CZ20032236A3 - Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv - Google Patents
Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032236A3 CZ20032236A3 CZ20032236A CZ20032236A CZ20032236A3 CZ 20032236 A3 CZ20032236 A3 CZ 20032236A3 CZ 20032236 A CZ20032236 A CZ 20032236A CZ 20032236 A CZ20032236 A CZ 20032236A CZ 20032236 A3 CZ20032236 A3 CZ 20032236A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- calcium
- magnesium
- pantothenic acid
- solution
- pantothenate
- Prior art date
Links
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 185
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 46
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000654 additive Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 21
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 146
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 88
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 88
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 66
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 64
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 60
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 48
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 46
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 38
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 37
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 29
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 23
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 22
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 19
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 19
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 15
- ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L magnesium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Mg+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 14
- -1 magnesium halide Chemical class 0.000 claims description 14
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 13
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 12
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 12
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 claims description 12
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 11
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical class OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 claims description 4
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 3
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 claims description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical class [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 claims description 2
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 claims description 2
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 claims 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 claims 1
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 claims 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims 1
- GMDNUWQNDQDBNQ-UHFFFAOYSA-L magnesium;diformate Chemical compound [Mg+2].[O-]C=O.[O-]C=O GMDNUWQNDQDBNQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 26
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 12
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 12
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 12
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 10
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 8
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 101150051152 coaX gene Proteins 0.000 description 7
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 7
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 7
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 7
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 6
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 6
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 description 6
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 101150048956 coaA gene Proteins 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 5
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 description 5
- 101150028586 panE gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- GQTHJBOWLPZUOI-FJXQXJEOSA-M sodium D-pantothenate Chemical compound [Na+].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O GQTHJBOWLPZUOI-FJXQXJEOSA-M 0.000 description 5
- 229940068459 sodium pantothenate Drugs 0.000 description 5
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 4
- 101150109763 coaW gene Proteins 0.000 description 4
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 108010002447 aspartate-alpha-decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 description 3
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N (R)-pantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(O)=O OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N (R)-pantolactone Chemical compound CC1(C)COC(=O)[C@@H]1O SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100493587 Escherichia coli (strain K12) avtA gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101100028493 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) pan2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000193396 Virgibacillus pantothenticus Species 0.000 description 1
- 101100056949 Wolinella succinogenes (strain ATCC 29543 / DSM 1740 / LMG 7466 / NCTC 11488 / FDC 602W) ansA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150050280 alsD gene Proteins 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 101150082095 ansB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N azane;octadecanoic acid Chemical class [NH4+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229940069765 bean extract Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 101150031021 birA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 235000005939 calcium D-pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011680 calcium D-pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L calcium;3-aminopropanoate Chemical compound [Ca+2].NCCC([O-])=O.NCCC([O-])=O QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002036 drum drying Methods 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000011640 ferrous citrate Substances 0.000 description 1
- 235000019850 ferrous citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- ONSCBWDZUUNMMK-CTWWJBIBSA-L magnesium 3-[[(2S)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound C(CCNC([C@@H](O)C(C)(C)CO)=O)(=O)[O-].[Mg+2].C(CCNC([C@@H](O)C(C)(C)CO)=O)(=O)[O-] ONSCBWDZUUNMMK-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- OVGXLJDWSLQDRT-UHFFFAOYSA-L magnesium lactate Chemical class [Mg+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O OVGXLJDWSLQDRT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000015229 magnesium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 150000002948 pantothenic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
- A61N1/20—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
- A61N1/20—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents
- A61N1/205—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents for promoting a biological process
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
- A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
- A61N1/326—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for promoting growth of cells, e.g. bone cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká zlepšeného způsobu výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí a použití jako přísady do zvířecích krmiv. . , ’
Dosavadní stav techniky .·
Jako výchozí produkt pro.biosyntézu koenzymu A je D-pantothenát v rostlinném a zvířecím světě široce rozšířen. Na rozdíl od člověka, který přijímá kyselinu pantothenovou v dostatečném množství ve výživě, jsou však jak u rostlin , tak i u zvířat často popisovány jevy nedostatku D-pantothenátu. Dostupnost D-pantotheňátu je proto značným hospodářským zájmem, obzvláště v krmivářském průmyslu.
Obvyklým způsobem se provádí výroba D-pantothenátu chemickou syntézou z D-pantolaktou a kalcium-β-alaninátu (Ullmann s Encyclopedia of Indůstrial Chemistry, 6. vydání, 1999, elektronická verze, kapitola Vitamins). K přípravě D-pantolaktonu je nutné .nákladné;klasické štěpení racemátu přes diastereomerní soli. Výsledný prodejný produkt z cheř' · \ .
mické syntézy je většinou vápenatá‘sůl kyseliny D-pantothenové kalcium-D-pantothenát. '
Oproti chemické syntéze má biotechnologický způsob výroby pomocí mikroorganismů výhodu v.. selektivní (čisté enanciomery) přípravě D-formy kyseliny pantothenové, zhodno• · ι· ···· titelné vyššími organismy. Tím odpadá nákladné štěpení racemátu, které je nutné při chemické syntéze.
Fermentativní způsoby výroby kyseliny D-pantothenové pomocí mikroorganismů jsou běžně známy, mezi jiným z EP 0 ’
590 857, VO 96/33283, US 6 013 492, VO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 a EP 1 006 193.
Tak popisuje EP 1 006 189 a EP 1 001 027 způsob výroby pantothenátu, při kterém se ve fermentačním roztoku dosáhne obsah nejvýše 1 g/1 kyseliny D-pantothenové. Takový nepatrný obsah kyseliny pantothenové ve fermentačním roztoku, tedy méně než 10 % hmotnostních, vztaženo na obsah pevné látky, je však pro hospodárnou výrobu.doplňků zvířecího krmivá obsahujících kyselinu D-pantothenovou nevhodný. Další nevýhodou u dosud popisovaných způsobů je) že izolace produktu z fermentačního media vyžaduje početné a nákladné zpracovatelské kroky. Hospodárný způsob výroby ve velkoprovozním technickém měřítku není zveřejněn:
Ve vykládacím spisu DE'100 16 321 se popisuje způsob fermentace k výrobě doplňků zvířecího krmivá obsahujících kyselinu D-pantothenovou. 'Podstatnou nevýhodou tohoto způsobu je však, stejně jakou Výše uvedeného fermentativního způsobu, výroby kyseliny D-pantothenové, že se mikroorganísmům pomocí fermentačního media.musí nutně dodávat předstupeň kyseliny pantothenové, β-alanin, aby se dosáhlo hospodárných výtěžků požadovaného produktu. ..
Dále popisují US 6 013 492 a VO 96/332839 zpracování kyseliny D-pantothenové z ferméntačního roztoku odfiltrováním nerozpustných podílů (příkladně buněčný materiál) z kultivačního media, adsorpcí filtrátu na aktivním uhlí, následnou elucí kyseliny D-pantothenové organickým rozpouštědlem, s výhodou methanolem, neutralizací hydroxidem vápenatým a konečně krystalizací kalcium-D-pantothenátu. Podstatnými nevýhodami jsou ztráty cenného produktu, ke kterým dochází , při krystalizaci a rovněž používání organického rozpouštědla, které se z produktu jen těžko odstraňuje a vyvolává nutnost nákladného zpětného získávání rozpouštědla.
EP 0 590 857 popisuje způsob fermentace k výrobě kyseliny D-pantothenové, při kterém se při kultivaci mikroorganismu nutně vyžaduje dokrmování β-alaninem. Fermentační roztok se k oddělení biohmoty filtruje, potom se vede přes kationtoměnič a následně přes aniontoměnič, potom se neutralizuje hydroxidem vápenatým, odpaří se, smíchá s aktivním uhlím, ještě jednou se'přefiltruje a krystaluje se za přídavku methanolu a ‘chloridu vápenatého. Výsledný produkt obsahující kalciumpantothenát vedle kyseliny D-pantothenové ve formě její vápenaté soli obsahuje ještě chlorid vápenatý v molárním poměru 1 : 1. K redukci obsahu chloridu vápenatého je nutná elekfrodialýza s následným sušením rozstřikováním. Tento způsob má nevýhodu, že pro velký počet nákladných procesních kroků a používání organických rozpouštědel není ani ekonomický ani ekologický.
Úkolem předloženého vynálezu je dát k dispozici doplněk zvířecího krmivá obsahující kyselinu D-pantothenovou a/nebo její soli a rovněž jeho výrobu zlepšeným způsobem výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí, který by neměl výše uvedené nevýhody. Přitom je z ekonomických důvodů žádoucí takový způsob, při kterém se dokrmování β-alaninu výrazně redukuje nebo dokonce není ‘nutné. Dále je žádoucí výroba kyseliny D-pantothenové ve formě jejích dvojsytných • · ' ···· solí a zde především solí kovů alkalických zemin,. protože dvojsytné soli mají méně hygroskopické vlastnosti než jednosytné soli kyseliny D-pantothenové a pro další použití, příkladně jako doplněk zvířecího krmivá, tak mají méně výrazný sklon ke spékání.
Tento úkol byl výhodným způsobem vyřešen předloženým vynálezem.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí, jehož podstata spočívá v tom, že , t '? 1
a) se použije nejméně-jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biošyntéza.kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v kultivačním mediu se 'fermentací tvoří nejméně 2 g/1\soli kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí .0 ‘ až 20 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu
b) fermentační roztok, obsahující D-pantothenát se'vede přes kationtoměhič, přičemž ze solí kyseliny D-pantothenové vznikne volná kyselina;» D-pantothenová, ' · >
c) volná kyselina D-pantothenová obsažená v roztoku se přídavkem vápenaté a/nebo horečnaté báze upraví na hodnotu pH 3 až 10, přičemž se získá roztok, který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát a , ,
..· ·· J ·· ·· ·· 9999 β· · · · · · e . · · · • · · ···· · · 9
99999 9 9 099 9 9 ‘9 · · · 4» ····
d) roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě .1' formulace.
Při jedné variantě způsobu podle vynálezu se v kroku c) také získá suspenze, která obsahuje chlorid vápenatý a/nebo hořečnatý. V následujícím kroku d) se tato suspenze potom podrobí sušení a/nebo formulování.
Fermentace podle vynálezu, probíhající v kroku a), Se může provádět známými způsoby šaržovým provozem, šaržovým provozem s dávkováním, opakovaným šaržovým provozem s dávkováním nebo kontinuálním způsobem vedení procesu.
K neutralizaci vznikající kyseliny pantothenové se přitom využívají obvyklé puf rovací. systémy, jako je příkladně fosfátový pufr s hydroxidem sodným,' hydroxidem draselným nebo s amoniakem. ' . ;
V další variantě způsobu pódle vynálezu se v kroku a) tvoří fermantací v kultivačním mediu nejméně 10 g/1, s výhodou nejméně 20 g/1, obzvláště výhodně nejméně 40 g/1, nanejvýš výhodně nejméně 60 g/1 a zvláště nejméně 70 g/1 solí kyseliny D-pantothenové. . ,Podle vynálezu se form.uláCí·' produkovat' rozumí, že organismus může syntetizovat větší.množství kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích sólí, než je nutné pro vlástní potřebu látkové výměny. V jedné výhodné variantě podle vynálezu se nevyskytuje syntetizované množství kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí interně v buňkách, nýbrž jsou z organismu ideálním způsobem,vylučovány do kultivační-., ho media. Toto vylučování se může provádět aktivně nebo pa. . Λ . ··'······ ··· ·· · · 0 · 0 0>· • - · 0 0 0 0 0 0 10 0
6· 000»· · 0 000 0 · “ . · *··· 0 0 00 0 • 00 00 00 φ φ φ φ φ φ j
’ »
·. ί sivně známými mechanismy. « j.
i
Podle vynálezu se jako organismy, produkující kyselinu J D-pantothenovou, použijí mikroorganismy. K nim patří podle J vynálezu houby, kvasinky a/nebo bakterie. Podle vynálezu j jsou výhodné houby jako příkladně Mucor nebo kvasinky, jako r příkladně Saccharomyces nebo Debaromyces, s výhodou se po- ;
užije Saccharomyces cerevisiae. S výhodou se podle vynálezu použijí coryneformní bakterie nebo Bacillaceae. Podle vynálezu jsou s výhodou zahrnuty příkladně bakterie druhů j
Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, , Bevibacterium, Pseudomonas, .Salmonel l.a, Klebsiella, Próteus, 5 f Acinetobacter nebo Rhizobiuní. Obzvláště výhodné jsou zde příkladně Corynebacterium glutámicum, Brevibacterium breve nebo Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B.. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. círculans, B. coagulans, B. megaterium, B.pumilus, B. thuringiensis,. B. brevis, B. stearóthermophilus a další druhy bacilů ze skupiny 1, které jsou charakterizovány jejich lósRNA nebo Actinum mycetalis. Tento výčet slouží vysvětlení a v žádném případě není pro předložený vynález limitující. * ř
Navíc zahrnuje předložený vynález také použití geneticky změněných organismů k‘ výrobě doplňku zvířecího krmivá podle vynálezu, obsahujícího volnou kyselinu B-pantotheliovou a/nebo její soli. Takové geneticky změněné organismy se mohou příkladně izolovat chemickou'mutagenezí a následnou ?
selekcí vhodným screeningovým způsobem. Podle vynálezu jsou zahrnuty také tak zvané produkční kmeny, které jsou vhodné k výrobě produktu ve smyslu· předloženého vynálezu a vykazují genetické změny ž hlediska toku látkové výměny ve směru kyseliny D-pantothenové, přičemž jsou také zahrnuty ί .
