ES2374554T3 - Anticuerpos humanizados específicos para tanto cd45rb como cd45ro. - Google Patents

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Abstract

Anticuerpo humanizado anti-CD45RO/RB que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID No:9 o de SEQ ID No:10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:7 o de SEQ ID No:8.

Description

Anticuerpos humanizados específicos para tanto CD45RB como CD45RO
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados contra isoformas del antígeno CD45, tales como por 5 ejemplo anticuerpos monoclonales (AcM).
Antecedentes de la invención
Un enfoque en el tratamiento de una variedad de enfermedades es lograr la eliminación o la inactivación de leucocitos patógenos y la posibilidad de inducción de tolerancia para inactivar respuestas inmunitarias patológicas.
Se cree que el rechazo de trasplantes de órganos, células y tejidos y las diversas enfermedades autoinmunitarias
10 son principalmente el resultado de la respuesta inmunitaria mediada por células T desencadenada por células T auxiliares que pueden reconocer antígenos específicos que se capturan, procesan y presentan a las células T auxiliares por células presentadoras de antígenos (APC) tales como macrófagos y células dendríticas, en forma de un complejo de antígeno-CMH, es decir, las células T auxiliares, cuando reconocen antígenos específicos, se estimulan a producir citocinas tales como IL-2 y a expresar o regular por incremento algunos receptores de citocinas
15 y otras moléculas de activación y a proliferar. Algunas de estas células T auxiliares pueden actuar directa o indirectamente, es decir, ayudando a células B o células T citotóxicas efectoras a destruir células o tejidos que expresan el antígeno seleccionado. Tras la terminación de la respuesta inmunitaria, algunas de las células seleccionadas clonalmente maduras permanecen como células T citotóxicas de memoria y auxiliares de memoria, que circulan por el cuerpo y reconocen rápidamente el antígeno si aparece de nuevo. Si el antígeno que
20 desencadena esta respuesta es un antígeno medioambiental inocuo, el resultado es alergia, si el antígeno no es un antígeno foráneo, si no un antígeno propio, puede dar como resultado enfermedad autoinmunitaria; si el antígeno es un antígeno de un órgano transplantado, el resultado puede ser rechazo del injerto.
El sistema inmunitario se ha desarrollado para reconocer lo propio de lo no propio. Esta propiedad permite a un organismo sobrevivir en un entorno expuesto a la exposición diaria de patógenos. Esta especificidad para lo no 25 propio y tolerancia hacia lo propio surge durante el desarrollo del repertorio de células T en el timo a través de procesos de selección positiva y negativa, que también comprenden el reconocimiento y la eliminación de células T autorreactivas. Este tipo de tolerancia se denomina tolerancia central. Sin embargo, algunas de estas células autorreactivas escapan de este mecanismo selectivo y representan un peligro potencial para el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias. Para controlar las células T autorreactivas que han escapado a la periferia, el
30 sistema inmunitario tiene mecanismos reguladores periféricos que proporcionan protección contra la autoinmunidad. Estos mecanismos son una base para la tolerancia periférica.
Los antígenos de la superficie celular reconocidos por AcM específicos se designan generalmente por un número de CD (grupo de diferenciación) asignado por talleres de tipificación de leucocitos internacionales sucesivos y el término CD45 aplicado en el presente documento se refiere al antígeno común de leucocitos de la superficie celular CD45; y
35 un AcM frente a ese antígeno se designa en el presente documento como “anti-CD45”.
El antígeno común de leucocitos (LCA) o CD45 es el componente principal de la globulina anti-linfocitos (ALG). CD45 pertenece a la familia de tirosina fosfatasas transmembrana y es un regulador tanto positivo como negativo de la activación celular, dependiendo de la interacción del receptor. La actividad fosfatasa de CD45 parece requerirse para la activación de cinasas de la familia Src asociadas con el receptor de antígenos de linfocitos B y T (Trowbridge 40 IS et al, Annu Rev Immunol. 1994; 12:85-116). Por tanto, en la activación de células T, CD45 es esencial para la señal 1 y células deficientes en CD45 tienen profundos efectos en acontecimientos de activación mediados por TCR.
El antígeno CD45 existe en diferentes isoformas que comprenden una familia de glicoproteínas transmembrana. Isoformas distintas de CD45 difieren en su estructura de dominio extracelular que surgen del corte y empalme alternativo de 3 exones variables que codifican para parte de la región extracelular de CD45 (Streuli MF. et al, J. 45 Exp. Med. 1987; 166:1548-1566). Las diversas isoformas de CD45 tienen diferentes dominios extracelulares, pero tienen los mismos segmentos citoplasmáticos y transmembrana teniendo dos dominios fosfatasa homólogos, altamente conservados de aproximadamente 300 residuos. Diferentes combinaciones de isoformas se expresan diferencialmente en subpoblaciones de linfocitos T y B (Thomas ML. et al, Immunol. Today 1988; 9:320-325). Algunos anticuerpos monoclonales reconocen un epítopo común a todas las diferentes isoformas, mientras que 50 otros AcM tienen una especificidad restringida (CD45R), dependiente de cuales de los exones cortados y empalmados de manera alternativa (A, B o C) reconocen. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales que reconocen el producto del exón A se designan por consiguiente CD45RA, los que reconocen las diversas isoformas que contienen el exón B se han designado CD45RB (Beverley PCL et al, Immunol. Sup. 1988; I:3-5). Anticuerpos tales como UCHL1 se unen selectivamente a la isoforma de 180 kDa CD45RO (sin ninguno de los exones variables A, B o C)
que parece que está restringida a un subconjunto de células T activadas, células de memoria y timocitos corticales y no se detecta en células B (Terry LA et al, Immunol. 1988; 64: 331-336).
Aversa G.G et al (1989), Transplantation proceedings, vol. 21, n.º 1; págs. 349-350, describen el uso de tres anticuerpos monoclonales para identificar antígenos de activación en linfocitos y visualizar células T activadas en 5 aloinjertos renales rechazados. Se da a conocer un anticuerpo denominado “A6”.
En el documento WO98/11918 se dan a conocer anticuerpos y usos de los mismos, frente a CDR45R. Los usos dados a conocer incluyen la reversión del rechazo de trasplantes o el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra que la inhibición de la MLR primaria por el “AcM candidato” es dependiente de la dosis en el 10 intervalo de 0,001 y 10 ug/ml. “Concentración” es la concentración del “AcM candidato”.
La figura 2 muestra el mapa de plásmido del vector de expresión HCMV-G1 HuAb-VHQ que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 12 (3921-4274) en la secuencia de nucleótidos del vector de expresión completo SEQ ID NO: 15.
La figura 3 muestra el mapa de plásmido del vector de expresión HCMV-G1 HuAb-VHE que comprende la cadena
15 pesada que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:11 (3921-4274) en la secuencia de nucleótidos del vector de expresión completo SEQ ID NO: 16.
La figura 4 muestra el mapa de plásmido del vector de expresión HCMV-KHuAb-humV1 que comprende la cadena ligera que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 14 (3964-4284) en la secuencia de nucleótidos del vector de expresión completo SEQ ID NO: 17.
20 La figura 5 muestra el mapa de plásmido del vector de expresión HCMV-KHuAb-humV2 que comprende la cadena ligera que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 13 (3926-4246) en la secuencia de nucleótidos del vector de expresión completo SEQ ID NO: 18.
Descripción de la invención
Se ha encontrado ahora un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia polipeptídica que se une a
25 CD45RO y CD45RB, también designado a continuación en el presente documento como “anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB”. Este anticuerpo humanizado según la invención puede inducir inmunosupresión, inhibir respuestas de células T primarias e inducir tolerancia de células T. Además, el anticuerpo humanizado de la invención inhibe respuestas de linfocitos mixtos primarias (MLR). Células derivadas de cultivos tratados con el anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB también tienen de manera preferida respuestas proliferativas alteradas
30 en MLR secundaria incluso en ausencia de anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB en la MLR secundaria. Tales respuestas proliferativas alteradas en MLR secundaria son una indicación de la capacidad del anticuerpo humanizado de la invención para inducir tolerancia. Adicionalmente, la administración in vivo de molécula de unión a CD45RO/RB a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) que se someten a xeno GVHD tras inyección con PBMC humanas puede prolongar la supervivencia de los ratones, en comparación con ratones tratados de
35 control, aún cuando todavía pueden detectarse células T humanas circulantes en ratones tratados con molécula de unión a CD45RO/RB.
