 CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT 3551 ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ATCAATGGGC GTGGATAGCG 3601 GTTTGACTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA 3651 GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC 3701 TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA 3751 TATAAGCAGA GCTCGTTTAG TGAACCGTCA GATCGCCTGG AGACGCCATC 3801 CACGCTGTTT TGACCTCCAT AGAAGACACC GGGACCGATC CAGCCTCCGC 3851 AAGCTTGATA TCGAATTCCT GCAGCCCGGG GGATCCGCCC GCTTGCCGCC 3901 ACCATGGAGA CCCCCGCCCA GCTGCTGTTC CTGCTGCTGC TGTGGCTGCC 3951 CGACACCACC GGCGACATTC TGCTGACCCA GTCTCCAGCC ACCCTGTCTC 4001 TGAGTCCAGG AGAAAGAGCC ACTCTCTCCT GCAGGGCCAG TCAGAACATT 4051 GGCACAAGCA TACAGTGGTA TCAACAAAAA CCAGGTCAGG CTCCAAGGCT 4101 TCTCATAAGG TCTTCTTCTG AGTCTATCTC TGGGATQCCT TCCAGGTTTA 4151 GTGGCAGTGG ATCAGGGACA GATTTTACTC TTACCATCAG CAGTCTGGAG 4201 CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAA CAAAGTAATA CCTGGCCATT 4251 CACGTTCGGC CAGGGGACCA AGCTGGAGAT CAAACGTGAG TATTCTAGAA 4301 AGATCCTAGA ATTCTAAACT CTGAGGGGGT CGGATGACGT GGCCATTCTT 4351 TGCCTAAAGC ATTGAGTTTA CTGCAAGGTC AGAAAAGCAT GCAAAGCCCT 4401 CAGAATGGCT GCAAAGAGCT CCAACAAAAC AATTTAGAAC TTTATTAAGG 4451 AATAGGGGGA AGCTAGGAAG AAACTCAAAA CATCAAGATT TTAAATACGC 4501 TTCTTGGTCT CCTTGCTATA ATTATCTGGG ATAAGCATGC TGTTTTCTGT 4551 CTGTCCCTAA CATGCCCTGT GATTATCCGC AAACAACACA CCCAAGGGCA 4601 GAACTTTGTT ACTTAAACAC CATCCTGTTT GCTTCTTTCC TCAGGAACTG 4651 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 4701 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 4751 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 4801 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 4851 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 4901 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 4951 ACAGGGGAGA GTGTTAGAGG GAGAAGTGCC CCCACCTGCT CCTCAGTTCC 5001 AGCCTGACCC CCTCCCATCC TTTGGCCTCT GACCCTTTTT CCACAGGGGA 5051 CCTACCCCTA TTGCGGTCCT CCAGCTCATC TTTCACCTCA CCCCCCTCCT 5101 CCTCCTTGGC TTTAATTATG CTAATGTTGG AGGAGAATGA ATAAATAAAG 5151 TGAATCTTTG CACCTGTGGT TTCTCTCTTT CCTCATTTAA TAATTATTAT 5201 CTGTTGTTTA CCAACTACTC AATTTCTCTT ATAAGGGACT AAATATGTAG 5251 TCATCCTAAG GCGCATAACC ATTTATAAAA ATCATCCTTC ATTCTATTTT 5301 ACCCTATCAT CCTCTGCAAG ACAGTCCTCC CTCAAACCCA CAAGCCTTCT 5351 GTCCTCACAG TCCCCTGGGC CATGGTAGGA GAGACTTGCT TCCTTGTTTT 5401 CCCCTCCTCA GCAAGCCCTC ATAGTCCTTT TTAAGGGTGA CAGGTCTTAC 5451 AGTCATATAT CCTTTGATTC AATTCCCTGA GAATCAACCA AAGCAAATTT 5501 TTCAAAAGAA GAAACCTGCT ATAAAGAGAA TCATTCATTG CAACATGATA 5551 TAAAATAACA ACACAATAAA AGCAATTAAA TAAACAAACA ATAGGGAAAT 5601 GTTTAAGTTC ATCATGGTAC TTAGACTTAA TGGAATGTCA TGCCTTATTT 5651 ACATTTTTAA ACAGGTACTG AGGGACTCCT GTCTGCCAAG GGCCGTATTG 5701 AGTACTTTCC ACAACCTAAT TTAATCCACA CTATACTGTG AGATTAAAAA 5751 CATTCATTAA AATGTTGCAA AGGTTCTATA AAGCTGAGAG ACAAATATAT 5801 TCTATAACTC AGCAATCCCA CTTCTAGATG ACTGAGTGTC CCCACCCACC 5851 AAAAAACTAT GCAAGAATGT TCAAAGCAGC TTTATTTACA AAAGCCAAAA