• 9 9 ·
9
9 • · ·
' . ί' ί· změny z hlediska vylučování kyseliny D-pantothénové a/nebo ;
. · v jejích solí přes buněčnou membránu.Toho je možné dosáhnout ; příkladně změnami v klíčových pozicích relevantních čest ' t biosyntézy při látkové výměně použitého organismu. ' í ' f
- ’ ' í~
Možné je také použití transgeních organismů, které :
rezultují z přenosu homologních a/nebo heterologních ' <
sekvencí nukleotidů, které jsou nutné k syntéze požadovaného f produktu nebo mohou být nápomocné. Možná je přitom přeex- · ) prese a/nebo deregulace jednoho nebo několika genů jednotlivě a/nebo v kombinaci, lokalizovaných v genomu a/nebo na jeden vektor. ,
Transgení organismy takového druhu mohou s výhodou obsahovat dodatečné kopie a/nebo geneticky změněné geny, vybrané ze skupiny panB, panC, panD, panE a/nebo jejich kombinací a/nebo dokonce organizační jednotky, jako je operon BCD. Dále mohou být do organismů s výhodou manipulovány další cesty látkové výměny, jako příkladně cesta biosyntézy isoleucin-valin, jak se popisuje příkladně v EP 1 006 189,
EP 1 006 192, EP 1 006 193 nebo EP 1 001 027. Tím jsou ve zvýšené míře dány k dispozici výchozí sloučeniny pro biosyntézu kyseliny pantothenové s rozvětvenými řetězci.
S výhodou se případně geny pro tuto cestu biosyntézy, to znamená ilvB, ilvN, ilvC a/nebo’ilvD přeexprimuji.
Navíc jsou podle vynálezů do použitých organismů produkujících kyselinu pantothenovoú zahrnuty genetické změny aspartát-a-dekarboxylázy (panD), příkladně přeexpresí a/nebo deregulací. ‘ ,
Termínem deregulace ses podle vynálezu rozumí následuj ící : . / ’ -
| • · · 4 4 4 4 | 4 4 4 | 4 | 4 4 4 4 | 4444 4 | |||
| 4 | • 4 | 4 | |||||
| 4 4 4 4 · | 4 | 4 | 4 | 4 4 4 | 4 | 4 | |
| Λ 'f | 4 * 4 | 4 | 4 | 4 | 4 4 | 4 | 4 4 |
| 4 4 4 4 4. | 4 4 | 4 4 4 4 | 4 4 |
Změna nebo modifikace nejméně jednoho genu, který kóduje pro >
• i.
enzym při biosyntetické cestě látkové výměny, takže aktivita ‘ enzymu v mikroorganismu je změněna nebo modifikována. Vý- * í hodné je, aby nejméně jeden gen, který kóduje pro enzym při ( biosyntetické cestě látkové výměny byl změněn takovým í způsobem, aby se produkt genu tvořil intenzivněji nebo aby i, vykazoval zvýšenou aktivitu. Pojem deregulovaná cesta látkové výměny zahrnuje také biosyntetickou cestu látkové výměny, při které je více jak· jeden gen, který kóduje pro ’ í více jak jeden enzym změněn nebo modifikován tak, aby byly · ’ změněny nebo modifikovány aktivity více jak jednoho enzymu.
Změny nebo modifikace mohou zahrnovat, avšak nejsou omezeny na :
Odstranění endogeního promotoru nebo regulačních prvků; zavedení silných promotorů, indukovatelných promotorů nebo několika promotorů zároveň; odstřanění regulačních sekvencí, takže se změní exprese genového produktu; změna chromosomální polohy genu; změna sekvence DNA v blízkosti genu nebo uvnitř genu jako je příkladně tibosomální místo vazby (RBS); zvýšení počtu kopií genu v genomu nebo různý počet kopií vnesením plasmidů; modifikace proteinů (příkladně regulačních proteinů, suppresorů, ěnhančerů, trankriptionelních aktivátorů a podobně), které hrají roli při transkripci genu a/nebo při translaci na produkt genu. K tomu patří také všechny další možnosti k deregulaci exprese genů podle stavu techniky jako příkladně použití antisense-oleonukleotidů nebo blokace represorových proteinů.
Deregulace může také zahrnovat změny v kódující oblasti genů, které příkladně veďoU;k·posílení feedback-regulace v produktu genu nebo k větší.nebo menší specifické aktivitě produktu genu. . í• ·· ·· ·· ··' ···· • ♦ ♦ , · · · · Ο · -, · 9· • · · · · ·· · ’· « • ,····· · · Ο · · · · .· · · · · Ο · · · · ··· ··' ·· ·· ·· ·· !
Ί • , * ·ί ! I
Navíc jsou podle vynálezu výhodné genově technické *?· ► » změny na enzymech, které ovlivňují úbytek výchozích látek <
pro kyselinu pantothenovou a/nebo přesun kyseliny pantothe- . f nové na koenzym A. Kódující geny pro takové enzymy jsou ! j příkladně : alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX a další. ( i
Tento výčet slouží vysvětlení a v žádném případě není limitující pro pro předložený vynález.
Dále jsou výhodné genově’ technické změny, které zajíš- , '' · ~ . ί tují celulární dostupnost kofaktorů (příkladně methylentet- · ' rahydrofolát, redox-ekvivalenty a jiné) v množství optimálním pro produkci kyseliny pantothenové.
S výhodou je dostupný β-alanin již v buňkách ve zvýšené koncentraci oproti oproti odpovídajícím geneticky nezměněným organismům a nemusí se tak přidávat do kultivačního media jako prekursor, jak se požaduje příkladně podle ÉP-A 0 590 857. Výhodné jsou mikroorganismy, jejichž biosyntéza kyseliny pantothenové (pan)- á/nebo isoleucin-valin-(ilv)a/nebo asparát-a-dekarboxyláza ’jsou deregulované. Dále je výhodná dodatečná přeexprese ketopanthoátu-reduktázy (panE) v mikroorganismech.
Dále je podle vynálezu'výhodné, jestliže případně coaA-gen, který je nutný pro· syntézu koenzymu A, má sníženou i aktivitu nebo (příkladně v druzích Bacillus) je zcela ' i vyřazen. Bacillus totiž obsahuje vedle coaA další gen pro tuto enzymatickou funkci (= coaX). Také aktivita tohoto genu coaX nebo korespondujících-enzymů se může změnit, s výhodou snížit, nebo dokonce deletovat, pokud coaA samotný vykazuje ještě dostatečnou, i když sníženou enzymatickou aktivitu, to znamená, že enzymatická aktivita coaA není zcela
| - ·Ί | * · * '·:. A , '· 1 . | ·· ·· ···· '· · « 0 a - a ’ · | ||
| 10 - | • · A · · · • · -1 ··· ·« | • A A A·· 9 9 • · A A A A A A AA A A AA AA |
v ' .. Ί potlačena. Vedle přeexprese různých genů je výhodná .také . !
genová manipulace oblasti promotorů těchto genů * takovým způsobem, aby tato manipulace vedla k přeexpresi produktu genů. ‘
V jedné variantě provedení předloženého vynálezu se >
použijí kmeny bakterií podle přílohy (PCT/US přihlášky 0025993), jako je příkladně Bacillus subtilis PÁ 824 á/nébo i jeho deriváty. V jedné výhodné variantě provedení podle vy- i nálezu se použije ke způsobu podlé vynálezu mikroorganismus Bacilllus subtilis PA 668, který-se popisuje v příloze :
(US-Serial-Nr. 60/262 995). .Tyto kmeny Bacilllus subtilis PA 824 a PA 668 se vyrobí následovně : ,
Vychází se z kmene Bacillus subtilis 168 (kmen Marburg ATCC 6051), který vykazuje genotyp YrpC2 (Trp-), ze kterého se transdukcí Trp+ markéru (z' Bacillus subtilis divoký typ V 23) vyrobí kmen PY 79. Do kmenu PY 79 se klasickými metodami genových technologií (jak popisuje příkladně Harwood,
C.R. a Cutting, S.M. (vydavatel)*-Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Viley'& Sons, Ltd. , Chichester, Anglie) zavedou mutace deltapanB a deZtupanEl.
Výsledný kmen se transformuje genomickou DNA kmene Bacillus subtilis PA 221 (genotyp P2gpánBCD, trpC2 (Trp-)) a genomickou DNA kmene BacilTus subtilis PA 303 (genotyp ,·. P2gpanEl). Výsledný kmen PÁ 327'má genotyp P2gpanBCD, |
P2gpanEl. a je tryptofaně-auxotrofní (Trp-) . Se kméněm Bá- ' , : s cillus subtilis PA 327 se vloží do 10 ml kultury s-mediem · I SVY (25 g/1 Difco Veal Infusion Broth, 5 g/1 Difco Yeast Extract, 5 g/1 glutamátu sodného, 2,7 g/1 síranu amonného ve 740 ml vody, autoklávuje se, následně se přidá 200 ml 1 M fosforečnanu draselného, pH 7,0 a 60 ml 50 %-ního sterilního roztoku glukózy), ke kterému se přidá 5 g/1 β-alaninu • '· ,'»♦ ·· ’·· ·· ···· -· · · · · · ’» · . β ,« ····· ·· · · · · · a 5 g/1 α-ketoisovalerátu a dosáhne se titru kyseliny,pantothenové až 3,0 g/1 (24 hodin).
Výroba kmene Bacillus subtilis PA 221 (genotyp P^pan BCD, trpC2 (Trp-)) se popisuje v následujícím odstavci : *
Klasickými metodami genových technik se s pomocí sekvenčních ionformací operonu panBCD E. coli (viz Merkel a spol., FEMS Microbiol.Lett., 143, 1996:247-252), přičemž se vychází z Bacillus subtílis GP 275 plasmidové knihovny se klonuje operon panBCD Bacillus*. Ke klonování se použije kmen E. coli BM4062 (birts) a4informace, že operon Bacillus leží v blízkosti genu birA. Operon panBCD se zavede do replikovatelného plasmidů E. coli. Ke zlepšení exprese operonu panBCD se použijí silné, 'konstitutivní promotory Bacillus subtilis fágy SP01 ,(P^g) a místo napojení ribosomu (= RBS) před panB-genem se nahradí* artificiálním RBS. Před kazetu P2gpanBCD na plasmidů se liguje fragment DNA, který leží bezprostředně upstream nativního genu panB v Bacillus. Tento plasmid se transformuje v kmenu Bacillus subtilis RL-1 (klasickou mutagenezí získaný derivát Bacillus subtilis 168 (kmen Marburg ATCC6051), genotyp trpC2 (Trp-) a homologovou rekombinaci se nahradí nativní operon panBCD operonem p2^panBCD. Výsledný kmen se jmenuje PA 221 a ma genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp-). Se kmenem Bacillus subtilis PA 221 se v 10 ml kultury 's mediem SVY, které se doplní 5 g/1 β-alaninu a 5 ’g,/l a-kětoisovalerátu se dosáhne . titru kyseliny pantothenové až Ó,92 g/1 (24 hodin).
• » (í
Výroba kmene Bacillus subtilis PA 303 (genotyp P2gpanEl) se popisuje v následujícím odstavci :
S pomocí genové sekvence E. Coli panE se analogicky
12,• , ··. . ·'* ·· ·· ··· • · · - «.- 9 9 9 9 «I» · { ...
· ;· · · · ·· Ο '· · • ··· 9 · · β Φ · Ο 9
klonuje sekvence Bacillus panE. Ukazuje se, že v Bacillus ’ subtilis existují dva homology genu panE E.coli, které se :
označují jako panEl a j?ahE2. Deleční analýzou se ukazuje, ·ί že gen panEl vyvolává 90 % produkce kyseliny pantothenové,. zatímco delece genu panE2 nemá žádný významný efekt na !
produkci kyseliny pantothenové. Také zde byl analogicky ke klonování operonu panBCD nahražen promotor silněji konstitu- ] tivním promotorem P2g a místo napojení ribosomu před genem | panEl se nahradí artificiálním místem vazby. Fragment :*
P2gpanEl se klonuje do vektoru, který je vytvořen tak, aby fragment P2gpanEl se mohl integrovat do originální pozice panEl v genomu Bacillus subtilis. Po transformaci, a homologní rekombinaci se výsledný kmen jmenuje PA 303 a má genotyp P2gpanEl. Se kmenem Bacillus subtilis PA 303 se v 10 ml kultury s mediem SVY,,které še doplní 5 g/1 β-alaninu a 5 g/1 a-ketoisovaíeratu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 1,66 g/1 (24 hodin).
• g , · ;. ' , , ‘ *“
Další konstrukce kmene se provádí transformací PA 327 plasmidem, který obsahuje, operon P2gIlvBNC a markerový .gen pro spectinomycin. Operon P2gIlvBNG integruje do pozice amyE, což bylo prokázáno pomocí, PCR: Transformanty se označuj i jako PA 340 (genotyp -P^gpánBCD, P2gpanEl, P^IlvBNC, specR, trpC2 (Trp-). < .
Se kmenem Bacillus subtilis PA 340·se v 10 ml kultury r s mediem SVY, které se doplní pouze 5 g/1 β-alaninu dosáhne ' titru kyseliny pantothenové’až 3,6 g/1 (24 hodin); v 10 ml , !
kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 β-alaninu a 5 g/1 α-ketoisovalerátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové t až 4,1 g/1 (24 hodin).
Dále byla uvedena do kmene PA 340 deregulovaná kazeta í . ·· « · ·' . W* <1 • · ·· • · · 1 • · · <1 ·'· ·»
- 13 r '^i , -.4, · - Λ 5
·.« · Φ· · • : · Φ • · · • · · • ;· · · ·· ·♦ t ' , *' 1 ' , · ι · ' Γ '.
ilvD. Κ tomu se plasmid, který obsahuje ilvD gen .za kontro- ί ly promotoru P2g s artif iciální—RBS2. transformuje v PA 340. j ;
Přitom se gen P2^ilvD‘integruje homologickou rekombinaci do · originální pozice ilvD. Výsledný kmen PA 374 má genotyp , í \
P26panBCD, P26panEl, P26ilvBNC, P26ilvD, specR a trpC2 í (Trp-) . J .·. ' •i ' ' s
Se kmenem Bacillus subtilis PA 374 v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní pouze 5 g/1 β-alaninu se dosá- f hne titru kyseliny pantothenové až 2,99 g/1 (24 hodin).