El anticuerpo humanizado de la invención tiene una especificidad de unión para tanto CD45RO como CD45RB. Preferiblemente. el anticuerpo humanizado se une a isoformas CD45RO con una constante de disociación (Kd) < 20 nM, preferiblemente con una Kd < 15 nM o < 10 nM, más preferiblemente con una Kd < 5 nM. Preferiblemente, el
40 anticuerpo humanizado se une a isoformas CD45RB con una Kd < 50 nM, preferiblemente con una Kd < 15 nM o < 10 nM, más preferiblemente con una Kd < 5 nM.
En una realización preferida adicional, el anticuerpo humanizado se une a las isoformas de CD45 que
1) incluyen los epítopos A y B pero no el epítopo C de la molécula CD45; y/o
2) incluyen el epítopo B pero no el epítopo A ni el epítopo C de la molécula CD45; y/o
45 3) no incluyen ninguno de los epítopos A, B o C de la molécula CD45.
Aún en una realización preferida adicional, el anticuerpo humanizado no se une a isoformas de CD45 que incluyen 1) todos los epítopos A, B y C de la molécula CD45; y/o
2) tanto los epítopos B como C pero no el epítopo A de la molécula CD45.
En realizaciones preferidas adicionales el anticuerpo humanizado además
1) reconoce células T aloactivadas in vivo y de memoria; y/o
2) se une a su diana sobre células T humanas, tales como por ejemplo células PEER; en la que dicha unión preferiblemente es con una Kd < 15 nM, más preferiblemente con una Kd < 10 nM, lo más preferiblemente con una Kd < 5 nM ; y/o
3) inhibe la función de células T alorreactivas in vitro, preferiblemente con una CI50 de aproximadamente 5 nM, más preferiblemente con una CI50 de aproximadamente 1 nM, lo más preferiblemente con una CI50 de aproximadamente 0,5 nM o incluso 0,1 nM; y/o
4) induce tolerancia de células T específicas de aloantígeno in vitro; y/o
5) previene la enfermedad de injerto xenogénico contra huésped (GVHD) inducida en ratones SCID mediante inyección de PBMC humanas cuando se administra en una cantidad eficaz.
En una realización preferida adicional el anticuerpo humanizado de la invención se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal “A6” tal como se describe por Aversa et al., Cellular Immunology 158,314-328 (1994).
Debido a las propiedades de unión y actividades biológicas descritas anteriormente, tales anticuerpos humanizados de la invención son particularmente útiles en medicina, para terapia y/o profilaxis. Enfermedades en las que los anticuerpos humanizados de la invención son particularmente útiles incluyen enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplantes, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y alergias, tal como se establecerá adicionalmente a continuación.
Se ha encontrado que una molécula que comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 1 y un polipéptido de SEQ ID NO: 2 es una molécula de unión a CD45RO/RB. Se ha encontrado también las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’ y CDR3’ en una molécula de unión a CD45RO/RB de SEQ ID NO:1, teniendo CDR1’ la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gin-Asn-lie-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), teniendo CDR2’ la secuencia de aminoácidos Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) y teniendo CDR3’ la secuencia de aminoácidos Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT).
Se han encontrado también las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3 en una molécula de unión a CD45RO/RB de SEQ ID NO: 2, teniendo CDR1 la secuencia de aminoácidos Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), teniendo CDR2 la secuencia de aminoácidos Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) y teniendo CDR3 la secuencia de aminoácidos Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT).
Las CDR son 3 regiones determinantes de complementariedad específicas que también se denominan regiones hipervariables que esencialmente determinan las características de unión a antígeno. Estas CDR son parte de la región variable, por ejemplo de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, respectivamente, en las que estas CDR alternan con regiones de entramado (FR) por ejemplo regiones constantes. Una SEQ ID NO: 1 es parte de una cadena ligera, por ejemplo de SEQ ID NO: 3, y una SEQ ID NO: 2 es parte de una cadena pesada, por ejemplo de SEQ ID NO: 4, en un anticuerpo quimérico. Las CDR de una cadena pesada junto con las CDR de una cadena ligera asociada constituyen esencialmente el sitio de unión a antígeno de una molécula de la presente invención. Se sabe que la contribución hecha por una región variable de cadena ligera a la energía de unión es pequeña en comparación con la hecha por la región variable de cadena pesada asociada y que las regiones variables de cadena pesada tienen su propia actividad de unión a antígeno. Tales moléculas se denominan comúnmente anticuerpos de dominio único.
En un aspecto, se proporciona una molécula que comprende al menos un sitio de unión a antígeno, por ejemplo una molécula de unión a CD45RO/RB, que comprende en secuencias las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3, teniendo dicha CDR1 la secuencia de aminoácidos Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH), teniendo dicha CDR2 la secuencia de aminoácidos Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) y teniendo dicha CDR3 la secuencia de aminoácidos Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT); por ejemplo y equivalentes directos de las mismas.
En otro aspecto, se proporciona una molécula que comprende al menos un sitio de unión a antígeno, por ejemplo una molécula de unión a CD45RO/RB, que comprende
a) un primer dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3, teniendo dicha CDR1 la secuencia de aminoácidos Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), teniendo dicha CDR2 la secuencia de aminoácidos Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Iys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) y teniendo dicha CDR3 la secuencia de aminoácidos Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT); y
b) un segundo dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’ y CDR3’, teniendo CDR1’ la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), teniendo CDR2’ la secuencia de aminoácidos Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) y teniendo CDR3’ la secuencia de aminoácidos Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT), por ejemplo y equivalentes directos de las mismas.
En una realización preferida, el primer dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3 es una cadena pesada de inmunoglobulina, y el segundo dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’ y CDR3’ es una cadena ligera de inmunoglobulina.
En otro aspecto, se proporciona una molécula, por ejemplo una molécula de unión a CD45RO/RB, que comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 1 y/o un polipéptido de SEQ ID NO: 2, que comprenden preferiblemente en un dominio un polipéptido de SEQ ID NO: 1 y en otro dominio un polipéptido de SEQ ID NO: 2, por ejemplo un anticuerpo monoclonal quimérico, y en otro aspecto una molécula, por ejemplo una molécula de unión a CD45RO/RB, que comprende un polipéptido de SEQ ID NO:3 y/o un polipéptido de SEQ ID NO: 4, que comprenden preferiblemente en un dominio un polipéptido de SEQ.ID NO: 3 y en otro dominio un polipéptido de SEQ ID NO: 4, por ejemplo un anticuerpo monoclonal quimérico.
Cuando el sitio de unión a antígeno comprende los dominios tanto primero como segundo o un polipéptido de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 3, respectivamente, y un polipéptido de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 4, respectivamente, estos pueden ubicarse en el mismo polipéptido, o, preferiblemente cada dominio puede estar en una cadena diferente, por ejemplo siendo el primer dominio parte de una cadena pesada, por ejemplo una cadena pesada de inmunoglobulina, o fragmento de la misma y siendo el segundo dominio parte de una cadena ligera, por ejemplo una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma.
Se ha encontrado además que un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención es una molécula de unión a CD45RO/RB en mamíferos, por ejemplo en el entorno del cuerpo humano. Un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención puede designarse por tanto como un anticuerpo monoclonal (AcM), en el que la actividad de unión está determinada principalmente por las regiones CDR tal como se describió anteriormente, por ejemplo estando asociadas dichas regiones CDR con otras moléculas sin especificidad de unión, tales como regiones de entramado, por ejemplo regiones constantes, que son sustancialmente de origen humano.
En otro aspecto se proporciona una molécula de unión a CD45RO/RB que no es el anticuerpo monoclonal “A6” tal como se describe por Aversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994), que se incorpora como referencia para los pasajes que caracterizan A6.
En otro aspecto la presente invención proporciona una molécula de unión a CD45RO/RB según la presente invención que es un anticuerpo monoclonal humanizado.