5901 ATTGGAAATA GCCCGATTGT CCAACAATAG AATGAGTTAT TAAACTGTGG 5951 TATGTTTATA CATTAGAATA CCCAATGAGG AGAATTAACA AGCTACAACT 6001 ATACCTACTC ACACAGATGA ATCTCATAAA AATAATGTTA CATAAGAGAA 6051 ACTCAATGCA AAAGATATGT TCTGTATGTT TTCATCCATA TAAAGTTCAA 6101 AACCAGGTAA AAATAAAGTT AGAAATTTGG ATGGAAATTA CTCTTAGCTG 6151 GGGGTGGGCG AGTTAGTGCC TGGGAGAAGA CAAGAAGGGG CTTCTGGGGT 6201 CTTGGTAATG TTCTGTTCCT CGTGTGGGGT TGTGCAGTTA TGATCTGTGC 6251 ACTGTTCTGT ATACACATTA TGCTTCAAAA TAACTTCACA TAAAGAACAT 6301 CTTATACCCA GTTAATAGAT AGAAGAGGAA TAAGTAATAG GTCAAGACCA 6351 CGCAGCTGGT AAGTGGGGGG GCCTGGGATC AAATAGCTAC CTGCCTAATC 6401 CTGCCCTCTT GAGCCCTGAA TGAGTCTGCC TTCCAGGGCT CAAGGTGCTC 6451 AACAAAACAA CAGGCCTGCT ATTTTCCTGG CATCTGTGCC CTGTTTGGCT 6501 AGCTAGGAGC ACACATACAT AGAAATTAAA TGAAACAGAC CTTCAGCAAG 6551 GGGACAGAGG ACAGAATTAA CCTTGCCCAG ACACTGGAAA CCCATGTATG 6601 AACACTCACA TGTTTGGGAA GGGGGAAGGG CACATGTAAA TGAGGACTCT 6651 TCCTCATTCT ATGGGGCACT CTGGCCCTGC CCCTCTCAGC TACTCATCCA 6701 TCCAACACAC CTTTCTAAGT ACCTCTCTCT GCCTACACTC TGAAGGGGTT 6751 CAGGAGTAAC TAACACAGCA TCCCTTCCCT CAAATGACTG ACAATCCCTT 6801 TGTCCTGCTT TGTTTTTCTT TCCAGTCAGT ACTGGGAAAG TGGGGAAGGA 6851 CAGTCATGGA GAAACTACAT AAGGAAGCAC CTTGCCCTTC TGCCTCTTGA 6901 GAATGTTGAT GAGTATCAAA TCTTTCAAAC TTTGGAGGTT TGAGTAGGGG 6951 TGAGACTCAG TAATGTCCCT TCCAATGACA TGAACTTGCT CACTCATCCC 7001 TGGGGGCCAA ATTGAACAAT CAAAGGCAGG CATAATCCAG CTATGAATTC 7051 TAGGATCGAT CCAGACATGA TAAGATACAT TGATGAGTTT GGACAAACCA 7101 CAACTAGAAT GCAGTGAAAA AAATGCTTTA TTTGTGAAAT TTGTGATGCT 7151 ATTGCTTTAT TTGTAACCAT TATAAGCTGC AATAAACAAG TTAACAACAA 7201 CAATTGCATT CATTTTATGT TTCAGGTTCA GGGGGAGGTG TGGGAGGTTT 7251 TTTAAAGCAA GTAAAACCTC TACAAATGTG GTATGGCTGA TTATGATCTC 7301 TAGTCAAGGC ACTATACATC AAATATTCCT TATTAACCCC TTTACAAATT 7351 AAAAAGCTAA AGGTACACAA TTTTTGAGCA TAGTTATTAA TAGCAGACAC 7401 TCTATGCCTG TGTGGAGTAA GAAAAAACAG TATGTTATGA TTATAACTGT 7451 TATGCCTACT TATAAAGGTT ACAGAATATT TTTCCATAAT TTTCTTGTAT 7501 AGCAGTGCAG CTTTTTCCTT TGTGGTGTAA ATAGCAAAGC AAGCAAGAGT 7551 TCTATTACTA AACACAGCAT GACTCAAAAA ACTTAGCAAT TCTGAAGGAA 7601 AGTCCTTGGG GTCTTCTACC TTTCTCTTCT TTTTTGGAGG AGTAGAATGT 7651 TGAGAGTCAG CAGTAGCCTC ATCATCACTA GATGGCATTT CTTCTGAGCA 7701 AAACAGGTTT TCCTCATTAA AGGCATTCCA CCACTGCTCC CATTCATCAG 7751 TTCCATAGGT TGGAATCTAA AATACACAAA CAATTAGAAT CAGTAGTTTA 7801 ACACATTATA CACTTAAAAA TTTTATATTT ACCTTAGAGC TTTAAATCTC 7851 TGTAGGTAGT TTGTCCAATT ATGTCACACC ACAGAAGTAA GGTTCCTTCA 7901 CAAAGATCCG GGACCAAAGC GGCCATCGTG CCTCCCCACT CCTGCAGTTC 7951 GGGGGCATGG ATGCGCGGAT AGCCGCTGCT GGTTTCCTGG ATGCCGACGG 8001 ATTTGCACTG CCGGTAGAAC TCCGCGAGGT CGTCCAGCCT CAGGCAGCAG 8051 CTGAACCAAC TCGCGAGGGG ATCGAGCCCG GGGTGGGCGA AGAACTCCAG 8101 CATGAGATCC CCGCGCTGGA GGATCATCCA GCCGGCGTCC CGGAAAACGA 8151 TTCCGAAGCC CAACCTTTCA TAGAAGGCGG CGGTGGAATC GAAATCTCGT 8201 GATGGCAGGT TGGGCGTCGC TTGGTCGGTC ATTTCGAACC CCAGAGTCCC 8251 GCTCAGAAGA ACTCGTCAAG AAGGCGATAG AAGGCGATGC GCTGCGAATC • 4 4444 4 4 4 · · « 444444 4 4 •4 «4 · 4444 ··· 4444 44 44 44 44