Aby bylo možné s kmenem ,PA 374 produkovat kyselinu ) pantothenovou bez dokrmování β-alaninu, byly do kmene PA 374 zavedeny dodatečné kopie genu panD kódující pro aspartát-a-dekarboxylázu. K tomp‘se transformuje chromosomální DNA kmene PA 401 na PA 374.1 'Selekcí na tetracyklin se získá ' kmen PA 377. Výsledný kmen PA 377 má genotyp P26panBCD, ;
P26panEl, P2gilvBNC, P26ilvD, specR, tetR a trpC2 (Trp-).
Se kmenem Bacillus subtilis PA 377 v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 1,1., 31 g/1 (24 hodin).
. t i.
Výroba kmene Bacillus subtilis PA 401 (genotyp ,
P2gpanD) se popisuje v následujícím odstavci :
* ‘ · . ·
Bacillus subtilis panD šé‘klonuje panBCD opeřenu do , ' vektoru, který nese tetracyklinóvý markerový gen. Před panD se klonuje promotor P2g a výše popsaná artificiální RBS.
Restrikčním trávením se vyrobí· fragment, který obsahuje tetracyklinóvý markerový gen a a gen P2gpariD. Tento fragment se religuje a transformuje do výše popsaného kmenu
PA 221. Přitom fragment integruje do genomu kmene PA 221.
' ··
Výsledný kmen PA 401 má genotyp P2gpanBCD, PggpanD, tetR a trpC2 (Trp-).
Se kmenem Bacillus subtilis PA 401 se v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 α-ketoisovalerátu dosáhne titru kyseliny pantothenové až 0,3 g/1 (24 hodin).
V 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 kyseliny D-pantoinové a 10 g/1 L-aspartátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 2,2 g/1 (24 hodin).
S výchozím kmenem PA 377 se transformací s chromosomální DNA kmene PY 79 generuje tryptofan-prototrofní kmen. Tento kmen PA 824 má genotyp P^panBCD, P2gPanEl,
P^ilvBNC, P2gilvD, specR, tétR a Trp+.
Se kmenem Bacillus subtilis PA 824 v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin se dosáhne titru kyseliny pantothenové .až 4,9 g/1 (48 hodin) (srovnání PA 377 : až 3,6 g/1 za 48 hodin.
Výroba PA 668 se popisuje.v následujícím odstavci :
Gen Bacillus panB se klonuje z divokého typu operonu panBCD a insertuje do vektoru,·který vedle genu rezistentního na chloramfenikol obsahuje také sekvence B.subtilis vpr locus. '
Silně konstitutivní promotor P2g se zavede před 5 -konec genu panB. Fragment,. který obsahuje gen P2gpanB, markerový gen pro chloramfenikovou rezistenci a rovněž sekvence Bacillus subtilis vpr.se’ získá restrikčním trávením. Isolovaný fragment se religuje a transformuje jím kmen PA 824. Získaný kmen se označuje PA 668. Genotyp PA 668 je P26panBCD, P26panEl, P26ilvBNC,,P2^ilvD, P^panB, specR,
| ·· · ·. | • · | • · ·, | ·· • | • | ··« · | |
| • | • · | |||||
| • ·· · · | • | • · | • | • · | • | • |
| • ' · | • | • · | • | • | • | • · |
| ·*· ·· | • · | • · | • · | • · |
tetR, CtnR a Trp+. j
Izolují se dvě kolonie PA 668 a označí se PA 668-2A ) a druhá PA 668-24. t
Se kmenem Bacillus subtilis PA 668-2A se v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin dosáhne í· ί
titru kyseliny pantothenové až 1,5 g/1 ve 48 hodinách. \
V 10 ml kultury doplněné 10. g/1 áspartátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 5 g/1.
Se kmenem Bacillus subtilis PA 668-24 se v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin dosáhne titru kyseliny pantothenové až .1,8 g/1 ve 48 hodinách.
V 10 ml kultury doplněné 10 g/1 L-aspartátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 4,9 g/1.
Přesná konstrukce kmenů se popisuje v přílohách PCT/US-přihlášky 0025993 a v US‘-Serial-Nr. 60/262,995.
S výše popsaným kmenem. PA 377 se při fermentaci limitované glukózou v mediu SVY (25 g/1 Difco Veal Infusion Broth, 5 g/1 Difco Yeast Extract,·5 g/1 tryptofanu, 5 g/1 Na-glutamátu, 2 g/1 (NH4)2SQ4, ΪΌ g/1 KH2PO4, 20 g/1 K2HPO4, 0,1 g/1 CaCl2, 1 g/1 MgSO4, 1 g/1 natriumcitrátu,
0,01 g/1 FeSO4 x 7 H20 a Ϊ 'ml/1 roztoku stopových solí o následujícím složení : 0,15 g Ν&2^°θ4 x 2. H2Q,
2.5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 x 6 H20, 0,25 g CuSO4 x 5 H20,
1.6 g MnCl2 x 4 H20, 0,3 g ZnS04 X 7 H20, doplněno vodou ha
1) se v měřítku 10 1 při kontinuálním dokrmování roztoku glukózy dosáhne za 36 hodin (48 hodin) koncentrací kyseliny pantothenové ve fermentační· břečce(18 až 19 g/1 (22 až 25 g/1) · · ’ ,
Při fermentací PA 824 limitované glukózou-, tryptófan- ;
-prototrofní derivát PA 377 v mediu s kvasnicovým extraktem ( (10 g/1 Difco Yeast Extract, 5 g/1 Na-glutamátu, 8 g/1 . f (NH4)2SQ4, 10 g/1 KH2P04, 20 g/1 K2HP04, 0,1 g/1 CaCl2, 1 ; g/1 MgSO4, 1 g/1 natriumcitrátu, 0,01 g/1 FeS04 x 7 H20 * ·.
a 1 ml/1 výše popsaného roztoku stopových solí) sev měřítku |
1 při kontinuálním dokrmování roztoku glukózy dosáhne.ža j.
hodin, 48 hodin a 72 hodin' následných koncentrací kyše- / ‘ · liny pantothenové ve fermentační'^ břečce : 20 g/1, 28 g/1 a 36 g/1. , J ’
Další optimalizací media se kmenem PA 824 se při fermentaci limitované glukózou dosáhne v mediu sestávajícím , z 10 g/1 Difco Yeast Extract, 10 g/1 NZ-aminu A (Quest International GmbH, Erftstadt)*, ·, 10 g/1 Na-glutamátu, 4 g/1 (NH4)2SQ4, 10 g/1 KH2PQ4, 20 g/1 K2HP04, 0,1 g/1 CaCl2, 1 g/1 MgS04, 1 g/1 natriumcitrátu, 0,01 g/1 FeSO4 x..7 H20 a 1 ml/1 výše popsaného roztoku? stopových solí se v měřítku 10 1 při kontinuálním dokrmování roztoku glukózy dosáhne za 36 hodin (48 hodin) koncentrace kyseliny pantothenové ve fermanační břečce 37 g/1 (48 -g/lj ’ ’ί· Λ '
4Je možné další zvyšování koncentrace kyseliny pantot- , , henové ve fermentační břečce optimalizací media, prodloužením doby fermentace, zlepšováním/procesu- a kmene, a rovněž kombinací jednotlivých kroků. Tak je možné dosáhnout výše ;
popsaných koncentrací kyseliny < pantothenové také fermentací kmenů, které jsou deriváty výše popsaného PA 824. Deriváty se mohou vyrábět klasickým vývojem kmene a rovněž dalšími genově technickými manipulacemi. Vývojem medií, kmenů a způsobu fermentace se může titr kyseliny pantothenové ve fermentační břečce zvýšit i nad 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, : 1 .
·· í «
19 * * ·» ··»» · · · · ® · ·
9t* ·· ·»
9 «♦·· podle vynálezu je, že se . mediu, které kromě nejméně
75, 80, 85 a > 90 g/1.
Podstatnou výhodou způsobu fermentace provádí v kultivačním jednoho zdroje uhlíku a dusíku jako výchozích sloučenin * 3 neobsahuje žádné další předstupně (prekuržory). To znamená, í že biosyntéza kyseliny D-pantothenové je nezávislá na L dokrmování dalších výchozích látek. Jako takové výchozí / látky se podle vynálezu rozumí příkladně β-alanin nebo '
L-aspartát a/nebo L-valin a/nebo oí-ketoisovalerát a/nebo . jejich kombinace.
V jedné výhodné variantě způsobu podle vynálezu se provádí fermentace organismů produkujících kyselinu D-pantothenovou v kultivačním mediu, které obsahuje jeden zdroj uhlíku a jeden zdroj dusíku, kě kterému se ale nepřidává žádný volný β-alanin a/nebo solí;β-alaninu a to ani v průběhu fermentace. To znamená, že k,výrobě kyseliny D-pantothenové v rozmezí nejméně 10 g/1 kultivačního media, s výhodou nejméně 20 g/1, obzvláště výhodně nejméně 40 g/1, zcela obzvláště výhodně nejméně 60 g/1 a obzvláště nejméně 70 g/1 není podle vynálezu nutné žádné dokrmování volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu. Nezávislost na dokrmování výchozích látek představuje obzvláště významnou ekonomickou výhodu způsobu podle vynálezu oproti známým způsobům, neboř řada výchozích látek je velmi drahá.. / . ' .{
Přídavek β-alaninu a/nebo solí β-alaninu však není ( podle vynálezu vyloučen, takže se může následně výtěžek kyseliny D-pantothenové přídavkem β-alaninu a/nebo solí β-alaninu ještě dále zlepšit. Pokud se příkladně vychází z toho, že potřebné výchozí látky kyseliny, pantothenové jsou k dispozici v dostatečném množství a pouze aktivita genu s panD limituje další nárůst produkce kyseliny D-pantothenové, pak se může příkladně výtěžek kyseliny D-pantothenové zvýšit o dalších 50 % přídavkem volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu. ,
V jedné výhodné variantě předloženého vynálezu se může ke kultivačnímu mediu přidat až 20 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu k dodatečnému zvýšení výtěžku kyseliny pantothenové o více jak 50 %. , Výhodný je přídavek asi 15 g/1 volného β-alaninu a/nebo/solí’ β-alaninu ke kultivačnímu mediu. «-*,··* i > ·.
Příklady vhodných zdrojů,uhlíku podle vynálezu k použití v kultivačním mediu pro <féímentaci výše uvedených organismů jsou cukry, jako hydrolyzáty škrobu (mono-, di-, oligosacharidy), s výhodou glukóza^nebo sacharoza a rovněž řepná melasa nebo třtinová melášá,.proteiny, hydrolyzáty proteinů, sojová moučka, kukuřičná,voda, tuky, volné mastné kyseliny, opětovně použité buňky z 'již provedených fermentací nebo jejich hydrolyzáty a rovněž'kvasnicový extrakt.
Tento výčet není pro předložený}'.vynález limitující.
Dále se předložený vynález, vyznačuje s výhodou tím, že celkový obsah cukru až do konce,fermentace je zredukován na minimum, protože v opačném případě1 je pozdější sušení a/nebo formulace· fermentačního roztoku ztížena slepováním. Toho lze podle vynálezu dosáhoút* tíni, .že se fermentace vede ještě nějaký čas po spotřebování‘zdroje uhlíku (při kultivaci v šaržovém způsobu) nebo pote., co. se přeruší přívod uhlíku (při vedení procesu šaržovým provozem s dávkováním nebo opakovaným šaržovým provozem s dávkováním) a/nebo se regujluje takovým způsobem, že koncentrace zdroje uhlíku je téměř nulová (při vedení procesu šaržovým provozem s dávko- 19 i
• · « · · · ·
váním, opakovaným šaržovým provozem s dávkováním nebo kontinuálním způsobem).
To se podle vynálezu provádí tak, že po přerušení dávkování zdroje uhlíku (příkladně roztoku cukru) še fermentace vede dále až k dosažení koncentrace rozpuštěného kyslíku (p02) na nejméně 80 %, s výhodou 90 % a obzvláště výhodně 95 % hodnoty nasycení ve fermentačním roztoku.
Příklady vhodných zdrojů dusíku je amoniak, síran amonný, močovina, proteiny,, hydřolyzáty proteinů nebo kvasnicový extrakt. Ani tento výčet není pro předložený vynález limituj ící. - \
Dále obsahuje fermentační medium minerální soli a/nebo stopové prvky, jako jsou aminokyseliny a vitaminy.
Přesné složení vhodných fermentačních medií jsou opakovaně ’ Ϊ’· ' známé a odborníkům dostupné.
Po inokulaci fermentacníhó'media vhodným organismem produkujícím kyselinu D-pantothehóvóu (s buněčnou hustotou známou odborníkům) případně pó přidání prostředku proti pěnění dochází ke kultivaci organismu. Případně nutná regulace pH hodnoty media se může provádět různými anorganickými nebo organickými louhy nebo kyselinami, jako je příkladně NaOH, KOK, amoniak, kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina solná, kyselina mravenci*, kyselina jantarová, kyselina citrónová a podobně. , '··
Na základě pufrovacích systémů,použitých během fermentace, které mohou být, jak bylo, výše popsáno příkladně NaOH, KOH, amoniak, kyselina fosforečná,-'kyselina sírová, kyselina solná, kyselina mravenčí,fkysélina jantarová, kyselina cit20 'r , ·· ,s. ·· · · ,···· ··· · · ·· · · · · t ’· ········' • · .<> tt ·· tt tt · ronová a podobně, je vytvořená kyselina pantothenová ve fermentačním roztoku podle použitého pufrovacího systému ve - formě dané soli (daných solí). Protože přitom podle vynále- > zu nejsou výhodné především soli kyseliny D-pantothenové ve formě jejich jednomocných kationtů případně je výhodná kyselina D-pantothenová ve formě jejích vápenatých nebo hóřečnátých solí, zpracuje se fermentační roztok podle vynálezu za použití kationtoměniče.