Los ejemplos de moléculas de unión a CD45RO/RB incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados por ejemplo derivados de anticuerpos producidos por células B o hibridomas y o cualquier fragmento de los mismos, por ejemplo fragmentos F (ab’) 2 y Fab, así como anticuerpos de dominio único o de cadena única. Un anticuerpo de cadena única consiste en las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos unidas mediante un conector peptídico, que consiste habitualmente en desde 10 hasta 30 aminoácidos, preferiblemente desde 15 hasta 25 aminoácidos. Por tanto, una estructura de este tipo no incluye la parte constante de las cadenas pesadas y ligeras y se cree que el espaciador peptídico pequeño debe ser menos antigénico que una parte constante completa. Por un anticuerpo quimérico quiere decirse un anticuerpo en el que las regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras o ambas son de origen humano mientras que los dominios variables de cadenas tanto pesadas como ligeras son de origen no humano (por ejemplo murino). Por un anticuerpo humanizado quiere decirse un anticuerpo en el que las regiones hipervariables (CDR) son de origen no humano (por ejemplo murino) mientras que toda o sustancialmente toda la otra parte, por ejemplo las regiones constantes y las partes altamente conservadas de las regiones variables son de orígenes humanos. Sin embargo, un anticuerpo humanizado puede conservar unos cuantos aminoácidos de la secuencia murina en las partes de las regiones variables adyacentes a las regiones hipervariables.
Las regiones hipervariables, es decir, las CDR pueden estar asociadas con cualquier clase de regiones de entramado, por ejemplo partes constantes de las cadenas ligeras y pesadas, de origen humano. Se describen regiones de entramado adecuadas en por ejemplo “Sequences of proteins of immunological interest”, Kabat, E. A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of health. Preferiblemente, la parte constante de una cadena pesada humana puede ser del tipo IgG1, incluyendo subtipos, preferiblemente la parte constante de una cadena ligera humana puede ser del tipo K o I, más preferiblemente del tipo K. Una parte constante preferida de una cadena pesada es un polipéptido de SEQ ID NO: 4, (sin las partes de secuencia de CDR1’, CDR2’ y CDR3’ que se especificaron anteriormente) y una parte constante preferida de una cadena ligera es
5 un polipéptido de SEQ ID NO: 3 (sin las partes de secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 que se especificaron anteriormente).
Se ha encontrado también un anticuerpo frente a CD45RO/RB humanizado que comprende una región variable de cadena ligera de aminoácidos SEQ ID NO:7 o de aminoácidos SEQ ID NO:8, que comprende CDR1’, CDR2’ y CDR3’ según la presente invención y una región variable de cadena pesada de SEQ: ID NO: 9 o de SEQ: ID NO: 10,
10 que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 según la presente invención.
En otro aspecto la presente invención proporciona un anticuerpo frente a CD45RO/RB humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 o de SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 7 o de SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto la presente invención proporciona un anticuerpo frente a CD45RO/RB humanizado que comprende
15 - una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 7,
-
una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8,
-
una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 7, o
-
una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8.
20 “Polipéptido”, si no se especifica lo contrario en el presente documento, incluye cualquier péptido o proteína que comprende aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos, que tiene una secuencia de aminoácidos que comienza en el extremo N-terminal y acaba en el extremo C-terminal. Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, se prefiere más un anticuerpo monoclonal quimérico (injertado con V) o humanizado (injertado con CDR). El anticuerpo monoclonal humanizado (injertado con CDR) puede incluir o no
25 mutaciones adicionales introducidas en las secuencias de entramado (FR) del anticuerpo aceptor.
Un derivado funcional de un polipéptido tal como se usa en el presente documento incluye una molécula que tiene una actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido según la presente invención, es decir, que tiene la capacidad para unirse a CD45RO y CD45RB. Un derivado funcional incluye fragmentos y análogos peptídicos de un polipéptido según la presente invención. Los fragmentos comprenden regiones dentro de la secuencia de un 30 polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. El término “derivado” se usa para definir variantes de secuencia de aminoácidos, y modificaciones covalentes de un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. Los derivados funcionales de un polipéptido, por ejemplo de una secuencia especificada, tienen preferiblemente al menos aproximadamente el 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, lo más
35 preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de homología de secuencia global con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, y conservan sustancialmente la capacidad para unirse a CD45RO y CD45RB.
La expresión “modificación covalente” incluye modificaciones de un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada; o un fragmento de la misma con un agente de derivatización proteináceo o 40 no proteináceo orgánico, fusiones con secuencias polipeptídicas heterólogas y modificaciones postraduccionales. Polipéptidos modificados de manera covalente, por ejemplo de una secuencia especificada, tienen todavía la capacidad de unirse a CD45RO y CD45RB mediante reticulación. Se introducen normalmente modificaciones covalentes haciendo reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana con un agente de derivatización orgánico que puede reaccionar con residuos terminales o laterales seleccionados, o mediante mecanismos de 45 aprovechamiento de modificaciones postraduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Ciertas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Residuos de glutaminilo y asparaginilo se desaminan frecuentemente de manera postraduccional para dar los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Otras modificaciones postraduccionales incluyen 50 hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo, tirosina o treonilo, metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, véase por ejemplo T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman &amp; Co., San Francisco, págs. 7986 (1983). Las modificaciones covalentes incluyen por ejemplo proteínas de fusión que comprenden un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada y sus variantes de secuencia de aminoácidos, tales
como inmunoadhesinas, y fusiones N-terminales con secuencias señal heterólogas.
“Homología” con respecto a un polipéptido nativo y su derivado funcional se define en el presente documento como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de un polipéptido nativo correspondiente, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el
5 porcentaje de homología máximo, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. No debe interpretarse que ni extensiones N- o C-terminales ni inserciones reducen la identidad u homología.
Se conocen bien métodos y programas informáticos para la alineación.
“Aminoácido(s)” se refiere a todos los L-a-aminoácidos que se producen de manera natural, por ejemplo e 10 incluyendo D-aminoácidos. Los aminoácidos se identifican mediante o bien las designaciones de una única letra o bien de tres letras bien conocidas.
La expresión “variante de secuencia de aminoácidos” se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. Variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido según la presente invención, por 15 ejemplo de una secuencia especificada, tienen todavía la capacidad para unirse a CD45RO y CD45RB. Variantes por sustitución son aquéllas que tienen al menos un residuo de aminoácido eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición en un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. Estas substituciones pueden ser únicas, en las que sólo un aminoácido en la molécula se ha sustituido, o pueden ser múltiples, en las que dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma molécula. 20 Variantes por inserción son aquéllas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en un polipéptido según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado a o bien el grupo funcional a-carboxilo
o bien a-amino del aminoácido. Variantes por deleción son aquéllas con uno o más aminoácidos en un polipéptido
según la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, eliminados. Habitualmente, las variantes 25 por deleción tendrán uno o dos aminoácidos delecionados en una región particular de la molécula.
Se ha encontrado también que las secuencias polinucleotídicas de
-
GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG, que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR1,
-
TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG; que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR 2,
-
ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR 3,
30 - TTATATTATCCACTG, que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR1’,
-
TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR2’,
AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR3’,
-
SEQ ID NO: 5 que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 1, es decir, la región variable de una cadena ligera 35 de un AcM;
-
SEQ ID NO: 6 que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 2, es decir, la región variable de la cadena pesada de un AcM;
-
SEQ ID NO:11 que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO:9, es decir, una región variable de cadena pesada que incluye CDR1, CDR2 y CDR3 según la presente invención;
40 - SEQ ID NO: 12 que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 10, es decir, una región variable de cadena pesada que incluye CDR1, CDR2 y CDR3 según la presente invención;
-
SEQ ID NO: 13 que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 7, es decir, una región variable de cadena ligera que incluye CDR1’, CDR2’ y CDR3’ según la presente invención; y
-
SEQ ID NO: 14 que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 8, es decir, una región variable de cadena ligera 45 que incluye CDR1’, CDR2’ y CDR3’ según la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican para un polipéptido de SEQ ID NO: 7 o SEQ.ID NO: 8 y un polipéptido de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; que codifican por ejemplo para
-
un polipéptido de SEQ ID NO: 7 y un polipéptido de SEQ ID NO: 9,
-
un polipéptido de SEQ ID NO: 7 y un polipéptido de SEQ ID NO: 10,
5 - un polipéptido de SEQ ID NO: 8 y un polipéptido de SEQ ID NO: 9, o
-
un polipéptido de SEQ ID NO: 8 y un polipéptido de SEQ ID NO: 10.
“Polinucleótido”, si no se especifica lo contrario en el presente documento, incluye cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado, incluyendo sin limitación ARN mono y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias.