- 59 4444

8301 GGGAGCGGCG ATACCGTAAA GCACGAGGAA GCGGTCAGCC CATTCGCCGC 8351 CAAGCTCTTC AGCAATATCA CGGGTAGCCA ACGCTATGTC CTGATAGCGG 8401 TCCGCCACAC CCAGCCGGCC ACAGTCGATG AATCCAGAAA AGCGGCCATT 8451 TTCCACCATG ATATTCGGCA AGCAGGCATC GCCATGGGTC ACGACGAGAT 8501 CCTCGCCGTC GGGCATGCGC GCCTTGAGCC TGGCGAACAG TTCGGCTGGC 8551 GCGAGCCCCT GATGCTCTTC GTCCAGATCA TCCTGATCGA CAAGACCGGC 8601 TTCCATCCGA GTACGTGCTC GCTCGATGCG ATGTTTCGCT TGGTGGTCGA 8651 ATGGGCAGGT AGCCGGATCA AGCGTATGCA GCCGCCGCAT TGCATCAGCC 8701 ATGATGGATA CTTTCTCGGC AGGAGCAAGG TGAGATGACA GGAGATCCTG 8751 CCCCGGCACT TCGCCCAATA GCAGCCAGTC CCTTCCCGCT TCAGTGACAA 8801 CGTCGAGCAC AGCTGCGCAA GGAACGCCCG TCGTGGCCAG CCACGATAGC 8851 CGCGCTGCCT CGTCCTGCAG TTCATTCAGG GCACCGGACA GGTCGGTCTT 8901 GACAAAAAGA ACCGGGCGCC CCTGCGCTGA CAGCCGGAAC ACGGCGGCAT 8951 CAGAGCAGCC GATTGTCTGT TGTGCCCAGT CATAGCCGAA TAGCCTCTCC 9001 ACCCAAGCGG CCGGAGAACC TGCGTGCAAT CCATCTTGTT CAATCATGCG 9051 AAACGATCCT CATCCTGTCT CTTGATCAGA TCTTGATCCC CTGCGCCATC 9101 AGATCCTTGG CGGCAAGAAA GCCATCCAGT TTACTTTGCA GGGCTTCCCA 9151 ACCTTACCAG AGGGCGCCCC AGCTGGCAAT TCCGGTTCGC TTGCTGTCCA 9201 TAAAACCGCC CAGTCTAGCT ATCGCCATGT AAGCCCACTG CAAGCTACCT 9251 GCTTTCTCTT TGCGCTTGCG TTTTCCCTTG TCCAGATAGC CCAGTAGCTG 9301 ACATTCATCC GGGGTCAGCA CCGTTTCTGC GGACTGGCTT TCTACGTGTT 9351 CCGCTTCCTT TAGCAGCCCT TGCGCCCTGA GTGCTTGCGG CAGCGTGAAG

SEKV. ID. Č. 18

Nukleotidová sekvence expresního vektoru HCMV-K HuAb-VLl humV2 (úplná sekvence DNA expresního vektoru pro humanizovaný lehký řetězec obsahující SEKV. ID. Č. 13 (humV2=Vlm) od 3926-4246)