Předložený vynález zahrnuje 'při tom všechny průmyslově využitelné kationtoměniče. Podle 'předloženého vynálezu vhodné kationtoměniče pro odsolení pantothenátových solí na kyselinu pantothenovou jsou v H+-formě se vyskytující kyselé pryskyřice na basi akrylátu s kárboxylovou funkcionalitou a/nebo polystyrénové pryskyřice Se sulfonátovými skupinami, jako je například Lewatit CNP 80, CNP LF, S 100, S 1468 a SP 112 Monoplus (firma Bayer Leverkusen, Deutschland), Dialon PK 216 (firma Mitsubishi Chemical Corp, Tokyo, Japan), Amberlite 200 a Amberlite 252 (firma Rohm and Haas, Philadelphia, USA). ' _
Výhodné kationtoměniče jsou silně kyselé iontoměniče v H+-formě na basi sulfonovaného polystyrenu. Obzvláště výhodné jsou monodispersní kationtoměniče, jako je například Lewatit S1468. Výše uvedený výčet kationtoměničů je příkladný a není pro předložený-vynález limitující. Jak je pro odborníky běžné, mohou se iontoměniče po vyčerpání opět regenerovat minerálními kyselinami do H+-formy a tím se mohou vícenásobně používat.
Použitím kationtoměniče se jednomocné kationty, jako je například amonium, draslík nebo sodík, výhodně prakticky úplně z ferméntačního roztoku odstraní, takže se v roztoku
• · · 9 99 ·' · .99999 99 999 · • · 9999 9999
999 99 99 9 9 · · « · ze solí kyseliny pantothenové tvoří volná kyselina pantothenová. Podle předloženého vynálezu se obsah jednomocných, * kationtů, obzvláště iontů amonia, draslíku a/nebo sodíku, redukuje na koncentraci lg/kg roztoku.
Takto získaný roztok volné kyseliny pantothenové se podle předloženého vynálezu nastaví přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté base na hodnotu pH 5 až 10. Výhodně se . . „ provádí nastavení na hodnotu pH 5 až 9 , obzvláště výhodně 6 až 9 a zcela obzvláště výhodně 6 až 8 . Tímto způsobem se získá roztok nebo suspenze pantothenátu vápenatého a/nebo hořečnatého. Výhodně se pro neutralisaci do roztoku přidává hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý, oxid vápenatý, hydroxid hořečnatý a/nebo bázický uhličitan vápenatý ve formě pevné látky a/nebo jako vodná suspenze.
Při tom je podle předloženého vynálezu výhodné, když se neutralizace roztoku, obsahujícího volnou kyselinu pantothenovou, provádí pomocí vápenaté a/nebo hořečnaté báze ve formě vodné suspenze. Použitím.vodné suspenze se provádí neutralizace rychleji a bez většího kolísání pH než při pou-žití odpovídající pevné látky'
Způsob podle vynálezu se vyznačuje tím, že se k roztoku v kroku cj přidá vodná suspenze'obsahující 2 až 55 % hmotnostních, s výhodou 10 až--50-% hmotnostních & obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu vápenatého. Podle vynálezu je dále zahrnut způsob, při·kterém se k roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 6.5 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních uhličitanu vápenatého.
V jedné další variantě provedení podle předloženého vynálezu se k roztoku v kroku c) způsobu podle vynálezu přidá vodná i
suspenze obsahující 2 až 60 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu horečnatého. Podle vynálezu je zahrnut také. způsob, při kterém se k roztoku v kroku c) přidá'vodná suspenze obsahující 2 až 25 % hmotnostních, s výhodou*10 až , 20 % hmotnostních bázického uhličitanu horečnatého.
V další variantě se může k roztoku, obsahujícímu] volnou kyselinu pantothenovou, z kroku b) ,· přidat'v následuj ícím kroku c) kyselá anorganická a/nebo organická vápenatá a/nebo horečnatá sůl, přičemž se získá roztok nebo suspenze, která obsahuje pantothenát vápenatý a/nebo horečnatý . , '
Výhodně se podle předloženého vynálezu rozumí pod kyselými anorganickými vápenatými a/něbo horečnatými Solemi odpovídající halogenidy vápenaté á/nebo horečnaté. Podle předloženého vynálezu je to výhodně chlorid vápenatý a/nebo . i ' a.
chlorid horečnatý. Pod pojmem; kyselé vápenaté, a/nebo horečnaté organické soli se například rozumí ve vodě dobře rozpustné soli organických aniontů.· ’ Jako výhodné je možno uvést například mravenčah, octah, propionát, glycinát a/nebo laktát vápenatý a/nebó horečnatý.
V následujícím kroku dj se .potom roztok nebo suspenze pantothenátu vápenatáho á/nébó.Horečnatého podrobí sušení a/nebo formulování. r...
Sušení a/nebo formulace získaného roztoku nebo suspenze, obsahující D-pantothenát vápenatý a/nebo horečnatý, se provádí o sobě známými způsoby, jako příkladně rozstřikovacím sušením, rozstřikovací granulací, sušením ve vířivé vrstvě, granulací ve vířivé vrstvě, sušením v bubnu nebo ·,· 9 · · · · 9« · · sušením spin-flash (Ullmann s Encyclopedia of Industrial .· Chemistry, 6. vydání, 1999, elektronická forma, kapitola Drying of Solid Materials). Vstupní teplota plynu při konvekčním sušení je v rozmezí 100 až 280 °C, s výhodou 120 až 210 °C. Výstupní teplota plynu je v rozmezí 50' až 180 °C, s výhodou 60 až 150 °C. K nastavení’ požadované velikosti částic a s tím spojenými vlastnostmi produktu se . mohou jemné čátice oddělit a uvést zpět. Dále se mohou · velké částice semlít v mlýně a následně rovněž zavádět zpět.
Podle vynálezu je výhodné při výše popsaném způsobu redukce nákladných zpracovatelských kroků, obzvláště nepoužívání organických rozpouštědel při současné přípravě požadovaného produktu s dobrou biologickou bonitou. Dále se podle vynálezu podstatně snižuje množství vznikajících odpadních vod. Výsledkem jsou tak další úspory na nákladných čisticích a zneškodňovacích zařízeních. Tak se vyznačuje způsob podle vynálezu obzvláště tím, že je jednodušší, méně náchylný k poruchám, méně’časové náročný, výrazně ekonomičtější a tím hospodárnější než obvyklé způsoby.
To však nevylučuje, aby šé'způsob podle vynálezu neobměňoval. Výše uvedené procesní korky a) až d) podle vy- nálezu se mohou doplnit jedním nebo několika následuj ícími € . ' procesními kroky, které jsou samy o sobě odborníkům známé.
Zde jsou podle vynálezu zahrnuty všechny možné kombinace dodatečných (fakultativních) procesních kroků se (základními) procesními kroky a) až d).
Tak se mohou výsledné roztoky nebo suspenze z procesních kroků a) až c) zbavit zárodků zahřátím (sterilizací) nebo jinými metodami, jako je příkladně pasterizace nebo sterilní filtrace,.
| • · ' ’· | • · • | • | ' · | • · í ·' | • | ··· | |
| • · · · · | • | • | • | • | • · | • | |
| • · | • | • | • | • | • | • | • |
| ·» ·« | ·'· | • · | • · | • · |
Aj f
V dalších variantách způsobu podle předloženého vyná- ‘ lezu se může před sušením a/nebo formulací roztoku nebo suspenze provést nejméně jeden a/nebo kombinace následujících kroků, zahrnující lysi a/nebo usmrcení biomasy a/nebo oddělení biomasy od fermentačního roztoku a/nebo přídavek dalších přísad a/nebo koncentraci fermentačního roztoku, s výhodou odtažením vody.
Předmětem předloženého vynálezu je tak také způsob, kdy se lyse a/nebo usmrcení bióhmasy provádí ještě .ve fer- , mentačním roztoku nebo teprve) po oddělení biomasy od fermentačního roztoku. To se může-provádět příkladně tepelným j ošetřením, s výhodou při teplotě 80 až 200 °C a/nebo okyselením, s výhodou kyselinou sírovou nebo kyselinou solnou a/nebo enzymaticky, s výhodou pómoci lysozymu.
V další formě provedení předloženého vynálezu se mohou buňky fermentačních mikroorganismů z roztoků nebo suspenzí v krocích a), b) nebo c) způsobu podle vynálezu oddělit filtrací, separací (příkladně odstředěním) a/nebo dekantováním. Možné je také uvádět roztoky nebo suspenze z kroků á),
b) nebo c) podle předloženého vynálezu bez oddělení obsažených mikroorganismů přímo pres·katióntoměnič. Pokud kroku zpracování kationtoměničem (krok b)j způsobu podle předloženého vynálezu nepředchází oddělení biomasy,'může se blomasu obsahující fermentační roztok‘Výhodně vést také zespodu ·’ vzhůru přes lože ióntoměniče, tedy proti síle tíže. Tento postup je zásadně výhodný, když jsou v čištěném roztoku přítomné vznášející se látky.
Výsledný roztok nebo suspenze ze zpracování kationtoměniěem se může návazně na neutralizaci koncentrovat na
| • ' ’ 4 · 4 4 4 | • | 4 4 % • | ' · 4 4 | • | '4 4' | 444 | |
| 4 | 4 | ||||||
| • · 4 · 4 | • | • | • | 4 | 4 4 | 4 | |
| • · | • | • | • | 4 | 4 | 4 | 4 |
| • <» 4 4 | • · | • · | 4 4 | 4 4 |
vhodné odparce, příkladně odparce se stékajícím filmem, odparce v tenké vrstvě nebo rotační odparce. V další varian tě může vlastnímu sušení a/nebo formulaci roztoku a/nebo suspenze v kroku d) výše uvedeného způsobu podle předloženého vynálezu předcházet zakoncentrován!. K tomu' se roztok nebo suspenze z kroku c) zakoncentruje ve filmové odparce ; nebo v odparce s tenkou vrstvou. Takovéto odparky vyrábí ‘ ( s příkladně firmy GIG (4800 Attnang Puchheim, Rakousko)j GEA Canzler (52303 Duřen, Německo), Diessel (31103 Hildesheim, Německo) a Pittón (35274 Kirchhain, Německo). ;
* v J s· *· j
Ke zlepšení barevných vlastností konečného produktu se ' j může provést krok dodatečné filtrace, při kterém se k roz- j tokům nebo suspenzím, získaným během procesu, přidá něco ’ , ; J aktivního uhlí a tato suspenze se následně filtruje. Nebo ' 1 se roztoky získané během fermentace mohou vést přes malé lože s aktivním uhlím. K tomu požadované množství aktivního uhlí je v rozmezí několika málo'' % hmotnostních roztoku a je na znalostech a uvážení odborníka.
Tyto filtace se mohou usnadnit, jestliže se k danému * . i ř · roztoku před filtrací přidá!obvyklý komerční flokulační pomocný prostředek (příkladně Sédipur CF 902 nebo Sedipur CL 930 firmy BASF AG, Ludwigshaf en) . i
1-, - '>. j
V jedné výhodné formě, provedení předloženého vynálezu se výsledný materiál fermentace (fermentační břečka) sterilizuje zahřátím a potom*seZbaví buněčné hmoty odstředěním, i filtrací nebo dekantací'Po, přídavku 50 až 1000 mg/kg, s výhodou 100 až 200 mg/kg komerčně dodávaného flokulačního pomocného prostředku, vztaženo na výtěžek fermentace, se filtruje přes krátké lože aktivního uhlí a písku, aby se získal roztok s vysokým obsahem, kyseliny D-pantothenové
| 4 4 • ' · | • 4 | • · | • | • 4 4 i | 4' | 4·· | |||
| • | • | 4 | |||||||
| • · · | • · | • | • | • | • · | • | |||
| 4 | • | • | • | • | • | • | • . | ||
| • 1» | • · | 4 | • | • · | • · | • · |
zbavený biomasy. Následně se tento vyčištěný roztok vede , přes lože iontoměniče (v H+-formě).
Pokud kroku zpracování podle předloženého vynálezu přes kationtoměnič nepředchází oddělení biomasy, může se biomasu obsahující fermentační roztok výhodně vést také zespodu vzhůru přes lože iontoměniče, tedy proti síle tíže.
Následné sušení roztoku nebo suspenze se může provádět příkladně rozstřikovacím sušením. To se může provádět v souproudu, protiproudu nebo vé smíšeném proudění. K rozprášení se mohou použít všechny známé rozprašovače, obzvláště odstředivé rozprašovače (rozprašovací disky), jednolátkové trysky nebo dvoulátkové trysky. Výhodné teplotní podmínky jsou 150 až 250 °C na vstupu do věže a 70 až 130 °C na výstupu z věže. Může se ale také sušit při vyšší nebo při nižší úrovni teploty. K,dosažení velmi nízké zbytkové vlhkosti se ale může dodatečně provést další fáze sušení ve vířivém loži. . ř
Rozstřikovací sušení se,může provádět v sušárnách FSD nebo SBD (FSD : Fluidized Spray Dryer, SBD : Spray Bed Dryer), které vyrábí firmy Niro (Kodaň, Dánsko) a APV-Anhydro (Kodaň, Dánsko), které představují kombinaci rozstřikovací sušárny a vířivého lože.