10 Un polinucleótido según la presente invención, por ejemplo un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2, CDR3, CDR1’, CDR2’, CDR3’, o de SEQ.ID NO:1, SEQ.ID NO: 2, SEQ.ID NO: 3, SEQ.ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, respectivamente, tal como un polinucleótido de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, respectivamente, incluye variantes alélicas de las mismas y/o sus complementos; incluyendo por ejemplo un
15 polinucleótido que se hibrida con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, respectivamente; que codifica por ejemplo para un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, respectivamente, incluyendo por ejemplo un derivado funcional de dicho polipéptido, teniendo por ejemplo dicho derivado funcional al menos el 65% de homología con SEQ ID NO:1,
20 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, respectivamente, incluyendo por ejemplo dicho derivado funcional modificaciones covalentes de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID.NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, respectivamente, incluyendo por ejemplo dicho derivado funcional variantes de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID.NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO:
25 10, respectivamente; por ejemplo una SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID.NO: 13 o SEQ ID NO: 14, respectivamente incluye una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica para un polipéptido de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ.ID NO: 10, respectivamente, o codifica para un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de
30 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ.ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, respectivamente.
Un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante. Por tanto, pueden construirse una o más moléculas de ADN que codifican para el CD45RO/RB, colocadas bajo secuencias de control apropiadas y transferirse a un huésped (organismo) adecuado para su expresión mediante un
35 vector apropiado.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica para una cadena única, pesada y/o ligera de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención; y el uso de un polinucleótido según la presente invención para la producción de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención por medios recombinantes.
40 Puede obtenerse un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según, por ejemplo de manera análoga, a un método de manera convencional junto con la información proporcionada en el presente documento, por ejemplo con el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables y las secuencias polinucleotídicas que codifican para estas regiones. Se describe un método para construir un gen de dominio variable, por ejemplo, en el documento EP 239 400 y puede resumirse brevemente tal como sigue: puede clonarse
45 un gen que codifica para una región variable de un AcM de cualquier especificidad. Se determinan los segmentos de ADN que codifican para las regiones de entramado e hipervariables y se eliminan los segmentos de ADN que codifican para las regiones hipervariables. Se preparan casetes de CDR sintéticos bicatenarios mediante síntesis de ADN según las secuencias de CDR y CDR’ tal como se especifica en el presente documento. Estos casetes se proporcionan con extremos cohesivos de modo que pueden ligarse en uniones de un entramado deseado de origen
50 humano. También pueden prepararse polinucleótidos que codifican para anticuerpos de cadena única según, por ejemplo de manera análoga, a un método convencional. Un polinucleótido según la presente invención así preparado puede transferirse convenientemente a un vector de expresión apropiado.
Pueden encontrarse líneas celulares apropiadas según, por ejemplo de manera análoga, a un método convencional. Se conocen vectores de expresión, que comprenden por ejemplo promotor(es) adecuado(s) y genes que codifican
para partes constantes de cadenas pesadas y ligeras, por ejemplo, y están disponibles comercialmente.
Se conocen huéspedes apropiados o pueden encontrarse según, por ejemplo de manera análoga, a un método convencional e incluyen cultivo celular o animales transgénicos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que 5 codifica para un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención.
En otro aspecto la presente invención proporciona
-
un sistema de expresión que comprende un polinucleótido según la presente invención pudiendo dicho sistema de expresión o parte del mismo producir un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención, cuando dicho sistema de expresión está presente en una célula huésped compatible ; y
-
una célula huésped aislada que comprende un sistema de expresión tal como se definió anteriormente.
Se ha encontrado además que un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención inhibe respuestas aloinmunitarias primarias de un modo dependiente de la dosis tal como se determina mediante MLR in vitro. Los resultados indican que las células que se habían aloactivado en presencia de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención están alteradas en sus respuestas a un aloantígeno. Esto 15 confirma la indicación de que un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención puede actuar directamente sobre las células T alorreactivas efectoras y modular su función. Además, se estudiaron adicionalmente las propiedades funcionales de células T derivadas de la MLR primaria en experimentos de reestimulación en MLR secundaria, usando células estimuladoras específicas o estimuladores de terceras partes para evaluar la especificidad de los efectos funcionales observados. Se ha encontrado que las células derivadas de MLR primaria en las que está presente un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención, estaban alteradas en su capacidad para responder a una estimulación óptima posterior con células estimuladoras específicas, aunque no hubiera ningún anticuerpo añadido a los cultivos secundarios. La especificidad de la inhibición se demostró mediante la capacidad de las células tratadas con un anticuerpo humanizado frente a CD45R0/RB según la presente invención para responder de manera normal a células estimuladoras de donantes de
25 terceras partes no relacionados. Los experimentos de reestimulación usando células T derivadas de cultivos de MLR primaria indican por tanto que las células que se habían aloactivado con CD45RO/RB según la presente invención son hiposensibles, es decir, tolerantes, al aloantígeno original. Se describen actividades biológicas adicionales en el ejemplo 7.
Además, se ha encontrado que la proliferación celular en células tratadas previamente con un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención puede rescatarse mediante IL-2 exógena. Esto indica que el tratamiento de células T alorreactivas con un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB, según la presente invención, induce un estado de tolerancia. De hecho, las respuestas proliferativas reducidas observadas en células tratadas con un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención, se debían a la alteración de la función de células T, y estas células podían responder a IL-2 exógena, indicando que estas células están en un
35 estado anérgico, no sensible verdadero. La especificidad de esta respuesta se mostró mediante la capacidad de las células tratadas con un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención para proliferar de manera normal en células de donantes no relacionadas hasta el nivel de las células tratadas de control.
Experimentos adicionales indican que la unión de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención a CD45RO y CD45RB puede inhibir las respuestas de memoria de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes inmunizados frente a un antígeno de recuerdo específico. Por tanto, la unión de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención a CD45RO y CD45RB es también eficaz en la inhibición de respuestas de memoria frente a Ag soluble. La capacidad de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención para inhibir respuestas de recuerdo frente al tétanos en PBMC de donantes inmunizados indica que el anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención
45 puede seleccionar como diana y modular la activación de células T de memoria. Por ejemplo, estos datos indican que un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención, además de reconocer células T activadas y alorreactivas, puede modular su función, dando como resultado la inducción de anergia de células T. Esta propiedad puede ser importante en el tratamiento de respuestas inmunitarias en curso frente a autoantígenos y alérgenos y posiblemente frente a aloantígenos tal como se observa en enfermedades autoinmunitarias, alergia y rechazo crónico, y enfermedades, tales como psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, en las que las respuestas de memoria desempeñan un papel en el mantenimiento del estado patológico. Se cree que es una característica importante en una situación patológica, tal como en enfermedades autoinmunitarias en las que las respuestas de memoria frente a autoantígenos pueden desempeñar un papel importante para el mantenimiento de la enfermedad.
55 Se ha encontrado también que un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención puede modular respuestas proliferativas de células T en una respuesta de linfocitos mixtos (MLR) in vivo, es decir, se encontró que una molécula de unión a CD45RO/RB según la presente invención tenía propiedades inhibidoras correspondientes en pruebas in vivo.
Por tanto, un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención puede tener propiedades
5 inmunosupresoras y tolerogénicas y puede ser útil para la inducción de tolerancia in vivo y ex vivo frente a aloantígenos, autoantígenos, alérgenos y antígenos de la flora bacteriana, por ejemplo una molécula de unión a CD45RO/RB según la presente invención puede ser útil en el tratamiento y la profilaxis de enfermedades incluyendo por ejemplo enfermedades autoinmunitarias, tales como, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Graves, diabetes tipo I y tipo II, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico,
10 síndrome de Sjogren, esclerodermia, gastritis autoinmunitaria, glomerulonefritis, rechazo de trasplantes, por ejemplo rechazo de xenoinjerto y aloinjerto de tejidos y órganos, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), y también psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y alergias.
En otro aspecto la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención como producto farmacéutico, por ejemplo en el tratamiento y la profilaxis de enfermedades 15 autoinmunitarias, rechazo de trasplantes, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y alergias.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención para la producción de un medicamento en el tratamiento y profilaxis de enfermedades asociadas con enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplantes, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y alergias.
20 En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado frente a CD45RO/RB según la presente invención en asociación con al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica puede comprender además, por ejemplo principios activos, por ejemplo otros anticuerpos inmunomoduladores tales como, pero sin limitarse a anti-ICOS, anti-CD154, antCD134L o proteínas 25 recombinantes tales como, pero sin limitarse a rCTLA-4(CD152), rOX40(CD134), o compuestos inmunomoduladores tales como, pero sin limitarse a ciclosporina A, FTY720, RAD, rapamicina, FK506,15-desoxiespergualina, esteroides.