CTAGCTTTTT GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC 51 TGGAATAGCT CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA 101 AATTAGTCAG CCATGGGGCG GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG 151 GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA 201 TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGTT GCTGACTAAT 251 TGAGATGCAT GCTTTGCATA CTTCTGCCTG CTGGGGAGCC TGGGGACTTT 301 CCACACCCTA ACTGACACAC ATTCCACAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA 351 TGACGGTGAA AACCTCTGAC ACATGCAGCT CCCGGAGACG GTCACAGCTT 401 GTCTGTAAGC GGATGCCGGG AGCAGACAAG CCCGTCAGGG CGCGTCAGCG 451 GGTGTTGGCG GGTGTCGGGG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG 501 CGGAGTGTAT ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG 551 AGTGCACCAT ATGCGGTGTG AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAI . 601 ACCGCATCAG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG 651 GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG 701 GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG 751 GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC 801 CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA ·· ··· ·

- 60 • ·· *♦ ·· ♦ · * * · » · · · 9 ·

851 GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG 901 GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC 951 CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG

1001 CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG 1051 TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT 1101 CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC 1151 CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT 1201 TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC AGTATTTGGT 1251 ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC 1301 TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA 1351 AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC 1401 TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT 1451 TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT 1501 AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT 1551 GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT 1601 ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA 1651 TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC 1701 CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG 1751 GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA 1801 TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG 1851 CGCAACGTTG TTGCCATTGC TGCAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT 1901 TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT 1951 GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC 2001 GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC 2051 ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA 2101 CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG 2151 AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AACACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG 2201 AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT 2251 CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA 2301 CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC 2351 AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA 2401 AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT 2451 CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA 2501 TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG 2551 TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA CCTATAAAAA TAGGCGTATC 2601 ACGAGGCCCT TTCGTCTTCA AGAATTCAGC TTGGCTGCAG TGAATAATAA 2651 AATGTGTGTT TGTCCGAAAT ACGCGTTTTG AGATTTCTGT CGCCGACTAA 2701 ATTCATGTCG CGCGATAGTG GTGTTTATCG CCGATAGAGA TGGCGATATT 2751 GGAAAAATCG ATATTTGAAA ATATGGCATA TTGAAAATGT CGCCGATGTG 2801 AGTTTCTGTG TAACTGATAT CGCCATTTTT CCAAAAGTGA TTTTTGGGCA 2851 TACGCGATAT CTGGCGATAG CGCTTATATC GTTTACGGGG GATGGCGATA 2901 GACGACTTTG GTGACTTGGG CGATTCTGTG TGTCGCAAAT ATCGCAGTTT 2951 CGATATAGGT GACAGACGAT ATGAGGCTAT ATCGCCGATA GAGGCGACAT 3001 CAAGCTGGCA CATGGCCAAT GCATATCGAT CTATACATTG AATCAATATT 3051 GGCCATTAGC CATATTATTC ATTGGTTATA TAGCATAAAT CAATATTGGC 3101 TATTGGCCAT TGCATACGTT GTATCCATAT CATAATATGT ACATTTATAT 3151 TGGCTCATGT CCAACATTAC CGCCATGTTG ACATTGATTA TTGACTAGTT 3201 ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG ·· ···· • · · * 4 4·« 4 · · 4 • · 44 ···«· ··· ···· ·· tt ·4 44