Při rozstřikovacím sušení se může přidat pomocný pros- , tředek ke zlepšení tekutosti. Tím se sníží tvorba povlaků na stěnách sušárny a zlepší se i chování při tečení, zejména u jemnozrnných prášků. Jako prostředky ke zlepšení tekutosti přicházejí v úvahu obzvláště silikáty, stearáty, fosfáty a kukuřičný škrob.
• · ·· • · · o * • · · · · · • · · · ·« ··♦ « · · · « • · · · · • ·· ·· ·0 • · ©
99
V zásadě se ale může sušení provádět také v nastřiko- !
vaně vířivé vrstvě, přičemž tato se může provozovat kontinu- * ;
álně nebo diskontinuálně. Nastřikování roztoku se může pro- j vádět jak zeshora (Topspray), tak i zespoda (Bottomspray) nebo také ze strany (Sidespray).
t
Předmětem předloženého vynálezu je dále přípravek pro použití jako přísada do zvířecího krmivá a/nebo doplněk ;
zvířecího krmivá, vyrobitelný tak, že ' !
a) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je | deregulovaná a v kultivačním mediu se fermentací tvoří nejméně 2 g/1 solíkyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až 20 g/1, výhodně 0 g/1, volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu,
b) fermentační roztok,obsahující D-pantothenát se vede přes kationtoměnic,'přičemž ze solí kyseliny D-pantothenové vznikne- volná kyselina D-pantothenová, ·'<'·.·'/ . , .
c) volná kyselina D-pantotheňová obsažená v roztoku.se ‘ ’ přídavkem vápenaté a/nebo’ horečnaté báze upraví na ' hodnotu pH 5 až 1.0 ^přičemž se získá roztok, který obsahuje kalcíumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát a
d) roztok obsahující kalcíumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace.
• ·· • · • · i « ·<· » · · 4 ·· ··
Pří jedné variantě způsobu podle vynálezu se v kroku ' >
c) nebo kroku d) získá nebo předloží suspenze, která ; j obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát. j , · ' ’ J 1 t
V další variantě se může přidat k roztoku volné .* - , \ * ·: ’ ‘ . - i kyseliny pantothenové z kroku b) v následujícím kroku c) , kyselá anorganická a/nebo organická sůl vápníku a/nebo , . { hořčíku, přičemž se získá roztok nebo suspenze, která ohša- ;
huje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát.
Výhodně se podle předloženého vynálezu rozumí pod , .
kyselými anorganickými vápenatými a/nebo horečnatými solemi ;
odpovídající halogenidy vápenaté a/nebo horečnaté. Podle předloženého vynálezu je to výhodně chlorid‘vápenatý a/něbo chlorid horečnatý. Pod pojmém· kyselé vápenaté a/nebo horečnaté organickésoli še například rozumí ve vodě dobře rozpustné soli organických anioritů. Jako výhodné je možno uvést například mravenčan,. octan.propionát, gly.cinát a/nebo laktát vápenatý a/nebo ‘horečnatý.
V následujícím kroku d) sě potom roztok nebo suspenze pantothenátu vápenatého a/něbo hořečnatého podrobí sušení a/nebo formulování. λ Λ ;
Podle vynálezu se přípravek dále vyznačuje tím, že obsahuje soli kysleiny D-pantothenové v koncentraci nejméně - j 1 až 100 % hmotnostních, s výhodou nejméně 20 až 100 % hmotnostních a obzvláště výhodně nejméně 50 % hmotnostních. Předmětem předloženého vynálezu je přípravek, který obsahuje soli kyseliny D-pantothenové ve formě dvojmocných kationtů, s výhodou kalcium-D-pantothenát a/nebo magnesium-D-pantothenát. Podle vynálezu je výhodný přípravek, který se
| • 9« | 9'9. | 9 9 Ú9 9 | 9 99 9 | |
| 99 · 9 9 | 9 | 9 | 9 9 9 | • |
| • 999 9 9 | 9 | 9 | 9 9 9 9 | 9 |
| • 9 9 | 9 | 9 | 9 9 9 | 9 9 |
| 999 99 | 99 | 99 99 | 9 9 |
vyznačuje tím, že obsah solí kyseliny D-pantothenové ve ‘ formě jednomocných kationtů je lg/kg.
>
Podle vynálezu se výše popsaným způsobem získá * “ kalcium-D-pantothenát a/nebo magnesium-D-pantothenát, který . vyhoví požadavkům na přísady do krmiv. Těmito požadavky je \ příkladně relativně vysoký obsah D-pantothenátu a dobrá snášenlivost cílovým organismem a rovněž biologická bonita ve smyslu vitaminový účinek produktu podle vynálezu.
t
Předložený vynález bude blíže vysvětlen následujícími ř ····' . , !
příklady, které však pro vynález.nejsou limitující.
; c . ' 1 i
Příklady provedení vynálezu ;
Přikladl :;j. . ': í
Do laboratorního fermentóřu,s míchadlem a plynovacím zařízením o obsahu 14 1 se předloží vodné fermentacní medium o následujícím složení : - . ; ,
| Násada | / ’ Koncentrace 'í * (g/1) . |
| Kvasnicový extrakt | 10 |
| Natriumglutamát | 5 |
| Síran amonný | 8 |
| dihydrogenfosforečnan K | 6,7 |
| hydrogenfosforečnan K | 9,8 |
Po sterilizaci byly navíc přidány následující sterilní • _· ‘ komponenty media: = γ > . í •f ·.
ί ..
• * · 1 · 9 . <
4. · , 9 9 « • 9 ’ ·Ί « 9 9 9
9 9 9 • 9 · 9 ·· 9909 • · '9
9. 9 9 • 99 9
9 9 9
| Násada | Koncentrace ' . . (g/1) |
| Glukóza | 2,5 |
| Síran vápenatý | θ’1 ' ' : |
| Síran hořečnatý | 1 |
| Natriumcitrát | 1 |
| FeS04 x 7 H20 | 0,01 |
| Roztok stopových solí | 1 ml |
'i · s .
Roztok stopových solí má následující složení :
0,15 g Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g H^BOj0,7 g CoClý x 6 H20,
0,25 g CuS04 x 5 H20, 1,6 g ‘MnGl2 X '4 H20, 0,3 g ŽnS04-x 7 H20, doplněno vodou.na 1 1. /Přídavek roztoku-stopových solí ' se provádí po sterilizaci.. - Počáteční objem kapaliny činí 6 1. Výše uvedené obsahy jsou vztaženy na tuto, hodnotu.
K tomuto roztoku se přidá’60 ml očkovací kultury · (OD = 10) Bacillus subtilis ΦΑ B24 a za intenzivního míchání se fermentuje při teplotě 43 °C při plynování 12 1/min.
Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky PCT/US 0025993.
V průběhu 4.7 hodin '.sé < nadávkuj e 6,5 .1 sterilního vod-·'·' něho roztoku. Složení je následující . : :· ί
999 · » ·» * '9 · ’ · e ·<· * 9 9 · * * · 9 9
99
Ί
9»' 9«·· • 9 9 · 9
9 9
9 9 9 • ♦ 99
| Násada | Koncentrace (g/1) |
| Glukóza | 550 |
| Síran vápenatý | 0,7 |
| Roztok stopových solí | 6 ml |
ίFermentace se provádí s limitovanou glukózou. V í průběhu fermentace se dávkováním 25 %-ního roztoku amoniaku případně 20 %-ní kyseliny fosforečné udržuje hodnota pH na ' 1
7,2. Amoniak zároveň slouží jako zdroj dusíku pro fermentaci. Počet otáček míchadla se reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje]na hodnotě 30 % hodnoty při nasycení. Po přerušení dávkovánizdroje uhlíku se fermentace vede dále tak dlouho,,dokud obsah rozpuštěného kyslíku (p09) nedosáhne hodnoty 95.% při nasycení. Potom se fermentáce ukončí a organismy se tepelně usmrtí. K tomu se ferr mentační roztok sterilizuje podobu 45 minut. Usmrcení bylo prokázáno na deskách. ,í
Následně se odstředěním provede oddělení buněk. Po oddělení buněk činí koncentrace D-pantothenátu po 48 hodinách 22,8 g/1. . , , >»·
Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační břečky, které vykazují titr. kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninem více jak20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90’ g/1.
Produkt fermentace, který se výše popsaným způsobem sterilizuje zahřátím a v podstatě se zbaví biomasy odstředěním, se smíchá s dodatečnou kyselinou D-pantothenovou a pomocí 25% roztoku (disperze) hydroxidu amonného se upraví ' - { i
·· ·· ·« ··-'··'·· • · · ·· 9 . .· 9 r * 9 · 9 9 ? 9 '* 9 • 9 ' 9 ’ 9 9 99 9 9 9* • ·99 9 9 · ♦ 999 9 9 • 9 9 99 9 9 99 9 • 9999 99 99 99 99 hodnota pH na přibližně 7. Takto získaný roztok nebo sus- f penze se filtruje přes malé lože písek/áktivní uhlí. Obsah ' kysleiny D-pantothenové ve filtrátu činí 70 g/1, přičemž j kyselina D-pantothenová se vyskytuje převážně ve formě ’ ' . ’ 'i amonné soli. >
i
1000 ml tohoto filtrátu se pomocí hydrostatického tlaku vede přes 250 ml sloupec, ve kterém se nachází asi 100 ml iontoměniče Lewatit S100 G1. . Průtok je zregulován na asi 20 ml/min.
Z prošlé kapaliny se shromažďují frakce po 100 ml a analyzují se se zřetelem na hodnotu pH, koncentraci
D-pantothenátu a iontů Ca^+, Mg^Ť·,; NH^4-, K+ a Na+. Příkladně jsou v následující tabulce uvedeny frakce 1 až 3.
| Vzorek 1 | r-( a > | počáteční pH | konečné pH | Pantothenát (g/1) | NH? | Ca2+ | K+ | Mg2+ | Na* |
| Filtrát | 7 | 70 | 0,76 % | i, 0,11 % | 0,20 % | 0,003 % | 0,031 % | ||
| Frakce 1 | 100 | 4,5 | 1,5 | 1,2 | < 1 ppm | < 0,001 % | < 0,001 % | < 0,001 % | 0,001 % |
| Frakce 2 | 100 | 1,5 | 1,6 | 64 | 4 ppm | < .0,001.% | < 0,001 % | < 0,001 % | 0,003 %. .. |
| Frakce 3 | 100 | 1,6 | 2,5 | 68 | 19 ppm | 0,001 % | < 0,001 % | < 0,001 % | 0,002 % |
ml frakce 2, která obsahuje 4,8 g pantothenátu, se za míchání upraví přídavkem pevného hydroxidu vápenatého na hodnotu pH 7 . Takto získaný roztok nebo suspenze D-pantothenátu vápenatého se potom odpařením vody na rotační odV - · . ,· parce usuší a získás e 8,98 g lehce nahnědlého práškovitého D-pantothenátu vápenatého, který má obsah 57 % D-pantothe-
Do laboratorního fermentoru s míchadlem a plynovacím zařízením o obsahu 14 1 se předloží vodné fermentační medium o následujícím složení :
| Násada ř | ' Koncentrace (g/1) |
| Kvasnicový extrakt | 10 |
| Natriumglutamát ' | 5 |
| Síran amonný | 8 |
| kh2po4 | 8,4 |
| k2hpo4 | 15 |
Po sterilizaci byly navíc přidány následující sterilní komponenty media:
| Násada | Koncentrace (g/1) ' |
| Glukóza | 2,5 |
| Chlorid vápenatý | ' 0,1 . · |
| Chlorid hořečnatý | ‘ 1 |
| Natriumcitrát | 1 |
| FeSO4 x 7 H20 | 0,01 |
| Roztok stopových solí | 1 ml |
I • «· · · ··· ··'·/>· · · · « ··«·· ·· • · · · · • · · · · · · · * • · ··
Roztok stopových solí má následující složení :
0,15 g Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g H^BO^, 0,7 g CoCl2 x 6 H20, 0,25 g CUSQ4 x 5 Η2θ > £ MnCl2 x 4 H20, 0,3 g ZnS04 x 7
H20, doplněno vodou na 1 1. Přídavek roztoku stopových solí se provádí po sterilizaci. Počáteční objem kapaliny činí 5,5 1. Výše uvedené obsahy jsou vztaženy na tuto hodnotu.
K tomuto roztoku se přidá 55 ml očkovací kultury (OD = 10) Bacillus subtilis PA 824 a za intenzivního míchání se fermentuje při teplotě 43 °C při plynování 12 I/min.
Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky PCT/US 0025993.
V průběhu 48 hodin se nadávkuje 6 1 sterilního vodného roztoku. Složení je následující,
| Násada | V ' | Koncentrace (g/1) | |
| Glukóza | •' >' · | ; f. , | 550 |
| Chlorid vápenatý | 0,6 | ||
| Roztok stopových solí | 6 ml/1 |
Fermentace se provádí s limitovanou glukožou. V průběhu fermentace se dávkováním·25.%-ního roztoku amoniaku případně 20 %-ní kyseliny fosforečně udržuje hodnota pH na
7,2. Amoniak zároveň slouží jako (zdroj dusíku pro fermentaci. Počet otáček.míchadla se reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 30 .% hodnoty při nasycení. Tvorba pěny se řídí občasným nadávkováním pro35
A-A ·· ··'· ' ΑΙ+ΊΑΑΑ . · A A A · ' · A A • · A A · «i · ·
A A « Α A A A A A A A A . /-i středku proti pěnění. Po přerušení dávkováni zdroje uhlíku ‘ se fermentace vede dále tak dlouho, dokud obsah rozpuštěného kyslíku (pC^) nedosáhne hodnoty 95 % při nasycení. Potom se . fermentace ukončí a organismy se tepelně usmrtí. K tomu se fermentační roztok sterilizuje po dobu 30 minut. Usmrcení ; bylo prokázáno na deskách.