En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento y/o profilaxis de enfermedades asociadas con enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplantes, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y alergias que comprende administrar a un sujeto que necesita un tratamiento y/o una profilaxis de este tipo una cantidad
30 eficaz de una molécula de unión a CD45RO/RB según la presente invención, por ejemplo en forma de una composición farmacéutica según la presente invención.
Las enfermedades autoinmunitarias que van a tratarse con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Graves, diabetes tipo I y tipo II, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, esclerodermia, gastritis autoinmunitaria, glomerulonefritis; rechazo de
35 trasplantes, por ejemplo rechazo de xenoinjerto y aloinjerto de tejidos y órganos y enfermedad de injerto contra huésped (GVHD).
Ejemplos
La invención se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. En los siguientes ejemplos, todas las temperaturas son en
40 grados centígrados.
El “AcM candidato” o “anticuerpo quimérico” es una molécula de unión a CD45RO/RB según la presente invención que comprende la cadena ligera de SEQ ID NO:3 y la cadena pesada de SEQ ID NO:4.
Se usan las siguientes abreviaturas:
ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
45 FACS clasificación celular activada por fluorescencia
FITC isotiocianato de fluoresceína
FBS suero bovino fetal GVHD enfermedad de injerto contra huésped
HCMV promotor de citomegalovirus humano
IgE inmunoglobulina isotipo E
IgG inmunoglobulina isotipo G
5 PBS solución salina tamponada con fosfato
PCR reacción en cadena de la polimerasa
xGVHD enfermedad de xenoinjerto frente a huésped
Ejemplo 1: Respuesta de linfocitos mixtos primaria (MLR)
Células
10 Se obtienen muestras de sangre de donantes humanos sanos. Se aíslan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia LKB) a partir de leucocitos de sangre periférica completa, leucoféresis o capas leucocíticas con tipo de sangre conocido, pero tipo de HLA desconocido. En algunos experimentos de MLR, se usan directamente PBMC como células estimuladoras tras la irradiación a 40 Gy. En otros experimentos, se redujeron las células T de PBMC usando Dynabeads CD2 o CD3 (Dynal, Oslo, Noruega). Se
15 eliminaron las perlas y las células contaminantes mediante un campo magnético. Se usan PBMC reducidas en células T como células estimuladoras tras la irradiación. Se usan PBMC, células T CD3+ o células T CD4+ como células que responden en MLR. Se preparan células de diferentes donantes para dar células estimuladoras. Se purifican células T CD3+ mediante selección negativa usando AcM anti-CD16 (Zymed, CA), Dynabeads de IgG de cabra anti-ratón, Dynabeads anti-CD14, Dynabeads CD19. Además, se usan Dynabeads anti-CD8 para purificar
20 células T CD4. Se analizan las células obtenidas mediante FACScan o FACSCalibur (Becton Dickinson &amp; Co., CA) y la pureza de las células obtenidas era >75%. Se suspenden las células en medio RPM11640, complementado con un 10% de FBS inactivado por calor, penicilina, estreptomicina y L-glutamina.
Reactivos
Se genera también el AcM quimérico anti-CD45RO/RB, “AcM candidato” y un anticuerpo quimérico de control de
25 isotipo coincidente. Se adquiere anticuerpo IgG1 de control de ratón (ser humano) específico para KLH (hemocianina de lapa californiana) o IL-10 humana recombinante de BD Pharmingen (San Diego, CA). El AcM anti-CD154 humano 5c8 es según Lederman et al 1992.
Respuesta de linfocitos mixtos primaria (MLR)
Se mezclan alícuotas de 1 x 105 PBMC o 5 X 104 de células CD3+ o CD4+ con 1x105 PBMC irradiadas o 5 x 104
30 PBMC irradiadas (50 Gy) reducidas en células T en cada pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA) en presencia del AcM indicado o ausencia de Ac. En algunos experimentos, se añade fragmento F(ab’)2 de Ig de cabra anti-ratón o anticuerpo de cabra anti-Ig humana específico para la parte Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a 10 !g/ml además del AcM candidato para garantizar la reticulación in vitro óptima de las moléculas CD45 diana. Se cultivan las células mezcladas durante 4 ó 5 días a 37ºC en un 5% de CO2
35 y se determina la proliferación pulsando las células con 3H-timidina durante las últimas 16 - 20 horas de cultivo. Otros experimentos son similares a los descritos anteriormente, pero con las siguientes excepciones: 1) el medio usado es EX-VIVO (Bio-Whittaker) que contiene un 10% de FBS y un 1% de plasma humano; 2) se usa IgG total anti-ratón (5 !g/ml) como etapa de reticulación secundaria; 3) la irradiación de células estimuladoras es a 60 Gy. Se realiza MLR primaria en presencia del “AcM candidato” o IgG1 quimérica de control (10 !g/ml) ambos con un reactivo
40 de etapa secundaria, fragmento F(ab’)2 de anticuerpo de cabra anti-Ig humana específico para la parte Fc (10 !g/ml). Se calcula el porcentaje de inhibición por el “AcM candidato” en comparación con la proliferación celular en presencia de IgG1 de control. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación:
TABLA 1
Inhibición de MLR primaria por 10 !g/ml de un AcM candidato según la presente invención
Respondedor
Estimulador (PBMC irr.) % de inhibición
CD4 de n.º 211
CD3 de n.º 219 63,51
CD4 de n.º 220
CD3 de n.º 219 red. 63,07
CD4 de n.º 227
CD3 de n.º 220 red. 65,96
CD4 de n.º 229
CD3 de n.º 219 red. 50,76
Promedio ± DE
60,83 ± 6,83*
* Significativamente diferente del valor de control (P<0,001)
Un AcM candidato según la presente invención inhibe MLR primaria tal como puede observarse a parir de la tabla 1. El efecto inhibitorio promedio es del 60,83 ± 6,83% en células T CD4+ derivadas de cuatro donantes diferentes y es 5 estadísticamente significativo. Se muestra que la inhibición de la MLR primaria por el “AcM candidato” es dependiente de la dosis en el intervalo de 0,001 y 10 !g/ml del “AcM candidato” tal como se muestra en la figura 1. La CI50 para la inhibición de la MLR primaria por un “AcM candidato” se determina a partir de los resultados de tres experimentos de MLR separados usando PBMC de un donante como células que responden. Por tanto, se mezclan células T CD4+ que responden del doante n.º 229 y n.º 219 y PBMC irradiadas reducidas en células T en presencia
10 de un “AcM candidato” o Ac quimérico de control con 10 !g/ml de fragmento F(ab’)2 de anticuerpo de cabra anti-Ig humana. Se repiten los experimentos 3 veces y se calcula el porcentaje de proliferación en presencia de un “AcM candidato” en comparación con la proliferación de células T en presencia de Ac de control. Se determina el valor de CI50 usando Origin (v. 6.0®). Se calcula que el valor de CI50 de la actividad celular es de 0,87 ± 0,35 nM (0,13 ± 0,052 !g/ml).