- 61 3251 TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCT GACCGCCCAA 3301 CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC 3351 CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT 3401 GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT 3451 TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA 3501 CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT 3551 ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ATCAAŤGGGC GTGGATAGCG 3601 GTTTGACTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA 3651 GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC 3701 TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA 3751 TATAAGCAGA GCTCGTTTAG TGAACCGTCA GATCGCCTGG AGACGCCATC 3801 CACGCTGTTT TGACCTCCAT AGAAGACACC GGGACCGATC CAGCCTCCGC 3851 AAGCTTGCCG CCACCATGGA GACCCCCGCC CAGCTGCTGT TCCTGCTGCT 3901 GCTGTGGCTG CCCGACACCA CCGGCGACAT TCTGCTGACC CAGTCTCCAG 3951 CCACCCTGTC TCTGAGTCCA GGAGAAAGAG CCACTTTCTC CTGCAGGGCC 4001 AGTCAGAACA TTGGCACAAG CATACAGTGG TATCAACAAA AAACAAATGG 4051 TGCTCCAAGG CTTCTCATAA GGTCTTCTTC TGAGTCTATC TCTGGGATCC 4101 CTTCCAGGTT TAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTTAC TCTTACCATC 4151 AGCAGTCTGG AGCCTGAAGA TTTTGCAGTG TATTACTGTC AACAAAGTAA 4201 TACCTGGCCA TTCACGTTCG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGTG 4251 AGTATTCTAG AAAGATCCTA GAATTCTAAA CTCTGAGGGG GTCGGATGAC 4301 GTGGCCATTC TTTGCCTAAA GCATTGAGTT TACTGCAAGG TCAGAAAAGC 4351 ATGCAAAGCC CTCAGAATGG CTGCAAAGAG CTCCAACAAA ACAATTTAGA 4401 ACTTTATTAA GGAATAGGGG GAAGCTAGGA AGAAACTCAA AACATCAAGA 4451 TTTTAAATAC GCTTCTTGGT CTCCTTGCTA TAATTATCTG GGATAAGCAT 4501 GCTGTTTTCT GTCTGTCCCT AACATGCCCT GTGATTATCC GCAAACAACA 4551 CACCCAAGGG CAGAACTTTG TTACTTAAAC ACCATCCTGT TTGCTTCTTT 4601 CCTCAGGAAC TGTGGCTGCA CCATCTGTCT TCATCTTCCC GCCATCTGAT 4651 GAGCAGTTGA AATCTGGAAC TGCCTCTGTT GTGTGCCTGC TGAATAACTT 4701 CTATCCCAGA GAGGCCAAAG TACAGTGGAA GGTGGATAAC GCCCTCCAAT 4751 CGGGTAACTC CCAGGAGAGT GTCACAGAGC AGGACAGCAA GGACAGCACC 4801 TACAGCCTCA GCAGCACCCT GACGCTGAGC AAAGCAGACT ACGAGAAACA 4851 CAAAGTCTAC GCCTGCGAAG TCACCCATCA GGGCCTGAGC TCGCCCGTCA 4901 CAAAGAGCTT CAACAGGGGA GAGTGTTAGA GGGAGAAGTG CCCCCACCTG 4951 CTCCTCAGTT CCAGCCTGAC CCCCTCCCAT CCTTTGGCCT CTGACCCTTT 5001 TTCCACAGGG GACCTACCCC TATTGCGGTC CTCCAGCTCA TCTTTCACCT 5051 CACCCCCCTC CTCCTCCTTG GCTTTAATTA TGCTAATGTT GGAGGAGAAT 5101 GAATAAATAA AGTGAATCTT TGCACCTGTG GTTTCTCTCT TTCCTCATTT 5151 AATAATTATT ATCTGTTGTT TACCAACTAC TCAATTTCTC TTATAAGGGA 5201 CTAAATATGT AGTCATCCTA AGGCGCATAA CCATTTATAA AAATCATCCT 5251 TCATTCTATT TTACCCTATC ATCCTCTGCA AGACAGTCCT CCCTCAAACC 5301 CACAAGCCTT CTGTCCTCAC AGTCCCCTGG GCCATGGTAG GAGAGACTTG 5351 CTTCCTTGTT TTCCCCTCCT CAGCAAGCCC TCATAGTCCT TTTTAAGGGT 5401 GACAGGTCTT ACAGTCATAT ATCCTTTGAT TCAATTCCCT GAGAATCAAC 5451 CAAAGCAAAT TTTTCAAAAG AAGAAACCTG CTATAAAGAG AATCATTCAT 5501 TGCAACATGA TATAAAATAA CAACACAATA AAAGCAATTA AATAAACAAA 5551 CAATAGGGAA ATGTTTAAGT TCATCATGGT ACTTAGACTT AATGGAATGT 5601 CATGCCTTAT TTACATTTTT AAACAGGTAC TGAGGGACTC CTGTCTGCCA ·· 4··· • 4