Následně se odstředěním provede oddělení buněk. Po oddělení buněk činí koncentrace/D-pantothenátu po 48 hodinách 24,1 g/1.
·'·’.?*··»
Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační břečky, které vykazují titr kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninem více jak 20,- 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 65, 70, 75, 80, 85 a >90 g/1.
2817 ml produktu z fermentace se smísí s 1183 ml roztoku kyseliny pantothenové o koncentraci 178,9 g/1 a neutralizuje se 25 %-ním roztokem hydroxidu amonného. Následně se filtruje přes písek/aktivní uhlí. Obsah kyseliny D-pantothenové ve filtrátu činí 67. g/1, převážně ve formě amoriné i soli .
1300 ml filtrátu se nanesena lože (objem asi 1 litr) iontoměníče Lewatitu S100 Gl · (v H+-formě) a. promývá se ; vodou. Průtok se reguluje‘asi . na 20 ml/min. Po předtoku
- ','-'.' * ,
200 ml se shromáždí 1810 ml. eluátu. Obsah kyseliny pantothenové činí 45 g/1. Vyskýtuji se zde následující koncentrace iontů : NH^4 = 66 mg/kg eluátu a K+ = < 0,001 g/100 g eluátu. Obsah fosforu činí 0,072 g/100 g eluátu..
Za míchání se volná kyselina pantothenové neutralizu-
• · · je pevným hydroxidem vápenatým, to znamená, že se hodnota pH upraví přibližně na 7 .
Získá se takto 1840 g vodného roztoku nebo suspenze D-pantothenátu vápenatého s obsahem D-pantothenátu vápenatého 49 g/1.
Vodný roztok nebo suspenze D-pantothenátu vápenatého se usuší v laboratorní rozstřikóvací sušárně firmy Niro, typ Minor. Teplota na vstupu.do věže činí asi 200 °C, teplota na výstupu z věže je 85 až 90 °C., Rozprášení se provádí pomocí dvoudruhové trysky při tlaku 0,4 MPa. Obsah vody se zjišťuje metodou Karl-Fischera. 'Získá se přitom práškovitý produkt o následující specifikaci (údaje jsou v % hmotnost,ních) : . ,
Obsah vody : ' 2 i%
D-pantothenát vápenatý 46,-1 %
Amoniové ionty : > 0,60 %
Draselné ionty Sodné ionty :
<0,01 % < 0,01 %
Příklad 3
Do laboratorního ferměntořu s míchadlem a. plynovacím zařízením o obsahu 300 1 sé;předloží .vodné fermentační medium o následujícím složení :
i,
• · « · « · · · · · ··· ·« ·· ·* ·· ·'«
| Násada | Koncentrace (g/1) |
| sojová moučka | 40 ’ ‘ |
| Kvasnicový extrakt | 5 |
| Natriumglutamát | 5 |
| Síran amonný | 8 |
| kh2po4 | Ť10 |
| K2HP04 ' · - | / 20 |
Po sterilizaci byly navíc přidány následující sterilní komponenty media:
| Násada | > Koncentrace : ' (g/D |
| Glukóza í ·. | 1 · 2,5 |
| Síran vápenatý | ’ - θ’1 - ' . |
| Síran hořečnatý | 1 |
| Natriumcitrát | i- ' 1 , |
| FeSO4 x 7 H20 \ | •f ο,οι |
| Roztok stopových solí | - 1 ml |
Roztok stopových solí má .nás-leduj ící složení : - !
* I
0,15 g Na2Mo04 x 2 H20, 2, 5 g H3BÓ3, 0,7 g CoCl2 x 6 H20,
0,25 g CuSO4 x 5 H20, 1,6 gMnCl2 x 4 H20, 0,3 g ZnSO4 x 7 - ;
H20, doplněno vodou na 1.1, Přídavek roztoku stopových solí se provádí po sterilní filtraci-'. Počáteční objem kapaliny činí 100 1. Výše uvedené Obsahy, jsou vztaženy na tuto ' < ' ' f * l \ ; · i ; i , ' i é
v •sí* • .·♦ ·· fcfc 9 ·' - fc fcfc · * · fc ' · · · fc fcfc.;· '· ? fc • ·*· fcfc fcfc · fcfc · fc”· • · fcfc·· · · · · ' ··· fc* fcfc fcfc ·· fcfc
hodnotu. ; ‘ '
K tomuto roztoku se přidají 4 1 očkovací kultury (OD = 10) Bacillus subtilis PA 824 a za intenzivního míchání o se fermentuje při teplotě 43 °C při plynování 1., 8 mJ/h.
Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky PCT/US 0025993.
V průběhu 43 hodin se nadávkuje 113 1 sterilního vodného roztoku. Složení je následující :
| Násada , | / , Koncentrace (g/1) |
| Glukóza | γ 550 |
| Chlorid vápenatý | 0,6 |
| Natriumcitrát | 2 |
| FeSO4 x 7 H20 | • \ 0,02 |
| Natriumglutamát | 5 |
| Roztok stopových solí | 1 ml |
Fermentace se provádí s limitovanou glukózou. V prů- r hu fermentace se dávkováním 25 %-ního roztoku amoniaku případně 20 %-ní kyseliny fosforečhé udržuje hodnota pH na
7,2. Amoniak zároveň slouží jako’.zdroj dusíku pro fermenta- . ci. Počet otáček míchadla ,sé reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 30 % hodnoty pří nasycení. Po přerušení dávkováni zdroje uhlíku se; fermentace vede dále tak dlouho, dokud obsah rozpuštěného kyslíku (p02) nedosáhne hodnoty 95 % při nasycení. Po 43 hodinách se fermentace ukončí. Oddělení buněk se provede separací na talířové odstředivce. Potom' Seřfermentační roztok prostý buněk sterilizuje po dobu 60 minut.'’ Usmrcení-bylo prokázáno t
j i39 ' «1 .
• 9 9 ·» ·· ·· «'·♦· * · · · · · * · ’ · ’ · 1 '9' • · · · · · * « > ia • · · · · · · ··· · · • · · · · · · · Φ · ··» tf ·· tt ·· ·<» na deskách.
Koncentrace D-pantothenátu po oddělení buněk činí 21 g/1Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační břečky, které vykazují titr kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninem více jak 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/1.
3270 ml získaného produktu z fermentace se pomocí 1750 ml roztoku pantothenátu sodného zvýší na koncentraci 170 g/1 a do tohoto roztoku se vmíchá asi 7 g práškovitého aktivního uhlí. Pro zlepšení filtrovatelnosti suspenze se tato smísí z poloviny se Sedipurem CF 902 (48 g 1% roztoku) a z poloviny se Sedipurem CL 930 (30 g 1% roztoku). Po krátkém promíchání se obě poloviny filtrují přes malé lože Cellite a potom se opět spojí..i(.
Z takto získaného filtrátu s obsahem kyseliny D-pantothenové 65,4 g/1 se 1800 ml nanese na lože (objem 1 litr) iontoměniče Lewatitu S100 G1 (v H+—formě) a promývá se vodou. Průtok činí asi 20 ml/miri. · *
Po předtoku 250 ml, který se vypustí, se shromáždí 2,2 1 eluátu a přídavkem vodné '20%- disperze hydroxidu vápenatého (vápenné mléko) se hodnota pH upraví na hodnotu přibližně 7. Ještě jednou se přefiltruje přes papírový filtr a jako filtrát se získá '2174 g vodného roztoku nebo suspenze D-pantothenátu vápenatého s obsahem 58 g/1 D-pantothenátu vápenatého. ·
Vodný roztok nebo suspenze D-pantothenátu. vápenatého ·· ί • ·· ·· ·· ·· o··· «<· · · · 6 · · ♦ · ί » • · · · · · · · · · • ···»· ·· ··· · · • · · · · · « · Q * ·«· ·· ·· ·· ·« ··
.. -í f,t · • · · t i ' ' í* -1 .· - c .... .1 - · · , . - i se usuší v laboratorní rozstřikovací sušárně firmy Niro, typ . j Minor. Teplota na vstupu do věže činí asi 185 °C, teplota . , 1 na výstupu z věže je asi 95 °C. Rozprášení se provádí pomocí dvoudruhové trysky při tlaku 0,2'MPa. Obsah vody se zjišťuje metodou Karl-Fischera. Získá se přitom práškovitý produkt o následující specifikaci (údaje jsou v % hmotnostních) :
| Obsah vody : | 1,4 % , . | |
| D-pantothenát vápenatý : | 63,2% | |
| Amoniové ionty | .0,043 % | |
| Draselné ionty | : < | 0,01 % |
| Sodné ionty : | ' .< v ; | 0,01 % |
| klad 4 | '· « . | |
| V laboratorním | fermentoru | ;š míchadlem a plynovacím |
zařízením o obsahu 20 1 se smíchá 200 g sojové móuěky, 50 g 50 %-ního kvasnicového extraktu, 25 g glutamátu sodného, 40 g síranu amonného a 50 ml'prostředku proti pěnění Tego KS911 se 3,9 1 vody a sterilizuje po dobu 30 minut při teplotě 121 °C. Následně se přidá roztok 1,'*. 2, 3 a roztok 4.
1' JI
Roztok 1 se připraví následovně :
12,5 g glukózy, 0,5 g CaCl2 2 F^Q a 5 g MgCl2 x 6 F^Q sé rozpustí ve 100 ml vody a sterilně se přefiltruje.
Roztok 2 se připraví následovně :
ml roztoku citrátu železpatého (200 g/1 citrátu sodného, g/1 FeS04 x 7 H^O, sterilně filtrováno) se smíchá s 5 ml roztoku stopových solí ( 0,15 g Na2Mo04 x 2 F^O, 2,5 , > -1 • ft'ft ftft ftftf ftft ftftftft ·· ...ft Α · ; -- ·· „ · · · . · ft > ·<
• ftftft.»· ···<>· · ,. ft • · ft ftft · ft ftft' ft' • ftft ft.ft ftft ftft ftft ·« ·-. ' r
.. - ť , . .í g H3BO3, 0,7 g CoCl2 X 6 H2Q, 0,25 g CuSO4 x 5-'H2O,.1,6 g MnCl2 x 4 H2O, 0,3 g ZnSO4 x 7 H2O, doplněno vodou na 1 1, sterilně filtrováno).
Roztok 3 se připraví následovně :
87,5 g glukózy se doplní vodou na 500 ml a sterilizuje se.
Roztok 4 se připraví následovně :
g KH2PO4, 50 g K2HPQ4, 25‘g-NaH2P04.a 50 g Na2HP04 se doplní vodou na 500 ml a sterilizuje se. ’
Do smíšeného media (óbjemjpo přídavku všech roztoků j činí 5 1) se přidá 100 ml očkovací kultury (OD = 9,5 v mediu j í ' * V j
SVY (SVY medium : 25 g Difco Veal Infusion Broth, 5 g Difco ‘ J Yeast Extract, 5 g glutamátu sodného, 2,7 g síranu amonného j. se rozpustí v 740 ml vody, sterilizuje se, následně se přidá ý 200 ml sterilního 1 M K2HP04 (pH 7,0) a 60 ml 50 %-ního . sterilního roztoku glukózy (konečný objem 1 1)), Bacillus . 7 subtilis PA 668-2A a za intenzivního míchání se fermentuje při teplotě 43 °C za silného míchání při plynováni 12 ’m3/min. Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky US-Serial-Nr. 60/262995 : , . v ;
_ V průběhu 48 hodin se nadávkuje asi 3,5 1 sterilního
i.. vodného roztoku glukózy., Roztok še připraví následovně : f φ 5 kg glukózy x. H20 a 3,6 g .chloridů vápenatého x 2 K20 se .J , smíchá s 1,2 kg vody a sterilizuje se po dobu 30 minut. *, Nálsedně se přidá 9 ml roztoku stopových solí (složení viz i výše) a rovněž 37,5 ml roztoku citrátu železnatého (složení viz výše) . Následně se přidá 6,0 ml . sterilně filtrovaného roztoku 375 g/1 glutamátu’sodného. ‘ !
Fermentace se provádí s limitovanou glukózou. V prů- ‘
| • • · 4-4 | -·♦ | 4· ‘ 9 | 9 | 9 9 i | . 0 4 4 4 4 ',4 | ||
| 4 | 9 | ♦ | |||||
| • ·· · | ·. · | • | • | 9 | • · | 4 4 | |
| • 4 | 9 | • | • | 9 | • | 4 4 4 | |
| « · » 4 4 | • 4 | 4 4 | • 4 | 4 4 |
I ' hu fermentace se dávkováním 25 %-ního roztoku amoniaku pří-, pádně 20 %-ní kyseliny fosforečné udržuje hodnota pH na
7,2. Amoniak zároveň slouží jako zdroj dusíku pro fermentaci. Počet otáček míchadla se reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 20 % hodnoty při nasycení. Tvorba pěny se řídí občasným nadávkováním prostředku proti pěnění Tego KS 911. Po přerušení dávkováni zdroje uhlíku se fermentace vede dále tak dlouho, dokud obsah rozpuštěného kyslíku (p02) nedosáhne hodnoty 95 % při nasycení. Potom, se fermentace ukončí. Oddělení buněk se provede odstředěním. Zbývající;buňky Se usmrtí termicky sterilizací. Po separaci a sterilizaci je koncentrace D-pantothenátu 35,8 g/1. :. /,7
Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační. břečky, které vykazují titr kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninu více jak 15, 20,,/25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a Více'jak 90 g/1.