15 Ejemplo 2: MLR secundaria
Con el fin de evaluar si un “AcM candidato” induce falta de respuesta de células T CD4+ a aloantígenos específicos, se realiza MLR secundaria en ausencia de cualquier anticuerpo tras la MLC primaria. Se cultivan células T CD4+ con células estimuladoras alogénicas irradiadas (PBMC reducidas en células T) en presencia del anticuerpo indicado en placas de cultivo de 96 pocillos durante 10 días (MLC primaria). Entonces, se recogen las células, se distribuyen en 20 capas en un gradiente de Ficoll-Hypaque para eliminar las células muertas, se lavan dos veces con RPMI y se reestimulan con el mismo estimulador, células estimuladoras de 3as partes o IL-2 (50 U/ml). Se cultivan las células durante 3 días y se determina la respuesta proliferativa pulsando las células con 3H-timidina durante las últimas 16 20 horas de cultivo. Específicamente, se cultivan células T CD4+ con células estimuladoras alogénicas irradiadas (PBMC reducidas en células T tomadas de otros donantes) en presencia de 10 !g/ml del “AcM candidato”, Ac
25 quimérico IgG1 de control y fragmento F(ab’)2 de anticuerpo de cabra anti-Ig humana. Se determina la proliferación de MLR primaria en el día 5. Para la MLR secundaria, se cultivan las células que responden y estimuladoras durante 10 días en presencia del “AcM candidato”, entonces se recogen las células, se lavan dos veces en RPMI1640 y se reestimulan con estimulador específico, estimuladores de terceras partes o IL-2 (50 U/ml) en ausencia de cualquier Ac. Se determina la proliferación celular en el día 3. Los resultados se exponen en la tabla 2:
TABLA 2
N.º de donante de células T CD4+ que responden
% de inhibición de MLR secundaria
n.º 211
49,90*
n.º 220
59,33*
n.º 227
58,68*
* Significativamente diferente del valor control (p=<0,001 determinado mediante la prueba de la t, SigmaStat V.2.03). n.º p=<0,046
Con el fin de evaluar si la proliferación alterada se debe a la falta de respuesta como consecuencia del tratamiento con un “AcM candidato”, se cultivan las células derivadas de MLR primaria en presencia de IL-2 (50 U/ml). La
5 adición de IL-2 da como resultado el rescate de las respuestas proliferativas de las células T que se habían tratado con un “AcM candidato” en MLR primaria, hasta niveles similares a los observados en presencia de Ac de control IgG1. Estos datos indican que la respuesta secundaria alterada en células T tratadas con un “AcM candidato” se debe a la alteración funcional de las células T que responden que se vuelven carentes de respuesta a las células estimuladoras específicas. Se calcula el porcentaje de inhibición según la siguiente fórmula:
c.p.m con Acdecontrol-c.p.m.con &quot;Acmcandidato&quot;
10 x 100
c.p.m.con Acdecontrol
El análisis estadístico se realiza usando SigmaStat (vers. 2.03). Se analizan los datos mediante ANOVA de dos vías seguido por el método de Dunnett. En todos los procedimientos de prueba, las probabilidades <0,05 se consideran significativas. En algunos experimentos se usa la prueba de la t (SigmaStat v. 2.03).
Ejemplo 3: Estudios de supervivencia in vivo en ratones SCID
15 Injerto de hu-PBL en ratones SCID
Se inyectan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas por vía intraperitoneal en ratones SCID
C.B 17 / ratones GbmsTac-Prkdcscid Lysrbg (Taconic, Germantown, NY) en una cantidad suficiente para inducir una enfermedad de injerto xenogénico frente a huésped letal (xGvHD) en >90% de los ratones en el plazo de 4 semanas tras la transferencia de células. Tales ratones SCID tratados se denominan a continuación en el presente documento
20 ratones hu-PBL-SCID.
Tratamiento con AcM de ratones hu-PBL-SCID
Se tratan ratones Hu-PBL SCID con un “AcM candidato” o controles de AcM de isotipo coincidente quiméricos o de control en el día 0, inmediatamente tras la inyección de PBMC, en el día 3, día 7 y a intervalos semanales después de eso. Se administran los AcM por vía subcutánea en 100 !l de PBS a una concentración final de 5 mg/kg de peso
25 corporal. Se detuvo el tratamiento cuando todos los ratones control murieron.
Evaluación de los resultados de tratamiento
El criterio principal para evaluar la eficacia de un “AcM candidato” en este estudio era la supervivencia de los ratones hu-PBLSCID. Se evalúa la significación de los resultados mediante el método estadístico de análisis de la supervivencia usando la prueba de rangos logarítmicos (método de Mantel) con la ayuda del software Systat v9.01. 30 El método de análisis de la supervivencia es una prueba no paramétrica, que no sólo considera si un ratón particular está todavía vivo sino también si se sacrificó por motivos irrelevantes para el tratamiento/enfermedad tales como el requisito de realizar análisis in vitro con sus órganos/células. Se obtienen biopsias del hígado, pulmón, riñón y bazo de ratones muertos para su evaluación adicional. Además, se pesan ratones hu-PBL-SCID al comienzo (antes de la transferencia de células) y durante (cada dos días) todo el experimento como estimación indirecta de su estado de
35 salud. Se generaron líneas de regresión lineal usando los valores de peso corporal frente a los días tras la transferencia de PBMC obtenidos de cada ratón y posteriormente se compararon sus pendientes (control frente a ratones tratados con anti-CD45) usando la prueba de Mann-Whitney no paramétrica.
Resultados
Todos los ratones hu-PBL-SCID tratados con controles de AcM de ratón tenían leucocitos humanos infiltrados en el pulmón, hígado y bazo y murieron (4/4) en el plazo de aprox. 2 a 3 semanas tras la transferencia de células. La muerte es probablemente una consecuencia de xGvHD. Además, los ratones tratados con AcM de control perdieron peso de una manera lineal, aprox. el 10% y más en el plazo de 3 semanas. Todos los ratones hu-PBL-SCID tratados con un “AcM candidato” sobrevivieron (4/4) sin ningún signo aparente de enfermedad más de 4 semanas, aún cuando se detuvo el tratamiento con “AcM candidato” tras 3 semanas. Los ratones tratados con “AcM candidato” aumentaron de peso de una manera lineal, hasta aprox. el 5% en el plazo de 4 semanas.
Ejemplo 4: Expresión de anticuerpos de la invención
Expresión de anticuerpo humanizado que comprende una SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10
Se construyen vectores de expresión según el mapa de plásmido mostrado en las figuras 2 a 5, que comprenden los nucleótidos correspondientes que codifican para la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera humanizada humV1 (SEQ ID NO:7), región variable de cadena ligera humanizada humV2 (SEQ ID NO:8), región variable de cadena pesada humanizada VHE (SEQ ID NO:9) o región variable de cadena pesada humanizada VHQ (SEQ ID NO:10), respectivamente. Estos vectores de expresión tienen las secuencias de ADN (nucleótidos) SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 o SEQ ID NO 18, respectivamente.
Construcción de vectores de expresión de cadena ligera y pesada de anticuerpo humanizado
Vectores de expresión de cadena ligera kappa humana para las versiones VLh y VLm
Con el fin de construir el vector de expresión final que codifica para la cadena ligera humanizada completa de isotipo kappa humano, se escindieron fragmentos de ADN que codificaban para las regiones variables de cadena ligera completas (VLh y VLm) de los vectores de clonación PCR-Script que contenían VLh y VLm (Stratagene) (región VLm) usando HindIII y BgIII. Entonces se subclonaron los fragmentos purificados en gel en los sitios de HindIII y BamHI del vector de expresión C21-HCMV Kappa que se creó durante la construcción del anticuerpo humanizado anti-IgE TESC-21 (Kolbinger et al 1993) y que originalmente se recibió de M. Bendig (MRC Collaborative Centre, Londres, R.U.) (Maeda et al. 1991). Se purificaron los productos de ligación mediante extracción con fenol/cloroformo, y se sometieron a electroporación en la cepa Epicurian Coli® XL1-Blue competente para electroporación (n.º de catálogo 200228, Stratagene). Tras sembrar en placa en placas de agar LB/amp durante la noche a 37ºC, se recogieron una de cada 12 colonias para preparar ADN de plásmido a partir de un cultivo de 3 ml usando el equipo BioRobot 9600 (Qiagen). Esto proporcionó los vectores de expresión de cadena ligera para las versiones de anticuerpo humanizado VLh y VLm, respectivamente, tal como se describe adicionalmente en las figuras.
Vectores de expresión de cadena pesada gamma 1 humana para VHQ
Para la construcción del vector de expresión VHQ, se adoptó un enfoque gradual. En primer lugar, se ensambló la región variable completa de VHQ mediante PCR según la metodología descrita en Kolbinger et al 1993 (Protein Eng. 1993 Nov; 6(8):971-80) y se subclonó en el vector de expresión C21-HCMV-gamma-1 del que se había retirado el inserto C21 usando las mismas enzimas. Entonces se subclonó un fragmento de HindIII/BamHI del clon VHQ de PCRScript que contenía la región variable completa en el vector de expresión C21-HCMV-gamma-1 escindido con las mismas enzimas. Esto proporcionó el vector de expresión final para la versión VHQ del anticuerpo humanizado.