- 62 5651 AGGGCCGTAT TGAGTACTTT CCACAACCTA ATTTAATCCA CACTATACTG 5701 TGAGATTAAA AACATTCATT AAAATGTTGC AAAGGTTCTA TAAAGCTGAG 5751 AGACAAATAT ATTCTATAAC TCAGCAATCC CACTTCTAGA TGACTGAGTG 5801 TCCCCACCCA CCAAAAAACT ATGCAAGAAT GTTCAAAGCA GCTTTATTTA 5851 CAAAAGCCAA AAATTGGAAA TAGCCCGATT GTCCAACAAT AGAATGAGTT 5901 ATTAAACTGT GGTATGTTTA TACATTAGAA TACCCAATGA GGAGAATTAA 5951 CAAGCTACAA CTATACCTAC TCACACAGAT GAATCTCATA AAAATAATGT 6001 TACATAAGAG AAACTCAATG CAAAAGATAT GTTCTGTATG TTTTCATCCA 6051 TATAAAGTTC AAAACCAGGT AAAAATAAAG TTAGAAATTT GGATGGAAAT 6101 TACTCTTAGC TGGGGGTGGG CGAGTTAGTG CCTGGGAGAA GACAAGAAGG 6151 GGCTTCTGGG GTCTTGGTAA TGTTCTGTTC CTCGTGTGGG GTTGTGCAGT 6201 TATGATCTGT GCACTGTTCT GTATACACAT TATGCTTCAA AATAACTTCA 6251 CATAAAGAAC ATCTTATACC CAGTTAATAG ATAGAAGAGG AATAAGTAAT 6301 AGGTCAAGAC CACGCAGCTG GTAAGTGGGG GGGCCTGGGA TCAAATAGCT 6351 ACCTGCCTAA TCCTGCCCTC TTGAGCCCTG AATGAGTCTG CCTTCCAGGG 6401 CTCAAGGTGC TCAACAAAAC AACAGGCCTG CTATTTTCCT GGCATCTGTG 6451 CCCTGTTTGG CTAGCTAGGA GCACACATAC ATAGAAATTA AATGAAACAG 6501 ACCTTCAGCA AGGGGACAGA GGACAGAATT AACCTTGCCC AGACACTGGA 6551 AACCCATGTA TGAACACTCA CATGTTTGGG AAGGGGGAAG GGCACATGTA 6601 AATGAGGACT CTTCCTCATT CTATGGGGCA CTCTGGCCCT GCCCCTCTCA 6651 GCTACTCATC CATCCAACAC ACCTTTCTAA GTACCTCTCT CTGCCTACAC 6701 TCTGAAGGGG TTCAGGAGTA ACTAACACAG CATCCCTTCC CTCAAATGAC 6751 TGACAATCCC TTTGTCCTGC TTTGTTTTTC TTTCCAGTCA GTACTGGGAA 6801 AGTGGGGAAG GACAGTCATG GAGAAACTAC ATAAGGAAGC ACCTTGCCCT 6851 TCTGCCTCTT GAGAATGTTG ATGAGTATCA AATCTTTCAA ACTTTGGAGG 6901 TTTGAGTAGG GGTGAGACTC AGTAATGTCC CTTCCAATGA CATGAACTTG 6951 CTCACTCATC CCTGGGGGCC AAATTGAACA ATCAAAGGCA GGCATAATCC 7001 AGCTATGAAT TCTAGGATCG ATCCAGACAT GATAAGATAC ATTGATGAGT 7051 TTGGACAAAC CACAACTAGA ATGCAGTGAA AAAAATGCTT TATTTGTGAA 7101 ATTTGTGATG CTATTGCTTT ATTTGTAACC ATTATAAGCT GCAATAAACA 7151 AGTTAACAAC AACAATTGCA TTCATTTTAT GTTTCAGGTT CAGGGGGAGG 7201 TGTGGGAGGT TTTTTAAAGC AAGTAAAACC TCTACAAATG TGGTATGGCT 7251 GATTATGATC TCTAGTCAAG GCACTATACA TCAAATATTC CTTATTAACC 7301 CCTTTACAAA TTAAAAAGCT AAAGGTACAC AATTTTTGAG CATAGTTATT 7351 AATAGCAGAC ACTCTATGCC TGTGTGGAGT AAGAAAAAAC AGTATGTTAT 7401 GATTATAACT GTTATGCCTA CTTATAAAGG TTACAGAATA TTTTTCCATA 7451 ATTTTCTTGT ATAGCAGTGC AGCTTTTTCC TTTGTGGTGT AAATAGCAAA 7501 GCAAGCAAGA GTTCTATTAC TAAACACAGC ATGACTCAAA AAACTTAGCA 7551 ATTCTGAAGG AAAGTCCTTG GGGTCTTCTA CCTTTCTCTT CTTTTTTGGA 7601 GGAGTAGAAT GTTGAGAGTC AGCAGTAGCC TCATCATCAC TAGATGGCAT 7651 TTCTTCTGAG CAAAACAGGT TTTCCTCATT AAAGGCATTC CACCACTGCT 7701 CCCATTCATC AGTTCCATAG GTTGGAATCT AAAATACACA AACAATTAGA 7751 ATCAGTAGTT TAACACATTA TACACTTAAA AATTTTATAT TTACCTTAGA 7801 GCTTTAAATC TCTGTAGGTA GTTTGTCCAA TTATGTCACA CCACAGAAGT 7851 AAGGTTCCTT CACAAAGATC CGGGACCAAA GCGGCCATCG TGCCTCCCCA 7901 CTCCTGCAGT TCGGGGGCAT GGATGCGCGG ATAGCCGCTG CTGGTTTCCT 7951 GGATGCCGAC GGATTTGCAC TGCCGGTAGA ACTCCGCGAG GTCGTCCAGC 8001 CTCAGGCAGC AGCTGAACCA ACTCGCGAGG GGATCGAGCC CGGGGTGGGC ·· • 4 · 4 • 4 4 4 ·«