Příklad 5
1000 ml centrifugátu z příkladu 4 se obohatí syntetickým pantotenátem sodným na 70, g/T a čerpá se shora dolů skleněným sloupcem, naplněným asi 1000 ml iontoměniče Lewatitu S100 G1. Průtok se při tom žreguluje na asi 20 ml/min.
Z přeteklé kapaliny se shromažďují frakce po 250 ml a
Λ i O > ~l· i analyzují se se zřetelem na ionty Ca , Mg , NH4 , K a Na+. Příkladně jsou v následující tabulce uvedené frakce 1 až 3 . ,1 st ·..-%·*'' * · ,
.. i, U< ' y . ' '/ ' ' - 43 » · ’ ·· · ' · · . ··'··. ·· t ť • · · ♦
| Vzorek | v ml | pH | Panto- thenát (g/i) | NH/ | Ca2+ | K+ | Mg2+- | Na+ |
| Filtrát | 7 | 70 | 0,48 % | 0,01 % | 0,57 % | 0,003 % | 0,51 % | |
| Frakce 1 | 250 | 2,05 | 34,1 | < 0,01% | < 0,01 % | 0,0005 % | '< 0,01 % | 0,0004 % |
| Frakce 2 | 250 | 1, 94 | 55,2 | < 0,01 % . | < 0,01 % | 0,0005 % | < 0,01 % | 0,0003 % |
| Frakce 3 | 250 | 1,91 | 61,7 | < 0,01 % | < 0,01 % | 0,004 % | < 0,01 % | .< 0,0003 % |
250 ml frakce 2 se za mícháni upraví přídavkem pevného hydroxidu vápenatého na hodnotu pH 7. Vypadne při tom bílá sraženina, která se po přídavku Sedipuru CF902 odfiltruje. Filtrát se potom vysuší; odpařením vody na rotační odparce a získá se takto 25 g lehce nahnědlého práškovitého D-pantothenátu vápenatého, který má obsah 55 % pantothená- , :
tu. Tento prášek nemá sklon k tvorbě slepenin a má dobré · 1 vlastnosti produktu. ' '
P ř í k 1 a d 6
1000 ml obohaceného.centrifugátu z příkladu 5 se čerpá ' sdola nahoru skleněným sloupcem5,, naplněným asi 1000 ml k j iontoměniče Lewatitu S100 Gí (v H+-formě), načež se vyplá- 1 chuje vodou. Průtok se při tom zreguluje na as‘i 20 ml/min.
Po předtoku 500 ml se,shromáždí 1750 g eluátu. Obsah
D-pantothenátu činí 35 g/1. Vyskytují se zde následující koncentrace iontů : NH^+ : < 0/01%, Na+ : 0,0064 %, K+ :
• · · » · · '· · ·♦!»',. ««· ·> «· .*· «« '
0,006 %, PO4 3 0,29 %, S04 2“ : 0,1 % a Cl“ : 0,043 % .
Za míchání se volná kyselina pantothenová neutralizuje pevným hydroxidem vápenatým, to znamená, že se hodnota pH upraví přibližně na 7 .
Získá se takto 1800. g vodné suspenze D-pantothenátu vápenatého s obsahem D-pantothenátu asi 35 g/1.
Vodná suspenze D-pantothenátu vápenatého se usuší v laboratorní rozstřikovací‘sušárně firmy Niro, typ Minor.
Teplota na vstupu do věže činí asi 200 °C, teplota na ‘
výstupu z věže je 85 až 90 °C. -Rozprášení se provádí pomocí dvoudruhové trysky při tlaku Ó,4»MPa. Obsah vody se zjišťuje metodou Karl-Fischera. Získá se přitom práškovitý produkt o následující specifikaci (údaje jsou v % hmotnostních) : ’
Obsah vody : . 2 %
D-pantothenát : ,56,3 %
-· -4..Λ ’ - ·· Amoniové ionty : * 0,03 %
Draselné ionty : < 0,015 %
Sodné ionty : <.0,019 % ( Vápenaté ionty : ’ *. * 9 ,’5 % .
φ Příklad 7 .. . , ' » r ' · f- <.
J; ,
3270 ml fermentačního roztoku, získaného v příkladě 4, se pomocí 1750 ml roztoku pántothenátu sodného upraví na koncentraci 125,6 g/1 pantothenáťu. Do tohoto roztoku se potom vmíchá asi 7 g práškovitého aktivního uhlí. Pro zlepšení filtrovatelnosti suspenze se tato smísí z poloviny se Sedipurem CF 902 (48 g 1% roztoku). Po krátkém promíchái
I
♦ '·♦. φ<. φ-φ · φφ\. φ-'φφ·· ·♦ 9 · · · e « · ♦ +< φ · ' · '· ·’ ·» · «'· φ* • ·φφ Ο Φ φ · φ Φ Φ Φ · ν * ·.» ,. · ♦ φ φ φ · φ · * ·«» ·· ·· φφ ·Φ «· ’ » ř
ní se obě poloviny filtrují přes malé lože Cellite a potom ' se opět spoj i. ‘ i*
Z takto získaného filtrátu s obsahem kyseliny D-pan- !
tothenové 66,5 g/1 se 1800 ml nanese na lože (objem 1 litr) L iontoměniče Lewatitu S100 G1 (v H+-formě) a promývá se vo- : dou. Průtok činí asi 20 ml/min.
t
F „ '
Po předtoku 500 ml, který se vypustí, se shromáždí ‘ Ϊ
1 eluátu a přídavkem vodné 20% disperze hydroxidu '·. !
vápenatého (vápenné mléko) se hodnota pH upraví na hodnotu i přibližně 7. Ještě jednou se přefiltruje přes papírový . :
filtr a jako filtrát se získá asi 1960 ml vodného roztoku ;
nebo suspenze D-pantothenátu»vápenatého s obsahem 16 g/1 í
D-pantothenátu vápenatého. ' , .
Vodný roztok nebo suspenze D-pantothenátu vápenatého se usuší v laboratorní rozstřikovací sušárně firmy Niro, typ i Minor. Teplota na vstupu do věže činí asi 185 °C, teplota na výstupu z věže je asi 95 °C. Rozprášení se provádí v, ' . · · f pomocí dvoudruhové trysky při-tlaku 0,2 MPa. Obsah vody se zjišťuje metodou Karl-Fischera. Získá se přitom práškovítý produkt o následující specifikaci (údaje jsou v % hmotnostních) : ϊ·;„· · -. ‘
| Obsah vody : | i,4· % |
| D-pantothenát vápenatý.*' | :)-51 ·'%' |
| Amoniové ionty : | •f 0,01 % . |
| Draselné ionty : | /7 0,012 % |
| Sodné ionty : | •ý 0,01 % |
| Vápenaté ionty : | .7,7. %: |
9 «4 '•♦λ ·«'
-·' * * ·.· · · ·« .. · • ··'/♦·· « · · · 9 «9 9 · :· řx ' 9 ·9:· ♦ 9 9
Příklad 4
Analogicky jako je popsáno v příkladě 4 se v další fermentaci s kmenem PA668-2A získá fermentační břečka s koncentrací kyseliny pantothenové 22 g/1.
1000 ml centrifugátu se obohatí pantotenátem sodným na 70 g/1 a čerpá se skleněným sloupcem, naplněným asi 1000 ml iontoměniče Amberlite 200 (v H+-formě) a promyje se vodou.
Z proteklé kapaliny se.^odstraní 500 ml a shromáždí se
2000 ml eluátu. Obsah kyselinyjĎ-pantothenové činí 32,6 žf 1 g/1. Vyskytují se zde následující· koncentrace iontů
NH,
0,0062 %,' K < 0,01 %, Na 20,00045 %, P04°“ : 0,06 %,' SO^- : 0,06 % a Cl : 0,02 % . Sloupec iontoměniče. se pro regeneraci propláchne nejprve 1000 ml 1 N hydroxidu sodného a potom 2500 ml vody, načež se regeneruje 1000 ml 10% kyseliny chlorovodíkové a potom se. Sloupec propláchne 2500.ml vody do neutrální reakce. , . f
Za míchání se volná ky selina-· pant othenová neutralizuje pevným hydroxidem vápenatým,ýto Znamená, že se hodnota pH upraví přibližně na 7 . r
Získá se takto asi 2000 g vodné suspenze D-pantothenátu vápenatého s obsahem paritotňenátu 27,35 g/1. . .
'.··; f ' . ·5 ' j-.. ’
Tato vodná suspenze D-pantothenátu vápenatého se usuší v laboratorní rozstřikovací sušárně firmy Niro, typ Minor. Teplota na vstupu do věže činí asi -200 °C, teplota na výstupu z věže je 85 až 90 . °C. \Rožprášehí se provádí pomocí dvoudruhové trysky při tlaku 0,4 MPa.' Obsah vody se zjišťuje metodou Karl-Fischera. Získá se přitom’ práškovitý pror.
, 99 99 9999 • · * * · * ', 9
9 99 9 9 9 * · · • 9 9 9
9'9 9 9 dukt ο následující specifikaci (údaje jsou v % hmotnostních) :
Obsah vody : 1,7%
D-pantothenát : 64,6 %
Amoniové ionty : 0,08 %
Draselné ionty : 0,006 %
Sodné ionty : 0,086 %
Vápenaté ionty : 6,5 % .
Příklad 9
Analogicky jako je popsáno v příkladě 4 se po čtyřicetihodinové fermentací s kmenem PA668-2A získá fermentační břečka. Tato se odstředěním zbaví biomasy a má koncentraci kyseliny pantothenové 42,9 g/1. 1000 ml této nesterilizované fermentační břečky se nanesena lože (objem asi 1,0 litru) iontoměniče S1468 (v H+-formě) a promývá se vodou. Průtok je nastaven na asi 20 ml/min.
Po předtoku 500 ml se shromáždí 2100 ml eluátu, přičemž obsah kyseliny D-pantothenové činí 19,2 g/1. Sloupec iontoměniče se pro regeneraci propláchne nejprve 1000 ml 1 N hydroxidu sodného a 2500 ml vody, načež se iontoměnič regeneruje 1000 ml 10% kyseliny chlorovodíkové a potom se sloupec proplachuje 2500 ml vody do neutrální reakce.
Za míchání se volná kyselina pantothenová neutralizuje, to znamená, že se hodnota pH upraví přibližně na 7.
Získá se takto asi 2000 g vodné.suspenze D-pantothenátu vápenatého, která se sterilizuje po dobu 60 minut. Usmrcení mikroorganismů se kontroluje na deskách.
9. ,99 • · 9 ' · • - · · .,9 . 9 '··· 9 9 ^99. 9'9· · 9 ·
9 99 • · 9 9 • · · 9 ·'· 99
9.,. 99'99· ',· í9 9
9
9 9
99
I /
Tato vodná suspenze D-pantothenátu vápenatého še usuší - / v laboratorní rozstřikovací sušárně firmy Niro, typ Minor. Ύ ’ i '
I
Teplota na vstupu do věže činí asi 200 °C, teplota na výstu- í , i pu z věže je 85 až 90 °C. Rozprášení se provádí pomocí .i, dvoudruhové trysky při tlaku 0,4 MPa. Obsah vody se zjišfu- \ ‘ í je metodou Karl-Fischera. Získá se přitom práškovitý pro- >
dukt o následující specifikaci (údaje jsou v % hmotnostních) :
Obsah vody : D-pantothenát Amoniové ionty Draselné ionty Sodné ionty : Vápenaté ionty '··. 2,6 % '' 8,5 % < 0,01 %
0,003 % , · 0,016 % > 0,61 % ** ·
Příklad 10
Ke 2305 ml centrifugátu, získaného podle příkladu 4, s obsahem kyseliny D-pantothenové·35,8 g/1, se přidá 895 ml roztoku pantothenátu sodného. 1000 ml této břečky se nanese na lože (objem 1 1) iontoměríiče Lewatitu S1Ó0 G1 (v H+ , formě) a proplachuje se vodou. Průtok činí asi 20 ml/min.
<-*v ; ’ ' » i . .
Po předtoku 500 ml, který se vypustí, se shromáždí » : 2 1 eluátu. Obsah D-pantothenátu v eluátu činí 25,3 g/1..
/’'·** = Přidá se jeden ekvivalent vápenatých iontů ve formě chloridu vápenatého, vztaženo na kyselinu pantothenovou.
Následující sušení se provádí v laboratorní rozstřikovací sušárně firmy Niro, typ Minor. Teplota na vstupu do věže činí asi 185 °C, teplota.na výstupuz věže je asi °C. Rozprášení se provádí pomocí dvoudruhové trysky při
Claims (27)
- P A T E N T O V ÉNÁROKY1. Způsob výroby kyseliny D-pantóthenové a/nebo jejích solí, vyznačuj ící tím , zea) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothénovoú,“ jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan)‘a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v. kultivačním mediu se fermentaci tvoří nejméně 2 g/1 solí.kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až 20 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu . 4b) fermentační roztok obsahující D-pantothenát se vede přes kationtoměnič, přičemž ze solí kyselinyD-pantothenové vznikne volná kyselina D-pantothenová,c) volná kyselina D-pantothénová, obsažená v roztoku, se přídavkem vápenaté -a/nebo hořečnaté báze upraví na hodnotu pH 3 až 10 ,· přičemž se získá roztok, ' ' který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesium? v pantothenát a d) roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace. , ?· - ' · ’ . .Λ''''':'
- 2. ··-Způsob'.podle nároku l'“, vyznačuj ící s et í m že se do kultivačího media nepřidává volný β-alanih a/něbo sůl'β-alaninu.9.9 ►' -‘ · r 1
- 3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, j vyznačující se tím, že se jako organismy · · ,χ produkující kyselinu D-pantothenovou použijí bakterie, 1 kvasinky nebo houby.