Vectores de expresión de cadena pesada gamma 1 humana para VHE
Se logró la construcción del vector de expresión de VHE final que codificaba para la cadena pesada humanizada completa de isotipo gamma 1 humano ligando directamente un fragmento de PCR sometido a restricción por HindIII y BamHI que codificaba para la región variable en los sitios de HindIII y BamHI del vector de expresión C21-HCMV gamma-1 que se creó durante la construcción del anticuerpo humanizado anti-IgE TESC-21 (Kolbinger et al 1993) y que también se recibió originalmente de M. Bendig (MRC Collaborative Centre, Londres, R.U.) (Maeda et al. 1991).
Expresión transitoria en células COS
El siguiente protocolo de transfección está adaptado para células COS adherentes en placas de cultivo celular de 150 mm, usando reactivo de transfección SuperFect™ (n.º de catálogo 301305, Qiagen). Los cuatro vectores de expresión diferentes descritos anteriormente se usan para la transfección transitoria de células. Para la expresión de anticuerpo humanizado, cada uno dos clones que contienen insertos de cadena pesada (VHE o VHQ, respectivamente) se transfectan conjuntamente en células con cada uno de los dos clones que codifican para las
cadenas ligeras (humV1 o humV2, respectivamente), en total 4 combinaciones diferentes de vectores de expresión de cadena pesada y ligera (VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2). Antes de la transfección, se linealizan los plásmidos con la endonucleasa de restricción PvuI que escinde en la región que codifica para el gen de resistencia para ampicilina. El día antes de la transfección, se siembran 4 x 106 células COS en 30 ml de medio de 5 cultivo reciente en placas de cultivo celular de 150 mm. La siembra a esta densidad celular proporcionó generalmente una confluencia al 80% tras 24 horas. En el día de la transfección, se diluyen cuatro combinaciones diferentes de vectores de expresión de ADN de cadena pesada y ligera linealizados (15 !g cada uno) en un volumen total de 900 !l de medio reciente sin suero ni antibióticos. Entonces se mezclan meticulosamente 180 !l de reactivo de transfección SuperFect con la disolución de ADN. Se incuba la mezcla de ADN durante 10 min. a temperatura ambiente para permitir la formación de complejo. Mientras tiene lugar la formación de complejo, se retira el medio de crecimiento de los cultivos de células COS, y se lavan las células una vez con PBS. Entonces se añaden 9 ml de medio de cultivo reciente (que contiene el 10% de FBS y antibióticos) a cada tubo de reacción que contiene los complejos de transfección y se mezcla bien. Se transfiere inmediatamente la preparación final a cada uno de los 4 cultivos que van a transfectarse y se mezcla suavemente. Entonces se incuban los cultivos celulares con los
15 complejos de ADN durante 3 horas a 37ºC y CO2 al 5%. Tras la incubación, se retira el medio que contiene complejos de transfección y se sustituye por 30 ml de medio de cultivo reciente. A las 48 h tras la transfección, se recogen los sobrenadantes de cultivo.
Concentración de sobrenadantes de cultivo
Para el análisis de ELISA y FACS, se concentran los sobrenadantes de cultivo recogidos de células COS transfectadas con plásmidos de cadena pesada y ligera tal como sigue. Se añaden 10 ml de cada sobrenadante a dispositivos de filtración centrífuga Centriprep YM-50 (n.º de catálogo 4310, Millipore) tal como se describe por el fabricante. Se centrifugan los filtros Centriprep durante 10 min. a 3000 rpm a temperatura ambiente. Entonces se repite la etapa de centrifugación de nuevo con los 20 ml restantes de sobrenadante usando sólo 5 min. de centrifugación y supervisando la evolución de la concentración. Se recuperan los 500 ul intermedios de
25 sobrenadante concentrado, se transfieren a nuevos dispositivos de filtración centrífuga Microcon (n.º de catálogo 42412, Microcon) y se concentran adicionalmente siguiendo las instrucciones del fabricante. Se centrifugan los sobrenadantes concentrados cuatro veces durante 24 min. a 3000 rpm a temperatura ambiente, una vez durante 10 min a 6000 rpm y después tres veces durante 5 min, siempre supervisando la evolución de la concentración.
El volumen final de medio condicionado concentrado logrado es de 100-120 ul correspondiente a una concentración de 250 a 300 veces del medio de cultivo original y se almacena a 4ºC hasta su uso. Para comparación y control, se concentra de manera similar medio de cultivo a partir de células sin transfectar, usando el mismo protocolo de centrifugación descrito anteriormente.
Ejemplo 5: Determinación de la expresión de IgG humanizada recombinante mediante ELISA
Para determinar las concentraciones de IgG de anticuerpo humanizado recombinante expresado en los
35 sobrenadantes de cultivo, se ha desarrollado un protocolo de ELISA tipo sándwich y se ha optimizado usando IgG humana como patrón. Se recubren placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (n.º de catálogo 4-39454, Nunc Immunoplate Maxisorp) durante la noche a 4ºC con 100 !l de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (molécula completa, n.º de catálogo 11011, SIGMA) a la concentración final de 0,5 !g/ml en PBS. Entonces se lavan los pocillos 3 veces con tampón de lavado (PBS que contiene Tween 20 al 0,05%) y se bloquean durante 1,5 horas a 37ºC con tampón de bloqueo (BSA al 0,5% en PBS). Tras 3 ciclos de lavado, se preparan las muestras de anticuerpo y la IgG humana patrón (n.º de catálogo 14506, SIGMA) mediante dilución de 1,5 veces en serie en tampón de bloqueo. Se transfieren 100 !l de muestras diluidas o patrón por duplicado a la placa recubierta y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la incubación, se lavan las placas 3 veces con tampón de lavado y posteriormente se incuban durante 1 hora con 100 !l de anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa del
45 rábano anti-cadena ligera kappa de IgG humana (n.º de catálogo A-7164, SIGMA) diluido a 1/4000 en tampón de bloqueo. Los pocillos de control recibieron 100 pi de tampón de bloqueo o medio de cultivo normal concentrado. Tras el lavado, se realiza la cuantificación colorimétrica de peroxidasa unida en los pocillos de muestra y patrón, usando un kit TMB Peroxidase EIA Substrate (n.º de catálogo 172-1067, Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se añade la mezcla de peroxidasa a 100 !l por pocillo y se incuba durante 30 min. a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detiene la reacción colorimétrica mediante adición de 100 !l de ácido sulfúrico 1 M y se lee la absorbancia de cada pocillo a 450 nm, usando un lector de placas de ELISA (modelo 3350-UV, BioRad).
Con un coeficiente de correlación de 0,998 para la curva patrón de IgG, se determinan las siguientes concentraciones para los cuatro concentrados de cultivo diferentes (concentrado aprox. 250-300 veces):
sobrenadante de VHE/humV1 = 8,26 !g/ml
55 sobrenadante de VHE/humV2 = 6,27 !g/ml
sobrenadante de VHQ/humV1 = 5,3 !g/ml
sobrenadante de VHQ/humV2 = 5,56 !g/ml
Ejemplo 6: Análisis de competición de FACS (afinidad de unión)
Se elige la línea de células T humanas PEER como célula diana para el análisis de FACS porque expresaba el antígeno CD45 sobre su superficie celular. Para analizar la afinidad de unión de sobrenadantes de anticuerpo humanizado, se realizan experimentos de competición usando anticuerpo quimérico marcado con FITC como referencia y se compara con la inhibición de anticuerpo de ratón purificado y de anticuerpo quimérico. Se centrifugan cultivos de células PEER durante 10 a 3000 rpm y se retira el medio. Se resuspenden las células en tampón de FACS (PBS que contiene el 1% de FBS y el 0,1% de azida de sodio) y se siembran en una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos a una densidad celular de 1x105 células por pocillo. Se centrifuga la placa y se desecha el sobrenadante. Para estudios de bloqueo, en primer lugar se añaden 25 !l de medio no transfectado concentrado o anticuerpo de control de isotipo coincidente (controles negativos), anticuerpo quimérico o anticuerpo de ratón sin marcar (controles positivos) así como sobrenadante concentrado que contiene las diversas combinaciones de anticuerpo humanizado (muestras), en cada pocillo a las concentraciones indicadas en el texto. Tras 1 hora de incubación a 4ºC, se lavan células PEER con 200 !l de tampón de FACS mediante centrifugación. Posteriormente se incuban células durante 1 hora a 4ºC con anticuerpo quimérico conjugado con FITC en 25 !l de tampón de FACS a la concentración final de 20 !g/ml. Se lavan las células y se resuspenden en 300 !l de tampón de FACS que contiene yoduro de propidio 2 !g/ml lo que permite activar células viables. Se analizan las preparaciones celulares en un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson).