8051 GAAGAACTCC AGCATGAGAT CCCCGCGCTG GAGGATCATC CAGCCGGCGT 8101 CCCGGAAAAC GATTCCGAAG CCCAACCTTT CATAGAAGGC GGCGGTGGAA 8151 TCGAAATCTC GTGATGGCAG GTTGGGCGTC GCTTGGTCGG TCATTTCGAA 8201 CCCCAGAGTC CCGCTCAGAA GAACTCGTCA AGAAGGCGAT AGAAGGCGAT 8251 GCGCTGCGAA TCGGGAGCGG CGATACCGTA AAGCACGAGG AAGCGGTCAG 8301 CCCATTCGCC GCCAAGCTCT TCAGCAATAT CACGGGTAGC CAACGCTATG 8351 TCCTGATAGC GGTCCGCCAC ACCCAGCCGG CCACAGTCGA TGAATCCAGA 8401 AAAGCGGCCA TTTTCCACCA TGATATTCGG CAAGCAGGCA TCGCCATGGG 8451 TCACGACGAG ATCCTCGCCG TCGGGCATGC GCGCCTTGAG CCTGGCGAAC 8501 AGTTCGGCTG GCGCGAGCCC CTGATGCTCT TCGTCCAGAT CATCCTGATC 8551 GACAAGACCG GCTTCCATCC GAGTACGTGC TCGCTCGATG CGATGTTTCG 8601 CTTGGTGGTC GAATGGGCAG GTAGCCGGAT CAAGCGTATG CAGCCGCCGC 8651 ATTGCATCAG CCATGATGGA TACTTTCTCG GCAGGAGCAA GGTGAGATGA 8701 CAGGAGATCC TGCCCCGGCA CTTCGCCCAA TAGCAGCCAG TCCCTTCCCG 8751 CTTCAGTGAC AACGTCGAGC ACAGCTGCGC AAGGAACGCC CGTCGTGGCC 8801 AGCCACGATA GCCGCGCTGC CTCGTCCTGC AGTTCATTCA GGGCACCGGA 8851 CAGGTCGGTC TTGACAAAAA GAACCGGGCG CCCCTGCGCT GACAGCCGGA 8901 ACACGGCGGC ATCAGAGCAG CCGATTGTCT GTTGTGCCCA GTCATAGCCG 8951 AATAGCCTCT CCACCCAAGC GGCCGGAGAA CCTGCGTGCA ATCCATCTTG 9001 TTCAATCATG CGAAACGATC CTCATCCTGT CTCTTGATCA GATCTTGATC 9051 CCCTGCGCCA TCAGATCCTT GGCGGCAAGA AAGCCATCCA GTTTACTTTG 9101 CAGGGCTTCC CAACCTTACC AGAGGGCGCC CCAGCTGGCA ATTCCGGTTC 9151 GCTTGCTGTC CATAAAACCG CCCAGTCTAG CTATCGCCAT GTAAGCCCAC 9201 TGCAAGCTAC CTGCTTTCTC TTTGCGCTTG CGTTTTCCCT TGTCCAGATA 9251 GCCCAGTAGC TGACATTCAT CCGGGGTCAG CACCGTTTCT GCGGACTGGC 9301 TTTCTACGTG TTCCGCTTCC TTTAGCAGCC CTTGCGCCCT GAGTGCTTGC 9351 GGCAGCGTGA AG

Claims (24)

1. Vazebná molekula obsahující alespoň jedno vazebné místo pro antigen, v jejíž sekvenci jsou obsaženy hypervariabilní oblasti CDRl, CDR2 a CDR3, přičemž aminokyselinová sekvence CDRl je Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), aminokyselinová sekvence CDR2 je Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-LysTyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) a aminokyselinová sekvence CDR3 je Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-TrpPhe-Asp-Thr (SGPYAWFDT).

2. Vazebná molekula podle nároku 1 obsahující

a) první doménu obsahující ve své sekvenci hypervariabilní oblasti CDRl, CDR2 a CDR3, přičemž aminokyselinová sekvence CDRl je Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), aminokyselinová sekvence CDR2 je Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-AsnHis-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) a aminokyselinová sekvence CDR3 je Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT); a

b) druhou doménu obsahující ve své sekvenci hypervariabilní oblasti CDRl', CDR2' a CDR3', přičemž aminokyselinová sekvence CDRl' je Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-SerIle-Gln (RASQNIGTSIQ), aminokyselinová sekvence CDR2' je Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) a aminokyselinová sekvence CDR3' je Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT).

3. Vazebná molekula podle kteréhokoli z nároků 1 nebo 2, kterou je chimérická nebo humanizovaná monoklonální protilátka.

44 4 44·

4 4 4 4 4 4 4 4 44 4 • · 444» 444 • · 44 444444 4 4 • · 44 4 4444

444 4444 ·4 4· 44 4·

- 65 4. Vazebná molekula podle kteréhokoli z nároků 1 nebo 2, obsahující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 1 a/nebo polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 2.