- 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako mikroorganismus použijí bakterie.rodu Bacillaceae.
- 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se t im,* že se použije bakterie . i rodu Bacillus a s výhodou druhu B. subtilis, B. 'lícheniformis nebo B. amyloliquefaciens. ,
- 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se ' t í m,- že se v kroku a) tvoří množství kyseliny pantothenové a/nebo jejích solí nejméně 10 g/1 kultivačního media, s výhodou nejméně 20 g/1 kultivačního media, obzvláště výhodně-nejméně 40 g/1 kultivačního, media a zcela obzvláště výhodně nejméně 60 g/1 kultivačního media. f
- 7. Způsob podle některého ž. nároků 1 až 6, vyznačuj ící se·' t í-m , že je v kroku b) redukován obsah jednomocných katíontů, výhodně iontů !amonných, draselných a/eb'o sodných, na koncentraci — lg/kg < 3 roztoku. * · ··!· ’ ·
- 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačuj ící setím, že se v kroku c) upraví pH roztoku na hodnotu 5 až -10. · / ; :Způsob podle některého z nároků 1 áž 8, ,
- 9.'í .....* '4 í <····K·'·’ vyznačující se ΐ í m, že se v kroku c),upraví pH roztoku na hodnotu 5 až 9, s výhodou 6 až 9 a obzvláště výhodně na 6 až 8. / 'T * , ·’. ··’ * «3
- 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující še tím, že se do roztoku ý v kroku c) přidá k neutralizaci hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý, oxid vápenatý, hydroxid horečnatý a/nebo bazický uhličitan horečnatý ve formě pevné látky á/nebo vodné * suspenze. , , 1 2/
- 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující s e t í m, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 55 % · hmotnostních, s výhodou 10 až 50..% hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních· hydroxidů vápenatého. .
- 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačuj ící se»! í; m, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze, obsahující 2 až 65 .% hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních uhličitanu vápenatého.‘m.i,
- 13. Způsob podle některého z'.nároků 1 až 12, vyznačuj ící se t „í m, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 60 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50% hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu hořečnatého.
- 14. Způsob podle některého z-nároků 1 až 13, vyznačuj ící še t ,í m, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 25-% hmotnostních, s výhodou 10 až '20 ^hmotnostních bázického uhličitanu hořečnatého. .····.· i-'·· γΛ.- 53 s i i
- 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14 , vyznačující se tím, že se v kroku c) při- í dá k roztoku, obsahujícímu volnou kyselinu pantothenovou, . kyselá anorganická a/nebo organická vápenatá a/něbo hořečnatá sůl.
- 16. Způsob podle některého z nároků 1 až 15 , vyznačuj ící se tím , že še jako kyselá anorganická a/nebo hořečnatá sůl použije odpovídající halogenid. ‘ · >.ý\*
- 17. Způsob podle některého z nároků 1 až 16 , vyznačuj ící se t i ’m , že se v kroku c) použije jako kyselá anorganická sůl vápníku a/nebo hořčíku chlorid vápenatý a/nebo chlorid hořečnatý.
- 18. Způsob podle některého z nároků 1 až 17 , vyznačuj ící se- tím , že se v kroku c) použije jako kyselá organická,sůl vápníku a/nebo hořčíku mravenčan, octan, propionát, glycinát a/nebo laktát vápníku a/nebo hořčíku. _ , /
- 19. Způsob podle některého zs nároků 1 až 18, vyznačující s e t i m, že se v kroku c) nebo d) získá nebo předloží suspenze, -obsahující pantothenát vápenatý a/nebo pantothenát hořečnatý.
- 20. Přípravek pro použití jako přísada do zvířecího krmivá a/nebo doplněk zvířecího krmivá, . .vyznačuj ící s é . t ®'í m, že je vyrobitelný tak, že .•. ♦»· AA , Α· .AA ··b)b)c)c) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v kultivačním mediu se fermentací tvoří nejméně 2 g/1 solí kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až 20 g/1, s výhodou 0 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu fermentační roztok obsahující D-pantothenát se vede přes kationtoměnič, přičemž ze solí kyseliny :D-pantothenové vznikne volná kyselina D-pantothenová, ϊ volná kyselina D-pantothenová obsažená v roztoku se přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté báze upraví na hodnotu pH 3 až 10, přičemž se získá roztok, který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát a roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace. . ‘
- 21. Přípravek podle nároku 20 , vyznačující s e \ tj i ňr , že se v kroku c) přidá anorganická a/nebo Organická vápenatá a/nebo hořečnatá sůl. přičemž se získá roztok, který obsahuje vícemocnou sůl kyseliny pantothenové, výhodně pantothenát vápenatý a/nebo hořečnatý. ' '.
- 22. Přípravek podle některého ž nároků 20 nebo 21 , vyznačující se tím, že se v kroku c) při- 55 <,r>• ·· ·· ·· · · I » · · • · · · · ·· » «»· · · « 9 · « • · ♦ · · · *·· ·· ·· ·« dá jako kyselá anorganická vápenatá a/nebo hořečnatá sůl • * · • · 1 · ♦ · · ’ ♦ ·· *« íhalogenid vápenatý a/nebo horečnatý. ,
- 23. Přípravek podle některého z nároků 20 až 22 , vyznačující se tím, že se v kroku c) při* dá jako kyselá anorganická vápenatá a/nebo hořečnatá sůl chlorid vápenatý a/nebo hořečnatý.
- 24. Přípravek podle některého z nároků 20 až 23 , vyznačující se tím, že se v kroku c) použije jako kyselá organická vápenatá a/nebo hořečnatá sůl i vápníku a/nebo hořčíku mravenčan, octan, propionát, glycinát i a/nebo laktát vápníku a/nebo hořčíku.
- 25. Přípravek podle některého z nároků 20 až 24 , vyznačující se tím, že se v kroku c) nebod) získá nebo předloží suspenze obsahující pantóthenát vá- f penatý a/nebo hořečnatý. » J
- 26. Přípravek podle některého z nároků 20 až 25 , vyznačující se tím, že obsahuje soli kyseliny D-pantothenové ve formě dvojmocných kationtů, s výhodou pantóthenát vápenatý a/nebo hořečnatý.*26. Přípravek podle některého z nároků 20 až 26 ', •C vyznačující s e t í m, že obsahuje soli kyseliny D-pantothenové o koncentraci nejméně 1 až 100 % hmotnostních, s výhodou nejméně 20 až 100 % hmotnostních a obzvláště výhodně nejméně 50 % hmotnostních.
- 27. Přípravek podle některého z nároků 20 až 27 , vyznačující se tí m, že obsah solí kyseliny D-pantothenové ve formě jednomocných kationtů je 1 g/kg.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10108225A DE10108225A1 (de) | 2001-02-21 | 2001-02-21 | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032236A3 true CZ20032236A3 (cs) | 2003-11-12 |
Family
ID=7674922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20032236A CZ20032236A3 (cs) | 2001-02-21 | 2002-02-20 | Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7781192B2 (cs) |
| EP (1) | EP1362117A2 (cs) |
| JP (1) | JP2004529626A (cs) |
| KR (1) | KR20030075203A (cs) |
| CN (1) | CN1294272C (cs) |
| AU (1) | AU2002250976A1 (cs) |
| BR (1) | BR0207475A (cs) |
| CA (1) | CA2439012A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20032236A3 (cs) |
| DE (1) | DE10108225A1 (cs) |
| EE (1) | EE200300404A (cs) |
| HU (1) | HUP0303216A3 (cs) |
| IL (1) | IL157472A0 (cs) |
| IN (1) | IN2003CH01298A (cs) |
| MX (1) | MXPA03007385A (cs) |
| NO (1) | NO20033704L (cs) |
| PL (1) | PL367284A1 (cs) |
| RU (1) | RU2003128529A (cs) |
| SK (1) | SK10442003A3 (cs) |
| WO (1) | WO2002066663A2 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10344200A1 (de) * | 2003-09-22 | 2005-05-04 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement |
| DE102005056668A1 (de) * | 2005-11-28 | 2007-05-31 | Basf Ag | Fermentative Herstellung organischer Verbindungen |
| WO2012175575A2 (en) * | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Increased vitamin b5 production |
| WO2019068642A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Metabolic Explorer | PROCESS FOR PRODUCING ORGANIC ACID SALTS FROM A FERMENTATION BROTH |
| CN108440332A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-08-24 | 安徽省恒锐新技术开发有限责任公司 | D-泛酸钙母液的回收方法 |
| WO2020011725A1 (en) * | 2018-07-10 | 2020-01-16 | Givaudan Sa | Improvements in or relating to organic compounds |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB562267A (en) * | 1941-08-08 | 1944-06-26 | Hoffmann La Roche | Process for the manufacture of a crystallised, non-hygroscopic calcium salt of d-pantothenic acid |
| DE4025962A1 (de) * | 1990-08-16 | 1992-02-20 | Basf Ag | Verfahren zur gewinnung von pantolacton und (beta)-alanin aus mutterlaugen der calcium-d-pantothenat-herstellung |
| EP0493060A3 (en) * | 1990-12-25 | 1993-04-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof |
| JP3710497B2 (ja) * | 1992-09-25 | 2005-10-26 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
| DK0822989T3 (da) * | 1995-04-21 | 2001-04-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af D-pantothenat |
| KR100421088B1 (ko) | 1995-09-13 | 2004-06-04 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 디-판토산및디-판토텐산또는그의염의생성방법 |
| RU2231552C2 (ru) | 1997-10-04 | 2004-06-27 | Форшунгсцентрум Юлих Гмбх | Способ микробиологического получения аминокислот семейства аспартатов и/или глутаматов и используемые в способе средства |
| AT407050B (de) | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Chemie Linz Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure |
| DE19846499A1 (de) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen |
| DE19855313A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen |
| PT1050219E (pt) | 1999-05-05 | 2003-04-30 | Degussa | Aditivos alimentares para animais contendo acido d-pantotenico e/ou seus sais e processo para a sua preparacao |
| EP2163629B1 (en) | 1999-09-21 | 2017-03-08 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| DE10021515A1 (de) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure |
| BR0113399A (pt) * | 2000-09-20 | 2003-07-15 | Basf Ag | Processo para a preparação de um suplemento de ração animal, suplemento de ração animal, e, uso do mesmo |
| DE10108223A1 (de) * | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| JP4377930B2 (ja) | 2007-06-21 | 2009-12-02 | 本田技研工業株式会社 | 車体パネル |
-
2001
- 2001-02-21 DE DE10108225A patent/DE10108225A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-20 BR BR0207475-3A patent/BR0207475A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 CA CA002439012A patent/CA2439012A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-20 WO PCT/EP2002/001753 patent/WO2002066663A2/de not_active Ceased
- 2002-02-20 SK SK1044-2003A patent/SK10442003A3/sk unknown
- 2002-02-20 KR KR20037010980A patent/KR20030075203A/ko not_active Withdrawn
- 2002-02-20 JP JP2002566367A patent/JP2004529626A/ja active Pending
- 2002-02-20 CZ CZ20032236A patent/CZ20032236A3/cs unknown
- 2002-02-20 EE EEP200300404A patent/EE200300404A/xx unknown
- 2002-02-20 US US10/468,609 patent/US7781192B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 IL IL15747202A patent/IL157472A0/xx unknown
- 2002-02-20 HU HU0303216A patent/HUP0303216A3/hu unknown
- 2002-02-20 PL PL02367284A patent/PL367284A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 CN CNB028053176A patent/CN1294272C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 RU RU2003128529/13A patent/RU2003128529A/ru not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 EP EP02719872A patent/EP1362117A2/de not_active Withdrawn
- 2002-02-20 AU AU2002250976A patent/AU2002250976A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-20 MX MXPA03007385A patent/MXPA03007385A/es unknown
-
2003
- 2003-08-19 IN IN1298CH2003 patent/IN2003CH01298A/xx unknown
- 2003-08-20 NO NO20033704A patent/NO20033704L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1294272C (zh) | 2007-01-10 |
| US20040048344A1 (en) | 2004-03-11 |
| BR0207475A (pt) | 2004-07-06 |
| WO2002066663A2 (de) | 2002-08-29 |
| KR20030075203A (ko) | 2003-09-22 |
| AU2002250976A1 (en) | 2002-09-04 |
| EP1362117A2 (de) | 2003-11-19 |
| IL157472A0 (en) | 2004-03-28 |
| IN2003CH01298A (en) | 2005-11-25 |
| MXPA03007385A (es) | 2003-12-04 |
| DE10108225A1 (de) | 2002-10-10 |
| WO2002066663A3 (de) | 2003-08-28 |
| EE200300404A (et) | 2003-12-15 |
| JP2004529626A (ja) | 2004-09-30 |
| NO20033704L (no) | 2003-10-13 |
| RU2003128529A (ru) | 2005-04-20 |
| HUP0303216A3 (en) | 2011-04-28 |
| US7781192B2 (en) | 2010-08-24 |
| PL367284A1 (en) | 2005-02-21 |
| HUP0303216A2 (hu) | 2003-12-29 |
| CA2439012A1 (en) | 2002-08-29 |
| SK10442003A3 (sk) | 2004-02-03 |
| NO20033704D0 (no) | 2003-08-20 |
| CN1492934A (zh) | 2004-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20032236A3 (cs) | Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv | |
| CZ2003797A3 (cs) | Doplněk zvířecího krmiva obsahující kyselinu D-pantothenovou a/nebo její soli, způsob jeho výroby a jeho použití | |
| US7727748B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by anion exchange as an additive for animal feed | |
| US20040053374A1 (en) | Method for the production of d-pantothenic acid and/or salts thereof as adjunct for animal feedstuffs | |
| CZ20032223A3 (cs) | Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv | |
| JP2004529632A (ja) | パントテン酸塩の改良された製造方法 |