El análisis de FACS indica un bloqueo dependiente de la dosis de anticuerpo quimérico marcado con fluorocromo mediante los sobrenadantes de cultivo de anticuerpo humanizado concentrados. No se observa ningún bloqueo dependiente de la dosis de la unión de anticuerpo quimérico con el anticuerpo de control de isotipo coincidente, lo que indica que el efecto de bloqueo por las diferentes combinaciones de anticuerpo humanizado es específico de epítopo y que la especificidad de epítopo parece conservarse tras el proceso de humanización.
Ejemplo 7: Actividades biológicas de moléculas de unión a CD45RB/RO
En este estudio, se ha abordado si el anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO, cuando está presente en cultivos de células T humanas primarias activadas de manera policlonal (i) soporta la diferenciación de células T con un fenotipo Treg característico, (ii) impide o potencia la apoptosis tras la activación de células T y (iii) afecta a la expresión de receptores y antígenos específicos de subconjunto tras la reestimulación.
El anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO potencia la muerte celular de células T activadas de manera policlonal
Se sometieron células T primarias (mezcla de subconjuntos T CD4+ y CD8+) a activación mediante AcM anti-CD3 más anti-CD28 (200 ng/ml cada uno) en presencia o ausencia (=control) de anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO. Se retiraron los anticuerpos en exceso mediante lavado el día 2. Se usó 7-amino-actinomicina D (7-AAD) como colorante de tinción de ADN captado por células apoptóticas y necróticas para medir la muerte celular tras la activación. Los resultados muestran que la activación de células T en presencia de anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO aumentó la fracción de células positivas para 7-AAD en dos veces en el día 2 tras el cultivo. En el día 7, la parte de células positivas para 7-AAD fue de nuevo similar en cultivos control y tratados con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO.
Las células T tratadas con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO, pero no con AcM control, muestran un fenotipo de célula T reguladora (Treg)
El aumento de la expresión de CD25 y la proteína reguladora negativa CTLA-4 (CD152) es un marcador de células Treg. La supresión funcional de respuestas primarias y secundarias de células T mediante anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO puede deberse a la inducción de células Treg. Para abordar este asunto, se activaron células T mediante AcM anti-CD3 + CD28 y se cultivaron en presencia de anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO o AcM control anti-LPS. El tiempo tratar este asunto, se activaron células T mediante AcM anti-CD3 + CD28 y se cultivaron en presencia de anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO o AcM control anti-LPS. El transcurso de tiempo de la expresión de CTLA-4 y CD25 revela marcadas diferencias entre controles y células T tratadas con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO en los días 1 y 3 tras la estimulación secundaria, lo que indica un fenotipo Treg.
La expresión de CTLA-4 intracelular se sostiene en presencia de anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO
Se ha notificado que también pueden encontrarse cantidades sustanciales de CTLA-4 de manera intracelular. Por tanto, en paralelo con la tinción de CTLA-4 de superficie, se analizó la expresión de CTLA-4 intracelular. Se observaron diferencias moderadas entre cultivos de células T en el día 4 tras la estimulación. Sin embargo, tras un cultivo prolongado sólo se sostuvieron altos niveles de CTLA-4 intracelular en células T tratadas con anticuerpo
5 quimérico de unión a CD45RB/RO pero no en células T de control.
Las células T tratadas con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO se vuelven dobles positivas para CD4 y CD8
Tras la estimulación, las células T inducen y regulan por incremento la expresión de varios receptores de superficie, tales como CD25, CD152 (CTLA-4), CD154 (CD40-ligando) y otros. En cambio, se piensa que el nivel de expresión 10 de CD4 o CD8 permanece relativamente constante. Se observó de manera reproducible un fuerte aumento de antígenos tanto CD4 como CD8 en células T tratadas con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO pero no tratadas con Ac de control tras la activación. La aparición de una población de células T dobles positivas para CD4/CD8 parece deberse a la regulación por incremento de CD4 en el subconjunto CD8+ y a la inversa, CD8 en el subconjunto CD4+. Esto contrasta con un porcentaje moderadamente bajo de células T dobles positivas en los
15 cultivos de control.
Alta expresión de cadena alfa de receptor de IL-2, pero muy baja de cadena beta por células T tratadas con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO
Se sabe que las células Treg son constitutivamente positivas para CD25, la cadena alfa del receptor de IL-2. Se desconoce la regulación de otras subunidades del receptor de IL-2 trimérico en células Treg. Recientemente se ha
20 comparado la expresión de la cadena beta del receptor de IL-2, por ejemplo CD122, en células T activadas y propagadas en presencia o ausencia de anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO. Los resultados muestran que células T tratadas con anticuerpo quimérico de unión a CD45RB/RO tienen aproximadamente diez veces menos expresión de CD122 en comparación con células T en cultivos de control. Esta diferencia puede indicar que las células Treg requieren factores distintos de IL-2 para proliferar.
25 Ejemplo 8: Secuencias de la invención (las secuencias de CDR de la invención están subrayadas)
SEQ ID NO:1
Parte de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera quimérica
SEQ ID NO:2 30 Parte de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada quimérica
SEQ ID NO:3 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera quimérica
35 SEQ ID NO:4
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada quimérica
SEQ ID NO:5 Secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:6 Secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:7 10 Parte de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera humanizada denominada humV2 (humV2 = VLm)
SEQ ID NO:8 Parte de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera humanizada denominada humV1 (humV1 = VLh)
SEQ ID NO:9 Parte de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada humanizada denominada VHE
SEQ ID NO:10 Parte de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada humanizada denominada VHQ
10 SEQ ID NO:11 Secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:12 Secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:13 Secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:14 Secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:15 Secuencia de nucleótidos del vector de expresión HCMV-G1 HuAb-VHQ 10 (secuencia de ADN completa de un vector de expresión de cadena pesada humanizada que comprende SEQ ID NO:12 (VHQ) desde 3921-4274)
SEQ ID NO:16 Secuencia de nucleótidos del vector de expresión HCMV-G1 HuAb-VHE (secuencia de ADN completa de un vector de expresión de cadena pesada humanizada que comprende SEQ ID NO:
11 (VHE) desde 3921-4274)
SEQ ID NO:17 Secuencia de nucleótidos del vector de expresión HCMV-K HuAb-VL1 hum V1 (secuencia de ADN completa de un vector de expresión de cadena ligera humanizada que comprende SEQ ID NO:
14 (humV1=VLh) desde 3964-4284)
SEQ ID NO:18 Secuencia de nucleótidos del vector de expresión HCMV-K HuAb-VL1 hum V2 (secuencia de ADN completa de un vector de expresión de cadena ligera humanizada que comprende SEQ ID NO:
13 (humV2=VLm) desde 3926-4246)

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Anticuerpo humanizado anti-CD45RO/RB que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID No:9 o de SEQ ID No:10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:7 o de SEQ ID No:8.
  2. 2.
    Anticuerpo humanizado anti-CD45RO/RB según la reivindicación 1 que comprende:
    -
    una región variable de cadena pesada de SEQ ID No:9 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:7;
    -
    una región variable de cadena pesada de SEQ ID No:9 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:8;
    -
    una región variable de cadena pesada de SEQ ID No: 10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:7, o
    -
    una región variable de cadena pesada de SEQ ID No: 10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:8.
  3. 3.
    Polinucleótidos aislados que codifican para un anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
  4. 4.
    Polinucleótidos aislados que codifican para una región variable de cadena ligera de SEQ ID No:7 o SEQ ID No:8 y una región variable de cadena pesada de SEQ ID No:9 o SEQ ID No:10.
  5. 5.
    Polinucleótido según la reivindicación 4, que comprende SEQ ID No:11 o SEQ ID No: 12 y SEQ ID No: 13 o SEQ ID No:14.
  6. 6.
    Vector de expresión que comprende polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
  7. 7.
    Sistema de expresión que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, pudiendo dicho sistema de expresión producir un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, cuando dicho sistema de expresión o parte del mismo está presente en una célula huésped compatible.
  8. 8.
    Célula huésped aislada que comprende un sistema de expresión según la reivindicación 7.
  9. 9.
    Uso del anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 como producto farmacéutico.
  10. 10.
    Uso del anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de un medicamento que va a usarse en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades autoinmunitarias, rechazo de trasplantes, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y alergias.
  11. 11.
    Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en asociación con al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
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