5. Vazebná molekula podle kteréhokoli z nároků 1 nebo 2, obsahující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 3 a/nebo polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 4.

6. Vazebná molekula podle kteréhokoli z nároků 4 nebo 5, kterou je chimérická monoklonální protilátka.

7. Vazebná molekula, kterou je humanizovaná protilátka obsahující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 nebo SEKV. ID. Č. 10 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 7 nebo SEKV. ID. Č. 8. 8 . Vazebná molekula, kterou je humanizovaná protilátka

obsahuj ící

polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 7, polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 8, polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 10 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 7, nebo polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 10 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 8.

9. Izolované polynukleotidy obsahující polynukleotidy kódující vazebnou molekulu podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.

·· 9999 * ·· ·· ·· • •99 · · · · 9« 9

9 9 · « · 9 ··· • · 99 »99999 9 9 • · 99 9 9999

999 9999 99 9« 99 99

- 66

10. Polynukleotidy podle nároku 9 kódující aminokyselinovou sekvenci CDRl, CDR2 a CDR3 podle nároku 2 a/nebo polynukleotidy kódující aminokyselinovou sekvenci CDRl', CDR2' a CDR3' podle nároku 2.

11. Polynukleotidy obsahující polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č. 5 a/nebo polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č. 6.

12. Polynukleotidy obsahující polynukleotidy kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 7 nebo SEKV. ID. Č. 8 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 9 nebo SEKV. ID. Č. 10.

13. Polynukleotidy obsahující polynukleotidy kódující polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 11 nebo SEKV. ID. Č. 12 a polypeptid o sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo SEKV. ID. Č. 14 .

14. Expresní vektor obsahující polynukleotidy podle kteréhokoli z nároků 9 až 13.

15. Expresní systém obsahující polynukleotid podle kteréhokoli z nároků 9 až 13, přičemž expresní systém nebo jeho část je schopna produkovat polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, pokud expresní systém nebo jeho část je přítomna v kompatibilní hostitelské buňce.

16. Izolovaná hostitelská buňka obsahující expresní systém podle nároku 15.

17. Použití molekuly nebo humanizované protilátky podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 jako léčiva.

·· 4444

- 67 <* 44 44 ·· *··· 4 4 * • · * · 444 4 4 4 « • · · 4 4 4 4 4

4··· 44 44 44 4«

18. Použití podle nároku 17 k léčbě a/nebo autoimunitních chorob, odhojení transplantátu, zánětlivé choroby střev a alergií.

profylaxi psoriázy,

Farmaceutický přípravek obsahuje molekulu nebo kteréhokoliv z nároků 1 farmaceuticky přijatelným vyznačující se tím, že humanizovanou protilátku podle až 8 společně s nejméně jedním nosičem nebo diluentem.

20. Způsob léčby a/nebo profylaxe chorob spojených s autoimunitními chorobami, odhojením transplantátu, psoriázou, zánětlivou chorobou střeva a alergiemi, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství molekuly nebo humanizované protilátky podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 osobě, u které je potřeba takové léčby a/nebo profylaxe.

21. Použití vazebné molekuly, která má vazebnou specificitu k CD45RO i CD45RB, v medicíně.

22. Použití podle nároku 21, přičemž vazebnou molekulou je chimérická, humanizovaná nebo zcela lidská monoklonální protilátka.

23. Použití podle nároku 21 nebo 22, přičemž vazebná molekula váže izoformy CD45RO s disociační konstantou (Kd) <15nM.

24. Použití podle kteréhokoli z nároků 21 až 23, přičemž vazebná molekula váže izoformy CD45RB s disociační konstantou (Kd) <15nM.

♦ » ··»· • · » ·

9 9 9 9

999 99 9 • «I · 9 99 99 99

25. Použití podle kteréhokoli z nároků 21 až 24, přičemž vazebná molekula váže izoformy CD45, které

- zahrnují epitopy A a B, ale ne epitop C molekuly CD45; a/nebo

- zahrnují epitop B, ale ne epitopy A a C molekuly CD45; a/nebo

- nezahrnují žádný z epitopů A, B nebo C molekuly CD45.

26. Použití podle kteréhokoli z nároků 21 až 25, přičemž vazebná molekula neváže izoformy CD45, které

- zahrnují současně epitopy A, B i C molekuly CD45; a/nebo

- zahrnují epitop B i C, ale ne epitop A molekuly CD45.

27. Použití podle kteréhokoli z nároků 21 až 26, přičemž vazebná molekula se váže na svůj cílový epitop na buňkách PEER a přičemž tato vazba se uskutečňuje s Kd<15 nM.